לסוגי הכרומטוגרפיה הרבים עקרון פעולה משותף. התערובת שאותה רוצים להפריד מומסת בנוזל או בגז (או שהיא בעצמה נוזל או גז); בחלק מסוגי הכרומטוגרפיה מוזרם הנוזל או הגז (המכונה פאזה נעה/ניידת) בצינור או שפופרת שדפנותיו הפנימיות מצופות במוצק או ג'ל (המכונה פאזה נחה/נייחת); לעיתים ממלאת הפאזה הנחה את הצינור כולו. בסוגי כרומטוגרפיה אחרים את הצינור מחליף משטח (נייר, פלסטיק או אחר) המהווה את הפאזה הנחה, והפאזה הנעה נודדת על גביו.
בין שתי הפאזות נוצרות אינטראקציות כימיות (לא תגובות כימיות). בדרך-כלל מדובר במשיכות חשמליות הנובעות מההבדלים בקוטביות של החומרים השונים המעורבים. לעיתים מדובר בהבדלים במסיסות או בכושר ההספגות של החומרים השונים. היות שחוזקן של האינטראקציות בין הפאזה הנחה ובין המרכיבים השונים של הפאזה הנעה שונה ממרכיב למרכיב, זורמים חלק מהמרכיבים במהירות לקצה הצינור או הנייר, ואילו חלק אחר זורם באטיות. כך מופרדת התערובת למרכיביה (הומוגנית).
את התוצאות ניתן לראות בשלושה אופנים:
בסוגי כרומטוגרפיה פשוטים, בהם ההפרדה נעשית על נייר או משטח אחר, ניתן לראות בעין את החומרים שהופרדו מהתערובת, בתנאי שהם בעלי צבע.
אם הם חסרי צבע, ניתן להוסיף שיירים אולטרה-סגולים לתערובת, לפני ההפרדה, ולאחר מכן לחשוף את הנייר לאור אולטרה סגול (UV). ניתן, כשיטה נוספת, להוסיף פיגמנטים שונים הצובעים את מרכיבי התערובת.
בסוגי כרומטוגרפיה מתקדמים, בהם ההפרדה נעשית בצינור, קיימים גלאים אלקטרוניים משוכללים בקצה הצינור. הללו מזהים את החומרים, לפי סדר הגעתם, ומתרגמים (בעזרת המעבד) את הנתונים לשם הצגתם באופן גרפי (על גבי צג או כהדפס).
הפרדה של דיוֹ למרכיביו באמצעות כרומטוגרפיית שכבה דקה
מקור המילה כרומטוגרפיה ביוונית: כרומו - "צבע", גרפיה - "כתיבה". השיטה פותחה במהלך המאה ה-19 על ידי הבוטנאי הרוסימיכאיל צבט. צבט חקר את הפיגמנט כלורופיל המקנה לצמחים את צבעם הירוק. כתוצאה מבידוד הכלורופיל התקבלה שורה של צבעים האופייניים למרכיביו ומכאן שם השיטה. כיום הכרומטוגרפיה התפתחה ונחשבת לכלי אנליטי מדויק להפרדה ולמדידות גזים, מוצקים ונוזלים ללא תלות בהיותם בעלי צבע.
צבט פיתח את השיטה בשנת 1901, הגם שעקרונותיה היו ידועים עוד לפני כן; תרומתו של צבט הייתה ביישום העקרונות לשימוש מעשי. צבט לא הצליח לפרסם את שיטתו במידה רבה, אולי כיוון שכתב את עבודותיו רק ברוסית. במהלך המאה ה-20 התפתחה הכרומטוגרפיה בצעדים משמעותיים; ב-1952 זכו שני בריטים בפרס נובל לכימיה על פיתוח תאוריות מתקדמות ומספר סוגים של כרומטוגרפיה.
