Jurnal Veteriner September 2009

ISSN : 1411 - 8327

Vol. 10 No. 3 : 125-132

Seleksi Spermatozoa Domba Garut

dengan Metode Sentrifugasi Gradien Densitas Percoll
(SELECTION OF GARUT SHEEP SPERMS USING
PERCOLL DENSITY GRADIENT CENTRIFUGATION METHOD)
Heri Sujoko1, Mohamad Agus Setiadi 2, Arief Boediono 3
Program Studi Peternakan, Fakultas Pertanian,
Universitas Palangka RayaKampus UNPAR Tunjung Nyaho,
Jl. Yos Sudarso, Kotak Pos 2/PLKUP Palangka Raya 73111,
Telp/Fax: (0536)32 22664 ; E-mail: [email protected]
2
Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi;
3
Lab Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi,
Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor,
Jl. Agatis, Kampus IPB Darmaga, Bogor.
1

ABSTRACT
Preparation of a good quality of sperm is required in order to increase the efficacy of in vitro fertilization.
One method of a good sperm preparation is the use of Percoll density gradient centrifugation. This study
was aimed to determine the optimal combination of speed and time of centrifugation for the sperm
preparation with the lowest mortality rate. Fresh semen collected from Garut sheep with the concentration
of 2 million cells per ml was used in this study. The experimental design used was a completely randomized
factorial design with one control group and sixteen combination of speed and time of centrifugation. They
were 1),(1) 200 xg for 5 min; (2) 200 xg for 10 min; (3) 200 xg for 15 min; (4) 200 xg for 20 min; (5) 300 xg for
5 min; (6) 300 xg for 10 min; (7) 300 xg for 15 min; (8) 300 xg for 20 min; (9) 400 xg for 5 min; (10) 400 xg for
10 min; (11) 400 xg for 15 min; (12) 400 xg for 20 min; (13) 500 xg for 5 min; (14) 500 xg for 10 min; (15) 500
xg for 15 min; and (16) 500 xg for 20 min. All of control and treatments combination were replicated for
three times. Each control and combined treatment were replicated for three times. The variables observed
were the concentration of sperm, the percentage of live sperms, the percentage of progressively motile
sperms and the percentage of normal sperm. The data obtained were analyzed by two way analysis of
variance (ANOVA) and the differences between treatment groups were subjected for Duncans Multiple
Range Test (DMRT). The best result was obtained using 400 xg for 15 minutes which showed the sperm
concentration of 66.66 12.22 millions per ml, the living sperms of 74.82 1.53%, the percentage of
progressively motile sperm of 57.568.42% and the percentage of normal sperm of 861.73%).
Keywords : selection, sperms, centrifugation, percoll

PENDAHULUAN
Teknologi reproduksi saat ini berkembang
sangat pesat (Nazlie et al., 2006). Teknologi
tersebut pada awalnya ditujukan untuk
peningkatan sifat reproduksi, mulai bergeser ke
arah teknologi reproduksi berbantuan (assisted
reproductive technology/ART) (Henkel dan
Schill, 2003). Teknologi reproduksi berbantuan
adalah teknik bidang kedokteran untuk
membantu proses reproduksi dengan cara
mengatasi hambatan bertemunya spermatozoa
dan oosit, sehingga memungkinkan terjadinya

konsepsi (Hermawanto dan Hadiwidjaja, 2006).

Secara umum ART meliputi beberapa metode,
yaitu fertilisasi in vitro (in vitro fertilisation/
IVF), embrio transfer (ET), inseminasi buatan
(IB), intracytoplasmic sperm injection (ICSI),
mikromanipulasi embrio, semen sexing, genome
resource banking dan somatic cell nuclear
transfer (SCNT)/cloning (Andrabi dan Maxwell,
2007).
Salah satu ART yang sering dilakukan pada
ternak domba adalah IVF. IVF merupakan
teknologi produksi embrio pada media di luar
tubuh (Jaswandi et al., 2001). Keberhasilan IVF

