L3 Biochimie Culture Cellulaire Chapitre 02

M.
BOURNINE
Maitre de conférences A - Faculté SNV/ST
Licence Biochimie
15-11-21 Année M.
universitaire
BOURNINE L. 2021/2022 1
Culture cellulaire: Comment?
M. BOURNINE L. 2
 Obtention cellules
 Les milieux de culture
 Les contenants
 L’environnement
 L’entretien
M. BOURNINE L. 3
Culture des cellules In Vitro:
Comment?
Pour croître et se diviser la cellule a besoin d’un certains nombre de progrès
techniques :
 obtention au départ de quelques cellules animales indemnes de cellules

procaryotes (sans contaminations);
 développement de milieux de culture adaptés à ce type de cellules ;
 possibilités de les observer et suivre leur développement (microscopes);
 pouvoir propager de telles cellules en culture en continu in vitro
 et de les conservées indemnes d’autres agents biologiques
4
 Obtention cellules
 Les milieux de culture
 Les contenants
 L’environnement
 L’entretien
5
Culture des PBMCs
PBMCs => Peripheral Blood Mononuclear Cells

Les cellules du sang mononucléaires périphériques
(CSPMs), sont principalement constituées de
lymphocyte et de monocyte
7
MISE EN CULTURE D’UN FRAGMENT TISSULAIRE
*Prélèvement cutané (fibroblastes)

*Prélèvement de tumeur solide
*Prélèvement de placenta
1. Recueil du prélèvement dans un tube contenant du milieu

de transport stérile
*par exemple milieu RPMI 1640, à température ambiante
*conditions d’asepsie+++
*taille du prélèvement : taille idéale = 1 cm3 (mais parfois petites biopsies)
*prélèvement cutané : privilégier un prélèvement profond jusqu’à l’aponévrose

plutôt qu’un prélèvement large en surface
*tumeur : éliminer les zones de nécrose, les caillots sanguins
* ne jamais laisser un prélèvement à sec; à défaut de milieu de transport : à

déposer en sérum physiologique stérile
Arrivée du prélèvement
au laboratoire :
Enregistrer le prélèvement
N° d’identification,
date, informations
concernant le patient,
consentement,
données
cliniques…
Noter l’aspect, la taille

de l’échantillon
2. Le fragment tumoral est extrait du tube de transport et
déposé dans une petite boîte de Pétri stérile
Le milieu de transport est parfois conservé (voir étape 8)

3. Dissociation mécanique (ciseau ou scalpel stérile)
Obtention de fragments les plus

petits possibles
4. Dissociation enzymatique (solution de collagénase; 200U/ml) :
complète la dissociation mécanique
5. Incubation 16 à 72 heures à 37°C dans

RPMI 1640+ 10% sérum de veau fœtal
+ antibiotiques+ collagénase
* Vérification visuelle de l’action de la
collagénase après 16h
6. Rinçage de la collagénase : transfert de la suspension cellulaire
dans un tube conique, centrifugation, élimination du surnageant
et reprise du culot cellulaire dans du milieu de culture.
7. Transfert des cellules dans un flacon plat et/ou une boîte
de Pétri puis incubation à 37°C + 5% CO2 en atmosphère
humide
Les cellules en suspension vont sédimenter puis adhérer à la surface du flacon.
Après quelques heures, elles commencent à se diviser et à proliférer
8. Facultatif: surtout pour tumeurs, les très petits prélèvements ou les
prélèvements « friables » : récupération et ensemencement des
cellules en suspension dans le milieu de transport lors de l’arrivée
du prélèvement
2. Aspiration et élimination du surnageant

1. Centrifugation
du tube contenant
le milieu de 3. Obtention d’un
transport du prélèvement culot cellulaire
(800 t/min; 10 min)
4. Suspension du culot cellulaire 5. Incubation à 37°C
dans du milieu de culture
Les cellules en suspension

vont sédimenter puis adhérer
à la surface du flacon.
Après quelques heures, elles
commencent à se diviser
et à proliférer
Complément de la culture
des cellules issues de la
dissociation du fragment
9-a. Surveillance quotidienne des cultures cellulaires à la
loupe binoculaire
Estimation visuelle de la croissance cellulaire: atteinte de la phase exponentielle

de croissance avec nombreuses cellules en mitoses
Prise de décision : arrêt de la culture et récolte des métaphases et/ou

