NORME ISO

INTERNATIONALE 19458

Première édition
2006-08-01

Qualité de l'eau — Échantillonnage

pour analyse microbiologique
Water quality — Sampling for microbiological analysis

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Numéro de référence
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E-mail [email protected]
Web www.iso.org
Publié en Suisse

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Sommaire Page

Avant-propos..................................................................................................................................................... iv
Introduction ........................................................................................................................................................ v
1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1
2 Références normatives ........................................................................................................................ 1
3 Point de prélèvement............................................................................................................................ 1
4 Technique de prélèvement .................................................................................................................. 2
5 Transport et conservation ................................................................................................................. 11
Annexe A (informative) Détermination a priori du nombre d'échantillons à analyser pour
déterminer la concentration moyenne de microbes présents dans l'eau avec une
confiance donnée, en cas de dénombrement de micro-organismes par culture ........................ 13
Annexe B (informative) Valeurs recommandées (R) et acceptables (A) pour la durée maximale de
conservation d'échantillon incluant le temps de transport et les températures, sauf
spécification contraire dans des normes spécifiques.................................................................... 16
Bibliographie .................................................................................................................................................... 17
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
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L'ISO 19458 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 4,
Méthodes microbiologiques.
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Introduction
Un échantillonnage approprié est essentiel pour fournir des échantillons représentatifs au laboratoire
d'analyse. Les modalités de l'échantillonnage dépendront de l'objectif de celui-ci, mais aussi de la nature des
échantillons. Les micro-organismes sont des organismes vivants. De plus, lors de leur introduction dans l'eau,
ils ne forment pas une solution parfaite mais une suspension ayant son propre degré d'hétérogénéité.

Les objectifs d'échantillonnage peuvent être multiples et ceux-ci sont décrits dans la série de normes
ISO 5667 (l'ISO 5667-1, l'ISO 5667-2 et l'ISO 5667-3):

a) déterminer la conformité d'une eau à une spécification réglementaire de qualité;

b) caractériser toute contamination, son niveau (moyen) et ses variations:

1) quelle est sa variation aléatoire?

2) existe-t-il une tendance?

3) existe-t-il des cycles?

c) identifier les sources de pollution.

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Le nombre ou la fréquence des échantillons variera en fonction de l'objectif du prélèvement.

Le nombre minimal d'échantillons sera faible si la concentration moyenne diffère considérablement de la

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spécification (très inférieure ou très supérieure), et le nombre minimal d'échantillons sera plus élevé si la
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concentration moyenne est proche de la spécification. Il en est de même dans le cas b) lorsqu'il s'agit d'une
tendance: la fréquence de prélèvement ea5837c66fb3/iso-19458-2006
est d'autant plus élevée que la tendance n'apparaît pas clairement
(voir aussi l'Annexe A).

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Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse

microbiologique

AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien

les pratiques courantes de laboratoire. La présente norme n'a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur de la
présente norme d'établir des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité, et de
s'assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.

IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément à la présente norme
soient effectués par un personnel convenablement formé.

1 Domaine d'application
La présente Norme internationale fournit des conseils sur les régimes de planification du prélèvement d'eau,
sur les modes opératoires de prélèvement en vue de l'analyse microbiologique et le transport, et sur la
manipulation et la conservation des échantillons avant le début de l'analyse. Elle porte sur les prélèvements
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pour recherches microbiologiques.
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Des informations générales sur l'échantillonnage à partir de différentes masses d'eau sont données dans les
parties respectives de l'ISO 5667.
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2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables à l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les amendements).

ISO 5667-1, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 1: Lignes directrices pour la conception des
programmes et techniques d'échantillonnage

ISO 5667-2, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques d'échantillonnage

ISO 5667-3, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 3: Lignes directrices pour la conservation et la
manipulation des échantillons d'eau

3 Point de prélèvement
Le site de prélèvement doit présenter des caractéristiques représentatives et rendre compte de toute variation
verticale, horizontale et temporelle. Il doit être identifié avec précision, selon les recommandations générales
fournies dans l'ISO 5667-1 et l'ISO 5667-2, en tenant compte des aspects supplémentaires spécifiques à la
microbiologie.

