BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEE

(BIOMOAP)

SEMESTRE: 4

CHARGE DU COURS : Mr. DOUMBOUYA IBRAHIMA

MSc. Biologie moléculaire et la Biotechnologie à l’Université Panafricaine, Nairobi-Kenya
MSc. Microbiologie, et immunologie et les maladies infectieuses à l’Université de Grenoble- France

CONTACT :
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Phone: (+224) 621041845/ (+33) 603564778
 Contenu du cours

CHAPITRE I: INTRODUCTION ET RAPPEL SUR LES STRUCTURES ET CARACTÉRISTIQUES DES ACIDES

NUCLEIQUES

CHAPITRE II: LES MÉTHODES DE CONSERVATION DES ECHANTILLONS ET D’EXTRACTION DES ACIDES

NUCLEIQUES

CHAPITRE III: ANALYSE DE LA QUALITÉ ET DE L'INTÉGRITÉ DES ACIDES NUCLÉIQUES ET DES

PROTÉINES EXTRAITS

CHAPITRE IV: MÉTHODES D'AMPLIFICATION

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CHAPITRE I : introduction et rappel sur la structures et caractéristiques des acides nucléiques

Introduction:
 La biologie moléculaire est une discipline consacrée à l’étude des êtres vivants au niveau moléculaire, qui les
composent et qui contrôlent leurs processus biologiques essentiels aux fonctions et au maintien de la cellule.

 Les biologistes moléculaires ont appris à caractériser, isoler et manipuler les composants moléculaires des cellules et
des organismes, notamment l’acide désoxyribonucléique (ADN), l’acide ribonucléique (ARN) et les protéines.

Objectifs du cours
 Avoir une connaissance sur les techniques de la biologie moléculaire appliquées à la recherche biomédicale ou à
l’exploration de matériel génétique par les laboratoires de biologie médicale.

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 Rappel sur la structures et caractéristiques des acides nucléiques
 Les acides nucléiques sont de deux types, l’ADN et les ARN
 Les acides nucléiques sont constitués d’acides phosphoriques, de
pentoses et de bases azotés.

 L’acide phosphorique est un triacide dont une fonction acide est

dissociée permettant de donner une charge négative à l’ADN, et
dont les deux autres peuvent former des liaisons phosphodiesters.
 Les pentoses sont des glucides cycliques à 5 atomes de carbone qui
sont sous forme de β-D-ribofuranose et sous forme « désoxy » pour
l’ADN.
 Les bases elles sont de deux types :
a) Les bases pyrimidiques : la cytosine, la thymine (ADN) et l’uracile
(ARN).
b) Les bases puriques : la guanine, l’adénine.

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Le dogme central de la biologie moléculaire : il établit la liaison qui existe entre le matériel génétique contenu dans la
cellule et les protéines que cette cellule synthétise.

Il comprend 3 étapes :

 La réplication de l’ADN : est le processus par lequel une cellule en division génère une copie de son ADN.

 Transcription: est un processus au cours du quel les informations continues dans la molécule d’ADN est transcrite
en ARNm et le début d’initiation de la synthèse des protéines.

 La traduction : est la synthèse d’un polypeptide (AA) à partir de l’ARNm.

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CHAPITRE II : les méthodes de conservation des échantillons et d’extraction des acides nucléiques

a) Stabilisateurs chimiques
 Préservation à éthanol : La méthode la plus courante de stockage de l'ADN est la suspension dans l'éthanol. Suivie d'une
conservation à -80oC.

 Préservation à ARN later : est le plus connu. Le réactif pénètre rapidement dans les tissus pour stabiliser et protéger les
cellules l'ARN.

 Carte de collectes des échantillons: Les échantillons peuvent également être séchés sur des cartes de collecte à base de
papier filtre. Empêche la dégradation bactérienne ou enzymatique des acides nucléiques.

