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clonage moléculaire et
pluricellulaire Plasmide Bactériophage Cosmide
• Un cosmide est un plasmide (avec son origine de
réplication, ses gènes de sélection et son site de polyclonage) dans lequel on a inséré les séquences cos nécessaires à l'encapsidation dans des particules de bactériophage X. Phagemide ou phasmid • Les phagemides sont des molécules hybrides entre un plasmide et un phage. • Ce sont des molécules d'ADN bicaténaires, circulaires. • Ils possèdent une origine de réplication, au moins un gène de résistance à un antibiotique, un site de polyclonage. • Et une séquence provenant du phage Ml 3 contenant l'origine de réplication qui permet d'obtenir la forme monocaténaire. Les YACs • Yeast Artificial Chromosome ou chromosome artificiel de Levure, Saccharomyces cerevisiae: sont des vecteurs construits à partir de séquences d'ADN chromosomique de Levure. • Ils possèdent une origine de réplication (ARS, Autonomous Replicating Séquence). • Plusieurs gènes de sélection codent pour des enzymes permettant de sélectionner les Levures ayant incorporé un vecteur viable. • Un site de clonage unique, situé dans le gène SUP42 , permet l'introduction d'ADN étranger ainsi que • la sélection des vecteurs recombinants • D'autres vecteurs permettent également le clonage de grands fragments d'ADN : les Bacterial Artificial Chromosome (BAC) ou les Pl-derived Artificial Chromosome (PAC). Transformation des bactéries • Afin de faciliter la pénétration des molécules d'ADN au travers de la paroi et de la membrane plasmique, les bactéries en phase exponentielle de croissance sont fragilisées (comme p. ex. par un traitement au chlorure de calcium à 4 °C). • Ces bactéries ainsi préparées, appelées bactéries compétentes. • Ils sont mises en contact avec la solution de plasmides à intégrer. Puis la membrane plasmique est momentanément rendue perméable soit par un choc thermique, soit par un choc électrique transgénèse • Le terme de transgénèse qui représente l'intégration et l'expression d'un gène étranger dans le génome d'un organisme donné.
• La transgénèse comprend deux opérations distinctes :
l’addition et le remplacement de gène.
• La première est très largement pratiquée chez plusieurs
espèces, la seconde commences seulement à être mise en œuvre chez des espèces autres que la souris.
• Il faut bien définir le LCR (locus control region).
Les étapes de la transgénèse
• Etape 1 : Identifier, isoler, intégrer et multiplier
un gène d'intérêt
• Etape 2 : Transférer le gène
• Etape 3 : Régénérer et évaluer les organismes
transformées • L’addition et le remplacement de gène sont des techniques laborieuses mais standardisées chez la souris et les plantes. • Il n’en est pas de même pour d’autres espèces, notamment pour les oiseaux et les gros mammifères. • Malgré ses imperfections, la transgénèse a été largement adoptée par les expérimentateurs ainsi que par certains industriels. • Environ 1 000 gènes ont été modifiés par recombinaison homologue chez la souris • La première protéine recombinante issue du lait a été mis sur le marché en 2000. • Plusieurs dizaines de plantes transgéniques destinées à la consommation humaine sont sur le marché ou en cours d’expérimentation. • Des animaux transgéniques sont également prêts à être proposés aux consommateurs. Les techniques de transfert de gène 1. Le transfert de gène dans les gamètes 2. Le transfert de gène dans les embryons au stade une cellule 3. Le transfert de gène par l’intermédiaire de cellules 4. Le transfert de gène dans les organites cellulaires 5. Le transfert de gène à l’aide de vecteurs épisomiques 1. Le transfert de gène dans les gamètes
• C’est une microinjection de gène dans les
ovocytes des animaux.
• L’introduction d’une particule rétrovirale
recombinante recouverte de l’enveloppe du VSV (vesicular somatitis virus) entre la zone pellucide et la membrane de l’ovocyte. conduit au transfert et à l’intégration des gènes du vecteur • L’enveloppe du virus VSV permet une haute efficacité d’infection, et l’intégration est facilitée par l’absence de membrane nucléaire de l’ovocyte au moment choisi pour réaliser l’infection.
• cette technique est actuellement appliquée à la vache
seulement.
• La mise en contact direct des spermatozoïdes avec des
solutions d’ADN suivie d’une fécondation in vitro ou in vivo, n’a conduit qu’à l’obtention d’un très petit nombre d’animaux transgéniques:
• Plusieurs invertébrés marins, des poissons, des poulets et un
porc transgéniques ont pu être obtenus de cette manière. 2. Le transfert de gène dans les embryons au stade une cellule
• Cette technique perd très nettement de son
efficacité chez les gros mammifères du faible taux d’intégration de l’ADN étranger.
• Pour contourner ces difficultés, les embryons
peuvent être obtenus après maturation des ovocytes et fécondation in vitro. Après microinjection, les embryons sont cultivés jusqu’au stade blastocyste. 3. Le transfert de gène par l’intermédiaire de cellules • Les cellules dans lesquelles on a transféré des gènes peuvent être un intermédiaire intéressant pour engendrer des organismes transgéniques.