125

Sujoko etal

Jurnal Veteriner

salah satunya dipengaruhi oleh kualitas

spermatozoa (Morrell, 2006). Kualitas
spermatozoa yang dimaksud adalah spermatozoa
yang mempunyai daya hidup tinggi, morfologi
normal dan motilitas progresif. Motilitas
merupakan kemampuan gerak maju individu
spermatozoa di dalam lingkungan zat cair.
Pergerakan tersebut penting dalam membantu
spermatozoa menembus sel-sel pelindung yang
mengelilingi sel telur (Herdis et al., 2005).
Syarat minimal konsentrasi spermatozoa untuk
IVF adalah 1 juta sel/ml, motilitas progresif 40%,
spermatozoa hidup 40% dan abnormalitas
kurang dari 14% (Klinc dan Rath, 2006 ;
Ksiazkiewicz et al., 2006). Dalam rangka
memenuhi hal tersebut perlu dilakukan seleksi
spermatozoa, yaitu memisahkan spermatozoa
berkualitas baik dari total populasi.
Metode seleksi spermatozoa yang telah
dikenal adalah simple washing, swim up, teknik
migrasi ke samping, sentrifugasi gradien
densitas, migration gravity sedimentation,
sephadex and glass woll collums, albumin
column filtration, optiprep, ixaprep, accudenz,
dan silane-coated silica-based gradient (Tucker
dan Jansen, 2002).
Pada penelitian ini dipilih metode
sentrifugasi gradien densitas percoll karena
paling banyak digunakan (Mendes et al., 2003)
dan telah terbukti lebih efektif serta efisien
dibandingkan metode swim up (Tucker dan
Jansen, 2002). Metode ini dilakukan dengan
cara membuat gradien densitas dan
memisahkan spermatozoa dengan alat
sentrifugasi. Permasalahannya adalah berapa
kecepatan dan lama sentrifugasi dilakukan, agar
daya hidup dan motilitas spermatozoa dapat
dipertahankan dan tingkat kerusakan
spermatozoa rendah. Penelitian ini bertujuan
menentukan kombinasi kecepatan dan waktu
sentrifugasi yang optimum untuk memperoleh
spermatozoa berkualitas baik.
METODE PENELITIAN
Ternak Percobaan
Ternak yang digunakan untuk percobaan
adalah seekor pejantan domba garut dengan
kondisi sehat, telah dewasa kelamin, berumur
sekitar 3 tahun, dan berat badan sekitar 70 kg.
Pejantan tersebut ditempatkan di dalam
kandang individu. Pakan yang diberikan berupa
campuran rumput gajah dan rumput lapangan
sebanyak 3 kg/ekor/hari dan konsentrat 700

gram/ekor/hari. Air minum diberikan secara ad

libitum.
Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan menggunakan
Rancangan Acak Lengkap Pola Faktorial.
Faktor pertama adalah sentrifugasi spermatozoa
dalam gradien densitas percoll pada kecepatan
200xg, 300xg, 400xg dan 500xg. Faktor kedua
adalah waktu sentrifugasi spermatozoa selama
5 menit, 10 menit, 15 menit dan 20 menit.
Sehingga terdapat 16 kombinasi perlakuan.
Sebagai pembanding, pada penelitian ini
digunakan perlakuan kontrol, yaitu sentrifugasi
spermatozoa dalam medium Brackett-Oliphant
(BO) pada kecepatan 200xg selama 5 menit.
Semua perlakuan diulang 3 kali dan setiap
ulangan terdiri dari 3 sampel percobaan yang
berasal dari 1 kali penampungan semen.
Penyiapan Medium BO dan Pengenceran
Percoll
Medium BO merupakan medium dasar
untuk fertilisasi in vitro. Pada penelitian ini
medium BO diperlukan sebagai pengencer
percoll 10%, 50%, dan 90%. Di samping itu
medium BO digunakan sebagai medium pencuci
dan penambah volume semen dalam upaya
mendapatkan konsentrasi spermatozoa 200 juta/
ml setiap perlakuan. Komposisi medium BO
terdiri dari: NaCl, KCl, CaCl 2 2H 2 O,
NaH2PO42H2O, MgCl26H2O, NaHCO3, glukosa,
sodium pyruvat, phenol red, dan antibiotik.
Penyiapan Semen
Penampungan semen dilakukan dengan
menggunakan vagina buatan sebanyak 2 kali
per minggu. Setiap kali penampungan,
dilakukan evaluasi semen secara makroskopis
(volume, konsistensi, warna, dan pH) dan
mikroskopis (gerakan massa, motilitas,
konsentrasi, spermatozoa hidup, dan
spermatozoa normal). Semen yang telah
dinyatakan layak kemudian diencerkan dengan
medium BO, hingga mendapatkan konsentrasi
spermatozoa 200 juta sel/ml yang selanjutnya
digunakan untuk tiap-tiap perlakuan (Maxwell
et al., 1984).
Seleksi Spermatozoa dengan Metode
Simple Washing (Kontrol)
Sebanyak 1ml semen yang telah diencerkan
medium BO dengan konsentrasi spermatozoa
200 juta sel/ml diteteskan ke dalam tabung
reaksi (ukuran 15ml) yang berisi 6ml medium

