Production de Métabolites Par Les Levures: Caractérisation Et Identification Des Arômes Et Des Alcools
Production de Métabolites Par Les Levures: Caractérisation Et Identification Des Arômes Et Des Alcools
Production de Métabolites Par Les Levures: Caractérisation Et Identification Des Arômes Et Des Alcools
Présentée par :
Le travail présenté dans cette thèse de doctorat a été effectué, en grande partie,
dans le Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, au sein de
l’EAD5 dirigée par le professeur Jean-Marie FRANÇOIS, à qui j’exprime ma
reconnaissance pour m’avoir accueillie au sein de son équipe de recherche et d’avoir
mis à ma disposition tous les produits et matériaux nécessaires à la réalisation de ce
travail. Merci pour son enthousiasme et son intérêt pour ce projet. J’ai beaucoup
appris auprès de lui et de son équipe et j’ai bénéficié de sa compétence, et de sa
patience contagieuse pour la recherche.
Ma plus profonde gratitude à Marie-Ange TESTE qui m’a été d’une aide
précieuse et considérable. Sa gentillesse et sa disponibilité constantes ont participé au
bon déroulement de ce travail.
Une pensée très particulière à Ceren ALKIM avec qui j’ai partagé mes joies, mes
déceptions et mes nuits blanches au laboratoire.
Et enfin, j’adresse mes remerciements, et pas des moindres, à ceux qui ont
toujours été là pour moi, qui m’ont soutenue quand le moral n’allait pas ou lorsque je
n’avais plus d’énergie pour continuer, ma petite famille: mon époux et mes deux chers
enfants, Mimi et Ramzi qui ont beaucoup pris sur eux pendant mon absence, merci
mes deux petits cœurs. Je vous aime et vous aurez toujours une très grande place dans
mon cœur.
RESUME
L’objet de cette thèse avait pour but l’isolement des levures à partir de biotopes algériens et
la caractérisation des souches qui possèdent des capacités intéressantes en termes de bio
productions. La taxonomie moléculaire sur la base des séquences du domaine D1/D2 de
l’ARN ribosomique 26S des isolats a aboutit à neuf espèces différentes. Notre étude s’est
concentrée sur cinq espèces: Clavispora lusitaniae, Hanseniaspora uvarum, Kodamaea
ohmeri, Issatchenkia orientalis et Trichosporon asahii qui proviennent de biotopes
particuliers et sont très peu étudiées. L’étude des caractéristiques physiologiques a permis
de sélectionner la souche d’Issatchenkia orientalis (connu également sous le nom de Pichia
kudriavezii) qui possède des potentialités importantes en production et résistance à
l’éthanol qui en plus de sa résistance à de multiple stress comme les stress thermique, salin,
osmotique et pH en fait une candidate idéale pour l’intensification de la production du
bioéthanol.
Cette étude a également porté sur le profil d’accumulation des alcools supérieurs chez ces
souches cultivées sur milieu glucosé en absence et en présence d’excès en acides aminés:
leucine, isoleucine et phénylalanine. Elles ont révélé une production importante de
différentes molécules en particulier une production entre 250 et 300 mg/L du 2-
méthylbutanol chez Clavispora lusitaniae, de 400 mg/L en 3-méthylbutanol pour la souche
Kodamaea ohmeri. Quand à la souche I. orientalis, elle a montré une production
remarquable en 2-phényléthanol avec une concentration très proche des 1000 mg/L
représentant pratiquement le double de la concentration donnée par la souche contrôle S.
cerevisiae CEN.PK122-2N. De plus, ce niveau de production très élevé du 2-phényléthanol
par I. orientalis est corroboré par une grande résistance de cette levure à cet alcool
supérieur allant à une concentration de 5 g/L. Cette dernière représente le double de la
concentration à laquelle résiste la souche de référence S. cerevisiae.
This study was designed for the isolation of yeasts from Algerian habitats and
characterization of strains that possess valuable capabilities in terms of bioproduction. The
molecular taxonomy based on the sequences of the D1/D2 domain of the 26S ribosomal RNA
of the isolates results in nine different species. Our study focused on five of them: Clavispora
lusitaniae, Hanseniaspora uvarum, Kodamaea ohmeri, Issatchenkia orientalis and
Trichosporon asahii that come from specific habitats and are poorly studied at the
physiological level. The study of physiological characteristics was used to select the
Issatchenkia orientalis strain (also known as Pichia kudriavezii) that has significant potential
in ethanol production. This potential, together with its resistance to multiple stresses such as
heat, pH, salt, osmotic and ethanol stress, makes this species an excellent candidate for the
intensification of production of bio-ethanol.
This study also concerned the profile of accumulation of superior alcohols to these selected
yeast species cultivated on a glucose media in the presence of excess amino acids leucine,
isoleucine, phenylalanine. This study showed an important production of various
biomolecules in particular a production of 2-methylbutanol ranging 250 and 300 mg/L by
Clasvispora lusitaniae, of 400 mg 3-methylbutanol by Kodamaea ohmeri. Remarkably, the
Issatchenkia orientalis species exhibted a remarkable production of 2-phenylethanol to up
1000 mg/L, which was about 2 times higher than that obtained by the control
Saccharomyces cerevisiae strain CEN.PK122-2N. Furthermore, this higher PE production by
Issatchenkia orientalis corroborated with a high resistance of this yeast species to this
superior alcohol that can go up to 5 g/L 2-phenylethanol, which is two times higher than that
obtained for S. cerevisiae.
ٌهذؾ هزا انعمم نعضل خمبئش مه عذة مىبطق خضائشٌت و ححذٌذ هىٌت انسالالث انمخحصم عهٍهب و
دساست أهمٍخهب انبٍىحكىىنىخٍت
إن االعخمبد عهى بٍىنىخٍب اندضٌئبث ـً حصىفٍهب بذساست انمدبل D2/D1نهحبمط انشٌبً ،26Sبٍه
أن هزي انسالالث حىخمً نخسعت أخىبط مخخهفت مه انخمبئش .ؼٍش أن دساسخىب انمعمقت حشكضث عهى خمست
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Issatchenkiaو Trichosporon asahiiو انخً عضنج مه بعط انمىبطق اندضائشٌت راث طببع خبص نم
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اإلٌثبوىل ببإلظبـت إنى مقبومخهب نخأثٍش انحشاسة ،انمهىحت ،األسمىصٌت انعبنٍت و انحمىظت ممب ٌششحهب
السخعمبنهب ـً اوخبج اإلٌثبوىل انبٍىنىخً.
نقذ خصص خضء كبٍش مه هزي انذساست نخحذٌذ وىعٍت انكحىالث انمىخدت مه قبم هزي انسالالث و رانك
بعذ حىمٍخهب عهى وسط ٌحخىي عهى انؽهكىص ـً وخىد او ؼٍبة ـبئط مه األحمبض األمٍىٍت
انخبنٍت leucine, isoleucine :و .phénylalanineإن انىخبئح انمخحصم عهٍهب بٍىج بأن انسالالث حمخهك
Clavispora lusitaniaeاوخدج مب بٍه 250و خصبئص عبنٍت ـً إوخبج عذة خضٌئبث مثال انسالنت
300مػ/ل مه 2-méthylbutanolوانسالنت 400 Kodamaea ohmeriمػ/ل مه 3-méthylbutanolأمب
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S. cerevisiae حشكٍضي .1000مػ/ل أي مب ٌعبدل ظعؿ انكمٍت انمىخدت مه قبم انسالنت انمشخعٍت
.CEN.PK122-2N
5غ/ل اي مب ٌعبدل اظبـت انى رنك حمخبص هزي انسالنت بمقبومخهب نكمٍت عبنٍت مه هزا انكحىل حصم انى
ظعؿ انكمٍت انخً حخحمههب انسالنت انمشخعٍت.
SOMMAIRE
RESUME ................................................................................................................................... 3
SUMMARY .............................................................................................................................. 4
RESUME EN ARABE ............................................................................................................. 5
INTRODUCTION GENERALE ......................................................................................... 10
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ............................................................................................ 13
1-Morphologie ..................................................................................................................... 16
1.1-La forme levure ....................................................................................................... 16
1.2- La forme pseudomycélium .................................................................................... 16
1.3- La forme mycélium ............................................................................................... 17
2- Structure cellulaire de la forme levure ............................................................................ 17
2.1- La paroi ................................................................................................................... 18
2.2- L’espace périplasmique .......................................................................................... 18
2.3- La membrane plasmique.......................................................................................... 18
2.4- Le cytoplasme .......................................................................................................... 19
2.5- Le noyau et le réticulum endoplasmique ................................................................. 19
3- Les exigences nutritionnelles .......................................................................................... 20
4- Métabolisme .................................................................................................................... 21
4.1- Métabolisme oxydatif .............................................................................................. 21
4.2- Métabolisme fermentaire ......................................................................................... 22
4.3- Métabolisme oxydo-réductif .................................................................................. .22
4.4- Métabolisme des monosaccharides ......................................................................... 23
4.5- Métabolisme des di- et tri-saccharides .................................................................... 24
4.6- Métabolisme des pentoses ...................................................................................... 25
4.7- Métabolisme des polysaccharides. ......................................................................... 27
4.8- Le transport des sucres .......................................................................................... 28
4.9- Le transport des ions ammonium .......................................................................... 28
4.10- Le transport des acides aminés ............................................................................. 29
4.11-Le transport des peptides et des polypeptides ...................................................... 30
5-Facteurs influençant le comportement des levures ......................................................... 31
5.1- Effet de la température ........................................................................................... 31
5.2- Effet du pH ............................................................................................................. 31
5.3- Effet de la pression osmotique et l’activité de l’eau ................................................ 32
5.4- Effet de l’oxygène et du dioxyde du carbone ......................................................... 32
5.5- Effet de la concentration d’éthanol ........................................................................ 33
5.6- Effet de l’acide acétique .......................................................................................... 33
Les levures sont des acteurs essentiels intervenant dans divers domaines et l’intérêt qu’elles
suscitent aujourd’hui est dû à leur grande diversité. Un grand nombre de levures
communément utilisées en biotechnologie a été obtenu à partir d’habitats naturels où elles
ont développé une faculté d’adaptation à un grand nombre de niches écologiques grâce à
leurs propriétés physiologiques très caractéristiques. L’ingénierie de ces levures a donc
trouvé dans l’industrie de la fermentation un champ d’application privilégié pour produire
divers métabolites comme les arômes et l’éthanol.
L’éthanol est un produit chimique industriel important pouvant avoir plusieurs destinées en
industrie chimique, pharmaceutique, cosmétique, etc. Aujourd’hui, il possède de nouveaux
potentiels en tant que biocarburant. Le bioéthanol grâce à ses propriétés physico-chimiques
compatibles avec l’essence, représente une alternative très prometteuse aux énergies
fossiles, couteuses et très polluantes. Grâce à leur capacité fermentaire, les levures
produisent cet alcool à partir de sucres qui peuvent être obtenus soit à partir de biomasse
sucrée (canne à sucre, betterave sucrière, etc.) ou amylacée (maïs, pomme de terre, manioc,
etc.), soit à partir de biomasse lignocellulosique (herbe, résidus agro-forestiers, bois, etc.).
Elles sont générées par les activités agricoles et agro-industrielles, c’est le cas par exemple
de la palmeraie algérienne, qui constitue le pivot de l’écosystème oasien par l’importance de
sa production et qui génère à chaque compagne des quantités importantes de déchets. La
valorisation de ces déchets, permet d’alimenter le marché national par des substances à
forte valeur ajoutée, en particulier l’alcool éthylique, substance énergétique stratégique et
base de nombreuses industries (Kaidi et Touzi, 2001). La production du bioéthanol à partir
de cette filière présente un très grand intérêt vu la diversité et la disponibilité des ressources
et la possibilité d’éviter la concurrence entre les usages alimentaires et énergétiques.
Mais comme dans tout procédé biotechnologique, il faut veiller à éviter les inhibitions par
les substrats utilisés et les métabolites produits. Or, l’inhibition par l’éthanol produit est un
frein majeur à l’obtention d’un titre et d’une productivité élevée en éthanol. La littérature
qui nous donne des pistes sur les perturbations cellulaires engendrées par l’éthanol et sur les
changements physiologiques et moléculaires mis en place par la levure en réponse à la
présence d’éthanol dans son environnement, précise que l’utilisation de Saccharomyces
cerevisiae a été fortement relancée suite au contexte économique et écologique actuel. Cet
organisme eucaryote unicellulaire et non-pathogène pour l’homme représente un modèle
expérimental avec de nombreux avantages dont la petite taille de son génome, sa facilité à
le manipuler génétiquement, la disponibilité de la séquence de son génome en 1996 et une
abondante littérature sur sa génétique et physiologie.
10
Introduction générale
Les arômes produits par les levures, constituent un élément important dans l’élaboration de
nombreux aliments en conférant à ces derniers leurs propriétés organoleptiques. Leur
marché est en plein essor afin de répondre aux demandes des consommateurs qui sont de
plus en plus attentifs à leur santé et à la composition de leurs aliments. Ces consommateurs
exigent des arômes dont l’innocuité est garantie et qui peut être satisfaite par les arômes
produits par voie microbiologique, en particulier par les levures.
Cependant ces métabolites, comme l’éthanol, deviennent des facteurs de stress importants
car ils s’accumulent dans le milieu de culture et inhibent la croissance des levures ainsi que
leur viabilité (Hu et al., 2007), ce qui diminue leurs rendements (Pina et al., 2004) et affecte
sérieusement les entreprises industrielles. L’étude et la maîtrise de la tolérance à ces
produits ont donc des intérêts économiques pour ces derniers. Cette problématique qui est
un sujet crucial pour la biotechnologie constitue notre deuxième objectif. De ce fait, la
recherche des souches à partir de divers biotopes algériens non encore exploités peut
répondre à ces contraintes. C’est dans ce contexte que s’intègre le présent travail dans
lequel les levures ont été isolées à partir des échantillons biologiques provenant de
différents biotopes. La capacité fermentaire et de production ainsi que leurs pouvoirs de
résistance ont été également étudiés.
Dans ce manuscrit, la première partie présente une étude bibliographique divisée en deux
chapitres distincts. Le premier rapporte des données générales sur les levures à l’échelle
structurale et physiologique. Le deuxième portera sur l’utilisation des levures de manière
très restreinte et se focalisera plus précisément sur les deux métabolites étudiés: l’éthanol et
les arômes.
La deuxième partie est consacrée aux matériels et aux protocoles expérimentaux mis en
place pour la réalisation de ce travail de thèse.
La troisième partie représente et discute l’ensemble des résultats obtenus à la suite de cette
étude.
Nous terminons par une conclusion générale et en envisageant les perspectives possibles à
la poursuite de ce travail.
11
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Etude Bibliographique
Les levures, champignons unicellulaires pour tout ou une partie de leur cycle végétatif,
forment un groupe très hétérogène. Il existe des formes intermédiaires entre levures et
champignons supérieurs typiques qui rendent leur distinction avec les champignons
filamenteux très subjective (Kreger-Van-Rig, 1984). Certaines levures ont une reproduction
sexuée qui correspond à une phase de leur cycle biologique où on note une alternance des
phases haploïde et diploïde. Le bourgeonnement qui est le mode de reproduction végétatif
le plus fréquent, est représenté par une évagination qui apparaît à un point de la cellule
mère. Le bourgeon grandit peu à peu en formant une nouvelle cellule qui se détache de la
cellule mère. Deux autres modes de reproduction végétative peuvent être rencontrés: la
fission, caractéristique du genre Schizosaccharomyces, qui se manifeste par la formation
d’une paroi transversale au grand axe de la levure et le bourgeonnement sur stérigmates,
propre au Sterigmatomyces, où la cellule fille prend naissance sur une protubérance formée
sur la cellule mère.
Ces micro-organismes ubiquitaires (Phaff et al., 1978 et Bonaly, 1990) peuvent coloniser
l’air, le sol, l’eau (Lo Presti et al., 2001), le tube digestif de certains animaux et les galeries
d’insectes (Rose et Harrison, 1987 ; Lachance et al., 1998 ; Lachance et al., 2001 et Lachance
et al., 2006). Certaines levures ont été isolées à partir d’environnements extrêmes comme
celles isolées à partir de l'Antarctique (Satyanarayana et Kunze, 2009). D’autres vivent
principalement sur les végétaux riches en sucres, dans les liquides sucrés, ou dans des
aliments tels que le pain et les céréales (Rocco et al., 1985). Les levures utilisatrices de
lactose se rencontrent ainsi dans les produits laitiers (Baroiller et Schmidt, 1990).
