Roteiro de Aula Testes Sorológicos

Testes Sorolgicos
de Ag a serem testadas pelo menos trs diluies diferentes e um

padro. Incubado em cmera mida. Havendo precipitao, o dimetro
do halo correlaciona com a concentrao do Ag.
1- Precipitao
Baseada nos precipitados formados pela reao antgeno-anticorpo,
A precipitao mxima quando a quantidade de Ag e Ac so
equivalentes (precipitados formados podem dissolver quando expostos a excesso de
reagentes, devido reversibilidade da reao),
1.1-
Imunodifuso
Difuso: processo pelo qual a substncia transportada, de um lado para

outro, como resultado do movimento molecular ao acaso.
O tamanho dos imunoprecipitado formados fica maior que o dimetro
dos poros da fase fixa e evita-se a difuso dos complexos Ag-Ac.
1.2-
Tcnica que utilizam eletroforese
Eletroimunodifuso:
Eletroimunodifuso simples unidimencional (Ac incorporado ao gel,
colocado em lmina. O pH secolhido de forma que os Ag fiquem com
carga negativa e os Ac no migrem. Padro de precipitao assemelha a
foguete e caudo proporcional concentrao do Ag),
Eletroimunodifuso dupla unidimencional (Ag e Ac migram,
simultaneamente, em direes opostas a partir de orifcios iniciais,
resultando em precipitao em ponto intermedirio),
1.1.1- Tipo de imunodifuso:

Iminodifuso simples em uma dimenso:
o Ac incorporado ao agar, sendo esta mistura colocada em um tubo at
formar uma coluna. Aps a gelificao, o Ag colocado no topo do tubo.
Os tubos so selados para evitar evaporao e colocados em temperatura
constante durante um perodo, geralmente uma semana,
Dupla imunodifuso:
o Precipitao ocorre na regio de equivalncia, perpendicular linha
de eixo entre os orifcios, apresenta sob a forma de linha ou arco de
precipitao.
o Realizao: coloca-se uma fina camada de gar nas placas de Petri,
aps gelificao faz orifcios onde so colocados Ag e Ac e incubada em
cmara mida por 18-48 h, a 37C.
o Ausncia de Ag ou Ac indicada pela ausncia de linha.
o Sensibilidade baixa e limita-se a deteco de complexos Ag-Ac em
que h precipitao.
Imunodifuso radial simples:
o gar misturado com diluio apropriada do Ac especfico e
colocados em placa de Petri. So feitos orifcios onde coloca as solues
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Imunoeletroforese,
Realizado em duas etapas: a) separao dos componentes por
eletroforese, b) imunodifuso de cada componente, a partir do seu
centro de difuso, contra o anti-soro especfico, (formando linha ou
arco de precipitao).
2- Aglutinao
Caracteriza-se pela formao de agregados visveis como resultado da
interao de Ac especficos e partculas insolveis que contm determinantes
antignicos em sua superfcie,
Aglutinao direta: ocorre com partculas que apresentam determinantes
antignicos naturais em sua superfcie (hemcias, bactrias, protozorios),
Aglutinao indireta ou passiva: ocorre com partculas inertes (partculas
de ltex, poliestireno, bentonita) ou mesmo com clulas antigenicamente no
relacionadas (hemcias, bactrias) s quais se adsorvem ou fixam antgenos
solveis.
Se possuir elevado ttulo de Ac aglutinantes, pode-se observar o
fenmeno de prozona, obtendo falsos reultados negativos. Este efeito
eliminado empregando-se diluies seriadas do soro.
1
2.1- Teste da aglutinao Direta

Os testes para detectar Ac especficos so realizados empregando
diluies em srie do Ac, frente a uma quantidade constante de Ag,
O resultado geralmente expresso como ttulo do anti-soro (mxima
diluio que ocorre aglutinao),
Empregado: tipagem de grupos sanguneos do sistema ABO e Rh.
2.2- Teste de inibio da hemaglutinao direta
Baseado na capacidade que certos antgenos virais tm de,
espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemcias,
Os Ac, se presentes, revestem as partculas virais, resultando na inibio
da aglutinao, indicando teste positivo para presena de Ac,
No distinguem entre IgG e IgM,
Empregado: detectar Ac contra os vrus da rubola, sarampo, influenza e
certos enterovirus.
O grau de inibio relaciona-se com a quantidade do Ag presente na