בשיטה פשוטה זו הפאזה הנחה היא רצועת נייר (העשוי ברובו מתאית), שבמרכזה מניחים טיפה מהתערובת שרוצים להפריד (יש לוודא שאף אחד ממרכיביה לא עלול להגיב עם הנייר). הנייר מוטבל בקצהו אל תוך הפאזה הנעה - מים או אתנול, למשל. הפאזה הנעה מתחילה "לטפס" במעלה הנייר; כשהיא פוגשת את טיפת התערובת היא גוררת את מרכיביה איתה. עתה מתבצעת ההפרדה: מרכיבי התערובת שאינם יוצרים אינטראקציות חזקות עם מולקולות הנייר מטפסים במהירות עם הפאזה הנעה אל קצה הנייר; המרכיבים שיוצרים אינטראקציות עם הנייר מזדחלים באיטיות. התוצאה המתקבלת היא שורה של נקודות, כל אחת מייצגת אחד ממרכיבי התערובת.
את התוצאות ניתן להשוות לתוצאות ידועות של החומרים המדוברים. ניתן לחשב את שיעור הנדידה של כל חומר. שיעור הנדידה (מסומן RF) שווה למרחק שנדד החומר (2 ס"מ, לדוגמה) חלקֵי המרחק שנדדה הפאזה הנעה (5 ס"מ, למשל; במקרה זה שווה ה-RF ל-0.4).
בכרומטוגרפיית נייר דו-ממדית מסובבים את הנייר באמצע התהליך ב-90 מעלות. כתוצאה מכך נוצרת הפרדה כפולה, מדויקת יותר; זו משמשת בדרך-כלל להפרדת תערובות בעלות מספר רב של מרכיבים דומים מאוד.
בחינה של לוח TLC תחת מנורת UV (על-סגול) באורך גל של 254 ננומטר
שיטה זו, הידועה יותר כ-TLC (באנגלית: Thin Layer Chromatography), זהה בעקרונותיה לכרומטוגרפיית נייר, אלא שכאן הפאזה הנייחת (בדרך כלל סיליקה או אלומינה) מצופה על גבי משטח (זכוכית, אלומיניום או פלסטיק). שיטת ה-TLC מהירה ומדויקת יותר מכרומטוגרפיית נייר ומשום כך, עם התפתחותה של שיטה זו - שיטת כרומטוגרפיית הנייר נעלמה כמעט לחלוטין. שיטת ה-TLC משמשת בעיקר לזיהוי של חומרים לא ידועים המוטענים על גבי המשטח ו"רצים" על גביו לצד חומרים ידועים (סטנדרטים). בסיום תהליך ההרצה מושווה מרחק הנדידה של החומר הנעלם למרחקי הנדידה של הסטנדרטים. ההנחה שעומדת במרכזה של שיטת ה-TLC היא שלחומרים זהים יהיה מרחק נדידה זהה. לכן, על פי מרחק של חומר לא ידוע ניתן לקבוע את זהותו. היא משמשת רבות בכימיה אורגנית בעיקר לבדיקת דרגת הניקיון של החומר ולבדיקה ראשונית של כמות המרכיבים בתערובת.
כרומטוגרפיה ברובד דק נחשבת לשיטה כרומטוגרפיית זולה, קלה ויעילה. היא משמשת בעיקר לזיהוי של חומרים ויש לה יישומים נרחבים בן התחום הכימיה האנליטית והן בתחום הכימיה האורגנית בעיקר לבדיקת דרגת הניקיון של החומר ולבדיקה ראשונית של כמות המרכיבים בתערובת.
ניתן לבצע בעזרת שיטה זו בדיקות כמותיות למציאת ריכוז חומרים, אך שיטות אלו פחות נפוצות. לצורך כימות חומרים בשיטות כרומטוגרפיות ישנו שימוש נרחב בשיטות של כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) וכרומטוגרפיה גזית (GC).
הפרדה לפי משקל מולקולרי או הפרדה לפי גודל מולקולה Size Exclusion Chromatography - SEC. כרומטוגרפיה סינון בג'ל, או SEC היא שיטה להפרדת חלקיקים לפי נפחם בממס מסוים. לרוב שימושיה הן טיהור ואנליזה של מולקולות סינתטיות וביולוגיות כמו: חלבונים, פוליסוכרים וחומצות גרעין.
