Apostila de Citometria de Fluxo em Doenças Infescto-Parasitárias

Instituto Oswaldo Cruz
Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular &

Ps-Graduao em Biologia Parasitria
CURSOS DE INVERNO 2010
Citometria de Fluxo no
estudo das doenas
infecto-parasitrias
Amanda Torrentes de Carvalho

Grazielle Alves Ribeiro
Raquel Ferraz Nogueira
Coordenador: lvaro Luiz Bertho dos Santos
A persistncia o caminho do xito.

Charles Chaplin
AUTORES
AMANDA TORRENTES
DE
CAVALHO:
Graduao
em
Cincias
Biolgicas
(Bacharelado 2005 e Licenciatura 2009) pela Universidade Federal Fluminense e Mestrado

em Biologia Parasitria pela Fundao Oswaldo Cruz (2008). Atualmente Doutoranda do
programa de Ps-Graduao em Biologia Parasitria da FIOCRUZ, sendo bolsista do CNPq.
Atua no projeto intitulado Infeco de Moncitos por Vrus Dengue-2: Mecanismos de
Ativao Celular, Apoptose e suas Aes na Carga Viral e Gravidade da Doena, sob
orientao da Dra Claire Fernandes Kubelka e co-orientao das Dras Elzinandes Leal de
Azeredo e Luzia Maria de Oliveira Pinto, desenvolvido no laboratrio de Imunologia Viral do
Instituto Oswaldo Cruz/ RJ. Possui experincia na rea de Microbiologia, com nfase em
Imunologia Viral, atuando principalmente nos seguintes temas: autoanticorpos, clulas B-1,
moncitos, resposta imune inata, pacientes, modelo de infeco in vitro e Imunopatogenia da
Dengue
GRAZIELLE ALVES RIBEIRO: Graduao em Cincias Biolgicas pela Universidade

Federal de Juiz de Fora (2008). Atualmente Mestranda do programa de Ps-Graduao em
Biologia Celular e Molecular pelo Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ. Atua na rea de
biologia celular, com nfase na quimioterapia da leishmaniose e na morte celular de
Leishmania amazonensis. Desenvolve no Laboratrio de Bioqumica de Tripanosomatdeos o
projeto
Avaliao
das
alteraes
ultra-estruturais
bioqumicas
induzidas
por
naftopterocarpanoquinonas em Leishmania amazonensis, sob orientao do Dr. Eduardo

Caio Torres dos Santos e da Dr. Rossana Corra Netto de Melo.
RAQUEL FERRAZ: Bacharel em Biomedicina pela Universidade Severino Sombra (2007)

com Habilitao em Imunologia e com nfase em Imunologia Celular e Aplicada. Mestranda
do Curso de Ps-graduao em Biologia Parasitria do Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
desenvolvendo a dissertao: Caracterizao do repertrio da cadeia varivel do TCR e da
apoptose em diferentes populaes de Linfcitos T de pacientes com Leishmaniose
Tegumentar Americana" no laboratrio de Imunoparasitologia do Instituto Oswaldo
Cruz/FIOCRUZ, sob orientao do Dro lvaro Luiz Bertho dos Santos. Treine na Plataforma
de Citometria de Fluxo, Ncleo de Anlise e Sorting, no Instituto Oswaldo Cruz FIOCRUZ.
COORDENADOR
LVARO LUIZ BERTHO DOS SANTOS: Bacharel em Biomedicina formado pela

Universidade do Rio de Janeiro UNI-RIO (1984). Doutor em Cincias, rea de concentrao:
Imunoparasitologia.
Pesquisador
Titular
Chefe
Substituto
no
Laboratrio
de
Imunoparasitologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ e Professor

Adjunto de Imunologia Clnica na Universidade Severino Sombra, Vassouras, RJ. Coordena a
Plataforma Multiusurios de Citometria de Fluxo do Instituto Oswaldo Cruz Fiocruz Ncleo de Anlise e Separao de Clulas (Sorting). Consultor Cientfico no Setor de
Imunologia do Laboratrio Dr. Srgio Franco (1996 a 2003). Expertise na rea de Imunologia
e Imunogentica, com nfase em Imunologia Celular e Clnica, atuando principalmente nos
seguintes temas: citometria de fluxo, apoptose, imunoparasitologia, e nas leishmanioses.
Primeiro Citometrista de Fluxo no Brasil.
PREFCIO
O estudo das doenas infecto-parasitrias realizado a partir da utilizao de uma

diversidade de tcnicas que viabilizam o entendimento da biologia dos parasitas, suas
interaes com o hospedeiro e a resposta do hospedeiro no decorrer das infeces. Embora os
cursos de graduao abordem amplamente os aspectos tericos envolvidos no estudo de tais
doenas, os aspectos prticos relacionados forma de obteno deste conhecimento no so
devidamente explorados. Essa apostila tem como objetivo apresentar a aplicabilidade da
tcnica de citometria de fluxo no estudo das doenas infecto-parasitrias, buscando despertar
no aluno de graduao novas idias que possam ser abordadas em estudos posteriores para
ampliar essa rea do conhecimento.
Inicialmente fazemos uma pequena reviso sobre os mecanismos de resposta imune
s doenas infecto-parasitrias, abordando os principais aspectos da imunidade inata e
adaptativa e a aplicabilidade da citometria no mbito dessas respostas. Posteriormente, um
breve histrico, sobre a citometria de fluxo e os princpios bsicos da tcnica, apresentado.
Descrevemos tambm as principais aplicaes dessa tcnica nos estudos relacionados morte
celular por apoptose e nos estudos na rea de protozoologia e virologia, apresentando em
seguida conceitos e princpios bsicos e a aplicabilidade da tcnica de Sorting, assim como
alguns protocolos para citometria de fluxo. Finalizando a apostila, propomos um ensaio
prtico em imunofenotipagem e apoptose, enfatizando aspectos relacionados aquisio de
amostras e anlise e interpretao dos dados obtidos nos ensaios.
Os autores
Rio de Janeiro 2010
SUMRIO
1. Mecanismos de resposta imune s doenas infectoparasitrias: imunidade inata e

adaptativa................................................................................................................................ 09
1.1. Caracterizao das diferentes subpopulaes de leuccitos......................................... 09
1.2. Imunidade Inata............................................................................................................ 11
1.3. Imunidade Adaptativa, Adquirida ou Especfica ........................................................ 13
1.3.1. Caractersticas da Imunidade Adaptativa......................................................... 14
1.3.2. Imunidade Celular.......................................................................................... 15
1.3.3. Imunidade Humoral....................................................................................... 18
1.4. Produo de Anticorpos monoclonais comercialmente............................................... 20
1.5. Morte celular programada: Apoptose........................................................................... 22
1.5.1. Caractersticas morfolgicas e bioqumicas da apoptose................................. 23
1.5.2. Vias de sinalizao da apoptose....................................................................... 24
1.5.2.1. Via extrnseca...................................................................................... 25
1.5.2.2. Via intrnseca...................................................................................... 25
1.5.3. Papel da apoptose no sistema imune............................................................... 27
1.5.4. Apoptose nas doenas infecto-parasitrias...................................................... 27
1.6. Citometria na Imunologia............................................................................................. 28
2. Histrico da citometria de fluxo....................................................................................... 29

2.1. Introduo................................................................................................................... 29
2.2. Como iniciou este estudo? ......................................................................................... 30
3. Princpios bsicos da citometria de fluxo....................................................................... 38

3.1. Conceito Bsico.......................................................................................................... 38
3.2. Preparao das amostras para aquisio por citometria de fluxo................................. 38
3.3. Fluorocromos.............................................................................................................. 39
3.4. Princpios bsicos........................................................................................................ 41
3.4.1. Sistema tico.................................................................................................... 42
3.4.2. Tipos de filtro................................................................................................... 42
3.4.3. Sistema eletrnico........................................................................................... 44
3.4.4. Software........................................................................................................... 44
4. Aplicaes da citometria de fluxo na apoptose.............................................................. 49

4.1. Alteraes morfolgicas (Foward and Side Scatter) .................................................. 50
4.2. Iodeto de Propdeo (PI)................................ 51
4.3. 7-AAD (7-amino-actinomicina D)............................................................................... 53
4.4. Hoechst 33342.............................................................................................................. 54
4.5. DAPI (Diamino-2-Fenilindol) ............................. 55
4.6. Annexina-V.................................................................................................................. 55
4.7. Rodamina 123............................................................................................................ 57
4.8. TUNEL........................................................................................................................ 58
4.9. DiOC6(3)...................................................................................................................... 58
4.10. Anticorpo monoclonal............................................................................................ 59
5. Aplicaes da citometria de fluxo na protozoologia....................................................... 60
6. Aplicaes da citometria de fluxo na virologia................................................................ 68

6.1. Introduo..................................................................................................................... 68
6.2. Deteco e quantificao de clulas infectadas ........................................................... 70
6.3. Caractersticas fenotpicas Susceptibilidade e funcionalidade.................................. 72
6.3.1. Susceptibilidade............................................................................................... 72
6.3.2. Funcionalidade................................................................................................. 73
6.4. Apoptose..................................................................................................................... 76
7. Conceitos bsicos e aplicao de Sorting......................................................................... 79

7.1. Princpios...................................................................................................................... 80
7.2. Aplicaes do Sorting................................................................................................. 82
8. Protocolos para citometria de fluxo................................................................................. 84

8.1. Protocolos de Citometria.............................................................................................. 84
8.2. Preparo da Amostra...................................................................................................... 84
8.3. Ensaio de Imunofenotipagem....................................................................................... 85
8.4. Marcao direta............................................................................................................ 86
8.5. Marcao indireta......................................................................................................... 86
8.6. Marcao extracelular.................................................................................................. 87
8.6.1. Soluo de fixao: clulas vivas vs. clulas fixadas................................... 88

8.6.2. Soluo de bloqueio..................................................................................... 88
8.6.3. Soluo de lavagem........................................................................................ 89
8.7. Marcao intracelular................................................................................................... 89
8.7.1. Soluo de fixao......................................................................................... 90
8.7.2. Soluo de permeabilizao saponina......................................................... 91
9. Prtica de imunofenotipagem e apoptose......................................................................... 92

9.1. Tipos de amostras utilizadas em ensaios de citometria de fluxo.................................. 92
9.2. Protocolo Prtico Marcao de receptores de membrana e de apoptose em
clulas mononucleares do sangue perifrico..................................................................... 92
9.2.1. Mtodos de processamento de sangue para ensaios de citometria de
fluxo............................................................................................................................. 92
9.2.2. Protocolo para marcao de receptores de superfcie e de apoptose ............ 97
10. Aquisio de amostras.................................................................................................... 99
11. Anlise de dados............................................................................................................. 102
12. Referncias Bibliogrficas ............................................................................................ 105
Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho
CAPTULO 1. MECANISMOS DE RESPOSTA IMUNE S DOENAS

INFECTOPARASITRIAS: IMUNIDADE INATA E ADAPTATIVA
Amanda Torrentes de Carvalho & Grazielle Alves Ribeiro
1.1. Caracterizao das diferentes subpopulaes de leuccitos
As clulas sanguneas, os leuccitos ou glbulos brancos, assim como os precursores

das hemcias, os eritrcitos que transportam oxignio, e os megacaricitos, que originam as
plaquetas envolvidas no processo de coagulao, derivam do mesmo precursor presente na
medula ssea as clulas tronco-hematopoiticas pluripotentes. Durante a hematopoiese,
essas clulas pluripotentes respondem a estmulos provenientes do meio que promovem a sua
diferenciao em dois tipos celulares mais especializados: um progenitor da linhagem
linfide, que dar origem aos linfcitos T e B, responsveis pela imunidade adaptativa; e um
progenitor mielide, que gera outros diferentes tipos de leuccitos como os moncitos,
neutrfilos, basfilos e eosinfilos; os eritrcitos e os megacaricitos. A maturao e a
ativao de alguns tipos celulares podem tambm ser finalizadas em outros tecidos e rgos,
como por exemplo, o desenvolvimento dos linfcitos T ocorre no timo.
Ao longo da maturao e da diferenciao, as clulas perdem algumas molculas de
superfcie e adquirem outras. Algumas molculas podem tambm estar presentes em maior ou
menor quantidade, dependendo da etapa de diferenciao da clula. A caracterizao destas
molculas, padres diferenciais de expresso antignica, ou at mesmo alteraes a nvel
morfolgico, possibilitam a reconstruo de uma via de maturao das clulas
hematopoiticas. O cluster (agrupamento) de diferenciao (cluster de designao), abreviado
como CD, um protocolo utilizado para a identificao e investigao de molculas de
superfcie celular presente nos leuccitos. O CD pode ser utilizado para identificar as
subpopulaes celulares e suas possveis diferenciaes. Essas molculas podem agir de
vrias maneiras, muitas vezes atuando como receptores ou ligantes (molculas que ativam um
receptor), importantes para a clula (Figura 1.1). Alm disso, possuem um importante papel
em desencadear a diferenciao, proliferao, ativao, migrao e morte celular.
10
Figura 1.1. Perfil de expresso dos antgenos CDs durante a hematopoise. Ao longo do processo de maturao e
diferenciao, as clulas expressam diferentes molculas de superfcie.
11
As clulas e molculas responsveis pela imunidade formam o Sistema Imunolgico,

e sua resposta coletiva e coordenada introduo de substncias estranhas chamada de
resposta imunolgica.
A funo fisiolgica do sistema imune a defesa contra microorganismos
infecciosos ou substncias estranhas. A imunidade protetora contra microorganismos
mediada pelas reaes iniciais da Imunidade Inata e pelas respostas posteriores da Imunidade
adquirida.
1.2. Imunidade Inata
As doenas infecciosas ocorrem quando um microorganismo capaz de evadir a

defesa inata do hospedeiro com sucesso para estabelecer um stio de infeco e replicao que
permita sua transmisso. A imunidade inata muitas vezes comparada linha de frente de
defesa do hospedeiro. Ela composta por barreiras naturais, como superfcies epiteliais,
clulas imunes e molculas solveis que existem independentemente do estabelecimento de
uma infeco. Quando um microorganismo atravessa a barreira epitelial, entra nos tecidos e
comea a se replicar, ou cai na circulao, na maioria dos casos ele imediatamente
reconhecido por clulas residentes nos tecidos ou no sangue (Figura 1.2).
Protenas do sistema complemento extravasam para os tecidos infectados, so
ativadas e ligam-se a superfcie dos patgenos levando-os lise. Essas protenas tambm
marcam os patgenos para serem reconhecidos por receptores para complemento em
fagcitos profissionais (opsonizao). Ao reconhecer microorganismos opsonizados os
fagcitos promovem a sua destruio. Algumas protenas do complemento tambm conectam
a imunidade inata adaptativa.
Os macrfagos, assim como os neutrfilos, so clulas cuja funo primria
identificar, ingerir e destruir microorganismos. Os macrfagos esto estrategicamente
posicionados nos locais de entrada dos microorganismos no hospedeiro. O estmulo para a sua
ativao vem do reconhecimento de antgenos atravs de receptores (receptores do tipo Toll) e
de molculas secretadas por outras clulas da imunidade inata, como as clulas Natural Killer
(NK). Alm de fagocitar e destruir o parasito endocitado, os macrfagos tambm apresentam
peptdeos desse patgeno para os linfcitos T CD4+ atravs de molculas do complexo
principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II, expressas em sua superfcie. Assim
como nas clulas dendrticas, essa apresentao importante para a induo de respostas
efetoras mais especficas do macrfago, como produo de substncias microbicidas e
12
mediadores inflamatrios que estimulam a ativao de mais fagcitos, a ativao de funes

citotxicas nas clulas NK, a induo da migrao celular para o local da infeco e a
ativao e estimulao de outros tipos de leuccitos, como os linfcitos, que tem um
importante papel na imunidade adaptativa.
Figura 1.2. Resposta imune inata. Componentes e vias efetoras da resposta imune natural na defesa do hospedeiro
contra microorganismos infecciosos.
As clulas dendrticas e os macrfagos, responsveis pela apresentao dos antgenos

dos microorganismos para os linfcitos T CD4+, so denominadas Clulas Apresentadoras de
Antgenos (APCs). Essas APCs, com o parasito fagocitado, migram para os rgos linfides
secundrios e apresentam os antgenos do parasito aos linfcitos T CD4+, no contexto do
MHC classe II. Clones de linfcitos especficos ao antgeno apresentado se expandem e
preparam o sistema imune adaptativo para responder de forma mais apropriada, de acordo
com a caracterstica de infeco: parasitismo intracelular (respostas do tipo Th1) ou
extracelular (respostas do tipo Th2).
Assim como nos macrfagos, o reconhecimento do patgeno pelas clulas dendrticas
ativa vias de produo de citocinas que inibem a replicao do parasito e atuam na
inflamao.
13
As clulas NK, que reconhecem clulas infectadas que perderam a expresso de

molculas do MHC de classe I, produzem citocinas que tambm ativam fagcitos. Suas
funes efetoras promovem a destruio de clulas infectadas atravs de substncias que
induzem a morte celular.
1.3. Imunidade Adaptativa, Adquirida ou Especfica
Quando os microorganismos desenvolvem maneiras de burlar os mecanismos

protetores da imunidade inata, tornam-se necessrios mecanismos de defesa mais especficos
para conter a infeco. Alm da imunidade inata ou natural, que atua de forma inespecfica
sobre diferentes microorganismos, o sistema imunolgico possui tambm a imunidade
adaptativa, adquirida ou especfica, que se baseia no reconhecimento especfico de
substncias estranhas associadas ou no a superfcies celulares.
Ao contrrio da imunidade natural, cuja resposta se desenvolve de maneira imediata,
a imunidade adquirida responsvel por mecanismos especficos que demoram alguns dias
para se estabelecer. A resposta imune adquirida formada por linfcitos e anticorpos, que so
altamente especficos. As substncias estranhas que induzem e so o alvo das respostas
especficas so chamadas antgenos.
O termo imunidade adaptativa deve-se ao fato de que os mecanismos de defesa,
desenvolvidos em resposta a um agente infeccioso, aumentam em magnitude e capacidade
defensiva em cada exposio sucessiva, adaptando-se a essa infeco. A imunidade adaptativa
apresenta tambm
grande especificidade,
podendo
distinguir entre os
diferentes
microrganismos e molculas, sendo tambm chamada de imunidade especfica.

A imunidade especfica pode ser desencadeada atravs da imunidade ativa ou atravs
da imunidade passiva. Quando a resposta a um determinado microorganismo ocorre como
reao a um antgeno, sendo produzida pelo prprio indivduo, ela chamada de imunidade
ativa. Quando a imunidade a um antgeno conferida pela transferncia de anticorpos ou
clulas de um indivduo imunizado para um receptor que se tornar resistente a determinado
antgeno mesmo sem ter sido exposto a ele, ela chamada de imunidade passiva.
Os linfcitos so as principais clulas da resposta imune adquirida, sendo os
responsveis por sua especificidade, uma vez que reconhecem at sutis diferenas entre os
variados tipos antgenos. Quando os receptores de superfcie para antgenos so expressos,
durante a maturao, eles se tornam responsivos estimulao antignica e se desenvolvem
14
em diferentes classes funcionais. Existem dois tipos de respostas imunes adquiridas, a

imunidade celular e a imunidade humoral, que possuem componentes imunolgicos distintos.
1.3.1. Caractersticas da Imunidade Adaptativa
A imunidade adquirida apresenta caractersticas fundamentais que a difere da

imunidade natural. A resposta imune adquirida apresenta alta especificidade a um
determinado antgeno ou at mesmo a determinadas pores deste antgeno. As pores
reconhecidas especificamente pelos linfcitos so chamadas de determinantes ou eptopos.
Essa especificidade deve-se aos receptores presentes na membrana dos linfcitos, que so
capazes de reconhecer diferenas mnimas na estrutura dos antgenos. O sistema imunolgico
capaz de reconhecer milhares de antgenos diferentes devido a enorme diversidade do seu
repertrio linfocitrio. A resposta imune adquirida apresenta tambm a capacidade de
memria. Quando o sistema submetido a um determinado patgeno, as clulas utilizadas em
sua eliminao permanecem viveis por longos perodos, podendo reagir novamente, de
forma mais rpida e eficiente, no caso de uma segunda infeco com o mesmo patgeno. A
imunidade adquirida autolimitante. Uma vez eliminado o antgeno que disparou o processo
imune, as respostas imunolgicas tendem a cessar, de forma que o organismo retorne ao seu
estado basal, num processo chamado de homeostasia (Figura 1.3). O sistema imunolgico
tambm caracterizado por sua tolerncia a antgenos prprios. Embora seja capaz de
reconhecer e eliminar antgenos estranhos, o sistema imunolgico apresenta mecanismos de
controle que inibem respostas contra antgenos do prprio hospedeiro, prevenindo assim a
ocorrncia de doenas auto-imunes.
Figura 1.3. A resposta

imune adquirida apresenta alta especificidade
(antgenos A e B
induzem a produo de
diferentes anticorpos),
memria (a resposta
secundria ao antgeno
A mais rpida e maior
que a resposta primria)
e altolimitao (os nveis
de anticorpos declinam
ao longo do tempo).
15
1.3.2. Imunidade Celular
A imunidade celular atua no combate a microorganismos intracelulares, que no

