Université de Monastir

ECOLE SUPERIEURE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

DE LA SANTE DE MONASTIR

Les Milieux de Culture en

Bactériologie
Niveau : 3ème année Biologie

Année Universitaire 2022-2023

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 Objectifs

 Citer les besoins nutritifs des bactéries

 Préciser l’intérêt des constituants d’un milieu de culture

 Détailler la préparation des milieux de culture

 Classer les milieux de culture selon leur composition de

base, leur consistance et leur pouvoir sélectif

 Détailler le principe des galeries miniaturisées

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 Plan
1. Besoins nutritifs des bactéries
2. Constituants d’un milieu de culture
3. Préparation des milieux de culture
3.1. Considérations générales
3.2. Cas particuliers
4. Contrôle de qualité des milieux de culture
5. Classification des milieux de culture
5.1. Selon la composition de base
5.2. Selon la consistance
5.3. Selon le pouvoir sélectif
6. Les micro-méthodes : galeries miniaturisées
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 1. Les besoins nutritifs des bactéries

Sont très variables en fonction des bactéries, mais certains

besoins de base sont communs :
 L’eau
 Les ions : principalement Mg2+ et phosphates
 L’azote et le soufre (forme minérale ou organique).
 Source de carbone : certaines bactéries de
l’environnement utilisent le CO2 atmosphérique. A partir de
ce dernier et d’éléments minéraux synthétisent tous leurs
composants. Ces bactéries sont dites autotrophes.
Les bactéries que l’on rencontre en pathologie sont des
bactéries hétérotrophes ( des bactéries ayant besoin d’un
apport de carbone sous forme organique, en général sous
forme de sucre).
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 1. Les besoins nutritifs des bactéries

 Les oligoéléments : fer en premier mais aussi CO2,Mn+

+
,Zn++

 Facteurs de croissance : certaines bactéries sont

capables d’effectuer toutes leurs synthèses avec les
éléments énumérées ci-dessus. D’autres restent
incapables de synthétiser certains constituants (par
exemple : un acide aminé ou un coenzyme). Ces
constituants doivent alors être présents dans le milieu de
culture pour permettre la croissance bactérienne.

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 2. Constituants d’un milieu de culture

 Un milieu de culture est une préparation au sein de

laquelle des micro-organismes peuvent se multiplier.

 Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du

micro-organisme étudié ce qui implique :

 Couvrir les besoins en ions minéraux, en facteurs de

croissance, apporter la source de carbone et d’énergie
 Présenter un pH voisin du pH optimal
 Présenter une force ionique optimale.

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 2. Constituants d’un milieu de culture

Ses principaux constituants sont :

 Extraits de viande et macérations : apportent principalement des
protéines peu dégradées, des glucides, des sels minéraux et des
vitamines hydrosolubles.
 Extraits de levures : commercialisés sous forme déshydratée. Ils sont
préparés à partir de levure de boulangerie. Ils sont utilisés comme source
d’acides aminés et de vitamines hydrosolubles.
 Peptones : sont des composés solubles dans l’eau qui proviennent de
l’action d’enzymes protéolytiques sur des matières protéiques. Ex :
peptone pepsique de viande (riche en soufre), peptone trypsique de
caséine (riche en tryptophane).
 Hydrolysats : peptones obtenus par une action inorganique (acide
chlorhydrique par exemple) sur des protéines.
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 2. Constituants d’un milieu de culture

 L’agar agar : c’est un extrait d’algues rouges..

 Produits biologiques : sang de mouton ou de cheval,

sérum de cheval ou de bœuf, liquide d’ascite, lait de vache,
pomme de terre…

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 3. Préparation des milieux

3.1. Considérations générales

 La plupart des milieux se présentent sous forme

déshydratée, ce qui assure une composition constante, un
stockage facile et une préparation simplifiée.

 Lors de la reconstitution des milieux, la poudre est mélangée

au volume d'eau préconisé, homogénéisée, puis dissoute
totalement par chauffage (l'ébullition ne doit pas dépasser 1 à
2 minutes).

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 3. Préparation des milieux

3.1. Considérations générales

 Après refroidissement à 50-60°C, le milieu est distribué dans

d'autres récipients en vue d’être stérilisé.

 La stérilisation se fait par autoclavage. Le temps et la

température peuvent varier d'un milieu à l'autre (tenir compte
également du conditionnement, de préférence des petits
volumes). En général, une stérilisation de 15-20 minutes à
120°C est préconisée.

10
 3. Préparation des milieux

3.1. Considérations générales

 Les milieux sont ensuite laissés refroidir jusqu’à 50°C dans

l'autoclave (ne pas les sortir avant car la différence de
températures provoquerait une dépression au sein des tubes).