établissement de sous-cultures
9-b. Entretien des cultures : changement de milieu, établissement de
sous-cultures, contrôle à la loupe binoculaire de la croissance cellulaire
Si mitoses: techniques de cytogénétique pour obtention du caryotype
confluence
Semi-confluence
Trypsination
Passage 1
Techniques de cytogénétique :
-Colchicine
(accumulation de cellules au Semi-confluence Semi-confluence
stade métaphasique)
-Choc-hypotonique-fixation Poursuite possible de la culture
-dénaturation-coloration Passages 2, 3….
Trypsination (« passage »): Utilisation d’une enzyme protéolytique (solution
de trypsine) pour détacher les cellules -i) les unes des autres -ii) du support
Mode opératoire :
-1. Aspirer le milieu surnageant, et rincer rapidement avec une solution de trypsine
(pour éliminer les traces de milieu)
-2. Laisser agir environ 0,5 ml à 1 ml de solution de trypsine sur la culture cellulaire
-3. Incuber (max 5 min) à 37°C et surveiller la dissociation du tapis cellulaire
3
2
-4. Inactiver la trypsine par adjonction de milieu de culture (action du calcium)
-5. La suspension cellulaire est alors répartie dans plusieurs flacons ou boîtes
de culture selon la densité désirée
-6. Cultures secondaires moins denses que la culture primaire
5 6
Croissance des cellules
en culture in vitro
 Le repiquage des cultures cellulaires
 Lavage du tapis cellulaire (PBS)
 Détachement des cellules par action enzymatique

(trypsine, collagénase à 4° ou à 37°C)
M. BOURNINE L. 22
Les différentes phases de la croissance
1ère phase = phase de latence

 Pas de division cellulaire
 Dépend du type cellulaire, du milieu de culture, de la densité cellulaire
2ème phase = phase exponentielle

 Phase de division cellulaire
 Temps de doublement selon le type cellulaire (4h à 48h)
3ème phase = phase stationnaire

 Épuisement du milieu = arrêt de la prolifération
4ème phase = poursuite de la croissance cellulaire

(repiquage) ou mort cellulaire
23
Les différentes phases de la
croissance
Phase de latence (cellules quiescentes)
Phase exponentielle Phase stationnaire

Nombre de cellules 10.6/ml
Mort cellulaire
Temps de doublement
Temps (jours)
24
Croissance des cellules en culture in vitro
1er Cas 
15-11-21 M. BOURNINE L. 25
Paramètres régulant la prolifération cellulaire
- La température (37°c)
- l ’hygrométrie (contrôle de l ’évaporation) 90% d ’humidité
- le pH
- CO2…
- la densité cellulaire
- le pourcentage de sérum
- la dépendance en facteur de croissance (ex lignée IL3
dépendante)
1 contrainte majeure : la stérilité microbienne

protection des cellules et des manipulateurs
Croissance des cellules en culture in vitro
Pendant la phase exponentielle les cellules sont distribuées de

façon hétérogène dans les différentes parties du cycle cellulaire.
La culture cellulaire est donc un ensemble hétérogène de cellules

caractérisées par des propriétés métaboliques différentes. Il est
possible de synchroniser les cellules
 privation en facteur de croissance = mise en G0
drogue bloquant la phase S (hydrea)
 déplétion calcique
M. BOURNINE L. 27
Croissance des cellules en
culture in vitro
 Cryoconservation des cellules
 Cellules peuvent être congelées
 Éviter les passages trop nombreux = vieillissement de la

population cellulaire. Permet d’interrompre l’activité
 Cryoconservateur: DMSO, glycérol

Azote liquide
Descente progressive en température
28
Conditions et difficultés de la culture
cellulaire
 Eviter les contaminations
Contaminations chimiques
• Endotoxines, résidus plastiques, ions métalliques, traces d’agents
nettoyants/désinfectants, etc…
Effets invisibles, produits difficiles à détecter

Contaminations biologiques
• Levures, bactéries, champignons
Effets généralement visibles, facile à détecter Modification

du pH et de la turbidité du milieu
M. BOURNINE L. 29
15-11-21 M. BOURNINE L. 30
M. BOURNINE L. 31
Boules bourgeonnantes
M. BOURNINE L. 32
Conditions et difficultés de la culture cellulaire
Contaminations biologiques
• Virus, mycoplasme
Effets invisibles, détection possible par analyse spécifique
Détection de mycoplasme: * marquage de l’ADN des cellules avec du Hoechst
Positif
Négatif
* microscopie électronique à balayage (MEB ou SEM pour Scanning
Electron Microscopy)
33
34
cellulaire
Moyens de lutte contre les contaminations
• Environnement et surfaces propres

• Consommable utilisé adapté (fournisseur certifié)
• Equipement, récipients plastiques et verre propres
et stérilisés
• Milieux de culture stériles
• Usage d’antibiotiques, d’antifongiques
35
cellulaire
Moyens de lutte contre les contaminations
Maintenir la stérilité des cultures et des milieux


Hotte à flux laminaire vertical
ou
Poste de sécurité microbiologique (PSM)
M. BOURNINE L. 36
cellulaire
 Trouver les conditions de culture optimales

Critères de jugement
Les cellules ne meurent pas Sont

Les cellules se divisent obligatoires
Environnement optimal
Les cellules reproduisent in vitro les fonctions
physiologiques ou biochimiques connues in vivo
37
cellulaire

