‫الجوهىريت الجسائريت الديوقراطيت الشعبيت‬

République Algérienne Démocratique et Populaire

‫وزارة التعلين العالي والبحث العلوي‬
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
‫جـاهعت هحود البشير اإلبراهيوي برج بىعريريج‬
Université Mohamed El Bachir El Ibrahimi - B.B.A.
‫كليت علىم الطبيعت والحياة وعلىم االرض والكىى‬
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie et des Sciences de la Terre et de l’Univers
‫قسن العلىم البيىلىجيت‬
Département des Sciences biologiques

Mémoire
En vue de l’obtention du Diplôme de Master

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie

Filière : Sciences biologiques
Spécialité : Microbiologies appliquée

Intitulé

Recherche et isolement de nouvelles souches pour le traitement

des eaux usées textiles

Présenté par : Kemoum Maria

Ben khalfallah Imene
Soutenu le : 09/07/2019
Devant le jury :
Président: Dr.BENSOUILAH Taqiyeddine M.C.B (Univ Mohamed El Bachir El Ibrahimi BBA)
Encadrant: Dr. BENYOUCEF Nabil M.C.B (Univ Mohamed El Bachir El Ibrahimi BBA)
Examinateur: Dr. SOUAGUI Yasmina M.C.B(Univ Mohamed El Bachir El Ibrahimi BBA)

Année universitaire : 2018/2019

 Remerciements
Nous commençons d’abord par remercier Dieu le Clément, qui nous a
procuré la patience pour aller au bout de notre objectif.
Toute notre gratitude,
A Mr. BENYOCEF Nabil notre encadrant, pour sa patience, sa
disponibilité et ses judicieux conseils qui ont contribué à alimenter notre
réflexion.
Hommages respectueux, aux membres du jury :
Mme. SOUAGUI Yasmina notre présidente
Mr. BENSOUILAH Taqiyeddine notre examinateur
Sincères remerciements,
A l’ingénieur du laboratoire de microbiologie Mme. GAHFIF Wahiba et
Mr. Khalil ingénieur de laboratoire de phytologie
de nous avoir soutenu durant la période de la réalisation de ce travail,
Aussi à Mr. Sadrati de nous avoir aidé
A tous ceux qui nous ont apporté leur support moral et intellectuel tout
au long de notre démarche.
A tous nos chers collègues de ma promotion master 2 microbiologie appliquée.
 Dédicaces
A l’homme de ma vie, mon exemple éternel, mon soutien
moral et source de joie et de bonheur, celui qui s’est toujours
sacrifié pour me voir réussir, que dieu te garde dans son vaste
paradis, à toi mon père.
A la lumière de mes jours, la source de mes efforts, la flamme
de mon cœur, ma vie et mon bonheur ; maman que j’adore.

A mon grand frère Samir et ma sœur Tina que j’aime

énormément.

Aux personnes dont j’ai bien aimé la présence dans ce jour

mon binôme Manou et mes aimables amies Linda, Sarah et
Houda et Riheb et aussi Makhlouf, Oussama,Mohamed et
Hamza. Je dédie ce travail dont le grand plaisir leurs
revient en premier lieu pour leurs conseils, aides, et
encouragements.

Maria
 Dédicaces
A l’homme de ma vie, mon exemple éternel, mon soutien
moral et source de joie et de bonheur, celui qui s’est toujours
sacrifié pour me voir réussir, que dieu te garde dans son vaste
paradis, à toi mon père.
A la lumière de mes jours, la source de mes efforts, la flamme
de mon cœur, ma vie et mon bonheur ; maman que j’adore.

A celui que j’aime beaucoup et qui m’a soutenue tout au long

de ce projet : mon mari :Sif eddine, et bien sur a mon frère
Lotfi, mes sœurs Samra, Lalima , Lamia, Sabeh et Sanae
sans oublié mon beau-père Nour eddine que j’aime
énormément qui été toujours a mes coté et aussi ma belle-mère
Zahira bien aimée.

Aux personnes dont j’ai bien aimé la présence dans ce jour

mon binôme Maria et mes aimables amies Khawla, Houda
et Ibtissem, je dédie ce travail dont le grand plaisir leurs
revient en premier lieu pour leurs conseils, aides, et
encouragements.