Les levures des produits alimentaires n’étant pas pathogènes, elles ne causeront pas
d’intoxication alimentaire mais peuvent produire par leur développement des altérations de
la qualité marchande de ces aliments (Rambaud, 2004). Enfin un petit nombre de levures
pathogènes sont à signaler, tout spécialement Candida albicans responsable du muguet des
jeunes enfants, des vaginites, etc. et Cryptococcus neoformens disséminé par les pigeons et
qui peut provoquer des méningites fatales (Koenig, 1995 ; Senet, 1995 ; Odds, 1995 et Hart
et Shears, 1997).
En se basant sur cette large distribution des levures, différents produits provenant de
différents biotopes algériens ont été choisis pour leur isolement:
Les dattes
Les dattes, famille des Palmacées, sont des fruits charnus, de 4 à 6 cm de long avec un
noyau allongé. Elles sont jaunes, oranges, rouges ou même brunes lorsqu’elles arrivent à
13
Etude Bibliographique
maturité. Elles sont très énergétiques avec une valeur de 287 Kcal/100 g et très riches en
sucre (glucose, fructose et saccharose), en sels minéraux (potassium, calcium, magnésium et
fer) et en vitamines, en particulier les vitamines B 2, B3, B5 et B6. Leur richesse en fibres est
très importante. Par contre, elles sont pauvres en protéines (4 à 6%) et leur teneur en eau
est de 20% pour les dattes sèches et de 70% pour les dattes fraîches. Elles sont très
appréciées pour leur forte concentration en antioxydants (principalement les caroténoïdes
et les composés phénoliques) et leur pauvreté en matières grasses. Ils existent au moins
1200 variétés de dattes en Algérie. Les trois variétés choisies sont parmi les plus
consommées en Algérie à cause de leur consistance et de leurs multiples destinées: Deglet-
Nour est destinée à la consommation, Gharas pour la pâtisserie et Hamira pour la confiture
(Matallah, 2004).
Le melon
C’est un fruit savoureux, sucré et parfumé, très consommé en Algérie. Le cantaloup,
variété possédant une note parfumée très prononcée, a été utilisé pour l’isolement. Il
constitue de plus une source importante de sels minéraux en particulier le potassium. Il est
également très riche en antioxydants, majoritairement des caroténoïdes qui représentent
85% et qui lui confèrent sa couleur rouge-orangée ; ainsi que certains composés
phénoliques, des superoxyde-dismutases et différentes vitamines comme la vitamine A et C
(Lester et Crosby, 2004).
Le cornichon
Le cornichon, proche du concombre, présente les mêmes caractéristiques nutritionnelles.
Il contient des vitamines, des fibres et des minéraux en particulier le sodium (700mg/100g),
dû au sel utilisé pour le dégorger. Il reste un condiment très apprécié pour son léger piquant
qui ne prend pas le dessus sur les notes aromatiques et acidulées pour lesquelles il a été
choisi.
Le lait
Le lait, liquide biologique de couleur blanchâtre légèrement visqueux, constitue un
aliment très riche dont la composition et les caractères physico-chimiques varient
sensiblement en fonction de plusieurs facteurs tels que l’espèce et la race animale, la région
et la saison. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi différentes régions et animaux
pour la récolte de nos échantillons. Le lait est un mélange très complexe et très instable qui
contient principalement des protides, des glucides (lactose) et très peu de lipides. Les
éléments minéraux sont très variés puisqu’il contient du calcium, du magnésium, du
phosphore et du sodium, et d’autres oligoéléments comme le fer, le fluor et le zinc. Son
profil vitaminique est très riche et est représenté par la vitamine A, D et les vitamines du
groupe B.
Le lait de brebis est plus riche que le lait de vache puisqu’il contient plus de matière grasse et
de matière azotée avec des teneurs en lactose et en sels minéraux plus élevées.
14
Etude Bibliographique
Le miel
Le miel est une solution saturée en sucres principalement le glucose et le fructose (en
plus du maltose, du saccharose et d’autres polysaccharides). Il est très riche en vitamines,
essentiellement les vitamines B1, B2, B3, B5, B6, C et accessoirement les vitamines A, B8, B9, D
et K. Il est très apprécié pour son effet antibactérien.
D’autres composants sont présents comme les flavonoïdes, les arômes, les grains de pollen,
les acides organiques, les sels minéraux et les protides où on note un très grand nombre
d’acides aminés. Cet échantillon, choisi pour sa richesse en différents sucres, a été récolté de
la région de Mostaganem très riche en flore. A notre connaissance aucune étude
microbiologique n’a étudié la nature des levures de ce produit, d’où son choix pour cette
étude.
1- Morphologie
La morphologie des levures est très variée. On distingue trois formes: la forme levure, le
pseudomycélium et le mycélium.
15
Etude Bibliographique
16
Etude Bibliographique
2.1- La paroi
C’est une structure dynamique externe qui englobe toute la cellule conférant sa rigidité et
sa forme caractéristique. Elle représente 15 à 20% de la matière sèche de la cellule,
d’épaisseur 150 à 230 nm. Sa composition chimique qui est sujette à des variations
importantes suivant les espèces, le cycle cellulaire et les conditions de culture (Aguilar-
Uscanga et François, 2003) comprend environ 80% de polysaccharides principalement des
mannanes (Peat et al., 1961 ; Gorin et al., 1969 et Mc Ellan et Lampin, 1969) et des glucanes
(Bacon et al., 1969 et Manners et masson, 1969) en proportion quasi égales, 10 à 20% de
protéines, 7 à 10% de lipides, 5% de sels minéraux et 1 à 3% de chitine qui se trouve
majoritairement au niveau des cicatrices de bourgeonnement afin de maintenir l’intégrité de
la paroi (Suarit et al., 1988 et Lipke et Ovalle, 1998). La couche intérieure de la paroi est en
grande partie responsable de sa force mécanique et fournit aussi les sites d'attachement pour
les protéines qui forment sa couche extérieure (Klis et al., 2002). Cette structure joue un rôle
important en maintenant une structure élastique qui assure une protection osmotique et
constitue une barrière physique.
17
Etude Bibliographique
intermédiaire de la biosynthèse des stérols. Ces derniers qui sont soit libres soit estérifiés
avec un acide gras augmentent la rigidité de la membrane et diminuent sa perméabilité
(Bayley et Parks, 1975). Les phospholipides, qui sont intimement associés aux protéines et
aux stérols, assurent à la membrane sa fluidité permettant ainsi le bon fonctionnement des
processus métaboliques.
2.4- Le cytoplasme
Le cytoplasme renferme en plus des organites cellulaires tels que les mitochondries (qui
contiennent des ADN, ARN, ARN polymérase et des enzymes respiratoires) et l’appareil de
Golgi, des vacuoles (où se trouve le pool des acides aminés en plus des purines, des
orthophosphates polymérisés et des hydrolases) et des ribosomes. Il contient également des
enzymes, notamment celles de la glycolyse et de la fermentation alcoolique, des
polysaccharides, des polyphosphates, du glycogène et du tréhalose (Larpent, 1991).
Le nombre des chromosomes varie selon les espèces, pouvant atteindre 3 chez
Hansenula holstii, 2 chez H. anomala et 16 chez S. cerevisiae haploïde. Chez cette dernière,
le génome comporte environ 12,5 millions de paires de bases qui ont été entièrement
séquencées en 1996 dans le cadre d’un travail international qui a pris environ 8 années en
utilisant les technologie standard de séquençage par la méthode Sanger (Goffeau et al.,
1996). Depuis, beaucoup d’autres levures ont été séquencées utilisant de technologies
nouvelles de séquençage (Souciet et al., 2009). On estime que la levure S. cerevisiae partage
23% de son génome avec l’homme, raison pour laquelle elle est utilisée comme organisme
modèle en biologie moléculaire et en génétique. Les levures peuvent être haploïdes,
diploïdes ou polyploïdes. La polyploïdie est fréquente chez les souches industrielles. Ceci en
plus des plasmides, petite molécule cyclique à ADN en double brin possédant 6Kpb qui est
un élément extra chromosomique présent chez presque toutes les souches de S. cerevisiae
(Guerineau et al., 1971). Le rôle de ce plasmide, 2µm, localisé dans le noyau de la levure à
raison de 60 copies (Livingston, 1977) n’est pas très bien connu. En revanche il est très utilisé
en tant que vecteur au cours des transformations (Broach, 1982).
18
Etude Bibliographique
Les composés carbonés sont d’une grande importance pour les levures puisqu’elles
fournissent, le carbone nécessaire pour la biosynthèse de constituants cellulaires et l’énergie
nécessaire à son fonctionnement. Les glucides sont les plus fréquemment utilisés, en
particulier les monosaccharides comme les hexoses, les disaccharides et les trisaccharides.
D’autres glucides abondants et peu couteux comme les pentoses et les polysaccharides ont
fait l’objet de nombreux travaux ces dernières années (Waldron, 2010). Cependant, d’autres
composés carbonés peuvent être utilisés tels que les alcools, les acides ou les composés
moins oxygénés comme les hydrocarbures. On peut citer à titre d’exemple les alcanes qui
sont utilisés principalement par les levures du genre Candida (Lévi et al., 1979). Mais aucune
levure n’est capable d’utiliser le méthane contrairement au méthanol qui est métabolisé par
plusieurs genres tels que Candida, Hansenula, Pichia et Torulopsis (Veenhuis et al., 1983).
Les sources de carbone pouvant être utilisés par les levures sont résumées dans le tableau 1.
Tableau 1: Les sources de carbone pouvant être utilisées par les levures
(Modifié de : Walker et White, 2005)
19
Etude Bibliographique
L’azote est le deuxième constituant important, jouant un rôle capital puisqu’il entre dans la
composition de plusieurs molécules, essentielles au fonctionnement cellulaire allant des plus
simples comme les acides aminés, les sucres aminés, les nucléotides, les coenzymes et les
vitamines jusqu’aux macromolécules, telles que les protéines, les acides nucléiques et la
chitine (Sanchez, 2008). La plupart des levures sont capables d’utiliser les sources azotées
minérales simples sous forme d’ion ammonium qui sont apportés dans le milieu par le
chlorure d’ammonium, le nitrate d’ammonium, le phosphate d’ammonium et surtout le
sulfate d’ammonium, meilleur composé car il apporte en même temps du soufre nécessaire
à la synthèse de certains acides aminés. L’azote peut être apporté également par des
composés organiques divers tels que les acides aminés, les peptides ou des polypeptides
dont la taille nécessite pour leur utilisation une hydrolyse par des peptidases intracellulaire.
Certaines levures, en particulier les Hansenula, Pachysolen, Citeromyces et certaines espèces
de Candida et de Trichosporon, sont capables d’utiliser les nitrites et les nitrates.
Généralement, les espèces qui utilisent les nitrates utilisent les nitrites, mais l’inverse n’est
pas toujours vrai, ainsi Debaryomyces hansenii et Pichia pinus utilisent les nitrates mais pas
les nitrites. Chez Brettanomyces bruxellensis et B. intermedius, l’utilisation des nitrates est
une caractéristique stable au moins à l’intérieur de l’espèce ce qui en fait un outil utilisé à
des fins taxonomiques (Lodder, 1970 ; Kreger Van Rij, 1984 et Moore et al., 1988). Enfin
l’urée en association avec la biotine et les bases puriques et pyrimidiques peut aussi être
utilisée comme source d’azote.
4- Métabolisme
Le métabolisme des levures est orienté par la source carbonée et les conditions
environnementales pour être : oxydatif, oxydo-réductif ou fermentaire. La voie de
dégradation des glucides, la glycolyse, convertit les sucres en pyruvate. L’entrée dans cette
voie varie selon le glucide tandis que la destinée du pyruvate dépend à la fois du sucre utilisé
et de l’espèce de levure considérée (Marden, 2007).
20
Etude Bibliographique
21
Etude Bibliographique
Ces sucres sont utilisés par toutes les levures et leur catabolisme laisse distinguer: les
levures à métabolisme uniquement respiratoire où le pyruvate formé à partir de ces sucres
est oxydé par le cycle de Krebs et les levures à métabolisme aéro-anaérobie où l’utilisation
des sucres se fait par la voie de la glycolyse qui a lieu dans le cytosol (voie d’Embden-
Meyerhof). En anaérobiose, ces sucres sont métabolisés en éthanol et en dioxyde de
carbone. La concentration des sucres n’a pas d’effet sur ce métabolisme. En revanche, en
aérobiose, la concentration de ces sucres est importante et peut inhiber chez certaines
levures la respiration. Le métabolisme est alors orienté vers la voie fermentaire même en
présence d’oxygène. C’est ainsi que la respiration et la fermentation contribuent à la
dégradation de ces sucres. On peut alors distinguer quatre phases:
22
Etude Bibliographique
Quand l’éthanol est épuisé, la croissance s’arrête et les cellules entrent en phase
stationnaire.
Ainsi les monosaccharides obtenus après hydrolyse sont utilisés par la levure comme
décrit précédemment.
4.5.1- Le lactose : est un disaccharide formé d’unité de galactose lié en β-1,4 à une
unité de glucose. Son hydrolyse conduit donc au galactose qui entre dans la voie
métabolique citée précédemment en faisant intervenir trois enzymes: kinase, transférase et
épimérase.
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Etude Bibliographique
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Etude Bibliographique
2011 ; Xu et Lou, 2012 ; Jayapal et al., 2013 et Zheng et al., 2013). La production du
bioéthanol à partir du xylose présent dans cette biomasse représente donc un enjeu
économique important puisque cette biomasse est renouvelable (Ragauskas et al., 2006). Le
L-arabinose est également présent dans les hydrolysats lignocellulosique, bien que moins
abondant. C’est ce qui a conduit ces dernières années, de nombreux chercheurs à s’orienter
vers ces glucides abondants et peu couteux. Ces deux pentoses (D-xylose et L-arabinose)
entrent dans la voie des pentoses phosphate après leur conversion en D-xylulose (figure 3)
et l’utilisation du xylose serait due à une xylitol deshydrogenase (Wenger et al., 2010).
Certaines souches de Saccharomyces cerevisiae peuvent pousser sur xylose comme seule
source de carbone, mais aucune n’est capable de le fermenter aussi efficacement que le
glucose (Attfield et Bell, 2006). Seul le xylulose, isomère du xylose peut être fermenté par
Saccharomyces cerevisiae. De nombreuses stratégies d’ingénierie métabolique ont été
employées au cours de ces années pour créer des souches de levures capables de fermenter
ces deux pentoses. Des enzymes hétérologues de la voie métabolique du xylose ont été
introduites chez S. cerevisiae (Kotter et al., 1990, Kuyper et al., 2003 et Kuyper et al., 2004).
Des efforts ont été également faits pour améliorer ou ajuster les activités enzymatiques de la
voie métabolique du xylose (XR, XK et XDH) (Jeffries et Jin, 2004 ; Toivari et al., 2004 et Van
Maris et al., 2007), le flux de la voie des pentoses phosphate (Jeppsson et al., 2002), ou
accroître l’utilisation du xylose par évolution dirigée ou mutagénèse aléatoire (Sonderegger
et Sauer, 2003 et Ni et al., 2007). Des méthodes d’ingénierie évolutive sont utilisées pour
améliorer la conversion de ces deux sucres en éthanol (Garcia-Sanchez et al., 2010 ;
Okamoto et al., 2012 et Kim et al., 2013).
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Etude Bibliographique
26
Etude Bibliographique
4.7.2- Glycogène : est un polymère formé d’unités de glucose liées en α-1,4 (pour les
chaînes principales) et des liaisons α-1,6 entraînant la structure ramifiée de ce
polysaccharide. C’est sous cette forme que certaines espèces, comme Saccharomyces
cerevisiae, stockent le glucose. C’est un sucre de réserve très important utilisé lors des
conditions stressantes.
Le transport du xylose est assuré par deux systèmes de forte affinité et un de faible affinité
qui consiste en une diffusion facilitée (Gardonyi et al., 2003). Chez S. cerevisiae, le xylose est
transporté par les transporteurs d’hexoses mais avec une affinité moins forte que pour le
glucose, en plus le transport du xylose est inhibé par ce dernier (Saloheimo et al., 2007). En
revanche, le système de transport du L-arabinose est totalement différent de celui du xylose
malgré la ressemblance de leur catabolisme comme il a été démontré par Fonseca et ses
collaborateurs. Les deux transporteurs caractérisés sont très spécifiques à l’arabinose
(Fonseca et al., 2007).