Les critères d’évaluation
 Viabilité cellulaire
Microscope en phase inversée, bleu trypan,
 Taux de croissance
numération à l’hémocytomètre
 Morphologie
 Efficacité d’ensemencement (dilution de la culture et formation de colonie)
 Expression de fonctions spécifiques
38
cellulaire
Paramètres de l’environnement à contrôler: Le milieu de culture
• Doit reproduire plus ou moins le milieu extra-cellulaire de l’organisme

dont proviennent les cellules.
• La multiplicité des lignées cellulaires, la diversification de leur origine, les

débuts de culture tridimentionnelle (cellules nerveuses), de
l’organogénèse in vitro (peau artificielle) ont été possibles grâce à la
définition des milieux.
• Par opposition aux liquides biologiques (lymphes, extraits

embryonnaires, sérums) qui ont été les premiers milieux utilisés, les
milieux actuels sont qualifiés de synthétiques.
M. BOURNINE L. 39
cellulaire
• Ils contiennent un grand nombre de constituants parfaitement définis :

acides aminés, sucres, hormones, vitamines, sels minéraux.
• Ces ingrédients de pureté au moins équivalente aux exigences des

pharmacopées, ils sont utilisés selon des formules de milieux synthétiques
dénommés par les noms des auteurs ayant mis au point la formule, suivis
parfois d’un numéro/ EAGLE, PARKER (M-199), HAM (F10, F12),
FISCHER….
• Prêts à l’emploi ou sous forme de poudre concentrée. On ajoute pour

une croissance optimum, du sérum (de veau fœtal, de veau, de cheval).
40
cellulaire

• L’action du sérum est imparfaitement connue, il apporte les hormones,
les molécules d’adhérence, les facteurs de croissance, des inhibiteurs de
protéases…
Il joue également un rôle tampon
M. BOURNINE L. 41
cellulaire

Le sérum pose une séries de contraintes :

• Composition inconstante ce qui implique de faire des tests par
l’utilisateur,
• Doit être conservé à - 20°C,
• L’emploi de sérum peut donc apparaître lourd, coûteux et parfois risqué.
42
 C’est pourquoi, on se penche de plus en plus sur mise au point
de substituts de sérum ou même de la fabrication de milieux
définis (Ultroser d’IBF ; Ultoser 6 pour cellules adhérentes :
Véro, Hela, épithéliales, fibroblastes, chondrocytes, Ultroser H
pour hybridomes)
Les substituts de sérum renferment: des facteurs de

croissance, des facteurs d’adhésion, des éléments minéraux,
des hormones, des protéines de transports (transferrine,
albumine) et des vitamines.
43
Les milieux de culture
 Leurs avantages sont nombreux:
- composition constante;
- activité similaire au sérum avec des concentrations 5 fois plus faible;
- présentation sous forme de poudre lyophilisée stérile soluble dans l’eau

qu’on conserve à 4°C;
- faible taux en protéines ce qui évite les problèmes de colmatage des

supports par adsorption protéique;
- cependant le développement de ces substituts reste encore limité et

beaucoup de laboratoires fabriquent leurs propres extraits, leur savoir faire
constitue leur secret.
M. BOURNINE L. 44
Milieux complexes qui doivent apporter tous les éléments nutritifs nécessaires
à la croissance/prolifération des cellules animales
 Exigences cellulaires minimales
 eau
 ions minéraux donnant une osmolarité identique à celle du sérum
physiologique
nombreux et variés en concentration adéquate (Na+, K+, Cl-,HCO3-, H2PO42-)
 source de carbone et d'énergie (glucose par exemple)
 source d'azote : acides aminés
 source d’acides gras
 pH constant 7,4 (indicateur de pH : rouge de phénol) grâce un système
tampon CO2/HCO3- ou phosphates.
 Base commune (milieux Hanks, Earl, PBS, Gey) :
 Sels minéraux : NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, NaH2PO4…
 Sucre : glucose
 Compléments variables selon les milieux (RPMI, MEM, DMEM…)
 Acides aminés
 Vitamines et cofacteurs
 Bases azotées, ribose et désoxyribose 45
 Compléments à ajouter extemporanément :
 Mélanges d’antibiotiques au taux final de 1 %
 Pénicilline G,
 Streptomycine,
 Amphotéricine B (antifongique)…
 Glutamine à 1% (acide aminé instable)
 Sérum de veau fœtal (S.V.F. ou F.C.S. Fœtal Calf Serum) entre 1,5 et 10 %
 prélevé stérilement et décomplémenté
 apportant
 facteurs de croissance cellulaire
 EGF (facteur de croissance épidermique),
 FGF (facteur de croissance fibroblastique)
 PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes)
 Facteurs de différenciation comme fibronectine (ancrage des cellules).
 Inhibiteurs comme l’alpha1 antitrypsine (neutralisation de l’action enzymatique
de la trypsine)
46
Les Milieux de culture les plus utilisés
• DMEM : la plupart des lignées cellulaires
• Ham's F12 : cellules de mammifères, cellules CHO
(ovaire de hamster chinois) …
• Leibovitz : virus, cellules de rein…
• MEM 199 : virus, production de vaccin, explants…
• Neurobasal : neurones
• RPMI 1640 : cellules en suspension, lymphocytes
• Williams' E : hépatocytes…
47
Gibco™ media
DMEM
Ham's F12
RPMI 1640
M. BOURNINE L. 48
Exemple de milieu de culture:
Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM)
 Sels (mg/L) 