ביולוגים וכימאים משתמשים בתמיסה ג'לטינית ספדקס שמורכבת מחרוזים קטנים בעלי חריצים המרכיבים את הפזה הנייחת, דרכה תעבור תמיסת הבופר ובה החלקיקים המיועדים להפרדה. יתרונה של השיטה הוא בכך שניתן להשתמש במגוון גדול של תמיסות מבלי שהן יפגעו בתהליך הסינון ולא יפגעו בפעילות הביוכימית של המולקולות המיועדות להפרדה.
השיטה היא המסת חומר בממס מסוים והנעתו בתוך קולונה על ידי ממס (בופר) נוסף דרך השכבה הנייחת לשם הפרדתו לפי גודל, כאשר לפי נפח הממס המניע שיצא (אילוציה), מחליטים על גודל המולקולה.
הפרדה לפי משקל (Size-Exclusion Chromatography – SEC) היא שיטה שנועדה להבדיל בין מולקולות כתלות בגודלם במרחב.
תאוריה ושיטות:
ישנן שתי הנחות בסיסיות שמניחים בשיטת SEC. (יש לשים לב שהן לא תמיד מתקיימות).
ככל שהמולקולה ארוכה (גדולה) כך גם משקלה המולקולרי יהיה גדול יותר (לדוגמה: נהוג להניח כי משקלה של חומצה אמינית אחת הוא כ-110 (KDa)
אבקת סיליקה (צורן דו-חמצני) המשמשת כמצע הרצה שכיח בכרומטוגרפית עמודההמולקולות איתן עובדים מתקפלות לאותו מבנה מרחבי עגול (לדוגמה: החלבונים נמצאים במבנה השלישוני או הרביעוני שלהם).
אם לחבר את שתי ההנחות, אז העיקרון המנחה הוא שמולקולות בגדלים שונים יצאו בנפחי אילוציה שונים (אילוציה היא התמיסה שנאספת בתחתית עמודת ההפרדה ובה החלקיקים שעברו סינון). ההפרדה מתבצעת בתוך עמודת הפרדה (Column או קולונה) שמורכבת מצינור חלול ובתוכו ארוזים חרוזים מחוררים (נקראים בידיים - bead) עשויים פולימר (לרוב דקסטרן, אגרוז או מפוליאקרילאמיד (Polyacrylamid)). הבידים מעוצבים בגדלים שונים ויוצרים תעלות דרכם החלקיקים (המתאימים בגודל) יוכלו לנוע, כלומר החלקיקים נעים בתוך הקולונה בנוזל הבופר כאשר בהתאם לגודלם היחסי חלקם נכנסים גם לחריצים של הבידים וחלקם ממשיכים עם הנוזל אל קצה הקולונה.
ככל שהחלקיק גדול יותר כך הנפח בו הוא יוכל לנוע בתוך הקולונה קטן יותר ולכן חלקיק גדול יצא בנפח אילוציה קטן יותר.
גורמים המשפיעים על הסינון:
גודל החלקיקים המסוננים וחריצי הבידים: במצב אמת החלקיקים וחריצי הבידים אינם מתואמים באופן מושלם לצפיותינו, התמיסה מורכבת מחלקיקים בגדלים שונים ולפעמים חלקיק שמתאים בגודלו לחריץ לא יכנס אליו, ובכך יקצר את דרכו החוצה. בדיוק בגלל הסיבה הזאת נפח האלוציה מתפלג נורמלית.
שינויים בקולונה: ניתן להשפיע על איכות ההפרדה על ידי הארכת הקולונה או על ידי הגדלת צפיפות הבידים, שינויים כאלה יעלו את רזולוציית ההפרדה. מצד שני צפיפות יתר עלולה לגרום לסתימת הקולונה ובכך לפגוע בפעילותה. דרך נוספת להגדלת יכולת ההפרדה היא תוספת של בידיים בגדלים שונים (או אם לדייק, הוספת בידיים בעלי מגוון רחב של חריצים), כלומר יצירת מצב בו גם למולקולות בגודלי הביניים ישנם בידיים בהן הן יכולות לנוע ו"להתעכב" בתוך הקולונה.
