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En l'an 2000, deux ans après les événements de The House of the Dead, l'agence internationale secrète, l'AMS, a lancé une recherche au sujet de la cause de l'incident du manoir du docteur Curien, afin d'empêcher dans le futur une catastrophe semblable. Cependant, des évènements étranges ont eu lieu dans la ville de Venise, en Italie, où un agent du gouvernement, « G », est porté disparu. Les agents James Taylor et Gary Stewart sont envoyés sur place.
James Taylor — James est un agent de l'AMS et un des deux principaux protagonistes du jeu. Avec son collègue Gary Stewart, il est chargé de retrouver « G », un autre agent de l'AMS porté disparu à Venise. Après de nombreux périples dans cette ville, James découvrira que Goldman est responsable du chaos régnant dans la ville.
Gary Stewart — Gary, 24 ans, est un jeune agent de l'AMS, le second personnage principal du jeu. Sur les traces de « G », il accompagne James Taylor tout au long de l'aventure.
« G » — En 2000, « G » enquêtait sur les activités inquiétantes de Goldman, le président de la DBR Corporation quand il a été attiré dans un guet-apens et blessé par des zombies. James Taylor et Gary Stewart le retrouveront dans une bibliothèque dévastée de Venise, où « G » leur présentera un rapport de son enquête avec les détails des expériences morbides menées par la DBR Corporation.
Harry Harris — Agent de l'AMS, Harry dirige l'évacuation de Venise. Il travaille avec Amy Crystal, et il aidera James et Gary dans leur mission en leur donnant des informations sur les sièges sociaux de Goldman.
Amy Crystal — Amy est également un agent de l'AMS et travaille avec Harry Harris.
Goldman — C'est le président de la DBR Corporation. Goldman est un expert sur le génome humain. Dégoûté par l'avarice et l'égoïsme des humains, il poursuit les expériences initiées par le docteur Roy Curien. Lorsque James et Gary réussirent à détruire la plus grande création de Goldman, The Emperor, Goldman se suicida en se jetant du cinquantième étage de son immeuble.
Judgment (Type 28) — Cet ennemi est formé de deux créatures : Kuarl, une armure possédée de trois mètres de haut dotée d'une grande hache tachée de sang mais dénuée de volonté propre obéissant à Zeal, une gargouille narquoise et mesquine.
The Hierophant (Type B 05) — Cet hybride entre un triton et un humain est armé d'un grand trident. Capable de respirer sous l'eau et contrôlant des piranhas, son seul point faible est son cœur protégé par un thorax solide mais articulé s'ouvrant par intermittence. Le joueur retrouvera ce boss près d'un pont jouxtant la place centrale de Venise.
The Tower (Type 8000) — Quatre vers géants aux dents pointues et gueules béantes obéissent à une cinquième créature différentiable par sa crête en os et capable de subsister seule dans le réseau d'égouts de la ville. Une reproduction inachevée de cette créature est trouvée dans le laboratoire de Goldman.
Strength (Type 205) — Strenght est un grand zombi très musclé chargé du rapt d'Harry et Amy. Il a des haches logées dans son épaule droite et tient une énorme tronçonneuse avec le mot « Blame » gravé à l'acide sur sa surface. Les deux agents de l'AMS le rencontreront dans le Colisée, dévasté.
The Magician (Type 0) — En 2000, la plus grande création du docteur Curien, The Magician, est ramenée à la vie par Goldman. Il est plus vif, plus rapide, plus dangereux et désormais doté du pouvoir de pyrokinésie.
The Emperor (Type α) — Résultat d'une expérimentation top secrète de Goldman, The Emperor est conçu pour détester et détruire l'humanité. Encore à l'état de prototype, cette créature n'est pas aussi forte que Goldman l'aurait espéré mais suffisamment pour accomplir son but. Il peut faire de la lévitation, et son corps se compose d'un sérum génétique qui lui permet de remodeler son corps à volonté. Il peut ainsi par exemple transformer son bras en lance aiguisée. Une fois encore, la plupart des fans inconditionnels déploreront un ennemi technique qui n'a plus rien à voir avec les zombis sanguinolents propre à la série.