interior das clulas do hospedeiro ficam inacessveis a ao dos anticorpos circulantes
provenientes da resposta humoral. A imunidade celular mediada pelos linfcitos T, que
possuem receptores para antgenos em suas membranas, chamados de TCR (receptor da clula
T). O reconhecimento de antgenos pelos linfcitos T depende da presena desses antgenos
na membrana de clulas em associao a protenas do complexo de histocompatibilidade
principal (MHC) e de molculas co-estimulatrias. Dessa forma, os linfcitos T respondem
somente a antgenos associados superfcie celular, no podendo responder antgenos
solveis. Os linfcitos T se subdividem em duas subclasses: os linfcitos T auxiliares ou T
helper (Th) e os linfcitos T citotxicos (CTL). Os linfcitos T auxiliares apresentam em suas
superfcies o marcador CD4 enquanto os linfcitos T citotxicos apresentam o marcador CD8.
A forma de resposta dessas clulas frente a antgenos de superfcie bastante diferente. Os
linfcitos T citotxicos (CD8+) realizam a lise das clulas que possuem antgenos estranhos,
como clulas infectadas por patgenos intracelulares (Figura 1.4).
Figura 1.4. As clulas TCD8+ reconhecem peptdeos antignicos de microorganismos fagocitados associados a MHC
de classe I e destroem as clulas.
Os linfcitos T auxiliares (CD4+), por sua vez respondem aos antgenos secretando
citocinas que disparam o processo inflamatrio e ativam diferentes tipos celulares. Aps o
reconhecimento de algum antgeno estranho associado ao MHC de alguma APC pelas clulas
T CD4+, elas tornam-se ativadas, expandem-se em vrios clones e diferenciam-se, para que o
combate ao antgeno estranho seja efetivado. A populao de clulas T CD4+ heterognea,
podendo se diferenciar em dois subconjuntos principais: as clulas Th1 e Th2, que produzem
um perfil de citocinas distinto um do outro (Figura 1.5).
16
Figura 1.5. Diferenciao das clulas TCD4+ frente exposio ao antgeno. As clulas TCD4+ podem se diferenciar
em subpopulaes distintas, principalmente Th1 e Th2 em resposta ao antgeno, aos co-estimuladores e s citocinas.
Ambas as respostas, Th1 e Th2, so importantes na defesa do hospedeiro contra

infeces. A resposta Th1 est relacionada com a defesa contra protozorios, bactrias
intracelulares e vrus, enquanto a resposta Th2 mais efetiva contra helmintos e bactrias
extracelulares. Os linfcitos Th1 secretam principalmente Fator de necrose Tumoral (TNF),
Interleucina-2 (IL-2) e Interferon-gama (IFN-). O IFN- age nos macrfagos para aumentar a
fagocitose e a destruio de microorganismos fagocitados. Nos linfcitos B, o IFN- estimula
a produo de Imunoglobulinas G (IgG) que opsonizam microorganismos para a fagocitose,
importante ativador de macrfagos. O TNF importante para a ativao dos neutrfilos e
conseqentemente para a estimulao do processo inflamatrio. Os linfcitos Th2, por sua
vez, produzem principalmente IL-4, IL5, IL10 e IL-13, perfil de citocinas que estimula a
diferenciao de linfcitos B em plasmcitos, direcionando para a imunidade humoral
(dependente de anticorpos). A IL-4 estimula a produo de IgE, que se liga a mastcitos. A
IL-5 ativa os eosinfilos, resposta importante na defesa contra infeces helmnticas. Essas
respostas so antagnicas, uma vez que o IFN- modula negativamente a resposta Th2, e a IL4e a IL-10 modulam negativamente a resposta Th1, possibilitando uma resposta imune
balanceada (Figura 1.6).
IMPORTANTE: A identificao das diferentes subpopulaes de linfcitos T foi possvel

somente aps a descoberta de que essas clulas apresentam protenas de membrana distintas
em suas superfcies. Essas protenas constituem os marcadores fenotpicos das diferentes
subpopulaes linfocitrias, sendo chamadas de CDs. Os CDs so molculas que podem ser
reconhecida por anticorpos monoclonais. A identificao dos diferentes tipos de linfcitos
pode ser feita por citometria de fluxo de acordo com os seus marcadores de superfcie.
17
Figura 1.6. Funes efetoras das clulas Th1 e Th2. As clulas Th1 e Th2 produzem diferentes tipos de citocinas, que
ativam diferentes vias de resposta imune. A resposta produzida por Th1 mais efetiva no combate microorganismos
intracelulares, enquanto a resposta produzida por Th2 eficaz no combate de patgenos extracelulares.
18
1.3.3. Imunidade Humoral
A imunidade humoral mediada por molculas (imunoglobulinas) presentes no

sangue, chamadas de anticorpos, que so produzidas e secretadas pelos linfcitos B em
resposta a um estmulo antignico. As imunoglobulinas ligam-se especificamente aos
determinantes eptopos antignicos presentes em um antgeno, desencadeando suas funes
efetoras. Elas constituem o principal mecanismo de defesa contra microorganismos
extracelulares e suas toxinas. Os anticorpos reconhecem antgenos microbianos, interrompem
a ao dos microorganismos infecciosos e sinalizam para o organismo a necessidade de
remoo deste patgeno. Diferentes tipos de anticorpos podem ativar mecanismos efetores
diferentes. Os anticorpos podem atuar como opsoninas, ativando o sistema do complemento,
que por sua vez induz a lise do microorganismo, ou desencadeando o processo de fagocitose
(Figura 1.7).
Figura 1.7: Funes efetoras dos anticorpos. Os anticorpos contra microorganismos infecciosos neutralizam esses
agentes, opsonizando-os para a fagocitose ou para a citotoxicidade celular dependente de anticorpo e ativam o
complemento.
19
Estruturalmente as molculas de anticorpo possuem um formato em Y e so

compostas por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves ligadas por pontes dissulfeto. Cada
cadeia de imunoglobulina, tanto a leve quanto a pesada, formada a partir de segmentos
gnicos que se rearranjam em uma seqncia especfica para constituir a cadeia completa,
formando as regies varivel e constante das mesmas.
Os braos da imunoglobulina so compostos pelas cadeias leves e pela regio
varivel das cadeias pesadas (poro Fab). A regio varivel tanto da cadela leve quanto da
pesada participa no reconhecimento dos antgenos especificidade.
Nas cadeias pesadas, as pores constantes interagem com outras molculas efetoras
e clulas do sistema imune, participando assim como mediadora da maioria das funes
biolgicas dos anticorpos (regio Fc). Existem cinco tipos diferentes de cadeias pesadas que
formam regio Fc da imunoglobulina e que definem as classes ou isotipos IgA, IgG, IgD, IgE
e IgM. As funes efetoras das imunoglobulinas so mediadas por esta regio da molcula.
Cada classe de anticorpo desempenha uma funo efetora distinta na imunidade diferentes
patgenos (Figura 1.8).
Cadeias leves
Cadeias pesadas
Regio de ligao de
antgenos
Regio Fab
Regio Fc
Figura 1.8. Estrutura de uma molcula de anticorpo. A imunoglobulina apresenta uma regio varivel de cadeia leve e
pesada (Regio Fab) que atua no reconhecimento dos antgenos. As pores constantes da cadeia pesada (Regio Fc)
interagem com clulas efetoras do sistema imune, mediando diferentes funes biolgicas dos anticorpos.
20
IMPORTANTE: As IgGs so imunoglobulinas capazes de desempenhar todas as funes

conferidas aos anticorpos. a mais abundante no soro e est igualmente distribuda nos
compartimentos extracelulares, alm de ser a nica que normalmente atravessa a placenta. A
IgG a principal imunoglobulina produzida nas respostas humorais secundrias patgenos.
Alm disso, as molculas de IgG, tem uma alta afinidade para neutralizar partculas virais .
Todas as caractersticas citadas acima tornam a IgG o anticorpo mais explorado em estudos de
imunofenotipagem aplicados a citometria de fluxo .
1.4. Produo de Anticorpos Monoclonais
A produo e caracterizao de anticorpos foram radicalmente alteradas em 1975

quando Khler & Milstein descreveram a tcnica de produo de anticorpos monoclonais
utilizando a fuso de linhagens de clulas de carcinoma e de linfcitos B revolucionando a
utilizao de anticorpos em metodologias como imunofluorescncia, hibridizao in situ e
citometria de fluxo. Essa tcnica foi denominada hibridoma.
Os anticorpos que reconhecem apenas um nico antgeno so denominados de
monoclonais. Eles so produzidos e secretados por um nico clone de linfcitos B antgenoreativos. Alguns anticorpos podem reconhecer diferentes antgenos e, portanto ser produzidos
a partir de clones distintos. Esses anticorpos so chamados policlonais. Ambos os anticorpos,
monoclonais e policlonais, presentes no soro podem ser utilizados em ensaios de
imunofenotipagem. Os anticorpos monoclonais so quimicamente idnticos. Eles tm a
vantagem de possuir uma alta especificidade e afinidade ao antgeno. Os anticorpos
monoclonais so os mais usados em pesquisa, em diagnstico clnico e terapia.
Para a produo de anticorpos monoclonais comercialmente, utilizam-se ensaios de
cultura de hibridomas formados por linfcitos B antgeno-especficos e clulas obtidas de
tumores. Nesse estudo camundongos so desafiados com um antgeno X. As clulas
esplnicas secretoras de anticorpos (clulas B antgeno especficas) so adquiridas do bao
desses animais e cultivadas em meio HAT com um inibidor que bloqueia vias normais de
biossntese de nucleotdeos. Dessa forma, as clulas normais utilizam uma via alternativa para
sintetizar seus cidos nuclicos. Essa via defectiva em linhagens de clulas tumorais que,
portanto morrem em cultura com meio HAT. Para se produzir uma fonte contnua de
anticorpos as clulas normais esplnicas so fundidas com clulas de mieloma, gerando
hbridos, e cultivadas in vitro em microplacas. As clulas hbridas passam a expressar o gene
envolvido com essa via alternativa de produo de aminocidos e, portanto, apenas as clulas
21
tumorais fundidas com as clulas B antgeo-reativas esplnicas conseguem sobreviver e

crescer continuamente nesse tipo de meio de cultura. Os sobrenadantes de poinhos de cultura
contendo hibridomas individuais so colhidos e submetidos a ensaios de imunodeteco de
anticorpos. As clulas reativas ao antgeno X so clonadas. Esses clones de hbridos so ento
expandidos em escala industrial produzindo-se uma grande quantidade de um determinado
anticorpo monoclonals. Como eles descendem de um nico tipo de clula especfica, todas as
clulas da linhagem desse hibridoma geram anticorpos monoclonais especficos (Figura 1.9).
IMPORTANTE: As comunicaes entre diferentes clulas da imunidade inata so

importantes para o reconhecimento do tipo de patgeno invasor, assim como para o
desencadeamento das funes efetoras para a eliminao do agente infeccioso. Essas
sinapses imunes ocorrem atravs do reconhecimento de molculas solveis que modulam a
inflamao, as citocinas, por diferentes receptores expressos nessas clulas. Atravs da
citometria de fluxo possvel identificar essas citocinas intracelulares, utilizando-se
marcadores especficos. Alm disso possvel avaliar qual a clula produtora de determinada
citocina atravs da marcao de superfcie, que caracteriza fenotipicamente as populaes
celulares.
Figura 1.9. Produo de anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais so produzidos a partir de ensaios de
cultura de hibridomas, formados por linfcitos B antgeno-especficas e clulas obtidas de tumores.
22
1.5. Morte celular programada: Apoptose
A morte celular um evento essencial na vida normal dos organismos, nas respostas
imunes frente a infeces causadas por uma variedade de microorganismos infecciosos ou nos
eventos patofisiolgicos que desencadeiam a doena. A nomenclatura clssica distingue duas
principais formas de morte celular: apoptose e a necrose.
A necrose a morte celular acidental em tecidos ou rgos. Ela compreende um
evento patofisiolgico que evolui por uma conseqente interrupo dos processos celulares.
Agentes fsicos, qumicos ou infeces podem origin-la. Esses agentes comprometem o
metabolismo celular, a integridade da membrana celular e a manuteno da capacidade de
multiplicao celular. Todos esses eventos culminam na perda da homeostase celular, de
forma que a clula perde a sua vitalidade. Dessa forma, a necrose abrange alteraes
regressivas que provocam leses irreversveis na clula. O tecido morto ou necrosado
ingerido e degradado pelos fagcitos, que atuam na limpeza do tecido danificado e na cura da
leso.
A apoptose, diferente da necrose, uma morte celular gentica, biologicamente
programada sem a perda da integridade de membrana celular e aparentemente
compartilhada por todos os organismos multicelulares, tendo sido descrita tambm em alguns
organismos unicelulares. Ela consiste em um mecanismo pelo qual as clulas com DNA
danificado podem ser eliminadas sem gerar prejuzo, atravs da fagocitose dos corpos
apoptticos. Tal processo culmina na ativao de uma cadeia enzimtica complexa de
sistemas de sinalizao intracelular, que levam destruio de componentes essenciais
sobrevivncia das clulas. Ela ocorre em resposta a uma variedade de sinais e estmulos, tanto
intra como extracelulares, incluindo deficincia de fatores de crescimento, hormnios,
citocinas, ativao de receptores de morte e proteases endgenas, pela interao via granzima
B/perforinas utilizadas por clulas do sistema imune ou ainda por agentes virais, qumicos ou
fsicos.
23
1.5.1. Caractersticas morfolgicas e bioqumicas da apoptose
Ao nvel celular, a apoptose caracterizada pela compactao e marginalizao da

cromatina nuclear e, posteriormente, citoplasmtica, com formao dos corpos apoptticos
contendo organelas ntegras. Esses corpos so fagocitados pelas clulas ao redor e
degradados. Sabe-se que as clulas hematopoiticas normais possuem uma disposio
assimtrica dos fosfolipdios de membrana. A fosfatidilcolina e esfingomielina, localizam-se
preferencialmente parte externa da membrana, enquanto a fosfatidiletanolamida e a
fosfatidilserina compes sua poro interna. No decorrer do processo apopttico ocorre a
perda dessa assimetria e a exposio da fosfatidilserina na superfcie externa da clula. Em
relao bioqumica, o que ocorre, inicialmente, independente do estmulo desencadeador,
a clivagem do DNA de dupla hlice nas regies de ligao dos nucleossomos. Com isso, h
uma produo de mltiplas cadeias de pares de bases. Este processo de clivagem feito por
endonucleases endgenas e estritamente controlado por vrios genes, como a famlia dos
genes Bcl-2 e a famlia dos genes ativadores de endonucleases (Figura 1.10).
Citoplasma
Citoplasma
Ncleo
Ncleo
C lula Vi
Vivel
Clula Apopt
Apopttica
Fosfatidilserina
Figura 1.10: Alteraes morfolgicas e nucleares em clulas apoptticas. As clulas em apoptose sofrem uma retrao,
com projees digitiformes da membrana celular e formao de corpos apoptticos. A nvel nuclear ocorre
fragmentao da membrana nuclear, condensao da cromatina e fragmentao do DNA pela ao de endonucleases
(A). A nvel de membrana plasmtica ocorre a externalizao da fosfatidilserina, porm sem perda de integridade de
membrana (B).
24
1.5.2. Vias de sinalizao da apoptose

O processo de apoptose pode ser engatilhado por duas vias. A forma pela qual a
clula responde morte pode ser atravs do ambiente (via extrnseca/receptores de morte) ou
por sinais internos, que induzem a ativao do processo apopttico (via intrnseca/via
mitocondrial). Independente de como ela iniciada, a apoptose resulta na ativao de uma
classe especfica de cistena-proteases, as caspases (que se encontram na sua forma inativa
pr-caspases), de extrema importncia, pois clivam protenas celulares que culminam na
desestruturao celular. As caspases so divididas em dois grupos, aquelas denominadas
iniciadoras, envolvidas nos eventos iniciais reguladores da apoptose, e as efetoras, que so
proteoliticamente ativadas em uma cascata conduzindo desintegrao celular (Figura 1.11).
Figura 1.11. Vias de sinalizao da Apoptose. Tipo 1: Seguindo a trimerizao dos receptores de morte e o
recrutamento das protenas adaptadoras, pr-caspases, so tambm recrutadas e ativadas. A caspase 8 ativa a caspase
3 conduzindo a desintegrao celular. Tipo 2: A caspase 8 tambm cliva Bid em Bidt, que translocado para a
mitocndria modulando a permeabilidade mitocondrial e promovendo a liberao do citocromo c, que induz a Apaf-1
e a pro-caspase 9 para ativar a caspase 9 e 3. Seguindo o sinal de morte, ptn da famlia do gene Bcl-2 associadas a
mitocndria so reguladas levando a liberao de mediadores que promovem a amplificao da cascata apopttica.
Alm das vias de sinalizao que culminam na apoptose vrios outros mecanismos regulatrios existem para inibir a
morte celular. Dentre esses podemos citar o papel das IAPS e protenas anti-apoptticas da famlia Bcl-2.
25
1.5.2.1. Via extrnseca
O principal evento pelo qual se origina a apoptose consiste na transduo de um sinal

atravs de receptores de morte. A via extrnseca ativada quando TNF-, Fas ligante ou
TRAIL, ligam-se a seus respectivos receptores, que fazem parte da famlia dos receptores
TNF (TNFR)/TNF: TNFR1, TRAIL-R1/2 e Fas (CD95/APO-1). Quando estimulados, eles
so recrutados para a superfcie e trimerizam-se juntamente com protenas adaptadoras
citoplasmticas associadas a eles. A formao desse complexo promove ativao das
caspases efetoras que, no citosol, induzem uma srie de clivagens proteolticas, culminando
na ativao da caspase-3 efetora. Quando ativada, essa caspase promove a ativao de
protenas importantes que induzem danos ao DNA.
IMPORTANTE: Os receptores de morte tambm estimulam, atravs de protenas

adaptadoras, sinais antiapoptticos. Quando ativados por essa via antiapopttica, fatores de
transcrio so translocados para o ncleo e ativam a expresso de genes, incluindo as IAPs,
protenas que inibem a atividade da caspase 8.
1.5.2.2. Via intrnseca
Os mecanismos moleculares envolvidos na ativao da via intrnseca apopttica

ainda no esto totalmente esclarecidos. Eles so induzidos por toxinas ou estresse causado
por carncia de fatores de crescimento, instabilidade genmica, privao de energia,
patgenos, dano ao DNA causado por drogas ou UV.
A famlia dos genes Bcl-2 representa um fator chave na via de apoptose intrnseca.
Ela codifica duas classes de protenas: aquelas com atividade anti-apopttica (por exemplo,
Bcl-2 e Bcl-xl) e as com atividade pr-apopttica (por exemplo, Bid e Bax). Essas protenas
podem estar associadas a membranas de organelas ou no citosol. Quando ativadas, as
protenas da famlia Bcl-2 tm a capacidade de induzir ou inibir a permeabilidade de
membrana. A membrana mitocondrial local de muitos dos membros da famlia Bcl-2 e seu
papel ativo no programa mitocondrial de apoptose implica que eles sejam parte do mecanismo
efetor de morte baseado nesta organela. O aumento da permeabilidade mitocondrial e
conseqentes alteraes no potencial de membrana mitocondrial (m) vm sendo
relacionados com os eventos iniciais que envolvem todo o sistema apopttico intrnseco.
Quando sinais de morte alcanam a mitocndria, ocorre o colapso do m, bem como a uma
26
transio da permeabilidade mitocondrial, em parte pela interao das protenas prapoptticas da famlia Bcl-2 que formam canais ou poros na membrana mitocondrial. Esses
mecanismos culminam na liberao de protenas do espao intermembranar, como
citocromo C, para o citoplasma. A funo do citocromo C consiste em modular a ativao da
caspase 9, localizada em um complexo formado no citoplasma conhecido como apoptossomo.
A caspase 9 ativada induz a ativao da caspase 3 efetora, culminando na desintegrao
celular.
IMPORTANTE: Protenas com funes pr-apoptticas tambm so liberadas pelos poros

formados na membrana da mitocndria, como a Smac/DIABLO, que bloqueia as XIAPs,
protenas inibidoras de apoptose.
As clulas desenvolveram vrios mecanismos regulatrios para inibir a apoptose.