126

Jurnal Veteriner September 2009

Vol. 10 No. 3 : 125-132

BO. Selanjutnya dilakuan pencucian dengan

sentrifugasi pada kecepatan 200xg selama 5
menit. Pelet spermatozoa yang terbentuk
dipindahkan ke tabung lain dan dievaluasi
kualitasnya.
Seleksi Spermatozoa dengan Metode
Sentrifugasi Gradien Densitas Percoll
Percoll yang telah diencerkan dengan
medium BO konsentrasi 10%, 50% dan 90%
dimasukkan ke dalam sebuah tabung reaksi
secara urut mulai konsentrasi 90% (paling
bawah), 50% dan 10% (paling atas) masingmasing 2 ml. Sebanyak 1 ml semen yang telah
diencerkan dengan medium BO dengan
konsentrasi spermatozoa 200 juta sel/ml,
diteteskan di atas gradien tersebut. Selanjutnya
dilakukan sentrifugasi sesuai kombinasi
perlakuan. Pelet spermatozoa hasil sentrifugasi
ditambahkan medium BO (1:3). Kemudian
dilakukan pencucian dengan sentrifugasi pada
kecepatan 200xg selama 5 menit
(Amershambiosciences, 2001). Pelet yang
dihasilkan kemudian dievaluasi kualitasnya.
Parameter Penelitian
Parameter yang diamati adalah (1) kualitas
semen segar, meliputi: volume, konsistensi,
warna, pH, gerakan massa, motilitas, konsentrasi, spermatozoa hidup dan spermatozoa
normal; (2) kualitas spermatozoa setelah
perlakuan, meliputi: konsentrasi, spermatozoa
hidup, motilitas progresif dan spermatozoa
normal.
Pemeriksaan Kualitas Spermatozoa
Pemeriksaan makroskopis semen segar
dilakukan menggunakan metode yang telah
baku (Toelihere, 1993). Volume dan warna semen
diukur dan dilihat langsung pada tabung
penampung yang berskala sesaat setelah
penampungan semen, konsistensi diperiksa
dengan menggoyang-goyangkan tabung berisi
semen, dan pH semen diukur dengan kertas
lakmus 6,4-8,0.
Berbagai pemeriksaan mikroskopis semen
segar mau pun pemeriksaan kualitas
spermatozoa setelah perlakuan menggunakan
mikroskop cahaya adalah :
a.

Pemeriksaan gerakan massa spermatozoa.

Gerakan massa spermatozoa diamati di atas
gelas obyek tanpa gelas penutup dengan
pembesaran 100 kali, dengan kriteria : +++

(sangat baik, bila terlihat gelombang besar,

banyak, gelap dan tebal); ++ (baik, bila terlihat
gelombang kecil, tipis, jarang, kurang jelas dan
bergerak lamban); + (cukup, bila tidak terlihat
gelombang dan hanya gerakan individual aktif
progresif); dan N (buruk, bila tidak ada gerakangerakan individual).
b.

Pemeriksaan konsentrasi spermatozoa

Semen diencerkan 200 kali dengan NaCl
3%. Konsentrasi spermatozoa dihitung dengan
menggunakan haemocytometer dalam 5 kamar
hitung menurut arah diagonal kemudian
dikalikan 107. Pengamatan dilakukan di bawah
mikroskop pembesaran 400 kali.
c.

Pemeriksaan spermatozoa motil

progresif setelah perlakuan
Semen diencerkan 200 kali dengan medium
BO. Jumlah spermatozoa motil progresif
diperoleh dari perhitungan secara riil (bukan
berdasarkan perkiraan), menggunakan
haemocytometer dalam 5 kamar hitung
menurut arah diagonal kemudian dikalikan 107.
Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop
pembesaran 400 kali. Jumlah spermatozoa motil
progresif dihitung dengan pendekatan sebagai
berikut : konsentrasi jumlah spermatozoa
tidak bergerak jumlah spermatozoa bergerak
di tempat.
d.

Pemeriksaan spermatozoa hidup dan mati

Pemeriksaan spermatozoa hidup dan mati
menggunakan pewarna eosin-negrosin diamati
di bawah mikroskop pembesaran 400 kali pada
10 lapang pandang yang berbeda minimal 200
sel. Spermatozoa dinyatakan hidup jika kepala
berwarna putih dan spermatozoa mati jika
seluruh atau sebagian permukaan kepala
berwarna merah.
e.

Pemeriksaan spermatozoa normal

Pemeriksaan spermatozoa normal
menggunakan pewarna eosin 2%. Preparat
diteteskan minyak immersi dan diamati di
bawah mikroskop pembesaran 1000 kali pada
10 lapang pandang yang berbeda, minimal 200
sel.
Analisis Data
Data dianalisis dengan uji sidik ragam, jika
terdapat perbedaan nyata dilanjutkan dengan
uji jarak berganda duncan pada taraf signifikansi
5% (Gomez dan Gomez, 1995). Pengolahan data
menggunakan software SPSS 15.0 for windows
(Uyanto, 2006).