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Etude Bibliographique
0.2 et 2 mM respectivement). Ils ont également montré que ce transport s’effectue par
l’intermédiaire d’un uniport électrophorétique accumulatif permettant d’atteindre des
concentrations intracellulaires de l’ordre de 850 à 1000 fois la concentration extracellulaire
(Dubois et Grenson, 1979). Cette activité de transport nécessite la présence d’une source de
carbone énergétique pour être fonctionnelle. En revanche, elle est inhibée de façon non
compétitive par certains acides aminés comme l’arginine et l’aspartate (Roon et al., 1975 et
Egbosimba et Slaughter, 1987). Cependant et pour des raisons d’équilibre de charge de part
et d’autre de la membrane plasmique, l’entrée de l’ion ammonium est couplée à l’excrétion
d’un proton par la pompe ATPase de la membrane plasmique selon le mécanisme présenté
dans la figure 4.
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Etude Bibliographique
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Etude Bibliographique
pH, l’apport en oxygène, les apports nutritionnels (sels, vitamines, glucose, etc.) (Alfenore et
al., 2002 ; Voit, 2003 et Wang et al., 2007), le mode de conduite du procédé (Gibson et al.,
2007 ; Lei et al., 2007), la concentration en éthanol (Tagaki et al., 2005 ; Canetta et al., 2006 ;
Lei et al., 2007 ; Wei et al., 2007) et les coproduits dans le milieu de culture (Ferreira et al.,
2004 ; Gibson et al., 2007 et Hirasawa et al., 2007). Ces derniers, considérés comme des
substances inhibitrices, sont parfois difficiles à éviter puisqu’ils sont souvent substrats ou
produits de la réaction biochimique considérée (Gryta et al., 2000). La réponse de la levure
face à ces phénomènes de stress est dynamique avec ou non une capacité d’adaptation à ces
conditions (Attfield, 1997 ; Sonnleitner 1998 ; Henson, 2003 et Lacroix et Yildirim, 2007) et
ceci à différents niveaux (macroscopique, microscopique et moléculaire) telles que la
modification du métabolisme cellulaire, des capacités de croissance et des fonctions
physiologiques. Ces modifications s’étendent naturellement sur leur rendement et leurs
productivités.
5.2- Effet du pH
Le maintien du pH cytoplasmique est indispensable à la survie de la levure et les limites
de leur pH reportées dans la littérature se situent entre 2,4 et 8,6 avec un pH optimal entre
4,4 et 6,5 (Jones et al., 1981). La nature de l’acide (forme dissociée ou non) a une grande
importance. Les levures supportent la plupart des acides organiques et sont inhibées par les
acides lactique, citrique et acétique et elles le sont encore plus avec les acides sorbique et
propionique. D’autres stress peuvent modifier ce pH comme il a été démontré par Jones et
30
Etude Bibliographique
Le CO2 peut être à la fois activateur et inhibiteur du métabolisme levurien (Kunkee et Ough,
1966 et Hirasawa et al., 2007). Il initie les voies anaplérotiques à faible concentration. Jones
et Greenfield (1982) ont montré que le rendement de conversion du substrat augmentait de
25% lors d’une croissance en aérobie sur glucose sous une pression partielle de 0,2 bar de
CO2. Par ailleurs, une augmentation trop importante de la pression partielle en gaz
carbonique semble entraîner une chute de la viabilité cellulaire (Ben Chaabane, 2006).
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Etude Bibliographique
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Etude Bibliographique
Les levures sont les premiers microorganismes à avoir été utilisé par l’homme puisque la
production des boissons alcoolisées est documentée depuis 6 000 ans avant notre ère chez
les Sumériens et les Babyloniens. Elles sont également les premiers microorganismes à avoir
été observé au microscope par A. Van Leeuwenhoek. C’est également grâce aux levures que
Pasteur contribua à la fondation de la microbiologie et Büchner au développement de la
biochimie. Leur rôle historique dans le domaine de l’agroalimentaire ne s’est pas démenti et
elles interviennent de nos jours dans la fabrication de nombreux produits alimentaires
(brasserie, vinification, fromagerie, etc.) en occupant une place essentielle dans cette
industrie. Elles participent aussi à la revalorisation des déchets agricoles et industriels et à la
production des protéines, des enzymes, des lipides et des vitamines.
Actuellement, ces microorganismes sont largement utilisés dans les secteurs de la recherche
biomédicale et des biotechnologies en raison de leur double état de micro-organismes et
d’eucaryotes. Ainsi, des levures modifiées génétiquement produisent l’antigène de surface
du virus de l’hépatite B utilisé dans le vaccin anti-hépatite. D’autres produisent la sérum-
albumine humaine.
La facilité d’approvisionnement, de conservation et de mise en culture de ces
microorganismes ainsi que la variété des espèces et des souches disponibles sont des atouts
majeurs pour les enseignants et font intervenir les levures dans le domaine de la pédagogie.
Enfin la biologie des levures permet d’illustrer concrètement la plupart des principes
fondamentaux de la biologie dans des domaines variés: biochimie, microbiologie, génétique,
biologie cellulaire, biotechnologie, etc., et ceci avec un intérêt dans les secteurs industriels,
économiques et scientifiques les plus divers. C’est un organisme modèle, peu encombrant,
peu exigeant et peu coûteux. La figure 5 résume les principales utilisations de la levure qui
représente le microorganisme le plus exploité par l’homme. Je ne m’attacherai dans ce
chapitre à traiter que deux productions: celle de l’éthanol et des arômes. Deux métabolites
étudiés au cours de notre travail.
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Etude Bibliographique
d’utilisation de la levure
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Etude Bibliographique
production est actuellement considérée comme une stratégie visant à réduire le coût de
l’énergie (Maiorella et al., 1984). Plusieurs pays ont développé cette stratégie en le
produisant à partir de matières agricoles (biomasse) produites localement afin de diversifier
les sources énergétiques en développant une énergie renouvelable. C’est le cas notamment
de l’Amérique, en particulier les USA et le Brésil qui le produisent respectivement à partir du
maïs et de canne à sucre (Coelho, 2005). Et récemment l’union européenne, qui fixe comme
condition la réglementation de l’ajout de l’éthanol dans l’essence sans modification des
moteurs conventionnels.
Cette énergie qui est une alternative prometteuse au pétrole fossile (Bothast et Saha, 1997
et Zaldivar et al., 2001) est à la fois renouvelable et écologique et pourrait diminuer les
problèmes engendrés par les combustibles fossiles en particulier les émissions de gaz à effet
de serre. Des études ont montré que ces émissions sont réduites de 75 % quand un litre
d'essence est remplacé par un litre d'éthanol. L’intérêt de cette production a mené à de
nombreux progrès afin de réduire le coût des étapes des procédés de sa production,
notamment au niveau de l’étape de prétraitement et la distillation (Wyman, 2001). D’autres
efforts ont porté sur l’amélioration de l’étape de fermentation, notamment par la recherche
de souches plus résistantes aux différents stress rencontrés lors de la fermentation
alcoolique comme la température, la faible concentration en glucose et en particulier la
haute concentration en éthanol. De plus les sources de carbones utilisables ont été
améliorées et diversifiées (utilisation du pentose par exemple) dans le but d’augmenter le
rendement (Jeffries et Jin, 2004), d’autres dans le but de réduire la pollution qui fragilise
l’équilibre de notre environnement.
35
Etude Bibliographique
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Etude Bibliographique
Mais les levures sont les microorganismes qui possèdent les meilleurs atouts et les meilleurs
potentiels pour cette production. Les plus utilisées sont Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces sp présentant chacune
des avantages et des désavantages, notamment en fonction de la composition du substrat et
du procédé employé (Zaldivar et al., 2001). Cependant Saccharomyces cerevisiae reste la
préférée car elle offre une efficacité en terme de production et de croissance à bas pH
(jusqu’à 4), un facteur important qui évite les contaminations. En plus, cette levure
représente un modèle expérimental avec de nombreux avantages (la petite taille et le
séquençage de son génome, la facilité à sa manipulation génétique, et la disponibilité de la
littérature). Toutefois peu de microorganismes sont réellement compétitifs en termes de
rendement en éthanol par rapport au substrat consommé, de capacité fermentaire, de
tolérance élevée à l’éthanol et d’adaptation aux conditions de fermentation.
La tolérance à l’éthanol est représentée par la capacité des levures à maintenir leur viabilité
à de fortes concentrations en éthanol. C’est un phénomène très difficile à étudier en raison
de l’absence de techniques universelles permettant sa quantification. Cependant, d’autres
valeurs sont utilisées telles que les valeurs relatives à la croissance cellulaire (Thomas et
Rose, 1979 et Beavan et al., 1982), à la vitesse spécifique de la production de l’éthanol
(Thomas et Rose, 1979) et à la viabilité cellulaire (Dombek et Ingram, 1987 et Birch et
Walker, 2000) ainsi que le flux de protons à travers la membrane plasmique (Jiménez et Van
Uden, 1985).
Les études réalisées dans ce domaine ont rapporté que l’accumulation de forte
concentration en éthanol augmente, chez la levure, la fluidité de la membrane plasmique qui
37
Etude Bibliographique
perd son intégrité (Cot, 2006), inhibe l’activité de l’ATPase de la membrane plasmique et des
enzymes de la glycolyse (Casey et Ingledew, 1986 et Salmon et al., 1998) et réprime le
système de transport du glucose ce qui perturbe ainsi le métabolisme et l’appauvrit en
énergie (Alexandre et al., 1998). D’autres travaux ont soulignés d’autres effets de ce stress
au niveau de la paroi comme la variation de sa composition en phospholipides, en ergostérol
et en acides gras (Alexandre et al., 1994 et Ding et al., 2009).
Cependant, les levures sont des microorganismes qui ont développé diverses stratégies pour
contrer les différents types de dommages produits par cet alcool (Ding et al., 2009). Parmi
elles, Saccharomyces cerevisiae qui présente les meilleurs atouts génétiques et
métaboliques et qui a toujours été considérée comme le producteur traditionnel d’éthanol:
1-Définition
Les arômes sont des préparations concentrées de substances aromatiques (odorantes ou
gustatives) destinées à être ajoutées à des solutions ou des denrées alimentaires afin de leur
donner ou renforcer une odeur et/ou un goût (Moll et Moll, 1990). Ils se traduisent
généralement par la présence, au sein d’une matrice complexe, de nombreux composés
volatils de diverses propriétés physico-chimiques avec des impacts sensoriels différents. Ils
sont classés selon leur structure chimique et répartis en 11 familles: alcools, aldéhydes,
38
Etude Bibliographique
39
Etude Bibliographique
Parce qu’ils possèdent des propriétés olfactives et gustatives bien définies, les arômes sont
aussi des additifs indispensables utilisés dans l’industrie alimentaire où ils participent
également à l’amélioration de la durée de vie des fruits transformés (Anese et al., 1997 et
Lanciotti et al., 2004). Les arômes alimentaires sont dépourvus de tout intérêt nutritionnel et
servent exclusivement à renforcer ou à améliorer le goût des aliments conférant ainsi aux
denrées alimentaires une saveur caractéristique (Mayer, 1991 et Aguedo et al., 2004) dans le
but de satisfaire le consommateur. Dans ce cas, ils peuvent soit modifier ou compléter le
profil aromatique d’un produit quelconque, soit aromatiser des produits
organoleptiquement neutres ou encore masquer des flaveurs désagréables comme les
produits issus du soja ou les concentrés protéiques.
40
Etude Bibliographique
d’obtention des matières aromatiques ainsi que les progrès réalisés dans le secteur des
biotechnologies ont conduit à explorer puis à exploiter les possibilités offertes par celles-ci.
Effectivement, les arômes produits par les biotechnologies semblent être la réponse pour
faire face à ces difficultés (Mayer, 1991) et le fait qu’elles puissent bénéficier du label naturel
a été un élément déterminant dans l’intérêt suscité au cours des dernières années. De plus,
la stéréospécificité de certains systèmes enzymatiques microbiens permet d’accéder
aisément à des molécules optiquement actives, difficiles à obtenir par synthèse. Les
biotechnologies donnent de surcroît la possibilité de réaliser en une seule étape des
synthèses qui nécessitent souvent de nombreuses réactions, ce qui entraîne des rendements
faibles et variables (Peyvatin et al., 1986). Grâce aux progrès réalisés dans le domaine des
connaissances sur le fonctionnement des organismes vivants, le champ d’application des
procédés utilisant des microorganismes qui ont historiquement joué un rôle essentiel dans
l’élaboration de ces composés dans de nombreux aliments (vins, bière, fromage, etc.)
(Chandrasekaran, 1997), des enzymes purifiées ou même des cellules végétales dont
l’approche est basée sur la capacité biochimique et génétique de ces cellules (Scragg, 1997
et Kim et al., 2001) pour la production d’arômes a été considérablement élargi. La
multiplicité des espèces naturelles utilisables, la variabilité induite par des conditions de
culture et la variabilité supplémentaire induite par le choix des procédés réalisés dans le
domaine du génie génétique permettent de modifier les systèmes biologiques au niveau
moléculaire, ainsi il est possible d’obtenir d’une part des microorganismes recombinés ayant
de nouvelles propriétés métaboliques, d’autre part des enzymes capables de surproduire
certaines arômes (Lerch et Schilling, 1992).
Bien que ces arômes issus des biotechnologies soient plus chers que les nature-identiques,
ils restent toujours moins onéreux que de véritables extraits (Lerch et Schilling, 1992) et leur
nombre reste limité.
La culture de cellules de plantes aromatiques in vitro a également été envisagée mais elle
présente des obstacles importants. L’expression des gènes contrôlant la production de ces
41
Etude Bibliographique
composés présente beaucoup de difficultés et les temps de croissance de ces cellules sont
trop élevés pour qu’elles soient appliquées à une production industrielle.
Enfin, il est possible d’utiliser des systèmes enzymatiques, particuliers et définis, connus
comme responsables de la production d’arômes dans les plantes. Ces systèmes
enzymatiques peuvent être utilisés in vivo dans les microorganismes ou bien in vitro après
avoir été isolés (Schreier, 1995). Dans les deux cas, les réactions mises en jeu sont simples et
unitaires, elles permettent la conversion d’un précurseur particulier naturel en une molécule
ou une série homologue de molécules aromatisantes. Ce mode de production n’est plus une
bioproduction mais une bioconversion. Il est important d’ajouter que pour synthétiser des
arômes par de tels systèmes enzymatiques, l’utilisation de «cellules entières» reste la plus
favorable car elle permet de réaliser des réactions pour lesquelles les enzymes impliquées
nécessitent des cofacteurs (NADH, NADPH, ATP, etc.). Cet avantage est capital car la
régénération des cofacteurs est souvent un obstacle à l’utilisation de nombreuses enzymes
purifiées et immobilisées sur support (Degorce-Dumas et al., 1984).
Les bactéries sont depuis très longtemps connues pour la synthèse d’arômes et peut
s’effectuer selon deux voies différentes : la première correspond à la biosynthèse d’arômes à
42
Etude Bibliographique
Les données bibliographiques concernant les capacités des bactéries à produire des arômes,
révèlent que les concentrations obtenues sont bien souvent inférieures à 100 mg/L, il
s’avère donc indispensable de faire appel à l’amélioration des souches afin d’accroître les
productivités. Les travaux de Kuila et ses collaborateurs (1971) révèlent qu’après traitement
à la nitrosoguanidine (NTG) associée aux UV, les capacités de Streptomyces diacetilactis, à
produire différents composés aromatiques, sont considérablement améliorées et à des taux
plus élevés. Cette même souche, traitée uniquement aux UV, subit des modifications qui
conduisent à l’obtention de mutants performants en termes de production du diacétyl.
Les bactéries et les levures présentent des avantages considérables par rapport aux
champignons, notamment dans leur facilité de mise en œuvre, leur connaissance biologique
plus approfondie, et la diversité des interventions génétiques réalisées sur ces
43
Etude Bibliographique
B°) Alcools supérieurs : ce sont des alcools à chaînes longues et complexes obtenus au
cours des fermentations par les microorganismes (levures) et qui ont des propriétés
organoleptiques très intéressantes. Parmi les principaux alcools figurent le propanol-1, le 2-
méthylpropanol (isobutanol), le 3-méthylbutanol, le 2-méthylbutanol-1 (alcools
isoamyliques). La synthèse de ces alcools dérive :
soit des cétoacides issus de la voie des sucres et notamment de l’acide pyruvique,
soit des α-cétoacides obtenus par la voie d’Ehrlich après désamination des acides
aminés correspondants (Parfait et Jouret, 1975).
C°) Les esters : très appréciés pour les arômes fruités qu’ils fournissent
Acétate d’éthyle : est un ester formé entre l’acide acétique et l’éthanol et qui
donne une odeur éthérée piquante.
Acétate d’amyle : cet ester, qui a une note fruitée caractéristique de la poire, est
formé à partir de l’alcool correspondant associé à l’acide acétique.