Protenas anti-apoptticas da famlia Bcl-2 compreendem um desses. O proto-oncogene Bcl-2
foi o primeiro membro da famlia Bcl-2 a ser descoberto. O gene codifica a protena Bcl-2,
expressa constitutivamente em todas as clulas hematopoiticas e linfides, alm de muitas
clulas epiteliais. Ela, assim como as outras protenas dessa famlia com funo antiapopttica, inibe direta ou indiretamente a formao de poros na membrana mitocondrial e,
portanto, protege a clula da apoptose. Sua expresso inapropriada est correlacionada com o
crescimento neoplsico (aumento de expresso) ou apoptose desregulada (diminuio de
expresso).
IMPORTANTE: A caspase 8 tambm cliva uma protena citoslica, a p22 Bid, em uma
forma truncada (Bidt). A Bidt tem um importante papel, pois interconecta tanto a via
extrnseca quanto a intrnseca apopttica. Na via extrnseca, a permeabilizao da membrana
mitocondrial serve como uma ala amplificadora da ativao de caspases efetoras.
27
1.5.3. Papel da apoptose no sistema imune
Fisiologicamente a apoptose est envolvida em diversos processos, como na

renovao e remodelamento tecidual, durante o desenvolvimento e metamorfose em animais
multicelulares, e na seleo intratmica dos linfcitos T.
Durante o desencadeamento das respostas efetoras a apoptose tem um papel essencial
tanto na imunidade inata quanto adaptativa. As clulas apoptticas sofrem algumas mudanas
a nvel de membrana celular e so rapidamente reconhecidas e ingeridas pelos fagcitos. A
clula ingerida completamente degradada e digerida pelos fagcitos sem a induo de
inflamao em decorrncia da morte celular. Durante as respostas citotxicas os linfcitos T
CD8, atravs da ao dos grnulos, induzem a ativao de enzimas (nucleases) que promovem
a destruio do DNA celular. Os mecanismos apoptticos tambm podem agir diretamente
sobre agentes patognicos, culminando por exemplo, na destruio do DNA viral e evitando,
assim, a montagem dos vrions e sua liberao.
1.5.4. Apoptose nas doenas infecto-parasitrias
A morte celular programada um mecanismo freqentemente dominante durante os

processos patolgicos. A apoptose um fator regulatrio do sistema imune, fundamental na
resposta imune em infeces causadas por uma variedade de agentes infecciosos. Interferir no
mecanismo de apoptose, inibindo-a ou estimulando-a, pode representar uma estratgia eficaz
do microorganismo para escapar do sistema imunolgico e garantir sua sobrevivncia e
replicao. Um exemplo so as alteraes fenotpicas induzidas por diferentes
microorganismos patognicos em clulas infectadas, escondendo essas clulas da morte por
citotoxicidade de linfcitos T e tornando-as importantes reservatrios de replicao do
patgeno. A apoptose induzida pelo parasito pode tambm facilitar sua disseminao no
organismo atravs da fagocitose de clulas infectadas Cavalo de Tria.
Por outro lado, a apoptose pode representar um mecanismo de resposta apropriado
para limitar o alastramento da infeco no hospedeiro. Os produtos da replicao de um
parasito intracelular, por exemplo, so freqentemente associados a alteraes nas vias de
biossntese de protenas em clulas do hospedeiro infectadas. Algumas vezes essas mudanas
tornam-se importantes para ativar a apoptose de clulas infectadas, na tentativa de conter a
infeco. Alm disso, moduladores inflamatrios induzidos podem tambm interferir nos
mecanismos de morte celular levando a destruio de clulas infectadas.
28
1.6. Citometria na Imunologia
O sistema imunolgico tem como funo bsica promover a defesa contra

microorganismos infecciosos e substncias estranhas. Para desencadear suas funes diversas
clulas leucocitrias so estimuladas, ativadas, se proliferam e produzem uma gama de
mediadores moleculares, desencadeando respostas efetoras importantes para combater a
infeco. Como apresentado, o sistema imune age atravs de dois mecanismos: a imunidade
inata e a adaptativa (Tabela 1.1).
As aplicaes da citometria na Imunologia so diversas, incluindo:
Separao de clulas sanguneas;
Diferenciao de subpopulaes de leuccitos;
Quantificao antignica;
Variaes linfoproliferativas;
Fagocitose;
Apoptose.
Tabela 1.1: Caractersticas gerais do sistema imune
Inata
Adaptativa
Reconhecimento
PAMP (Patterns of Pathogen-associated

Molculas como DNA microbial, lipdeos,
polissacardeos e protenas do flagelo de
bactrias)
Determinantes (epitopos) antignicos

especficos
Desenvolvimento
Rpido, imediato
Demorado (1-2 semanas)
Mensageiros
Citocinas
Citocinas
Memria
No ?
Sim, duradoura
Apresentao antignica
Reconhecimento direto pelos receptores

do tipo Toll ou outros
Processamento, sinapse:
Anticorpo Humoral
Medida por clula
Citotxica
Auxiliar
Clulas
Fatores solveis
Sistema
Macrfagos/moncitos
Clulas B (RI humoral)
Clulas dendrticas
C lulas NK
Fagcitos (neutrfilos, eosinfilos,
mastcitos e basfilos)
Molculas do sistema complemento e
citocinas
Clulas T (RI celular)

clulas T CD4
clulas T CD8
Aparentemente simples, reconhecimento

e resposta rpida e direta
Reconhecimento e resposta altamente

complexa
citocinas
29
CAPTULO 2. HISTRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO

Raquel Ferraz
2.1. Introduo
A citometria de fluxo pode ser definida como metodologia, tecnologia e/ou

ferramenta direcionada ao estudo de clulas, e utilizada na identificao, avaliao, e
diferenciao de diversas caractersticas celulares como contedo de DNA e RNA, receptores
de superfcie, atividade enzimtica, produo de citocinas e de ons. Baseia-se na deteco de
substncias fluorescentes (fluorocromos) acoplados a anticorpos, capazes de se ligar a
determinada molcula presente nas clulas - avaliadas uma a uma. Alm disso, a citometria de
fluxo permite ainda a separao rpida e purificada de uma suspenso heterognea de clulas
processo denominado Sorting.
O princpio bsico da citometria resume-se no emprego de uma radiao laser
direcionada, que excita substncias fluorescentes (fluorocromos) presentes nas clulas, atravs
das quais podemos interpolar informaes biolgicas, moleculares e/ou qumicas das clulas
em suspenso. Estas clulas marcadas so ento transportadas e protegidas por um fluxo
hidrodinmico contnuo (soluo salina), que acomoda as mesmas, de forma que
individualmente sejam interceptadas pelo laser. Ao ser excitado pela radiao do laser, o
fluorocromo emite luz, que dependendo do comprimento de onda, possui uma cor
caracterstica. Os sistemas ticos (espelhos) e eletrnicos, coletam, filtram e convertem em
pulsos eltricos os parmetros de disperso de luz e fluorescncia emitidos. A aquisio
destes parmetros se d atravs de um sistema computacional especfico, permitindo ainda
que o usurio interaja com a mquina e controle as funes da mesma (Figura 2.1). A seguir,
os pulsos eltricos so convertidos em dados digitais ou analgicos, enviados a um
computador e avaliados em software especfico capaz de reproduzir atravs de grficos mono
e biparamtricos, informaes fsicas, qumicas e biolgicas de cada clula, em funo da
intensidade de fluorescncia e da luz dispersada.
30
Figura 2.1. Citmetro de fluxo padro. Cmara de fluxo, para onde a suspenso aspirada;.sistema de espelhos e
foto-sensores para direcionamento e captao de luz, sistema computacional para a converso em dados digitais e
anlise.
2.2. Como iniciou este estudo?
Especialistas de diversas reas (como biologia, engenharia, cincia da computao,

biologia molecular, fsica e matemtica) atravs de tcnicas cientficas e do constante e
crescente interesse em aprimorar as mesmas, contriburam para o surgimento do primeiro
citmetro de fluxo e para o desenvolvimento destes equipamentos at os dias atuais.
A histria da citometria de fluxo pode ser contada a partir da inveno do
microscpio tico; seguido dos corantes, que permitiram a visualizao de constituintes
celulares; e das substncias fluorescentes acompanhadas do surgimento do microscpio de
fluorescncia. O desenvolvimento dos anticorpos monoclonais associado ao uso das
substncias fluorescentes possibilitou uma maior especificidade na identificao dos
componentes celulares, com conseqente classificao mais detalhada das clulas.
Posteriormente, o surgimento do laser, o desenvolvimento eletrnico, e a revoluo da
informtica computacional foram fundamentais para a evoluo destes equipamentos.
A inveno do microscpio no sculo XVII foi seguida da descoberta das clulas
sanguneas, que por sua vez, despertou o interesse dos pesquisadores em saber o nmero
destas clulas.
Neste cenrio iniciou-se uma srie de estudos e descobertas, que ao serem associadas
e aprimoradas, resultaram nas aplicaes do que conhecemos hoje como Citometria de
Fluxo.
1930, Sucia Caspersson - Comeou a estudar os cidos nuclicos das clulas e

sua relao com o crescimento e funcionamento das mesmas. Este pesquisador desenvolveu
um microespectrofotmetro capaz de medir, com certa preciso, cidos nuclicos e o
31
contedo protico baseado na absoro de luz ultravioleta (UV) em um comprimento de onda

que se aproximava de 260 280 nm.
1934, Canad Andrew Moldaven - Desenvolveu um contador de clulas com um

sensor fotoeltrico, acoplado na ocular do microscpio, no qual as clulas previamente
coradas eram visualizadas e registradas passando por um tubo capilar montado sob um
microscpio tico.
1940, E.U.A. Coons - O mdico Albert Coons desenvolveu uma tcnica de

imunofenotipagem, que revolucionou os estudos na rea de imunologia, na qual ele observou
que os anticorpos poderiam ser conjugados fluorescena sem comprometer sua propriedade
de ligao especfica ao antgeno
1949, E.UA. Wallace Coulter - Publicou o artigo: Means for counting particles
suspended in a fluid no qual patenteou o primeiro contador de clulas eletrnico utilizando
um mtodo alternativo de deteco e contagem individual de clulas em um meio lquido
soluo salina isotnica. O contador de clulas desenvolvido por Wallace Coulter permitia
uma contagem rpida e automatizada de clulas sanguneas, e passou a ser utilizado em
laboratrios clnicos.
IMPORTANTE: Os princpios deste equipamento caracterizam alguns fundamentos da

citometria de fluxo conhecidos atualmente: uma nica clula passando atravs de um fluxo de
soluo salina (foco hidrodinmico), deteco de sinais eltricos, e anlise automatizada
destes sinais.
IMPORTANTE: A Coulter Electronics Inc. foi uma das empresas de citometria de fluxo de
maior importncia no mercado mundial, e que, em meados de 2000, foi comprada pela
Beckman, tornando-se conhecida como Beckman Coulter.
1952/53, Inglaterra Crosland e Taylor - Semelhante ao princpio desenvolvido

por Coulter, Crosland e Taylor, se basearam no uso de um sistema de fluidos pelo qual a
clula era centralizada ao passar pelo mesmo, permitindo que houvesse um alinhamento para
a contagem eletrnica.
32
1953 - Parker e Horst - Patentearam um contador de clulas capaz de detectar duas

cores. Usado como contador hematolgico de hemcias, coradas em vermelho; e leuccitos,
corados em azul.
1965, E.U.A
Katmentsky
Louis Katmentsky - Baseado nos avanos da citoanlise,
associou a cmara de Crosland e Taylor absoro de radiao UV
desenvolvendo um microscpio baseado na espectrofotometria, e projetou um dispositivo

capaz de selecionar as clulas da amostra e separ-las.
1965, E.U.A Mack Fulwyler - Descreveu um separador de clulas Cell Sorter no qual as clulas sanguneas eram adquiridas em equipamento do tipo Coulter Counter e
posteriormente a interceptao do laser eram desviadas por um campo eletrosttico e
coletadas em tubo de ensaio.
1967 E.U.A - Van Dilla - Teve influncia do trabalho de Crosland-Taylor, montando

uma cmara com o mesmo princpio de foco hidrodinmico. Van Dilla desenvolveu o
primeiro citmetro de fluxo com a configurao ortogonal e utilizao de um laser argnio
(488nm) como fonte luminosa.
1969, Alemanha Dittrich e Gohde - Iniciou uma das aplicaes mais importantes
e utilizadas da citometria uso de corantes de DNA utilizando o brometo de etdeo.
Primeiro citmetro de fluxo comercializado ICP11.
IMPORTANTE: Naquela poca, citofotometria de pulso era o nome original do que

conhecemos hoje por citometria de fluxo.
1969, E.U.A. - Leonard Herzenberg - Utilizou um equipamento similar ao de Van

Dilla, e comeou a utilizar a combinao de fluorescncias, em protocolos multiparamtricos
incluindo o que hoje conhecemos como tamanho e granularidade celular.
No final dos anos 60, os citmetros passaram a ser usados, tambm, para se obter
amostras homogneas de clulas a partir de amostras de leuccitos separando linfcitos e
granulcitos.
33
1974, E.U.A Howard Shapiro - Desenvolveu uma configurao tica, com

instrumentos de bloqueio de passagem de luz que permitiu a utilizao de diferentes
comprimentos de onda de excitao e emisso de luz.
1974 Leonard Herzenberg - Patenteou os citmetros desenvolvidos por seu grupo

na Universidade de Stanford, E.U.A. (e que foram comercializados pela empresa BECTON &
DICKINSON - BD) com a sigla FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter).
1975 Khler e Milstein - Introduziram a tecnologia dos anticorpos monoclonais.

Prmio Nobel.
1975 Gray - Realiza a primeira descrio de caritipo atravs da citometria de

fluxo.
1976 Andreff - Utiliza a citometria para classificar leucemias.
1977 Loken - Mediu simultaneamente dois antgenos celulares com um s laser e

realizou a chamada compensao eletrnica.
1978 Wallace Coulter - Sua empresa, Coulter Electronics, Inc. lana no mercado o
primeiro EPICS (Electronically Programmabl Individual Cell Sorter).
1979 Darzynkiewicz e Traganos - Atravs do estudo de DNA e utilizao de

laranja de acridina publicam os primeiros trabalhos sobre ciclo celular utilizando a citometria
de fluxo.
IMPORTANTE: A sigla EPICS est para os citomtros de fluxo da empresa hoje conhecida
como Beckman Coulter, assim como a sigla FACS est para os citmetros de fluxo da
empresa hoje conhecida como Becton & Dickinson (BD). A evoluo dos citmetros a partir
da dcada de 1980 aconteceu com a produo de equipamentos de ambas as empresas, as
quais junto com a Dako-Cytomation (hoje em dia comprada pela Beckman Coulter)
dominaram o mercado da citometria de fluxo.
34
Neste cenrio, uma variedade de aplicaes citofluorimtricas vem sendo

desenvolvida e aprimorada progressivamente, devido um crescente desenvolvimento dos
recursos e tecnologia dos citmetros. Sendo assim, atualmente podemos encontrar no mercado
citmetros de fluxo equipados com at seis lasers; com cada vez mais fotosensores (capazes
de detectar at 11 comprimentos de onda diferentes (11 cores) acompanhando a produo de
uma maior diversidade de fluorocromos; e cell sorters capazes de separar at 6 populaes
celulares diferentes; permitindo assim uma maior variedade e detalhamento de caracterizaes
fenotpicas e funcionas, assim como uma separao de populaes celulares, como o moderno
cell sorter da Beackman Coulter, Moflo (Figura 2.2).
Figura 2.2. MoFlo XDP Cell Sorter. Beckman Coulter - 3 lasers, 11 cores - foto cortesia: Bertho, A.L.
No Brasil, a histria comea em 1988 com a chegada do primeiro citmetro de fluxo

no Pas o EPICS 751 da Coulter Electronics, Inc (Figura 2.3) instalado no Departamento de
Protozoologia, do Instituo Oswaldo Cruz, FIOCRUZ.
35
Figura 2.3. EPICS 751 Cell Sorter Coulter Electronics. Primeiro citmetro de fluxo no Brasil 2 lasers, 4 cores. Foto
cortesia: Bertho A.L.
Desde ento a citometria de fluxo, devido a suas diversas aplicaes na Biologia e na

Biomedicina, apresenta uma crescente demanda de utilizao por vrios laboratrios clnicos
e de pesquisa em todo o Pas, e por isso houve um aumento considervel na compra destes
equipamentos. A partir de 1992, todo laboratrio clnico que participasse da rede CD4/HIV
teria, por determinao do Ministrio da Sade, que possuir um citmetro de fluxo em suas
dependncias para determinar as taxas da relao entre linfcitos CD4+ e CD8+ em pacientes
HIV positivos. Alm disso, laboratrios que trabalham com diagnstico de leucemias
necessitariam destes equipamentos para alcanarem seus laudos clnicos. Por causa disso, a
FIOCRUZ e outras instituies de pesquisa (p.ex. UFRJ) criaram Plataformas Multiusurios
de Citometria de Fluxo aumentando seus parques instrumentais e concentrando alguns
citmetros de modo a oferecer essa tecnologia para a comunidade cientfica nacional.
No caso da FIOCRUZ existem atualmente duas Plataformas de Citometria de
Fluxo:
Plataforma do Programa de Desenvolvimento Tecnolgico e Insumo em Sade

(PDTIS) onde se encontra um FACS Aria Cell Sorter da BD (Figura 2.4).
36
Figura 2.4.FACS Aria Cell Sorter. 2 lasers 11cores foto cortesia: Ferraz, R.
Plataforma Multiusurio de Citometria de Fluxo do Instituto Oswaldo Cruz onde se

encontram um FACS Calibur da BD (Figura 2.5); um Cyan ADP (Figura 2.6) e um
EPICS ALTRA Cell Sorter (Figura 2.7), ambos da Beckman Coulter.
Figura 2.5. FACS Calibur Bench-top Analyzer BD. 2 lasers, 4 cores. Foto cortesia: Ferraz, R.
Figura 2.6. Cyan ADP Bench-top Analyzer Dako Cytomation. 2 lasers 7 cores foto cortesia: Ferraz, R.
Figura 2.7. EPICS Altra Cell Sorter Beckman Coulter - 1 laser, 4 cores foto cortesia: Bertho, A.L.
37
38
CAPTULO 3. PRINCPIOS BSICOS DA CITOMETRIA DE FLUXO

Raquel Ferraz
3.1. Conceito Bsico
A citometria de fluxo um mtodo utilizado para o estudo de clulas e resultado da

reunio e aplicao de tcnicas desenvolvidas na rea da computao; na produo de
anticorpos monoclonais e de fluorocromos; na tecnologia dos raios laser; e na eletrnica.
Permite a avaliao de caractersticas fsicas, qumicas e biolgicas de vrios tipos celulares
(humanas, de animais, protozorios, fungos, ou bactrias), previamente preparados e
marcados com anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromos, com afinidade por
determinada molcula de interesse.
Estes fluorocromos so excitados por uma radiao laser e emitem um comprimento
de onda (cor) que detectado por um sensor, chamado de fotomultiplicadores (PMTs)
capazes de converter a luz captada em sinais eletrnicos, que so enviados ao computador,
possibilitando, atravs de software especfico, uma anlise multiparamtrica para obteno
dos resultados. Esta anlise realizada atravs de representaes grficas da intensidade de
fluorescncia emitida pelo fluorocromo e as respectivas caractersticas morfolgicas das
clulas.
3.2. Preparao das amostras para aquisio por citometria de fluxo
Para utilizar a citometria de fluxo como ferramenta de estudo as amostras devem

estar em uma suspenso. Dois protocolos principais devem ser seguidos: um protocolo de
separao de clulas; e outro protocolo de marcao citofluorimtrica (Captulo 7).
Seja esta amostra de sangue perifrico, de cultura celular, de medula ssea, de
tecido, ou de lquor, as clulas devem ser dissociadas e de forma a evitar a formao de
grumos na suspenso. A seguir, deve-se escolher as partculas e ou molculas celulares de
interesse que iro receber a marcao. Para a escolha dos fluorocromos necessrio saber a
configurao tica do citmetro de fluxo a ser utilizado, em relao aos filtros que direcionam
as cores a cada PMT.
39
3.3. Fluorocromos
A identificao de molculas na superfcie ou no interior das clulas

(imunofenotipagem) atravs da utilizao de anticorpos monoclonais conjugados
fluorocromos ou substncias fluorescentes, ambos capazes de emitir cor, a base para os
protocolos citofluorimtricos (Captulo 8).
Os fluorocromos so molculas fluorescentes, que esto inicialmente em repouso,
que so excitados por uma determinada fonte luminosa (laser), emitindo uma luz de
comprimento de onda (cor) caracterstica.
Quando utilizados em protocolos citofluorimtricos, e, portanto, ligados (mesmo que
de forma indireta) a uma clula, os fluorocromos so excitados quando esta clula
interceptada pela luz do laser.
A maioria dos fluorocromos excitada por um laser argnio (comprimento de onda
de 488 nm), presente em todos os citmetros de fluxo. Alguns fluorocromos so excitados por
outro comprimento de onda, e por isto, alguns citmetros so configurados com mais de um
laser, p.ex.:
Laser Ultravioleta 355 nm
Laser Violeta-Azul 405 nm
Laser Hlio-Nenio (HeNe) 633 nm

Os fluorocromos so geralmente acoplados a anticorpos com afinidade por
determinada estrutura qumica das clulas e biologicamente significativas, as quais podem

caracterizar um tipo celular, um evento bioqumico ou um tipo de resposta imunolgica. Por
exemplo, o receptor de superfcie CD3 est presente na membrana de todos os linfcitos T, e
se utilizarmos um anticorpo anti-CD3 acoplado a um fluorocromo, como o isotiocianato de
fluorescena (FITC) (488 nm de excitao e 525 nm de emisso) (Figura 3.1), todo linfcito T
da amostra ao ser interceptado pelo laser ter o fluorocromo (FITC) excitado e o comprimento
de onda que ele emite ser captado pelo PMT atravs da configurao tica.
40
Figura 3.1: Espectro de comprimento de onda de excitao e de emisso do FITC.
Estes anticorpos esto comercialmente disponveis no mercado por empresas

especializadas como, a Beckman Coulter, Becton & Dickinson, Dako, entre outras. A
combinao anticorpo monoclonal-fluorocromo deve ser escolhida de acordo com as
molculas que se deseja avaliar (Tabela 1.1) e a cor que o fluorocromo vai emitir.
Vale lembrar que para a escolha do fluorocromo fundamental conhecer a
configurao dos citmetros em relao aos filtros e nmero de PMTs, que se pretende
utilizar para aquisio das amostras. Assim, se um citmetro tem trs PMTs para
fluorescncia, sabemos que poderemos escolher uma combinao de trs monoclonais
diferentes, cada um com um fluorocromo especfico. Alm disso, deve-se conhecer qual
comprimento de onda de cada fluorocromo para se escolher um filtro adequado para ser
colocado a frente de cada PMT, permitindo a deteco da cor emitida.
Alguns fluorocromos e seus respectivos comprimentos de onda de excitao, pico
mximo de emisso, e cor correspondente, esto na Tabela 3.1.
41
Tabela 3.1. Fluorocromos e seus respectivos comprimentos de onda de excitao e de

emisso, e cor correspondente emisso
IMPORTANTE: Quanto mais lasers e PMTs um citmetro tiver, maior variedade de

fluorocromos poder ser utilizada em uma mesma amostra.
Conhecendo as propriedades de excitao e de emisso de cada fluorocromo

possvel escolher combinaes de anticorpos monoclonais a serem usadas em conjunto, de
forma que diferentes molculas de interesse podem ser avaliadas em uma mesma clula. Por
exemplo: antiCD4-FITC, antiCD8-PE, antiCD3-PercP em um citmetro que tenha PMTs
capazes de captar comprimentos de onda de 525 nm, 578 nm, 667 nm, respectivamente.
IMPORTANTE: No caso da marcao ser feita com mais de um anticorpo monoclonal,

deve-se tomar cuidado para no escolher fluorocromos cujos comprimentos de onda se
sobreponham.
3.4. Princpios bsicos (Figura 3.2)

