Luís H. Melo de Carvalho Complementos de Química I - Módulo de cromatografia Luís H.

Melo de Carvalho Complementos de Química I - Módulo de cromatografia

CLASSIFICAÇÃO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA EM COLUNA
Método
Classificação geral Fase estacionária Tipo de equilíbrio
específico

Amostra Fase móvel Cromatografia líquida Líquido-líquido Líquido adsorvido Partição entre líquidos
(LC) ou partição num sólido imiscíveis
(fase móvel: líquido)

A+B Líquido-fase Espécies Partição

ligada orgânicas ligadas líquido/superfície ligada
a uma superfície
sólida
B
A Líquido-sólido ou Sólido Adsorção
adsorção
Troca iónica Resina de troca Troca iónica
iónica

B Exclusão por Líquido nos Partição/peneiragem

A tamanho interstícios de um
sólido polimérico

Cromatografia gasosa Gás-líquido Líquido adsorvido Partição gás/líquido

(GC) num sólido
B
B Detector (fase móvel: gás)
A Gás-fase ligada Espécies Partição gás/superfície
t0 t1 t2 t3 t4 orgânicas ligadas ligada
Sinal do detector

a uma superfície
A
B sólida
Gás-sólido Sólido Adsorção

t0 t1 t2 t3 t4 Cromatografia de Partição fluido

fluido supercrítico supercrítico/superfície
Tempo
(SFC) ligada
(fase móvel: fluido
supercrítico)

1
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TEORIA DA CROMATOGRAFIA SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

t1
Fase móvel A

Concentração
B

Fase estacionária t2

CS
K= A
CM B

Distância migrada
ALARGAMENTO DE BANDA

MELHORANDO A SEPARAÇÃO
Comportamento ideal

Cromatograma original
Resposta do detector

Sinal do detector
Aumento da separação
Tempo das bandas

Comportamento real

Diminuição do
alargamento das bandas

Tempo Tempo

2
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ALGUMAS QUANTIDADES IMPORTANTES QUANTIDADES IMPORTANTES (CROMATOGRAMA)

Tempo de retenção (Tr)

Tr= Testacionária + Tmóvel

Tr
Sinal do detector

Tm T’r Tempo morto (Tm)

Tempo de retenção ajustado (Tr’)

W1/2

Tr’= Tr - Tm

0 Factor de retenção (k’)

Tempo medida de retenção na fase estacionária

Tm= tempo morto Tempo que o analito passa na f ase estacionária

k' = =
Tempo que o analito passa na f ase móvel
Tr = tempo de retenção total
T − Tm Tr '
T’r = tempo de retenção ajustado (ou líquido) = r =
Tm Tm
W1/2 = largura do pico a meia altura
Coeficiente de separação ou selectividade (α)
medida de retenção na fase estacionária

k' (T ) − T
a= 2 = r 2 m
k'1 (Tr )1 − Tm

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ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO PROCESSOS CINÉTICOS QUE CONTRIBUEM

PARA O ALARGAMENTO DOS PICOS
B
H= + CS u + C M u
Nº de moléculas

u
Processo Termo na equação Relação com as propriedades da
L coluna e do analito
(L-1σ) (L+1σ)
Difusão longitudinal B B 2k D DM
=
u u u

Transferência de massa CS u qk' d f2u

CS u =
(fase estacionária líquida*)
Distância migrada (1 + k' ) 2 DS

Transferência de massa CS u 2t d k' u

CS u =
Enchimento ( 1 + k' ) 2
DETERMINAÇÃO DE H E N (fase estacionária sólida**)
Introdução Detector
Transferência de massa CM u
da amostra f ( d p2 , d c2 ,u )
CM u = u
(fase móvel) DM