 Ils peuvent ensuite être conservés tels quels après

refroidissement en position verticale, ou inclinés (en pente ou
pente et culot), ou distribués en boites de pétri.

11
 3. Préparation des milieux

3.2. Cas particuliers

 Certains milieux nécessitent l'adjonction de produits ne
supportant pas l'autoclavage (sang frais, jaune d'oeuf,
antibiotiques, compléments vitaminiques...).

 Ces compléments doivent alors être apportés stériles à la

gélose en surfusion. La stérilité des additifs est assurée soit
au moment du prélèvement, soit par filtration.

12
 3. Préparation des milieux

3.2. Cas particuliers

 Certains milieux nécessitent d’être régénérés avant

utilisation :

 Ils sont placés pendant 20 minutes dans un bain-marie

bouillant de sorte à chasser l'oxygène dissout (Ex : gélose VF,
milieu Hugh-Leifson ...).

13
 3. Préparation des milieux

3.2. Cas particuliers

 Les milieux qui doivent être ensemencés en profondeur :

 Ils sont préalablement liquéfiés au bain-marie, puis

maintenus en surfusion (45-50°C) en bain thermostaté
jusqu'à leur ensemencement.

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 4. Contrôle de qualité des milieux de
culture
 Tous les milieux à préparer ou les milieux vendus prêts à l’emploi
doivent faire l’objet d’un contrôle de qualité à l’aide de souches
bactériennes de collections internationales telles que :

 CIP : collection de l’institut pasteur

 ATCC : American Type Culture Collection

 On doit déterminer les caractéristiques suivantes :

 Capacité à produire des réactions biochimiques appropriées.

 Stérilité : incuber un tube ou une boîte de pétri de chaque lot de

milieu, passé à l’autoclave ou stérilisé au filtre, pendant une nuit à 35
ou 37°C et l’examiner pour détecter les contaminants.

 Capacité à permettre la croissance de l’organisme cible.

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 5. Classification des milieux de culture

 Il existe une grande variété de milieux de culture en rapport

avec la diversité des exigences nutritives des micro-
organismes.
 Ces milieux sont classés selon divers critères tels que :

 La composition de base

 La consistance

 Le pouvoir sélectif
16
5. 1. Selon la composition de base

5.1.1. Les milieux synthétiques

 Composition qualitative et quantitative exactement

connue.

 Surtout utilisés pour l’étude les besoins nutritifs d’un

germe ou pour l’étude des bactéries autotrophes chimio-
lithotrophes telles que les cyanobactéries.

 Rarement utilisés en routine à l’exception de quelques

uns : Citrate de Simmons, Urée-Tryptophane…
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Citrate de sodium 1,0 g

Bleu de bromothymol 0,08 g

Chlorure de sodium 5,0 g

Sulfate de magnésium 0,2 g

Hydrogénophosphate de
1,0 g
potassium

Dihydrogénophosphate
1,0 g
d'ammonium

Agar-agar 15,0 g

PH 6,9

18
5. 1. Selon la composition de base

5.1.2. Les milieux empiriques

 Composition connue seulement avec approximation car

dépendant des matières premières utilisées : extrait de
viande ou de levure, peptones, sucres et éventuellement
liquides biologiques (sérum, sang…), mais qui conviennent
aux micro-organismes étudiés.

 Ce sont les milieux les plus employés aujourd’hui.

 Exemple : Columbia, Trypticase soja, Chocolat, …

19
 5.2. Selon la consistance

5.2.1. Milieux liquides

 Les micro-organismes s’y développent parfaitement.

20
 5.2. Selon la consistance
5.2.2. Milieux solides
 Nécessaires pour l’isolement bactérien (séparer les
différents germes présents dans un prélèvement).
 Obtenus en ajoutant un agent gélifiant à un milieu liquide.
 Gélifiant +++ : agar-agar ou gélose :
o Un polygalactoside sulfaté présentant la propriété de
former avec l’eau un gel solide à une température < 60°C
o Liquéfiable par ébullition, auquel cas, il reste en surfusion
(liquide) jusqu’à 45°C.
o Très peu de micro-organismes sont capables d’hydrolyser
l’agar.
 Teneur en gélose assez élevée (15 g/L).
 Coulés en boîte de pétri ou en tube.

21
 5.2. Selon la consistance

5.2.3. Géloses molles ou semi-solides

 Peu gélosées (3 à 5 g/L)
 Consistance intermédiaire.