Manou.
Table de
matières
Liste des tableaux

Liste des figure

Liste des abréviations

Introduction générale ………………………………………………………………....……01

Partie I : synthèse bibliographique

1 Généralité sur les eaux usées ……………………………………………………………..02

I-1 Définition des eaux usées …………………………………………………………..........02

I-2 Les principaux rejets polluants………………………………………………………..….02

I-2-1 Les eaux usées domestiques ……………………………………………………….….02

I-2-2 Les eaux usées pluviales…………………………………………………………...….03

I-2-3 Les eaux usées agricoles…………………………………………………………....…03

I-2-4 Les eaux usées industrielles………………………………………………….............03

II les colorants textiles………………………………………………………………………04

II-1 Introduction…………………………………………………………………….………..04

II-2 Classification des colorants………………………………………………..………….....05

II-2-1 Classification technologique ou (appellation usuelle)………………………………05

II-2-2 Classification chimique………………………………………………………..……05

II-2-2-1 Colorants azoïques………..…………………………………………...………….05

II-2-2-2 Colorants anthraquinoniques.....………………………………….……………….06

II-2-2-3 Les colorants du diphénylamine et du triphénylméthane……...………..….………..07

II-2-2-4 Les colorants indigoïdes……………………………………………………………..07

II-2-2-5 Les colorants xanthénes………………………………………………………….…..07

 II-2-3 Classification tinctoriale……………………………………………….………..…..07

II-2-3-1 Les colorants acides au anioniques……………………………….……………..…..07

II-2-3-2 Les colorants basiques au cationiques………………………….…………………....08

II-3 Toxicité des colorants azoïques et anthraquinoniques……………………….…………..08

II-4 Pollution engendrée par les colorants textiles et leurs détections…………………....…..10

III traitement biologique des eaux usées textile…………………………………………...11

III-1 Généralité sur les traitements biologiques……………………………………….……...11

III-1-1 Décoloration par les champignons………………………..……………….…….….12

III-1-2 Décoloration par les actinobacteries…………………………………..…………….12

III-1-3 Décoloration par les algues……………………………………………...………….13

III-1-4 Décoloration par les levures………………………………………….……………..13

III-1-5 Décoloration par les bactéries………..……………………………….………….…14

III-1-5-1Dégradation des colorants azoïques par des bactéries dans des conditions limitées
en oxygène……………………………………………….…………………………….…….14

Partie II: partie expérimentale

IV Matériel et méthodes

IV.1. Introduction………………………………………………………………………….…15

IV.2. Matériel biologique……………………………………………………………………15

IV.2.1 Isolement et sélection des souches d’intérêt…………………………………….….15

IV.2.1.1.Collecte de matériel végétale………………………………………….…..……..15

IV.2.1.2. Préparation des suspensions mères…………………………………….………..15

IV.2.1.3. Isolement des souches………………………………………………………..….16

IV.2.2. Préparation des colorants et méthodologie d’analyse……………………..………16

IV.2.2.1. Préparation des colorants……………………………………………………..….16

 IV.2.2.2. Dosage des colorants………………………………………….……………........17

IV.2.3. Essai de biodégradation des colorants et sélection des souches…………………...17

IV.2.4. Préparation et dénombrement des suspensions de souches positives……………...18