127

Sujoko etal

Jurnal Veteriner

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kualitas Semen Segar Domba garut
Rataan kualitas semen segar hasil
penampungan sebanyak 48 kali, dari seekor
domba garut tertera pada Tabel 1. Hasil evaluasi,
menunjukkan bahwa semen domba garut yang
digunakan pada penelitian ini mempunyai
kategori baik dan layak digunakan untuk
percobaan lebih lanjut sesuai persyaratan yang
ditetapkan menurut Evans dan Maxwell (1987)
yaitu gerakan massa +++, motilitas lebih besar
dari 70% dan spermatozoa normal lebih banyak
dari 85%.
Volume semen domba garut pada penelitian
ini diperoleh rataan 0,980,16 ml per ejakulat,
lebih tinggi dibandingkan hasil penelitian
Boediono et al., (2004) yang memperoleh rataan
0,70,1 ml. Perbedaan volume semen tersebut
selain disebabkan oleh perbedaan individu
ternak, juga disebabkan oleh frekuensi ejakulasi,
bangsa ternak, umur, musim, nutrisi, libido,
dan kondisi ternak itu sendiri (Everett dan Bean,
1982).
Warna, konsistensi, dan konsentrasi
mempunyai hubungan yang erat satu sama lain.
Semakin kental semen yang dihasilkan oleh
ternak, maka konsentrasi semakin tinggi dan
warna akan semakin pekat. Rataan warna
semen domba garut pada penelitian ini adalah
krem dengan rataan konsistensi kental dan
rataan konsentrasi 3528,85777,11 juta/ml
(Tabel 1). Rizal et al., (2003) melaporkan rataan
warna semen domba garut adalah krem, rataan
konsistensi kental, dan rataan konsentrasi
spermatozoa 3224636,35 juta/ml. Perbedaan ini
diduga disebabkan oleh variasi individu hewan
percobaan, di antaranya umur dan bobot badan.
Derajat keasaman plasma semen sangat
menentukan status kehidupan spermatozoa di
dalam semen. Semakin tinggi atau semakin
rendah pH semen dari keadaan normal akan
menyebabkan spermatozoa lebih cepat
mengalami kematian. Hasil pengukuran pH
semen domba garut pada penelitian ini diperoleh
rataan
6,730,24 (Tabel 1), lebih rendah
dibanding hasil penelitian Rizal et al., (2003)
yang memperoleh rataan 7,070,11. Menurut
Toelihere (1985) spermatozoa sangat aktif dan
tahan hidup lama pada pH sekitar 7,0. Menurut
Evans dan Maxwell (1987) variasi pH
disebabkan oleh variasi produksi plasma semen
oleh kelenjar kelamin aksesoris. Kelenjar
kelamin aksesoris bertanggung jawab terhadap

Tabel 1 Rataan kualitas semen segar domba

garut
Parameter
Volume (ml)
Konsistensi
Warna
pH
Gerakan massa
Konsentrasi (juta/ml)
Spermatozoa hidup (%)
Motilitas (%)
Spermatozoa normal (%)

RataanSD
0,980,16
Kental
Krem
6,730,24
+++
3528,85777,11
88,482,68
79,623,98
92,163,61

kapasitas penyangga semen. Sistem penyangga

semen berperan melindungi spermatozoa dari
perubahan pH secara tiba-tiba yang dapat
merusak daya hidup sel spermatozoa.
Ciri utama spermatozoa yang berkualitas
baik adalah mempunyai gerakan massa dan
motilitas dengan daya gerak maju yang
progresif. Semakin aktif dan semakin banyak
spermatozoa yang bergerak ke depan, maka
gerakan massa akan semakin baik. Rataan
gerakan massa semen domba garut pada
penelitian ini adalah +++ dan rataan motilitas
79,623,98% (Tabel 1). Beberapa peneliti
melaporkan bahwa rataan persentase motilitas
spermatozoa domba garut adalah 74,174,92%
(Herdis et al., 2002), 76,67%2,36 (Rizal et al.,
2003) dan 75,03,2% (Boediono et al., 2004).
Perbedaan tersebut kemungkinan disebabkan
oleh perbedaan kuantitas dan kualitas pakan
yang diberikan. Pemberian pakan dengan
kuantitas dan kualitas rendah dapat
menghambat fungsi reproduksi melalui
pengaruhnya terhadap sekresi hormon
gonadotropin kelenjar adenohipofisa, dalam hal
tersebut tubuli seminiferi kurang dipengaruhi
dibandingkan dengan sel-sel interstitial yang
memproduksi testosteron.
Penilaian persentase spermatozoa hidup dan
mati bertujuan untuk mengetahui viabilitas
membran spermatozoa. Teknik pewarnaan pada
penelitian ini menggunakan pewarna eosinnegrosin. Menurut Bjorndahl et al., (2003)
teknik tersebut sangat mudah dan dapat
dipercaya untuk menandai spermatozoa hidup
dan mati. Eosin berfungsi sebagai penanda selsel mati, sedangkan negrosin memberikan
warna pada latar belakang. Persentase
spermatozoa hidup semen domba garut pada
penelitian ini diperoleh rataan 88,48%2,68