Tr f: “função de”; kD, q : constantes; td tempo médio de dessorção do analito da

Sinal do detector

superfície; dc: diâmetro da coluna; B: coeficiente de difusão longitudinal; CS e

CM: coeficientes de transferência de massa nas fases estacionária e móvel,
respectivamente.
* a fase estacionária é um líquido imiscível imobilizado
** a fase estacionária é uma superfície sólida onde ocorre adsorção.
Tm Variável Símbolo Unidades
-1
Velocidade linear da fase móvel u cm.s
W Coeficiente de difusão na fase móvel (a)
DM cm .s-1
2

(a) 2 -1
Coeficiente de difusão na fase estacionária DS cm .s
Coeficiente de capacidade k’ -
Tempo Diâmetro de partícula do enchimento dp cm
Espessura do revestimento líquido na fase estacionária df cm
(a)
Aumenta quando a temperatura aumenta e a viscosidade diminui

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EQUAÇÃO DE VAN DEEMTER ALARGAMENTO DE BANDAS

B H Efeito de percursos múltiplos

Contribuição para H, cm

H= + CS u + CM u
u Largura de banda inicial

CSu 1 2

CMu

B/u

Velocidade linear de fluxo, cm/s Largura de banda final

glc
2 4 6 8 10
Fase móvel “estagnada”

8 0.8

6 GLC 0.6
Fluxo de fase móvel
H, mm

4 0.4

LC Grau de alargamento
2 0.2 de banda

1.0 2.0
lc
Velocidade linear de fluxo, cm/s

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SEPARAÇÃO E RESOLUÇÃO
LARGURA DE PICO NA BASE (W) E A MEIA
ALTURA (W1/2)
RS=0.75

A B

Resposta do detector
RS=1.0
Sinal do detector

A B

W1/2= 2.35σ
h

(Tr)B RS=1.5 h
∆Z 2
(Tr)A
Tm W = 4σ
A B

WA/2 WB/2
Tempo

WA WB

Tempo

6
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TÉCNICAS PARA MELHORAR A RESOLUÇÃO

EFEITO DO COMPRIMENTO DA COLUNA
Objectivo: NA RESOLUÇÃO E NO TEMPO DE RETENÇÃO
Separações eficientes em tempos de análise curtos.

1. Aumentar a distância entre os picos, ∆Tr=T2-T1

(a) Aumentar o comprimento da coluna, L
(b) Aumentar a quantidade de fase estacionária, VS ou VL
(c) Usar um coeficiente de selectividade melhor, α=T2’/T1’
• Diminuir a temperatura
• Escolher uma fase estacionária diferente
• Escolher uma fase móvel diferente (se for líquida)

2. Diminuir a largura da banda, W

(a) Usar um enchimento mais uniforme
• Encher mais cuidadosamente
• Usar partículas mais pequenas
(b) Aumentar a área de interface entre as fases
(c) Optimizar a velocidade de fluxo
(d) Reduzir o tamanho da amostra
(e) Reduzir o espaço morto no sistema
(f) Reduzir a constante de tempo do detector
(g) Diminuir o diâmetro da coluna

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EFEITO DO TAMANHO DE PARTÍCULA E H EFEITO DA TEMPERATURA NA CG

Isotérmica a 45ºC
1
0.2 4
0.6 – 0.8 mm 2
H, cm

3
0.4 – 0.6 mm
0.3 – 0.4 mm 5
0.1
0.25 – 0.3 mm x4
0.1 – 0.15 mm 5 Isotérmica a 145ºC
6

5 10 15 20
7
Velocidade linear, cm/s 8

EFEITOS DO FACTOR DE CAPACIDADE

Programada de 30ºC a 180ºC

Resolução, RS

4
RS/Q ou (Tr)B/Q’

8 9
Tempo de eluição, (Tr)B 1 2 3 5 7
6

10 20 30
Tempo (min)

30º 60º 90º 120º 150º 180º

0 5.0 10.0 15.0
Temperatura (ºC)
Coeficiente de capacidade, k’B

8
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EFEITO DA COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL PARÂMETROS USADOS NAS TÉCNICAS