Aps a preparao da amostra1, o tubo contendo a suspenso de clulas acoplado
ao citmetro de fluxo e as clulas so aos poucos, aspiradas por um sistema de presso e
levadas uma cmara especial (flow cell)2. Alm de receber a suspenso de clulas, esta
cmara banhada por uma soluo salina3, responsvel por um fluxo contnuo4 o qual, junto
42
com o desenho cnico da cmara, fora a acomodao das clulas uma atrs da outra5 de
forma que ao deixarem esta cmara por um pequeno orifcio (50 - 200m de dimetro) sejam
individualmente interceptadas6 por uma radiao laser. Este encontro resulta na refrao da
luz do laser e na emisso de fluorescncia(s) de acordo com o(s) fluorocromo(s) presentes na
clula que interceptada pelo laser (Figura 3.2).
Figura3.2. Princpios bsicos. Esquema do caminho da clula com fluorocromo acoplado at a fluoresccia ser
detectada por PMT especfico. O caminho est numerado de 1 11.
3.4.1. Sistema tico
Para que as informaes de emisso de luz, que neste caso representam propriedades
da clula, sejam determinadas, preciso que esta luz atinja um determinado PMT. Para isto,
necessrio que a luz emitida pelo fluorocromo e a luz do laser refratada pela clula passem
por filtros com propriedades especficas, de permitir a passagens de determinados
comprimentos de onda e refletir outros, e direcionando, assim, a luz para os PMTs.
3.4.2. Tipos de filtro
Filtros Dicricos: capazes de refletir um determinado comprimento de onda e deixar

que outros comprimentos passem, ou seja, atravessem o filtro. Podem ser do tipo long
pass (reflete um comprimento de onda e deixa passar comprimentos de onda maiores)
43
e short pass (reflete um comprimento de onda e deixa passar comprimentos de onda

menores).
Filtros de Interferncia: deixam passar um comprimento de onda especfico e evitam

que um comprimento de onda diferente daquele que se deseja detectar interfira. So
chamados de band pass.
Filtros de bloqueio: tm um poder maior de reflexo, no deixando passar nenhum

comprimento de onda acima daquele que ele reflete. So chamados de block.
Alm de excitar os fluorocromos, a luz do laser argnio, ao interceptar a clula,

refratada e dispersada permitindo que propriedades fsicas da clula, como tamanho e
granularidade sejam avaliadas. A luz dispersada na mesma direo do laser (forward scatter)
permite analisar o tamanho celular
10a
. Quanto maior for a partcula, maior ser o ngulo de
incidncia da luz do laser, dispersada pela partcula, que atinge o fotossensor
7a
(Figura 3.2 e
Figura 3.3).
Figura 3.3. Avaliao dos parmetros tamnho e granularidade de acordo com a incidncia da luz do laser sobre a
clula. Luz do laser atravessando o fluxo de soluo salina no intervalo entre uma amostra e outra, e incidnciapadro no fotossensor de tamanho (FS); e luz do laser sendo refratada pela clula, de acordo com seu tamanho,
formando ngulo de refrao maior incidncia de luz detectada.
Simultaneamente, a luz do laser refratada devido granularidade celular, assim como

a luz emitida pelos fluorocromos, so captadas e enviadas por lentes que as direcionam
lateralmente para os PMTs, de acordo com a configurao tica (filtros) do citmetro
(Figura 3.3.).
Assim, um filtro dicrico long pass 488nm, deixa passar todos os comprimentos de
onda acima de 488nm e reflete a luz do laser argnio refratada pela clula, direcionada ento
para um filtro de interferncia (band pass) que a deixa passar comprimento de onda de
44
488nm. Finalmente chegando ao PMT10b, a luz detectada determina o que chamamos de side
scatter10b ou granularidade celular. Ao mesmo tempo, as fluorescncias que passam pelo filtro
dicrico long pass 488nm9a so refletidas por um outro filtro dicrico long pass9b de
determinado comprimento de onda, e ento chegam ao PMT11 aps passar por um filtro de
interferncia (band pass) especfico para cada fluorescncia (Figura 3.2 e Figura 3.4).
Figura 3.4. Esquema bsico da disposio dos filtros dicricos - Long pass; de interferncia (band pass) e do filtro de
bloqueio (block) - e do caminho das cores at o PMT.
3.4.3. Sistema eletrnico
Os ftons captados pelos PMTs so convertidos em pulsos eltricos, enviados para o

computador e utilizados para representar a intensidade de fluorescncia detectada em cada
PMT, na forma analgica ou digital.
3.4.4. Software
Em frao de segundos, milhares de clulas passam uma a uma pelo laser e toda a
informao quanto a intensidade de fluorescncia detectada e convertida. A avaliao das
informaes de tamanho e de granularidade, fenotpicas e ou funcionais, simultaneamente
aquisio realizada atravs de um software especfico.
45
Antes de comear a aquisio de amostras, deve-se conectar o citmetro a este

software e nele montar um protocolo com grficos mono e biparamricos especficos para
anlise dos diferentes parmetros de tamanho, granularidade e fluorescncia(s).
Toda anlise se baseia, primeiro, na identificao das populaes quanto s
propriedades fsicas, isto , tamanho e granularidade, selecionados (no software) para os eixos
x e y (Figura 3.5)
Figura 3.5. Dot plot de tamanho vs. Granularidade
A seguir, deve-se montar os grficos para a avaliao de intensidade de fluorescncia

dos respectivos fluorocromo(s) referente a cada clula. Pode-se avaliar a intensidade de uma
nica fluorescncia, atravs de um grfico monoparamtrico, chamado histograma
(Figura 3.6).
Figura 3.6. Histograma de nmero de clulas vs. intensidade de fluorescncia.
46
IMPORTANTE: As clulas no marcadas, ou seja, que no possuem a molcula de

interesse, tambm so interceptadas pelo laser. Sendo assim, a luz refratada (tamanho e
granularidade) so captados pelos fotossensores e elas tambm aparecem nos grficos de
anlise daquela amostra. Ao mesmo tempo, nos grficos de anlise de intensidade de
fluorescncia, estas clulas aparecem como negativas para aquele comprimento de onda.
Quando se deseja avaliar a intensidade das florescncias emitidas pelos

fluorocromos, ou qualquer um dos parmetros fsicos, deve-se montar um grfico
biparamtrico, chamado de dot plot, selecionando para o eixo x e y, a fluorescncia
correspondente ao fotomultiplicador que a detecta (ou FSC; ou SSC), geralmente em escala
logartmica. Este grfico deve ser dividido em quatro quadrantes (Q1, Q2, Q3, Q4). A
intensidade de fluorescncia representada no Q1 referente as clulas marcadas com o
fluorocromo X; o Q2 representa a intensidade de fluorescncia das clulas marcadas tanto
com o fluorocromo X quanto com o fluorocromo Y; as clulas negativas para ambos os
fluorocromos so representadas no Q3; e finalmente, o Q4 representa a intensidade de
fluorescncia das clulas positivas para o fluorocromo Y.
Figura 3.7: Dot plot de intensidade de fluorescncia X vs. intensidade de fluorescncia Y.
possvel montar um protocolo com a variedade desejada de histogramas e dot

plots, de forma que, conforme cada amostra vai sendo adquirida, os grficos vo sendo
preenchidos de acordo com a intensidade de luz refratada e de fluorescncia.
Os softwares permitem a seleo de regies que se deseja analisar, chamadas de gate.
47
Figura 3.8: Tamanho vs. granularidade de clulas, e gate na regio dos linfcitos.
A partir deste gate, pode-se determinar a intensidade de fluorescncia somente das

clulas situadas nesta regio. Por exemplo, em uma amostra de clulas submetidas a um
protocolo citofluorimtrico de imunofenotipagem utilizando anti-CD8-FITC e anti-CD4-PE,
pode-se fazer um gate no dot plot de tamanho e granularidade, que definam a populao de
linfcitos de acordo com suas caractersticas morfolgicas, e a partir da mesma avaliar a
intensidade de fluorescncia de FITC vs. PE (Figura 3.9).
Figura 3.9. Gate de linfcitos, e anlise dos mesmo quanto s molculas de superfcie CD4 e CD8, de acordo com a
intensidade de fluorescncia de PE e FITC, respectivamente.
No histograma identifica-se um pico positivo de fluorescncia (a partir de 101) e um

negativo (entre 100 e 101) (Figura 3.10).
48
Figura 3.10: Interpretao do histograma. Clulas negativas para a FL1 representadas no 10 pico, e clulas positivas
para FL1, representadas no 20 pico.
Assim, possvel determinar o percentual de clulas em cada quadrante ou gate,

representado em nmeros, e desta forma os dados obtidos de diversas amostras so
compilados e sua anlise pode resultar em uma concluso de importncia no seu estudo
cientfico.
49
CAPTULO 4. APLICAES DA CITOMETRIA DE FLUXO NA APOPTOSE

Raquel Ferraz
A apoptose ou morte celular programada um fenmeno fisiolgico que regula,

atravs de um mecanismo gentico, a homeostase dos tecidos, em um processo oposto ao da
mitose. A regulao desta morte um fator importante em muitos processos biolgicos, tais
como maturao e diferenciao celular, e renovao de populaes celulares. Entretanto o
desequilbrio na homeostase levando a uma exacerbao ou inibio da apoptose est
relacionada
com
aparecimento,
agravamento
ou
cura
de
diversas
doenas
infectoparasitriass como Leishmaniose, Doena de Chagas, Hansenase, Hepatite e AIDS,

alm de ser um mecanismo caracterstico no desenvolvimento de tumores.
A apoptose se caracteriza por diversos eventos bioqumicos como, ativao de
caspases iniciadoras e efetoras, que culminam na fragmentao do DNA; eventos
morfolgicos, como a diminuio do tamanho celular e formao de corpos apoptticos; e
ainda eventos moleculares como a expresso de Fas (CD95) na membrana da clula programa
para morrer por apoptose, e de fosfatidilserina, em um mecanismo capaz de sinalizar para os
macrfagos que estas clulas devem ser fagocitadas. Alm disso, outras molculas podem ser
associadas aos eventos apoptticos como a famlia de protenas Bcl-2, o gene supressor
tumoral p53, a molcula solvel FasL que se liga no receptor Fas (ligao esta capaz de
acionar a via extrnseca da apopotse), e aplicada ainda no estudo do metabolismo
mitocondrial.
Por conta destas diversas molculas que caracterizam os eventos apoptticos, a
citometria de fluxo uma ferramenta cada vez mais utilizada no estudo de diversas doenas
associadas a este processos de morte programada, acompanhando a descoberta e utilizao de
substncias fluorescentes e fluorocromos acoplados a anticorpos capazes de se ligar a estas
molculas e receptores que caracterizam a apoptose.
IMPORTANTE: A citometria de fluxo tambm se aplica aos estudos de necrose atravs da

utilizao de alguns protocolos que se baseiam na comparao dos dois tipos de morte celular.
Sendo assim, deve-se conhecer as diferenas e as caractersticas comuns entre necrose e
apoptose.
50
Diversas metodologias se aplicam ao estudo da apoptose, porm a citometria

de fluxo vem se mostrando a tcnica de escolha por oferecer vantagens como anlise
multiparamtrica de propriedades celulares que caracterizam a apoptose, alm de possibilitar
ainda a determinao das clulas no ciclo celular. Alm disso, as informaes simples quanto
ao tamanho e a granularidade das clulas podem fornecer informaes que diferenciam as
clulas apoptticas das demais.
Algumas das aplicaes mais utilizadas para estudar apoptose, atravs da citometria
de fluxo esto listadas a seguir:
4.1. Alteraes morfolgicas (Foward and Side Scatter)
As alteraes morfolgicas das clulas em processo de morte por apoptose podem

ser avaliadas por citometria de fluxo atravs da luz do laser refratada pela clula, isto , sem a
necessidade de submeter a amostra a protocolo citofluormtrico. Sabendo que durante a
apoptose a clula diminui de tamanho, como resultado do encolhimento celular, e torna-se
mais granular como resultado da condensao da cromatina, um dot plot de tamanho vs.
granularidade possibilita a identificao desta populao (Figura 4.1).
Figura 4.1. Clulas em apoptose. As clulas apoptticas podem ser identificadas de acordo com seu tamanho e
granularidade caractersticos.
A maior vantagem desta anlise a simplicidade do preparo da amostra, o baixo

custo, e a possibilidade de combinar a anlise morfolgica com a anlise de marcadores de
superfcie para a identificao da populao de clulas mortas.
51
4.2. Iodeto de Propdeo (PI)
O PI uma substncia com a propriedade de se intercalar em pequenas seqncias de

bases nucleotdicas (entre 4 e 5) e de emitir uma cor (vermelha, de 617 nm) quando excitadas
pelo laser argnio. Aplicado em protocolos citofluorimtricos inicialmente para estudo do
ciclo celular em substituio ao Brometo de Etdeo (excitado por laser UV), passou a ter
aplicao tambm nos estudos da apoptose. O PI um dos corantes com afinidade por DNA
mais utilizados e sua aplicao pode ser baseada em trs protocolos diferentes:
Viabilidade celular: Pela propriedade de ser impermevel membrana plasmtica

ntegra, o PI utilizado em protocolos citofluorimtricos como corante vital de forma
que as clulas negativas para a marcao com PI esto viveis. Nas clulas mortas o PI
tem acesso ao DNA celular em funo da perda da integridade da membrana
plasmtica destas clulas (Figura 4.2).
Figura 4.2. Avaliao da viabilidade celular com PI. As clulas viveis apresentam-se com membrana ntegra,
impermevel ao PI. As clulas mortas apresentam perda da integridade da membrana e marcam-se com PI, que se
intercala nos cidos nuclicos.
Ciclo celular: O protocolo para identificar as clulas em diferentes fases do ciclo

celular baseado em uma soluo que contm PI; um detergente para a
permeabilizao de membranas (NP-40; Triton X-100); Ribonuclease A, para
degradao do RNA e para que a marcao seja especfica para DNA; Citrato de
Sdio; Cloreto de Sdio; em gua destilada. A anlise baseada na quantificao de
DNA no interior das clulas. Assim, clulas na fase G2M do ciclo tm o dobro de
DNA do que as clulas na fase G0/G1, representadas pela intensidade de fluorescncia
52
em escala linear. Da mesma forma, as clulas em apoptose so representadas por

menor intensidade de fluorescncia j que o DNA est fragmentado (Figura 4.3).
Figura 4.3. Avaliao do ciclo celular. A intensidade de fluorescncia proporcional quantidade de DNA,
definindo as clulas em diferentes fases do ciclo celular, e clulas apoptticas, com menos DNA marcado do
que as clulas viveis em G0/G1.
PI hipotnico: Posteriormente ao protocolo aplicado para o estudo de ciclo celular e

adaptado para o estudo da apoptose, foi padronizado um protocolo para a avaliao da
fragmentao de DNA, caracterizando as clulas em apoptose. Para isso utilizada
uma soluo hipotnica para ressuspender as clulas (PI, Citrato de Sdio e TritonX100), em uma concentrao que facilita a entrada do PI por transporte
transmembranar. Com este protocolo a membrana nuclear das clulas no alterada,
permitindo uma avaliao fiel da fragmentao nuclear. Alm disso, outra
caracterstica importante deste protocolo a anlise em escala logartmica, j que em
escala linear o pico que representa as clulas em apoptose fica escondido, devido
baixa intensidade de fluorescncia (Figura 4.4).
Figura 4.4. Utilizao do PI hipotnico. Clulas (cls.) da mesma amostra, submetidas ao protocolo de PI hipotnico,
analisadas em escala linear e logartmica.
53
4.3. 7-AAD (7-amino-actinomicina D)
O 7-AAD um corante de viabilidade celular com a propriedade de se inserir entre

as bases Citosina Guanina em fita dupla de DNA. Durante o processo de morte a membrana
plasmtica progressivamente alterada, tornado-se permevel 7AAD, que ento se liga no
DNA acessvel no interior da clula (alterao da membrana nuclear e/ou condensao da
cromatina e fragmentao do DNA).
A anlise das clulas viveis e no viveis feita atravs da intensidade de
fluorescncia, de forma que as clulas vivas so representadas pelo pico negativo, e o pico de
intensidade de fluorescncia positiva representa as clulas mortas. Inicialmente, a 7AAD foi
utilizada para a identificao de apoptose, e posteriormente passou-se a analisar tambm as
clulas em necrose, as quais so representadas por uma intensidade de fluorescncia maior do
que a das clulas em apoptose (Figura 4.5).
Figura 4.5: Marcao de clulas apoptticas com 7AAD. Intensidade de fluorescncia da 7AAD e respectivas
populaes de clulas (cls.) viveis, em apoptose e em necrose.
Quando excitado pelo laser argnio a 7AAD emite fluorescncia entre 620 e 675nm,
e simultneas marcaes de superfcie e intracelular com fluorocromos de outro comprimento
de onda podem ser realizadas para associar caractersticas fenotpicas e funcionais ao
processo de morte celular (Figura 4.6).
54
Figura 4.6: Protocolo multiparamtrico de tripla marcao (CD4-FITC, CD8-PE, 7AAD) baseado em gate de
linfcitos.
4.4. Hoechst 33342
Corante utilizado tanto na citometria de fluxo como na microscopia. Excitado por

laser UV, o Hoechst 33342 tem pico mximo de emisso de 461nm emitindo uma cor azul.
Este corante utilizado como um substituto do DAPI para a marcao de cido nuclico
devido a sua maior propriedade lipoflica e conseqente afinidade por membrana celular (e,
portanto sem a necessidade de permeabilizao da membrana), com aplicabilidade no estudo
de replicao e diviso celular, e apoptose.
No estudo da apoptose o uso Hoechst combinado ao PI (kit Hoechst 33342/PI)
em ensaios baseados na menor
intensidade de fluorescncia de Hoechst nas clulas
apoptticas, devido cromatina compactada, em comparao s clulas viveis; e maior

intensidade de fluorescncia das clulas apoptticas. Em relao ao PI, impermevel s
clulas viveis, apresenta maior intensidade de fluorescncia para as clulas necrticas,
quando comparadas s clulas apoptticas (Figura 4.7).
Figura 4.7: Dupla marcao Hoechst vs. PI. Clulas viveis em ciclo celular representadas pela diferena de
intensidade de fluorescncia do Hoechst no dotplot A. Clulas viveis positivas para o Hoechst, clulas em apoptose
inicial e tardia positivas para PI, e clulas necrticas duplamente marcadas, no dotplot B.
55
4.5. DAPI (Diamino-2-Fenilindol)
Corante de cido nuclico com afinidade pela ligao Adenina-Timina em DNA

dupla fita, e propriedade de emitir fluorescncia azul (461nm) quando excitado por laser UV.
Tambm capaz de se ligar ao RNA, se intercalando na ligao Adenina-Uracila, emitindo
neste caso, fluorescncia com pico de emisso de 500nm (Figura 4.8 e 4.9). tambm
utilizado o em protocolos multiparamtricos, em funo de seu pico de emisso no sobrepor
o pico de emisso dos fluorocromos mais utilizados, como FITC e PE.
Figura 4.8: Pico de intensidade de fluorescncia do corante DAPI quando ligado ao DNA e ao RNA.
Figura 4.9: Clulas no estimuladas, e clulas com induo de apoptose. DAPI em menor intensidade de fluorescncia
nas clulas com DNA fragmentado.
4.6. Annexina-V
Protena com a propriedade biolgica de se ligar fosfatidilserina em uma ligao de

alta afinidade. Este fosfolipdeo est presente na superfcie interna da membrana plasmtica,
voltados para o citoplasma, e translocado para a superfcie externa na fase inicial da
56
apoptose funcionando como sinalizao para fagocitose desta clula por macrfagos
(Figura 4.10).
Figura 4.10. Translocao da fosfatidilserina, da superfcie interna para a superfcie externa da membrana
plasmtica na fase inicial da apoptose, e ligao com a AnexinaV.
Esta molcula conjugada a um fluorocromo utilizada na citometria de fluxo para

identificar as clulas em apoptose, e por ser um marcador de superfcie que pode ser
conjugado a qualquer fluorocromo frequentemente utilizada em conjunto a outros
marcadores.
Uma das combinaes mais utilizadas AnexinaV e PI para diferenciar as clulas
necrticas (positivas somente para a marcao com PI), as clulas em apoptose inicial (ainda
com a membrana ntegra o suficiente para o PI no passar; positivas somente para AnexinaV),
e as clulas em apoptose tardia (dupla marcao) (Figura 4.11 e 4.12).
Figura 4.11: Dupla marcao AnexinaV vs. PI. Clula vivel,

AnexinaV no se liga fosfatidilserina, e PI no entra na clula.
Clula em fase inicial de apoptose , ligao da AnexinaV em sua
superfcie; e clula em apoptose tardia ou necrose, duplamente
marcada.
57
Figura 4.12:Dotplot PI vs. AnexinaV. Q1 clulas em necrose; Q2 clulas em apoptose tardia ou necrose; Q3 clulas
viveis; Q4 clulas em fase inicial de apoptose.
4.7. Rodamina 123
Excitado pelo laser argnio, com pico de emisso mxima em 528 nm, tambm
possui a propriedade de se acumular no interior da mitocndria metabolicamente ativa.
Quando esta organela apresenta-se vivel esse corante se acumula no espao intermembranas,
onde esterificado. Quando a mitocndria perde seu potencial de membrana a Rodamina 123
no esterificada pelos prtons H+ e nem se acumula no espao intermembranas. Redues
na intensidade de fluorescncia desta sonda, detectadas atravs do deslocamento dos picos no
histograma, representam a perda do potencial de membrana (Figura 4.13).
Figura 4.13: Mitocndria de clula vivel hiperpolarizada, com acmulo de Rodamina 123 e alta intensidade de
fluorescncia; e mitocrndria de clula em apoptose com perda do potencial de membrana e menor ligao de
Rodamina 123.
58
4.8. TUNEL
Nos kits comerciais baseados no TUNEL utiliza-se a enzima TdT (transferase

terminal deoxinucleodil) para adicionar nucleotdeos marcados (dUTP-FITC) extremidade
3 do DNA. A aplicabilidade no estudo da apoptose decorrente da extremidade 3 exposta
em cada fragmento de DNA durante o processo apopttico. Sendo assim, quanto maior a
intensidade de fluorescncia, maior a fragmentao do DNA, e caracterizao da apoptose
(Figura 4.14).
Figura 4.14: Clula com DNA intacto e dUTP, marcado com fluorocromo, ligado s duas extremidades 3. Clula em
apoptose, e dUTP ligado vrias extremidades 3 do DNA fragmentado.
4.9 DiOC6(3)
Marcador de potencial de membrana mitocondrial (m) com propriedade de

emisso de fluorescncia. Tem afinidade por membranas hiperpolarizadas, se acumulando na
membrana mitocondrial de clulas vivas, identificadas por alta intensidade de fluorescncia
em anlise citofluorimtrica. Durante o processo de apoptose ocorre a formao de canais e
poros na membrana mitocondrial das clulas diminuindo a capacidade do DiOC6(3) se
acumular na membrana deste organela, e assim as clulas apoptticas so representadas por
baixa intensidade de fluorescncia.
59
Figura 4.15: Representao da marcao com Dioc6(3): Clulas viveis representadas por alta intensidade de
fluorescncia, e clulas em apoptose, em menor nmero, com menor intensidade de fluorescncia.
4.10. Anticorpo monoclonal
Alm dos corantes que se ligam a molculas especficas que permitem a

identificao das clulas em apoptose, os anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromo
tambm podem ser utilizados para este estudo, desde que tenham afinidade por protenas,
receptores de superfcie, ou qualquer molcula que caracterize a morte celular por apoptose.
Alguns exemplos incluem as protenas propoptticas Bax e Bid, protena antiapopttica Bcl2, caspase-3, receptor Fas, e protena p53 (Figura 4.16).
Figura 4.16: Anticorpos monoclonais antiFas, antiBax e Anticaspase-3, com afinidade por molculas que caracterizam
a apoptose, conjugados a fluorocromos. Estes anticorpos monoclonais no se ligam clula vivel, e portanto
identificam as clulas apoptticas.
60
CAPTULO 5. APLICAES DA CITOMETRIA DE FLUXO NA

