I.

Introduction :

Les aliments peuvent parfois présenter des risques sanitaires si les conditions de culture,
d’élevage, de production ou de conservation sont mauvaises. L’unité de microbiologie
alimentaire permet de contrôler la qualité sanitaire des principaux produits alimentaires ou
dérivés, de prévenir des risques d’intoxication alimentaire et ainsi garantir la santé des
consommateurs. En particulier la matière grasse elle dégrade facilement à cause de
l’oxydation ,

la margarine comme tout produit alimentaire peut être le siège d’altérations microbiennes et la
contamination provient surtout de la phase aqueuse qui est le plus vulnérable aux attaques
microbienne.

II. Objectif :

L’objectif de ce TP est de rechercher ou de quantifier un certain nombre de micro-organisme

indicateurs d’un ou de plusieurs problèmes rencontrés lors du procède de fabrication ou
susceptibles de présenter un risque pour la santé humaine lors de la mise sur le marché.
III. Matériels et réactifs :

1. Matériels :

 Boites de pétri
 Tubes à essai
 Bec bensen
 Pipette et pipteur
 Pipette pasteur
 Spatule
 Bécher et erlenmeyer
 Etuve à déférentes températures (37 ; 30 ; 25)
 Bain marie
 Balance électronique
 Vortex
2. Milieux de culture et réactifs :
 Margarine
 Solution de ringer
 Milieu TGEA (Gélose glucosé tryptonée à l’extrait de levure )
 Milieu SFB
 Milieu Hekteon
 Milieu Giolitti Cantonni+additif tellurite de potassium
 Gélose OGA
 Milieu VBL
 L’eau physiologique

IV. Mode d’opératoire :

Préparation des solutions mère :

Solution mère 1 :

-A coté de bec bensen, on élimine à l’aide d’une spatule stérile la couche superficiel de notre
échantillon : margarine.
-Peser dans un Erlenmeyer stérile une masse de 40g de margarine prélevée aseptiquement à
l’aide d’une spatule stérile sans toucher les parois d’erlenmeyer.

-Ajouter 34 ml du diluant (Solution Ringer 1/4) .

-L’ensemble est fermé hermétiquement avec coton, cardé et du papier aluminium puis Placer
l’erlenmeyer au bain marie réglé à 45°C (pour ne pas tuer les microorganismes) jusqu’à
fusion complète du produit pendant 20 min.
-Agiter jusqu’à obtention d’une émulsion homogène.

- mettre erlenmeyer dans le réfrigérateur pour séparer la phase aqueuse de la phase solide et
facilite de retirer la phase aqueuse , cette solution pour faire tous les tests sauf pour la
recherche des salmonelles.

-à coté de bec bensen et à l’aide d’une pipette stérile on prend la phase aqueuse sans toucher
les parois d’erlenmeyer =la solution mère

Solution mère 2 :pour les salmonelle

-A coté de bec bensen, peser dans un Erlenmeyer stérile une masse de 25g de margarine
prélevée aseptiquement à l’aide d’une spatule stérile sans toucher les parois d’erlenmeyer.

-Ajouter 225ml du diluant (Solution Ringer 1/4) par ce que cette solution contient les
sels minéraux permet d’extraire la phase aqueuse.

-L’ensemble est fermé hermétiquement avec coton, cardé et du papier aluminium puis placer
l’erlenmeyer au bain marie réglé à 45°C pendant 20min
- On fait l’incubation à 37c° pendant 24h

-après 24h on fait l’ensemencement de cette solution dans 3 tubes de milieu SFB puis
incubation à 37c° Pendant 24h.

Préparation des dilutions décimales :

Réaliser Aseptiquement des dilutions à partir de la solution mère1 deux tubes à vis stérile
contient de (9ml) d’eau physiologie stérile, avec une pipette stérile prendre 1ml de la solution
mère et mettre dans le premier tube « c’est le tube de dilution 10 -1». Après une
homogénéisation été réalisé avec la même micropipette (changer lombo) et prendre (1 ml) à
partir de tube de dilution (10-1) et mettre dans le 2 éme tube « c’est le tube de dilution 10-2 »
* Ces dilutions serviront à la recherche des : germes aérobies mésophiles totaux
(FTAM) , Les coliformes totaux, staphylococcus aureus et les levures et moisissure.

Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles totaux

(FTAM):

-prendre aseptiquement 1ml de chaque dilution décimale (10 -1,10-2) aussi la solution mère à
l’aide d’une micropipette (changer lombo entre les déférentes solutions) et mettre dans chaque
boite de Petrie (2 boite pour chacune) vide préparée à cet usage et numérotée.

- après coller les boites de 10 à 15 ml de milieu TGEA.

-faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour bien

mélanger l’inoculum.

- laisser les boites un peu ouvert pour évité la formation des bulle d’eau, ce test est réalisé
devant le bec benzène pour crée un endroit stérile.

- Laisser solidifier sur la paillasse, puis rajouter une deuxième couche de la même gélose,
Cette double couche à un rôle protecteur contre les diverses contaminations superficielles.

-Préparer de la même manière deux boites témoins l’une contenant 1 ml de la gélose TGEA et
l’autre contenant 1 ml de la solution Ringer.Ces deux boites servent à tester la gélose et La
solution Ringer en cas de contamination.

- Les boites seront incubées à 30°C pendant 24 h.

Recherche des coliformes:

-on prend 9 tubes stérile contiennent le milieu VBL.

-après l’homogénéisation manuelle, on prendre aseptiquement 1ml de chaque dilution

décimale (10-1,10-2) aussi la solution mère à l’aide de la même micropipette (changer lombo
entre les déférentes solution)et mettre dans chaque tube (3 tube pour chacune) préparée à cet
usage et numérotée .

-a l’aide de vortex on fait l’homogénéisation de chaque tubes.

-on fait l’incubation à 37c° pendant 24h.

Recherche des staphylocoques :

-on ajouté l’additif tellurite de potassium (c’est un indicateur coloré) dans le milieu Giolitti
cantonni, et on met de 9ml à 10 ml de cette milieu dans 9 tubes stérile.

-après l’homogénéisation manuelle des solutions on prendre aseptiquement 1ml de chaque

dilution décimale (10-1,10-2) aussi la solution mère à l’aide de la même micropipette(changer
lombo entre les déférentes solution)et mettre dans chaque tube (3 tube pour chacune)
préparée à cet usage et numérotée .

-A l’aide de vortex on fait l’homogénéisation de chaque tubes.

-On fait l’incubation à 37c° pendant 24-48h.

Dénombrement des levures et moisissures :

-prendre aseptiquement 1ml de chaque dilution décimale (10 -1,10-2) aussi la solution mère à
l’aide d’une micropipette et mettre dans chaque boite de Petrie (2 boites pour chacune) vide
préparée à cet usage et numérotée.

-après coller les boites de 10 à 15 ml de gélose OGA.

-faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour bien

mélanger l’inoculum.

-Préparer de la même manière deux boites témoins l’une contenant 1 ml de la gélose OGA et
l’autre contenant 1 ml de la solution Ringer.Ces deux boites servent à tester la gélose et La
solution Ringer en cas de contamination.

- laisser les boites un peu ouvert pour évité la formation des bulle d’eau sauf la boite de
solution Ringer, ce test est réalisé devant le bec bensen pour crée un endroit stérile.

- Laisser solidifier sur la paillasse puis les boites seront incubées à 25°C pendant 5 à 7 jours.
V. Les résultats et les interprétations :

Pour les salmonelle :

Résultat négative dans les trois tubes : on n’observe pas un trouble microbien qui indique
l’absence des salmonelles

Remarque :

Si les résultats sont positifs il faut faire un isolement (utilisant le milieu Hektoen) des colonies
noirs et milieu rouge (utilisation de lactose et acidification).

L’interprétation :

La gélose Hektoen est un milieu de choix pour l’isolement des entérobactéries pathogènes :comme les
Salmonella, La présence d’extrait de levures et de sucres, et la qualité des peptones favorisent leur
croissance

Dans le milieu Hektoen on observe des colonies noirs et virage de milieu vers le rouge
(utilisation de lactose et acidification).

Pour les FTAM :

Milieu TGEA : on a 4 colonies

Solution Ringer : absence des colonies

Solution mère: dans une boite on a 8 colonies et l’autre boite on a 7 colonies.