Acétate d’isoamyle : se forme à partir de l’alcool correspondant associé à l’acide
acétique et donne une note fruitée caractéristique de la banane. Sa production a
été mise en évidence par de nombreuses études chez les levures telles que Pichia
44
Etude Bibliographique
Parmi les composés volatils d’origine microbienne, trois seront étudiés au cours de ce
travail le 2MB (2-méthylbutanol), le 3MB (3-méthylbutanol) et le 2PE (2-phényléthanol).
Je m’attarderai sur ce dernier car c’est un composé très utilisé actuellement et dont la
production par voie microbienne est en expansion.
45
Etude Bibliographique
46
Etude Bibliographique
Les effets inhibiteurs du 2-phényléthanol ont déjà fait l’objet de nombreuses études chez
d’autres espèces de levures afin de lever cette inhibition liée à une concentration critique
responsable non seulement de la bioconversion partielle de la phénylalanine mais aussi de la
diminution du pourcentage de viabilité de la souche au cours du temps (Fabre et al.,1997).
Cette sensibilité pose un véritable problème et a poussé les chercheurs à adopter d’autres
stratégies afin d’obtenir des concentrations économiquement intéressantes. L’amélioration
de la tolérance de la souche vis-à-vis du phényléthanol a été notamment recherchée en
utilisant un chemostat et en optimisant la composition du milieu et des conditions de culture
(Fabre et al., 1997). Mais les résultats n’étaient pas très concluants car il est difficile de
poursuivre la bioconversion au-delà d’une concentration critique de 3,1 g/L d’arôme.
Une seconde alternative repose plus sur l’élaboration d’une technique permettant de
détourner cette inhibition par l’extraction de l’arôme visant à améliorer la production en 2-
phényléthanol (Fabre et al., 1995 et Serp et al., 2003). Parmi ces travaux on peut citer
l’utilisation du polypropylène glycol 1200 afin d’éliminer en continu le 2-phényléthanol à
partir du milieu de fermentation (Etschmann et Schrader, 2006).
Bien que l’industrie des arômes se soit développée grâce au perfectionnement des
méthodes d’extractions, ces dernières présentent toutes des inconvénients. Certaines ne
47
Etude Bibliographique
résolvent pas tous les problèmes légaux d’innocuité ou de préservation des qualités
aromatiques, d’autres conduisent souvent à des produits dégradés par la chaleur ou
modifiés par les réactions secondaires avec les solvants d’extraction. Cependant, des levures
naturellement résistantes peuvent résoudre ce problème et permettent de faire face à ce
phénomène d’inhibition et d’augmenter ainsi la productivité.
48
MATERIEL ET METHODES
Matériel et Méthodes
1- Matériel biologique
Différents isolats de levures ont été obtenus à partir de plusieurs échantillons
biologiques récoltés en Algérie: des fruits tels que les dattes, le melon et le cornichon,
différents types de laits et de miel. La liste des échantillons et leur région de provenance
sont représentées dans le tableau 2 et la figure 6.
Gharass 1 Bechar
Hamira 1 Ouargla
50
Matériel et Méthodes
51
Matériel et Méthodes
La présence des levures dans tous ces échantillons est d’abord confirmée par observation
microscopique directe sur un frottis fixé à chaud, dégraissé au xylène et coloré au violet de
Gentiane (Guittonneau et al., 1939).
0,1 ml de chaque échantillon, contenant des levures, est ensuite étalé sur milieu OGA
(0,5% Yeast Extract et 2% Glucose) rendu sélectif par un pH acide (5 à 5,6), par l’ajout de
deux antibiotiques (Chloramphénicol à 0,5mg/ml et Oxytétracycline à 0,1mg/ml) et d’un
antifongique (thiabendazole à 3mg/L) car ces aliments contiennent, en plus des levures, des
bactéries et des moisissures (Vergeade et al., 1976 et Bouix et Leveau, 1980). Les boites sont
ensuite incubées à 30°C.
A partir de chaque boîte contenant une centaine de colonies, six colonies sont prélevées
au hasard, ensemencées chacune sur d’autres boîtes contenant le même milieu et incubées
à la même température. Après isolement, les isolats de levures ont été purifiés par
technique d’épuisement et conservés sur milieu « Sabouraud-Chloramphénicol » (1%
Bactopeptone, 2% Glucose) en gélose inclinée à 4°C afin d’éviter d’éventuelles
contaminations par des bactéries. Des repiquages réguliers sont effectués tous les trois mois
(Schmidt et Lenoir, 1978). Pour une conservation plus longue, les isolats sont conservés à –
80°C dans leur propre milieu de culture dilué de moitié avec une solution stérile de glycérol
40%.
52
Matériel et Méthodes
Les ADN génomiques ont été extraits en utilisant le kit Masterpure Yeast DNA
purification kit de chez Epicentre (Ref MPY 80200). 300µl de chaque culture sont centrifugés
et le culot est resuspendu de façon énergique dans 60µl d’une solution de lyse. Les mélanges
ainsi obtenus sont placés au bain-marie à une température de 65°C pendant 15 minutes puis
dans la glace pendant 5 minutes. 30µl de solution de précipitation sont ensuite ajoutés et la
solution est mélangée par inversion du tube pendant 2 minutes.
53
Matériel et Méthodes
Après une centrifugation de 10 minutes, le surnageant est récupéré dans un autre tube et
100µl d’isopropanol sont ajoutés afin de précipiter l’ADN. Après une nouvelle centrifugation
de 10 minutes le culot est lavé avec 200µl d’éthanol à 70%. Le tube est séché et le culot
d’ADN repris dans 25µl de TE (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, pH8). De la RNase (5µg/µl, 1
heure à 37°C) est ajoutée afin d’éliminer les ARNs qui pourraient être gênants pour voir
l’amplification de petits produits PCR. L’ADN génomique ainsi préparé est conservé à -20°C.
H3R2YEAS CTCTCAAGGCNACNGTNCCNGG
H4R1CERE GATAGCTGGCTTAGTGATACC
H4R1YEAS GATAGCTGGYTTNGTNATNCC
54
Matériel et Méthodes
Un milieu minéral synthétique, MMS (Verduyn et al., 1992), dans lequel l’apport de
tous les éléments nutritifs peut être contrôlé. Ce dernier est composé de quatre
solutions qui sont préparées séparément et stérilisées différemment :
- solution 3 : on mélange 1,5g (EDTA di-sodium) à 0,45g (ZnSO4, 7H2O) dans 75ml
d’eau distillée où le pH est ajusté à 6 avec du NaOH 1M. Cet ajustement doit être fait
après l’ajout de chacun des éléments suivants : 0,1g (MnCl2, 4H2O), 0,03g (CoCl2,
6H2O), 0,03g (CuSO4, 5H2O), 0,4g (Molybdène di-spodique (Na2MoO4, 2H2O)), 0,45g
(CaCl2, 2H2O), 0,3g (FeSO4, 7H2O) et 0,1g (Acide borique(H3BO3)). Le volume est
ensuite complété avec de l’eau distillée.
- solution 4 : on dissout 10mg de d-Biotine dans 5ml de NaOH 0,1M, puis le volume
est complété avec de l’eau distillée à 75ml et on ajuste le pH à 6,5 avec HCl 1M. Ce
pH doit être maintenu après l’ajout de chacun des constituants suivants afin de
faciliter leur dissolution : 100mg de Ca (D+) pantothénate, 100mg d’acide nicotinique,
250mg (My-Inositol), 100mg (Thiamine HCl), 100mg (Pyridoxal HCl) et 20mg (Acide
paminobenzoïque).
55
Matériel et Méthodes
l’abri de la lumière. Le milieu MMS est alors préparé en mélangeant les solutions 1 et 2 à 1
ml de chacune des solutions 3 et 4.
4.2.2- Cultures
4.2.2.1- Cultures sur milieu solide
Afin d’évaluer les exigences nutritionnelles de ces souches, deux milieux ont été
utilisés. Un milieu complet (YPD) et un milieu minimum (YNB). La lecture des résultats se fait
pendant trois jours à une incubation de 30°C pour noter d’éventuels changements.
Cette fermentation en mode batch a été réalisée dans un fermenteur SARTORIUS, Biostat B
Plus (figure 7). Le pH est ajusté à 3 à l’aide d’une solution d’ammoniaque à 14% (V/V). La
température de la fermentation est maintenue à 30°C grâce à un baffle chauffant et un
système de refroidissement (en double cloison). Le bioréacteur a été balayé en permanence
par de l’air à un débit de 0,1L/mn. La vitesse d’agitation est fixée à 400 rpm jusqu’à ce que
pO2 atteigne 20%, puis augmentée pour éviter toute limitation d’oxygène dans le milieu. Ces
systèmes sont connectés à un ordinateur et un programme informatique qui réalise en ligne
l’acquisition des paramètres contrôlés (taux d’agitation, pH, température, débit d’air et
pression partielle de l’oxygène dissous) (figure 8). Cette culture est suivie et des
56
Matériel et Méthodes
prélèvements, à travers un septum prévu à cet effet situé au centre du bioréacteur, sont
effectués toutes les heures pour des dosages hors ligne (glucose, éthanol, glycérol et
acétates).
Figure 8: Fermenteur SARTORIUS, Biostat B Plus avec son système d’acquisition pour le
contrôle des différents paramètres de la croissance
57
Matériel et Méthodes
5- Analyse phénotypique
5.1- Etude des caractères culturaux
L’étude des caractères culturaux des cinq souches retenues (C. lusitaniae, H. uvarum, K.
ohmeri, I. orientalis et T. asahii) (cf. 1er paragraphe-Résultats et discussion) nous a conduits à
examiner l’aspect des cultures en milieu liquide et sur milieu solide après incubation à 30°C.
la présence de dépôt au fond du tube ainsi que son aspect (fin, modéré ou épais).
la présence de voile ou de pellicule en surface.
la production de gaz.
5.1.2- Caractères culturaux sur milieu solide
La culture de ces souches sur YPD gélosé (même période et même température
d’incubation) nous a permis de définir la forme, la couleur et l’aspect des colonies.
58
Matériel et Méthodes
Après l’ensemencement des cinq souches, une incubation a été faite à 30°C. A chacun de ces
stress on en a ajouté un autre qui est le stress thermique en réalisant une autre incubation à
40°C. Ainsi l’effet combiné des deux stress peut être déterminé (salin-thermique et
osmotique- thermique).
5.3.3- Effet du pH
Le milieu YPD solide a été préparé à quatre pH différents, trois acides (pH 2,5 ; 4 et 5)
ajustés avec du HCl 1M et un basique (pH 7) ajusté avec du NaOH 0,1M. L’agar (2%) est
ajouté aux deux milieux à pH 5 et 7 avant autoclavage alors que pour les milieux à pH 2,5 et
4 il est rajouté après autoclavage (agar 4% à diluer deux fois) afin d’éviter son hydrolyse.
Pour chaque souche, une pré-culture a été préparée, centrifugée à 13 000 tr/mn pendant
3mn et lavée avec de l’eau distillée stérile. Après un bref passage au vortex et centrifugation,
les cellules sont remises en suspension avec 100µl d’eau distillée stérile. Des dilutions
séquentielles (10-1, 10-2, 10-3 et 10-4) ont été préparées et 10µl de chaque dilution sont
déposés stérilement sur les boites précédemment préparées. Après séchage, elles sont
incubées à 30°C et à 40°C. Les résultats sont ainsi suivis et notés quotidiennement pendant
trois jours.
La souche I. orientalis, montrant une résistance importante, a été sélectionnée afin de suivre
sa croissance en milieu YPD et YNB liquides en présence d’éthanol aux concentrations
suivantes: 0%, 5%, 8%, 12% et 20% (V/V d’éthanol). L’ensemencement est réalisé à 2UDO et
l’incubation à 30°C sous agitation (200 rpm). La croissance cellulaire est ainsi suivie à
intervalle de temps régulier par la mesure de la densité optique (600 nm, cf. paragraphe
6.1.1) et la viabilité cellulaire est déterminée par étalement sur milieu solide et par un
comptage après coloration au bleu de méthylène (cf. paragraphe 6.1.3). La première
technique est utilisée pour vérifier la fiabilité du comptage. C’est cette dernière qui sera
représentée.
59
Matériel et Méthodes
6- Méthodes analytiques
6.1- Détermination de la biomasse
6.1.1- Mesure de la densité optique (DO)
L’évolution de la densité optique est estimée par spectrophotométrie à 600nm
(Spectrophotomètre Biochrom Libra S11) dans une cuve de 1mm de trajet optique. Afin de
favoriser le détachement des cellules et leur propagation dans le milieu, un bref passage au
sonificateur a été réalisé avec certaines souches qui préfèrent rester associées les aunes aux
autres. La zone de linéarité du spectrophotomètre se situant entre 0,1 et 0,3 unités
d’absorbance, des dilutions seront réalisées afin d’obtenir une densité optique située dans
cet intervalle.
Le bleu de méthylène est une molécule organique qui réagit avec les oxydoréductases des
cellules actives. Il peut exister sous les deux formes :
60
Matériel et Méthodes
Le bleu de méthylène sera réduit si les cellules sont actives (Bapat et al., 2006) tandis que les
cellules mortes seront colorées en bleu (Manabu et al., 1994).
N = (n x1000)/0,04 = 25 000 n
6.1.3.3- Comptage
Afin d’estimer le pourcentage des cellules viables, un mélange de 200µl de la
solution de bleu de méthylène avec 200µl de la suspension cellulaire est réalisé dans les
puits d’une microplaque ELISA. Après homogénéisation et 10mn d’incubation à température
ambiante, le mélange est introduit dans la cellule de Thoma et les cellules de levures sont
alors comptées au microscope optique (Nikon Eclipse E 400, grossissement 40 x 10). Ces
cellules se répartissent sur la lame de manière aléatoire. Les règles de comptage appliquées
sont les suivantes: pour des cellules chevauchant les lignes de quadrillage, seules les cellules
chevauchant la ligne horizontale supérieure et la ligne verticale droite sont comptées. Dans
le cas des levures bourgeonnantes, la cellule fille est comptée comme une cellule seulement
si sa taille est supérieure ou égale à la moitié de la taille de la cellule mère. Le nombre de
61
Matériel et Méthodes
cellules doit être compris entre 150 et 300 pour diminuer l’erreur effectuée sur le comptage
au dessous de 10% (Postgate, 1967 ; McLean et al., 2001). Il suffit de compter les cellules
bleues et les cellules incolores.
L’étalon inter, qui va servir pour l’extraction, est préparé en prenant 25µl d’octanol dans une
fiole jaugée auquel on ajoute de l’éther jusqu’à 25ml. Ce mélange, qui est préparé
rapidement et avec précision sous une hotte, est mélangé et réparti dans des flacons qui se
ferment hermétiquement puis placé dans de la glace dans une chambre froide.
L’extraction des arômes est réalisée dans une chambre froide en mélangeant 1ml de chaque
échantillon avec 500µl de l’étalon inter. Ce mélange est vortexé pendant une minute puis
centrifugé à 400 rpm, à 16°C pendant 5 minutes. Deux phases sont alors obtenues (une
phase aqueuse et une phase organique).
62
Matériel et Méthodes
En travaillant toujours à froid, 400µl de la phase organique sont récupérés dans des flacons
qui sont rapidement scellés afin d’éviter toute évaporation et qui seront analysés en
chromatographie en phase gazeuse.
L’appareil utilisé dispose d’une colonne (Aminex HPX-87H 300 mm x 7.8 mm -BioRad-)
spécifique pour la séparation des sucres, des alcools et des acides organiques. La phase
mobile utilisée est une phase polaire constituée d’un mélange d’acide sulfurique (H 2SO4) et
d’eau ultrapure à une concentration de 5 mM circulant à un débit de 0,5ml/mn pendant
toute la durée de l’acquisition. Cet éluant est préparé et préalablement dégazé sous vide.
63
Matériel et Méthodes
250°C 5 min
7- Analyse physiologique
7.1- Culture en anaérobiose
Les cinq souches (C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii) ont été
examinées pour leur capacité à croitre en anaérobiose sur YPD solide à 30°C.
D’autres cultures ont été réalisées sur YPD liquide dans des fioles (figure 9), auxquelles ont
été ajoutés de la resazurin sodium salt (1000X) à 1g/L comme indicateur d’oxygène, du
Tween 80 (200X, dilué dans de l’eau) et de l’ergostérol (1000X, dilué dans de l’isopropanol)
qui est un facteur de croissance nécessaire en anaérobiose. L’incubation se fait sous
agitation (100 rpm).
64
Matériel et Méthodes
semi-solides (API C Medium) (Annexe 2) qui permettent de mettre en suspension les levures
à tester.