Il convient d'éviter les points de prélèvement pour lesquels les conditions ne sont pas stables. L'hétérogénéité
du système hydraulique doit être prise en considération. Dans le cadre d'études portant sur l'efficacité de la
désinfection, le point de prélèvement doit être choisi de sorte à garantir que la réaction soit complète.

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EXEMPLE Des exemples de l'influence de l'hétérogénéité du système sur les résultats sont donnés ci-dessous.

⎯ Il n'est pas équivalent de prélever un échantillon de subsurface ou de surface, ou un échantillon de subsurface

«contaminé» lors de la remontée à travers le film superficiel. Dans certains cas (par exemple lacs, piscines), la
concentration dans le film superficiel peut être 1 000 fois supérieure à celle en subsurface.

⎯ Tous les points d'un réseau ne sont pas équivalents car il peut exister des culs-de-sac et des sections où le débit est
réduit, notamment si le réseau est alimenté par deux sources.

⎯ La qualité de l'eau à la sortie d'un réservoir bien mélangé est généralement la même qu'au sein de la masse d'eau
mais elle peut varier considérablement par rapport à l'entrée du réservoir.

4 Technique de prélèvement

4.1 Personnel

La formation formelle, les dossiers de formation et la détermination des compétences doivent être décrits pour
tout personnel en charge des prélèvements et cette information doit être correctement documentée.

4.2 Flacons de prélèvement

4.2.1 Généralités

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Pour les prélèvements de routine (par exemple prélèvements à des robinets, dans les eaux pour activités de
loisir, dans les eaux de piscine) utiliser des flacons propres et stériles. Il convient que le volume des flacons
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soit adapté à l'analyse de tous les paramètres demandés.

Pour le prélèvement par immersion dans des eaux ISOpropres,

19458:2006utiliser des flacons stériles à l'intérieur et à
l'extérieur, protégés par duhttps://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/4ada84a7-687c-45c6-90e5-
papier kraft (à maintenir au sec après le passage à l'autoclave), du papier
d'aluminium ou d'un sachet extérieur en plastique. ea5837c66fb3/iso-19458-2006
Si ce sachet ne peut être passé à l'autoclave, la stérilisation devra se faire au moyen de rayons gamma ou à
l'oxyde d'éthylène. Le sachet peut ensuite être ouvert juste avant le prélèvement et peut également servir de
gant pour tenir le flacon et garantir des conditions d'asepsie maximales avant de le placer sur une perche ou
autre appareil de prélèvement stérilisable.

Il est également possible de désinfecter la paroi extérieure des flacons de prélèvement immédiatement avant
l'immersion au moyen d'un désinfectant approprié, tel que l'isopropanol (4.3.1.1) et de les laisser sécher avant
utilisation. Ceci n'est pas adapté à l'analyse de bactéries sporulées.

Dans la plupart des cas, des flacons de 500 ml sont suffisants dans la mesure où moins de cinq catégories de
micro-organismes sont mesurées, impliquant chacune l'ensemencement d'un volume maximal de 100 ml.
Dans certains cas, des volumes plus importants sont nécessaires, par exemple:

⎯ pour l'analyse d'eau embouteillée (250 ml par paramètre);

⎯ pour les Legionella spp. ou Salmonella spp. (jusqu'à 1 l);

⎯ pour les virus, les kystes de Giardia, les oocystes de Cryptosporidium, les amibes dans les eaux propres,
de 10 à plusieurs centaines de litres ou plus sont examinés. En général, une étape de concentration est
réalisée sur le site au moyen d'un filtre à cartouche qui est ensuite transporté au laboratoire.