128

Jurnal Veteriner September 2009

Vol. 10 No. 3 : 125-132

Tabel 2 Rataan konsentrasi spermatozoa, persentase spermatozoa hidup, spermatozoa motil

progresif, dan persentase spermatozoa normal domba garut hasil sentrifugasi gradien
densitas percoll (Konsentrasi spermatozoa sebelum perlakuan adalah 200x106/ml)
Kecepatan
Sentrifugasi
(xg)

Waktu Sentrifugasi (menit)

5

10

15

20

Rataan Konsentrasi spermatozoa (106/ml)

200
24,663,06a-A
43,342,3b-A
a-B
300
38,004,00
50,662,3b-B
a-C
400
48,663,06
55,344,16ab-B
a-C
500
51,343,06
56,665,04a-B

53,343,06c-A
61,345,04c-A
66,6612,22b-A
84,0011,14b-B

64,665,04d-A
78,006,00d-B
86,005,30c-BC
95,344,16b-C

Persentase spermatozoa hidup

200
14,795,60a-A
300
35,729,02b-BC
400
46,443,30a-C
500
25,343,64b-AB

19,222,40ab-A
48,774,07c-B
71,592,12c-C
52,923,75c-B

24,984,19b-A
58,914,03c-B
74,821,53c-C
56,473,42c-B

17,203,93ab-A
22,984,75a-A
63,251,97b-B
17,424,22a-A

Rataan spermatozoa motil progresif

200
15,0013,23a-A
300
23,1926,12ab-AB
400
48,482,63b-B
500
25,672,27b-AB

24,343,67ab-A
44,541,42b-C
51,282,22b-D
34,460,14c-B

34,899,95b-A
48,045,64b-AB
57,568,42b-B
37,011,21c-A

11,793,11a-A
15,517,53a-A
34,169,30a-B
11,462,99a-A

Rataan spermatozoa normal

200
262,65b-A
300
551,00b-C
400
711,00a-D
500
433,61b-B

293,00b-A
741,00c-B
782,00b-C
722,00c-B

353,46c-A
811,73d-C
861,73d-D
751,00c-B

151,00a-A
461,00a-C
822,00c-D
311,73a-B

Keterangan : Nilai dengan superskrip berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata
(a-d, P<0.05). Nilai dengan superskrip berbeda pada kolom yang sama menunjukkan
berbeda nyata (A-C, P<0.05)
(Tabel 1). Beberapa peneliti melaporkan bahwa
persentase spermatozoa hidup domba bervariasi.
Herdis et al., (2002) melaporkan rataan
spermatozoa hidup domba garut 91,832,00%.
Sedangkan menurut Rizal et al., (2003)
87,33%3,40 dan Boediono et al., (2004)
91,53,1%. Spermatozoa yang hidup ditandai
oleh kepala yang berwarna putih, sedangkan
yang mati ditandai oleh kepala yang berwarna
merah setelah pewarnaan dengan eosin negrosin.
Bentuk morfologi sel spermatozoa yang
dilaporkan Dally et al., (2000) dalam Hafez dan
Hafez (2000) berpengaruh terhadap pembuahan,
jika jumlah abnormalitas spermatozoa terlalu
tinggi maka akan menurunkan fertilitasnya.
Persentase spermatozoa normal semen domba
garut pada penelitian ini diperoleh rataan
92,163,61% (Tabel 1) atau rataan abnormalitas
spermatozoa 7,84%. Abnormalitas pada beberapa

ternak bervariasi. Menurut laporan Garner dan

Hafez (2000) dalam Hafez dan Hafez (2000),
bahwa abnormalitas spermatozoa domba
berkisar antara 5-20%; sapi 5-35%; babi 10-30%;
kuda 10-40%, dan ayam 10-15%. Beberapa
peneliti melaporkan bahwa rataan abnormalitas
spermatozoa domba garut sebesar 3,170,41%
(Herdis et al., 2002), 5,471,75% (Rizal et al.,
2003), dan 1,80,8% (Boediono et al., 2004).
Berdasarkan hasil pengamatan, abnormalitas
primer yang banyak didapatkan adalah kepala
terlampau kecil (microcephalic), sedangkan
abnormalitas sekunder yang banyak ditemukan
adalah patahan pada ekor.
Kualitas Spermatozoa Hasil Sentrifugasi
Gradien Densitas Percoll
Hasil pengujian statistika menunjukkan
bahwa faktor kecepatan dan waktu sentrifugasi

129

Sujoko etal

Jurnal Veteriner

Tabel 6 Perbandingan rataan kualitas spermatozoa semen segar, kontrol, dan metode sentrifugasi
gradien densitas percoll
Parameter

Konsentrasi (x106/ml)
Spermatozoa hidup (%)
Spermatozoa motil progresif (%)
Spermatozoa normal (%)

