Activite Des Endonucleases de Type II SUR L'ADN
Activite Des Endonucleases de Type II SUR L'ADN
Activite Des Endonucleases de Type II SUR L'ADN
RECHERCHES MEDICALES DE
FRANCEVILLE
Mémoire de Master 1
Parcours : Biochimie biologie moléculaire et cellulaire
Activité des endonucléases de type II SUR L’ADN extrait par des méthodes
non organiques en comparaison à l'ADN extrait par phénol/chloroforme.
INTRODUCTION
I-OBJECTIFS
II-MATERIEL ET METHODES
III-RESULTATS
IV-DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSEPECTIVES
INTRODUCTION
ADN
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Figure 1 : La double hélice :modèle rubans (Housset and Raisonnier 2006)
2
Méthodes d’extraction
3
Enzymes de restriction
Les méthodes d’extraction de l’ADN ont été évaluer sur la base de plusieurs
paramètres (Rendement , pureté et le temps de purification requis, les risques ,les
bénéfices, coût...)
4
I-OBJECTIFS
Objectifs généraux
Objectifs spécifiques
• Définir des méthodes simples mais efficaces d’extraction de l’ADN pour les laboratoires très
peu équipés (pays du Sud);
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II-MATERIEL ET METHODES
II-1.MATERIEL
matériel de laboratoire:
6
matériel biologique: sang total prélever à l’URAM (Unité de Recherche et
d’Analyse Médical) au cirmf.
7
Dispositif pour la révélation de l’ADN
Dispositif pour la quantification de l’ADN
Dispositif pour la pureté de l ’ADN
Figure 5:electrophorèse
8
II-2.METHODES
Isolement des PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell.)
Centrifugation et
Dilution Ecoulement
récupération de
Prélèvement du sang de 7ml de
la phase
du sang de moitié sang dilué
blanchâtre
au PBS sur du ficoll
(3ml)
Phase contenant
les PBMC
Extraction au Tris-EDTA
Extraction phénol/chloroforme
10
Préparation des échantillons pour Qubit 2.0
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Activité des endonucléases exemple
de EcoRI
Préparation des échantillons:
• 10XBuffer
• 1µl d’enzyme
• H2O
Figure10:Endonucléase de types II
Calcule du rendement en ADN
Rendement (µg)= concentration de l’ADN (µg/ µl) x Volume total d’ADN extraits (µl)
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III-RESULTATS
13
Figure11: Révélation des bandes d’ADN après électrophorèse sur
gel d’agarose à 0,8%.
14
Tableau 1: Différentes concentrations des ADN en ng/µl
Méthodes d’extraction Passage 1 Passage 2 Passage 3 Moyenne
S01 - - - 0
S02 - - - 0
PC1 ˃600 ˃600 ˃600 600
PC2 560 ˃600 ˃600 586,67
M1 238 272 266 258,67
M2 97,5 117 103 105,83
TE1 79 153 142 124,67
TE2 29,4 49,2 55,5 44,7
S1 7,17 9,42 7,99 8,19
S2 253 285 274 270,67
C1 19,2 22,6 20,5 20,77
C2 97,7 111 106 104,9
Q1 26,1 23,9 6,36 18,78
Q2 280 313 300 297,67 15
Tableau 2:Rendement de l’ADN par le Qubit 2.0
T2 202x65 13130 µg
S1 -8,1x65 -526,5 µg
S2 -1,7x65 -110,5 µg
C1 -2,0x100 -200 µg
C2 -3,8x100 -380 µg
Q1 0,2x200 40µg
Q2 10,4x200 2080 µg
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Figure 12: Digestion totale et partielle des ADN
PM2
Digestion-
partielle
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IV-DISCUSSION
• Au cours de cette étude, on a revisiter six méthodes d’extraction de l’ADN.
Protocoles d’extraction:
• Les méthodes au CTAB et au salting-out sont fiables avec de bon ratio A260/A280 .
(Rathanyaka 2011) ce qui corrobore avec l’analyse de Siew Lee Fong al., en 2009 la méthode
saline est plus efficace que celle des kits commerciaux d’extraction de l’ADN.
• Les coûts sont moindres par rapport à ceux du phénol /chloroforme ou des kits (Ameziane N. et
al.,2006).
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• La méthodes au phénol/chloroforme est dite de référence
• la rentabilité de cette méthodes standard s’appuie sur l ’étude mené par Djurkin
Kušec, I. et al.(2015)
• Phénol/chloroforme est bien plus rentable, que les Kits commerciaux est une bonne
alternative.
Digestion enzymatique:
• L’efficacité de la digestion totale (2H) a été bien apprécié sur tous les échantillons
comparé à la digestion partielle (1H) (Nathans et Smith, 1975).
• Meselson et Yuan (1968) décrivent un protocole sur la digestion de l’ADN par les
enzymes issus de E.coli comparable à notre étude .
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CONCLUSION
• Un criblage de toutes les méthodes d’extraction de l’ADN a été effectué.
• le temps est un facteur déterminant par exemple dans la mise en place des examens
cliniques.
• Les laboratoires du sud doivent adopter des méthodes simples et peu couteuses pour la
mise en place des diagnostiques de masse (détection de la microfilaire loa loa).
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PERSPECTIVES
• Mettre en place des diagnostiques médicaux de masse dans les laboratoires très
peu équipés ,une fois que l’intégrité de l’ADN a été vérifiée.
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MERCIE POUR VOTRE ATTENTION