O documento discute métodos de investigação de genotoxicidade em ensaios pré-clínicos de fitomedicamentos, incluindo os testes Allium cepa, Cometa e Micronúcleo. O teste Allium cepa avalia mutagenicidade através da observação de alterações cromossômicas em raízes de cebola, enquanto o teste Cometa mede danos no DNA celular e o teste Micronúcleo quantifica fragmentos de DNA para detectar efeitos cancerígenos. Esses biomarcadores são úteis para avaliar a segurança e o me
O documento discute métodos de investigação de genotoxicidade em ensaios pré-clínicos de fitomedicamentos, incluindo os testes Allium cepa, Cometa e Micronúcleo. O teste Allium cepa avalia mutagenicidade através da observação de alterações cromossômicas em raízes de cebola, enquanto o teste Cometa mede danos no DNA celular e o teste Micronúcleo quantifica fragmentos de DNA para detectar efeitos cancerígenos. Esses biomarcadores são úteis para avaliar a segurança e o me
O documento discute métodos de investigação de genotoxicidade em ensaios pré-clínicos de fitomedicamentos, incluindo os testes Allium cepa, Cometa e Micronúcleo. O teste Allium cepa avalia mutagenicidade através da observação de alterações cromossômicas em raízes de cebola, enquanto o teste Cometa mede danos no DNA celular e o teste Micronúcleo quantifica fragmentos de DNA para detectar efeitos cancerígenos. Esses biomarcadores são úteis para avaliar a segurança e o me
O documento discute métodos de investigação de genotoxicidade em ensaios pré-clínicos de fitomedicamentos, incluindo os testes Allium cepa, Cometa e Micronúcleo. O teste Allium cepa avalia mutagenicidade através da observação de alterações cromossômicas em raízes de cebola, enquanto o teste Cometa mede danos no DNA celular e o teste Micronúcleo quantifica fragmentos de DNA para detectar efeitos cancerígenos. Esses biomarcadores são úteis para avaliar a segurança e o me
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Antonio Luiz Gomes Jnior
Mtodos de investigao em genotoxicidade
em ensaios pr-clnicos de novos fitomedicamentos Genotoxicidade Definio: o setor da gentica que estuda os processos que alteram a base gentica da vida (DNA), processo este classificado de mutagnese; A genotoxicidade uma especialidade relativamente recente, e se situa na interface entre toxicologia e gentica, por isso denominada, frequentemente, de gentica toxicolgica; (DA SILVA; ERDTMANN; HENRIQUES, 2003) FATORES ENDGENOS Sexo Idade Constituio gentica FATORES EXGENOS Hbitos de consumo Alimentao Medicamentos Fatores qumicos Fatores fsicos Fatores biolgicos MUTAES So alteraes irreversveis que podem ocorrer tanto ao nvel gnico quanto cromossmico (Machado-Santelli, 2003) CNCER MUTAO Alterao no DNA, o qual regula todos os fenmenos da vida; Espontnea X Induzida Agentes: Sinttico X Natural Finalidade: prejudicial ou benfica? Efeitos: -variabilidade gentica - disfuno/morte celular - cncer Teste Allium cepa: biomarcador de toxicidade, citotoxicidade e mutagenicidade TESTE Alliumcepa Apesar de ser um ensaio muito usado desde os anos 30, somente em 1985 um protocolo foi estabelecido (Fiskesjo, 1985). Segundo este protocolo, o teste de Allium pode ser feito da forma original ou da forma modificada. TESTE Alliumcepa VANTAGENS -Sensvel; - Alto percentual de clulas em diviso; - Cromossomos uniformizados; - Boas correlaes com outros sistemas e testes com mamferos e humanos; - Indicador de toxicidade; - Investigaes para poluentes ambientais; - Toxicidade de compostos qumicos; - Avaliao de propriedades