Prof. MSc.

Nara Vanessa dos Anjos Barros

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAU
CENTRO DE CINCIAS DA SADE
DEPARTAMENTO DE NUTRIO
DISCIPLINA: BROMATOLOGIA DE ALIMENTOS
PROF. NARA VANESSA DOS ANJOS BARROS
Espectrofotometria
Faz parte da classe dos mtodos analticos que
baseiam-se na interao da matria com a energia
radiante.
Podem ocorrer dois tipos de interaes:
- Absoro: a luz absorvida por um tomo, on ou
molcula indo para um estado energtico mais elevado.
- Emisso: a emisso de um fton pelo tomo, on ou
molcula, retornando para um estado energtico mais
baixo.
Espectrofotometria
Os comprimentos de onda absorvidos ou emitidos so
ESPECFICOS para os elementos que esto presentes na amostra.
O espectro de energia radiante dividido em vrias regies.
Diferentes regies espectrais tm significado nas interaes
fsicas.
A regio do espectro do ultravioleta na faixa de 200 a 400
nm e a da luz visvel entre 400 e 800 nm.
Espectrofotometria
Fundamentao
Baseia-se no aumento de energia em funo do aumento
da frequncia da radiao incidida.
tomo: nveis de energia camadas de eltrons
A absoro de radiao no ultravioleta e no visvel por um
composto orgnico se deve presena de pelos menos um grupo
funcional insaturado (C=C, C=O, por exemplo), chamado de
CROMFORO.
Figura 1: Diferentes espectros de absoro da luz pelos
aminocidos fenilalanina, tirosina e triptofano.
Espectrofotmetro
Instrumento que registra a
absorbncia em funo do
comprimento de onda ().
A caracterstica mais importante
do espectrofotmetro a seleo
de radiaes monocromticas.
O espectro de absoro
caracterstico para cada espcie
qumica (identificao).
Principais componentes de um
espectrofotmetro
Fontes de radiao.
Monocromador.
Compartimento de amostra.
Detector.
Emisso da radiao (lmpada de deutrio radiao UV; lmpada de
tugstnio luz visvel).
Transforma a radiao eletromagntica
em luz monocromtica.
Cubeta - diferentes materiais.
Converso da energia radiante em sinal
eltrico, e este ser registrado.
TIPOS DE ESPECTROFOTMETROS
Esquema Bsico de um Instrumento para Medir a Absoro
Sistema de Feixe Simples
Sistema de Feixe Duplo
Determinao dos Flavonoides Totais
1 mL do extrato
+
0,3 mL de NaNO
2
+
0,3 mL de AlCl
3
2 mL de
NaOH 1M
425 nm
mg de equivalentes a quercetina/100g de amostra
Mtodo espectrofotomtrico
(KIM; JEONG; LEE, 2003 modificado por BLASA et al., 2006).
Aplicabilidade
Cromatografia
um mtodo fsico-qumico de separao dos
componentes de uma mistura, realizada atravs da
distribuio desses em duas fases. Uma das fases
permanece estacionria, enquanto outra fase se move
atravs dela.
Separao
Identificao
Quantificao
Histrico
1906:
Mikhael Tswett: Separao de misturas de pigmentos
vegetais em colunas recheadas com adsorventes slidos,
arrastando os componentes com ter de petrleo.
Cromatografia chrom (cor) e graphe (escrever).
Princpios Bsicos
Mtodo fsico-qumico de separao dos
componentes de uma mistura.
A separao vai depender da interao dos
componentes da mistura com a fase mvel e
com a fase estacionria.
A identificao se d por meio da comparao
da interao de padres com as fases
estacionrias.
A quantificao feita pela comparao com
padres de concentraes conhecidas.
Separao de misturas por interao diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONRIA - FE (lquido ou
slido) e uma FASE MVEL - FM (lquido ou gs).
Princpios Bsicos
Classificao das tcnicas cromatogrficas
De acordo com o sistema cromatogrfico
Em coluna (FE depositada em um tubo cilndrico)
- Cromatografia lquida.
- Cromatografia gasosa.
- Cromatografia supercrtica.
Planar (FE depositada em uma superfcie plana)
- Cromatografia em camada delgada (CCD).
- Cromatografia em papel (CP).
Classificao das tcnicas cromatogrficas
De acordo coma fase mvel
Utilizao de Gs
- Cromatografia gasosa.
Utilizao de Lquido
- Cromatografia lquida clssica (CLC) deslocamento da
FM sobre a FE pela fora da gravidade.
- Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)
deslocamento da FM por altas presses.
Utilizao de Gs pressurizado
- Cromatografia supercrtica (CSC).
Classificao das tcnicas cromatogrficas
De acordo com a fase estacionria
Lquida
Slida
De acordo com o modo de separao
Por adsoro
Por partio
Por trocas inicas
Por afinidade
Por excluso
Mais importante!
Cromatografia
resultante da adsoro diferencial dos componentes da
mistura sobre a superfcie do slido, utilizado como fase
estacionria.
Na adsoro, as interaes moleculares (pontes de
hidrognio, foras eletrostticas, foras de transferncia de
carga, etc.) dependem da natureza (polaridade) do
adsorvente, do soluto adsorvido e do solvente.
Aplicaes:
Vitaminas, carotenides, micotoxinas (aflatoxinas) e
oligossacardeos.
Mecanismos de separao por adsoro
Cromatografia
A separao por partio (ou absoro) depende da maior
afinidade ou dissoluo dos solutos nas fases mvel ou
estacionria, pois ambas so lquidas e imiscveis.
As foras intermoleculares so pontes de hidrognio, foras
de dipolos induzidos, foras de disperso e foras de
interao especfica.