 La préservation au froid Carte de collectes des échantillons

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 b) Méthodes D’extraction D’ADN et ARN
Dans la grande majorité des cas, la technique d'extraction des acides nucléiques doit être adaptée au type d'échantillon
biologique.
Méthodes D'extraction D'ADN
 Extraction de l'ADN à l'aide de Phénol : Chloroforme, alcool iso-amylique
 Kits commerciaux
Schéma du procédé d'extraction de l'ADN a Phénol, Chloroforme, alcool iso-amylique

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Étape 1 : Disruption des cellules
Les tissus solides sont d'abord broyés pour augmenter leur surface. Les cellules sont dissociées à l'aide de dodécylsulfate de
sodium (SDS) et de protéinase K pour la digestion enzymatique des protéines et des composants cellulaires autres que les
acides nucléiques.

Étape 2 : Un mélange de phénol : chloroforme : alcool iso amylique est ensuite ajouté.
 Le phénol dissocie les protéines liées à l'ADN, les dénature et les solubilise.
 Le chloroforme dénature les protéines et les lipides et stabilise l'équilibre aqueux/organique.
 L'alcool iso amylique empêche la formation de mousse et permet la séparation des phases aqueuses/organiques.
Étape 3 : Centrifugation
Après la centrifugation, 3 phases distinctes se sont formées:
En haut: La phase aqueuse contient l'ADN purifié.
Au milieu: L'interphase contient les protéines.
En bas: La phase organique contient les lipides.

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Étape 4 : La phase aqueuse est transférée dans un tube propre en prenant soin de ne pas la contaminer avec l'interphase.

Étape 5 : Précipitation et récupération de l'ADN

L'ADN peut être récupéré et concentré par précipitation à l'éthanol ou à l'isopropanol.

La précipitation à l'éthanol est une technique couramment utilisée pour concentrer et le dé-salage des préparations
d'acides nucléiques (ADN ou ARN) en solution aqueuse.

L'ADN précipité peut ensuite être pelleté par centrifugation et dissous dans un tampon de choix pour être utilisé dans les
réactions en aval.

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c) Kits commerciaux
Extractions rapides à l'aide de réactifs prêts à l'emploi proposés par un certain nombre d’industriels

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d) Méthodes d’extraction des Protéine

La procédure d'extraction doit être douce afin d'éviter.

 La dénaturation de la molécule cible

 Que la protéine cible ne forme pas de complexes protéiques permanents
 Les modifications chimiques

L'extraction doit être.

 Très rapide
 Sur glace

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Extraction de protéines à partir des cellules en suspension
 Centrifuger la suspension cellulaire à 2 000 rpm pendant 5-7 minutes à 4 °C.
 Les cellules sont concentrées au fond du tube, jeter le surnageant.
 Ajouter du PBS glacé au culot cellulaire et laver les cellules par centrifugation à 2 000 rpm pendant 5 à 7 minutes à 4
°C.
 Ajouter un tampon de lyse glacé au culot cellulaire. Agiter le contenu des tubes de micro centrifugation pendant 30
minutes à 4 °C.
 Centrifuger les tubes à 16 000 rpm pendant 20 minutes à 4 °C.
 Recueillir le surnageant dans un nouveau tube et le placer sur la glace et jeter le culot.

Extraction de protéines à partir de tissus

 Découper le tissu d'intérêt sur la glace.
 Transférer le tissu dans des tubes de micro centrifugation à fond rond et le congeler en l'immergeant dans l'azote
liquide.
 Pour 5 mg de tissu, ajouter 300 µl de tampon de lyse glacé et homogénéiser à l'aide d'un homogénéisateur électrique.
 Ajouter 300-600 µl supplémentaires de tampon de lyse pendant l'homogénéisation.
 Agiter le contenu pendant 2 heures à 4 °C.
 Centrifuger les tubes à 16 000 rpm pendant 20 minutes à 4 °C.
 Recueillir le surnageant dans un nouveau tube et le placer sur la glace et jeter le culot.