IV.2.5. Etude cinétique de la biodégradation des colorants………………………….…….18

IV.2.6. Identification des souches………………………………………………………….18

IV.2.6.1. Mise en évidence de l’activité enzymatique………………….………………….18

IV.2.6.1.1. Screening de l’activité cellulasique……………………………………………19

IV.2.6.1.2. Screening de l’activité protéolytique…………………………………………..19

IV.2.6.1.3. Screening de l’activité estérasique……………………………………………..19

IV.2.6.1.4. Screening de l’activité lipolytique……………………………………….…….19

V. Résultats et discussion

V.1. Isolement et purification des souches…………………………………………….……..20

V.2. Spectre d’absorption des colorants étudiés………………………………………….….20

V.3.La sélection des souches ayant un potentiel de biodégradation…………………………22

V.4. Cinétique de biodégradation des colorants………………………..…………………….23

V.5. Identification des souches 1 et 2…..……………………………………………….…....26

V.5.1. Caractérisation phénotypique des souches sélectionnées……………………..……..26

V.5.2. Mise en évidence de l’activité enzymatique…………………………………….……26

V.5.2.1. Activité cellulasique…………………………………………………...………..…26

V.5.2.2. Activité proteolytique…………………………………………………………..….27

V.5.2.3. Activité lipolytique et estérasique…………………………………………………..28

V.5.3. Observation microscopique…………………………………………………..…….…29

Conclusion générale………………………………………........................................…...30

La liste des références bibliographiques

Annexes
Liste des figures
Titre de la figure N°de page
Figure I. 1: Exemples des groupes chromophores et auxochromes des
colorants de type azoiques 6

Figure I. 2: Exemples des groupes chromophores et auxochromes des 6

colorants de type anthraquinnones
Figure I. 3: Représentation schématique des effets des effluents de l’industrie 10
textile sur l’environnement
Figure I. 4 : Présentation d’un procédé d’ennoblissement textile 11
Figure II.1 : Solutions mères préparées 15
Figure II. 2 : Dilutions décimales et ensemencement des boites de petri 16
Figure II. 3 : Solutions mères des deux colorants 17
Figure III. 1 : Spectre d’absorption du rouge de congo 20
Figure III. 2 : Spectre d’absorption du bleu de méthylène 21
Figure III. 3 : Courbe d’étalonnage de bleu de méthylène 21
Figure III. 4 : Courbe d’étalonnage de rouge Congo 22
Figure III. 5 : Résultats du teste présomptif 23
Figure III. 6 : Cinétique de dégradation de rouge de Congo par les souches 24
sélectionnée
Figure III. 7 : Cinétique de dégradation de bleu de méthylène par les souches 25
sélectionnée
Figure III. 8 : Aspect des colonies sur milieu King A et King B 26
Figure III. 9 : Résultats de l’activité cellulasique 27
Figure III. 10 : Résultats de l’activité proteolytique 27
Figure III. 11 : Résultats de l’activité lipolytique et de l’activité estérasique 28
Liste des tableaux
Titre du tableau N°de page
Tableau I : Composant majeurs typiques d’eau usée domestique 2
Tableau II : Longueur d’onde absorbée et couleur du colorant observée 4
Tableau III : Colorant azoïque révèles mutagène et /ou carcinogènes 9
Tableau IV : Résultats teste présomptif 22
Liste des abréviations
DBO : Demande biologique en oxygéne.

TDS : Solides dissous.

Nm: Unité de longueur du Système international.

HAP : Hydrocarbure aromatique polycyclique.

Lip : Lignine peroxydase.

Mnp : Manganèse peroxydase.

UV : Ultra-violet visible.

λ : La langueur d’onde.

KDP (KH2 PO4) : Dihydrogénophosphate de potassium.

Na Cl : Chlorure de sodium.

NaNO3 : Nitrate de sodium.

NH 4Cl : Le chlorure d'ammonium.

KNO 3 : Le nitrate de potassium.

MgSO4 : Sulfate de magnésium.

CaCl2 : Le chlorure de calcium.

FeCl3 : Le chlorure de fer.

GN: Gélose nutritive.

RC: Rouge Congo.

BM : Bleu de méthylène.
Introduction générale
 Introduction générale
Introduction

En Algérie, l’eau est une denrée de plus en plus rare et de moins en moins
renouvelable, de part les changements climatiques ainsi que l’exploitation non rationnelle,
suite à l’industrialisation et l’évolution des modes de consommation.

La pollution des eaux constitue un grand danger pour l’environnement et contribue à la

dégradation des écosystèmes. Cette pollution est le résultat de l’utilisation massive des
polluants organiques et minéraux d’origine agricole, urbaine et industrielle.

L’industrie textile constitue à nos jours l’un des secteurs à forte consommation d’eau,
utilisée principalement pour le lavage des colorants de diverses natures. Cependant, les
effluents textiles constitue une menace à l’environnement, d’où la nécessité de traiter cette
pollution par le choix et l’application d’un procédé adapté à la nature des polluants à traiter.