בשיטה זו, הידועה גם ככרומטוגרפיית אפיניות (באנגלית: Affinity Chromatography) והמשמשת בעיקר להפרדת חלבונים, משתמשים באינטראקציות ביולוגיות ספציפיות (לא קוולנטיות). דוגמאות לאינטראקציות כאלו הן: אנזים וסובסטראט, קולטן וליגנד וכו'.השיטה הזאת דומה לשיטת SEC, כאשר גם פה ישנה עמודה (Column - קולונה) שמורכבת מפאזה נייחת, רק שבמקרה זה אל החרוזים קשורה קוולנטית מולקולה, שזיקתו אליה של אחד החומרים המועמסים לקולונה גבוה. את הפאזה הנעה, נוזל המכיל את התערובת, מוזגים אל הפתח העליון של העמודה. התערובת מחלחלת לאיטה דרך העמודה, כשמרכיביה נודדים במהירויות שונות, עד שהיא מגיעה לתחתית, בשלב זה החומר אותו נרצה לבודד יהיה קשור לפאזה הנייחת (ליתר דיוק לליגנד) בצורה הפיכה ויתר המולקולות שהועמסו לקולונה ישטפו על ידי נוזל הבופר. כשמבצעים כרומטוגרפיית אפיניות, יש לדעת מראש אילו חלבונים מצויים בתערובת, ולבחור את הליגנד בהתאם. שיטת כרומטוגרפיית הזיקה פותחה בידי פרופ' מאיר וילצ'ק ממכון ויצמן למדע.
תאוריה ושיטות
כאשר רוצים להפריד על ידי קולונת אופייניות נלקחים מספר דברים בחשבון:
מולקולת המטרה (לרוב חלבון) תהייה בעלת תכונה ידועה ומוגדרת, אותה ניתן לנצל לטובת ההפרדה (לדוגמה: Concanavalin A שהוא חלבון בעל זיקה גבוהה לגלוקוז).
הקישור של מולקולת המטרה לליגנד היא ספציפית מאוד ורוב המולקולות לא יקשרו אליו.
הקשר בין מולקולת המטרה לליגנד הוא לא קשר קוולנטי ולכן ניתן להתחרות בו. (לדוגמה: הוספת גלוקוז חופשי כדי לבודד את ה-Concanavalin A מהקולונה).
לפיכך כדי לבודד חלבון מסוים על ידי קולונת אפיניות צריך להכיר את החלבון אותו מבקשים לבודד. לפי הידע המוקדם יודעים לקשור בצורה קוולנטית, אל החרוזים מולקולה אליה לחלבון המטרה אפיניות גבוהה. את החרוזים עם המולקולה הקשורה מעמיסים אל הקולונה והם יהוו את הפאזה הנייחת. בהמשך מעמיסים לתוך הקולונה תמיסה ובה החלבון אותו מבקשים לבודד, לאחר מכן מוזרמת תמיסת בופר שתשטוף את יתר החלבונים שלא נקשרו מהקולונה. בשלב הבא מוזרם לתוך הקולונה את אותה המולקולה שקשרה את החלבון לחרוזים, והיא תתחרה על הקישור לחלבון, כלומר בריכוז גבוה החלבון יקשר אליה וכל שנשאר לעשות הוא לאסוף את האילוציה מתחתית הקולונה.
שימושים
בידוד מולקולות מתערובת מבלי לפגוע בתפקודם הביולוגי/כימי.
דילול בריכוז חומר מסוים מתוך תערובת.
גילוי איזה מולקולה ביולוגית נקשרת לחומר מסוים (כמו לתרופות לדוגמה).
