La Chromatographie sur Couche Mince

Thin - Layer Chromatography

(CCM – TLC)
I- Classification des méthodes chromatographiques
 Place de la chromatographie en phase liquide :

Mélanges homogènes

Transfert de phase

Chromatographie

Phase Gazeuse Phase supercritique Phase Liquide

 Chromatographie en phase liquide

Sur colonne De surface

• Adsorption • Sur couche mince CCM

• Partage
• Echange d’ions • Sur papier CP
• Paire d’ions
• Exclusion
II- Principe de la CCM
 Technique de séparation dans laquelle :

• La phase stationnaire constituée d’un matériau approprié, est

déposée en une couche mince et uniforme sur un support
constitué par une plaque de verre, de métal ou de plastique.

• La phase mobile se déplace par capillarité à travers la phase

stationnaire entraînant à des vitesses différentes les
constituants à séparer.
• Au cours de leur migration (= développement) les solutés
(solutions d’analytes) entrainés par la phase mobile à
travers la couche mince vont se déplacer en fonction de
leurs affinités pour chacune des phases.

• La séparation repose sur les mécanismes d’adsorption, de

partage ou d’échange d’ions.
III- Matériel
Support recouvert Récipients en verre
d’une couche fine et quadrangulaires ou
adhérente de phase cylindriques d’une
stationnaire étanchéité parfaite

Plaque Cuve

• Caractérisée par sa
• Polaire ou apolaire
force éluante

Phase
Phase Mobile
stationnaire
 A - La Plaque

• Support lisse, inerte, rigide ou souple (verre, plastique ou

aluminium) recouvert d’une couche fine et adhérente de
phase stationnaire.

• L’adhérence de la phase stationnaire sur le support est

assurée par un liant organique (amidon) ou minéral (sulfate
de calcium hydraté) ajouté dans des proportions de 1 à 15% à
la phase stationnaire en cours de fabrication.

• La plaque de CCM peut avoir différentes dimensions:

5 x 5 / 10 x 20 / 20 x 20
Figure 1: Plaque de CCM
 B - Les Phases Stationnaires

Les adsorbants traditionnellement utilisé en CCM sont :

• La silice,
• l’alumine,
• le Kieselguhr,
• la cellulose,
• le polyamide.

- Le gel de silice reste le plus utilisé en CCM classique.

- les couches minces utilisées actuellement font l’objet des
tableaux ci – après.
 Tableau I: Phases stationnaires non greffées

Type de phase Principe de Domaine

rétention d’application
Substances apolaires
Gel de Silice Adsorption
ou peu polaires
Adsorption
Gel d’alumine Partage Composés basiques
Terre siliceuse de
Adsorption
Diatomée Partage
Substances polaires
(Kieselguhr)
Molécules polaires
Cellulose Partage
(sucres, A.A)
Polyamide 6 ou 11 Partage Phénols, Flavonoïdes
Les phases stationnaires greffées sont également utilisées en CCM

Phases greffées peu Phases greffées

polaires ou apolaires polaires

Silice greffée C8 ou C18 Cyanopropyle

Aminopropyle
 C - Les Phases Mobiles

Choix de la phase mobile en CCM.

Selon les informations connues
du soluté :

Soluté connu par ses

Soluté déjà Substance
propriétés physico-
étudiée par CCM inconnue
chimiques

Utilisation de la PM
décrite dans la PM choisie selon la
PM de même série
littérature polarité du solvant
chimique.
scientifique ou
Pharmacopée
 D - Cuves ou enceintes de migrations

• Les cuves de développement sont des récipients en verre

quadrangulaires ou cylindriques d’une étanchéité parfaite.

• Pour que l’atmosphère de la cuve soit parfaitement saturée:

- On tapisse entièrement les parois de papier filtre et on

introduit les solvants pour que le papier en soit imprégné.
- On laisse la phase mobile dans la cuve pendant 24 heures
(phase de saturation).
Figure 2: Cuve de développement pour la CCM
IV- Mise en œuvre de la CCM
 La CCM est réalisée en 3 étapes:

 Dépôt de l’échantillon.
 Développement de la plaque ou migration.
 Révélation post-chromatographique.
1 - Dépôt de l’échantillon
• Selon la nature des produits, on prépare des solutions de 0.1 à 5 % dans un
solvant très volatil
• Sur la couche mince, on commence par tracer légèrement une ligne
horizontale à 1cm de son bord inférieur.
• On trace une autre ligne horizontale en grattant la PS pour stopper
l’évolution du solvant, située à environ 15 cm du bord inférieur.
• On dépose un petit volume (compris entre quelques nano litres et plusieurs
microlitres) de l'échantillon en solution diluée, à proximité du bord inférieur
de la plaque sous forme d'une tache de 1 à 3 mm de diamètre.
 Dépôt manuel par micro seringues Dépôt automatique par pulvérisation

Figure 4: Techniques de dépôt de l’échantillon

Le dépôt est réalisé soit manuellement, soit de manière automatique avec un
capillaire à extrémité plane.

