Dcoupage de lADN par

enzymes de Restriction

Prsenter par:

Nouar Oussama
Hadji Rabah

Encadreur:
Pr.Rahmouni
 Sommaire:
I. Introduction
II. Dfinition
III. Rle biologique
IV. les types denzymes de restriction
V. Nomenclature
VI. Diffrentes extrmits sont gnres
VII.Isoschizomre
VIII.lectrophorse sur gel d'agarose
 I. Introduction :
Lorsquun bactriophage infecte une bactrie, il lui
injecte son ADN. Sans systme de dfense adapt, de
nombreux bactriophages seront alors produits dans la
bactrie qui sera finalement lyse.
De manire rsister cette infection la bactrie
synthtise des enzymes de restriction qui vont fragmenter
lADN viral tranger.
Paralllement, la bactrie possde des mthylases capables
de modifier (mthyler) son propre ADN afin quil ne soit
pas reconnu par les enzymes de restriction.
 Aujourdhui plusieurs centaines denzymes de
restriction diffrentes sont disponibles
commercialement.
Elles font parties des outils (ciseaux
molculaires) indispensables aux biologistes
molculaires.
Ces outils permettent de couper lADN afin
disoler certains fragments, de construire des
cartes gntiques (cartes de restriction), de
crer de nouvelles combinaisons dADN, etc.
Les enzymes de restrictions ont permis
lavnement de la biologie molculaire.
 II. Dfinition :
Les enzymes de restriction sont des protines qui coupent lADN en
des sites spcifiques.
Les enzymes de restriction, galement connues sous le nom
d'endonuclases de restriction, reconnaissent les squences
spcifiques de paires de bases dADN et coupent ou sparent
chimiquement lADN au niveau des arrangements spcifiques de
paires de bases.
Elles ont tout dabord t identifies et isoles sur des bactries qui
les utilisent en tant que mcanisme de dfense naturelle pour couper
lADN intrus des bactriophages virus qui infectent les bactries.
Tout ADN tranger rencontrant une enzyme de restriction sera digr
ou coup en de nombreux fragments, et rendu in efficace.
Ces enzymes dans les bactries constituent le premier systme
immunitaire biologique.
Il y a des milliers denzymes de restriction, chacune est appele
daprs le nom de la bactrie dont elle est isole.
 III. Rle biologique:
Les enzymes de restriction produites par des bactries
constituent un mcanisme de dfense contre les infections
par les bactriophages, des virus spcifiques des bactries.
Lorsque le virus injecte son ADN dans la bactrie, celui-ci
est coup par l'enzyme de restriction au niveau des sites
spcifiques.
La destruction du gnome du virus bloque ainsi l'infection.
Le nom d'enzyme de restriction provient de ce
mcanisme : la prsence de ces enzymes dans les
bactries restreint l'infectiosit des bactriophages.
 Pour viter que l'enzyme de restriction ne coupe
l'ADN de son propre gnome, la bactrie fabrique
aussi une deuxime enzyme appele mthylase, qui
reconnat galement le site de restriction.
La mthylase ne coupe pas l'ADN, mais le modifie
en lui rajoutant un groupement mthyle sur un ou
plusieurs nuclotides du site. Cette mthylation
empche la coupure par l'enzyme de restriction.
Ce mcanisme de dfense, appel systme de
restriction/modification, associe systmatiquement
ces deux enzymes, l'une de coupure et l'autre de
protection.
 IV. Les types denzymes de restriction:
Les enzymes de type I et de type III reconnaissent une
squence d'ADN spcifique et coupent en un endroit
alatoire, d'une distance d'environ 1 000 paires de bases
(pb) pour le type I et de 25 pb pour le type III plus loin
que le site de restriction. Ces 2 types ont galement une
activit mthylnique en plus de leur activit
endonuclasique, ce qui les diffrencie du type II.
Les enzymes de type II, les plus utilises, reconnaissent
une squence spcifique et coupent en un endroit
spcifique de cette squence. Quelques exemples de ces
enzymes figurent ci-dessous.
De manire gnrale, les enzymes de restriction sont
bloques par le monoazide d'thidium.
Exemples d'enzymes de type II:
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore
S.p.A. Copyright 2006
 V. Nomenclature :
La nomenclature des enzymes de Leur nom
comporte 3 ou 4 lettres correspondant entre
autres la bactrie partir de laquelle on a
extrait cette enzyme:

La premire lettre est en majuscule cela

correspond la premire lettre du genre de
la bactrie.
La seconde et troisime lettre sont en minuscule
et correspondent aux deux premires lettres
de l'espce bactrienne
La quatrime lettre correspond la souche bactrienne, elle est crite en
majuscule mais n'est pas prsente dans toutes les enzymes de restriction.
Enfin un chiffre romain donne le numro d'ordre de caractrisation de l'enzyme.
VI. Diffrentes extrmits sont gnres :
Enzymes de restriction EcoRI

5-G A A T T C-3
Extrmits 5 Cohsives
3-C T T A A G-5
 denzymes de restriction :
SmaI

5-C C C G G G-3
Extrmits franches
3-G G G C C C-5
 denzymes de restriction :
PstI

5-C T G C A G-3
Extrmits 3 Cohsives
3-G A C G T C-5
 VII. Isoschizomre:
Dans certains cas,
deux ou plusieurs
enzymes diffrentes
BglII 5 A-G-A-T-C-T peuvent reconnatre
T-C-T-A-G-A 5 des sites identiques

Sau3A 5 G-A-T-C
Toutes ces extrmits
C-T-A-G 5 collantes sont compatibles

BamHI 5 G-G-A-T-C-C
C-C-T-A-G-G 5
VIII. lectrophorse sur gel d'agarose
L'lectrophorse sur gel d'agarose est une mthode
utilise en biochimie et en biologie molculaire pour
sparer l'ADN, l'ARN ou des protines en fonction de
leur poids molculaire.
La technique de l'lectrophorse sur gel d'agarose
est base sur la sparation des acides
nucliques chargs ngativement sous l'effet
d'un champ lectrique. Cette sparation s'effectue
travers la matrice du gel d'agarose : les molcules de
plus petites tailles se dplacent plus rapidement et
migreront plus loin que les molcules de tailles
suprieures
Cartes de restriction des plasmides
pUC19 et pUC19-TIF1
L'lectrophorse sur gel d'agarose
 Conclusion :
Elles sont trs utilis en biologie molculaire pour extraire ou
recombiner des morceaux d'ADN lors de clonages.
les enzymes de restriction sont utilises Pour couper(rduire) l'ADN
dans des fragments, qui est ncessaire pour la recombinaison d'ADN
et l'lectrophorse.
La recombinaison d'ADN dans ce laboratoire a utilis des enzymes de
restriction Pour insrer ampicilline rsistant des gnes dans des
cellules bactriennes usine plasmide bactrien, qui prend les gnes.
L'lectrophorse d'ADN est utilise dtermine le site du fragment
qui Est coup(rduit) d'enzymes de restriction.
Enzymes de restriction seulement coupe(diminution) et leurs sites de
reconnaissance de protine spcifiques.