PROTOZOOLOGIA
Grazielle Alves Ribeiro
A protozoologia consiste no estudo dos protozorios, que so seres unicelulares

eucariontes. O protozorio uma clula nica que para sobreviver realiza todas as funes
vitais, como respirao, alimentao, reproduo, locomoo e excreo. Os protozorios
apresentam morfologia bastante diversificada, que varia conforme sua fase evolutiva e meio
em que esto inseridos. Apresentam-se como formas esfricas, ovais ou alongadas. A
locomoo, necessria para a busca por habitats adequados sobrevivncia, realizada a
partir de estruturas especializadas, como pseudpodes, clios ou flagelos. De acordo com as
organelas apresentadas para locomoo os protozorios so divididos em quatro filos
principais: Mastigophora (com flagelos), Sarcodina (com pseudpodes), Sporozoa (sem
estruturas especializadas) e Ciliophora (com clios). Os protozorios podem ser de vida livre,
comensais, mutualistas ou parasitos. Dentre os parasitos de maior importncia mdica
destacam-se os gneros Trypanosoma, Leishmania, Giardia, Trichomonas, Entamoeba,
Toxoplasma e Plasmodium.
O estudo dos protozorios pode ser realizado atravs de mtodos de observao
direta por microscopia ptica ou eletrnica, que permitem elucidar aspectos morfolgicos
relacionados biologia destes organismos, e tambm atravs do estudo de aspectos
bioqumicos, de biologia celular e molecular.
A citometria de fluxo permite uma rpida e quantitativa medida das caractersticas
pticas das clulas e possibilita a avaliao da viabilidade reprodutiva, atividade metablica,
integridade e permeabilidade de cada uma delas individualmente. Quando as clulas so
avaliadas por citometria de fluxo, trs parmetros so medidos: tamanho, granularidade e a
fluorescncia emitida pelos corantes que tem interao especfica com os componentes
intracelulares.
A citometria de fluxo abre um leque de opes e perspectivas para o conhecimento.
Entretanto, torna-se indispensvel um grande conhecimento da biologia dos sistemas
estudados, dos reagentes utilizados, dos mtodos de marcao e dos controles experimentais.
No estudo dos protozorios, a citometria de fluxo constitui-se como uma potente
ferramenta que possibilita anlises multiparamtricas de milhares de clulas individualmente,
dentro de uma populao heterognea. A tcnica possibilita a avaliao qualitativa e
quantitativa das clulas e de seus constituintes. Embora a microscopia de fluorescncia
61
tambm permita o estudo da resposta de clulas individualmente a determinados tratamentos

utilizando o mesmo repertrio de corantes fluorescentes utilizados na citometria de fluxo, o
estudo microscpico bastante trabalhoso e os resultados esto sujeitos a uma grande
variao devido dimenso reduzida da amostra analisada e subjetividade. Vantagens da
citometria de fluxo sobre a microscopia de fluorescncia incluem um alto grau de preciso
estatstica, devido ao maior nmero de amostras avaliadas, e eliminao da subjetividade.
Diversas abordagens podem ser realizadas a partir da citometria de fluxo no estudo de
protozorios e das doenas por eles provocadas.
O Sorting por citometria um mtodo pelo qual se torna possvel separar clulas de
acordo com suas caractersticas fsicas, como tamanho e granularidade, sem a utilizao de
marcao por anticorpos monoclonais. Essa tcnica possibilita a clonagem de parasitos de
vrias espcies como Leishmania ssp ou T. cruzi, que so utilizados com freqncia em
estudos biolgicos e bioqumicos por diferentes laboratrios. Alm disso, essa tcnica permite
o estudo de fenmenos imunolgicos que utilizam populaes de clulas purificadas a partir
de amostras heterogneas.
A citometria de fluxo pode ser aplicada para discriminar morfologicamente formas
epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas envolvidas no ciclo da doena de Chagas.
Permite tambm o estudo de aspectos de diferenciao que ocorrem durante a transformao
de um estgio evolutivo em outro atravs da avaliao dos padres de superfcie de cada
forma do parasito. Alguns estudos tambm utilizam a citometria para a diferenciao de
promastigotas de Leishmania e caracterizao de anticorpos espcie-especficos.
Em laboratrios clnicos, a viabilidade de Trichomonas vaginalis determinada pelo
uso da microscopia de luz (contagem diferencial de organismos mveis e imveis).
Marcadores fluorescentes de viabilidade, como iodeto de propdeo possibilitam que estes
ensaios sejam realizados por citometria de fluxo. Esse protocolo fornece a discriminao entre
a populao vivel e invivel e permite uma contagem estatstica mais confivel do que
aquela obtida por microscopia ptica, uma vez que remove a subjetividade e aumenta a
preciso do ensaio.
Protocolos de citometria de fluxo tambm podem ser utilizados para deteco de
cistos de Giardia lamblia na gua e nas fezes. Os mtodos tradicionais envolvem
procedimentos para concentrao dos cistos e posterior visualizao por microscopia
convencional, sendo bastante demorados. Protocolos baseados em citometria de fluxo so
mais eficientes e rpidos. A marcao das amostras com anticorpo monoclonal especfico para
o parasito e com Iodeto de Propdeo (marcador de morte celular) possibilita no s a deteco
62
do parasito nas amostras como tambm a deteco da viabilidade das amostras (Figura 5.1). A
avaliao da viabilidade um parmetro importante para se avaliar os riscos de infeco e
para a monitorao do tratamento.
Figura 5.1. Deteco de cistos de Giardia e da viabilidade celular. A deteco pode ser realizada a partir de uma
marcao com anticorpos monoclonais para molculas de superfcie desse parasito e a avaliao simultnea da
viabilidade dos mesmos pode ser realizada com o marcador de morte celular Iodeto de Propdeo (PI).
Em estudos relacionados deteco da Doena de Chagas, a citometria de fluxo

pode ser utilizada como instrumento de anlise qualitativa e quantitativa da presena de
anticorpos lticos, dirigidos a eptopos expressos apenas em tripomastigotas vivos (Figura
5.2).
Figura 5.2. Diagnstico da Doena de Chagas. O diagnstico pode ser realizado atravs da deteco de
anticorpos especficos para as formas tripomastigotas vivas do parasito.
63
A citometria de fluxo pode ser utilizada no estudo da interao patgeno-clula

hospedeira. Essa ferramenta possibilita detectar, por exemplo, a interao entre macrfagos e
Leishmania amazonensis de acordo com as caractersticas fsicas da clula hospedeira. A
deteco da internalizao dos parasitos pela clula hospedeira baseia-se no aumento da
granularidade dos macrfagos. Esse aumento da granularidade indica a presena de parasitos
no interior de vacolos parasitforos dos macrfagos (Figura 5.3).
Figura 5.3. Deteco da interao entre macrfagos e L. amazonensis por citometria de fluxo. Os macrfagos
infectados apresentam maior granularidade do que aqueles no infectados.
A citometria de fluxo tambm possibilita a quantificao da taxa de infeco de

macrfagos por amastigotas de Leishmania. A partir da fixao e permeabilizao da clula
hospedeira, torna-se possvel a marcao das amastigotas com anticorpos monoclonais, como
por exemplo, o anticorpo monoclonal especfico para lipofosfoglicano do parasita intracelular
(Figura 5.4). Por citometria a quantificao da taxa de infeco torna-se mais eficiente e
rpida em relao aos mtodos de contagem convencionais, permitindo que esse tipo de
protocolo seja utilizado na avaliao antileishmanial de diferentes amostras.
Figura 5.4. Quantificao da taxa de infeco de macrfagos por L. amazonensis. Marcao de amastigotas, com
anticorpo monoclonal especfico, no interior de macrfagos infectados aps permeabilizao.
64
Protocolos baseados em citometria permitem a avaliao simultnea dos efeitos

antiparasitrios e citotxicos de diferentes compostos. Utilizando-se parasitos Leishmania
transgnicos expressando protenas reprteres, tais como a protena verde fluorescente (GFP)
possvel avaliar no s a morte do parasito em resposta a determinado estmulo no interior
da clula hospedeira, como tambm a viabilidade desta clula hospedeira. A marcao com o
corante vermelho fluorescente PI, permite a avaliao da viabilidade da clula hospedeira,
enquanto que a fluorescncia verde (GFP) emitida pelos parasitos no interior da clula fornece
a indicao da carga parasitaria. A reduo da intensidade de fluorescncia verde indica uma
reduo na carga parasitaria dos macrfagos, j que estes tero uma quantidade menor de
parasitos e conseqentemente uma menor emisso de fluorescncia pela GFP. Neste
protocolo, a permeabilizao da clula hospedeira para se acessar as amastigotas no
necessria, como descrito no pargrafo anterior e, portanto, a viabilidade dessas clulas
tambm pode ser avaliada. Esse mtodo, portanto, permite avaliar simultaneamente os efeitos
antileishmanial e citotxico de diversos compostos (Figura 5.5.).
Figura 5.5. Avaliao simultnea do efeito antileishmanial e citotxico de diversos compostos. (A) Esquema
mostrando a anlise simultnea da presena do parasito marcado com GFP no interior da clula hospedeira e da
viabilidade dessa clula, uma vez que a permeabilizao neste caso no necessria j que os parasitos j so
geneticamente marcados. (B) Histograma representativo.
Quando comparado com os mtodos de contagem de parasitas em preparaes

microscpicas, a avaliao do efeito de compostos antileishmaniais atravs de citometria de
fluxo apresenta maior objetividade e permite uma significativa reduo do tempo gasto na
anlise, visto que milhares de clulas so avaliadas a cada segundo.
A citometria de fluxo tambm utilizada para avaliar a proliferao celular em
Leishmania. O corante intracitoplasmtico 5-6-carboxifluorescena diacetato succinimidil
ster (CFSE) pode ser utilizado para se avaliar a diviso celular. O CFSE permite a
identificao da descendncia celular e a anlise da histria da diviso de clulas individuais.
65
O CFSE se liga as clulas parasitrias e a cada diviso a fluorescncia das clulas cai pela
metade, o que faz deste corante uma ferramenta ideal para monitorar a proliferao celular.
Cada clula filha herda aproximadamente a metade da marcao de CFSE, permitindo assim o
acompanhamento e quantificao das divises celulares.
Na tentativa de entender melhor as diferentes patogenias causadas por parasitas, vrios
estudos envolvendo a interao do parasita com a clula hospedeira tm sido desenvolvidos
com o uso da citometria de fluxo. A interao entre essas clulas dependente da interao de
vrios ligantes na superfcie do parasito com receptores na superfcie da clula hospedeira.
A interao de promastigotas de Leishmania com as clulas do hospedeiro baseia-se
no reconhecimento de ligantes do parasito por receptores dos fagcitos. Essas interaes
incluem a ligao de molculas de superfcie do parasito (lipofosfoglicanos e gp63) ou de
opsoninas derivadas do hospedeiro (complemento, fibronectina e imunoglobulinas) aos
mltiplos receptores dos macrfagos. Nesse sentido, a citometria de fluxo torna-se uma
ferramenta til para avaliao destes ligantes e receptores, responsveis pelo estabelecimento
da infeco pelos parasitos. A citometria pode ser utilizada como instrumento de estudo da
expresso e da modulao de receptores e ligantes de superfcie, a partir da marcao com
diferentes anticorpos.
Alm disso, pode ser utilizada tambm para investigar diversos parmetros associados
ativao ou anergia do sistema imune, com a identificao simultnea das subpopulaes
celulares envolvidas. A distino de subpopulaes celulares envolvidas com a patogenia,
principalmente linfcitos, realizada a partir da marcao de molculas de superfcie. A
anlise da expresso dessas molculas de superfcie permite identificar e avaliar a
representatividade de um determinado tipo celular em uma determinada infeco. O perfil das
molculas expressas nessas clulas varia de acordo com o parasito envolvido, desencadeando
diferentes patogenias.
A avaliao dos mecanismos imunolgicos associados leishmaniose extremamente
importante, uma vez que a resposta imune celular est diretamente relacionada patologia da
doena. A infeco por Leishmania desencadeia uma resposta imune bastante complexa, que
se inicia com a resposta imune inata, na qual receptores presentes na superfcie de
macrfagos, clulas dendrticas e NK reconhecem molculas presentes na superfcie dos
parasitas, tais como lipofosfoglicanos. Aps o reconhecimento dos parasitos, essas clulas
induzem a produo de citocinas proinflamatrias tais como TNF-alfa, IFN- e IL-12, bem
como molculas coestimulatrias. Nesta doena os macrfagos exercem um triplo papel,
sendo clulas hospedeiras, clulas efetoras e clulas apresentadoras de antgenos (APC) que
66
ativam clulas T especficas. Em modelos experimentais tem sido demonstrado que a resposta
Th1 leva cura da doena, enquanto a resposta Th2 leva progresso da doena (Figura 5.6).
A partir dos ensaios com citometria de fluxo possvel detectar o perfil da infeco,
relacionado predominncia de clulas do tipo Th1 ou Th2.
especficos
possvel
realizar
uma
investigao
Atravs de marcadores
detalhada
das
caractersticas
imunofenotpicas das clulas envolvidas na imunidade inata (macrfagos e moncitos) e

adaptativa (subpopulaes linfocitrias) no decorrer da infeco.
Figura 5.6. Resposta imune direcionada Leishmania. Em modelos animais, a suscetibilidade ou resistncia doena
depende do tipo de citocinas secretadas e do perfil de clulas T ativado. Enquanto a resposta Th1 induz a destruio
do parasito, a resposta Th2 possibilita a sobrevivncia do parasito e a progresso da doena.
O estado de ativao de macrfagos infectados ou no com algum parasito tambm

pode ser avaliado por citometria de fluxo utilizando-se a marcao de superfcie para
molculas relacionadas ativao celular ou marcadores intracelulares que identificam, por
exemplo, o xido ntrico.
A replicao dos parasitos nos macrfagos um processo regulado por citocinas, que
atuam no desenvolvimento da infeco ou na morbidade da doena. A citometria pode ser
utilizada com a finalidade de identificar essas citocinas e as principais subpopulaes
celulares produtoras.
A citometria de fluxo tambm pode ser utilizada para quantificar o papel funcional de
determinada organela ou a resistncia biolgica de um determinado parasita a drogas alm de
auxiliar na delimitao do mecanismo de ao de um determinado frmaco.
A citometria de fluxo oferece uma metodologia simples para realizar anlise do ciclo
celular, que consiste no conjunto de acontecimentos bioqumicos e morfolgicos responsveis
pela proliferao celular. A citometria possibilita o acompanhamento da distribuio das
clulas nas diferentes fases do ciclo em resposta a determinados estmulos ou ao de
67
drogas. Possibilita tambm a visualizao de clulas com padro anormal no contedo de

DNA.
A citometria de fluxo extensivamente utilizada em estudos de apoptose. As teorias e
modelos sobre morte celular programada so baseados na observao de marcadores
apoptticos tais como retrao celular, protuberncias (blebs) na membrana plasmtica,
condensao da cromatina, fragmentao de DNA, formao de vesculas, externalizao de
fosfatidilserina, estresse oxidativo, perda do potencial de membrana mitocondrial (m),
liberao de protenas mitocondriais (citocromo c, endonuclease G, fatores indutores de
apoptose) e atividade de proteases (caspases). Apesar de ser ainda uma questo em debate, o
mecanismo de morte celular programada tem sido detectado em diversos parasitas
unicelulares, inclusive em kinetoplastidas do gnero Trypanosoma e Leishmania, em resposta
a vrios estmulos quimioterpicos.
A avaliao dos nveis de apoptose nesses organismos por citometria de fluxo
realizada por mtodos que detectam caractersticas especficas desse processo, como
externalizao de fosfatidilserina por anexina V-FITC, deteco de alteraes no potencial de
membrana mitocondrial por rodamina ou JC-1; deteco de fragmentao do DNA atravs da
tcnica de Tunel, entre outros. Iodeto de propdeo e 7-AAD possibilitam observar em clulas
permeabilizadas a existncia de populaes hipodiplides, tambm compatveis com a
ocorrncia de apoptose. Ensaios de apoptose em promastigotas de Leishmania tratadas com
diferentes compostos (antimoniais, camptotecina e perxido de hidrognio) demonstraram
que durante o processo de morte celular programada ocorre a liberao de clcio dos estoques
intracelulares para o citoplasma das clulas. Esse on txico para o potencial de membrana
mitocondrial, devido a atividade de canais de clcio no especficos presentes na membrana
dessa organela, desencadeando o processo de apoptose. A deteco do aumento desse on no
citoplasma celular pode ser feita por citometria de fluxo utilizando-se o corante fluorescente
Indo-1.
Nesse captulo, objetivamos exemplificar algumas aplicaes da citometria de fluxo na
protozoologia. Neste contexto, uma variedade de aplicaes podem ser propostas e realizadas
com base na citometria de fluxo, provendo resultados interessantes e um considervel
aumento no nvel de conhecimento sobre as infeces parasitrias por protozorios.
68
CAPTULO 6. APLICAES DA CITOMETRIA DE FLUXO NA VIROLOGIA

6.1. Introduo
A citometria de fluxo um mtodo quantitativo moderno de se estudar as clulas.

Atravs dessa tcnica, mltiplas propriedades fsicas e biolgicas podem ser determinadas em
uma nica partcula clula, de forma rpida e precisa (Figura 6.1). A citometria usada
como uma tcnica suplementar para confirmar diagnsticos e fornece informaes de
prognstico valiosas. As subpopulaes de clulas em uma amostra podem ser avaliadas
utilizando diversos parmetros: Imunofenotipagem; Morfologia; Ciclo celular; Diviso
celular; Secreo de citocinas; Fluxo de clcio intracelular; Anlises de cromossomos; Nveis
intracelulares de espcies reativas de oxignio; Anlise do potencial de membrana
mitocondrial; Separao de clulas (Cell Sorting); Viabilidade (Apoptose); etc.
Figura 6.1. Parmetros que podem ser avaliados utilizando a citometria de fluxo. A partir da citometria diversos
parmetros celulares podem ser analisados, como imunofenotipagem, ciclo celular, diviso celular, produo de
citocinas, fluxo de clcio intracelular, nveis intracelulares de espcies reativas de oxignio, potencial de membrana
mitocondrial, viabilidade (apoptose), entre outros.
69
As doenas infecciosas so causadas por uma variedade de microorganismos.