Après avoir mis en culture nos souches, on suspend quelques colonies de chaque souche
dans de l’eau distillée stérile dont l’opacité est comparée au Mac Farland point 2. 250µl de
chaque suspension sont transférés dans une ampoule qui contient le milieu semi solide API C
Medium, fourni dans le coffret. Après homogénéisation, on inocule la galerie en distribuant
135µl de la suspension par cupule puis on place le couvercle sur la galerie et on l’incube à
30°C.
Une première lecture est réalisée après 24 heures d’incubation et une autre après 48
heures, en notant la présence éventuelle d’un trouble et ceci par comparaison au contrôle
(O) qui est en position 1.F sur la galerie.
65
RESULTATS ET DISCUSSION
Résultats et Discussion
Les levures sont largement distribuées dans la nature et leur aspect ubiquitaire est encore
une fois confirmé par leur présence dans les échantillons biologiques choisis. Les levures
représentent une part notable de la flore microbienne des dattes, du melon, du cornichon,
du lait, et du miel où elles sont susceptibles de participer activement aux différentes
modifications biochimiques qui sont à l’origine du développement de la saveur et de l’arôme
de ces produits (Grippon, 1978 ; Schmidt et al., 1979 ; Schmidt, 1984 et Baroiller et Schmidt,
1990).
Parmi ces dix huit isolats sélectionnés nous avons pu identifier par PCR sur histones les cinq
suivants S6, S7, S10, S11, S12 (figure 10) qui appartiennent au genre Yarrowia et à l’espèce
lipolytica. Cette technique est très fiable puisqu’elle a démontré que les régions promotrices
des gènes H3-H4 codant les histones dans la levure représentent une zone de choix pour une
identification rapide et précise permettant de différencier les différentes espèces entre elles
(Bell, 2004). Mais à cause du nombre limité de souches contrôles les autres isolats n’ont pas
pu être identifiées comme le montre les profils d’amplification qui sont représentés dans la
figure 10.
67
Résultats et Discussion
Figure 10: PCR des produits d’amplification (Amplicons H3 et H4) des 18 isolats
de levures
S: souches à identifier.
Le nombre d’isolats a été limité à dix. Les amplicons obtenus ont été séquencés et leurs
séquences ont été comparées aux bases de données. Les identités de séquences (100%) ont
permis de classer les dix isolats suivants en neuf espèces :
Clavispora lusitaniae
Hanseniaspora uvarum isolées à partir des dattes
Kodamaea ohmeri
Issatchenkia orientalis
Trichosporon asahii isolées à partir du lait de chamelle
68
Résultats et Discussion
La présence de Yarrowia lipolytica dans le lait de vache, de brebis et de chèvre n’était pas
fortuite en raison de la teneur élevée de ces produits en lipides (Choisy et al., 1987 ;
Guerzoni et al., 1998 ; Wyder et Puham, 1999 ; Guerzoni et al., 2001 ; Suzzi et al., 2001). La
présence de Zygosaccharomyces bailii dans le cornichon n’est pas étonnante non plus car
elle est très tolérante au sel (Praphailong et Fleet, 1997) et c’est aussi le cas de
Zygosaccharomyces rouxii qui est présente dans le miel et qui est très résistante au sucre
(Barnett et al., 1990 ; Jansen et al., 2003).
69
Résultats et Discussion
La large gamme d’habitat de l’espèce Clavispora lusitaniae comme l’a signalé Lachance et
ses collaborateurs en 2003 est en adéquation avec sa présence dans les dattes. Wyder et
Puham (1999) ainsi que El-Sharoud et ses collaborateurs (2009) ont également signalé sa
présence dans les fromages et certains produits laitiers car elle participe à leur affinage.
C’est une espèce qui a été retrouvée également dans les déchets industriels et quelques
échantillons cliniques (Gargeya et al., 1990).
L’isolement de Hanseniaspora uvarum à partir des dattes est en accord avec ce fruit puisque
cette espèce se retrouve couramment sur la peau des fruits riches en fructose et glucose
comme la peau des raisins (Baffi et al., 2011) et des pommes (Pando Bedrinana et al., 2011).
Elle a été retrouvée également dans le jus d’orange où elle participe à sa fermentation
(Mingorance-Cazola et al., 2003).
La présence de Kodamaea ohmeri dans les dattes est moins évidente car c’est une levure
qui est transporté par les insectes et les abeilles lors de leur visite sur les fleurs éphémères
(Lachance et al., 2001 et Benda et al., 2008). C’est une espèce qui a été isolée par Chi et ses
collaborateurs (2012) à partir de l’écosystème des mangroves (Chine), de la chair et des
excréments du poulet (avec I. orientalis) pour une éventuelle utilisation en tant que
probiotiques chez les animaux (Garcia-Hernandez et al., 2011 et Chi et al., 2012). Ajoutons à
ces travaux, ceux de Zhu et ses collaborateurs qui ont isolé à partir des sources naturelles
osmophiles, une souche de K. ohmeri capable de produire le D-arabitol, qui a une saveur
sucrée plus faible que le saccharose et moins sucré que le xylitol avec une valeur calorique
proche du zéro, et qui était jusque là produit uniquement par Candida famata (Zhu et al.,
2010).
Issatchenkia orientalis est l’une des levures indigènes présente sur la peau des raisins (Baffi
et al., 2011) et dans le vin (Clemente-Jimenez et al., 2004) qui se caractérise par sa tolérance
à l’acidité et à l’éthanol (Okuma et al., 1986). Elle a été également isolée à partir du Kéfir et
utilisée comme additif alimentaire microbien pour les animaux (Lee et al., 2002). Sa
présence peut s’expliquer par le fait que l’isolement a été réalisé après la fermentation du
lait de chamelle. Sa tolérance à la température, à l’acidité et à l’éthanol, ainsi que sa capacité
à assimiler du citrate et à fermenter du glucose et du saccharose lui permette de jouer un
rôle dans la fermentation du cacao (Daniel et al., 2009). Elle a été aussi retrouvée dans les
olives (Arroyo-Lopez et al., 2006) et certains produits laitiers tels que les fromages (El-
Sharoud et al., 2009) où elle participe à la protéolyse et la formation de composés d’arômes
dans le fromage type camembert (Chen et al., 2011) et les yaourts (Lourens-Hattingh et
Viljoen, 2002).
70
Résultats et Discussion
Il est à noter que l’étude réalisée par Galzy et ses collaborateurs (1996) a bien confirmé la
présence de C. lusitaniae, H. uvarum et Z. bailii dans les fruits, celle d’I. orientalis et de Y.
lipolytica dans les laitages et de Z. rouxii dans le miel.
De nombreux travaux ont été réalisés sur les souches Yarrowia lipolytica (Barth et Gaillardin,
1997), Zygosaccharomyces bailii et Z. rouxii (Merico et al., 2003 ; Martorell et al., 2007),
nous avons donc concentré notre étude physiologique sur les cinq souches restantes, à
savoir: C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii. Ces espèces sont isolées
à partir des dattes et du lait de chamelle, provenant d’un biotope particulier caractérisé par
son climat désertique et sa température élevée. De plus ces souches sont très peu étudiées
ce qui donne à notre travail un caractère novateur.
71
Résultats et Discussion
Figure 11: Aspect des cultures des cinq souches sur YPD liquide à 30°C pendant 3 jours
72
Résultats et Discussion
Figure 12: Aspect macroscopique des colonies des cinq souches après 3 jours d’incubation
73
Résultats et Discussion
Figure 13: Aspect microscopique des cellules des cinq souches après une culture de 24 h sur
YPD liquide à 30°C
74
Résultats et Discussion
Hanseniaspora -Souche gazogène. -Colonie ronde, bord régulier -Cellules apiculée (en forme
uvarum -Dépôt fin. -Contour lisse, centre velouté de citron).
-Blanche -Bourgeonnement bipolaire.
-Bombée avec le centre en -Présence de pseudo-
cône. mycélium.
Kodamaea ohmeri -Souche gazogène. -Colonie ronde, bord régulier -Cellules sphériques.
-Dépôt modéré. -Velouté -Bourgeonnement
-Blanche multipolaire.
-Bombée avec -Présence de pseudo-
le centre en cône. mycélium.
Issatchenkia -Souche gazogène. -Colonie ronde, bord régulier -Grosses cellules ovoïdes.
orientalis -Dépôt épais. - Velouté -Bourgeonnement
-Présence de -Blanche multipolaires.
voile. -bombée.
Trichosporon asahii -Souche -Colonie ronde, bord dentelé -Forme variable souvent
non gazogène. -Velouté avec surface plissée allongée.
-Dépôt fin. - Blanche - Présence de pseudo-
-Présence de -Bombée. mycélium.
voile. -Mycélium bien développé.
-Présence d’arthrospores.
75
Résultats et Discussion
Figure 14: Effet de la température sur les cinq souches de levure étudiées cultivées
sur milieu YPD solide
Ces résultats montrent que seule Hansenispora uvarum est incapable de soutenir une
croissance au-delà de 30°C et montre une sensibilité très nette à 37°C. Les quatre autres
souches affichent une bonne croissance jusqu’à 40°C. Il est important de noter que la
croissance d’Issatchenkia orientalis a été la moins affectée à haute température et elle peut
poursuivre sa croissance jusqu’à 42°C (résultat non présenté). Ces résultats sont en accord
avec les propriétés thermo-tolérantes de cette espèce signalées dans les travaux précédents
76
Résultats et Discussion
(Gallardo et al., 2010 ; Gallardo et al., 2011 ; Kwon et al., 2011 et Yuangsaard et al., 2013),
elle doit avoir une membrane plasmique plus résistante aux dénaturations thermiques. De
plus, Gallardo et ses collaborateurs ont montré que non seulement cette espèce poursuit sa
croissance à de telles températures mais donne le meilleur de sa production en éthanol à
42°C contrairement à Saccharomyces cerevisiae connue pour sa production maximale
d’éthanol entre 30-35°C (Gallardo et al., 2010). Cette souche peut avoir une grande valeur
pour des applications biotechnologiques en particulier lorsque la température dépasse les
39°C au sein d’un système de fermentation continu.
3.2- Effet du pH
Les levures apprécient bien l’acidité, mais elles n’ont pas la même sensibilité au pH.
Chacune est caractérisée par un seuil en dessus duquel elle ne se développe pas. La capacité
que possède les levures à résister à l’acidité a été étudiée chez de nombreuses souches de
levures (Wyder Puham, 1999) qui précisent l’importante inhibition par des pH très acides
(inférieur à 3) (Thomas et al., 2002) en ralentissant la consommation du sucre et réduisant
par conséquent la productivité (Torija et al., 2003) ou en affectant le transport actif de
l’azote (Dubois et Grenson, 1979 et Gregory et al., 1982), d’où l’importance des souches
résistantes à des pH bas.
Dans ce contexte et compte tenu du rôle essentiel que joue le pH sur différents aspects,
nous avons mis au point l’effet de ce stress sur les souches de levures retenues. Les résultats
reportés sur la figure 15 montrent une bonne résistance de toutes les souches aux pH= 4 - 5
et 7. En revanche à un pH très acide comme 2,5, la croissance n’est observée qu’avec les
souches Clavispora lusitaniae, Hanseniaspora uvarum et Issatchenkia orientalis qui arrivent
à y résister. Les deux autres souches, en particulier Trichosporon asahii, présentent une
forte sensibilité à cette valeur. Il convient de noter que malgré la sensibilité de la souche H.
uvarum à la température, cette dernière montre une résistance importante aux pH très
acides.
77
Résultats et Discussion
Figure 15: L’effet du pH sur les cinq souches de levure étudiées sur milieu YPD solide,
incubées à 30°C
T.a: Trichosporon asahii ; I.o: Issatchenkia orientalis ; K.o: Kodamaea ohmeri ;
Cette résistance persiste même à 40°C avec la souche Issatchenkia orientalis qui affiche la
plus large gamme de pH pour sa croissance (résultats non présentés). Ceci concorde très
bien avec les travaux qui ont souligné la résistance de cette espèce à des pH très bas et à
différents acides comme l’acide lactique (Halme et al., 2004), l’acide acétique (Casey et
Dobson, 2003) et l’acide malique (Seo et al., 2007 et Kim et al., 2008) auxquels beaucoup de
levures sont sensibles.
78
Résultats et Discussion
qu’utilisent les levures pour répondre à ce genre de stress. Afin d’évaluer la réponse à ce
stress par nos souches, nous les avons cultivées sur un milieu minimum avec une
concentration de 0,5M de NaCl.
Cette étude a montré qu’à 30°C, température optimale pour la croissance des levures, les
cinq souches (C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii) ont bien toléré
cette concentration de NaCl (figure 16). Les études, peu nombreuses, réalisées sur ce stress
chez les levures ont montré que le glycérol joue un rôle important dans la résistance
puisqu’il constitue le principal soluté accumulé en réponse à la salinité (Jennings, 1984 et
Bellinger et Larher, 1988).
Figure 16: Effet du NaCl (0,5M) sur les cinq souches cultivées sur milieu YNB avec une
incubation à 30°C et à 40°C.
79
Résultats et Discussion
Figure 17: Effet du sorbitol (2M) sur les cinq souches cultivées sur milieu
L’effet des stress osmotique et salin ont été étudiées chez d’autres souches (Jakobsen et
Narvhus, 1996 ; Laubscher et Viljoen, 1999 et Fleet, 2007) mais sans l’effet de la
température. Notre étude a combiné ces stress avec le stress thermique et les résultats
obtenus montrent qu’à 40°C seules les souches C. lusitaniae et I. orientalis résistent à l’effet
synergique (figure 16 et 17). La souche H. uvarum, ne pousse pas à cette température et les
deux autres souches (K. ohmeri et T. asahii) ne résistent pas à l’effet combiné de ces deux
stress. Ces résultats sont résumés dans le tableau 6.
80
Résultats et Discussion
Tableau 6: Effet des différents stress sur les cinq souches de levures étudiées
Clavispora + + + + + + + + - + + + +
lusitaniae
Hanseniaspora + + + + + + - - - + - + -
uvarum
Kodamaea - + + + + + + + - + - + -
ohmeri
Issatchenkia + + + + + + + + + + + + +
orientalis
Trichosporon - + + + + + + + - + - + -
asahii
L’impact de ce stress sur nos souches ainsi que sur S. cerevisiae CEN.PK122-2N qui a servi de
souche de référence, a été étudié sur YPD avec différentes concentration en éthanol et à
deux températures (30°C et 40°C). La figure 18 illustre la réponse observée à ces stress et
montre clairement que l’effet inhibiteur de l’éthanol diffère d’une souche à une autre.
81
Résultats et Discussion
Figure 18: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YPD
solide incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)
A 30°C, les souches les plus sensibles sont Hanseniaspora uvarum et Trichosporon asahii
dont la résistance ne dépasse guère les 8%. La résistance pour la souche Kodameae ohmeri
atteint les 10% avec une inhibition complète à 12%. Celle de Clavispora lusitaniae atteint les
8% avec une inhibition totale à 10%. La souche de référence CEN.PK122-2N montre une
résistance importante allant jusqu’à 16%. Cependant, la souche Issatchenkia orientalis s’est
révélée la plus résistante à la toxicité de l’éthanol et d’une manière significative puisqu’elle
peut se développer en présence de 18% d’éthanol.
A 40°C, H. uvarum ne pousse pas, quand à T. asahii, sa résistance ne dépasse pas les 8%. La
résistance de la souche K. ohmeri baisse à 5% et de la souche de référence à 10%. En
revanche, une reprise de croissance de la souche C. lusitaniae a été constatée à cette
température mais avec un aspect de colonies différent, ceci laisse supposer l’apparition de
mutants. La souche I. orientalis reste la souche la plus résistante même à 40°C, une
température favorable à sa croissance comme il a été montré précédemment et à sa
production en éthanol, puisque cette production est meilleure à 42°C comme il a été
démontré par d’autres études (Gallardo et al., 2010 et Kwon et al., 2011)
On peut en déduire que lorsque la température et l’éthanol induisent des effets synergiques
sur la croissance, la résistance de ces levures diminue. Ceci a été montré chez S. cerevisiae
où la contribution de la température de la fermentation combinée avec le stress éthanol
influe sur la production en biomasse, la viabilité cellulaire et les différents types de
production notamment celle de l’éthanol et du glycérol (Aldiguier et al., 2004). Cependant
82
Résultats et Discussion
d’autres travaux ont bien montré que la concentration critique de l’éthanol à partir de
laquelle la levure cesse de croître est influencée par plusieurs facteurs (Casey et Ingledew,
1986 ; Van Uden, 1985 ; D’Amore et Stewart, 1987 et Jones, 1989).