Rataan kualitas spermatozoa

Semen segar

Metode simple
washing
(Kontrol)

200,00a
88,48a
79,62a
92,16a

34,66b
73,01b
50,89b
85,33b

Metode sentrifugasi
gradien densitas percoll
400 xg 15 menit
66,66c
74,82b
57,56b
86,00b

Keterangan : Nilai dengan superskrip berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata
( P<0.05)
tidak berpengaruh nyata (p>0.05) terhadap
konsentrasi spermatozoa dan persentase spermatozoa motil progresif. Namun, berpengaruh
nyata (p<0.05) terhadap persentase spermatozoa
hidup dan persentase spermatozoa normal. Data
menunjukkan semakin tinggi kecepatan dan
waktu sentrifugasi, konsentrasi spermatozoa
makin meningkat (r=0.97) (Tabel 2).
Meningkatnya konsentrasi tersebut juga
diikuti dengan peningkatan persentase
spermatozoa hidup, persentase spermatozoa
motil progresif dan persentase spermatozoa
normal (Tabel 2). Peningkatan kualitas ketiga
parameter tersebut, hanya sampai pada
kecepatan sentrifugasi 400 xg selama 15 menit.
Sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 400 xg
15 menit, diperoleh persentase spermatozoa
hidup, persentase spermatozoa motil progresif,
dan persentase spermatozoa normal menurun.
Peningkatan kualitas spermatozoa ketiga
parameter hanya sampai pada kecepatan
sentrifugasi 400 xg selama 15 menit ini
disebabkan (1) perbedaan perlakuan; (2) akibat
proses pemisahan gradien densitas percoll; (3)
akibat perbedaan viskositas dan osmolaritas
gradien densitas percoll.
Peningkatan rataan konsentrasi
spermatozoa (Tabel 2) disebabkan oleh pengaruh
perbedaan perlakuan kecepatan dan waktu
sentrifugasi. Perbedaan tersebut mengakibatkan
pengaruh gaya sentrifugal dan sentripetal
terhadap spermatozoa menjadi berbeda. Proses
sentrifugasi memaksa spermatozoa untuk
bergerak ke tengah tabung, akibat adanya gaya
sentripetal. Meningkatnya kecepatan dan waktu
sentrifugasi menyebabkan semakin banyak
spermatozoa yang tertarik ke pusat atau

mengumpul di tengah-tengah tabung reaksi dan

akhirnya mengendap ke dasar tabung reaksi,
yang berarti konsentrasi spermatozoa semakin
meningkat. Hal tersebut dibuktikan pada
perlakuan sentrifugasi tertinggi, 500xg selama
20 menit, rataan konsentrasi spermatozoa
diperoleh 95,344,16 juta/ml, paling tinggi
dibandingkan perlakuan yang lain.
Sebaliknya sentrifugasi dengan kecepatan
dan waktu lambat, keberadaan spermatozoa
dalam tabung menyebar dan menjauh dari pusat
tabung reaksi akibat gaya sentrifugal lebih besar
dibanding sentripetal, sehingga spermatozoa
tidak banyak mencapai ke dasar tabung reaksi,
menyebabkan konsentrasi spermatozoa yang
mengendap menjadi rendah. Hal ini dibuktikan
pada perlakuan sentrifugasi terendah, 200 xg
selama 5 menit, rataan konsentrasi spermatozoa
diperoleh 24,663,06 juta/ml, paling rendah
dibandingkan perlakuan yang lain.
Makin tinggi kecepatan dan waktu
sentrifugasi mengakibatkan gesekan antar
spermatozoa atau spermatozoa dengan medium
mau pun dinding tabung reaksi makin besar.
Hal tersebut menyebabkan persentase
abnormalitas dan kerusakan membran
spermatozoa meningkat. Kerusakan membran
spermatozoa dapat menyebabkan proses
metabolisme terganggu dan mempengaruhi daya
hidup dan motilitas spermatozoa. Hal tersebut
dibuktikan dengan sentrifugasi kecepatan tinggi
lebih dari 400xg selama 15 menit, menyebabkan
persentase spermatozoa hidup, motilitas
progresif, dan spermatozoa normal menurun.
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa
sentrifugasi dengan kecepatan rendah 200 xg
selama 5 menit dan kecepatan tinggi 500xg