Les procédés de traitement de la pollution par les colorants textiles sont soit basés sur
des méthodes physico-chimiques, soit des méthodes biologiques utilisant des
microorganismes capables de dégrader les colorants visés (Singh et al., 2015). En effet, la
sélection de souches à haut potentiel en traitement de la pollution des eaux par les colorants
s’avère indispensable, de part la diversité des colorants utilisés avoisinant les 100000, de
leurs structures complexes ainsi que leurs résistances à la biodégradation (Selvam et al.,
2003).

En générale, la dégradation des colorants se fait soit par clivage des groupements
chromophores, soit par transformation des cycles aromatiques ( Kodam et al., 2015).

Le présent travail s’intègre dans le cadre de développement des procédés biologiques de

traitement de la pollution des eaux textiles par la recherche et la sélection de nouvelles
souches à haut potentiel épuratoire et une meilleure adaptation aux variations de la
composition de l’effluent à traiter, qui sont les principaux problèmes rencontrés dans les
stations de traitement.

Le choix de la rhizosphère de la culture de betterave comme source de bactéries est

fondé sur le fait que la partie racinaire de la betterave rouge est riche en colorants, d’où la
probabilité de la présence de souches adaptés à cet environnement. En effet, les souches
sélectionnées seront testées sur des milieux synthétiques afin d’évaluer dans un premier temps
leurs pouvoir de biodégradation.

1
Synthèse bibliographique
Partie I Synthèse bibliographique

I-Généralités sur les eaux usées

I.1. Définition des eaux usées

Les eaux usées sont utilisées pour des usages domestiques, industriels ou même agricoles,
constituant donc un effluent pollué dans un émissaire d'égout. Ils regroupent les eaux usées
domestiques (les eaux vannes et les eaux Ménagères), les eaux de ruissellement et les effluents
industriels (eaux usées des usines) (Baumont et al., 2004).
I.2.Les principaux rejets polluants
Les rejets sont de diverses origines classées en:
I.2.1. Les eaux usées domestiques
Ces eaux sont constituées par les eaux usées ménagères provenant des usages
domestiques (eaux de bain et de lessive) et les eaux vannes (urines et matières fécales)
(Baumont et al., 2004).
Les eaux usées domestiques contiennent des matières organiques dégradables et de
matières minérales, ces substances sont sous forme dissoute ou en suspension (Tableau 1)
(Regsek, 2002).

Tableau I : Composant majeurs typique d’eau usée domestique.

Constituants Concentration (mg /l)

Fort moyen
Solides totaux 1200 700
Solides dissous (TDS) 850 500
Solides en suspension 350 200
Azote 85 40
Phosphore 20 10
Chlorures 100 50
Alcalinité (en CaCO3) 200 100
Graisses 150 100
DBO5 300 200

2
Partie I Synthèse bibliographique
I.2.2.Les eaux usées pluviales
Ce sont des eaux de ruissellement qui se forment après une précipitation. Elles peuvent
être particulièrement polluées surtout en début de pluie par trois mécanismes :
 Le lessivage des sols et des surfaces imperméabilisées ;
 Les déchets solides ou liquides déposés par temps sur ces surfaces sont entrainées
dans le réseau d’assainissement par les premières précipitations qui se produisent ;
 Par temps sec, l’écoulement des eaux usées dans les collecteurs des réseaux est lent ce
qui favorise le dépôt de matières décantables. Lors d’une précipitation, le flux d’eau
plus important permet la remise en suspension de ces dépôts (Regsek, 2002).
I.2.3. Les eaux usées agricoles
L’agriculture est une source de pollution des eaux non négligeable car elle apporte les
engrais et les pesticides. Elle est la cause essentielle des pollutions diffuses (Metahri, 2012).

Les pollutions dues aux activités agricoles sont de plusieurs natures :

 Apport des eaux de surface de nitrate et de phosphate utilisés comme engrais ;
 Apport de pesticides chlorés ou phosphorés utilisés comme désherbants ou
insecticides ;
 Apport de sulfate de cuivre de composés arsenicaux destines à la protection des
plantes (Richarde, 1996).
I.2.4. Les eaux usées industrielles
Les eaux usées industrielles ont généralement une composition plus spécifique et
directement liée au type d’industrie considérée. Indépendamment de la charge de la pollution
organique ou minérale, de leur caractère putrescible ou non (Rodier, 2002).
Les rejets industriels peuvent donc suivre trois voies d'assainissement :
- Ils sont directement rejetés dans le réseau domestique ;
- Ils sont prétraités puis rejetés dans le réseau domestique ;
- Ils sont entièrement traités sur place et rejetés dans le milieu naturel (Baumont et al., 2004).