Les flacons peuvent être en verre ou en différentes matières plastiques (polypropylène, polystyrène,
polyéthylène, polycarbonate). Généralement, le verre est préféré en cas de réutilisation, et le polyéthylène est
utilisé pour un usage unique.

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L'adhérence aux surfaces peut diminuer la détection de micro-organismes, et la tension de surface

tangentielle critique γ doit être pris en considération si un matériau non standard est utilisé [13].

Le dispositif de fermeture peut être un bouchon en verre dépoli ou en plastique pour les flacons en verre, une
cape à pression en plastique pour les flacons ou bocaux en plastique, ou une capsule à vis métallique ou
plastique pour l'un ou l'autre. Il convient que les ouvertures des flacons fermés par des bouchons en plastique
ou en verre disposent aussi d'une autre protection contre la contamination, par exemple du papier
d'aluminium.

Quand de grands volumes sont nécessaires pour la recherche, par exemple de virus, de Salmonella spp.,
d'amibes, d'oocystes de Cryptosporidium, de kystes de Giardia, il est parfois nécessaire d'analyser des
dizaines de litres ou des centaines de litres. Pour pallier les difficultés de manipulation, de réfrigération et
d'agitation de tels volumes, il est recommandé de procéder à une étape de concentration in situ (par
floculation, centrifugation ou filtration). Des pompes péristaltiques peuvent être utilisées avec des tubulures
stériles.

NOTE 1 Les capsules en métal, notamment celles en aluminium, peuvent libérer de la toxicité lorsqu'elles sont
autoclavées. Ceci peut être évité si elles incorporent un revêtement étanche thermorésistant.

NOTE 2 Certains matériaux peuvent également entraîner la formation de sous-produits toxiques lorsqu'ils sont
stérilisés à chaud, même au four, ou induire des variations de pH.

NOTE 3 Certaines marques de coton utilisées pour boucher la verrerie peuvent devenir toxiques si elles sont
chauffées trop longtemps à des températures trop élevées.

NOTE 4 Les capes à pression en plastique fixées aux flacons ou bocaux présentent plusieurs avantages compte tenu
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du fait qu'elles sont aussi étanches que les capsules à vis, et que les capes peuvent rester ouvertes, ce qui facilite le
remplissage et le pipetage. Lorsque la cape est ouverte, elle reste attachée au flacon de sorte que les flacons et les
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dispositifs de fermeture sont maintenus ensemble et la cape est également protégée contre la contamination.

4.2.2 Stérilisation des flacons ISO 19458:2006

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En cas de réutilisation, nettoyer les flacons en verre et leur dispositif de fermeture à l'aide d'un détergent non
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toxique, exempt de phosphore, puis les rincer soigneusement avec de l'eau déionisée ou distillée.

Passer les flacons à l'autoclave à (121 ± 3) °C pendant au moins 15 min. Laisser le dispositif de fermeture
des flacons desserré pour permettre à la vapeur de remplacer la totalité de l'air contenu pendant la montée en
température, et pour éviter que les flacons en plastique s'écrasent pendant le refroidissement. Serrer les
capsules à vis après la stérilisation. Passer à l'autoclave les bouchons en verre séparément du flacon ou
utiliser un séparateur en papier ou en aluminium pour éviter le coincement du bouchon lors du refroidissement.

Si besoin est, stériliser les flacons dans un four pendant au moins 1 h à (170 ± 10) °C. Placer une bande de
papier ou un bout de ficelle entre le bouchon en verre dépoli et le goulot du flacon pour éviter qu'ils se
coincent pendant le refroidissement. Pour les flacons, il convient qu'il y ait une traçabilité de la date de
stérilisation.

Contrôler l'efficacité du procédé de stérilisation à l'aide d'indicateurs chimiques ou biologiques.

Lorsqu'aucune autre méthode de stérilisation n'est possible, désinfecter les flacons en les immergeant dans
de l'eau bouillante pendant au moins 30 min. Immédiatement après l'ébullition, vider les flacons et les fermer
avec des capsules bouillies emballées dans du papier propre.