Nous avons voulu compléter ce travail en étudiant l’effet de ces deux stress sur ces souches
dans un milieu minimum (YNB), ceci permettrait de mieux cerner l’impact du stress et de le
gérer efficacement au cours des fermentations en conditions contrôlés. La figue 19 montre
la gamme de concentration d’éthanol au cours de laquelle on note l’effet inhibiteur pour les
différentes souches analysées.
Figure 19: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YNB
solide incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)
A 30°C, les souches H. uvarum, T. asahii, K. ohmeri et C. lusitaniae donnent les mêmes
résultats que sur YPD. La souche I. orientalis donne une croissance très faible avec 16 et 18%
d’éthanol. Quand à la souche de référence sa croissance s’est arrêtée à la concentration en
éthanol de 14%.
Par contre à 40°C, dans des conditions minimum on note une baisse significative de la
résistance qui est passée à 5% pour la souche de référence, K. ohmeri et T. asahii et à 10%
pour la souche I. orientalis qui reste la souche la plus résistante. Il importe également de
noter qu’aucun mutant n’a été observé chez la souche C. lusitaniae sur ce milieu dont la
résistance ne dépasse guerre les 5% à cette température. La souche d’Issatchenkia orientalis
83
Résultats et Discussion
possède donc un caractère de très grande valeur en termes de résistance, ce qui peut
impliquer son utilisation à l’échelle industrielle en particulier pour la production de l’éthanol.
Cette étude est importante car Saccharomyces cerevisiae, producteur traditionnel d’éthanol,
a toujours été considérée comme une souche sensible aux fortes concentrations en éthanol
(Bai et al., 2004 ; Pina et al., 2004). Différentes stratégies ont été utilisées afin d’améliorer la
production d’éthanol et la viabilité de Saccharomyces cerevisiae comme la composition du
milieu, les paramètres de fonctionnement et le niveau d’oxygène (Zhao et Bai, 2009).
D’autres travaux se sont intéressés à une alimentation exponentielle en vitamines (Alfenore
et al., 2002) et en acides aminés qui ont un effet protecteur (Morita et al., 2003 ; Sekine et
al., 2007 et Takagi, 2008) comme l’isoleucine, la méthionine, la phénylalanine et la proline
(Hirasawa et al., 2007 ; Ding et al., 2009).
L’extrait de levure, qui a également un rôle dans la protection des cellules (Casey et al.,
1983 ; Thomas et Inglewed, 1992 ; Thomas et al., 1993 ; Jones et Ingledew, 1994), le
magnésium (Dombek et Ingram, 1986 et Birch et Walker, 2000), l’ammonium (Leao et Van
Uden, 1986 ; Jones et Ingledew, 1994 et Nissen et al., 2000) et le calcium (Nabais et al.,1988)
ont également fait l’objet de plusieurs utilisations pour contrer l’effet de l’éthanol. Mais les
résultats restent toujours très limités et cette souche de levure demeure toujours incapable
de résister à des taux très élevés d’éthanol. La tolérance à cet alcool montre une complexité
importante qui implique de multiples gènes (Hu et al., 2007). Plus de 400 gènes tolérants à
l’éthanol ont été répertoriés (Alexandre et al., 2001 ; Fujita et al., 2004 ; Teixeira et al.,
2009 ; Ma et Liu, 2010).
Devant cette incapacité de créer une souche de Saccharomyces cerevisiae avec une
tolérance bien améliorée, des levures naturellement tolérantes à l’éthanol peuvent avoir un
intérêt fondamental pour les scientifiques et économique pour les industriels. Ces premiers
résultats obtenus avec la souche d’Issatchenkia orientalis montrent qu’elle est multi-
résistante et la capacité à tolérer divers stress est l’un des critères importants dans le choix
des souches performantes pour la fermentation. Elle peut être donc une candidate idéale et
constituer une souche robuste pour la fermentation alcoolique. Cependant, des recherches
supplémentaires et complémentaires doivent être menées afin de confirmer cette résistance
sur milieu liquide et comprendre l’origine et le mécanisme de résistance chez cette souche.
84
Résultats et Discussion
Tableau 7: Assimilation des substrats carbonés par les cinq souches de levure réalisée
sur la galerie: ID 32C
-: pas de trouble ; +: léger trouble ; ++: trouble moyen ; +++ : très bon trouble
ARA L-ARAbinose ++ - - - ++
INO INOsitol - - - - -
O Pas de substrat 0 0 0 0 0
85
Résultats et Discussion
ERY ERYthritol - - - - ++
MEL D-MELibiose - - - - -
GLN GLucosamiNe ++ - ++ - ++
ESC ESCuline ++ ++ ++ - -
citrate de fer
Comme prévu toutes les espèces de levures ont consommé de façon très active le glucose et
le galactose comme sources de carbone. Ces sucres simples représentent les formes
préférentielles de transport à l’intérieur de la cellule (Botton, 1991).
Cette analyse qualitative a montré que le spectre des sources de carbone utilisées par ces
souches ressemble beaucoup à celui trouvé dans la littérature excepté pour la souche
86
Résultats et Discussion
d’Issatchenkia orientalis. Cette souche isolée à partir du lait de chamelle du Sahara algérien
est sans doute génétiquement différente de celle qui a été isolée à partir du sirop de la
canne à sucre par Gallardo et ses collaborateurs et qui était incapable de croitre sur du
saccharose (Gallardo et al., 2011) et de la souche DMKU-3ET15, isolée à partir des saucisses
de porc fermentés incapable aussi de se développer sur du galactose, du maltose, du
saccharose et du melizitose (Yuangsaard et al., 2013).
Figure 20: Culture des cinq souches de levures sur les milieux YPD, YNB et MMS solides
incubées à 30°C
Cette première culture réalisée sur ces milieux à l’état solide a montré que ces levures
trouvent tous les éléments nécessaires à leur synthèse et leur besoin énergétique dans ces
milieux en affichant une bonne croissance. Ceci à l’exception de la souche Hanseniaspora
uvarum qui exige trois vitamines pour croitre sur MMS: la vitamine B 2 (riboflavine), la
vitamine B3 (niacine) et la vitamine B9 (l’acide folique) comme le montre la figure 21. Il
importe de noter que la composition du milieu YNB sur lequel elle a donné une croissance
positive et l’échantillon biologique à partir duquel elle a été isolée (les dattes) nous ont aidé
dans la détermination de son auxotrophie pour ces trois vitamines.
87
Résultats et Discussion
En effet, la riboflavine (vitamine B2) et l’acide folique (vitamine B3) font partie des vitamines
qui représentent des facteurs de croissance pour certaines souches de levures. Par contre, la
niacine (Vitamine B9) qui est impliquée par l’intermédiaire des NAD + et NADP+ dans la
synthèse de l’ATP, est synthétisée par la plupart des levures (Henry, 1983).
88
Résultats et Discussion
40 40
C. lusitaniae YPD K. ohmeri
35 35
MIN
30 30
25 25
DO 600
20 20
15 15
10 10
5 5
0 0
11
14
17
20
24
9,5
3,5
6,5
0
2
12,5
15,5
18,5
25,5
0 3,5 6,5 9,5 12,5 15,5 18,5 24
40 40
I. orientalis T. asahii
35 35
30 30
25 25
DO 600
20 20
15 15
10 10
5 5
0 0
8
0
2
12,5
15,5
18,5
25,5
11
14
17
20
24
3,5
6,5
9,5
Figure 22: Cinétique des quatre souches de levures sur les milieux YPD et MMS,
incubées à 30°C
Le dosage du glucose et des métabolites à savoir l’éthanol, le glycérol et les acétates dans les
milieux de cultures précédents a été déterminé par HPLC. Les résultats représentés par la
figure 23 montrent que les souches C. lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri et I. orientalis
produisent, sur YPD, de l’éthanol à des quantités variant entre 4 et 6 g/L. Cette production
est très proche de celle de la CEN.PK122-2N qui atteint les 8 g/L. Même constatation pour le
glycérol et les acétates dont la production est assez faible.
Des résultats similaires ont été obtenus sur MMS à l’exception de la souche H. uvarum qui
exige sur ce support un supplément des trois vitamines citées précédemment. Seule la
souche T. asahii ne présente aucune production intéressante et les concentrations de
l’éthanol et du glycérol données sont très faibles. En effet, les levures sous la forme
89
Résultats et Discussion
10 10
Clavispora lusitaniae Hanseniaspora uvarum
9 9
Eth/YPD
8 8
Eth, gly,Acét (g/L)
7 Eth/MIN 7
6 Gly/YPD 6
5 5
Gly/MIN
4 4
3 Acét/YPD 3
2 Acét/MIN 2
1 1
0 0
1 2 3 4 1 2 3 4
10 10
Kodamaea ohmeri Issatchenkia orientalis
9 9
8 8
Eth, Gly, Acét (g/L)
7 7
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
1 2 3 4 1 2 3 4
10 10
Trichosporpon asahii CEN.PK122-2N
9 9
8 8
Eth, Gly, Acét (g/L)
7 7
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
1 2 3 4 1 2 3 4
Points de prélèvement Points de prélèvement
indépendante révèlent un métabolisme plus actif que sous la forme mycélienne. Ceci est
fonction du rapport des masses et des surfaces respectives car elles offrent une plus grande
aire de contact avec le milieu extérieur.
90
Résultats et Discussion
Sur la base de ces analyses, on peut conclure qu’à l’exception la souche T. asahii qui semble
différente car présente un métabolisme oxydatif pur, les autres souches présentent un
métabolisme oxydo-réductif avec assimilation de glucose aux rendements très proche de
celui de Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK122-2N).
La souche Issatchenkia orientalis qui sort du lot par ses capacités de résistance a été
sélectionnée pour être comparée à la souche de référence CEN.PK122-2N. Leur croissance
en anaérobiose, la consommation du sucre et leurs productions (éthanol, glycérol et
acétates dosés en HPLC) ont été suivies sur les mêmes milieux et sous les mêmes conditions
de culture que précédemment.
Les résultats (figure 24A) montrent que tout en consommant du glucose la souche
CEN.PK122-2N produit 8 g/L d’éthanol sur YPD et environ 10 g/L d’éthanol sur MMS pendant
la croissance. Cette production se stabilise au cours de la phase stationnaire et ce métabolite
n’est pas consommé dans ces conditions d’anaérobiose. Le glycérol est produit à une
quantité double sur MMS que sur YPD.
En anaérobiose et sur YPD, la production en éthanol de la souche Issatchakia orientalis est
de 20% supérieur à celle de la souche de référence CEN.PK122-2N, une production qui
dépasse les 10 g/L (figure 24B). Il en est de même pour la production du glycérol qui est plus
importante avec des valeurs deux fois supérieures à la souche de référence.
La différence au niveau de la production de ces deux métabolites (éthanol et glycérol) par les
deux souches est très bien appréciée sur les figures 25 et 26.
91
Résultats et Discussion
Glycérol 16 16
16 16
Acétates MMS
14 YPD 14 14 14
DO 600
8 8 8 8
DO 600
6 6 6 6
4 4 4 4
2 2 2 2
0 0 0 0
6,5 9,5 23 26 6,5 9,5 23 26
A
16 16 16 16
YPD MMS
Glu, Eth, Gly, Acét (g/L)
14 14 14 14
8 8 8 8
6 6 6 6
4 4 4 4
2 2 2 2
0 0 0 0
6,5 9,5 23 26 6,5 9,5 23 26
Temps (h) Temps (h)
B
92
Résultats et Discussion
12
CN.PK-2/YPD I orient/YPD CN.PK-2/MIN I orient/MIN
10
8
Ethanol (g/L)
0
6,5 9,5 23 26
Temps (h)
Figure 25: Production d'éthanol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS)
par les deux souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)
2,5
CN.PK-2/YPD I orient/YPD CN.PK-2/MIN I orient/MIN
2
Glycérol (g/L)
1,5
0,5
0
6,5 9,5 23 26
Temps (h)
Figure 26: Production de glycérol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS)
par les deux souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)
(CN.PK-2: CEN.PK122-2N ; I orient: Issatchenkia orientalis ; MIN: MMS)
93
Résultats et Discussion
Dans ce sens et afin de comparer et de compléter les résultats obtenus par la galerie ID 32C,
des cultures sont réalisées avec cinq substrats glucidiques: le glucose, le fructose, le
saccharose et le lactose, utilisés avec le milieu YP et le xylose avec le milieu YNB. Ces sucres,
en particulier le glucose, le saccharose et le lactose représentent les sucres majoritaires des
sous-produits comme le lactosérum et les mélasses utilisés dans la production du
bioéthanol. Le résultat de leurs cinétiques est résumé dans le tableau 8. Les dosages de leurs
productions ont montré une production très faible en acétates, les autres productions à
savoir l’éthanol et le glycérol sont représentées dans le tableau 9.
Tableau 8: Croissance des cinq souches sur quatre substrats glucidiques avec leur taux de
croissance (µ [h-1])
94
Résultats et Discussion
En consommant les trois sucres (glucose, fructose et saccharose), C. lusitaniae, qui ne pousse
pas sur le lactose, produit de l’éthanol à des concentrations sensiblement égales autour de 5
g/L. Cependant, une croissance insignifiante avec le saccharose et le lactose est observée
chez la souche Hanseniaspora uvarum. En revanche, avec les autres sucres elle donne une
production en éthanol comparable à celle de C. lusitaniae.
Le lactose ne semble pas favorable à la croissance de Kodamaea ohmeri. Par contre cette
dernière est très bien stimulée par les autres sucres, en particulier le saccharose. Les taux de
croissance obtenus avec ces sucres sont très proches et la production d’éthanol est
sensiblement égale. Même constatation pour le glycérol. Le dosage des différents sucres a
montré que chez cette souche, le saccharose qui est un diholoside est hydrolysé, comme le
précise la littérature, en glucose et fructose à l’extérieur de la membrane plasmique par des
glycosidases périplasmiques, contrairement à Saccharomyces cerevisiae où ce sucre est
transporté intact à travers le plasmalemme par un mécanisme de transport actif de type
symport-H+ (Santos et al., 1982).
La croissance de la souche Issatchenkia orientalis est beaucoup plus faible avec le lactose
qu’avec les autres sucres. La meilleure croissance est obtenue avec le glucose et le fructose
après une phase de latence d’un peu plus de trois heures et un taux de croissance plus élevé
que celui obtenu avec les autres sucres (tableau 8). Des études ont confirmé la fermentation
de ces deux sucres chez cette espèce (Barnett et al., 2000 et Gallardo et al., 2010). Cette
souche produit environ 8 g/L avec le glucose et le fructose, et ce dernier n’est pas assimilé,
95
Résultats et Discussion
un résultat très intéressant. De même le glycérol est produit seulement avec le glucose et le
fructose et à des taux semblables (tableau 9). L’assimilation de ces métabolites a été
démontrée chez d’autres souches d’I. orientalis par Gallardo et ses collaborateurs (2010).
Cette propriété explique son utilisation dans la production des boissons alcoolisées (Basilio
et al., 2008 et Gallardo et al., 2010).
Même si la croissance n’est pas très importante et la phase de latence est un peu plus
longue, Trichosporon asahii poussent pratiquement sur tous les sucres (tableau 8). Mais au
niveau production cette souche n’est pas intéressante (tableau 9).
Sur la base de ces analyses de croissance et à l'exception de T. asahii, les autres souches de
levures en croissance exponentielle sur glucose, saccharose et fructose montrent des
vitesses de croissance très élevées. Ces souches et en particulier K. ohmeri peuvent être
utilisées dans la valorisation des mélasses de canne à sucres et de betteraves qui
contiennent principalement du glucose et du saccharose.
Les analyses obtenues avec ces quatre sucres reflètent les résultats de la galerie ID 32C et
confirment que le glucose est le sucre utilisé par l’ensemble des levures. Ceci en plus
d’autres monosaccharides dont certains entrent directement en chaînes de réaction de la
fermentation comme le fructose. Ces sucres simples sont en effet les formes préférentielles
de transport à l’intérieur de la cellule.
l’acide acétique est produit à des quantités très faibles (données non représentés), ce
qui est mentionné dans la littérature. Cette production peut être augmentée dans un
milieu alcalin à cause de l’enzyme responsable (l’acétaldéhyde déhyrogénase) qui
fonctionne très bien en condition basique. Cet acide toxique pour les levures, ainsi
que les autres acétates traversent le plasmalemme des levures par diffusion passive.
Cette diffusion, lente à pH neutre, est favorisé par un pH acide et entraine une
acidification à l’origine d’une protéolyse généralisée conduisant à la mort cellulaire.