3
Partie I Synthèse bibliographique

II – Les colorants textiles

II-1 Introduction

Les colorants furent pendant très longtemps, extraits du milieu naturel : plantes
(garance, gaude, indigo…, animaux (cochenille, murex..) et minéraux (Donzé, 1988).
Un colorant est une substance qui possède deux propriétés spécifiques, indépendantes
l'une de l'autre, la couleur et l'aptitude à être fixée sur un support tel qu'une fibre. Cette
dernière propriété résulte de l’interaction entre la molécule du colorant et le substrat à teindre.
Ainsi, cette interaction se forme entre la partie réactive de la molécule colorante et la
molécule à teindre par formation d’une liaison sélective.

Les colorants peuvent absorber la lumière de longueur d'onde située dans la région
visible (350–700 nm); ils sont colorés et détectables même à la concentration de 1 mg.L-1. De
plus, l'absorption de la lumière due aux colorants textiles pose un problème pour les plantes
aquatiques photosynthétiques et les algues (Needles, 1986 ; Singh, 2015).

Tableau II: Longueur d’onde absorbée et couleur du colorant observée (Needles, 1986).

Longueur d’onde (nm) Couleur absorbée Couleur observée

400–435 Violet jaune vert
435–480 Bleu Jaune
480–490 Vert-bleu Orange
490–500 Bleu-vert Rouge
500–560 Vert Rose
560–580 Jaune-vert Violet
580–595 Jaune Bleu
595–605 Orange Vert-bleu

Cependant, les colorants se distinguent des pigments : les premiers sont solubles dans le
bain de teinture (aqueux) tandis que les derniers sont insolubles, ils sont mis en suspension
dans un liant organique. Les deux classes se regroupent dans la famille des matières
colorantes (Needles, 1986 ; Defosse, 1991).

4
Partie I Synthèse bibliographique
II-2 Classification des colorants

Les colorants synthétiques sont classés selon leur structure chimique et leur méthode
d’application sur différents substrats (textiles, papier, cuir, matières plastiques, etc.).

II-2-1 Classification technologique ou (appellation usuelle)

La classification technologique permet à l’utilisateur de connaître le mode d’application

du colorant, et donc ses domaines d’utilisation, ses propriétés (solubilité, affinité pour tel type
de fibres ou matériaux, nature de la fixation …). Il est souvent difficile de connaître la
composition chimique des colorants car la confidentialité sur la composition chimique est
généralement préservée. Cette classification comprend trois éléments :
-Le nom générique de la classe d’application ;
-La couleur ;

-Le numéro d’ordre chronologique d’inscription au "colour index" (Yang et al., 2005).

II-2-2 Classification chimique

Le classement des colorants selon leur structure chimique repose sur la nature du
groupement chromophore qui les compose on distingue :
II.2.2.1. Colorants azoïques
Les colorants azoïques sont des composés aromatiques, contenant un groupement
azoïque (-N=N-) ou plus (colorant diazoïques, triazoïques.. polyazoïques). Ces colorants
constituent la plus large classe des colorants synthétiques utilisés dans les applications
commerciales. En 1994, la production mondiale en colorants a dépassée 1 million de tonnes,
dans laquelle plus de 50% sont des colorants azoïques. Ces derniers, trouvent plusieurs
applications dans différents domaines: textile, alimentaire, cosmétique, papetière etc (Chang
et Lin, 2001).
Cependant, les composés azoïques sont des composés analytiques utilisés comme des
indicateurs de pH et des indicateurs de complexométrie. De même, les composés azoïques ont
montré plusieurs activités biologiques, antibactériennes, antifongiques, pesticides, antivirale
et antinflammatoire (Patai, 1997).