Aplicaes:
Vitaminas, cidos graxos em leos e gorduras e antioxidantes (BHA
e BHT).
Mecanismos de separao por partio
Cromatografia
A separao acontece por troca de ons entre os solutos da
amostra e os componentes inicos das fases mvel e
estacionria.
Aplicaes:
Tratamento da dureza da gua, metais traos, cidos orgnicos em
frutas, protenas e aminocidos, vitaminas do complexo B.
Mecanismos de separao por trocas inicas
Cromatografia
Os componentes da amostra no tm afinidade nem com a
FM nem com a FE.
Eles so separados por seleo de tamanho das molculas
do soluto, que passaro atravs da FE, que faz o papel de
uma peneira.
A FM tem o papel de apenas dissolver os componentes da
amostra para carreg-los atravs da coluna.
Aplicaes:
Protenas, polissacardeos, triacilgliceris, compostos naturais
responsveis por sabor/odor e cor, resduos de pesticidas.
Mecanismos de separao por excluso
Cromatografia - Tipos
Cromatografia em Papel - CP
A CP uma tcnica de partio, que utiliza dois lquidos (lquido-lquido)
sendo fixado em um suporte slido (fase estacionria - papel). A
separao e distribuio dependem da solubilidade. muito til para a
separao de compostos polares, sendo largamenteusado em bioqumica.
Fase estacionria lquida: (suportada no papel filtro).
Fase mvel
Cromatografia - Tipos
Cromatografia em Camada Delgada - CCD
Fase estacionria slida (slica,
alumina, celulose, poliamida).
Fase mvel (solventes polares, apolares
ou misturas).
Separaes.
A CCD uma tcnica de adsoro lquidoslido. Nesse caso, a separao
se d pela diferena de afinidade dos componentes de uma mistura pela
fase estacionria.
Cromatografia - Tipos
Cromatografia em coluna
A fase estacionria
mantida em um tubo estreito
e a fase mvel forada
atravs do tubo sob presso
ou por gravidade.
A substncia a ser separada
ou analisada colocada na
parte superior do tubo, e o
eluente vertido aps.
A velocidade no qual o
composto passa pela coluna
depende da polaridade da
fase estacionria.
Coluna cromatogrfica: srie de estgios independentes
onde acontece o equilbrio entre o analito dissolvido na
fase estacionria e na fase mvel.
Afinidade pela FE [ A ]
FE
Volatilidade [ A ]
FM
MENOR RETENO
Cromatografia - Tipos
Cromatografia em coluna
Azul mais fortemente retido na FE, e o vermelho na FM.
CROMATOGRAMA
Tempo de reteno
S
i
n
a
l
Cromatografia - Tipos
Cromatografia em coluna
R A espcie B, pois
quanto maior a
afinidade do soluto
pela FE maior seu
tempo de reteno.
Qual espcie (A ou B)
tem maior afinidade
pela FE?
Cromatografia - Tipos
Cromatografia gasosa
A amostra injetada (injetor de amostra) e arrastada pela fase mvel (gs
arrastador) atravs da coluna que contm a fase estacionria (coluna CG
aquecida), onde ocorre a separao da mistura. As substncias separadas saem
da coluna dissolvidas na fase mvel e passam por um detector que gera um
sinal eltricoproporcional quantidadede material separado.
Fase mvel:
gs inerte
Fase estacionria:
coluna
Detector
Separaes
Quais misturas podem ser separadas por CG?
Para uma substncia qualquer poder ser arrastada por
um fluxo de um gs ela deve dissolver-se, pelo menos
parcialmente, nesse gs.
Cromatografia - Tipos
Cromatografia gasosa Aplicabilidade
Misturas cujos constituintes sejam VOLTEIS
(=evaporveis)
De uma FORMA GERAL: a CG aplicvel na separao e anlise de
misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at
300 C e que sejam termicamente estveis.
Cromatografia gasosa
Anlise qualitativa
Tempo de reteno = identificao dos constituintes da amostra.
Cromatografia gasosa
Anlise quantitativa
rea
Altura
REA SOB O PICO = medida quantitativa da concentrao do composto.
A cromatografia gasosa uma das tcnicas analticas
mais utilizadas. Alm de possuir um alto poder de
resoluo, muito atrativa devido possibilidade
de deteco em escala de nano a picogramas.
Cromatografia gasosa
Cromatografia - Tipos
Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)
Do ingls: High Perfomance/pressure Liquide
Chromatography (HPLC)
Tcnica analtica usada para separar e quantificar
componentes numa mistura lquida.
A utilizao de suportes com partculas diminutas (colunas)
so os responsveis pela alta eficincia desse mtodo de
cromatografia.
A FASE MVEL (lquida) movimenta-se continuamente atravs
da coluna contendo a FASE ESTACIONRIA(slido).
Quais misturas podem ser separadas por CLAE?
Para uma substncia qualquer poder ser arrastada por
um lquido ela deve dissolver-se nesse lquido.
Cromatografia - Tipos
Cromatografia lquida de Alta Eficincia CLAE
Lquidos e slidos, inicos ou covalentes
De uma FORMA GERAL: a CLAE aplicvel na separao e anlise de
misturas cujos constituintes sejam solveis na FM. No h limitao
de volatilidade ou de estabilidade trmica.
Cromatografia - Tipos
Cromatografia lquida de Alta Eficincia CLAE
CECCHI, H. M. Fundamentos Tericos e Prticos em
Anlises de Alimentos. 2. ed. Campinas/SP: Editora
da UNICAMP, 2003. 207p.
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Introduo a
mtodos cromatogrficos. 5. ed. Campinas: Editora da
Unicamp, 1993.
Referncias