Mikroskop

Et mikroskop (fra gresk: μικρόν (micron) = liten + σκοπεῖν (skopein) = å se på) er et instrument som brukes til å se på og studere objekter som vanskelig kan sees med det blotte øyet eller med en lupe. Læren om å granske små strukturer gjennom et mikroskop kalles mikroskopi.

Historie

Helt siden middelalderen kjente man til bruk av luper. Noe som lignet mikroskoper har vært laget i Nederland siden ca. 1590. Det er usikkerhet både om oppfinneren og om dato for oppfinnelsen, men tre forskjellige brillemakere har fått æren for denne. De er Hans Lippershey (som også utviklet det første teleskopet), Hans Janssen og hans sønn Zacharias. Siden begynnelsen har mikroskopet, og ikke minst mikroskoperingsteknikker, gjennomgått en betydelig utvikling. De tidligste mikroskopene hadde linser som var grovt tilpasset og ga uskarpe bilder, men de hadde likevel stor betydning i forskningen, spesielt innen biologi, geologi og materialteknikk. Det største problemet med de tidligere mikroskopene var fargespredning (kromatisk avvik) og bildekrumming (sfærisk avvik). Man forsøkte å løse problemene ved å konstruere objektiver av flere linser med ulik fargespredningsevne (dette hevdet Isaac Newton var umulig i praksis). I 1824 konstruerte Jacques Louis Vincent Chevalier et akromatisk objektiv bestående av flere linser og linseelementer kittet sammen med kanadabalsam (et harpiks). Forbedring av denne typen objektiv gjorde det mulig å oppdage cellekjernen.

Det første moderne mikroskopobjektivet ble konstruert gjennom et samarbeide mellom Ernst Abbe og Carl Zeiss i Jena. Forbedringene fremkom til en stor del gjennom utvikling av matematiske formler for beregning av objektivkonstruksjoner. I 1886 ble det første apokromatiske objektivet demonstrert av Abbe, og i dette objektivet var sfærisk og kromatisk avvik i det nærmeste eliminert. Senere, når antirefleksbehandling ble vanlig (1950-tallet), ble kontrasten betydelig forbedret i disse kompliserte objektivene. Andre milepæler i mikroskopets utvikling var utviklingen av fasekontrast (Frits Zernike 1932, nobelpris for dette i 1953), som gjorde det mulig å studere ytterst fine strukturer i levende celler, samt utviklingen av konfokale mikroskop hvor objektet skannes av en tynn lyskilde og bildet rekonstueres av en datamaskin.

I 1931 bygde Ernst Ruska et elektronmikroskop i samarbeide med andre, og det første kommersielle elektronmikroskop ble produsert av Siemens GmbH i 1939.

Funksjon

I et lysmikroskop forstørres et bilde av et objekt, som oftest montert i mellom et dekkglass og et objektglass, gjennom et objektiv opp til et reelt mellombilde projisert i tubus. Gjennom ett eller to okular observerer vi dette mellombildet (egentlig blir det to mellombilder i et binokulart mikroskop). Ved hjelp av en kondensator (optisk konstruert på tilsvarende måte som et objektiv) projiseres en lyskilde (kan være dagslys, glødetråden i en lampe eller LED) på objektet underfra.

Objektet avbildes med svært liten dybdeskarphet (mindre dess høyere numerisk apertur for objektivet), og må derfor være svært tynt (10-20 mikrometer eller enda tynnere). Ofte er preparatet montert mellom et objektglass og et dekkglass (dekkglasset skal være vendt mot objektivet). Den mest brukte standarden for dekkglass har en tykkelse på 0,17 mm.

Et mikroskop består av okular, tubus (røret mellom), objektiv (eventuelt flere objektiver i en revolver), objektbord (et kryssbord, også kalt koordinatbord, underletter manøvrering og sentrering av objektet), kondensator med blender, lyskilde (lampe eller et speil for å konsentrere dagslys eller annen lyskilde), samt sokkel. Fokuseringen skjer med en grovskrue, og i tillegg er en finskrue nødvendig ved større forstørrelser.