N=¿)-4= 3,5≈ 3 donc le nombre des colonies dans la solution mère est :

3×10 =30UFC /ml (on multiple fois 10 parce que notre échantillon est solide solution
mère =dilution 10-1 )

Solution 10-1 : dans les deux boites on a 2 colonies

N=¿)-4= -2 cette résultat est impossible et indique a une contamination lors des
manipulations au laboratoire.

Solution 10-2 : dans une boite on a 2 colonies et l’autre boite une colonie.
N=¿)-4= - 2,5 cette résultat est impossible et indique a une contamination lors des
manipulations au laboratoire.

Pour les coliformes :

Résultat négative dans tout les tubes :Pas de trouble et pas de production du gaz donc
l’absence des coliformes.

Interprétation :

La fermentation du lactose se traduit par l’apparition de gaz dans les cloches de Durham.

Dans le milieu VBL la présence simultanée de bile de boeuf et de vert brillant provoque
l’inhibition de la presque totalité des microorganismes à Gram-positif et des bactéries à Gram-
négatif autres que les coliformes.
-La teneur en vert brillant est spécialement déterminée afin d’empêcher la croissance des
anaérobies fermentant le lactose à 44°C, ce qui évite l’obtention de résultats faussement
positifs.
- Le développement des coliformes se manifeste par l’apparition d’une turbidité, associée à
une production de gaz dans la cloche de Durham par suite de la fermentation du lactose.

Pour les staphylocoques :

Résultats négative :pas de trouble donc il n’ya pas la réduction de tellurite en tellure noir

Interprétation :

Le Bouillon Giolitti-Cantoni est un milieu d’enrichissement utilisé pour la recherche de

Staphylococcus
aureus dans les aliments.

Les résultats positifs se traduisent par le noircissement des tubes de Giolitti et Cantoni, qui
sont dues à la réduction de tellurite en tellure noir qui révèle donc la croissance des
staphylocoques.
Pour les leveurs et les moisissures :

La lecture des résultats des levures se fait par le comptage des colonies qui présentent se
forme round, opaque et parfois pigmentées.

La lecture des résultats des moisissures se fait par le comptage des taches se forme de
mycélium

Pour le témoin OGA : 2 moisissures

Solution Ringer : une moisissure +2 leveurs

Solution mère : dans une boite une moisissure et pas des leveurs et dans l’autre une
moisissure + 36 leveurs

N= ( 36+2
2 )
−5=14 colonies , donc le nombre des champignons dans la solution mère

c’est :14×10 = 140 UFC /ml.

Solution 10-1 : dans une boite une moisissure+6 leveurs et dans l’autre une moisissure + 12
leveurs

N= ( 18+2
2 )
−5=5colonies, donc le nombre des champignons dans la Solution 10 -1
c’est :

5×102 = 500 UFC /ml. (Solution 10-1 =dilution 10-2)

Solution 10-2 : dans une boite 2 moisissure et pas des leveurs et dans l’autre une moisissure +
5 leveurs.

N= ( 5+32 )−5=−1colonie, donc le nombre des champignons dans la Solution 10 -1 :

c’est :5×102 = 500 UFC /ml. (Solution 10-1 =dilution 10-2)

Interprétation :

-La gélose glucosée à l’oxytétracycline est utilisée pour la recherche et le dénombrement des
levures et des moisissures dans les produits alimentaires et les produits cosmétiques.

-La croissance des levures et des moisissures est favorisée en présence de glucose et d’extrait
de levure.
 - L’addition extemporanée d’oxytétracycline ou de chloramphénicol ou de chloramphénicol +
gentamicine ou d’oxytétracycline + gentamicine permet d’inhiber les bactéries, y compris les
lactobacilles (microorganismes acidophiles qui sont susceptibles de représenter la flore
dominante de certains produits alimentaires).

VI. Conclusion :

Selon les normes microbiologiques des aliments, la margarine doit répondre aux critères
suivants :

- FTAM: 102à 103 UFC/g

-champignons : 10 à 102 UFC/g

-Staphylocoques : 10 à 102 UFC/g

-salmonelle : absence

Et d’après notre résultat, on ne peut pas comparé avec les normes, donc on ne peut pas
conclure esque la margarine conforme aux normes ou non.