22
 5.3. Selon le pouvoir sélectif

5.3.1. Milieux non sélectifs

 Ne contiennent aucune substance inhibitrice de la

croissance bactérienne.

 Permettent l’isolement de tous les micro-oganismes

présents dans l’échantillon ensemencé et susceptibles de
pousser dans les conditions d’incubation utilisées.

23
 5.3. Selon leur pouvoir sélectif

5.3.1. Milieux non sélectifs

 Sont plus ou moins enrichis en incorporant à un milieu de

base adéquat des liquides ou des suspensions riches en
molécules organiques diverses (sang, sérum, liquide d’ascite,
extrait globulaire, des suppléments vitaminiques,…).

 Selon leur degré d’enrichissemnt, ces milieux permettent

la croissance des bactéries plus ou moins exigeantes. Par
ailleurs, des fois, ils permettent la mise en évidence de
certains caractères utiles pour l’identification de certaines
bactéries.

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 Exemples de milieux non sélectifs

 Milieux « usuels »
 Gélose nutritive
 Gélose Columbia
 Trypticase-soja
 Milieux « usuels » additionnés de glucide
et d’indicateur de pH afin d’orienter le
diagnostic
 Gélose lactosée au BCP (porpre de bromocrésol)
 Milieu CLED (Cystine Lactose Electrolyte Déficient),
…
25
26
 Exemples de milieux non sélectifs
 Les géloses au sang frais (GS) et chocolat
(GC)

 Le sang peut être d’origines diverses : cheval, mouton,

lapin, homme, bœuf (attention! certains germes
présentent un type d’hémolyse sur un sang et un autre
type d’hémolyse avec un autre sang).
 Le sang est à ajouter à raison de 5 à 10% au milieu de
base (Columbia, Trypticase soja, Mueller Hinton, cœur
cervelle). Celui-ci ne doit pas contenir de glucose, car il
inhibe les hémolysines.

27
 Exemples de milieux non sélectifs
 Les géloses au sang frais (GS) et chocolat
(GC)
L’addition de sang au milieu de base peut avoir plusieurs
buts :
• Apporter des facteurs de croissance nécessaires au
micro-organisme étudié
• Neutraliser certains inhibiteurs contenus dans les
peptones des milieux
• Neutraliser, du fait de l’action peroxydasique et
catalasique de l’hémoglobine, des ions superoxydes ou
des peroxydes toxiques produits par le micro-organisme
(intéressant en particulier pour les bactéries à catalase
négative comme les Streptococcaceae)

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 Exemples de milieux non sélectifs
 Les géloses au sang frais (GS) et chocolat
(GC)
Permettent la lecture d’un caractère important lors de la
détermination du germe : l’hémolyse qu'effectuent
certaines bactéries.
• Les bactéries capables de détruire complètement les
globules rouges (ce qu'on appelle une hémolyse bêta)
formeront des colonies entourées d'une zone claire
facilement visible sur la gélose rouge ;
• Si l'hémolyse est incomplète (hémolyse alpha), la zone
d'hémolyse sera moins claire et verdâtre.

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Gélose au sang Gélose chocolat

30
Types d’hémolyse

• Alpha (α) : hémolyse

incomplète (partielle)

• Zone verdâtre autour de

la colonie

31
 Types d’hémolyse

• Bêta (β) : hémolyse

complète

• Zone transparente
autour de la colonie

 Gamma (γ) : absence d’hémolyse

32
 Exemples de milieux non sélectifs

 Les milieux d’enrichissement non sélectifs

Sont liquides et favorisent une croissance bactérienne à

partir des prélèvements pauci-microbiens. Ces milieux
permettent le développement d’un maximum de bactéries.

Exemples :

 Bouillon nutritif
 Milieu Schaedler
 Milieu cœur-cervelle

33
 Exemples de milieux non sélectifs

 Milieux chromogènes

 Sont utilisés dans le diagnostic des infections urinaires.

Ils contiennent à partir d’une gélose de base des mélanges
chromogènes permettant de détecter des enzymes
produites par les bactéries comme des bêta glucosidases,
des bêta D-galactosidases.
 Chaque espèce ou groupe d’espèce pousse sous forme
de colonie de couleur spécifique.

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 Exemples de milieux non sélectifs

 La gélose Mueller Hinton

 Est de composition, de pH et d’épaisseur standards.
 Elle est recommandée par le comité de l’antibiogramme
de la société de la société francaise de Microbiologie (CA-
SFM) pour tester la sensibilité des bactéries aux
antibiotiques.