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CHAPITRE III : contrôle de qualité et de l’intégrité des acides nucléiques

Paramètres de CQ des acides nucléiques :

Le contrôle de qualité (CQ) est important dans les tests basés sur les acides nucléiques.
Le CQ des acides nucléiques comprend généralement des aspects quantitatifs et qualitatifs.
Les paramètres quantitatifs contrôlés comprennent généralement :
 Concentration d'acide nucléique (récupération / mesure du rendement)
Les paramètres qualitatifs contrôlés comprennent généralement :
 Pureté de l'acide nucléique (détection des contaminants et des impuretés)
 Intégrité de l'acide nucléique (qualité / dégradation des fragments)
Il est souvent important de connaître la concentration, la pureté et l'intégrité d'un échantillon d'acide nucléique pour les
opérations en aval.
Dans les réactions de PCR et de PCR en temps réel :
 De faibles quantités de template peuvent conduire à
 Une amplification insuffisante et un manque de rendement,
 Des résultats faussement négatifs.

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Méthodes de quantification des acides nucléiques
La concentration d'acide nucléique peut être évaluée à l'aide de trois méthodes différentes :
UV/VIS Spectrophotométrie

 Basé sur la mesure de l'absorbance (densité optique),

Le Nano-drop

 Il mesure la concentration des acides nucléiques

Electrophorèse sur gel d'agarose,
Pour la quantification et l'analyse de la qualité

a) UV/Vis spectrophotométrie: est un instrument utilisé pour mesurer la quantité de lumière qu'un échantillon absorbe.

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Absorbance à 260nm

 Les acides nucléiques absorbent la lumière UV à 260nm en raison des unité aromatique hétérocyclique dans leur
structure de base.

 Les purines (thymine, cytosine et uracile) et les pyrimidines (adénine et guanine) ont toutes deux un pic d'absorption à
260 nm.

Absorbance à 280nm

 L'absorbance à 280nm est mesurée là où les protéines ont une forte absorbance.

Absorbance à 230nm

 De nombreux composés organiques (phénol, TRIzol, et sels chaotropiques) ont une forte absorbance à 230nm.

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b) Nano-drop

Le rapport d'absorbance de 260nm/280nm

Comme les protéines absorbent la lumière à 280 nm, le rapport
260nm/280nm est utilisé pour estimer la contamination protéique
dans un échantillon d'acide nucléique.

 Le rapport 260nm/280nm pour l'ADN pur = ~1,8

 Le rapport 260nm/280nm pour l'ARN pur = ~2,0

 Le rapport 280nm/260nm pour une protéine pure = 0,6.

 Si le rapport 260 nm/280 nm d'un échantillon d'acide nucléique

est inférieur à 1.7, la préparation d'acide nucléique peut être
contaminée par des quantités inacceptables de protéines

 Parfois, le rapport A260/A280 est supérieur à 2, ce qui indique

une dégradation de l'ADN et une mesure des nucléotides libres.

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Le rapport d'absorbance de 260nm/230nm

A260/230 indique la présence de contaminants organiques, tels que le phénol, le TRIzol, les sels chaotropiques et
autres composés aromatiques.

 Les valeurs A260/230 sont généralement comprises entre 2,0 et 2,2.

 Les échantillons dont les rapports 260/230 sont inférieurs à 1,8 sont considérés comme ayant une quantité
significative de contaminants qui absorbent à 230nm.

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c) Electrophorèse sur gel d'agarose pour la quantification et l'analyse de la qualité :
l'électrophorèse sur gel d'agarose est une technique de séparation des acides nucléiques basée sur leur taille et leur
charge électrique. Elle est largement utilisée en recherche scientifique et en diagnostic génétique pour diverses
applications, telles que l'analyse de la PCR, la cartographie de restriction, et la détection de mutations.