Méthionine
Phenylalanine
30.00
66.00
 CaCl2 200.00
 Serine 42.00
 Fe(NO3)3.9H2O 0.10
 Thréonine 95.00
 KCl 400.00
 Tryptophane 16.00
 MgSO4 97.67
 Tyrosine.2Na.2H2O 104.00
 NaCl 6400.00
 Valine 94.00
 NaHCO3 3700.00
 NaH2PO4.H2O 125.00  Vitamines (mg/L)
 Acides aminés (mg/L) 

Ca.pantothénate
Chlorure de choline
4.00
4.00
 Arginine 84.00
 Acide folique 4.00
 Cystine.2HCl 63.00
 Inositol 7.20
 Glutamine 584.00
 Niacinamide 4.00
 Glycine 30.00
 Riboflavine 0.40
 Histidine 42.00
 Thiamine.HCl 4.00
 Isoleucine 105.00
 Pyridoxine.HCl 4.00
 Leucine 105.00
 Lysine.HCl 146.00  Autres (mg/L)
 Méthionine 30.00  Glucose 4500.00
 Phenylalanine 66.00  Rouge de phénol 15.00
 Sérine 42.00  Na.Pyruvate 110.00
 + mélange d'additifs non-définis

Les paramètres physico-chimiques
Osmolarité avoisinant celle du sérum Rôle des ions, contrôle les mouvements
physiologique (300 mOsm/L) d’eau et de substances entre milieux
extra et intra-cellulaire
pH compris entre 7,0 et 7,4 En particulier HCO3-/CO2, système tampon

Température : 37°C
Hygrométrie : 80% d’humidité Eviter évaporation du milieu
Contrôle de la température,
INCUBATEUR A CO2 hygrométrie, 5% de CO2
50
Matériels – Le laboratoire
Classification
P1 Organismes non pathogènes, non modifiées génétiquement

Pas d'inactivation nécessaire.
P2 OGM. Inactivation des microorganismes. Incinération du

matériels. Récipients collecteurs spéciaux.
P3 Risque pathogènes pour l'individu mais pas de dissémination.

Médicaments disponibles. Inactivation, incinération…
Mycobactérium tuberculosis, VIH, Hépatite…
P4 Fort risque pathogène pour l'homme. Transmission possible.

Traitements difficiles voire inexistant.
Fièvres hémorragiques : Ebola, Crimée, Lassa
M. BOURNINE L. 51
Le matériel
 Flacons
 En polystyrène optiquement clair stérile
 Traités ou non pour adhérence
 De contenance et surface variable par ex :
 25 cm2 contenance totale 60 mL / vol 5 mL
 Plaques multipuits
 En polystyrène optiquement clair
stérile
 Boites
 À fond plat et couvercle
 Nombre de puits et contenance stérile
variable
 6, 12, 24, 48, 96
 Diamètre allant de 35 à 150 mm
52
Pipetus
Channel Micropipettes
Cônes pour micropipettes
M. BOURNINE L. 53
54
Matériels – Le microscope
Observation des cellules
M. BOURNINE L. 55
Matériels – Le microscope
56
L’environnement durant l’incubation
Respectant certains paramètres physico-chimiques

nécessaires à la culture cellulaire
 la température: 37 °C
 l'hygrométrie: 84 à 85 % d’humidité
 le pH 7,4 maintenu grâce aux systèmes tampon
 du milieu
 renforcés par à l’atmosphère enrichie à 5% de CO2 (système tampon avec
HCO3-)
57
L’incubateur à CO2
Double porte avec verrouillage
5% 37°C Clayettes perforées pour circulation d’air
Voyants de Pression en CO2 et température
Ses manomètres de pression
Son système d’injection
Incubateur fermé avec Bonbonne d’anhydride carbonique Bac d’eau stérilisée pour maintien
d’un taux d’humidité suffisant
58
L’environnement durant le repiquage
Respectant la stérilité
Sensibilité des cellules aux infections
 Bactériennes (en particulier les mycoplasmes),
 Fongiques,
 Virales.
Utilisation de façon adéquate d’une enceinte à atmosphère
stérile :
 PSM Poste de Sécurité Microbiologique
Indicateur de pH : Rouge de phénol