• La formation de chimères à partir de cellules
multipotentes: blastocyste (cellules ES) ou des cellules primordiales germinales d’un foetus (cellules EG). • Ces cellules sont considérées comme multipotentes si elles peuvent coloniser une morula ou un blastocyste après y avoir été introduites par microinjection.
• L’obtention de clones à partir de cellules
différenciées: plus simple consiste, en principe, à recréer un embryon et un organisme entier à partir d’une cellule plus ou moins différenciée. • Le transfert de gènes est le plus souvent réalisé par biolistique. Ce procédé consiste à projeter à haute vitesse des microbilles métalliques enrobées d’ADN.
• Ces projectiles traversent la paroi cellulosique
et la membrane plasmique et délivrent ainsi leur ADN dans la cellule 4. Le transfert de gène dans les organites cellulaires
• Deux organites cellulaires, les mitochondries chez
les animaux et les chlorophastes chez les plantes sont des cibles pour le transfert de gène.
• Des fragments d’ADN étranger peuvent être
transférés dans des mitochondries isolées, et les mitochondries peuvent être introduites par microinjection dans des cellules hôtes. • L’ADN étranger peut être introduit par biolistique ou par un système particulier de microinjection. 5. Le transfert de gène à l’aide de vecteurs épisomiques
• Les vecteurs capables de se répliquer de
manière indépendante du génome principale par: des plasmides, des phages, des cosmides, des BAC et de YAC. LE CLONAGE DES ANIMAUX • Le clonage est par définition la reproduction d'organismes génétiquement identiques. Ceci implique en pratique un mode de reproduction non sexuée. • Le clonage est le mode naturel de reproduction chez des organismes unicellulaires (bactéries, levures). • Chez les organismes pluricellulaires, le clonage implique un phénomène de dé-différenciation. • La dé-différenciation est donc la capacité pour une cellule appartenant à un tissu donné de donner naissance par division cellulaire à des cellules filles capables de produire toutes les fonctions cellulaires. 02 techniques de clonage des animaux:
• Le clonage par clivage d'embryon
• Le clonage par transfert de noyau 1. Le clonage par clivage d'embryon
• Les cellules de l'embryon très précoce sont
considérées comme totipotentes.
• Les embryons de mammifère jusqu'au stade
blastocyste peuvent être mécaniquement clivés. Les deux moitiés d'embryon peuvent dans certaines conditions se développer et donner à des jumeaux vrais. 2. Le clonage par transfert de noyau • Après la fécondation, le noyau du spermatozoïde, dans lequel aucun ou très peu de gènes sont actifs. • Quelques heures ou jours après, les gènes provenant du spermatozoïde sont activés pour permettre le développement de l'embryon. • Le cytoplasme de l'ovocyte doit donc posséder les éléments qui permettent la programmation du génome du spermatozoïde. Le principe du clonage est d'utiliser cette propriété du cytoplasme de l'ovocyte pour ré- activer les gènes de la différenciation à partir de n'importe quel type de noyaux, notamment ceux des cellules somatiques TRANSFORMATION GÉNÉTIQUE DES VÉGÉTAUX PAR AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
• Agrobacterium tumefaciens est une bactérie
tellurique responsable de la galle du collet ou crown gall (zone de liaison entre la racine et la tige).
• Une maladie des plantes dicotylédones, qui se
traduit par une division anarchique des cellules au point d'infection et le développement d'une tumeur végétale. • Lors du processus d'infection, des mécanismes moléculaires complexes mènent à l'intégration de façon stable d'un fragment d'ADN –plasmide- d'origine bactérienne dans le génome de la plante.
• A. tumefaciens possède un grand plasmide, le
plasmide Ti (pour Tumour inducing), qui porte une part importante des informations nécessaires au transfert d'ADN bactérien dans le génome de la plante hôte. • La région T, présente sur ce plasmide Ti, correspond à la séquence d'ADN qui sera transférée dans le génome végétal sous le nom d'ADN-T.
• Cette région est délimitée par 2 répétitions
directes de 25 paires de bases, les bordures. Entre ces bordures sont localisés : (i) les gènes induisant le développement de la tumeur (oncogènes), dont l'expression entraîne des déséquilibres dans la balance hormonale des cellules transformées (ii) les gènes qui dirigent la synthèse des opines, acides aminés liés à un sucre utilisables par la bactérie et non par la plante La région vir porte une série de gènes de virulence qui codent pour des protéines intervenant dans les mécanismes de transfert de l'ADN-T dans la cellule végétale (sous forme simple brin). • Ainsi, l'interaction entre A. tumefaciens et la plante hôte constitue un mécanisme naturel de transfert d'ADN chez les plantes. Ce mécanisme a été modifié pour devenir un outil versatile de transformation génétique.