amostra e com a afinidade pelos stios de combinao do anticorpo,
Empregado: deteco de Ag na hepatite e na hemofilia.
2.5- Teste de aglutinao do ltex
Partculas de ltex so esferas de poliestireno utilizadas como suporte na
adsoro,
Empregado na pesquisa de Ag ou ac,
Aplicao mais comum na deteco de fator reumatide:
o Anticorpo da classe IgM dirigido contra IgG, IgA, IgM e IgE, tambm h fator
reumatide da classe IgG e IgA.
o Auto-anticorpo poro Fc de IgG, ocorrendo em doenas auto-imunes, em
processos agudos ou crnicos, em doenas reumticas, infecciosas, degenerativas) .
Empregado: detectar Ag polissacardicos bacterianos Haemophilus

influenzae, Rickettsia sp, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis,
estreptococos do grupo B, deteco de drogas, hormnios: -gonadotrofina
corinicahumana, pesquisa de Ac na rubola, protena C.
2.3- Teste de hemaglutinao passiva
2.6- Teste de aglutinao de cristais de colesterol
Protenas podem ser adsorvidas a hemcias tratadas com cido tnico e

podem ser aglutinadas por Ac especficos,
Emprega hemcias de carneiro ou humanos do grupo O,
Teste considerado positivo: verifica formao de tapete cobrindo o fundo
da cavidade da placa em V (ttulo ser a mxima diluio em que se observa a
formao de tapete),
Teste considerado negativo: hemcias sedimentam formando boto
compacto.
Empregado: sistemas comerciais para pesquisa de Ac para Trypanosoma
cruzi, Treponema pallidum (sfilis), Toxoplasma gondii, etc.
Emprega cristais de colesterol que so sensibilizados com lecitina e

cardiolipina, para pesquisa de anticorpos na sfilis (VDRL)
Detecta Ac antilipdios que formam no hospedeiro como resposta ao material de
2.4- Teste de inibio de hemaglutinao passiva

Baseia-se na competio, pelos stios de combinao do Ac, entre o Ag
fixado hemcia e o Ag solvel ou hapteno,
250743803.doc
natureza lipdica, liberado pelas clulas lesadas no incio da infeco e ao material lipdico
do prprio treponema.
Leitura macroscpica contra fundo escuro, aps agitao:
o Positivo: formao de flculos,
o Negativo: aspecto homogneo.
3- Teste de imunofluorescncia
Utilizado para pesquisa de Ac e Ag,
Baseia na capacidade das molculas de Ac se ligarem covalentemente a
fluorocromos sem perder a reatividade especfica com Ag,
Ac marcado deve ser purificado, para aumentar eficincia e evitar
coloraes no especficas.
2
3.1- Teste de imunofluorescncia direta

Empregado na pesquisa e localizao de Ag em clulas ou tecidos (por
intermdio de um Ac especfico marcado),
Ac no ligado removido por lavagens,
O preparado observado em microscpio de fluorescncia,
Teste de elevada sensibilidade e especificidade, mas requer um
conjugado para cada sistema,
Principal aplicao: imunocitoqumica, pesquisa de Clamydia trachomatis,
Treponema pallidum, estreptococos -hemolticos, etc),
Tcnica de amplificao,
Avidina (glicoprotena derivada da albumina) possui alta afinidade por biotina
(vitamina do complexo B),
Biotina contm domnio ativo que se liga a aminocidos, portanto se ligar
a Ac,
Avidina pode ser satura com fluorescena sem perder a afinidade pela
biotina,
Aps reao Ag-Ac no marcado, biotina marcada com segundo Ac
adicionada (como muitas molculas de biotina se liga ao Ac, h amplificao do sinal) e
em seguida adicionado a avidina marvada com fluorescena,
3.2- Teste de imunofluorescncia indireta

Empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade,
3.2.1- Para pesquisa de Ag
Incubao da clula ou tecido em que se queira pesquisar Ag com o Ac
especfico,
Aps lavagem, a preparao incubada com conjugado
antiimunoglobulina produzida em outra espcie animal,
3.2.2- Para pesquisa de Ac
Ag padronizados so fixados em lminas de vidro,
Soro do paciente diludo e incubado com Ag,
Aps lavagem, a preparao incubada com conjugado fluorescente (antiIg marcada, se houver Ac no soro o conjulgado reage com Ac especfico para o Ag),
Pode-se detectar Ig de determinadas classes e subclasses.
Para pesquisa de IgM, pode haver falso positivo, pois o fator reumatide
IgM e utiliza anti-IgM quando a IgG se liga ao Ag, expe novos stios
na poro Fc, aos quais IgM se liga necessrio absoro ou separao
do fator reumatide,
Teste de referncia de muitas doenas,
4- Tcnicas Imunoenzimtica
Baseadas na utilizao de Ag ou Ac marcados com enzimas e permitem a
deteco, titulao e quantificao de substncias de interesse biolgico.
4.1- Imunoperoxidase
Emprega mesmo princpio da imunofluorescncia, com a diferena de
que utiliza enzima em vez de fluorocromo,
A enzima converte o cromgeno (substrato + doador de eltrons) em
produto insolvel (pode ser colorido) que precipita no stio de reao (sendo
visualizado ao microscpio ptico),
Pode ser utilizada na pesquisa de Ac, como na imofluorescncia indireta,
4.2- Enzimaimunoensaio
um mtodo quantitativo, em que a reao Ag-Ac monitorada por
medida da atividade enzimtica,
Vantagens: elevada sensibilidade; utiliza reagentes estveis; pode ser
adaptado a testes simples como a automao,
4.2.1- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
3.2.3- Sistema avidinabiotina