anticncer; - Avaliao de extratos vegetais para toxicidade, citotoxicidade e mutagenicidade; (SETHet al., 2010) Observao de clulas Princpio do Teste de microncleo em Allium cepa Os microncleos so definidos como pequenas massas esfricas, extranucleares, constitudas de cromatina no incorporada ao ncleo principal da clula durante as etapas finais da mitose (Fenech, 2000); O princpio do teste de microncleo se baseia na exposio de tipos celulares em diviso, como as clulas radiculares de A. cepa, a um agente de interesse, e a quantificao da freqncia de microncleos aps exposio. 12 Avaliao da Citotoxicidade Avaliao da Mutagenicidade: MN 14 Pontes Atrasos Cromossomos soltos Fragmentos Avaliao da Mutagenicidade: AC ALTERAES CROMOSSMICAS EM Allium cepa Figura: Razes de A. cepa crescidas em amostras de gua do rio Parnaba do ponto 2 (vero). (A) e (B) clulas com microncleo; (C) clula com ponte e fragmento na anfase; (D) e (E) clulas com atraso na anfase; (F) clula com fragmento em anfase (CRONEMBERG et. al., 2008) Ficha de avaliao do Teste Allium cepa Fases da Mitose Aberraes cromossmicas Foto Intrfase Prfase Metfase Anfase Telfase N de clulas em diviso Atrasos Pontes Fragmentos Cromossomos soltos MN 1 23 10 2 2 0 14 1 1 0 0 0 2 34 13 3 0 1 17 0 0 0 0 1 20 Teste Cometa: biomarcador de genotocixidade Princpio do Teste Cometa O teste cometa um mtodo sensitivo para os estudos de danos ao DNA em clulas individualizadas (SINGH et al., 1988; SARAN et al., 2008). As clulas so embebidas em agarose e colocadas em lminas, onde so lisadas com detergentes e submetidas eletroforese, onde possvel avaliar os danos ao DNA pela sua migrao em forma de cauda, que so observadas ao microscpico, indicando a freqncia de quebras e danos de bases. (Dusinska e Collins, 2008). 22 Solues utilizadas no Teste cometa Agarose pr-corbetura (1,5%); Agarose Low Mekting (LMP) (0,75%); Soluo de Lise ~ estoque; Tampo de eletroforese; Tampo de neutralizao; Soluo de fixao; Solues de colorao com nitrato de prata; Soluo de parada; 23 Protocolo do Teste Cometa 24 25 Teste Cometa ndice de dano: o Tipo de dano x n de clulas com o dano Ex.: 100 clulas avaliadas: o Dano 0 = 20 0 x 20 = 0 o Dano 1 = 35 1 x 35 = 35 o Dano 2 = 15 2 x 15 = 30 o Dano 3 = 23 3 x 23 = 69 o Dano 4 = 7 4 x 7 = 28 26 + 162 Teste Cometa Frequncia de danos: o N de clulas com dano 0 100 (total de clulas avaliadas); Ex.: 100 clulas avaliadas: o Dano 0 = 20 o Dano 1 = 35 o Dano 2 = 15 o Dano 3 = 23 o Dano 4 = 7 27 100 - 20 = 80 Tecidos que podem seu usados pata o TC Clulas do Sangue; Clulas da Medula ssea; Clulas da Mucosa Bucal; Clulas do Fgado; Clulas do Rim; Clulas do Crebro; Clulas do Pulmo; Espermatozoides; 28 Ex. Teste Cometa 29 Teste de Microncleo: biomarcador de mutagenicidade Teste de Microncleo Os microncleos so fragmentos de DNA que so reportados como de alto risco para o aparecimento do cncer, em resposta a agentes genotxicos e carcingenos O teste de microncleos um teste citogentico que pode ser usado como biomarcador para avaliao de efeitos aneugnicos e clastognicos e tem sido bastante usado para avaliar danos citogenticos em vrias populaes do mundo (PASTOR et al., 2003). 31 32 Teste de Microncleo Clulas do sangue perifrico; Clulas da Mucosa Bucal; Clulas da Medula ssea; Clulas do Rim; Clulas do Figado; Avaliao de 2.000 clulas Teste de MN com bloqueio da citocinese (CBMN); o Apoptose; o Pontes; o Amplificao gnica; Avaliao de 1.000 clulas 33 Avaliao da citotoxicidade MN em clulas da mucosa bucal 34 CBMN 35 CBMN 36 Obrigado!!! 37