 rose à pH 7,4
 rouge si alcalinisation (infection fongique)
 jaune si acidification (contamination bactérienne ou mort cellulaire)
59
Le PSM
15-11-21 M. BOURNINE L. 60
Le PSM 35%
Enceinte
 une paillasse inox (parfois perforée) 100%
 des grilles d’aspiration
 un écran transparent
 un ventilateur
 créant une aspiration d’air par les
grilles d’aspiration
 une zone de filtration d’air par deux 65%
filtres HEPA
 retenant toute particule de diamètre
>0,3 µm
 redistribuant l’air filtré
 dans l’enceinte de travail 65 % d’air
stérile
 dans l’atmosphère les 35% restants
61
62
Suivi de la culture cellulaire
L’entretien vs passage
 Aspect macroscopique
 Observation du milieu de culture limpide et rose pouvant devenir
trouble et/ou rouge ou jaune
 Au microscope inversé
 sous la platine : les objectifs
 au dessus de la platine : l’éclairage
 avec contraste de phase : meilleure visualisation des
prolongements cytoplasmiques, organites et vacuoles
 vacuolisation et présence de cellules arrondies en suspension =
souffrance et perte d’adhésion
 Nécessité de changer le milieu tous les 2 ou 3 jours
63
 Microscope inversé
avec contraste de phase
au dessus de la platine : l’éclairage
sous la platine : les objectifs
64
Installation du Poste (PSM)
 Nettoyage des mains et avant bras
 Désinfection à l’alcool
 du plan de travail
 de tout le matériel nécessaire
 Pipettes stériles, portoirs, auxiliaire de pipetage ou pipettes
automatiques avec filtres et cônes stériles, tubes stériles…
 de tous les récipients contenant les réactifs stériles
 Milieu complémenté (ou réactifs pour le constituer)
 Trypsine
65
Lavage des mains et

des avant-bras
Désinfection du matériel
Installation sous PSM après

désinfection du plan
66
L’entretien
Élimination du milieu ancien
Rinçage en tampon sans Ca2+
Addition d’un milieu neuf
67
Passage ou repiquage
Élimination du milieu ancien
Rinçage en tampon sans Ca2+
Ajout de trypsine
68
Détachement cellulaire par
digestion enzymatique
PBS – EDTA : élimination du sérum (α1-antitrypsine) et des

ions bivalents (dissociation des interactions cellules–cellules
via les cadhérines)
Trypsine = enzyme qui coupe la protéine du C-terminal des

arginines et des lysines digestion des
protéines accessibles
M. BOURNINE L. 69
Action de la trypsine
surveillée au microscope
70
Inaction de l’activité enzymatique de ta trypsine par ajout de milieu complémenté
Prélèvement d’une fraction de la suspension pour dénombrement après une série

d’aspirations refoulements prolongée pour détacher les cellules
71
Dénombrement en présence d’un colorant pour estimation de la viabilité
cellulaire :
Par exemple, Bleu de Funk (ou Trypan) exclus des cellules vivantes et pénétrant
dans les cellules mortes
Calcul du volume de suspension cellulaire (cellules viables) à introduire dans le

milieu neuf pour une nouvelle incubation de 2 à 3 jours
72
Comptage de cellules avec un
Hémacytomètre
Le comptage cellulaire est régulièrement utilisé à plusieurs étapes de

l’établissement et de l’exploitation d’une lignée cellulaire, que ce soit
pour suivre son évolution, pour évaluer la réponse cellulaire à un agent
cytotoxique, ou encore pour établir des densités cellulaires précises (ex:
un aliquotage pour congélation).
Il existe ainsi deux techniques distinctes de comptage se différenciant

par le nombre d’échantillons qu’ils sont capables d’analyser: la méthode
manuelle à l’aide d’un hémocytomètre, ou la méthode motorisée, à l’aide
d’un compteur électronique.
M. BOURNINE L. 73
Qu’on le nomme hemocytometer, hematocytometer, hemacytometer, cell
counting chamber ou chambre de Neubauer, il est composé de 2 chambres
identiques, subdivisées en 9 carrés de 1 mm chacun, contenant du liquide
sur une hauteur de 0.1mm, soit un carré de 1 mm2. Son utilisation qui, à
priori, servait au comptage de cellules sanguines et de spermatozoïdes, nous
permet de déterminer la concentration de cellules dans un liquide (par ml).
Il est bien important qu’au moment de prélever l’échantillon, votre mélange
soit bien homogène et représentatif
74
Comptage de cellules avec un Hémacytomètre
Chambre de comptage de Neubauer

avec lamelle rodée (vue supérieure)
Observez les deux secteurs de
comptage en forme de croix
Représentation schématique d'une

chambre de Neubauer (vue de profil)
Photographie d'une chambre de en bleu: profondeur de la chambre
Neubauer (vue de profil)
Observez la hauteur (0.1 mm) entre
la chambre et la lamelle
75
Détermination du volume à prélever dans une suspension du départ pour faire le
passage (Savoir la dilution à effectuer).
Méthodes :
Une flasque de 25 cm2 (T25) 720000 cellules.
Le passage des cellules dans une nouvelle la flasque T25.
Pour cela :
 Il faut trypsiniser pour détacher les cellules et suspendre avec 3 ml du milieu

de culture.
 L’étape suivante c’est le comptage des cellules pour déterminer combien y a