5
Partie I Synthèse bibliographique

Figure I.1: Exemples des groupes chromophores et auxochromes des colorants de types
azoïques

II.2.2.2. Les colorants anthraquinoniques

La structure de ces colorants est basée sur le noyau anthraquinone 9,10 qui présente le
groupe chromophore carbonyle : >C=0 sur un noyau quinonique qui est le chromogène. Avec
leurs large gamme de nuances (toutes les couleurs du spectre du visible) mais particulièrement
bleue et turquoise, ces colorants constituent la deuxième classe de colorants commerciaux
(15% des colorants synthétiques) (Hunger, 2003). Les colorants anthraquinoniques
complètent les colorants azoïques jaunes, orange et rouges (Aspland, 1997).

En effet, ils constituent la classe des colorants présentant la plupart du temps les
meilleures stabilités à la lumière et aux agents chimiques (Perrin, 1993).

Figure I. 2: Exemple de groupe chromophore et auxochrome des colorants de types

anthraquinonnes.

6
Partie I Synthèse bibliographique
II.2.2.3 Les colorants du diphénylamine et du triphénylméthane
Les colorants triphénylméthanes dérivent du triphénylméthane, qui est un hydrocarbure
possédant trois cycles phényle liés a un carbone central. On retrouve cette structure de base
dans un grand nombre de composés organiques colorés. Les colorants triphénylméthanes et
leurs dérivés hétérocycliques constituent la plus ancienne classe de colorants synthétiques.

II.2.2.4 Les colorants indigoïdes

Tirent leur appellation de l’indigo dont ils dérivent. Ainsi, les homologues sélénié,
soufré et oxygéné du bleu indigo provoquent d’importants effets hypsochromes avec des
coloris pouvant aller de l’orange au turquoise.

II.2.2.5 Les colorants xanthènes

Le composé le plus connu est la fluorescéine, ils sont dotés d'une intense fluorescence.
Peu utilisés en tant que teinture, leur usage est bien établi comme marqueurs lors d'accidents
maritimes ou comme traceurs d'écoulement pour des rivières souterraines, des flux de rejets
.… etc.

II.2.3 Classification tinctoriale

Si la classification chimique présente un intérêt pour le fabricant de matières colorantes,
le teinturier préfère le classement par domaines d’application. Ainsi, il est renseigné sur la
solubilité du colorant dans le bain de teinture, son affinité pour les diverses fibres et sur la
nature de la fixation.

II.2.3.1. Les colorants acides ou anioniques

Très solubles dans l’eau grâce à leurs groupes sulfonate ou carboxylate, ils sont ainsi
dénommés parce qu’ils permettent de teindre les fibres animales (laine et soie) et quelques
fibres acryliques modifiées (nylon, polyamide) en bain légèrement acide.
L'affinité colorant - fibre est le résultat de liaisons ioniques entre la partie acide
sulfonique du colorant et les groupes amino des fibres textiles (Bauer et al., 2001; Ganech et
al., 1994; O’Neil et al., 1999; Pande et al., 2007).

7
Partie I Synthèse bibliographique
II.2.3.2 Les colorants basiques ou cationiques
C’est la classe des colorants porteurs d’ions positifs et reconnus pour leurs nuances
brillantes, les colorants basiques se composent de grosses molécules et ce sont des sels
solubles dans l’eau. Ils ont une affinité directe pour la laine et la soie et peuvent être utilisés
sur le coton. La solidité des colorants basiques sur ces fibres est très faible. Ces colorants ont
bénéficié d’un regain d’intérêt avec l’apparition des fibres acryliques, sur lesquelles ils
permettent des nuances très vives et résistantes (Ganech et al., 1994; O’Neil et al., 1999;
Bauer et al., 2001; Pande et al., 2007).

II.3 Toxicité des colorants azoïques et anthraquinoniques

Ces deux classes de colorants sont xénobiotiques et récalcitrants, ils présentent des
effets toxiques : létales, génotoxiques, multigéniques et cancérigènes pour les organismes
aquatiques, les animaux, les plantes, et l’homme (Xu et al., 2007 ; Gottlieb et al., 2003).

En effet, des problèmes de santé très sévères ont été causés par la plupart des colorants
azoïques, l’exposition prolongée provoque des problèmes d’allergie cutanée et pulmonaire et
de graves problèmes des cancers cutanés et de la vessie (Sharma et Sobti, 2000).

De plus, les colorants azoïques sont suspectés d’être cancérigènes et mutagènes,

beaucoup plus par la formation des amines aromatiques potentiellement cancérigènes issus
surtout de la réduction de ces colorants azoïques sous l’effet de biodégradation anaérobie par
les bactéries gastro-intestinales des mammifères (Xu et al., 2007).