Parasitos intracelulares obrigatrios, como algumas bactrias, fungos e protozorios, utilizam
sua prpria maquinaria celular para a replicao, transcrio e traduo do seu material
gentico. Tais parasitos tambm obtm suas prprias fontes de energia metablica. Os vrus,
por sua vez, so pequenas partculas que carregam pouco mais do que a informao gentica
na forma de cidos nuclicos. A replicao desses organismos depende obrigatoriamente da
maquinaria celular do hospedeiro. Dessa forma, os vrus so considerados os verdadeiros
parasitos obrigatrios. Eles apresentam um genoma pequeno composto de um nico tipo de
cido nuclico DNA ou RNA- que, em ambos os casos, pode ser formado por uma nica fita
ou dupla-fita. O genoma viral fica envolto por uma protena que, dependendo do tipo de vrus,
tambm envolta por um envelope lipdico. Os vrus replicam-se de vrias formas. Em geral,
sua replicao envolve (1) dissociao das partculas virais, (2) replicao do genoma viral,
(3) sntese de protenas virais usando a maquinaria da clula infectada, (4) organizao desses
componentes para a formao das partculas virais e (5) sua liberao para o meio celular de
forma lisognica ou ltica.
Dentre os diversos tpicos inerentes ao estudo dos vrus e suas propriedades,
incluem-se: classificao e estrutura viral; replicao viral; patognese viral; imunologia viral;
vacinas virais; terapias virais; mtodos de diagnsticos; quimioterapia antiviral, etc. Durante a
evoluo de uma infeco viral, o reconhecimento inicia a resposta inata na qual uma srie de
molculas efetoras e clulas esto envolvidas, no stio da infeco, para promover a destruio
do agente invasor e conter sua replicao e disseminao. Os principais mecanismos da
imunidade inata contra os vrus so a inibio da infeco pelos interferons e e a morte de
clulas infectadas, mediada pela clula NK. Se a imunidade inata no for o suficiente para
conter a infeco viral, tornam-se necessrios mecanismos de defesa mais especficos. Outras
clulas sero recrutadas, mais molculas sero produzidas e respostas altamente especficas
sero geradas - imunidade adaptativa. A imunidade adaptativa contra infeces virais
mediada por anticorpos, os quais bloqueiam a ligao do vrus e a entrada na clula
hospedeira, e por clulas T citotxicas, os quais eliminam a infeco destruindo as clulas
infectadas. Alguns vrus, assim como outros parasitos, desenvolveram mecanismos para
escapar dessas defesas, ficando latentes ou destruindo clulas que tenham um papel central na
imunidade efetora. Dependendo do tipo do vrus e da magnitude das respostas efetoras
geradas, as infeces virais podem apresentar um perfil agudo ou tender para a cronicidade.
As infeces agudas so caracterizadas por intensa replicao viral e ativao da imunidade
inata e adaptativa culminando no clearence viral e gerao de uma memria de vida longa.
70
Nas infeces virais crnicas, nveis elevados de replicao viral persistem por longos
perodos levando a uma estimulao contnua e conseqente perda da capacidade funcional e
elaborao de respostas efetoras pelo sistema imune.
Os estudos da patogenia das infeces virais, diagnstico e o monitoramento de uma
doena infectoparasitria envolvem uma srie de fatores que incluem a caracterizao e
quantificao do parasito, das clulas, dos receptores e mediadores inflamatrios envolvidos.
Para isso utilizam-se ensaios de imunofenotipagem com anticorpos monoclonais conjugados
fluorocromo ou sondas fluorescentes, ambos especficos a antgenos virais encontrados na
superfcie, citoplasma ou ncleo de clulas infectadas. Com esse propsito, a citometria de
fluxo torna-se uma ferramenta de extrema aplicao e importncia. Para demonstrar o estudo
das infeces virais por citometria, utilizamos como base um exemplo de infeco crnica
(causada pelo Vrus da Imunodeficincia Adquirida HIV) e um exemplo de infeco aguda
(Dengue).
As interaes vrus-clula do hospedeiro vm sendo analisadas em conjunto com a
citometria de fluxo por mais de 25 anos. O potencial da Citometria de Fluxo para anlise
multiparamtrica traz duas vantagens importantes no estudo de infeces virais:
Detectar e quantificar clulas infectadas;
Avaliar modificaes fenotpicas e funcionais das clulas infectadas ou no infectadas.
6.2. Deteco e quantificao de clulas infectadas
A citometria de fluxo permite caracterizar clulas infectadas obtidas de amostras

biolgicas de pacientes infectados ou de culturas celulares infectadas com vrus. Em geral, a
infeco de clulas por vrus resulta na produo de cidos nuclicos e/ou protenas que se
acumulam dentro da clula. Alm disso, a infeco causada por vrus envelopados est
associada expresso de glicoprotenas do envelope viral na superfcie de clulas infectadas.
Esses componentes virais podem ser avaliados por citometria atravs de sondas acopladas a
fluorocromos especficas a segmentos de cido nuclico viral ou anticorpos monoclonais
especficos a antgenos virais ou a marcadores celulares, com intuito de se detectar e
quantificar subpopulaes distintas de clulas infectadas.
Na infeco causada pelo HIV a desregulao observada nas clulas T CD4+,
tanto quantitativa quanto qualitativamente, a marca desta doena. A Infeco pelo HIV pode
ser definida como um estado de ativao imune crnica tendo seu curso clnico dividido em 3
fases: Infeco primria fase precoce (perodo de tempo a partir da infeco inicial pelo
71
vrus at o desenvolvimento da resposta de anticorpos); fase assintomtica ou de latncia

clnica; e fase sintomtica, onde surgem as doenas que definem a Sndrome da
Imunodeficincia Adquirida (AIDS). Com o uso da citometria de fluxo, podemos monitorar a
fase inicial da infeco permitindo detectar, por exemplo, a infeco precoce e macia das
clulas T CD4+ e sua depleo utilizando anticorpos especficos para protenas do
nucleocapsdeo viral, por exemplo a p24, versus molculas de superfcie caractersticas das
clulas CD4 ou outras. De fato, com auxlio da citometria de fluxo estudos demonstraram que
clulas marcadas para p24 aumentam com a progresso da doena e decaem a um nvel basal
em pacientes aidticos tratados com terapias antiretrovirais.
Ao longo da progresso da infeco pelo HIV, ocorre a perda contnua de
linfcitos TCD4. Em um determinado momento, quando os nveis de clulas T CD4 esto
muito baixos no paciente isso gera um quadro de imunodeficincia grave, com o
desenvolvimento e/ou reaparecimento de diversas infeces oportunistas, ao qual pode
culminar com o bito do paciente, em ausncia de tratamento. A infeco pelo
Citomegalovrus
Humano
(HCMV)
geralmente
assintomtica
em
indivduos
imunocompetentes, entretanto, vem se apresentando como uma importante infeco

oportunista em indivduos HIV positivo. O HCMV pertence famlia Herpesviridae. Na fase
aguda, ocorre uma intensa replicao viral com disseminao do vrus pelo sangue, levando a
um maior risco de progresso da doena clnica. A quantificao da carga viral em pacientes
com infeco persistente pode promover um mtodo para prever o desenvolvimento da
doena e ajudar a diferenciar a infeco assintomtica da sintomtica. A identificao por
citometria de populaes de clulas infectadas no sangue perifrico de pacientes que
receberam transplante de medula ssea, usando anticorpos monoclonais especficos a
antgenos virais de fase precoce um mtodo rpido para o diagnstico imediato da doena.
A caracterizao da protena da matriz do HCMV (pp65) fagocitada por neutrfilos do sangue
perifrico atravs de anticorpos monoclonais uma alternativa bastante utilizada no
monitoramento da carga viral sistmica como um marcador substituto para o diagnstico da
doena e incio do tratamento com terapias antivirais
A Dengue conhecida atualmente como a arbovirose mais importante no mundo.
Transmitida pelo mosquito Aedes aegypti, ela uma doena causada por uma infeco aguda e
que causa desde manifestaes brandas at quadros graves que podem culminar no bito. O
uso da citometria importante para complementar os estudos de diagnstico. Neste contexto,
nas clulas mononucleares do sangue perifrico de pacientes na fase aguda da doena
possvel detectar antgenos virais por citometria, enquanto que na fase convalescente no.
72
Alm disso, estudos in vitro vm demonstrando que fagcitos mononucleares representam

alvos importantes da replicao viral (Figura 6.2). De forma interessante, comparando-se o
percentual de clulas infectadas entre pacientes brandos e graves, foi confirmado o papel
dessas clulas como fontes de disseminao viral na fase inicial e conseqente gravidade da
doena. Atravs do uso de anticorpos monoclonais especficos a protenas do envelope ou no
estruturais do vrus possvel detectar sua presena tanto em fagcitos mononucleares como
FL2 Log:: CD14 PE
em clulas endoteliais e hepatcitos; e sua ausncia em linfcitos.
FL8 Log:: DENV Alexa-647
FL8 Log:: DENV Alexa-647
Figura 6.2: Caracterizao de moncitos humanos infectados ou no com DENV-2. Moncitos obtidos do sangue
perifrico de doadores saudveis foram cultivados em meio apenas(A) ou vrus infeccioso (C). As clulas foram
recuperadas e marcadas extracelularmente com Ac anti-CD14 PE e em seguida, intracelularmente com anticorpo
anti-dengue conjugado com Alexa fluor 647. O percentual de clulas CD14+, infectadas ou no, foi estabelecido por
citometria de fluxo. (Figura cortesia: Carvalho, A.T.).
Vem sendo bastante explorada em protocolos de citometria de fluxo, a avaliao da

atividade antiviral de diferentes drogas in vitro. O monitoramento de pacientes submetidos a
terapias antivirais, atravs da anlise de amostras clnicas, permite o uma avaliao da
susceptibilidade ou resistncia ao tratamento.
6.3. Caractersticas fenotpicas Susceptibilidade e funcionalidade
6.3.1. Susceptibilidade
A infeco viral iniciada pela interao do vrus com receptores especficos na

superfcie de clulas alvo e co-receptores. Portanto, a identificao de clulas expressando
receptores que interajam de alguma forma com partculas virais representou um avano na
compreenso da imunopatogenia de diversas infeces virais e do tropismo desses vrus por
diferentes tecidos e rgos.
73
Na infeco causada pelo HIV, o receptor a molcula CD4 (expressa

preferencialmente em linfcitos T auxiliares); e os co-receptores associados migrao,
CXCR-4 (expresso preferencialmente em linfcito T auxiliares) e CCR-5 (expresso
preferencialmente em macrfago). Os linfcitos T CD4 so os principais alvos de infeco e
replicao viral. Portanto, o vrus HIV capaz de subverter o sistema imune do hospedeiro
por infectar os linfcitos TCD4, que normalmente orquestram as respostas imunes
adaptativas. Isso gera um quadro de imunossupresso (AIDS) levando a uma deficincia na
montagem de respostas imunes contra infeces oportunistas.
Durante a infeco causada pelo vrus dengue, a partcula viral liga-se a receptores
especficos e/ou entra na clula por endocitose mediada por receptor. Dentre os vrios
candidatos sugeridos como receptores para o vrus, inclumos as molculas DC-SIGN
(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing non-integrine expresso
preferencialmente em clulas dendrticas), CD14, receptores do tipo Toll e um receptor de
manose (MBL). Esses marcadores so especficos de fagcitos mononucleares, principais
alvos da infeco pelo vrus dengue.
6.3.2. Funcionalidade
Os vrus tambm podem modular a expresso de protenas de superfcie ou

intracelulares em clulas infectadas ou no infectadas. Essas alteraes podem ser causadas
pela ativao celular em decorrncia da resposta imune desencadeada contra o patgeno ou
por influncia direta do vrus, como um mecanismo de escape. O padro fenotpico de
diferentes subpopulaes pode refletir na funcionalidade e diferenciao (naive, efetora,
memria) dessas clulas e pode ser monitorado por citometria.
Tem sido observado que clulas T CD4+ obtidas de pacientes infectados por HIV
apresentam um decrscimo na expresso de molculas envolvidas na sua ativao e nas
molculas associadas as funes de linfcitos B. A resposta citotxica mediada pelos
linfcitos T CD8+ crucial para supresso da replicao viral em indivduos HIV positivos. O
mecanismo de citotoxicidade se d pelo reconhecimento especfico de eptopos virais
apresentados via MHC-I pelas clulas infectadas. Protenas virais do HIV podem induzir a
diminuio de MHC-I na superfcie de clulas infectadas na fase aguda da doena,
diminuindo portanto, a atividade citotxica dos linfcitos T CD8+.
O Vrus da Hepatite C (HCV) causa uma doena crnica, podendo levar a uma
cirrose hepatica em decorrncia do tropismo preferencial do vrus por hepatcitos. Um
74
mecanismo pelo qual o HCV escapa do sistema imune e estabele uma infeco persistente
prejudicando as funes efetoras das clulas dendrticas. Estudos in vitro por citometria
demonstram que clulas dendrticas infectadas tem uma diminuio na expresso de MHC-I e,
portanto um defeito no desencadeamento de respostas efetoras do tipo Th1.
Nas infeces causadas por Dengue, apesar dos linfcitos T CD8+ e clulas NK no
serem susceptveis a replicao viral, trabalhos utilizando a tcnica de citometria demonstram
que a frequncia aumentada dessas subpopulaes celulares no sangue perifrico dos
pacientes est associada a um aumento na expresso de grnulos citotxicos em pacientes na
fase aguda da doena (Figura 6.3 e Figura 6.4). Moncitos obtidos do sangue perifrico de
pacientes da fase aguda com a forma branda da doena, apresentam um aumento na expresso
de receptores do tipo Toll 2 e 4, indicando que o perfil fenotpico ativado dessas clulas
importante na imunopatogenia da Dengue (Figura 6.5).
IMPORTANTE: Uma famlia de receptores bastante estudada na Imunologia, caracterizada

e quantificada por citometria de fluxo em muitos estudos de imunopatogenia de doenas, so
os receptores do tipo Toll. Essas molculas podem estar expressas na superfcie celular ou
compartimentalizadas em endossomas e atuam como receptores de reconhecimento padro
para uma variedade de molculas derivadas dos microorganismos (PAMPs). A via de
sinalizao pelos receptores do tipo Toll induz a produo de diversos peptdeos
antimicrobianos e citocinas que contribuem na defesa inata contra patgenos intracelulares e
extracelulares.
75
Figura 6.3: Ativao de linfcitos TCD8 durante a infeco por dengue. PBMCs do sangue perifrico de indivduos
saudveis (n:9) e de amostras de pacientes em diferentes dias da doena. As clulas foram marcadas
extracelularmente com Ac anti-CD8 PE e em seguida, intracelularmente com anticorpo anti-Tia 1 FITC ou seu isotipo
anticorpo IgG1 FITC Os nmeros em cada quadrante dos grficos de dot plot indicam o percentual de clulas Tia+ na
subpopulao de linfcitos TCD8. As mdias esto representando os 3 diferentes grupos de pacientes e controle. para
cada paciente e controles. A significncia estatstica foi avaliada pelo teste Mann-Whitney U com * representando P <
0,05 (Figura cortesia: Azeredo, E. L. et al.).
Figura 6.4: Ativao de clulas NK durante a infeco por dengue. PBMCs do sangue perifrico de indivduos
saudveis e de amostras de pacientes em diferentes dias da doena foram analisadas por citometria de fluxo. As
clulas foram marcadas extracelularmente com Aniticorpo anti-CD56 Cy e em seguida, intracelularmente com
anticorpo anti-Tia 1 FITC ou seu isotipo anticorpo IgG1 FITC Os nmeros em cada quadrante dos grficos de dot
plot indicam o percentual de clulas Tia+ em subpopulaes de clulas NK CD56+. As mdias esto representando os 3
diferentes grupos de pacientes e controle. para cada paciente e controles. A significncia estatstica foi avaliada pelo
teste Mann-Whitney U com * representando P < 0,05. (Figura cortesia: Azeredo, E. L. et al.).
76
Figura 6.5: Deteco de TLR-2 e TLR-4 em pacientes com Febre do Dengue: PBMCs do sangue perifrico de
indivduos saudveis (n: 6)s e de amostras de pacientes da fase febril (n: 10) e defervecncia (n: 13) foram analisadas
por citometria de fluxo. As clulas foram marcadas extracelularmente com Anticorpos anti-CD14 FITC e anti-TLR-2
PE (isotipo IgG PE) ou com Anticorpos anti-CD14PE e anti-TLR4 FITC (Isotipo IgG FITC). Os nmeros em cada
quadrante dos grficos de dot plot indicam o percentual de clulas + duplo marcadas, marcao simples ou nenhuma
marcao. A mdia dos percentuais de moncitos TLR-2+ e TLR-4+ esto representadas para cada paciente e
controles nos grficos A e B. A significncia estatstica foi avaliada pelo teste Mann-Whitney U com * representando P
< 0,05. (figura cortesia: Azeredo, E. L. et al.).
4. Apoptose
A apoptose um evento essencial tanto na fisiologia quanto na patogenia dos

organismos. Ela compreende um processo ativo de autodestruio, geneticamente regulado e
orquestrado por uma cascata complexa de eventos bioqumicos, liderando com mudanas
morfolgicas e finalmente morte celular por uma cadeia enzimtica complexa. Uma variedade
de sinais e estmulos, incluindo citocinas, agentes virais, qumicos ou fsicos podem
desencadear este evento. O programa pode ser engatilhado ou disparado por duas vias:
extrnseca (receptores de morte) e intrnseca (via mitocondrial). Independente de como ela
iniciada, a apoptose resulta na ativao das caspases que clivam protenas celulares e
promovem a destruio do material gentico. Os produtos da replicao viral so
freqentemente associados a alteraes nas vias de biossntese de protenas nas clulas
infectadas. Algumas vezes essas mudanas so importantes ativar a apoptose.
A desregulao da apoptose durante a infeco pelo HIV vista como um fator
importante na depleo de clulas TCD4 e TCD8 e progresso da doena. Protenas virais
77
induzem a apoptose de clulas TCD4 infectadas ou no, por diminuir a expresso de protenas
anti-apoptticas da famlia Bcl-2 como o Bcl-2, ou pelo aumento da expresso de receptores e
ligantes da famlia de morte, como Fas e FasL.O aumento na expresso de Fas em clulas
TCD4 naive e de memria; e a diminuio na expresso de Bcl-2 e Bcl-xL e clones de
linfcitos TCD8 HIV especficos tornam essas clulas mais susceptveis a apoptose. Protenas
virais induzem a diminuio da expresso de molculas de MHC-I em clulas infectadas,
prevenindo a apoptose mediada por citotoxicidade de linfcitos TCD8. O uso de marcao
por citometria para avaliar potencial de membrana mitocondrial e exposio de
fosfatidilserina demonstra que PBMCs de pacientes HIV positivos so mais susceptveis a
apoptose quando comparados aos PBMCs de pacientes que receberam terapia antiviral. Outro
dado interessante que o vrus tambm capaz de inibir a atividade citotxica de clulas NK
em clulas dendrticas infectadas, tornando-as importantes reservatrios para a persistncia
viral em tecidos linfides.
A apoptose vem sendo descrita nas infeces por Flavivrus. O papel de protenas
virais e mediadores inflamatrios produzidos durante a infeco promovem a induo da
apoptose . Resduos de aminocidos da protena de membrana do sorotipo 2 do vrus dengue
provocam disfuno mitocondrial e ativao de caspases em linhagens de clulas epiteliais
infectadas. Em pacientes na fase aguda da doena foi demonstrado um aumento na freqncia
de uma subpopulao de Linfcitos TCD8 do sangue perifrico expressando baixos nveis de
Bcl-2 comparado aos controles e pacientes na fase de convalescncia (Figura 6.6). A infeco
in vitro do vrus induz a expresso de fosfatidilserina e receptor Fas em moncitos infectados
in vitro (Figura 6.7). Todos esses eventos podem contribuir na susceptibilidade a gravidade da
Dengue.
78
Figura 6.6. Diminuio na expresso de Bcl-2 em linfcitos TCD8+ de pacientes na fase aguda da Dengue: A expresso
ex vivo de Bcl-2 em linfcitos T CD8+ obtidos do sangue perifrico de indivduos saudveis (controle) e pacientes na
fase aguda e de convalescncia, respectivamente. O percentual de clulas expressando nveis baixos, intermedirios
ou elevados de Bcl-2 foram determinadas por citometria atravs da marcao com anticorpos anti-Bcl-2 PE e antiCD8 Cy 5.5. Os grficos so representativos, onde: PBMCs isolados de controles (n = 8); pacientes na fase aguda (110 dias n = 10) e nas fases de convalescncia (> 11 dias n = 9) (Figura cortesia: Azeredo, E. L. et al.).
Inactivated
DENV-2
PI
Control
CD14 Cy5.5
Annexin V-FITC
Fas-FITC
Figura 6.7. Vrus Dengue-2 aumenta apoptose de moncitos humanos infectados in vitro. Moncitos foram obtidos a
partir de PBMCs de indivduos saudveis, cultivado e infectados com vrus da dengue. Dois dias aps infeco as
clulas foram recuperadas e marcadas com anexinaV FITC e iodeto de propdeo para avaliao de clulas apoptticas
e necrticas; e anticorpos anti-CD14 Cy5.5 e anti-Fas FITC para avaliao de moncitos expressando receptor Fas.
Os grficos so representativos 6 experimentos independentes. (Figura cortesia: Carvalho, A.T.).
79
CAPTULO 7. CONCEITOS BSICOS E APLICAO DE SORTING

Raquel Ferraz
A citometria de fluxo tem como princpio principal a aquisio e a anlise de clulas

e prover informaes acerca das caractersticas fsicas, qumicas e biolgicas destas clulas.
Os citmetros de fluxo que possuem esta capacidade so chamados de citmetros
analisadores. Alm deste recurso, alguns citmetros possuem uma configurao particular e
um sistema especfico que permitem a separao de populaes celulares puras e
homogneas, a partir de uma amostra heterognea, de acordo com critrios de caractersticas
biolgicas predefinidos (Figura 7.1). Estas populaes purificadas se tornam, ento,
disponveis para avaliaes morfolgicas ou genticas, bem como para ensaios funcionais e
de teraputica. Este processo citofluorimtrico conhecido como Flow Sorting (ou Cell
Sorting) e os citmetros de fluxo capazes de realizar este processo so chamados de Cell
Sorters.
Figura 7.1: Separao de clulas. Anlise de amostra heterognea, submetida ao Sorting e separada em amostras
homogneas.
Desde as primeiras aplicaes, realizadas por Leonard Herzenberg, o Sorting vem

sendo cada vez mais aplicado, tanto na rea da biologia como na rea industrial, devido
capacidade nica de isolar populaes celulares em um processo relativamente rpido; s
condies estreis que permitem que estas populaes sejam submetidas a outras
metodologias; pureza e integridade das clulas isoladas e, portanto, confiabilidade do
processo.
No entanto, foi em estudos na imunologia que o Sorting teve sua utilizao mais
acentuada, com a realizao, por exemplo, de purificaes de subpopulaes de linfcitos.
Detalhar todas as aplicaes desta tecnologia citofluorimtrica no faz parte do escopo desta
apostila, deste modo listaremos, abaixo, uma seleo de tcnicas para ilustrar a versatilidade
do Sorting por citometria de fluxo, algumas das quais sero detalhadas mais adiante:
80
Clonagem de uma nica clula a partir de clulas de hibridoma para a produo de

anticorpos monoclonais;
Seleo de clulas progenitoras (CD34+) em busca de clulas-tronco pluripotentes;
Isolamento e purificao de diferentes linhagens, incluindo clulas-tronco, a partir de

amostras de medula ssea;
Seleo clulas transfectadas com um marcador de expresso, como a Green