Après l’application de l’échantillon, la plaque est séchée à l’air libre pendant

environ 10 min ou à l’aide d’un sèche-cheveux.
2 – Développement de la plaque
(Migration)
 • Processus au cours duquel l’échantillon est entraîné par la
phase mobile à travers la phase stationnaire.

Figure 5 : développement de la plaque dans la cuve de migration

- La Phase mobile migre par capillarité à travers la phase stationnaire
sèche, entraînant à des vitesse différentes les solutés à séparer.

- Durée de développement selon la nature des solvants (de 30 minutes

à 3 heures au maximum).

- Migration arrêtée lorsque le front du solvant a parcouru 10 à 15 cm.

 Techniques de développement

Développement linéaire Développement

(Vertical ou horizontal) bidimensionnel
 A – Développement linéaire

A.1. Développement vertical:

- La plaque est disposée verticalement dans la cuve
- La phase mobile monte traverse la phase stationnaire par capillarité

A.2. Développement horizontal:

- La plaque est disposée horizontalement

-La phase mobile arrive de deux côtés opposés de la plaque.
- Le processus de développement s’arrête lorsque les deux fronts se
rencontrent.
- Avantage: permet une occupation totale de la surface de la PS et
de doubler le nombre d’échantillons à analyser.
 B – Développement bidimensionnel

Si un développement linéaire ne permet pas de séparer les

constituants du mélange

 développement bidimensionnel : deux élutions successives

dans deux directions perpendiculaires.
Plaque de forme carrée
Permet de faire la CCM
bidimensionnelle

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Figure 6: Développement bidimensionnel en CCM
3 – Révélation post-chromatographique
La détection s’effectue sur la couche mince débarrassée du
solvant de développement.

Détection visuelle Révélation par les réactifs

 Détection visuelle

• Lumière blanche pour les substances colorées

• Lumière ultraviolette :
- Substances sont fluorescentes à l’examen de la plaque aux radiations
ultraviolettes → elles apparaissent brillantes sur fond sombre.
- Substances non fluorescentes → on introduit un indicateur fluorescent
lors de la préparation de la couche mince.
L’indicateur fluorescent est un sel inorganique (sulfure mixte de
zinc et de cadmium fluorescent à 254 nm.) ou organique
fluorescent généralement à 366 nm.

Les substances non fluorescentes masqueront la fluorescence de

la plaque et apparaîtront sous forme de taches sombres sur
fond lumineux.
Plaque CCM sous lampe UV
 Révélation par les réactifs

• Projection du réactif de révélation sous forme d’aérosol sur la plaque

séchée .

Réactifs généraux :
Acide sulfurique concentré.
Acide phosphorique.
Acide phosphomolybdique.
Bichromate de potassium en solution sulfurique.
Permanganate de potassium en solution sulfurique.
Vapeurs d’iode ( substances organiques sous forme de taches brunes)
Solution chloroformique d’iode à 0.5%
 Réactifs spécifiques :
Tableau II : Réactifs spécifiques de révélation et leurs applications

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V- Grandeurs de la CCM
Le résultat de la séparation par CCM est un chromatogramme.

Le facteur de Retardement « Rf » ( Retarding Factor) :

Pour un système chromatographique donné, un soluté peut être

caractérisé par un rapport appelé « facteur de retardement »
Rf exprimé par la relation :

Distance parcourue par le soluté a

Rf = =
Distance parcourue par le front du solvant b
Figure 7 : détermination du facteur de retardement
• Paramètres qui influencent Rf:

 Épaisseur de la phase stationnaire.

 Contenu en eau dans les phases mobiles et stationnaires.
 La température.
 Le degré de saturation par la vapeur de la phase mobile de l’enceinte de
développement.
 La taille de l’échantillon.

• Le contrôle total de ces conditions est difficile.

• On peut palier ce problème en utilisant le facteur de rétention relatif Rx

Département de Pharmacie 41
Laboratoire de Chimie Analytique
VI- Applications de la CCM
 A – Analyse qualitative

• Identification d’une substance inconnue: par comparaison de

son Rf à celui d’un standard élué sur le même

chromatogramme.

• Mise en évidence des impuretés de synthèse, des substances

apparentées et des produits de dégradation.

• Études de stabilité des médicaments aussi bien en

développement qu’en analyse de routine.

 B – Analyse quantitative

Densitomètrie
• Nécessite la quantification des tâches.

• La plaque à examiner est placée sous l’optique d’un densitomètre

qui mesure soit l’absorption soit la fluorescence à une ou
plusieurs longueurs d’ondes.

 Diagramme comportant des pics dont on peut mesurer les aires

Figure 8: Séparation de 3 stéroïdes en CCM sur phase de polarité inversée.
La distance de migration augmente avec la polarité du composé.
Le pseudochromatogramme a été obtenu par scannérisation de la plaque CCM.
Élution:
-Localisation des tâches (coloration, détection UV)
-Prélèvement ,par grattage, de la phase stationnaire au niveau
de chaque tâche.
-Elution des substances qui s’y trouvent pour dosage par une
méthode microchimique appropriée.
Remarque :
Du fait que l’adsorbant influe en général sur les mesures, on
détermine un blanc dans des conditions identiques et on le
retranche du résultat obtenu pour les échantillons.

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