t-il de cellules dans 1 ml.
M. BOURNINE L. 76
 Le comptage se fera avec une
méthode colorimétrique en
utilisant le bleu de trypan sur une
cellule de Neubauer de 9
rectangles.
Profondeur de la cellule:
0,1 mm Carrés de numération: 9
Grands carrés: 1 mm²
M. BOURNINE L. 77
Détail de la grille de la plaque de Neubauer
M. BOURNINE L. 78
Pour le comptage sous microscope inverse on va procéder de la
manière suivante
a) Coller la lamelle sur l’hématimètre, en humectant les deux bords de celui-ci avec
un petit chiffon légèrement humide, en faisant glisser la lamelle sur la largeur de
l’hématimètre et vérifier la bonne adhésion hématimètre – cellule.
b) Vérifier la propreté de la cellule sous le microscope.
c) Mélanger bien à l’intérieure du microtube et prendre avec la micropipette une

quantité suffisante pour remplir la cellule de Neubouer.
d) Laisser rentrer, par capillarité, une goutte de l'échantillon dilué entre l’hématimètre
et la lamelle. La goutte ne doit pas déborder dans les rigoles de l'hématimètre et elle
doit recouvrir complètement et d'un seul coup toute la surface quadrillée de
l'hématimètre et sans faire de bulles d’aire.
e) Mettre la cellule sous microscope avec l’objectif 10 et faire la mise au point ensuite
compter.
M. BOURNINE L. 79
M. BOURNINE L. 80
À l’aide du microscope inversé, compter
les cellules vivantes dans chaque grand
carré en veillant à ne compter qu’une seule
fois chaque cellule. Lorsque celles-ci sont
à cheval sur 2 carreaux, il est usuel de ne
compter que les cellules présentes sur les
bordures haute et gauche de chaque
carreau
Comptée
Pas Comptée
Nous on compte juste 4 rectangles , ensuite en va faire la moyenne
Nombre moyen de cellules comptées /1 carré x Facteur de dilution

Nombrededecellules
Nombre cellules/1/1ml
ml==
Surface d’un carré x Profondeur du carré
* mettre la suspension de 3 ml dans un tube à centrifuger de 5 ml.

* prendre un microtube à centrifuger de 2ml pour la dilution à effectuer.
* pour notre cas on prends 100 l de la suspension et 100 l du bleu de
trypan (dilution ½) et les mettre dans le microtube.
82
Microscope Inverse Analyse de la viabilité au bleu trypan
M. BOURNINE L. 83
Lors du dénombrement : nous avons compté 21, 19, 18, 24 dans chaque
des 4 rectangles et pour minimiser l’écart du chaque comptage il est
préférable de compter les autre 4 rectangles en haut dont les résultats
sont : 28, 31, 26, 25.
La moyenne des 4 premiers carrés : 20 et pour les quatres en haut : 27
Donc 20+27=47/2=23 (une moyenne de 23 cellules par carré)
Pour le nombre de cellules par ml = 23x 2 /1mm2 x 0,1mm = 46/0.1mm3
1mm3 = 10-3 ml donc 46/0.1 x 0.001 = 46x 10000 = 460 000

cellule/ml.
Le but de notre comptage c’est de déterminer comme bien de volume que

nous devons prélever de notre suspension de 3 ml pour avoir 720 000
cellules dans la nouvelle flasque.
84
1 ml 460 000 cell
X ml 720 000 cell donc
X = 720 000 / 460 000=1.56 ml
A partir de la suspension de 3 ml ( suspension mère) il

faut prélever 1.56 ml, les mettre dans la nouvelle flasque
de 25 cm2 et compléter par : 4.44 ml du milieu neuf pour
avoir un volume total de 6 ml dans la T25.
M. BOURNINE L. 85
 Comment entretenir l’hématimètre ?
a) Rincer la cellule et la lamelle à l’eau courante puis à l’alcool à 70 % (v/v).
b) Sécher la cellule et la lamelle avec un torchon sec, doux et non pelucheux
(éviter de la rayer).
 Principales sources d’erreurs
• Pipettes sales ;
• Cellule à numération non nettoyée et/ou non dégraissée ;
• Erreur de pipetage ;
• Erreur dans le choix de la pipette ;
• Temps non respectés ;
• Mauvaise homogénéisation ;
• Comptage dans une chambre de comptage desséchée ;
• Présence de bulles d’air dans la cellule ;
• Absorption du liquide en cas de débordement ;
• Mauvais réglage du microscope ;
• Erreurs de dilutions ;
• Erreurs de calculs ;
• Erreurs d’unités.
M. BOURNINE L. 86
L’adhérence cellulaire
Lignées cellulaires
M. BOURNINE L. 88
L’adhérence à un support est indispensable à la prolifération de

la plupart des types cellulaires issus des mammifères,
exception faite des cellules circulantes et de certaines cellules
transformées.
Les phénomènes adhésifs jouent un rôle fondamental dans la