NOTE 1 Les flacons en polyéthylène peuvent être stérilisés par exposition au gaz oxyde d'éthylène mais, en raison de
sa toxicité, ce mode opératoire est réalisé dans des installations spécialisées et du temps est donné pour la désorption de
l'oxyde d'éthylène. En conséquence, il n'est pas utilisé comme mode opératoire de routine dans les laboratoires.

NOTE 2 L'exposition aux rayons gamma produits par une source de 60Co ou 137Cs ou l'exposition aux électrons
accélérés d'énergie suffisante (de 1 × 104 Gy à 2 × 104 Gy) sont des techniques de stérilisation très efficaces, disponibles
dans des installations spécialisées. Toute activité antibactérienne résiduelle est éliminée, en revanche certains matériaux
peuvent être altérés par polymérisation après une exposition répétée aux rayonnements.

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4.2.3 Neutralisation des désinfectants

Pour évaluer la qualité microbiologique de l'eau désinfectée par un oxydant (par exemple chlore, chloramines,
brome ou ozone), l'action de l'oxydant doit être interrompue dès que l'échantillon est prélevé. Ajouter un agent
réducteur, tel que le thiosulfate de sodium, dans les flacons de prélèvement.

La masse théorique du thiosulfate de sodium (anhydre) nécessaire pour neutraliser 1 mg de chlore est de
7,1 mg. En conséquence, on ajoute 0,1 ml d'une solution de thiosulfate de sodium pentahydraté (4.3.1.2) pour
chaque 100 ml contenu dans le flacon. Ceci neutralisera au minimum 2 mg/l et jusqu'à 5 mg/l de chlore libre,
en fonction des dynamiques de neutralisation, ce qui est suffisant pour la majorité des échantillons.

Dans certaines circonstances, telles que pédiluves dans les piscines, mesures de désinfection (par exemple
éradication des Legionella dans les réseaux de distribution d'eau potable), les concentrations de chlore
peuvent être supérieures, auquel cas un dosage proportionnellement plus élevé de thiosulfate de sodium sera
nécessaire.

Le thiosulfate de sodium n'est pas détruit par le passage à l'autoclave ni par la chaleur sèche. Veiller à ce que
le pH de la solution de thiosulfate de sodium soit presque neutre (un pH bas peut entraîner une
décomposition).

Le thiosulfate de sodium n'a pas d'effet sur l'échantillon et peut également être utilisé pour les eaux non
chlorées.

NOTE Il a été déclaré que les Legionella étaient sensibles au sodium et qu'il était préférable d'utiliser du thiosulfate
de potassium. Toutefois, aucun effet néfaste du sodium n'a été détecté aux concentrations utilisées pour neutraliser des
concentrations habituelles de chlore.
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Pour d'autres désinfectants, des mesures de neutralisation correspondantes doivent être prises. Si la
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neutralisation n'est pas possible ou réalisable, ceci doit être consigné.

Des agents chélatants ont été recommandés pourISO 19458:2006

protéger les bactéries contre l'action toxique de métaux
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lourds tels que le cuivre ou le zinc. L'acide éthylène diamine tétracétique (EDTA) ou le nitrilotriacétate de
sodium (NTA) (Na3C6H6NO6) peuvent être utilisés ea5837c66fb3/iso-19458-2006
en solution stérilisée par filtration à une concentration finale
d'environ 50 mg/l mais il convient de ne l'ajouter qu'en cas de nécessité (par exemple eau traitée à l'argent ou
au cuivre). L'argent peut également être neutralisé par du sulfure de sodium. Ajouter 1 ml d'une solution de
sulfure de sodium (4.3.1.3) dans 1 l d'échantillon.