בשיטה זו, הידועה יותר כ-IEC (באנגלית: Ion-Exchange Chromatography). IEC) מופרדות מולקולות לפי מטענן החשמלי. בשיטה ניתן להפריד כמעט כל סוג של מולקולה טעונה לרבות, חלבונים, חומצות גרעין וחומצות אמיניות. התמיסה המיועדת להפרדה נקראת דוגמית. את הדוגמית מעמיסים לתוך עמודה (קולונה), שהיא בעצם צינור חלול המורכב משכבת ג'ל עשויה חרוזים קטנים (בידים, באנגלית: bead), החרוזים קשורים קוולנטית לשיירים טעונים, ומהווים את הפזה הנייחת. הדוגמית מוזרמת דרך הקולונה על ידי תמיסת בופר ונקראת הפזה הניידת. ניתן גם להשתמש בשיטה זו להפרדה פרפרטיבית (לא לצורך אנליזה), כפי שיוסבר בדוגמה למטה.
הפרדה זו מתבססת על כך שלחלבונים מספר גדול של קבוצות פונקציונליות טעונות (חיובית או שלילית) כתלות בחומציות התמיסה בה הם נמצאים. IEC מפרידה בין חלבונים על סמך המטען הכללי על שרשרת הפפטיד, כאשר המטען תלוי בחומציות הפזה הניידת.
IEC מפרידה בין מולקולות על ידי אינטראקציה יונית בין המולקולות הטעונות הנמצאות בפאזה הניידת לבין השיירים הטעונים (R-X) הנמצאים על הפאזה הנייחת. השיירים מגיבים עם מולקולות טעונות (במטען הנגדי) מהדוגמית.
ניתן לחלק כרומטוגרפיה מסוג זה לשתי תת-קבוצות: כרומטוגרפיית קטיונים וכרמטוגרפיית אניונים. כרומטוגרפיית קטיונים מפרידה בין המולקולות מהדוגמית בעזרת האופי השלילי של השייר על הפאזה הנייחת, כאשר בכרומטוגרפיית אניונים משתמשים בשייר טעון חיובית.
אופי האינטראקציה בין המולקולות יכול להיות מבוקר על ידי pH תמיסת הבופר, כאשר השינוי ב-pH נעשה על ידי הוספה של מלח. ככל שמולקולה טעונה יותר כך ידרשו ריכוזים גבוהים יותר של מלח כדי להזרימה מתוך הקולונה. ניתן לקבל פרופיל אילוציה הדומה ליתר שיטות הכרומטוגרפיה בעמודה, כלומר כדי להזרים חלבון טעון יותר דורש כמות מלחים גבוהה יותר.
תהא דוגמית המכילה את חלבונים א' וב' המתוארים להלן:
חלבון
מטען כללי ב-pH 7
חלבון א'
+ (חיובי)
חלבון ב'
- (שלילי)
הדוגמית תוזרם בנוזל בופר דרך קולונה של כרומטוגרפיית קטיונים (כלומר אל החרוזים שמרכיבים את הפזה הנייחת קשורים שיירים שליליים) חלבון א' בשל מטענו החיובי יקשר בתוך הקולונה לחרוזים בעלי שיירים שליליים, בזמן שחלבון ב' יזרום מתוך הקולונה עם תמיסת הבופר. ישנן מס' שיטות בהן ניתן להשתמש כדי להוציא את חלבון א' מחוץ לקולונה:
הזרמת יונים בעלי מטען זהה למטען החלבון הקשור, בדרך זאת "נמסך" על הפאזה הנייחת. היונים יאפשרו לנו להזרים את החלבון אל מחוץ לקולונה.
הזרמת יונים בעלי מטען שונה ממטען החלבון הקשור, בכך נייצר גורם תחרותי לשיירים הטעונים שעל הפזה הנייחת.
דרך נוספת לנתק חלבונים הקשורים לפזה הנייחת היא על ידי הוספת מלחים אשר יבצעו את שני התהליכים שהזכרנו בשני הסעיפים הקודמים במקביל.
שינויים בחומציות הפזה הניידת יביאו את החלבונים לנקודה האיזואלקטרית, ובכך ישחררו אותם מהפאזה הנייחת.