DE OPTIMIZAÇÃO
NA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

70% metanol, Variação de N

30% água Alteração do comprimento da coluna

60% metanol,
40% água

50% metanol, Variação de H

40% metanol,
50% água 60% água Alteração da velocidade do fluxo da fase móvel
Alteração do tamanho de partícula do enchimento
Alteração da espessura do filme líquido que serve de fase estacionária (LC)
Alteração do diâmetro da coluna
Alteração da viscosidade da fase móvel (e assim DM ou DS)
Alteração da temperatura da coluna (GC)

Variação de k’ e de α
Alteração da temperatura
Tempo de retenção, min Alteração da composição da fase móvel
Alteração do enchimento da coluna
1 → 9,10-antraquinona Utilização de efeitos químicos especiais
2 → 2-metil-9,10-antraquinona
3 → 2-etil-9,10-antraquinona
4 → 1,4-dimetil-9,10-antraquinona
5 → 2-t-butil-9,10-antraquinona

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VARIAÇÃO DA RESOLUÇÃO EFEITOS DE α E N NA RESOLUÇÃO DE PICOS

Tm

Inicial Factor de separação fraco Factor de separação bom

N pequeno N pequeno

diminuir k’ aumentar k’

Variação de k’

Resposta do detector
Factor de separação fraco Factor de separação bom
N elevado N elevado
Aumento de N

Aumento de α

Tempo

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O PROBLEMA GERAL DA ELUIÇÃO Razão de altura dos picos = 1:1

RS = 0.4 0.5 0.6 0.7

0.8 1.0 1.25

Sinal do detector

Razão de altura dos picos = 8:1

RS = 0.4 0.5 0.6 0.7

Tempo

0.8 1.0 1.25

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SOBREPOSIÇÃO DE PICOS SOBREPOSIÇÃO DE PICOS

1) Localização Erro na quantificação por área de pico

Posição aparente Rs = 1

1:1 4:1

Posição verdadeira

100% 96%

8:1 16:1

2) Medição de áreas

93% 88%

% erro na área do pico menor = (% indicada -100 %)

% erro na área do pico maior = - (1/x) % erro na área do pico menor

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EXPRESSÕES E QUANTIDADES IMPORTANTES EM CROMATOGRAFIA

Relação com outras

QUANTIDADES EXPERIMENTAIS IMPORTANTES EM CROMATOGRAFIA Nome Expressão
quantidades

Velocidade linear da fase L

Nome Símbolo Determinada a partir de: u=
móvel Tm
Tempo morto Tm Cromatograma
Volume da fase móvel VM = Tm F
Tempos de retenção (de A e de B) (Tr)A e (Tr)B Cromatograma
(Tr − Tm ) k' =
KVS
Coeficiente de capacidade k' =
(T’r)A e Tm VM
Tempo de retenção ajustado (de A e de B) (T’r)A= (Tr)A - Tm
(T’r)B CS
k' VM K=
Coeficiente de partição K=
VS CM
Largura de picos (de A e de B) WA e WB Cromatograma

Comprimento do enchimento da coluna L Medição directa (Tr )B − Tm α=

k' B K B
=
Factor de selectividade α =
(Tr )A − Tm k' A K A
Velocidade média das moléculas da fase
u Medição directa
móvel 2[(Tr )B − (Tr ) A ] N  α − 1  k' B 
RS = RS =   
4  α  1 + k' B 
Resolução
W A + WB
Dados da preparação do
Volume da fase estacionária VS 2 2
 α   1 + k' B 
2
enchimento T 
Nº de pratos N = 16 r  N = 16RS2    
W   α − 1   k' B 
Concentração de analito nas fases móvel e
CM e CS Análise e dados da preparação L
estacionária Altura de prato H=
N
16RS2 H  α  (1 + k' B )3
2
Tempo de retenção (Tr )B =  
u  α − 1  (k' B )2

