Universit des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene

Facult des Sciences Biologiques

SNV L2
2015 - 2016

Travaux pratiques de
Microbiologie gnrale

Prpar par: Dr. BEDDOU F.

But des TP de Microbiologie:

Se familiariser avec le monde microbien;

Acqurir les techniques utilises (strilisation, prparation des
milieux de culture, identification des micro-organismes).
Dfinitions:

Microbiologie = cest la science qui tudie les tres vivants de petite taille
(du grec "mikros" = petit, "bius" = vie, "logos" = science), en particulier: les
bactries, les protozoaires, les champignons et les algues.

Microorganismes (ou germes) = tres vivants microscopiques (une taille trs

petite, invisible lil nu, sa dimension se mesure en m), unicellulaires (une
cellule unique constitue un organisme autonome: bactries, levures, certaines
algues unicellulaires) ou pluricellulaires (plusieurs cellules identiques:
champignons et certaines algues pluricellulaires), rpartis dans les 3 domaines
du vivant: Bactries, Arches et Eucaryotes.
Rgles suivre au laboratoire de microbiologie:
1. Les fentres et les portes des zones de travail doivent tre fermes
pendant le travail;
2. viter de porter ses doigts ou tout objet sa bouche. Ne pas manger ou
fumer au laboratoire;
3. Le port dune blouse est de rigueur. Elle devra toujours tre propre et
autant que possible, n'tre utilis qu'au laboratoire de microbiologie;
4. Ne jamais oublier de se laver les mains avant et aprs chaque sance de
laboratoire;
5. Les zones de travail doivent tre parfaitement propres et en ordre. Les
postes de travail doivent tre dsinfects selon le concept dhygine
avant et aprs leur utilisation. Les paillasses ne doivent comporter que
les appareils et le matriel effectivement employs.
6. L'tudiant(e) aux cheveux longs verra les attacher surtout lors d'un
travail exigeant l'emploi d'un bec gaz.
7. Les instruments de travail contamins ne seront dposs sur la table
qu'aprs avoir t striliss par un flambage adquat;
8. Aviser immdiatement le professeur de tout accident (bris de verre,
blessures, etc.).
9. viter de laisser les becs allums inutilement afin de conserver une
temprature ambiante confortable.
10. Pendant les travaux pratiques, viter de parler, notamment lorsque des
ensemencements sont faits; viter galement de se dplacer inutilement.
11. tiqueter soigneusement les cultures avant de les porter l'tuve.
Matriel utilis en microbiologie:
1. Poste de travail:

Bec bnsen: Sa flamme bleue procure une zone circulaire strile de 20 30 cm

de diamtre dans laquelle toutes les manipulations doivent seffectuer. La flamme
est galement utilise pour striliser les instruments.

Une flamme bleue est une flamme chauffante, non clairante, non bruyante. C'est
son extrmit que la flamme est la plus chaude (jusqu' 1 500C).
2. Les instruments densemencement:

Pipettes pasteurs

Etaleur ou rteau

Anse de platine

Ecouvillon
3. La verrerie:

Eprouvette Erlenmeyer Bcher Fiole jauge Entonnoir Pipette gradue

Flacons Tubes essais Boites de Ptri

4. Le matriel lourd utilis:

Bain-marie Agitateur magntique

Vortex Rfrigrateur Autoclave
plaque chauffante

pH mtre Balance de prcision Etuve ou incubateur Microscope

Techniques de strilisation et de dsinfection:
A voir
Dfinitions:

. Strilisation:
Procd permettant la destruction totale des microorganismes (virus, bactries,
champignons, parasites), quils soient sous leur forme vgtative ou sporule.
. Pasteurisation:
Elle dtruit uniquement les germes pathognes non sporuls, utilise principalement
pour le lait.
. Dsinfection:
Procd permettant la destruction momentane des microorganismes sur des milieux
inertes contamins (paillasses, locaux, etc.).
. Asepsie:
Ensemble de mesures propres empcher tout apport exogne de microorganismes.
. Antisepsie:
Procd permettant la destruction momentane des microorganismes sur des tissus
vivants.
 Mthodes physiques:
Radiations Chaleur Filtration