96
Résultats et Discussion
L’éthanol représente le métabolite majeur produit par toutes les souches excepté T.
asahii principalement avec le glucose et le fructose. Les réactions qui conduisent à
l’éthanol sont les suivantes :
L’acide pyruvique est, dans une première étape décarboxylé en CO 2 et
acétaldéhyde, grâce à la pyruvate décarboxylase qui a pour coenzyme la
thiamine pyrophosphate ;
Dans une deuxième étape l’acétaldéhyde est réduit en éthanol par l’alcool
déshydrogénase, ce qui permet la réoxydation du NADH.
Les cultures réalisées sur un milieu minimum (YNB) avec xylose comme seule source de
carbone (YNX) affichent une croissance seulement de deux souches: Clavispora lusitaniae et
Issatchenkia orientalis (figure 27).
La croissance en erlenmeyer sur xylose confirme l’incapacité des autres souches (H. uvarum,
K. ohmeri et T. asahii) à pousser avec ce substrat glucidique. Les seules souches qui utilisent
ce dernier donnent une croissance très faible en particulier I. orientalis et ceci après une
longue phase de latence (figure 28). Les dosages réalisés par HPLC ne décèlent aucune
production en éthanol (figure 29). Ce résultat explique que ces deux souches ne fermentent
pas le xylose et que ce dernier est converti en xylitol, qui en s’accumulant est connu pour
devenir toxique à la cellule (Hahn-Hägerdal et al., 2007).
97
Résultats et Discussion
I.o C.l
Figure 27: Culture des cinq souches sur milieu YNX (2%) solide et liquide
C.lusitaniae I.orientalis
40
35
30
DO 600
25
20
15
10
5
0
0 3 4,5 7,5 24 28 33 48 54 58 67 73
Temps (heures)
98
Résultats et Discussion
DO 600
20 20
15 10 15 10
10 10
5 5
5 5
0 0 0 0
28 48 54 67 73 28 48 54 67 73
Temps (heures) Temps (heures)
Les études réalisés sur la conversion de ce sucre soulignent deux enzymes métaboliques clés
que les levures utilisent dans la dégradation du xylose: la xylose réductase (XR) et la xylitol
déshydrogénase (XDH). Chez la levure, la phosphorylation des pentoses s’effectue
généralement après la transformation des aldopentoses en cétopentoses (pentuloses), ainsi,
le D-xylose est isoméré en D-xylulose. Ces cétopentoses sont utilisés par un grand nombre
de levures mais seulement un petit nombre possédant les isomérases spécifiques utilisent
les aldopentoses. La XR convertit le xylose en xylitol et la XDH catalyse l'oxydation du xylitol
pour la production du xylulose. Ce dernier est phosphorylé par une xylulokinase (XK) en
xylulose 5-phosphate puis métabolisé en éthanol en suivant la voie de la glycolyse et la voie
des pentoses phosphate (Lee et al., 2012). Ces résultats nous laissent supposer que C.
lusitaniae possède au moins la XR (xylose réductase).
99
Résultats et Discussion
Alors que la demande des consommateurs pour ces additifs alimentaires naturels est en
hausse (Lugay, 1986 et Anonyme, 1999), l’option de l’obtention de ces produits par voie
microbienne paraît donc la plus appropriée. En effet, de nombreux travaux ont été réalisés
dans ce sens et le profil aromatique de différentes souches de levure a été étudié. C’est le
cas de quatre de nos espèces sélectionnées connues pour participer à la maturation des
fromages en améliorant et en rehaussant leurs saveurs et leurs odeurs. K. ohmeri et I.
orientalis ont été isolées respectivement à partir des produits laitiers traditionnels brésiliens
(Borelli et al., 2006) et égyptiens (El-Sharoud et al., 2009). C. lusitaniae (Wyder et Puham,
1999) et H. uvarum (Pando-Bedrinana et al., 2011) ont été isolées à partir d’autres types de
fromage comme le camembert (Chen et al., 2011). Ces souches jouent également un rôle
capital dans les boissons alcoolisées en assurant un meilleur équilibre entre les alcools
supérieurs et leurs esters (Mingorance-Cazola et al., 2003 ; Clemente-Jimenez et al., 2004 et
Baffi et al., 2011) et peuvent de ce fait avoir une valeur applicative importante dans
l’optimisation de ces derniers (Kim et al., 2008 ; Hernandez-Orte et al., 2008 et Wang et al.,
2011).
Un des objectifs de nos recherches a été d’étudier la production des arômes par ces cinq
souches. Les souches sélectionnées et la souche de référence Saccharomyces cerevisiae
CEN.PK122-2N ont été cultivées sur glucose. L’azote est apporté par le sulfate d’ammonium
dans les milieux YPD et MMS (milieu minéral synthétique), alors que le milieu MMS-AA
(milieu minéral synthétique enrichi) a été supplémenté par trois acides aminés (la leucine,
l’isoleucine et la phénylalanine). La présence de ces acides aminés provoque un besoin
anabolique chez ces souches qui les transforment en alcools par la voie d’Erlich. La nature
des sources carbonées et azotées joue donc un rôle prépondérant dans la production
d’arômes tant sur le plan qualitatif que quantitatif (Yong et al., 1985 ; Yong et Lim, 1986 ;
Berger et al., 1987 et Gross et al., 1989). L’analyse chromatographique des bouillons de
fermentation de ces levures a permis d’identifier: un alcool amylique (2MB: 2-
méthylbutanol), un alcool isoamylique (3MB: 3-méthylbutanol) et le 2-phényléthanol (2PE).
Les profils d’accumulation de ces trois alcools supérieurs sont illustrés dans la figure 30.
100
Résultats et Discussion
1000
900 2MB
800
700
2MB (mg/L)
600
500
400
300
200
100
0
YPD MMS MMS-AA
1000
3MB
900
800
700
3MB (mg/L)
600
500
400
300
200
100
0
YPD MMS MMS-AA
1000
2PE
900
800
700
2PE (mg/L)
600
500
400
300
200
100
0
YPD MMS MMS-AA
Milieux
C. lusitaniae H. uvarum K. ohmeri I. orientalis T. asahii CEN.PK122-2N
Figure 30: Profil d’accumulation des alcools supérieurs (2MB, 3MB et 2PE)
101
Résultats et Discussion
Nous observons que la souche T. asahii ne produit aucun de ses alcools. Elle a été plutôt
utilisée pour la production de la coumarine en assimilant des phénylalcanes avec des chaînes
d’alkyle de 7 à 12 atomes de carbones (AWE et al., 2009). Ce produit a une odeur douce,
poudrée et amandée qui évoque le foin et le tabac, est très utilisé en note de fond dans de
nombreux parfums orientaux et est un excellent fixateur. En revanche les résultats obtenus
avec les autres espèces montrent des productions variables.
La production de ces composés aromatiques est plus importante sur YPD, milieu complexe
riche en acides aminés qui proviennent de la peptone. En revanche elle est très faible sur le
MMS, ce qui était attendu car c’est un milieu minimum qui ne possède que le sulfate
d’ammonium comme seule source d’azote. Lorsqu’on ajoute au milieu MMS les acides
aminés, précurseurs de ces alcools supérieurs, la production est augmentée. Ce qui indique
que la production de ces alcools supérieurs dans un milieu riche est le résultat de la
bioconversion de l’excès des chaînes ramifiées et des acides aminés présents dans le milieu
de culture par la voie catabolique Ehrlich (Hazelwood et al., 2008).
Sur YPD, c’est Issatchenkia orientalis qui semble trouver dans ce milieu les acides aminés
nécessaires à la synthèse de ces alcools en particulier le 3MB et le 2PE dont la production
dépasse légèrement les 150 mg/L, suivie de la souche de référence (CEN.PK122-2N) et de
Kodamaea ohmeri (exception faite pour le 2PE). Pour les souches Clavispora lusitaniae et
Hanseniaspora uvarum, la production la plus importante qui a été noté sur ce milieu est celle
du 3MB qui est autour de 100 mg/L.
Les acides aminés (leucine, isoleucine et phényalanine) semblent bien stimuler la production
de ces alcools pour les autres souches, mais à des concentrations différentes:
102
Résultats et Discussion
Parmi les espèces testées, C. lusitaniae peut être sélectionnée pour la production du 2-
méthylbutanol, K. ohmeri pour la production du 3-méthylbutanol et I. orientalis pour la
production du 2-phényléthanol.
Les esters correspondant à ces alcools supérieurs (2MBA, 3MBA et 2PEA) sont au dessous du
seuil de détection pour la majorité des souches testées (donnés non représentés). Seules H.
uvarum et I. orientalis qui donnent une petite production :
103
Résultats et Discussion
CN Ta Io Ko Hu Cl CN Ta Io Ko Hu Cl
10-1
10-2 1g/L
10-3
10-4
10-1
10-2
2g/L
10-3
10-4
10-1
10-2
2,5g/L
10-3
10-4
10-1
10-2
10-3 3g/L
10-4
10-1
10-2 5g/L
10-3
10-4
30°C 40°C
104
Résultats et Discussion
Sur un milieu riche (YPD), on note une sensibilité de toutes les espèces à partir de 2 g/L de
phényléthanol, y compris la souche de référence S. cerevisiae dont la résistance ne dépasse
pas les 2,5 g/L de phényléthanol. En revanche I. orientalis montre une résistance qui atteint
les 5 g/L à une température d’incubation de 30°C et de 2,5 à 3g/L à 40°C. Sur milieu
minimum (YNB) la résistance est moins marquée même pour la souche I. orientalis qui ne
dépasse guerre 2 g/L (résultats non représentés). Ces résultats confirment l’action délétère
du phényléthanol exogène sur ces souches et traduisent une inhibition de leur croissance au
fur et à mesure que la concentration augmente dans le milieu. De plus l’effet synergique du
phényléthanol et de la température est évident sur l’ensemble des souches.
Le niveau de production très élevé du 2-phényléthanol par I. orientalis est corroboré avec la
plus grande résistance de cette espèce à ce produit. Elle se révèle donc doublement
résistante par rapport aux autres levures étudiées jusqu’à présent, en particulier S.
cerevisiae qui résiste à 2,5 g/L. I. orientalis est donc une candidate importante pour la
production du 2-phényléthanol. Il serait intéressant de poursuivre cette étude dans des
conditions contrôlées pour analyser la bioconversion réalisée par cette souche.
De même pour le phényléthanol qui est utilisé dans différents domaines et occupe la
deuxième place après l’éthanol sur le plan commercial, dont la sensibilité pose un problème
105
Résultats et Discussion
sérieux qui a incité les chercheurs et les industriels à adopter des méthodes très couteuses
comme l’extraction de cet arôme.
Des souches naturellement résistantes sont préférables car elles présentent certains
avantages par rapport au coût et à leur manipulation.
Les résultats de notre travail montrent que la souche Issatchenkia orientalis, connu
également sous le nom de Pichia kudriavezii ou Saccharomyces krusei ou Candida krusei
présente des caractéristiques intéressantes, dont une meilleure capacité de production et
une résistance à l’éthanol et au phényléthanol.
Cette souche est restée viable en raison de sa tolérance à des températures allant
jusqu’à 42°C, des conditions thermiques qui sont mortelles pour certaines souches de
Saccharomyces cerevisiae. Ce résultat est très prometteur car les levures capables de
croître et de produire de l’éthanol à grande température peuvent étendre le
processus de fermentation au-delà des limites tolérées par S. cerevisiae (35°C) (Isono
et al., 2012). En plus la sélection et l’adaptation des levures à hautes températures
est très importante dans la production à grande échelle en particulier dans les
régions tropicales où le refroidissement du système est très couteux. Certaines
souches thermo-tolérantes étaient capables de produire de l’éthanol à des
températures variant entre 30°C et 40°C comme Kluyvermyces marxianus (Singh et
al., 2006), mais aucune autre espèce n’a donné jusqu’à présent des productivités
importantes en éthanol à une température variant entre 41 et 43°C comme
Issatchenkia orientalis (Isono et al., 2012). Cette espèce peut représenter donc un
organisme de choix car la résistance à la température est un paramètre crucial pour
les procédés de bioconversion.
Elle est également tolérante aux pH acides, une tolérance allant jusqu’à 2,5 et peut
être plus. A ce pH, une souche industrielle de S. cerevisiae est capable de produire de
l’éthanol (De Molo et al., 2010) mais I. orientalis est plus résistante à l’acide lactique
(Thalagala et al., 2009) et l’acide acétique (Sarkar et al., 2012) que S. cerevisiae. Cette
tolérance aux conditions acides est très importante car elle permet de minimiser les
risques de contamination bactérienne et de réduire le coût de la stérilisation.
Cette souche affiche également une résistance aux stress osmotique et salin qui sont
d’une importance considérable à l’échelle industrielle car ils permettent de réduire le
coût du dessalement et de diminuer les risques de contamination (Isono et al.,
2012).
106
Résultats et Discussion
Une étude détaillée sera intéressante pour caractériser mieux les résistances de cette
souche. Pour atteindre cet objectif, cette partie de la thèse explore donc le comportement
de cette souche au cours du processus de fermentation en suivant les données macro-
cinétiques tels que les concentrations en substrats (glucose) et en produits (éthanol, glycérol
et acide acétique). Ce travail a été précédé par une caractérisation et une quantification de
la résistance de la souche Issatchenkia orientalis placée sous contraintes environnementales
en utilisant des concentrations croissantes en éthanol sur milieu liquide en focalisant la
viabilité cellulaire.
Les résultats de croissance où chaque courbe correspond à une culture contenant une
concentration différente en éthanol initialement ajoutée ainsi que ceux de la viabilité
cellulaire sont rassemblés dans la figure 32.
107
Résultats et Discussion
0% 5% 8% 12% 20%
100
25
50
20 40
15 30
10 20
5 10
0 0
11
25
28
30
32
34
3,5
6,5
9,5
0
2
12,5
0 10 20 30
YPD
0% 5% 8% 12% 16%
Pourcentage des cellules viables 100
45
90
40 80
35 70
30 60
DO 600
25 50
20 40
15 30
20
10
10
5
0
0
0 10 20 30
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Temps (h)
Temps (h)
YNB
Les résultats montrent qu’une baisse de croissance de la souche I. orientalis est noté à partir
de 5% d’éthanol (V/V) par rapport à la culture témoin (0% d’éthanol (V/V)) et ceci sur les
deux milieux (YPD et YNB) où on a obtenu les même résultats au niveau de la croissance et
du pourcentage des cellules viables qui est de 80%.
108
Résultats et Discussion
Une inhibition totale de la croissance est observée pour une concentration initiale en
éthanol supérieure à 12% et la viabilité cellulaire diminue de façon significative pour se
situer aux alentours de 50% sur YPD et de 70% sur YNB au bout de 20h. Cette valeur seuil
s’est avérée être différente de la valeur obtenu sur milieu solide et ceci peut s’expliquer par
la concentration cellulaire de l’inoculum utilisé. Mais cette souche reste la plus intéressante
en terme de résistance.
Il importe de noter que le test de la reprise des capacités de croissance réalisée comme
indiqué dans la partie matériel et méthodes a montré que cette dernière était positive et on
a noté en 14 h seulement une reprise de 37,32% de cellules viables sur milieu liquide et une
croissance qui était d’autant plus rapide que la concentration initiale en éthanol dans le
milieu est faible.
La fermentation présentée dans cette thèse a été réalisée en mode batch sur milieu
minimum YNB en utilisant le glucose comme substrat carboné et le sulfate d’ammonium
comme source d’azote. Plusieurs paramètres sont contrôlés et régulés: le pH à 3, la
température à 30°C et l’agitation et l’aération afin de maintenir une pression partielle en
oxygène au-dessus de 20% (cf. Matériel et Méthodes).
Pour répondre à notre objectif, l’impact de l’éthanol est suivi au cours de cette fermentation
ainsi que l’évolution des différents paramètres tels que le substrat, la biomasse, l’éthanol et
autres co-métabolites (glycérol, acide acétique) en fonction du temps.
Les résultats présentés dans la figure 33 nous permet de souligner quelques différences par
rapport aux autres souches de levures y compris la souche de référence Saccharomyces
cerevisiae.
109
Résultats et Discussion
15,00
20,00
10,00
5,00
5,00
0,00 0,00
- 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Temps (h)
Tout d’abord, le taux maximum de croissance (0,389 h-1) est obtenu dans les premières
heures et la croissance cellulaire est couplée à la production d’éthanol et du glycérol
pendant toute la fermentation. Ceci est observé chez les autres levures, principalement
Saccharomyces cerevisiae, uniquement pendant la première phase de la fermentation
(Barford, 1981 ; Van Dijken et Pronk, 1995 et Pham et al., 1998). La production de cette
fermentation est de 8,61 g/L d’éthanol, 1,50 g/L de glycérol et 0,42 g/l d’acide acétique.