plupart des étapes de la vie cellulaire (survie, prolifération,
migration, différenciation, activation) et des phénomènes
pathologiques (infections, maladies cadiovasculaires, évolution
des métastases cancéreuses, réactions inflammatoires).
M. BOURNINE L. 89
Dans les tissus la nature des molécules impliquées dans
l’adhérence sont :
 Des protéines membranaires appelées intégrines qui font

le relais entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette
(formation de points focaux d’adhérence).
 Les composants de la matrice extracellulaire,

glycosaminoglycanes (acide hyaluronique),
protéoglycanes (aggrégan, perlécan, syndécan…) et des
protéines (collagène, fibronectine, laminine, ténascine,
vitronectine …).
CAMs (Cell Adhesion Molecules), interaction cellule-cellule
SAMs ( Substrate Adhesion Molecules) interaction cellule-
matrice extracellulaire
M. BOURNINE L. 90
In vitro l’ancrage des cellules est indispensable à leur
prolifération.
Cet ancrage dépend des facteurs d’attachement cités ci-
dessus qui seront synthétisés par les cellules et apportés
dans le milieu de culture.
Il dépend également de la nature du support utilisé, ils sont

en général en plastique, polystyrène, traité physiquement
pour exposer des charges négatives.
M. BOURNINE L. 91
Le matériel
 Flacons
 En polystyrène optiquement clair stérile
 De contenance et surface variable par ex :
 Plaques multipuits
stérile
 Boites
 À fond plat et couvercle
 Nombre de puits et contenance stérile
variable
 6, 12, 24, 48, 96
 Diamètre allant de 35 à 150 mm
92
Le polystyrène est le plastique le plus largement utilisé, bien

que d'autres substrats tels que le polycarbonate, le
polytétrafluoroéthylène et polyvinyle sont également utilisées.
ces matières plastiques nécessitent un traitement par
irradiation ou par traitement chimiques pour produire une
surface chargée.
L’ adhérence cellulaire peut être fortement augmentée par

revêtement du substrat avec les composants de la matrice
extracellulaire (ECM).
M. BOURNINE L. 93
Facteurs d'attachement
 Les supports tapissés (« coatés ») avec un substrat

protéique constituent des surfaces de choix pour la culture
des cellules dont l’adhésion est difficile.
 Ils favorisent aussi la différenciation des cellules cultivées.

Certains facteurs d’attachement peuvent aussi être introduits
en solution dans le milieu de culture.
M. BOURNINE L. 94
- Poly-L-lysine: c’est une molécule synthétique présentant de
nombreuses charges positives. La poly-lysine amplifie l'interaction
électrostatique entre les ions négatifs de la membrane cellulaire et les
ions positifs de la surface cellulaire présents dans les facteurs de
fixation de la surface de la culture. Une fois adsorbée en surface des
cellules, elle augmente le nombre de sites chargés positivement
disponibles pour la fixation des cellules au support plastique
chargé négativement.
- Collagène: glycoprotéine fibreuse dont le rôle peut être comparé à une

armature. C’est une protéine structurale, les molécules de collagène
jouent le rôle de câble entre les cellules de notre corps et c’est la
protéine la plus abondante de l’organisme (notion de « colle »). Il est
secrété par les cellules des tissus conjonctifs.
M. BOURNINE L. 95
- Fibronectine : glycoprotéine qui contribue à l’organisation de la matrice
extracellulaire et à l’adhésion cellulaire. In vivo c’est une molécule-clé pour
l’adhérence des cellules à la matrice extracellulaire (les récepteurs de la
fibronectine sont notamment les intégrines). La fibronectine est également un
facteur limitant la prolifération tumorale. Les cellules métastatiques n’ont pas
de fibronectine qui se lient à leur membrane.
- Laminines : famille de glycoprotéines qui forment le constituant majeur de

la lame basale, en dehors du collagène. La lame basale est un assemblage
de protéines et glycoprotéines extracellulaires sur lequel reposent les
cellules épithéliales. Elle permet l'adhérence de la cellule épithéliale au tissu
conjonctif sous-jacent. Les molécules constitutives de la lame basale sont
sécrétées par les cellules épithéliales.
- Gélatine : Elle est obtenue par l'ébullition prolongée de la peau animale,

des os et des tissus conjonctifs. Elle est constituée à environ 98-99 % (en
poids à sec) de protéines. Elle est utilisée comme agent collant.
96
Facteurs du milieu et
surface d’adhésion
M. BOURNINE L. 98
99
100
M. BOURNINE L. 101
15-11-21 M. BOURNINE L. 102
103
M. BOURNINE L. 104
1. Les traitements des récipients commerciaux utilisés en culture
sont différents pour les cellules adhérentes sur support ou
maintenues en suspension
2. Les cellules en suspension ont une surface cellulaire plus

accessible et sont plus faciles à manipuler pour la production (pas
de détachement par digestion trypsique)
3. Les contacts cellules–cellules sont favorisés en suspension et se