Rayons ionisants Sche Humide

UV Sur membrane
X et Gamma Four Pasteur Autoclave

Prin Les radiations UV Ce sont des Le matriel striliser est Lagent strilisant est la Cette technique repose
cipe provoquent de nombreux rayonnements expos la chaleur sche vapeur deau sature sous sur le passage dun
changements dans les lectromagntiques une temprature donne pression. solvant travers une
cellules; elles cassent les capables de dposer (170-200C) durant un La chaleur associe membrane semi-
liaisons hydrogne, assez dnergie dans temps dtermin (90 min au lhumidit provoque la permable.
destruction des En microbiologie, on utilise
oxydent les doubles la matire quils minimum). microorganismes en dnaturant
liaisons, dtruisent les traversent pour crer des filtres de 47 mm de
les protines par hydrolyse diamtre dont les pores sont
structures cycliques et une ionisation. partielle des chanes de 0.45m de diamtre.
polymrisent certaines peptidiques.
molcules.
Ava - Tue toutes les espces - Trs fort pouvoir de - Dtruit les spores et les - Engendre la mort - Moyen efficace lors
ntag de microorganismes pntration. formes vgtatives. assure des micro- de lutilisation des
cause de sa longueur organismes. produits thermolabiles
es (vitamine, antibiotique,
donde courte et de son
nergie leve. acides amins, etc.)

Inco - Rayons peu pntrants. - Constituent un -Inefficacit vis--vis des - Ne convient pas pour - Ne retient pas les
nv danger pour ceux qui prions (un type dagent les produits liquides virus.
les manipulent. pathogne de nature dlicats: lait, glatine,
nien
protique); milieux albumineux, etc.
ts - Ne convient pas pour les
objets en plastique;
- Cycle de strilisation long.
 Mthodes chimiques:
Avantages Inconvnients

Halognes chlors (eau de -Trs efficaces contre les micro-organismes; Provoquent des irritations sur la peau.
javel = dsinfectant) - Utiliss pour dsinfecter les paillasses, les viers,
etc.

Halognes iods (PVPI = -Inhibent la prolifration des microorganismes et Rduisent temporairement la population
antiseptique) les liminent; de microorganismes prsents sur la peau
Solutions - Utiliss pour le nettoyage de la peau, des plaies, et les muqueuses au moment de leur
etc. application.

Phnol (antiseptique puissant) Il agit comme un poison protoplasmique brut, Produit corrosif, il provoque des
pntrant la paroi cellulaire et prcipitant les irritations svres.
protines cellulaires causant la mort bactrienne en
inactivant les activits enzymatiques.

Solution alcoolique Action trs rapide dtruisant efficacement les - Inefficace contre les champignons et les
(dsinfectant et antiseptique) bactries Gram + et Gram - virus;
- Temps daction trs court.

Gel hydro-alcoolique Large spectre daction (dtruit plusieurs types de Malgr la prsence dagents adoucissant,
(antiseptique) microorganismes). lalcool a quand mme un effet asschant
sur la peau.

Ammonium quaternaire Lutte contre les infections et rduit une quantit de Gnralement irritant et peut causer des
(dsinfectant et antiseptique) bactries prsents dans notre milieu. rougeurs si on lutilise en permanence.
Ozone (O3) (dsinfectant) - Pouvoir dsinfectant plus efficace que le chlore; -Il est plus onreux fabriquer que le
Gaz - Il se dcompose naturellement en oxygne. chlore;
- impossible de le stocker sous forme
gazeux car il se dgrade assez rapidement.

Oxyde dthylne (C2H4O) - Utilis pour striliser essentiellement les produits - Gaz extrmement toxique et mutagne,
pharmaceutiques (exp. Les ttines des biberons). il ne doit tre utilis quen cas
- Permet deffectuer une strilisation froid et est dimpossibilit dutiliser un autre procd
utilis comme biocide et comme fongicide. de strilisation.
Les milieux de culture
La microbiologie dpend en grande partie de la croissance et de la conservation
des microorganismes en laboratoire; ceci nest possible que si des milieux de
culture adquats sont disponibles.

Un milieu de culture est une prparation solide, semi-solide ou liquide,

utilise pour faire croitre, pour repiquer, pour conserver et transporter des
microorganismes.