שחרור המולקולות נעשה על ידי הוספה של גורמים תחרותיים כגון מלחים. פרופיל האילוציה דומה ליתר שיטות ההפרדה בעמודה, כאשר הגורמים המשפיעים הם: כמות המטען על המולקולה אותה מבקשים להפריד מול כמות המלח אותה צריך להמיס כדי לשחרר את החלבון. בשתי התמונות ניתן לראות פרופיל אילוציה של חלבון מסוים כתלות בכמות המלח שהומס. בדוגמה 1 החלבון השני מתחיל להשתחרר טרם יצא כל החלבון הראשון (ועל כן קיים תחום חפיפה), ואילו בדוגמה 2 החלבון השני יוצא אחרי שכל החלבון הראשון יצא (דבר המצביע על הפרש משמעותי בין מטעני שני החלבונים).בדוגמה 2 אפשר להשתמש גם להפרדה פרפרטיבית כמוזכר לעיל.
בשיטה זו (GC), הפאזה הנעה היא גז (המורכב ממולקולות דו-אטומיות של הליום, מימן או חנקן, על-מנת שלא יגיב עם החומרים בתערובת). ההפרדה נעשית בעמודת הפרדה או בנים (Capillary) דק וארוך (אורכו עשוי להגיע ל-100 מטרים). שיטה זו מתאימה רק לחומרים המתאדים או רותחים בטמפרטורות נמוכות יחסית. זיהוי החומרים המופרדים נעשה על ידי גלאים משוכללים, המתרגמים את הנתונים לצורה גרפית.
זמן הנדידה של כל אחד מהחומרים בתערובת - הזמן שעובר עד שהם חוצים את העמודה לאורכה - תלוי בנקודת הרתיחה שלהם, בעיקר, ופחות באינטראקציות עם הפאזה הנחה. לפיכך, השיטה יעילה במיוחד להפרדה של סדרות הומולוגיות - תרכובות אורגניות המשתייכות לאותה משפחה, אך הנבדלים זה מזה באטוםפחמן אחד (לדוגמה: האלקאניםמתאן, אתאן, פרופאן, בוטאן). כל אטום פחמן נוסף מגביר את חוזקה של המולקולה, ובכך את נקודת הרתיחה שלה; לכן החומרים מגיעים אל הגלאי לפי סדר גודל המולקולה.
ההפרדה ב-GC נעשית במהירות, תוך מספר דקות. אחד מחסרונות השיטה הוא שהתערובת הנבדקת רותחת ונהרסת; אלא אם כן ניתן לוותר עליה, יש להשתמש בשיטה אחרת. חיסרון נוסף הוא מחירם של מכשירי ה-GC, המתחיל בעשרות אלפי דולרים.
בשיטה זו, הידועה כ-HPLC (באנגלית: High Performance Liquid Chromatography), מומסת התערובת בפאזה הנעה (ממס זה או אחר), המוזרק בלחץ גבוה אל עמודה או נים. גם כאן מחכה לחומרים גלאי בקצה העמודה, המתרגם את הנתונים לצורה גרפית. ב-HPLC, אולם, ההפרדה מבוצעת על ידי הבדלים בקוטביות של חומרי התערובת. חומרים קוטביים (הידרופיליים) נמשכים לפאזה הנחה ונשארים זמן רב יותר בעמודה, וחומרים הידרופוביים (שומנים, למשל) ממהרים להגיע לקצה. גם שיטה זו טובה להפרדת סדרות הומולוגיות, שכן כל אטום פחמן נוסף מוריד מקוטביות המולקולה.
ב-HPLC מהופך (Reversed Phase (RP) HPLC) הפאזה הנחה היא הידרופובית, בניגוד ל-HPLC הרגיל, בו היא הידרופילית. לפיכך, החומרים מגיעים אל הגלאי בסדר הפוך.
HPLC הוא סוג הכרומטוגרפיה הנפוץ ביותר; 80% מההפרדות מבוצעות בשיטה זו. גם כאן מהווה המחיר הרב חיסרון, ולעיתים מכונה השיטה בהיתול High Price Liquid Chromatography (כרומטוגרפיית נוזל במחיר גבוה).
ערך מורחב – HPLC
ניתוח כרומטוגרפי, דף שער בספרייה הלאומית