250743803.doc
Princpio bsico a imobilizao de um dos reagentes na fase slida,

enquanto o outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservao
tanto da atividade enzimtica como da imunolgica do Ac,
Aps o desenvolvimento de cor, a determinao pode ser feita
visualmente para resultados qualitativos, ou medindo-se a densidade ptica
da soluo, espectrofotometricamente,
4.2.1.1- Ensaio para anticorpos
A) Mtodo Indireto
o Placas plstica so sensibilizadas com Ag, reage com Ac da amostra,
o Conjugado anti-Ig humana reage com Ac capturado,
o Reao revelada com soluo cromgena (reao interrompida e a
intensidade de cor estimada a olho nu ou fotometricamente) .
o Vantagens: utiliza um nico conjugado para diferentes sistemas;
determinao de Ac de classes diferentes.
B) Mtodo de captura para anticorpo IgM
o Fase slida sensibilizada com anti-IgM especfico para regio Fc,
o Soro teste incubado, havendo a captura de qualquer IgM da
amostra,
o A seguir, incuba-se com Ag marcado ou no marcado, seguido de Ac
especfico marcado.
o Deteco de IgM pelo mtodo indireto pode haver resultado falso
positivo devido presena simultnea de Ac IgG e fator reumatide, que
pode reagir com conjugado anti-IgM.
o Pode ocorrer, tambm, falso negativo se houver excesso de IgG, que
competir pelos stios de ligao com maior afinidade.
o Amostra teste incubada com fase slida,

o A seguir, incuba-se com excesso de Ac especfico marcado,
o Revela-se com adio do substrato (taxa de degradao
proporcional concentrao do Ag).
B) Mtodo de competio com antgeno marcado
o Placas sensibilizadas com Ac especfico,
o Incuba as placas com conjugado Ag-enzima e amostra (ou padro),
o Aps obteno do equilbrio, lava-se e incuba com soluo do
substrato da enzima,
o Reao interrompida e faz a leitura, espectrofomtrica (relao
inversamente proporcional concentrao de Ag).
C) Mtodo da competio com anticorpo marcado
o Ag ligado placa e a ligao do Ac marcado competitivamente
inibida pelo Ag da amostra (ou padro),
o Demais etapas semelhantes s mtodo da competio com anticorpo
marcado e densidade ptica tambm inversamente proporcional.
D) Mtodo da inibio para haptenos
o Placas sensibilizadas com haptenos,
o Incubadas com amostra (pesquisa de haptenos) e Ac contra hapteno,
o Aps lavagem adiciona anti-Ig marcada com enzima,
o Ao mesmo tempo executa um teste sem hapteno e a diferena da
absorbncia na amostra e na referncia reflete o nvel de hapteno.
4.2.1.2- Ensaios para antgenos

A) Mtodo de captura
o Fase slida sensibilizada com anticorpo especfico,
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de Ag a serem testadas pelo menos trs diluies diferentes e um

Difuso: processo pelo qual a substncia transportada, de um lado para

Tcnica que utilizam eletroforese

1.1.1- Tipo de imunodifuso:

2.1- Teste da aglutinao Direta

O grau de inibio relaciona-se com a quantidade do Ag presente na

Empregado: detectar Ag polissacardicos bacterianos Haemophilus

2.3- Teste de hemaglutinao passiva

2.6- Teste de aglutinao de cristais de colesterol

Protenas podem ser adsorvidas a hemcias tratadas com cido tnico e

Emprega cristais de colesterol que so sensibilizados com lecitina e

2.4- Teste de inibio de hemaglutinao passiva

3.1- Teste de imunofluorescncia direta

3.2- Teste de imunofluorescncia indireta

3.2.3- Sistema avidinabiotina

Princpio bsico a imobilizao de um dos reagentes na fase slida,

o Amostra teste incubada com fase slida,

4.2.1.2- Ensaios para antgenos

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