35
 5.3.2. Les milieux sélectifs

 Contiennent des substances inhibitrices (minérales,

colorantes ou antibiotiques).
 Sont utilisés pour l’isolement, parmi un mélange
polymicrobien, des espèces bactériennes résistantes à ces
inhibiteurs.
 Ces milieux sont plus ou moins enrichis et permettent pour
certains d’entre eux la mis en évidence d’un ou de plusieurs
caractères biochimiques aidant à une identification plus
rapide des germes.

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 Gélose de Chapman – milieu sélectif
 Composition
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptones, extrait
de viande
 Autres molécules carbonées : mannitol
 Inhibiteur : NaCl à 75g/L
 Indicateur de pH : rouge de phénol
 Ions minéraux : NaCl
 Agar
 Eau

 Caractéristiques
 Permet la croissance des bactéries halophiles.
Permet l’étude de l’attaque du mannitol (si baisse du pH, alors teinte
jaune)

 Usage
 Isolement de Staphylococcus aureus.

 Lecture
 Si Staphylococcus aureus : colonie jaunes (Mannitol +). Les autres
colonies sont Mannitol -. 37
Gélose de Chapman – milieu sélectif

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 Drigalski – milieu sélectif
 Composition
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptones,
extraits de viande et levure
 Glucide et dérivés : lactose
 Inhibiteurs : cristal violet, désoxycholate de sodium
 Indicateurs de pH : bleu de bromothymol
 Ions minéraux : thiosulfate de sodium
 Agar
 Eau
 Caractéristiques
 Cristal violet : inhibe les bactéries Gram +
 Désoxycholate de sodium : inhibe les bactéries Gram +
 Sélectionne les bactéries Gram –
 Usage
 Isolement des entérobactéries.
 Lecture
 Bactéries lactose + : colonies jaunes (utilisation du lactose)
 Bactéries lactose - : colonies bleu-vert
39
Drigalski – milieu sélectif

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 Hektoen – milieu sélectif
 Composition
 Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptones,
extraits de levure
 Glucide et dérivés : salicine, lactose, saccharose
 Indicateurs S2- : citrate de fer
 Inhibiteurs : sels biliaires
 Indicateurs de pH : bleu de bromothymol, fuschine acide
 Ions minéraux : thiosulfate de sodium, NaCl
 Agar
 Eau

 Caractéristiques
 Sels biliaires : limitent le développement des Gram +
 Fuschine : vire au rose s’il y a production d’aldéhyde.
 Favorise Salmonelle et Shigella du fait des peptones.
 Mise en évidence de la production d’H2S

 Usage
 Isolement des entérobactéries pathogènes : principalement
pour vérifier la présence de Shigella et Salmonella.
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 Lecture
 Aspect des colonies :

 Interprétation
 Saumon : Escherichia, Levinea, Citrobacter, Klebsiella,
Enterobacter, Serratia, Yersinia.
 Saumon et centre noir : Proteus vulgaris.
 Bleu-vert : suspicion de Shigella ou Salmonella.
 Bleu-vert et centre noir : suspicion de Salmonella. 42
43
 Remarque : Les milieux d’enrichissement

 La présence de certaines bactéries à pouvoir pathogène

spécifique dans un prélèvement, a une signification
pathologique indiscutable. C’est le cas par exemple des
Salmonella dans les selles.
 Quelques fois, leur proportion peut être minime par rapport
à celle de la flore commensale et leur présence ne peut être
révélée par un isolement (sélectif).
 C’est pourquoi un enrichissement est mis en route en
même temps que l’isolement (sélectif).

Enrichir, c’est augmenter la représentation (proportion) d’un

sous-groupe de micro-organismes dans un ensemble plus
vaste.
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 Remarque : Les milieux d’enrichissement

Un milieu d’enrichissement sélectif réunit deux

caractéristiques :
 Il contient des molécules à action sélective inhibant
totalement ou partiellement la culture des micro-organismes
non recherchés ;

 Il est généralement liquide (bouillon) afin que son action

sélective s’exerce sur une population importante et homogène.

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 5. Les micro-méthodes : galeries miniaturisées

 Avec la multiplication des analyses bactériologiques, se

sont développés des systèmes permettant d'associer rapidité,
reproductibilité et faible coût : les macro-galeries classiques
ont été progressivement miniaturisées.

 Exemples : Galeries API.

 C’est un assemblage de cupules contenant des substrats

déshydratés qui sont régénérés avec la suspension de la
bactérie à étudier.

 Ces dispositifs nécessitent de travailler en conditions

standardisées : densité et quantité de l'inoculum, atmosphère
d'incubation ...

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5. Les micro-méthodes : galeries miniaturisées

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