Fluorescence Protein (GFP);
Isolamento mutiparamtrico de clulas a partir de populaes mistas;
Sexagem de smem atravs do Sorting de espermatozides utilizando a diferena no

contedo de DNA entre os cromossomos portadores de X e Y;
Sorting de uma nica clula para ensaios in vitro a partir de um clone celular.
7.1 Princpios
Durante a aquisio e anlise das amostras devemos definir, nos dot plots e/ou
histogramas, regies de interesse (gates) para selecionar as populaes celulares que
desejamos separar. O processo de Sorting se inicia com o estabelecimento de procedimentos
junto ao software e ao equipamento visando que as clulas escolhidas sejam direcionadas para
um recipiente que as armazenaro (tubos ou vrios tipos de placas de cultivo).
Estes procedimentos incluem uma vibrao da cmara de fluxo (Flow Cell) levando
o fluxo contnuo de salina a se quebrar em gotas (droplets). Assim cada clula dentro de
uma gota interceptada pelo laser e posteriormente passa por uma placa de carreamento de
eltrons, onde recebe uma carga positiva ou negativa dependendo do critrio de seleo prestabelecido no software de aquisio e anlise. Por exemplo, se duas subpopulaes de
linfcitos T CD4+ e CD8+, forem escolhidas para serem separadas, cada gota contendo uma
destas clulas receber uma carga positiva e outra gota contendo a outra clula receber uma
carga negativa. A seguir, as gotas so atradas por placas defletoras com carga eltrica
contrria da gota, de forma que as gotas carregadas ao invs de seguir o fluxo de lquido
contnuo, regular do equipamento, so atradas pelas respectivas placas (Figura 7.2).
81
Figura 7.2: Principio do Cell Sorting.
IMPORTANTE: Alguns usurios de citmetro de fluxo utilizam, ao invs de

soluo salina, gua destilada para realizar a anlise de amostras. Entretanto, para o Sorting
fundamental que as gotas sejam formadas por soluo salina, j que a separao das clulas
baseada na transferncia de ons.
Atravs de parmetros eletrnicos especficos, como freqncia, fase, e drop delay,

deve-se ajustar o equipamento quanto distncia precisa entre a primeira gota a ser formada e
a flow cell; a distncia entre as gotas de forma que cada uma contenha uma nica clula ao ser
interceptada pelo laser; e o tempo correto que cada gota deve levar entre a flow cell e a placa
de carreamento, a fim de atingir 100% de pureza de eficincia da separao homognea das
82
populaes celulares. A eficcia do Sorting pode ser conferida atravs de nova aquisio das
clulas isoladas, as quais devem ser positivas somente para o parmetro que foi selecionado.
7.2 Aplicaes do Sorting
O Sorting um processo que pode ser utilizado tanto em pesquisa bsica,

quanto em pesquisa clnica nas reas de imunologia, microbiologia, gentica, parasitologia,
oncologia, biologia molecular e toxicologia.
A partir da amostra homognea submetida ao Sorting, podem-se utilizar
diversos ensaios experimentais e metodologias devido ao alto grau de pureza das amostras, a
integridade das clulas aps a separao, alm das condies estreis em que realizado este
processo.
Alm disso, utilizando esta tecnologia possvel determinar o nmero de
clulas a ser separado, o que confere ainda mais especifidade a este processo.
Em alguns equipamentos possvel, ainda, separar apenas uma clula, em um
processo chamado de Single Cell Sorting (ou clonagem), muito utilizado para clonar parasitos
para serem cultivados para enriquecimento de acervos das colees parasitrias ou serem
utilizados em ensaios in vitro ou de biologia molecular. Geralmente neste processo cada
clula direcionada para um poo de placa de cultivo e para isso o citmetro de fluxo deve ter
alm do suporte especfico para placa que permite a sua movimentao para que cada poo
receba a clula, um dispositivo para calcular a direo que esta deve seguir (Figura 7.3).
Figura 7.3. Clonagem. Placa de cultivo em movimento para que cada poo receba uma clula.
83
IMPORTANTE: A clonagem de parasitos pode ser baseada apenas na anlise de parmetros

morfolgicos caractersticos daquela clula, isto , tamanho e granularidade. Sem a
necessidade do uso de anticorpos e fluorocromos.
Os ensaios in vitro utilizando amostras homogneas so utilizados para uma

variedade de aplicaes, podendo ser til na avaliao de caractersticas fenotpicas e
funcionais de uma mesma populao celular frente a estmulos especficos, na infeco de
uma nica clula com determinado parasito, assim como em ensaios de dosagem, resistncia e
ao de drogas.
O seqenciamento outra metodologia aplicada a partir de uma populao celular
obtida por Sorting. Estas clulas podem, ser submetidas ento a estudos genticos de
sequenciamento do DNA, utilizando a PCR, mostrando que a citometria de fluxo combinada
biologia molecular, permite a realizao da fenotipagem e genotipagem.
Na rea da fertilizao a separao de espermatozides tem sido aplicada atravs de
marcadores de viabilidade celular, ou ainda atravs da diferena de contedo de DNA entre os
cromossomos X e Y, muito utilizada para reproduo de bovinos, mas eticamente ainda
controversa para reproduo humana.
Outra aplicao do Sorting inclui estudos de clula-tronco pluripotente a partir da
purificao de diferentes linhagens de clulas progenitoras de amostra de medula ssea.
Com o avano tecnolgico e o aprimoramento dos equipamentos, atualmente alguns
citmetros de fluxo cell sorter so capazes de separar 100 mil eventos por segundo, e separar
at seis populaes a partir de uma mesma amostra, abrindo caminho para uma variedade de
aplicaes.
84
CAPTULO 8. PROTOCOLOS PARA CITOMETRIA DE FLUXO

8.1. Protocolos de Citometria
Os protocolos para anlise em citometria de fluxo devem ser preparados

considerando alguns fatores importantes:
1) Quantas cores o citmetro de fluxo capaz de ler;
2) Saber o tipo e a quantidade da amostra (sangue, fludos, tecidos, parasitos, etc.);
3) Cuidado no preparo e estoque dos reagentes de citometria;
4) Saber quais os marcadores sero utilizados e a cor de fluorescncia de cada um deles;
5) Utilizar um controle interno (isotipo);
6) Organizao e armazenamento dos dados obtidos.
8.2. Preparo da Amostra
Para que seja possvel analisar uma amostra no citmetro necessrio,

primeiramente, que o material esteja em suspenso celular. Materiais como sangue perifrico,
medula ssea, lquido peritoneal e pleural, so suspenses celulares naturais. Amostras
obtidas de culturas celulares tambm so consideradas suspenses, embora o procedimento de
obteno dependa do tipo de clula que est sendo cultivada. J rgos como bao, fgado e
tecidos tumorais, devem ser submetidos a processamentos especiais para obteno das clulas.
Em alguns casos, as amostras devem tambm ser filtradas para reduzir qualquer tipo de
varivel que possa influenciar durante os procedimentos de marcao ou danos durante a
aquisio das amostras pelo citmetro. Geralmente requerido, 0.5 ml de suspenso celular,
com uma concentrao ideal na faixa de 105 to 106 clulas/mL. Para muitas amostras, mesmo
em suspenso, necessria uma etapa de separao de clulas por ensaios especficos para
obteno da(s) subpopulao de interesse e eliminao de hemcias e debris celulares.
Tomando todos os cuidados necessrios, segue-se a etapa de marcao das clulas
com anticorpos especficos.
Como sabemos para a tcnica de citometria as amostras analisadas so submetidas a
um ensaio de Imunofenotipagem, ou seja, um sistema de marcao via Anticorpos especficos
e/ou reveladores a um stio, ou stios antignicos de um antgeno.
85
IMPORTANTE: A separao por Ficoll-Hypaque bastante utilizada para obteno de

clulas mononucleares do sangue perifrico (PBMCs). O Ficoll-Hypaque consiste em uma
mistura de polissacardeos neutros hidroflicos de alta densidade que se dissolve prontamente
em soluo aquosa. Quando apropriadamente misturado em temperatura ambiente, o FicollHypaque mais denso que as clulas mononucleares e as plaquetas. Por ser uma soluo
txica e causar lise celular, a mistura colocada no fundo de um tubo e o sangue (coletado em
presena de anticoagulante para evitar a coagulao) vagarosamente colocado sobre a fase
de Ficoll. Aps centrifugao, as duas fases tornam-se bem visveis e a separao ocorre da
seguinte maneira: na fase superior ficam o plasma e seus constituintes solveis, na interface as
clulas mononucleares, em seguida o Ficoll e aps os eritrcitos e granulcitos que ficam sob
a forma de um sedimento celular no fundo do tubo.
IMPORTANTE: Para que seja possvel a anlise correta no citmetro, devemos ficar atento
a vrios procedimentos, tanto na obteno quanto no preparo e procedimentos de marcao
das amostras. Minimizar a perda de material a ser analisado, reduzir alteraes morfolgicas e
evitar ou minimizar variveis que influenciem na antigenicidade, so alguns exemplos.
8.3. Ensaio de Imunofenotipagem
A imunofenotipagem consiste num sistema de marcao via interaes entre

anticorpos especficos, antgenos e anticorpos reveladores. O desenvolvimento de ensaios de
imunofenotipagem tem sido til para clnicos e epidemiologistas elaborarem diagnsticos
conclusivos. A citometria uma tcnica imunolgica fundamental, utilizada para deteco de
Antgenos ou Anticorpos numa amostra, baseado nessas interaes. O uso de anticorpos
especficos de amplo espectro torna a citometria uma das mais tcnicas laboratoriais mais
sensveis e especficas, fornecendo dados tanto qualitativos quanto quantitativos. Alm da
anlise de clulas normais, as aplicaes clnicas do uso da citometria na imunofenotipagem
tambm se estendem a identificao e estudo patolgico de leuccitos e outras clulas
sanguneas.
Os citmetros tm a habilidade de selecionar e quantificar simultaneamente diversos
parmetros distintos de uma amostra contendo milhares de clulas. Essa anlise feita
individualmente para cada clula e em poucos minutos. As clulas so geralmente marcadas
direta ou indiretamente (via anticorpos) com fluorocromos, quando excitados ou quando
submetidos a uma ao ou atividade de um componente celular em particular.
86
IMPORTANTE: A intensidade de fluorescncia emitida pelo fluorocromo acoplado uma

molcula, como o anticorpo, est diretamente relacionada com o nmero de locais de ligao
dessa molcula de reconhecimento. Geralmente os anticorpos conjugados a fluorocromos
especficos a um determinado antgeno podem tambm se ligar de forma inespecfica a outras
molculas presentes na clula. Para evitar a interferncia de falsa positividade nos resultados
preciso quantificar e eliminar a fluorescncia inespecfica, comparando as amostras marcadas
com anticorpo especfico amostras marcadas com um anticorpo isotpico - anticorpo da
mesma classe do anticorpo especfico mas com especificidade para algo irrelevante.
IMPORTANTE: Cuidados devem ser tomados para que a concentrao ideal do anticorpo
disponvel no decaia em decorrncia da sua ligao a formas solveis do antgeno na amostra
a ser testada.
8.4. Marcao direta
O uso de anticorpos conjugados a fluorocromos para identificar antgenos especficos

dentro ou na superfcie das clulas bastante explorado na Imunologia e imunodiagnstico,
onde a maioria das amostras celulares j est em suspenso. Quando o anticorpo de deteco
j vem conjugado a um fluorocromo, dizemos que o ensaio de imunodeteco utilizado uma
marcao direta. As clulas em suspenso so incubadas com os anticorpos conjugados ou
anticorpo controle (isotipo). Posteriormente as amostras so submetidas lavagem para a
eliminao dos anticorpos que no se ligaram (Figura 8.1).
Esse ensaio tem a vantagem de ser rpido e simples porque apenas uma nica
incubao com um ou mais anticorpos marcados com fluorocromos e de especificidade
distintos requerida. Entretanto, necessrio que todos os anticorpos sejam conjugados a
fluorocromos distintos e, portanto, sua produo torna-se mais complexa, o que encarece o
produto.
8.5. Marcao indireta
Na imunodeteco indireta, as clulas em suspenso so incubadas com um

anticorpo no marcado, especfico ao antgeno que se quer avaliar (anticorpo primrio).
Posteriormente as clulas so lavadas e incubadas com um anticorpo secundrio conjugado ao
fluorocromo que especfico a imunoglobulina da mesma natureza no qual o anticorpo
87
primrio foi gerado e analisado. O anticorpo controle (isotipo) correto nesse tipo de
imunoensaio ser um anticorpo no conjugado da mesma classe de imunoglobulina do
anticorpo primrio e tambm ser incubado ao anticorpo secundrio conjugado (Figura 8.1).
Ao contrrio da marcao direta, a marcao indireta um ensaio mais demorado e
dispendioso, pois requer o uso de dois tipos de anticorpos, alm de aumentar a probabilidade
de marcaes inespecficas. Entretanto, a principal vantagem desta tcnica compreende na
maior sensibilidade devido amplificao do sinal adquirida pela ligao de vrios anticorpos
secundrios a um nico anticorpo primrio (Figura 8.1).
Figura 8.1. Marcao direta e indireta
8.6. Marcao extracelular
Uma das aplicaes clnicas mais comuns da citometria de fluxo a determinao de

antgenos de superfcie (imunofenotipagem) (Figura 8.2). Todas as clulas normais expressam
uma variedade de marcadores de superfcie. Entretanto, anomalias associadas a maturao ou
causadas pela infeco por parasitas intracelulares podem interfirir na expresso natural
dessas molculas. Atravs da citometria podemos distinguir entre clulas saudveis e aquelas
anormais ou infectadas.
88
8.6.1. Soluo de fixao: Clulas vivas versus clulas fixadas
Existem boas razes para o uso de clulas vivas quando se quer caracterizar a expresso
de receptores de superfcie. Nessas condies, tenta-se ao mximo manter as clulas num
estado natural, prximo do que ocorre in vivo. Portanto o ajuste da quantidade de sal,
temperatura, pH e outros componentes proticos devem obedecer a um parmetro fisiolgico.
Nos protocolos de marcao extracelular, geralmente fixamos as amostras ao trmino do
ensaio de imunofenotipagem para preservar as marcaes, permitindo uma anlise posterior.
A utilizao do protocolo de fixao celular em citometria, antes dos procedimentos de
marcao extracelular, pode alterar a antigenicidade do anticorpo causando resultados falsonegativos, embora a ultraestrutura da membrana celular permanea ntegra.
IMPORTANTE: Em protocolos de marcao para avaliao funcional da habilidade

fagoctica e morte celular necessrio o uso de clulas viveis, sem etapa de fixao. Como
so eventos dinmicos, a preparao de amostras temporrias possibilita a visualizao de
material biolgico in vivo, no seu estado natural.
Adiante ser explicado com mais detalhes a importncia da etapa de fixao e os tipos de
fixadores a serem utilizados durante o procedimento de citometria de fluxo.
8.6.2. Soluo de bloqueio
Anticorpos podem se ligar de forma inespecfica, geralmente com baixa afinidade, a

outros componentes da clula. Portanto, um passo importante nos procedimentos de marcao
extracelular o uso de solues que inibam ou reduzam as marcaes inespecficas. Essas
solues so chamadas de solues de bloqueio. As ligaes inespecficas geralmente
ocorrem como produto da adsoro de molculas de anticorpo superfcie celular sem haver
reao antgeno-anticorpo ou pela interao da poro Fc da imunoglobulina com receptores
na superfcie de diferentes populaes leucocitrias. Portanto, durante os procedimentos de
marcao, costuma-se tratar as amostras previamente com uma soluo de bloqueio, composta
de salina tamponada (pH fisiolgico), albumina srica bovina e plasma humano inativado.
89
8.6.3. Soluo de lavagem
Independente da procedncia da amostra utilizada e do protocolo de marcao a ser

utilizado, importante que ela seja mantida em solues contendo nutrientes para sua
manuteno e sob condies que evitem ao mximo sua degenerao. Alm disso, clulas
mortas, debris, anticorpos que no se ligaram ao antgeno, excesso de solues de bloqueio e
de fixao, devem ser removido da suspenso para no influenciarem na viabilidade,
morfologia e funcionalidade celular. Portanto, nos diferentes protocolos de citometria, desde a
obteno da amostra e durante todo ensaio de marcao, as clulas so submetidas a lavagens
seqenciais. A soluo de lavagem geralmente feita com salina tamponada de pH
fisiolgico, azida sdica e albumina srica bovina. Geralmente, as demais solues citadas
anteriormente e a seguir so feitas a partir da soluo de lavagem.
IMPORTANTE: Durante o preparo de solues para o tratamento de amostras celulares em

citometria de fluxo, deve-se ajustar as concentraes de sal e pH nessas solues. Altas
concentraes de sal e pH extremo podem levar ao rompimento dos imunocomplexos
antgeno anticorpo.
8.7. Marcao intracelular
Em muitas reas de pesquisa, vem se tornando de extrema importncia a deteco

e/ou quantificao de antgenos intracelulares incluindo componentes estruturais, enzimas,
fatores de transcrio e glicoprotenas destinas a secreo ou exportadas (Figura 8.2).
Anticorpos, assim como substncias fluorescentes, so molculas relativamente
grandes, no sendo permevel a membrana das clulas. Portanto, se componentes internos
devem ser marcados, as membranas plasmticas e das organelas devem ser permeabilizadas,
antes ou durante o ensaio de imunodeteco. Ao mesmo tempo, os antgenos-alvo devem
permanecer dentro da clula. Por estas razes, os protocolos de marcao intracelular tambm
so acompanhados de etapas de fixao.
90
Figura 8.2. Marcao extra e intracelular
8.7.1. Soluo de fixao
A antigenicidade, em geral, perdida progressivamente com o aumento da

concentrao e tempo de incubao das amostras com o agente fixador. Portanto, para a
escolha do fixador ideal deve-se sempre levar em considerao essas duas caractersticas.
Existem dois tipos principais de agentes fixadores utilizados em citometria e em
outros ensaios laboratoriais que requeiram esse tipo de procedimento.
Os alcois e acetonas competem com as molculas de gua na formao de pontes de
hidrognio causando a precipitao local de protenas. Porm, eles no fixam cidos nuclicos
ou carboidratos que, portanto, extravasam das clulas durante as etapas de lavagem. Um outro
problema no uso desses tipos de fixadores em citometria que eles tendem a formar
agregados celulares.
O paraformaldedo o fixador mais utilizado em citometria. Ele consiste na forma
polimerizada do formaldedo, mas que pode se dissolver vagarosamente em soluo aquosa
com pH e temperatura apropriados. O formaldedo reage, ligando-se covalentemente a muitas
macromolculas biolgicas. Seus principais alvos so grupos amino em aminocidos de
protenas e nas bases de cidos nuclicos. Ele tambm um bom fixador de lipdios e no
altera os grupamentos funcionais de glicoprotenas de superfcie celular.
91
IMPORTANTE: Ps-fixao A ligao dos anticorpos a antgenos de superfcie ou

intracelulares pode ser preservada encubando paraformaldedo, diludo em soluo salina
tamponada (PBS). A fixao sob essas circunstncias ir prevenir a perda da marcao
fluorescente nas amostras. Como a exposio ao fixador pode promover danos estruturais s
clulas, este utilizado em baixas concentraes e incubado por um curto perodo de tempo.
Essa fixao branda o suficiente para inibir alteraes celulares geradas por vias
metablicas ou energticas.
8.7.2. Soluo de permeabilizao saponina
Aps a fixao branda com formaldedo, as clulas tambm mostram um aumento

na permeabilidade a molculas pequenas mais ainda permanecem impermeveis a grandes
molculas como os anticorpos. A saponina o agente permeabilizante mais utilizado em
citometria. Produzida por vrias plantas, as molcula de saponina contm uma regio
lipoflica que se insere nas membranas e interage com colesterol, fosfolipdios e protenas. As
saponinas rompem as interaes entre colesterol e fosfolipdio e criam poros na membrana
das clulas grandes o suficiente para permitir a entrada de macromolculas, sem alterar a
integridade da membrana e preservando a morfologia e os antgenos de membrana, em baixas
concentraes.
IMPORTANTE: A formao dos poros pela saponina reversvel. Os anticorpos devem

entrar na clula para marcar o antgeno intracelular. Aps a etapa de incubao, aquelas
molculas que no interagiram com o antgeno devem ser retiradas por lavagem. Portanto,
essencial manter a saponina em todas as etapas do procedimento de marcao das amostras.
92
CAPTULO 9. PRTICA DE IMUNOFENOTIPAGEM E APOPTOSE

Amanda Torrentes de Carvalho, Grazielle Alves Ribeiro & Raquel Ferraz
9.1. Tipos de amostras utilizadas em ensaios de citometria de fluxo
A. Amostra de sangue:
Em tubos com EDTA - o preferencial para a imunofenotipagem e demais
protocolos de marcao com anticorpos monoclonais;
Em tubos com Heparina quando as clulas forem submetidas ensaios de cultivo
celular.
B. Cultura de clulas - Dependendo do tipo celular a obteno pode ser feita por ao
enzimtica, trmica e/ou mecnica;
C. Outras: Lquor; lavados peritoneal e bronco-alveolar (BAL) pulmonar; MO suspenses celulares naturais;
D. rgo ou tecidos: Processamentos especiais para obteno das clulas em suspenso
ao enzimtica, mecnica e/ou trmica.
9.2. Protocolo Prtico Marcao de receptores de membrana e de apoptose em PBMCs
Para a caracterizao fenotpica (imunofenotipagem) de algumas subpopulaes de

linfcitos T e para a determinao de apoptose nessas clulas, aplica-se o mesmo protocolo
citofluorimtrico tanto para amostras de sangue (obtidas por puno venosa), quanto para
clulas de cultura.
9.2.1. Mtodos de processamento de sangue para ensaios de citometria de fluxo
H duas maneiras de utilizar amostras de sangue para serem submetidas a protocolos

de citometria de fluxo:
Sangue Total (submetido a uma lise prvia das hemcias) - ST
Clulas Mononucleares do Sangue Perifrico (submetidos a uma centrifugao em
gradiente de sedimentao) - PBMC
Sero abordados trs protocolos para obteno de ST (A, B e C) e um protocolo para
obteno de PBMC (D) baseando-se na lise ou excluso das hemcias, mantendo a
morfologia dos leuccitos e a integridade da membrana celular:
93
IMPORTANTE: As hemcias so clulas crticas para a aquisio de amostras, podendo

causar problemas de entupimento no equipamento e atrapalhar na identificao de linfcitos
quanto ao tamanho e a granularidade e na anlise dos resultados.
A) Optilyse C (Beckman Coulter); Optilyse B (BD)
O optilyse um reagente prprio para a preparao de clulas a serem analisadas por

citometria de fluxo, que se baseia na lise de hemcias e fixao dos leuccitos. Esse reagente
deve ser armazenado em temperatura ambiente e j vem pronto para utilizao, um uma nica
soluo, composta de cido frmico para lise das hemcias, tampo e fixador (1,5% de
formaldedo), no sendo necessria nenhuma diluio.
Protocolo:
Em 100L de sangue, contendo 5x105 clulas (sangue pode estar diludo em PBS
para ajustar as clulas para 5 x 103/L) adiciona-se 5 L do Ac anti-CD4-FITC, 5
L de Ac anti-CD8-PE e 5 L de AC anti-CD3-PC5 (diludos em PBS);
Agitar em vortex e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente, protegido da
luz; Lavar e centrifugar a amostra e em seguida adicionar 500 L de Optilyse C,
agitando imediatamente;
Incubar por mais 10 minutos em temperatura ambiente;
Adicionar 500 L de PBS; agitar mais uma vez; e fixar com paraformaldedo 1%.
Em 10 minutos a amostra j est pronta para ser analisada, mas pode ser
armazenada por 24 horas na geladeira.
IMPORTANTE: Como a amostra fixada no se pode realizar, por exemplo, protocolos de

marcao para apoptose (7AAD e PI) ou proliferao celular, que necessitem de clulas
viveis. Outra limitao a no eficincia da lise das hemcias em algumas patologias como
insuficincia renal, hemoglobinopatias, etc...
94
B) Lysing solution, NH4Cl (Beckman Coulter)