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Méthodes de quantification des Protéines
La concentration et la pureté des protéines peuvent être évaluée à l'aide de quatre (4) méthodes différentes
 UV/Vis spectrophotométrie
 SDS PAGE (sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis)
 Western blot ou Immunoblot
 Dot blot

a) SDS PAGE : est une technique largement utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour séparer les protéines selon
leur poids moléculaire la taille et leur charge électrique.
Bleu de
Coomassie

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b) Western blot ou Immunoblot :
Technique utilisée pour identifier une protéine dans un échantillon contenant plusieurs protéines.
Les protéines d’un échantillon sont séparées par électrophorèse en fonction de leur poids moléculaire.
Un anticorps spécifique est ensuite utilisé pour détecter la protéine d’intérêt.

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c) Dot blot :
Le Dot blot est une technique moléculaire et immunologique utilisée pour détecter la présence de protéines spécifiques dans
un échantillon biologique. Contrairement à d'autres techniques telles que le Western blot, qui nécessitent une séparation
préalable des protéines par électrophorèse, le Dot blot permet une détection rapide et directe des protéines sans nécessiter de
séparation préalable.
SSC buffer
Nitrocellulose
membrane

Nitrocellulose A:
membrane
Donor

Dry vacuum 1.8E8 µg/ml

B:

Receiver

HRP conjugate IgG

secondary antibody

IgG primary antibody

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CHAPITRE IV : méthodes d'amplification

Historique de l'amplification de l'ADN

L'amplification de l'ADN est la pierre angulaire de la biotechnologie moderne et c'est également une procédure clé dans
de nombreuses études fondamentales impliquant des molécules d'ADN.

Toutes les méthodes d'amplification de l'ADN ont reposé sur le concept de complémentarité des brins d'ADN (A=T ;
G≡C) découvert par James Watson et Francis Crick il y a 50 ans.
Il existe de nombreux protocoles différents de la PCR destinés à une multitude d’application différentes et à
l’amplification de population très diverses d’ADN. Il est facile d’adapter l’amplification par PCR aux ARN servant de
modèles en les transformant d’abord en ADN complémentaires grâce à la transcriptase inverse.

 Types de PCR:

• PCR conventionnelle (ou PCR en bout de chaîne)

• PCR quantitative (qPCR) (ou PCR en temps réel)
• Multiplexe PCR
• Colonie PCR

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Les enzymes utiliser en PCR
 Les deux amorces d’ADN : Les deux amorces (une amorce avant et une amorce inverse) sont complémentaires aux
extrémités 3' de chacun des brins sens et anti-sens de la cible d'ADN qui doit être amplifiée. L'ADN polymérase ne
peut se lier et s'allonger à partir d'une région double brin de l'ADN, et sans amorces, il n'y a pas de site d'initiation pour
que la polymérase se lie.

 Les dNTPs (Désoxyribonucléosides-Tri-Phosphates) (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : sont des molécules de base, qui
constituent l’ADN, utilisés par la Taq polymérase pour la synthèse du nouveau brin d’ADN complémentaire.
 Taq polymérase: Synthétise un nouveau brin d’ADN à partir du brin d’ADN matrice après s’être fixée à une amorce.

 Milieu réactionnel : Comporte l’ADN à amplifier, les dNTPs, les deux amorces, la Taq polymérase, un tampon et des
ions magnésium (MgCl2). Ces deux derniers composants définissent un milieu avec un pH optimal et une
concentration saline optimale pour le bon fonctionnement de l’enzyme.
 La PCR master mix : Est une solution pré-mélangée qui contient tous les composants d'une réaction PCR, à
l'exception de l'échantillon. L'utilisation d'un master mix PCR (qui contient tous les composants de la réaction, sauf
l'échantillon) :
• Réduit le nombre d'étapes de pipetage,
• Réduit les risques de contamination entre puits
• Réduit les autres erreurs de pipetage

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La conception des amorces d’ADN (Primer) utiliser en PCR

Le NCBI (National Center for Biotechnology Information) est

une ressource extrêmement importante dans le domaine de la
biologie et de la biotechnologie.
Il contient:

 Base de données de séquences génomiques

 Base de données de publications scientifiques : PubMed
 Outils d'analyse bioinformatique

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Optimisation et le déroulement de la PCR

Pour obtenir les meilleurs résultats à la fin de la PCR, il est important de comprendre comment faire bon déroulement de
votre réaction PCR et à quelle température vos amorces peuvent se lier à votre molécule cible.
En effet, la réaction de PCR se fait dans un thermocycleur.