130

Jurnal Veteriner September 2009

Vol. 10 No. 3 : 125-132

selama 20 menit menghasilkan persentase

spermatozoa normal rendah. Abnormalitas
spermatozoa yang terjadi antara lain: kepala
terpisah dengan ekor, ekor patah dan
melengkung.
Perlakuan 200xg selama 5 menit membuat
rataan persentase spermatozoa normal sebesar
262,65% dan perlakuan 500xg selama 20 menit
sebesar 311,73% (Tabel 2). Perlakuan
sentrifugasi 400xg selama 15 menit merupakan
kombinasi optimum karena diperoleh kualitas
spermatozoa tertinggi, yaitu spermatozoa
mampu mempertahankan daya hidup, motilitas
progresif, dan spermatozoa normal. Hal tersebut
menunjukkan spermatozoa mampu mempertahankan efek sentrifugasi mencapai maksimal.
Jika sentrifugasi dilakukan melebihi 400xg 15
menit maka kualitas spermatozoa menurun.
Semen normal mengandung sejumlah
spermatozoa yang bergerak progresif, mati,
hidup tetapi immotil atau motilitasnya lemah
(Campbell et al., 2003) serta beberapa material
asing seperti partikel-partikel pemuai dan selsel bakteri (Rodriguez-Martinez et al., 1997).
Semen dalam gradien densitas percoll yang
disentrifugasi membuat spermatozoa terpisah
dari plasma semen mau pun material asing.
Proses pemisahan tersebut diduga akibat
perbedaan berat jenis dan motilitas progresif
spermatozoa. Partikel-partikel dipisahkan
menurut ukuran atau faktor-faktor lain yang
mempengaruhi mobilitasnya (Giancoli, 2001).
Menurut Salisbury dan Vandemark (1985) berat
jenis spermatozoa berkisar antara 1,24-1,34 dan
berat jenis plasma semen 1,005. Spermatozoa
mati diduga mempunyai berat jenis lebih rendah
dibandingkan spermatozoa hidup, akibat
keluarnya suspensi dari dalam sel karena
membran sel telah rusak. Jika dilakukan
sentrifugasi maka spermatozoa mati akan
terapung atau berada di atas permukaan tabung
reaksi, sedangkan spermatozoa hidup
mempunyai berat jenis lebih besar sehingga
cenderung turun ke dasar tabung.
Sejumlah spermatozoa mati, abnormal, atau
immotil akan lebih banyak berada pada gradien
densitas percoll konsentrasi rendah akibat
ketidakmampuannya menembus gradien
densitas percoll yang lebih pekat (konsentrasi
tinggi), sedangkan spermatozoa dengan motilitas
progresif, mempunyai kemampuan untuk
menembus gradien densitas percoll dengan
konsentrasi tinggi. Meningkatnya rataan
persentase spermatozoa hidup dan persentase

spermatozoa motil progresif (Tabel 2) berkaitan

dengan terpisahnya spermatozoa dengan bakteri
patogen (Morrell, 2006) selama sentrifugasi
gradien densitas percoll. Kehadiran bakteri
patogen tersebut dapat mempengaruhi secara
langsung mau pun tidak langsung daya hidup
dan motilitas spermatozoa.
Cairan percoll memiliki gesekan internal
yang disebabkan oleh gaya kohesi antar molekul.
Cairan yang berbeda memiliki besar viskositas
yang berbeda pula (Giancoli, 2001). Percoll
mempunyai viskositas 105 centipois pada suhu
20oC (Amershambiosciences, 2003), sedangkan
rataan viskositas semen sebesar 2,5 atau kisaran
1,15-7,15 centipois, rataan kekentalan plasma
yang telah disentrifugasi sebesar 1,3 atau
kisaran 1,0-1,85 centipois (Salisbury dan Van
Demark, 1985). Makin besar viskositas gradien,
gaya gesek sel-sel spermatozoa terhadap gradien
makin besar. Makin besar kecepatan dan waktu
sentrifugasi menyebabkan tingginya gesekan
spermatozoa dengan gradien densitas percoll.
Akibatnya ikatan protein dan lipid membran
goyah dan mengganggu permeabilitas membran
spermatozoa. Keadaan tersebut menyebabkan
rataan persentase spermatozoa hidup dan
normal menurun. Hal tersebut dibuktikan jika
sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan tinggi,
di atas 400xg selama 15 menit rataan persentase
spermatozoa hidup dan spermatozoa normal
menurun akibat ketidakmampuan spermatozoa
mempertahankan pengaruh gaya gesek tersebut.
Pada perlakuan 400xg selama 15 menit
kemampuan spermatozoa dalam mempertahankan gaya gesek mencapai maksimal.
Hasil pengukuran, menunjukkan rataan
osmolaritas percoll sebelum sentrifugasi adalah
sebagai berikut: percoll 10% (237 mOs/kg H2O),
percoll 50% (142 mOs/kg H2O), dan percoll 90%
(38 mOs/kg H2O). Sedangkan rataan osmolaritas
gradien densitas percoll setelah sentrifugasi 192
mOs/kg H2O lebih rendah dibandingkan dengan
osmolaritas spermatozoa normal yaitu berkisar
280-330 mOs/kg H2O. Kondisi medium yang
tidak isotonis tersebut mengakibatkan
terjadinya peristiwa perpindahan cairan dari
medium percoll ke dalam sel-sel spermatozoa
melalui membran semipermeabel, sehingga
menyebabkan kondisi sel spermatozoa
menggembung akibat konsentrasi cairan
meningkat. Meskipun sifat percoll sendiri tidak
menembus membran sel (Amershambiosciences,
2003) namun, dalam gradien densitas percoll
terdapat cairan medium BO. Kondisi medium