4.2.4 Contrôle de la qualité des flacons de prélèvement

4.2.4.1 Essais de stérilité

Le laboratoire doit s'assurer de la stérilité des flacons de prélèvement, qu'ils soient préparés en interne ou
dans le commerce, qu'ils soient en verre ou en plastique. Il convient que les flacons préparés dans le
commerce soient accompagnés d'un certificat de stérilisation, condition de leur acceptation. Il est également
recommandé de réaliser des essais de stérilité sur le lot en usage. Ceci correspond au lot de flacons après
étiquetage, ajout d'agents neutralisants le cas échéant et stockage.

La stérilité des flacons peut généralement être garantie par le contrôle du procédé de stérilisation. Dans le cas
contraire, il convient de soumettre les flacons à des essais de stérilité.

EXEMPLE Des exemples de modes opératoires d'essai de stérilité sont fournis ci-dessous (généralement réalisés
au taux de 1 pour 100 flacons):

a) Méthode du «flacon roulé»

Cette méthode consiste à introduire 20 ml ou 50 ml de gélose nutritive en fusion (gélose pour dénombrement en
boîte) dans le flacon d'essai et à recouvrir la paroi du flacon avec la gélose en le faisant tourner pendant la phase de
refroidissement (sous un mince filet d'eau, si nécessaire). Il convient que l'incubation à (22 ± 2) °C pendant 5 j ne
donne lieu à aucune croissance visible.

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b) Méthode en bouillon liquide

Cette méthode consiste à placer entre 20 ml et 50 ml de bouillon au thioglycolate ou autre bouillon nutritif dans le
flacon en le faisant tourner de façon à mouiller les parois et à incuber à (22 ± 2) °C pendant 5 j. Il convient qu'aucune
turbidité n'apparaisse si le flacon est stérile.

4.2.4.2 Essai de présence d'agents neutralisants

La présence de thiosulfate peut être vérifiée par une méthode iodométrique:

I2 + 2 S2O32− 2 I− + S4O62−

Ajouter 10 ml d'eau distillée dans le flacon et titrer avec une solution d'iode (4.3.1.4), en utilisant de l'amidon
ou du thiofène comme agent de titrage pour la détermination du point d'équivalence.

4.2.4.3 Essai de toxicité résiduelle dans les flacons de prélèvement

La toxicité résiduelle dans les flacons de prélèvement peut provenir du mode opératoire de nettoyage de la
verrerie, du dégagement de composants ou d'additifs des flacons en plastique et également du procédé de
stérilisation. Pour une utilisation courante de flacons en verre ou en polyéthylène, il n'est pas requis de vérifier
régulièrement la toxicité mais, en cas de doute, procéder à l'essai conformément à Geldreich, 1975 [8] (par
exemple).

4.3 Réactifs, appareillage et matériel

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4.3.1 Réactifs
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4.3.1.1 Éthanol, fraction volumique ϕ (C2H5OH) = 70 %, isopropanol, fraction volumique
ϕ [(CH3)2 CHOH] = 70 % ou solution d'hypochlorite, ρ (CLO–) ≈ 1 g/l.
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4.3.1.2 Solution de thiosulfate de sodium pentahydraté, ρ (Na2S2O3, 5H2O) = 18 mg/ml.
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4.3.1.3 Solution de sulfure de sodium, ρ (Na2S) = 0,1 mg/ml.

4.3.1.4 Solution d'iode, c(I2) = 0,05 mol/l.

4.3.2 Appareillage et matériels

Outre les flacons de prélèvement, les éléments suivants peuvent être nécessaires.

4.3.2.1 Savon et serviettes.

4.3.2.2 Chalumeau à gaz et recharge.

4.3.2.3 Bocaux ou béchers, chiffons désinfectants.

4.3.2.4 Briquet, allumettes.

4.3.2.5 Marqueurs, stylos, étiquettes.

4.3.2.6 Clés, pinces, tournevis, couteau.

4.3.2.7 Glacière, avec glace ou blocs réfrigérants, réfrigérateurs portables ou compartiments

réfrigérants dans des véhicules.

4.3.2.8 Thermomètre ou enregistreur de température.

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