L’appareil contient un bloc chauffant où l’on insère les tubes contenant notre mélange pour la réaction de PCR et où la
température peut varier très rapidement et très précisément de 0°C à 100°C.

Le thermocycleur est alors programmé pour effectuer les différents cycles de la PCR. Ainsi, chaque cycle est composé
d’une succession de paliers de température prédéterminée, et d’une durée bien définie. Ces deux paramètres, température et
temps, dépendent de la taille de la séquence à amplifier de la taille et de la composition en désoxyribonucléotides des
amorces.

Bloc chauffant

Ecran à manipuler

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1. Dénaturation : La température dans le tube est réglée à 95°C environ 01min. A ce moment-là, l’ADN se dénature.

2. Hybridation des amorces : Ensuite la température est descendue à la température dite d’hybridation. Cette dernière est
généralement comprise entre 50°C et 60°C environ 50 secondes.

3. Elongation : Puis la température est réglée à 72°C pendant environ 02min, température idéale pour l’activité de la Taq
polymérase. Cette étape permet à la Taq polymérase de synthétiser le brin complémentaire à l’ADN matrice, grâce aux
dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel. Au cycle suivant de chaque cycle, les nouveaux fragments synthétisés
servent à leur tour de matrice pour la synthèse de nouveaux fragments d’ADN.

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Le nombre de cycles de la PCR est fonction du protocole de PCR. A partir d’une copie d’ADN cible, on pourra donc
obtenir 1 milliard de copie d’ADN cible.

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PCR quantitative (qPCR) (ou PCR en temps réel)

La technique RT-PCR a permis de montrer que la transcription de tous les gènes s’effectuait dans tous les tissus et ceci
même pour les gènes qui présentent une très grande spécificité tissulaire. On parle dans ces conditions de transcription
illégitime. Il est évident qu’avant les techniques d’amplification génique, la sensibilité des méthodes classiques n’avait
pas permis de mettre en évidence un tel phénomène.

La RT-PCR se déroule en deux phases. Une première phase correspond à la copie d’ARN messager en ADN
complémentaire (ADNc) et une seconde phase correspond à une réaction PCR classique sur l’ADNc synthétisé.

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Synthèse du premier et du second brin d'ADNc
Dans la première phase, l’ARN messager à étudier est repéré en utilisant une sonde Oligo nucléotidique spécifique
(amorce 1 qui s’hybride à l’extrémité 3’ du seul ARNm auquel on s’intéresse), puis la transcriptase inverse (ou
rétrotranscriptase) permet la synthèse du brin complémentaire (sous une forme de ADNc simple brin), une seconde
amorce Oligo nucléotidique spécifique (amorce 2) permettra la synthèse du second brin par extension. L’ADN
complémentaire synthétisé servira ensuite de matrice pour une réaction PCR classique.

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Principe du Ct
Les données de fluorescence sont collectées à chaque cycle de PCR et représente la quantité de produits amplifiés à cet
instant. Plus l’échantillon est concentré en molécules cibles à l’origine, moins il faudra de cycles pour atteindre un
point pour lequel le signal fluorescent est significativement supérieur au bruit de fond. Ce point est défini comme étant
le cycle seuil (Ct) et apparaît au début de la phase exponentielle. Ce concept de Ct est à la base de la précision et de la
productivité de la technique.

31
 THANK YOU

FOR

YOUR ATTENTION