Okularet

Okularet er oftest optisk sett av enklere konstruksjon enn objektivene i et mikroskop. Det virker som en lupe som vi betrakter det reelle mellombildet i mikroskopet. Okularet må være oppbygd av minst to linser og da kalles den linsen nærmest øyet øyelinsen, og den linsen nærmest objektivet for feltlinsen eller kollektivlinsen. De enkleste okularene er såkalte Huygensokularer, andre og dyrere okularer er eksempelvis kompensasjonsokularer (Inngravert f.eks. «komp» eller «KPL») og planokularer (f.eks. «periplan»). Okularene har ofte en egenforforstørrelse på mellom 6,3 og 20 ganger. Står det f.eks «komp. 10x/18 P», betyr det at okularet er et kompensasjonsokular med forstørrelse 10 ganger, med et synsfelt på 18 mm og at det er beregnet på bruk med polarisert lys (krever optikk fri for mekaniske spenninger). Andre typer okularer er for eksempel Fasekontrast-«kikkerter» for å sentrere faseringene ved fasekontrast, projiseringsokular, spesialokular for fotografering samt måle og telleokular. Det er viktig at okularene er tilpasset objektivene og resten av mikroskopet og det fungerer ofte dårlig å blande okular og objektiver fra forskjellige produsenter.

Tubus

Den mekaniske tubuslengden er en viktig egenskap ved mikroskopet og defineres som avstanden mellom den øverste rand av tubus som okularet hviler på ned til basis av objektivet (fronten av objektivfatningen). DIN standarden er 160 mm, men 170 mm er for eksempel vanlig for eldre Leitz mikroskop. Moderne objektiv og mikroskop har gjerne en uendelig tubuslengde, da inneholder tubus en tubuslinse som fokuserer lysgangen fra objektivet. Dette er benevnt med et uendelig symbol (∞) i stedet for for eksempel 160 på objektivet. Tubuslengden står inngravert som 160/- eller 160/0,17, eventuelt ∞/- eller ∞/0,17 (graveringen «-» respektive «0,17» refererer til dekkglasstykkelsen). Egenforstørrelsen for objektivet finnes ved formelen $E=T/B$ , hvor T er optisk tubuslengde og B er brennvidden for objektivet.

Monokular tubus

Eldre mikroskop og billigere mikroskop er oftest monokulare. Det anvendes bare ett okular og tubus inneholder som oftest ingen ekstra optiske element.

Binokular tubus

Vi kan oppnå mye større brukerkomfort med binokulare mikroskop. Her er det satt inn et halvgjennomsiktlig speil i tubus, samt prismer og to okular, som gjør at vi kan anvende begge øynene for observasjon. Ved å sette in ytterligere ett halvspeil, eller gjennom å forskyve speil eller prismer, kan trinokulare mikroskop konstrueres, for å kunne fotografere (eventuelt observere og sentrere fasekontrast-ringene) gjennom det tredje okularet. Det er verd å merke seg at et binokulart lysmikroskop i de fleste tilfeller skiller seg fra et stereomikroskop, siden objektet i stereomikroskopet observeres tredimensjonalt, gjennom to atskilte lysganger (ofte er det likevel kun en frontlinse).

Objektiver

Objektivet er den viktigste delen av mikroskopet, og det finnes en rekke objektiver av forskjellig kvalitet, beregnet på forskjellige forstørrelser, kontrasteringsteknikker og forskjellige immersjonsmedier mm. De rimeligste objektivene er såkalte akromater (og da står det oftest ingenting på objektivet annet enn produsent og tallbenevnelser). Akromatene er korrigert for to farger, rødt og blått. Er objektivene korrigert for flatt bildefelt står det gjerne inngravert «Plan», «Pl», eller «NPL» (Normal Plan) på objektivet.

Fluoritobjektiver, (Plan-) Neofluar, eller Fluotar er benevnelser på dyrere objektiver, med bedre fargekorrigering og disse er også svært kontrastrike på grunn av enkel konstruksjon kombinert med bruk av spesielle glassorter. De dyreste objektivene er apokromatene, hvor det er korrigert for alle farger (alt kromatisk avvik). Et oljeimmersjonsobjektiv av denne typen kan være oppbygd av opp til 13 linser. Apokromatene har oftest også høyere numerisk apertur enn andre objektiver med tilsvarende egenforstørrelse, noe som gir både høyere lysstyrke og økt oppløsning.