131

Sujoko etal

Jurnal Veteriner

yang mempunyai osmolaritas berbeda dengan

spermatozoa tersebut diduga memberi
kontribusi terhadap meningkatnya kematian
spermatozoa setelah sentrifugasi gradien
densitas percoll. Meskipun demikian, pengaruh
tersebut bisa diabaikan, dengan melakukan
pengamatan kualitas spermatozoa dilakukan
secepat mungkin, dibawah 30 menit. Pada
penelitian ini diketahui bahwa perlakuan 400xg
selama 15 menit merupakan kombinasi
kecepatan dan waktu sentrifugasi optimum,
karena diperoleh kualitas spermatozoa
maksimum dengan tingkat kematian dan
kerusakan spermatozoa rendah.
Efektifitas Metode Sentrifugasi Gradien
Densitas Percoll
Ditinjau dari aspek kuantitatif, seleksi
spermatozoa dengan menggunakan metode
sentrifugasi gradien densitas percoll lebih efektif
dan efisien dibandingkan dengan metode simple
washing (kontrol). Rataan kualitas spermatozoa
hasil seleksi metode sentrifugasi gradien
densitas percoll (perlakuan 400xg selama 15
menit) nilainya lebih tinggi dibandingkan
dengan kontrol, meskipun secara statistika
rataan spermatozoa hidup, spermatozoa motil
progresif, dan spermatozoa normal hasil seleksi
metode sentrifugasi gradien densitas percoll
perlakuan 400xg selama 15 menit tidak berbeda
nyata (P>0.05) dibandingkan kontrol (Tabel 3).
Jika dibandingkan dengan metode
sentrifugasi gradien densitas percoll, perlakuan
kontrol lebih sederhana karena hanya
menggunakan satu lapisan atau satu gradien,
namun perlakuan tersebut kurang efektif untuk
memperoleh spermatozoa berkualitas, karena
spermatozoa hasil seleksi banyak mengandung
komponen plasma semen seperti reruntuhan
(debris) sel-sel epitel. Seleksi spermatozoa dengan
metode sentrifugasi gradien densitas percoll
10%, 50%, dan 90% lebih efektif dan efisien
karena secara riil dapat diperoleh spermatozoa
berkualitas lebih banyak. Hasil pengamatan
menunjukkan bahwa gradien densitas percoll
10%, 50%, dan 90% efektif sebagai alat filtrasi
spermatozoa secara bertahap, untuk
memisahkan spermatozoa dari plasma semen,
debris, dan sel-sel epitel. Spermatozoa hasil
seleksi dengan metode tersebut lebih bersih
dibandingkan dengan perlakuan kontrol.

SIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat
disimpulkan bahwa seleksi spermatozoa dengan
metode sentrifugasi gradien densitas percoll
menggunakan kombinasi kecepatan dan waktu
sentrifugasi 400xg 15 menit merupakan
kombinasi optimum karena diperoleh
konsentrasi spermatozoa tinggi, persentase
spermatozoa hidup tertinggi, persentase
spermatozoa motil progresif tertinggi, dan
persentase spermatozoa normal tertinggi.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
tentang hubungan kualitas spermatozoa hasil
sentrifugasi gradien densitas percoll dengan
kemampuan fertilisasi, dan perkembangan
embrio in vitro serta kajian kualitas
spermatozoa semen beku pasca sentrifugasi
gradien densitas percoll.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih atas
bantuan dana dari BPPS 2006 dan Beasiswa
Penelitian Unggulan Program P3SWOT
Depdiknas RI Tahun 2007, Lab. Unit
Rehabilitasi Reproduksi, dan Lab. Embriologi
FKH IPB sehingga penelitian ini dapat
dilaksanakan.
DAFTAR PUSTAKA
Andrabi SMH, Maxwell WMC. 2007. A review
on reproductive biotechnologies for
conservation of endangered mammalian
species. (Review). Anim Reprod Sci. 99:
223243.
Amershambiosciences. 2001. Percoll
Methodology and Applications. Back To
Collection 18-1115-69. Edition AC. Uppsala,
Sweden. http://www.Amershambiosciences.
com. Pp: 1-84 [26 Nov 2007].
Amershambiosciences. 2003. Product
Information. Percoll Density Marker Bead
Kit for Calibration of Percoll Density
Gradients.
SIGMA.
http://www.
sigmaaldrich. com. Pp: 1-4 [26 Nov 2007].

132