O Lysing solution permite a preparao de amostras como sangue e medula ssea,
atravs da lise de hemcias por do cloreto de amnia (alm de EDTA e bicarbonato de
potssio). A soluo vem 10x concentrada, e deve ser diluda em gua deionizada somente no
dia em que for fazer a lise, e depois descartada. No se devem armazenar as amostras
processadas na geladeira, somente a soluo-me. A vantagem de sua utilizao que ele no
tem componente de fixao e pode ser utilizado em protocolos que requeiram o uso de clula
vivas.
Protocolo:
Em 100L da amostra contendo entre 5 x 105 e 1 x 106 clulas, adicionar o
anticorpo monoclonal desejado e agitar por vortex por 5 segundos antes da etapa de
incubao (por 20 minutos, protegido da luz e em temperatura ambiente);
Aps a incubao adicionado 2mL da soluo de lise, j diluda, e novamente
agitada por 5 segundos; Outra incubao feita, por 10 minutos, protegido da luz,
para que ocorra a lise das hemcias;
A amostra submetida centrifugao por 5 minutos a 300g; O sobrenadante
descartado e o pellet celular ressuspendido em 1mL de PBS seguido de mais 5
segundos de agitao no vortex;
A amostra j est pronta para ser analisada, mas pode ser armazenada por at 2h na
geladeira (*aps este perodo a propriedade de fluorescncia comea a ser
prejudicada; j que a amostra no est fixada). No caso de se utilizar uma
soluo fixadora uma nova lavagem deve ser realizada para em seguida adicionar a
soluo de fixao com paraformaldedo.
C)
ImmunoPrep (Beckman Coulter)
O ImmunoPrep tambm um reagente utilizado no preparo dos leuccitos a serem

analisados por citometria de fluxo, atravs da lise, tamponamento e fixao das clulas,
previamente marcadas com os anticorpos monoclonais acoplados aos fluorocromos desejados.
composto por trs solues separadas: ImmunoPrep A (cido frmico), ImmunoPrep B
(tamponamento) e ImmunoPrep C (fixao), que podem ser preparadas manualmente.
95
Alm de ser um mtodo extremamente facilitador (automatizado), o processamento

das clulas com este reagente no necessita de etapa de lavagem, acelerando ainda mais o
processo. O fixador mais utilizado o formoldedo. Metanol e etanol so pouco usados por
grumar as clulas.
O processamento das clulas pode ser realizado na bancada ou atravs do Multi Q prep
(Beckman Coulter); ou FACS Prep (BD), que um aparelho que possui um carrossel com
capacidade de 32 amostras, capaz de distribuir os reagentes e misturar de forma automatizada.
Muito utilizado nos laboratrios de anlises clnicas, j vem com o cdigo de barras pra
identificao dos tubos; e este carrossel pode ser diretamente acoplado no citmetro para a
anlise das amostras.
D)
Obteno de PBMC atravs de gradiente de Ficoll-Hypaque
A soluo de Ficoll-Hypaque o gradiente de densidade mais utilizado para isolar

clulas mononucleares. O Ficoll um polmero de sacarose de alto peso molecular e o
Hypaque (ou isopaque) um composto orgnico iodado. Como um meio de separao, o
ficoll aumenta a viscosidade promovendo a formao de rouleaux dos eritrcitos e o Hypaque
aumenta a densidade do meio. Quando apropriadamente misturado e com densidade de 1077
em temperatura ambiente, o Ficoll-Hypaque mais denso que as clulas mononucleares e as
plaquetas. Com o uso de centrifugao, os granulcitos, eritrcitos e os moncitos carregados
de ferro ficaro depositados no tubo de centrifugao. Os gradientes de Ficoll-Hypaque so os
mais utilizados em laboratrios clnicos para separar os componentes celulares do sangue
perifrico.
Protocolo (Figura 9.1):

Utilizam-se duas partes de sangue diludo em meio, colocada lentamente sobre uma
parte de Ficoll que deve estar em temperatura ambiente. Dependendo do volume
final, fazer em tubo de 15ml ou de 50ml (usar tubo de 50 ml para volume final
maior do que 30 ml, porque volume pequeno pode prejudicar a visualizao e
retirada do anel de clulas). * O Ficoll armazenado na geladeira e protegido da
luz, mas nunca deve ser usado gelado para evitar sua polimerizao e
prejudicar na viabilidade das clulas presentes na amostra;
O sangue pode ou no estar diludo 1:1 em meio RPMI completo com 10% de
SFB, ou em PBS. Se o sangue estiver fresco no tem problema usar sem diluio,
96
caso contrrio recomendado diluir pra no prejudicar a formao do anel de

PBMC. * O ideal utilizar o sangue fresco, processado em at 6h depois da
coleta, podendo ser armazenado, desde que em temperatura ambiente, at 48h.
Aps 36 horas na bancada a qualidade do Ficoll comea a ser prejudicada;
Diferentes protocolos so utilizados para obteno de PBMC atravs do Ficoll, mas
geralmente o anel formado com rotao de 400g durante 30 minutos em
temperatura de 20C. No recomendado usar freio para no desfazer o anel, e
preferencialmente usar acelerao mnima. Alguns protocolos aumentam a
rotao e diminuem o tempo tanto na formao do anel quanto nas lavagens
posteriores;
O anel de clulas mononucleares retirado com cuidado, geralmente com pipeta

Pasteur, para evitar aspirar Ficoll, que txico e causa lise celular, ou contaminao
por granulcitos. A remoo de plasma em excesso causar contaminao da
amostra por protenas do plasma;
A suspenso celular transferida para outro tubo, no gelo, onde se acrescenta 10mL
de meio de cultura e submete-se a soluo a lavagens e centrifugaes (250g, por
10 min, temperatura ambiente com freio e acelerao) de 3 a 4 vezes para a
retirada de resduo de Ficoll. Alguns protocolos recomendam fazer a ltima
lavagem a 40 C;
Em seguida as clulas devem ser ressuspendidas em PBSAZ (2% de soro + 0,1% de
azida sdica) e uma alquota retirada e diluda 1:10 em Azul de Tripan 0,2% para
verificar a viabilidade e contagem das clulas em cmara de Neubauer. A
concentrao celular deve ser ajustada para 1 x106 clulas/mL.
Marcao de receptores de membrana e de apoptose de PBMC obtidos a partir de
cultivos in vitro.
97
Figura 9.1. Obteno de PBMCs pela tcnica do Ficoll-Hypaque
Na cultura de PBMC os moncitos ficam aderidos no fundo da placa de cultura e sua

obteno geralmente requer ao mecnica por tripsinizao ou raspagem do fundo da placa
na presena de meio de cultura, em temperatura fria. As clulas cultivadas devero ser
retiradas dos poos da placa de cultura sem a etapa da raspagem, para obteno da suspenso
rica em linfcitos. Como, a marcao ser feita para linfcitos, uma homogeneizao com
pipeta Pasteur, suficiente para a retirada destas clulas e posterior lavagem para retirada do
meio de cultura (5 minutos a 250g).
9.2.2. Protocolo para marcao de receptores de superfcie e de apoptose
Aps a etapa de obteno de clulas por Ficoll-Hypaque ou de culturas, o pellet de

clulas deve estar em uma suspenso de PBSAZ, de forma que em cada tubo de marcao
tenhamos um volume final de 100l. Obtm-se, ento, 2 tubos para marcao das clulas
separadas por Ficoll-Hypaque; 2 tubos para marcao de clulas cultivadas sem o estmulo; 2
tubos para a marcao de clulas cultivadas estimuladas, e 1 tubo controle (sem marcao).
98
A anlise multiparamtrica por citometria ser feita para se detectar as

subpopulaes de linfcitos. Nesse contexto so utilizados anticorpos monoclonais
especficos para os receptores de superfcie:
Ac anti-CD3/PE-cy5: Antgeno de reconhecimento de linfcitos T;
Ac anti-CD4/FITC: Antgeno de linfcitos T restritos ao MHC-II (Linfcitos T
auxiliares);
Ac anti-CD8/PE: Antgeno de linfcitos T restritos ao MHC-I (Linfcitos T
citotxicos);
Para a deteco de clulas mortas foi utilizado o componente fluorescente 7AAD,
um marcador de DNA celular que se liga nas bases guanina e citosina.
Protocolo de marcao - volume final 100 L

Tubo 0 70 L de PBS AZ + 10 L de IgG FITC + 10 L de IgG PE + 10 L de IgG PE Cy5
Tubo 1 70 L de PBS AZ + 10 L de CD4 FITC + 10 L de CD8 PE + 10 L de CD3 PE Cy5
Tubo 2 80 L de PBS AZ + 10 L de CD4 FITC + 10 L de CD8 PE *aps, 7AA-D 20 g/mL
Incubar as amostras por 20 minutos, protegidas da luz, e 40C;

Adicionar 900 L de PBSAZ e centrifugar por 5 minutos a 250g. Nas amostras do
tubo 0 e 1, o pellet ressuspendido em 500 L de paraformaldedo (1%), para a
fixao das clulas. No tubo 2, deve adicionar 4 L de 7AA-D + 96 L e incubar a
amostra novamente por 20 minutos, protegida da luz, e 40C;
Centrifugar as clulas por 5 minutos a 250g, e fixar com 500 L de
paraformaldedo (1%) + 2,5L de AD (fixador especfico para 7AA-D);
Aps a marcao as clulas esto prontas para serem adquiridas em citmetro de
fluxo equipado com os filtros especficos para FITC, PE e 7AA-D (no caso FACS
Calibur), ou armazenadas em temperatura entre 4 80C, protegidas da luz, por no
mximo 4 dias.
99
CAPTULO 10. AQUISIO DE AMOSTRAS

Para a utilizao da citometria de fluxo como metodologia preciso seguir uma srie
de etapas, desde o preparo da suspenso de clulas at a anlise de dados, passando pela
aquisio das amostras. Esta ltima deve ser realizada por profissional treinado, que conhea
as caractersticas de funcionamento do equipamento, que podem variar de um citmetro para
outro.
De uma forma geral esto descritos a seguir, seqencialmente, os procedimentos
bsicos para adquirir as amostras em um citmetro de fluxo.
1 passo: Definir que tipo de clulas ser adquirido e quais molculas se deseja avaliar.
2 passo: Conhecer o citmetro de fluxo onde a suspenso de clulas marcadas ser

adquirida, ou seja, qual o comprimento de onda do(s) laser(s) do equipamento, e quais
comprimentos de onda os filtros que o equipamento possui so capazes de detectar.
IMPORTANTE: Existem tubos de material, tamanho e dimetro especfico para cada
citmetro de fluxo. Todo equipamento possui um sistema de pressurizao e, portanto, o tubo
deve encaixar precisamente na agulha por onde a amostra aspirada.
3 passo: Escolher uma combinao de fluorocromos de forma que a emisso de

fluorescncia de um no se sobreponha emisso de outro fluorocromo.
4 passo: Utilizar o protocolo de marcao escolhido, para as clulas j em suspenso, com

o(s) anticorpo(s) especfico para a molcula de interesse e seu(s) respectivo fluorocromo.
Manter as clulas em temperaturas entre 4 e 8C protegidas da luz.
IMPORTANTE: Se a suspenso de clulas marcadas no for adquirida de imediato,

recomenda-se utilizar uma soluo fixadora de forma que a ligao clula-anticorpo, assim
como a ligao anticorpo-fluorocromo (e sua capacidade de emitir cor), sejam preservadas at
o momento da aquisio (aproximadamente 7 dias, dependendo do fluorocromo).
100
5 passo: Antes de ligar o citmetro, conferir se o compartimento de soluo salina est

cheio, e se compartimento de descarte est vazio. Ligar o citmetro e o computador conectado
ao mesmo, e aps ligar o laser aguardar 30 minutos antes da aquisio.
6 passo: Acionar o sistema de pressurizao.
IMPORTANTE: O sistema hidrulico dos citmetros funciona a base de pressurizao. Uma

Bomba hidrulica bombeia a soluo salina para a parte central da cmara do fluxo de forma a
mant-lo em um volume muito maior do que a amostra que est sendo adquirida, gerando
uma presso diferencial. Dessa forma a presso exercida pela soluo salina, juntamente com
a velocidade do fluxo, estabiliza o fluxo de clulas que est sendo aspirada, garantindo o
mnimo de deformao durante a passagem da amostra.
7 passo: Abrir o software de aquisio e montar os grficos de acordo com os parmetros

que se deseja avaliar, isto , tamanho vs. granularidade (padro); fluorescncia vs.
fluorescncia, vs. contagem de clulas, vs. tempo, vs. tamanho, vs. granularidade.
IMPORTANTE: Em qualquer aquisio o dot plot padro, ou seja, o que vai definir a sua
populao de clulas, independente de fluorescncia, tamanho vs. granularidade. A partir
deste dot plot podemos distinguir diferentes populaes celulares, com tamanho e
granularidade caractersticos, e selecionar as de interesse.
8 passo: Identificar (nomear), no software, a amostra a ser adquirida e salv-la na pasta de

arquivos de interesse, onde os dados sero armazenados.
9 passo: Colocar o tubo contendo a amostra no citmetro e iniciar a aquisio.
IMPORTANTE: A cada troca de amostras deve-se deixar a soluo salina passar pela agulha
para evitar contaminao da prxima amostra a ser adquirida.
10 Passo: A fim de evitar qualquer entupimento do sistema hidrulico, a contaminao do

equipamento e das amostras subseqentes a serem adquiridas deve-se Lavar o sistema
hidrulico com aquisio de hipoclorito de sdio (em tubo de citometria) por
101
aproximadamente 5 minutos (alguns corantes precisam de um tempo maior para ser

removidos completamente do equipamento, como PI), e aquisio de gua destilada.
11 Passo: Despressurizao do equipamento.
12 Passo: Reabastecimento do compartimento de soluo salina, e esvaziamento do

compartimento de descarte.
102
CAPTULO 11. ANLISE DE DADOS

Uma variedade de programas de computao, chamados software, so especficos

para o armazenamento e anlise dos dados adquiridos por citometria de fluxo, os quais so
apresentados na forma de grficos mono e biparamtricos. Assim, todo citmetro de fluxo
possui determinado software no qual a anlise concomitante a aquisio ser realizada.
Atualmente j existem alguns destes programas que permitem que a anlise seja realizada
offline, isto , os dados so armazenados em arquivos e analisados aps a aquisio.
IMPORTANTE: Cada arquivo corresponde a uma amostra.
Aps a aquisio em citmetro FACSCalibur, seguimos com a etapa de anlise dos

dados experimentais adquiridos:
IMPORTANTE: Uma boa anlise depende de uma aquisio bem ajustada.
1 passo: Escolha do programa de software especfico para anlise dos dados.
2 passo: Elaborao dos grficos e histogramas - Depois de exibir os grficos e

histogramas voc poder alterar alguns parmetros (Figura 11.1). O conjunto de todos os
grficos a serem utilizados para uma amostra chama-se protocolo, o qual tambm pode ser
armazenado como um arquivo e, portanto, pode ser utilizado para as anlises offline.
3 passo: Grfico 1 de morfologia dos linfcitos e marcaes controle Criar grfico 1

com parmetros de tamanho (FSC) x granularidade (SSC) para selecionar morfologicamente
os eventos que representam a populao de linfcitos (R1); Tambm sero feitos grficos de
tamanho x marcao isotpica e/ou histogramas das marcaes isotpicas: Tubo 0
103
4 passo: Grfico 2 da populao de linfcitos T e Histograma 1 A partir dos eventos

individualizados na R1 criar grfico 2 representando os linfcitos com parmetros de tamanho
x CD3; Selecionar e quantificar a regio R2 que representa a subpopulao de linfcitos T
CD3+; Criar histograma 1 da marcao com CD3+ sobreposto com a marcao de seu
anticorpo isotpico: Tubo 1
5 passo: Grfico 3 das subpopulaes de linfcitos T e Histogramas 2 e 3 - A partir da

seleo da R2 no grfico 2, criar o grfico 3 com parmetros de marcao CD4 x CD8. Com
esse grfico poderemos selecionar e quantificar, dentro da populao de linfcitos T CD3+
(R2), o percentual de linfcitos T auxiliares (CD4+) e T citotxicos (CD8+); Tambm podero
ser feitos o histogramas 2 e 3, para cada marcao sobreposto com seus respectivos
isotipos:Tubo 1.
6 passo: Grficos 4 e 5 da viabilidade das subpopulaes de linfcitos T - Criar grfico 1

com parmetros de tamanho (FSC) x granularidade (SSC) para selecionar morfologicamente
os eventos que representam a populao de linfcitos (R1); A partir da seleo da R1 no
grfico 1, criar o grfico 3 com parmetros de marcao CD4 x CD8; A partir do grfico 3,
selecionar a regio dos eventos positivos para CD4 (R3) e dos eventos positivos para CD8
(R4); Criar o grfico 4 a partir da R3 com parmetros de marcao 7-AAD x FSC e o grfico
5 a partir da R4 com parmetros de marcao 7-AAD x FSC. Atravs dos grficos 4 e 5
poderemos analisar as subpopulaes de linfcitos T viveis, em apoptose ou em necrose:
Tubo 2
7 passo: O programa de software permite a observao dos valores estatsticos de cada

amostra como nmero de eventos (totais ou por regies), mdia (geomtrica e aritmtica) e
mediana.
104
Figura 11: Grficos em Dot Plot com parmetros de FSC vs SSC; FSC vs CD3; CD4 vs CD8 e 7 AAD vs FSC e as
regies selecionadas para cada grfico.
Grficos dot plot - seleo das Regies

Grfico 1 R1 - Morfologia dos linfcitos - parmetros FSC x SSC
Grfico 2 R2 - Populao de linfcitos T - parmetros FSC x CD3
Grfico 3 R3 e R4 - Subpopulaes de linfcitos T - parmetros CD4 x CD8 *a partir da R2
Grfico 4 R3 - Viabilidade das subpopulaes de linfcitos T auxiliares - parmetros FSC x 7 AAD *a partir da R3
Grfico 5 R4 - Viabilidade das subpopulaes de linfcitos T citotxicos - parmetros FSC x 7AAD *a partir da R4
Histogramas das marcaes - Sobreposio

Histograma 1
Marcao com Anticorpo isotipo IgG PE cy5 (linha azul) e Anticorpo anti-CD3 PE cy5 (linha vermelha)
Histograma 2
Marcao com Anticorpo isotipo IgG FITC (linha azul) e Anticorpo anti-CD4 FITC (linha vermelha)
Histograma 3
Marcao com Anticorpo isotipo IgG PE (linha azul) e Anticorpo anti-CD8 PE (linha vermelha)
105
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Instituto Oswaldo Cruz

Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular &

CURSOS DE INVERNO 2010

Amanda Torrentes de Carvalho

A persistncia o caminho do xito.

(Bacharelado 2005 e Licenciatura 2009) pela Universidade Federal Fluminense e Mestrado

GRAZIELLE ALVES RIBEIRO: Graduao em Cincias Biolgicas pela Universidade

naftopterocarpanoquinonas em Leishmania amazonensis, sob orientao do Dr. Eduardo

RAQUEL FERRAZ: Bacharel em Biomedicina pela Universidade Severino Sombra (2007)

LVARO LUIZ BERTHO DOS SANTOS: Bacharel em Biomedicina formado pela

Imunoparasitologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ e Professor

O estudo das doenas infecto-parasitrias realizado a partir da utilizao de uma

1. Mecanismos de resposta imune s doenas infectoparasitrias: imunidade inata e

2. Histrico da citometria de fluxo....................................................................................... 29

3. Princpios bsicos da citometria de fluxo....................................................................... 38

4. Aplicaes da citometria de fluxo na apoptose.............................................................. 49

5. Aplicaes da citometria de fluxo na protozoologia....................................................... 60

6. Aplicaes da citometria de fluxo na virologia................................................................ 68

7. Conceitos bsicos e aplicao de Sorting......................................................................... 79

8. Protocolos para citometria de fluxo................................................................................. 84

8.6.1. Soluo de fixao: clulas vivas vs. clulas fixadas................................... 88

9. Prtica de imunofenotipagem e apoptose......................................................................... 92

10. Aquisio de amostras.................................................................................................... 99

11. Anlise de dados............................................................................................................. 102

12. Referncias Bibliogrficas ............................................................................................ 105

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

CAPTULO 1. MECANISMOS DE RESPOSTA IMUNE S DOENAS

1.1. Caracterizao das diferentes subpopulaes de leuccitos

As clulas sanguneas, os leuccitos ou glbulos brancos, assim como os precursores

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

As clulas e molculas responsveis pela imunidade formam o Sistema Imunolgico,

1.2. Imunidade Inata

As doenas infecciosas ocorrem quando um microorganismo capaz de evadir a

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

mediadores inflamatrios que estimulam a ativao de mais fagcitos, a ativao de funes

As clulas dendrticas e os macrfagos, responsveis pela apresentao dos antgenos

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

As clulas NK, que reconhecem clulas infectadas que perderam a expresso de

1.3. Imunidade Adaptativa, Adquirida ou Especfica

Quando os microorganismos desenvolvem maneiras de burlar os mecanismos

microrganismos e molculas, sendo tambm chamada de imunidade especfica.

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

em diferentes classes funcionais. Existem dois tipos de respostas imunes adquiridas, a

1.3.1. Caractersticas da Imunidade Adaptativa

A imunidade adquirida apresenta caractersticas fundamentais que a difere da

Figura 1.3. A resposta

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

1.3.2. Imunidade Celular

A imunidade celular atua no combate a microorganismos intracelulares, que no

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

Ambas as respostas, Th1 e Th2, so importantes na defesa do hospedeiro contra

IMPORTANTE: A identificao das diferentes subpopulaes de linfcitos T foi possvel

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

1.3.3. Imunidade Humoral

A imunidade humoral mediada por molculas (imunoglobulinas) presentes no

Citometria de Fluxo Carvalho; Ferraz; Ribeiro & Bertho

Estruturalmente as molculas de anticorpo possuem um formato em Y e so