On note que la production d’acide acétique est très faible et que la quantité du glycérol
produit augmente avec celle de l’éthanol. Ce comportement peut être lié, selon plusieurs
auteurs, au rôle attribué au glycérol dans la protection de la cellule «en conditions
stressantes » (Omori et al., 1996 et Nevoigt et Stahl, 1997), elle est également associée à la
production de biomasse pour l’équilibre redox.
110
Résultats et Discussion
Elle maintient de plus ses capacités de croissance et de productions ce qui est très important
et même indispensable pour l’intensification des productions microbiennes. Ajoutons à cela
son grand niveau de tolérance, une condition importante qui permet d’augmenter le
rendement en éthanol.
111
CONCLUSION GENERALE
ET PERSPECTIVES
Conclusion Générale et Perspectives
L’étude et la maîtrise de la tolérance à certains stress sont très importantes. Ces contraintes
peuvent entraîner une baisse de la croissance des levures en affectant leur production. Cette
étude traite un sujet important dans les technologies microbiennes. En complément à de
nombreux travaux qui ont étudié l’effet des différents stress sur la physiologie des levures,
ce travail permettra de prolonger ces connaissances sur d’autres levures provenant de divers
biotopes non explorés et très peu étudiées. Il s’agit des souches sauvages issues d’un
écosystème naturel particulier. Ainsi les traits originaux de ces levures peuvent être
exploités.
L’étude des caractéristiques culturales et morphologiques ont permis de mettre au point les
différences phénotypiques entre les cinq souches isolées (Clavispora lusitaniae,
Hanseniaspora uvarum, Kodamaea ohmeri, Issatchenkia oreintalis et Trichosporon asahii).
L’étude physiologique de ces souches qui a porté principalement sur l’assimilation des
différents substrats carbonés et la croissance sur différents milieux de culture, en aérobiose
et en anaérobiose a déterminé le type trophique et le métabolisme glucidique de chacune
de ces souches. Les résultats obtenus montrent qu’en anaérobiose, la souche I. orientalis
s’investit dans la production de l’éthanol qui dépasse légèrement celle de la souche de
référence et dont la production du glycérol est deux fois plus élevée que celle obtenue par la
CEN.PK122-2N. Ces analyses ont été complétées par le dosage en HPLC de la consommation
des différents substrats et de certains métabolites tels que l’éthanol, le glycérol et les
acétates. Ces dosages révèlent une production importante autour de 8 g/L d’éthanol
produite par la souche I. orientalis avec le glucose et le fructose comme substrats
glucidiques.
113
Conclusion Générale et Perspectives
La deuxième partie de ce travail a porté sur l’étude des profils aromatiques de chacune de
ces souches (C.lusitaniae, H. uvarum, K. ohmeri, I. orientalis et T. asahii) en ciblant les
molécules les plus produites par les levures telles que le 2-méthylbutanol (2MB), le 3-
méthylbutanol (3MB) et le 2-phényléthanol (2PE). Des cultures puis des extractions ont été
réalisées en utilisant trois milieux avec différents substrats azotés. Les dosages réalisés en
CPG-FID ont révélé que pour le 2MB, c’est C. lusitaniae et la souche de référence qui
donnent les meilleures productions variant entre 250 et 300mg/L. Pour le 3MB, la souche K.
ohmeri se caractérise par une production dépassant les 400mg/L. Par contre, la souche I.
orientalis a donné une production remarquable en 2PE avec une concentration très proche
des 1000 mg/L représentant pratiquement le double de la concentration donnée par S.
cerevisiae en mg/L. Le niveau de production très élevé du 2-phényléthanol par I. orientalis
est corroboré avec la plus grande résistance de cette espèce à ce produit. Elle se révèle donc
doublement résistante par rapport aux autres levures étudiées jusqu’à présent, en
particulier S. cerevisiae qui résiste à 2,5 g/L. I. orientalis est donc une candidate intéressante
pour la production du 2-phényléthanol.
Ces premiers résultats obtenus avec la souche d’Issatchenkia orientalis montrent qu’elle est
multi-résistante, la capacité à tolérer divers stress étant l’un des critères les plus importants
pour choisir des souches performantes pour la fermentation. Elle peut donc être une
candidate intéressante et constituer une souche robuste pour la fermentation alcoolique qui
est d’une importance particulière pour la production de l’éthanol. Cependant, des
recherches supplémentaires et complémentaires à l’échelle physiologique et moléculaire
doivent être menées afin de comprendre l’origine et le mécanisme de résistance chez cette
souche.
114
ANNEXES
Annexes
ANNEXE 1
116
Annexes
ANNEXE 2
117
Annexes
ANNEXE 3
IDENTIFICATION MOLECULAIRE
LES SEQUENCES:
TACGCCAGCGTCCTAGAATCGCAGGCCTCGAAAAGG
GATGGAGGCGTCAACACGAGCTATAACACGCGCGCCCGAAGGTGCGCGCC
ACATTCTCGAGTTCTTGTTCCTCCCCCCTTTTCGACGCTGGCCCGGTAAA
ACCGTGTCTGCTTGCAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTGCTGTTT
CACTCTCTTTTCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGC
TATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTT
AGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTCGGAGCCGCGGTGTACAAAG
118
Annexes
AGTCGGCGTGCGCCATACGGGGCTCTCACCCTCCCAGGCGCCATGTTCCA
ATGGACTTGGGCGCGGCCGACTCAGACCACGAAACCTTCAAATTACAATT
CCCGCAGGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGG
GGCAATCCCTGTTG
ACATCCTTGCcgAAGCGCAGTCCTCAATCCCG
GCTAACAGTATTCCAAAAAGCTATAACACTACAGAGTAGCTACATTCTTA
ATGATTTATCCTGCTGCCAGAATTGATGTTGGCCCAGTGAAATTTTTGAG
AGGCCCAAGCCCACGAGAGGCGAGTGCATGCAAAAAACACCATGTCTGAT
CAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTC
AAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTC
GCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTTGAGCTGCATTC
CCAAACAACTCGACTCTTCGAAAAAGTCTTACAGAGAAAAGGTATCCTCG
CCAAACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGAC
AAGGACCTAATCAAAGACAAATTCTACAAATTACAACTCGGGCACTGAAA
GTACCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTACCGCTTCACTCGCCGTA
CGTCGGTGTCCTCAAAGCAGGCCTCGGAAAGAGACGGGGCATGA
ACTGCGGCTATAACACCCGAGGGCCACGTTCCACAGTCTTTGTACCCCGC
TTCTTACCCACACTGACAATCTGACGGCATGCCCTTCCCTTTCAACAATT
TCACGTGCTGTTTCACTCTCTTTTCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCATCAC
TGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCTGTATTTAGCTTTAGATGGAAT
TTACCACCCACTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTCGAGAGC
GCCTTATAAGGAGCCGGGGGCCGTGCCGCACGGGATTCTCACCCTCTGTG
ACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACACGGTCGCCTCCAAGACGCAATCTT
CAAATTACAACTCCCCGGGGGGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCA
CTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCG
ACATCCTAGGCCGAAGCCGCAGTCCTCAGTC
TAAGCTGGCAGTATCGACAAAGACTATAACACACTACCGAAGCAGTGCCA
CATTTCTTTGCACTTATCCTACCGCTCAAACTGATGCTGGCCCGGTAAAC
TGTAGAGGCCACCCCCGAGAGAGTAACATACAAAATACCAAGTCTGATCT
CAAGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAA
119
Annexes
AGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGC
CAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTCCC
AAACAACTCGACTCTTCGAAGGAACTTTACATAGGTCTGGGACATCTCAT
CGCACGGGATTCTCACCCTCTGTGACGTTCTGTTCCAAGAAACATAGACA
AGAGCCAGACCCAAAGATACCTTCTTCAAATTACAACTCGGACACTGAAA
GTGCCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGCTACTAAG
GCAA
TCAAGACGGGTGAAATGGGTGGATTATGTCGTCG
GTGGCAGTGTGGAGGGTTAGGGGAGAACGCCCGAAGGCGCTCCCATTTGT
AACCCTCGTCTCGCTATCGATGACTCGGCGTCGGCAGTACACCGCCCACG
AGGGGCGGCTGAAACCTCGGCCACTCTCCACTCATTTCCTTCCCTATCAA
CAATTTCACATACTATTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCACCTTTCC
TTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCACCAGTATTTAGCTTTAGAT
GGAGTTTACCACCCACTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTTG
ATAAGGCAATACATGGAGAACGGTTAGCCAGACGGGGTTGTCACCCTCTA
TGACGTACTATTCCAAGCAACTTGGGTTAGCTTTCTCCAATGCCAAATCT
TCAAATTACAATCCCGAGGGTTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTC
GCCGTTACTGAGGCAATCCCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGC
GCATCCGTGACCTACACGGCCGCAGTCCTC
GGTCCCCGCACGCAGCATCTGGCCCTGGCTATAACACTCCGAAGAGCCAC
GTTCCAGAACCCCTTCTCCTGCAGCAAGAACCGATGCTGGCCCAGGGAAA
GCCCAGAGCGCCGCCCACGAGAGGCAGCGGTGCGCAATCCCCATGTCGGG
CGCAATACCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTGCTGTTTCACTCTCTTTT
CAAAGTGCTTTTCATCTTTCCTTCACAGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCT
CGCCAGTATTTAGCCTTAGATGGAATTTACCACCCGCTTGGAGCTGCATT
CCCAAACAACTCGACTCGTCAGAAGGGCCTCACTGCTTCCGCCGGCATCC
CACGGGGCTCTCACCCTCCTGGGCGCCCTGTTCCAAGGGACTTGGACACC
GCCTTCCACACAGACTCCAACCTGCAATCTACAACTCGTGCCGCAAAGCA
CGATTTCAAATCTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGCTACTGAGG
120
Annexes
TATGTCAACATCCTAAGCTCGAACGTGCCCGAAGGCCG
GCCATAAAGGCGAGCTGCAGTCCTCAGTCTCACCCAGTGTATGTGATAAT
AGGCTATAACACTTCCGGAGAAGTCACATTCCTACTACCTTTATCCACCG
GACAAAACTGATGTTGACCCGTTCCAAGGAAGTAGACCAGCAGAACTGGC
TGAATCCAAAGAACACGACTGACTTCAATCGTTTCCCTTTCAACAATTTC
ACGTACTGTTTAACTCTCTTTCCAAAGTGCTTTTCATCTTTCCCTCACGG
TACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTC
ACCACCCATTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTAGAAGACGT
ATCACAGAGCACCGGTGGTCGTGTTAAGTACGGGATTATCACCCTCTTTG
ATACTCCTTTCCAGGAGACTTGGACACGGTCCGGCACGGAAAACGCCTCT
ATAGATTACAACTCGGACAATCGAAGACTGCCAGATTTCAAATTTGAGCT
CTTCCCGCTTCACTCGCCGTTACTA
ATTATGCCAGCATCCTTGACTAAAAGTCGCATTCCTCAG
TCCCAGCTGGCAGTATTCCCCTGGACTATAAGTTCGTCCGCCACGAAGTG
GTAGAGCTACATTCCCAGGGATTTATCCTGCCGCCAAAACTGATGCTGGC
CCAGTGAACTGCGAGATTCCCCCACCCACGAGAGGCGAGGGGCGCAAAAC
ACCATGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTT
CACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGC
TATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTT
AGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAGGCACTCTACAAAGAA
CTGGGATCCTCGCCATACGGGATTCTCACCCTCCATGACGTCCTGTTCCA
AGGAACATAGACAAGGACCAGCCCCAGAGTCGCCTTCTACAAATTACAAC
TCGGGCACCGAAGGTACCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACT
CGCCGT
TTATGCCAACATCCTTGACAAAATGTCGCATACCTCAGT
CCCAGCTGGCAGTATTCCCCTGGGCTATAACACTCCCTCCCGAAGAAAGA
AGCCACATTCCCAGAGATTTATCCTGCCGCCAAAACTGATGCTGGCCCAG
TGAGCTGCGAGATTCCCCCACCCACGAGGAGCGAGGGGCACAAAACACCA
121
Annexes
TGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTCCTTTTTCACT
CTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCATCACTGTACTTGTTCGCTATC
GGTCTCTCGCCTGTATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAG
CTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTCGAAAGCGTTCTACAAAGAACTGG
ATCACCTCGCCTCACGGGGTTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGG
AACATAGGCAAGGGCCAGTCCCAGAATCACTTTCTCCAAATTACAACTCG
GGCACCGAAAGGTACCAGATTTCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCG
CCGT
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LISTE DES TABLEAUX
Liste des tableaux
Tableau 1: Les sources de carbone pouvant être utilisées par les levures……………………........20
Tableau 2: Provenance des échantillons biologiques utilisés pour l’isolement des levures….50
Tableau 3: Le nom et les séquences des amorces utilisés pour l’amplification des histones H3
et H4……………………………………………………………………………………………………………………………………54
Tableau 4: Résultats du séquençage des amplicons obtenus après amplification par PCR, du
domaine D1/D2 de la région 26S de l’ADN ribosomique et comparaison aux séquences de la
base de données du NCBI faites à CIRM (Grignon, Paris)……………………………………………………..69
Tableau 5: Les caractères culturaux et morphologiques des cinq souches de levure retenues
cultivées sur milieu YPD solide et liquide et incubées à 30°C …………………………………………….. 75
Tableau 6: Effet des différents stress sur les cinq souches de levures étudiées…………………..81
Tableau 7: Assimilation des substrats carbonés par les cinq espèces de levure réalisés sur la
galerie: ID 32C……………………………………………………………………………………………………………………85
Tableau 8: Croissance des cinq souches sur quatre substrats glucidiques avec leurs taux de
croissance (µ)…………………………………………………………………………………………………………………….94
155
LISTE DES FIGURES
Liste des figures
Figure 8: Fermenteur SARTORIUS, Biostat B Plus avec son système d’acquisition pour le
contrôle des différents paramètres de la croissance……………………………………………………………57
Figure 10: PCR des produits d’amplification (Amplicons H3 et H4) des 18 isolats de levures.68
Figure 11: Aspect des cultures des cinq souches sur YPD liquide à 30°C pendant 3 jours…….72
Figure 12: Aspect macroscopiques des colonies des cinq souches après 3 jours d’incubation
sur YPD solide à 30°C…………………………………………………………………………………………………………..73
Figure 13: Aspect microscopique des cellules des cinq souches après une culture de 24 h sur
YPD liquide à 30°C……………………………………………………………………………………………………………….74
Figure 14: Effet de la température sur les cinq souches de levure étudiées cultivées sur
milieu YPD solide…………………………………………………………………………………………………………………76
Figure 15: L’effet du pH sur les cinq souches de levure étudiées sur milieu YPD solide,
incubées à 30°C…………………………………………………………………………………………………………………. 78
Figure 16: Effet du NaCl (0,5M) sur les cinq souches cultivées sur milieu YNB avec une
incubation à 30°C et à 40°C…………………………………………………………………………………………………79
Figure 17: Effet du sorbitol (2M) sur les cinq souches cultivées sur milieu YNB avec une
incubation à 30°C et à 40°C…………………………………………………………………………………………………80
Figure 18: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YPD solides
incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)………………………………………………………………………………………...82
157
Liste des figures
Figure 19: Croissance des souches à différentes concentrations d’éthanol sur YNB solides
incubées à 30°C (A) et à 40°C (B)……………………………………………………………………………………….. 83
Figure 20: Culture des cinq souches de levures sur les milieux YPD, YNB et MMS solides
incubées à 30°C ………………………………………………………………………………………………………………….87
Figure 21: Culture de la souche Hanseniaspora uvarum sur MMS(A) et MMS + vitamine B2, B3
et B9 (B)………………………………………………………………………………………………………………………………88
Figure 22: Cinétique des quatre souches de levures sur les milieux YPD et MMS à 30°C……..89
Figure 23: Productions des cinq souches et de la souche de référence CEN.PK122-2N après
culture sur milieux YPD et MMS et incubation à 30°C………………………………………………………….90
Figure 25: Production d'éthanol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS) par les deux
souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)……………………………………………………………………………...93
Figure 26: Production de glycérol en anaérobiose sur deux milieux (YPD et MMS) par les
deux souches (CEN.PK122-2N et I. orientalis)……………………………………………………………………..93
Figure 27: Culture des cinq souches sur milieu YNX (2%) solide et liquide…………………………..98
Figure 30: Profil d’accumulation des alcools supérieurs (2MB, 3MB et 2PE) par les six souches
de levures étudiées sur trois milieux différents (YPD, MMS et MMS-AA)………………………….101
158