font via les CAMs (Cell Adhesion Molecules), dont les cadhérines
dépendantes du Ca++
SAM ( Substrate Adhesion Molecules) interaction cellule- matrice
extracellulaire
4. Les liaisons cellules–cellules sont inhibées par l’EDTA:
Éthylène Diamine Tétra-Acétique qui chélate les ions bivalents
(Ca++, Mg++).
105
5. Chaque type de lignée ou culture primaire exprime les récepteurs

appropriés pour la phase d’attachement Récepteurs: SH GAGs
(glyco-amino-glycanes), intégrines, protéoglycanes
6. L’adhérence cellulaire se réalise en 4 étapes : adsorption de

fibronectine, liaison aux intégrines (court terme), interactions avec
les protéines de la matrice extracellulaire (ECM) et le cytosquelette
(long terme)
7. Les liaisons des cellules avec l’ECM in vitro sont rompues grâce à
la trypsine qui clive spécifiquement certains liens peptidiques
M. BOURNINE L. 106
Remarque : Certaines cellules ne nécessitent pas d’ajouter une molécule d’adhésion cas des
fibroblastes (sécrètent de la fbronectine). D’autres cas SVF dans le milieu de culture: 3µg/ml de
fibronectine
Caractérisation
M. BOURNINE L. 108
Caractérisation
M. BOURNINE L. 109
Caractérisation
110
Caractérisation
M. BOURNINE L. 111
Méthodes physiques de séparation cellulaire
112
Méthodes physiques de séparation cellulaire
M. BOURNINE L. 113
114
M. BOURNINE L. 115
M. BOURNINE L. 116
117
M. BOURNINE L. 118
119

L3 Biochimie Culture Cellulaire Chapitre 02

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M.

Maitre de conférences A - Faculté SNV/ST

 obtention au départ de quelques cellules animales indemnes de cellules

 développement de milieux de culture adaptés à ce type de cellules ;

 possibilités de les observer et suivre leur développement (microscopes);

 pouvoir propager de telles cellules en culture en continu in vitro

 et de les conservées indemnes d’autres agents biologiques

PBMCs => Peripheral Blood Mononuclear Cells

*Prélèvement cutané (fibroblastes)

1. Recueil du prélèvement dans un tube contenant du milieu

*taille du prélèvement : taille idéale = 1 cm3 (mais parfois petites biopsies)

*prélèvement cutané : privilégier un prélèvement profond jusqu’à l’aponévrose

*tumeur : éliminer les zones de nécrose, les caillots sanguins

* ne jamais laisser un prélèvement à sec; à défaut de milieu de transport : à

Noter l’aspect, la taille

Le milieu de transport est parfois conservé (voir étape 8)

Obtention de fragments les plus

5. Incubation 16 à 72 heures à 37°C dans

2. Aspiration et élimination du surnageant

Les cellules en suspension

Estimation visuelle de la croissance cellulaire: atteinte de la phase exponentielle

Prise de décision : arrêt de la culture et récolte des métaphases et/ou

 Le repiquage des cultures cellulaires

 Lavage du tapis cellulaire (PBS)

 Détachement des cellules par action enzymatique

1ère phase = phase de latence

2ème phase = phase exponentielle

3ème phase = phase stationnaire

4ème phase = poursuite de la croissance cellulaire

Phase exponentielle Phase stationnaire

1 contrainte majeure : la stérilité microbienne

Pendant la phase exponentielle les cellules sont distribuées de

La culture cellulaire est donc un ensemble hétérogène de cellules

 Cryoconservation des cellules

 Cellules peuvent être congelées

 Éviter les passages trop nombreux = vieillissement de la

 Cryoconservateur: DMSO, glycérol

Effets invisibles, produits difficiles à détecter

Effets généralement visibles, facile à détecter Modification

Détection de mycoplasme: * marquage de l’ADN des cellules avec du Hoechst

 Eviter les contaminations

Moyens de lutte contre les contaminations

• Environnement et surfaces propres

 Eviter les contaminations

Moyens de lutte contre les contaminations

Maintenir la stérilité des cultures et des milieux

 Trouver les conditions de culture optimales

Les cellules ne meurent pas Sont

 Trouver les conditions de culture optimales

 Efficacité d’ensemencement (dilution de la culture et formation de colonie)

 Expression de fonctions spécifiques

Paramètres de l’environnement à contrôler: Le milieu de culture

• Doit reproduire plus ou moins le milieu extra-cellulaire de l’organisme

• La multiplicité des lignées cellulaires, la diversification de leur origine, les

• Par opposition aux liquides biologiques (lymphes, extraits

• Ils contiennent un grand nombre de constituants parfaitement définis :

• Ces ingrédients de pureté au moins équivalente aux exigences des

• Prêts à l’emploi ou sous forme de poudre concentrée. On ajoute pour

 Trouver les conditions de culture optimales

Paramètres de l’environnement à contrôler: Le milieu de culture