Un bon milieu:

doit tre strile;

doit contenir tous les nutriments ncessaires au dveloppement des
microorganismes;
doit contenir une quantit deau suffisante pour permettre le mtabolisme
microbien;
Doit avoir un pH convenable.
 A- Les besoins nutritifs courants:
(communs tous les microorganismes)

Nutriment: substance utilise dans les ractions de biosynthse et de

production dnergie et donc requis pour la croissance et la reproduction des
microorganismes .
 Macrolments (ou macronutriments):

lments majeurs (Carbone, Oxygne, Hydrogne, Azote, Soufre, Phosphore,

Potassium, Calcium, Magnsium et Fer), ncessaires aux microorganismes en quantits
importantes.

C, O, H, N, S, P: sont utiles pour la synthse des glucides, des lipides, des protines et
des acides nucliques;
K+ et Na+ sont utiles pour :
Lquilibre osmotique de la cellule
Lactivit de diverses enzymes
Ca2+ est utile pour :
Lactivit de certaines enzymes
La thermo-rsistance des endospores bactriennes
Mg2+ est un cofacteur de nombreuses enzymes, il forme un complexe avec lATP,
stabilise les ribosomes et les membranes cellulaires.
Le fer (Fe2+ ou Fe3+) est utile pour la synthse des enzymes et des protines
transporteuses dlectrons.
 Oligolments (micronutriments):

lments ncessaires en petites quantits (Manganse, Zinc, Cobalt, Molybdne,

Nickel et Cuivre).

Ils aident la catalyse des ractions et au maintien de la structure des protines.

Beaucoup doligolments servent la synthse de substances spcifiques
(pigments, toxines, vitamines : vitamine B12,).

Il faut souligner que les microorganismes ont besoin dun mlange quilibr de
nutriments. Sil manque un nutriment essentiel, le dveloppement sera limit quelle
que soit la concentration des autres lments nutritifs.
Les types nutritionnels (trophiques) chez les
microorganismes:
 Selon la source de carbone:

Les autotrophes: organismes qui utilisent le CO2 comme unique ou

principale source de carbone.

Les htrotrophes: organismes qui utilisent des molcules organiques

prformes et rduites comme source de carbone.
 Selon la source dnergie:

Les phototrophes: organismes qui utilisent la lumire comme source

dnergie.

Les chimiotrophes: organismes qui utilisent loxydation de composs

chimiques (soit organiques ou inorganiques) comme source
dnergie.
 Selon la source dlectrons:

Les lithotrophes: organismes qui utilisent des substances inorganiques

rduites comme source dlectrons.

Les organotrophes: organismes qui extraient les lectrons de

composants organiques.
 Sur la base de leurs sources primaires (en carbone, en nergie et en lectrons), les
microorganismes peuvent tre classs en cinq catgories nutritionnelles:

Les autotrophes photolithotrophes (bactries sulfureuses pourpres et vertes,

ccyanobactries);

Les autotrophes chimiolithotrophes (bactries oxydant le soufre, bactries nitrifiantes,

bactries oxydant le fer, );

Les htrotrophes photoorganotrophes (bactries non sulfureuses pourpres et vertes);

Les htrotrophes chimioorganotrophes (la plupart des microorgnismes non

photosynthtiques, y compris la plupart des agents pathognes, les champignons, de
nombreux protistes et de nombreuses arches);

Les htrotrophes chimiolithotrophes ou les mixotrophes (certaines bactries oxydatrices du

soufre).
 B- Les besoins nutritifs spcifiques:
(Facteurs de croissance)

Facteur de croissance: substance organique indispensable la croissance dun

microorganisme (mtabolite essentiel) quil est incapable de la synthtiser et
quil doit donc ncessairement la trouver dans le milieu de culture.
 Les acides amins (ncessaires pour llaboration des protines cellulaires)
Ex : GLU, ALA, ASN

Les bases puriques et pyrimidiques (entrant notamment dans la composition

des acides nucliques et de lATP)
Ex : Adnine pour certains Lactobacillus
Uracile pour certains Streptococcus

Les vitamines: petites molcules organiques servant de coenzymes ou de

prcurseurs de coenzymes
Ex: Nicotinamide pour Proteus vulgaris et certaines souches de
Staphylococcus aureus
Thiamine (vit B1) pour certaines souches de Staphylococcus aureus.
Selon les besoins en facteurs de croissance, on peut classer les microorganismes en
deux catgories:

les prototrophes: ne ncessitent pas de facteurs de croissance;

les auxotrophes: ncessitent des facteurs de croissance (Ex. Proteus vulgaris est
auxotrophe pour la vitamine PP).