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COMPONENTES FUNDAMENTAIS DE UM SISTEMA DE GC COLUNAS PARA CROMATOGRAFIA GASOSA

Detector
Injector Tipo de coluna
Capilar Enchimento
Característica (WCOT)

Comprimento (m) 10 - 100 1-6

Diâmetro interno (mm) 0.25 – 0.75 2-4

Eficiência (pratos/m) 1000 - 4000 500 - 1000

Gás de arraste
3
Quantidade de amostra (ng) 10 - 10 10 - 106
Forno
Coluna Pressão relativa Baixa Alta
Gás Tratamento
de arraste de dados Velocidade relativa Rápida Lenta

INJECTOR DIRECTO
COLUNA TUBULAR ABERTA ( ou COLUNA CAPILAR)
Septo

Coluna
Seringa

Agulha da
seringa Câmara de
Purga do septo vaporização

Gás de arraste

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EFICIÊNCIA DE COLUNAS
CAPILARES E EMPACOTADAS GASES DE ARRASTE

106 N2
1.2
)
5 OT
10
es (WC 1.0
ilar
N

Cap

H (mm)
0.8
104 He
adas
acot
Emp 0.6 H2

103 0.4

10 102 103 104 0.2

Tempo (s)
20 40 60 80
2.0
Velocidade linear média (cm/s)
s
1.5 da
ota
H (mm)

c
pa
Em
1.0

(WCOT)
0.5 Capilares

20 40 60
Velocidade linear média (cm/s)

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DETECTOR DE IONIZAÇÃO DE CHAMA DETECTOR DE EMISSÃO ATÓMICA

Bateria de
Colector
díodos

Rede de
170 nm
difracção
250 nm

ar 480 nm

Chama ar-H2
656 nm
Bico de queima 690 nm
Plasma 748 nm
Parede do forno H2 777 nm

Coluna
Gás de complemento

Coluna
Amostra duma gasolina

Monitoração
DETECTOR DE CONDUTIVIDADE TÉRMICA da linha do C

Sinal do detector
0 10 20 30

Monitoração
Fluxo de saída da linha do O

0 1 2 3 4 5

Fluxo de entrada Tempo (min)

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SISTEMA DE INJECÇÃO DA AMOSTRA

COMPONENTES PRINCIPAIS DE UM SISTEMA DE HPLC
1) Carregamento da amostra 2) Injecção da amostra

“loop” “loop”

Unidade de
injecção

Para a coluna Para a coluna

Coluna
Da bomba Da bomba

Solventes Detector
Saída Saída

DETECTOR DE UV PARA HPLC

Da coluna

Bomba + sistema de
gradiente Janelas
de quartzo

Aquisição e processamento Fonte de UV Detector

de dados

Para o esgoto

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EFEITO DA ELUIÇÃO EM GRADIENTE

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Mistura de clorobenzenos
Eluição em gradiente
Polaridades dos solutos: A > B > C Inicio: 40:60 (v/v) MeOH/H2O
Eluição isocrática MeOH ä 8%/min
50:50 (v/v) MeOH/H2O

Fase normal Fase reversa

Fase móvel de polaridade baixa Fase móvel de polaridade alta

C B A A B C
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Tempo (min) Tempo (min)
Tempo Tempo

BOMBA RECÍPROCA PARA HPLC

Fase móvel de polaridade média Fase móvel de polaridade média

Coluna

Junta selada Amortecedor

Motor de pulsações
C B A A B C
Válvulas
Tempo Tempo
de esfera
Pistão de
vaivém

Solvente

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APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA IÓNICA

Eluente: Eluente:
NaHCO3 0.0028M / Na2CO3 0.0023M Fenilenodiamina.2HCl 0.025M / HCl 0.0025M
Volume de amostra: 50 µL Volume de amostra: 100 µL

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