Som oftest benyttes et dekkglass over objektet som vi studerer, og dekkglasset har stor betydning for lysbrytningen gjennom objektivet, større for stigende egenforstørrelse og numerisk apertur. Objektiver med større egenforstørrelse og numerisk apertur enn 10x/0,30 har oftest opgitt hvilken dekkglasstykkelse de er korrigert for, for eksempel refererer graveringen «160/-» respektive «160/0,17» til at objektivet er korrigert for ingen eller 0,17 mm dekkglasstykkelse. Tørrobjektiver med større apertur enn 0,80 har oftest en korreksjonsring for varierende dekkglasstykkelse, for eksempel 160/0,11-0,23 (tallet 160 refererer til tubuslengden).

Det finnes en mengde objektiv for spesielle behov, for eksempel spesielle kontrasteringsteknikker; fasekontrast («Ph»,«Phase»), «DIC» (differential interference contrast/Nomarski kontrast), poarisert lys («P» i rød tekst, «Pol»), Fluorescens («Fluorezens», ikke det samme som et objektiv med glass av fluoritt). Objektiver med irisblender er tilpasset mørkefeltkontrast (engelsk: «darkfield»). Andre objektiver er konstruert for ulike immersjonsmedier, vann («W»), glycerin («Glyc.»), olje («Oel», «Oil», «imm.», «HI» eller «homog. imm.»). Her benyttes et immersjonsmedium mellom objektivets frontlinse og eventuelt et dekkglass over objektet for å øke lysbrytningsvinkelen og dermed øke den numeriske aperturen, oppløsningen og egenforstørrelsen i betydelig grad.

Ved pålysmikroskopi sendes lys ned gjennom objektivet (spesielle pålysobjektiv – «Epi-») i stedet for fra undersiden, og det benyttes ikke dekkglass. Pålysobjektiver med egenforstørrelse mer enn 10 ganger kan ikke brukes til lysfeltmikroskopi («vanlig mikroskopering») med bra resultat.

Eldre Zeiss Winkel akromatisk objektiv (8x/0,20 160/-)
Eldre apokromat med korrigeringsring for varierende dekkglasstykkelse (45x/0,90 160/0,10-0,20 Apo Korrek)
Moderne Fasekontrastobjektiv med fargekoder (her blå ring for 40 x og grå for tørrobjektiv)(40x/0,75 ∞/0,17 Plan Neofluar Ph 2)
Oljeimmersjonsobjektiv, planapokromat med numerisk apertur på 1,40 (svart ring for oljeimmersjon)(63x/1,40 ∞/0,17 Plan Apochromat Oil)
Pålysobjektiver montert i revolver, objektivene er beregnet for DIC og i lysgangen er et Wollastonprisme montert (Epiplan-Neofluar)

Mikroskopets mekaniske deler

Objektivrevolver
Tubus med okularet fjernet.
Irisblender og kondensator
Grovjustering av fokus
Finjusteringsskruen (midt i bildet)

Det finnes tre typer mikroskop:

lysmikroskop – kan forstørre ca. opp til 10 000 ganger.
elektronmikroskop – kan forstørre en million ganger.
rasterelektronmikroskop

Stereomikroskopet

En stereolupe (også kalt stereomikroskop eller disseksjonsmikroskop) brukes til å se detaljer som er for små å se med det blotte øye, men samtidig for store til å praktisk kunne observeres i et vanlig mikroskop. En stereolupe er også ofte et nødvendig redskap for å kunne fremstille gode preparater for mikroskopering ved større forstørrelser. Det som skiller en stereolupe fra et mikroskop er at objektet observeres fra litt ulik vinkel for hvert øye (tredimensjonalt eller stereoskopisk). En stereolupe forstørrer vanligvis mellom 5 og 75 ganger, noe som gir bedre oversikt og større dybdeskarphet enn ved bruk av et tradisjonelt lysmikroskop. Det blir også større avstand opp til frontlinsen, slik at det blir plass til å arbeide med objektet. En annen stor forskjell er at stereomikroskopet savner kondensator, lyskilden er oftest pålys, eller mer eller mindre direkte lys undenfra; det siste er spesielt bra for observasjon av vannlevende organismer.

Litteratur

Motzfeldt Laane, Morten og Thore Lie (1992): Håndbok i Mikroskopi og fremstilling av preparater. Universitetsforlaget, Oslo.

Eksterne lenker