Ainsi, la toxicité des colorants azoïques est accrue par la nature et la position des
substituant sur le noyau aromatique notamment des groupes nitro (-NO2) et halogènes.

Cependant, la substitution avec des groupes carboxyliques ou sulfonates diminue la toxicité

(Chung et Cerniglia, 1992).

8
Partie I Synthèse bibliographique
Tableau III: Colorants azoïques révélés mutagènes et/ou carcinogènes.

Colorants azoïques Effets mutagène et/ou carcinogène Références

Soudane I : mono azoïque Mutagène et carcinogène

Soudane II Carcinogène
Soudane III : diazoïque Carcinogènicité non évalué (Chen, 2006)
Soudane IV Mutagène
Rouge de Para Mutagène et carcinogène
Colorant azoïque à base de
benzidine : vert direct 1 ; noir
direct 38 ; rouge direct 17 ; Carcinogènes (Gotlka et al.,
rouge direct 28 ; bleue direct 2004)
2
Bleu disperse 373 ; violet Très mutagènes et carcinogènes (Alves de Lim et
disperse 93 et orange disperse al., 2007)
37
N,N-diméthyl-4-méthyle-4- Très mutagènes et carcinogènes (Yahagi et al.,
aminoazobenzéne 1975)
Rouge de méthyle et Jaune de Très mutagènes (Chung et al.,
méthyle 1981)
Bleu disperse 291 Mutagènes (Umbuzeiro et al.,
2005)
3-méthyl-diaminoazobenzéne carcinogènes (Medvedev et al.,
1988)
(Duilardet et
Orange de méthyle Mutagène Hofnung 1993;
Ben Mansour et
al., 2009)
(Ben Mansour et
Acide violet 7 Mutagène et carcinogène al., 2009; Ben
Mansour et al.,
2010)

Les colorants anthraquinoniques sont les colorants les plus résistant à la dégradation à
cause de leur structure aromatique spéciale ce qui leur confère une meilleure stabilité de la
couleur au cours du temps (Anjaneyulu et al., 2005 ; Banat et al., 1996).
L’absorption des colorants par les rats conduit en leur métabolisme en 1-hydroxy- et 2-
hydroxyanthraquinone, le premier provoque le cancer d’estomac, de l’intestin et du foie et le
deuxième est mutagénique. (Brown et al., 2000).
Des risques mutagéniques signifiant sur le système nerveux central voire un effet
cancérigène mortel de l’homme sont provoqués (Itoh et al., 1996 ; IARAC, 2011).

9
Partie I Synthèse bibliographique
De plus, les colorants de la famille 2-aminoanthraquinone sont irritants pour la peau, les yeux
et le système respiratoire (Carmen et al., 2012).
II.4 Pollution engendrée par les colorants textiles et leurs détections

L’industrie textile est l’une des industries anciennes et technologiquement complexes

dans le monde, cette industrie utilise un grand volume en eau et en matières colorantes.
(Carmen et Daniela, 2012).

Cependant, les effluents textiles sont classés parmi les effluents les plus pollués dans
les différents secteurs. Ce sont des mélanges complexes contenant plusieurs substances
polluantes : colorants, métaux lourds, et des additives chimiques utilisés au cours des
opérations de teinture et d’impression (Carmen et Daniela, 2012; Ratna et Padhi, 2012).

Ces composés sont caractérisés par une très bonne stabilité à la lumière, à la
température, aux détergents et aux attaques chimiques et microbiologiques
(Babuponnusamie et Muthukumar, 2014 ; Drumond et al., 2013 ; Torres-Duarte et
Vazquez-Duhalt, 2010). Les différents impacts environnementaux provoqués par les
colorants sont schématisés sur la figure I. 3:

Figure I. 3: Représentation schématique des effets causés par les effluents de l’industrie
textile sur l’environnement (Babuponnusami et Muthukumar, 2014).

En effet, au cours des différentes étapes de teinture, une bonne quantité de colorant
basique est perdue par manque d'affinité avec les surfaces à teindre (Carmen et Daniela,
2012), représentant ainsi une source de pollution esthétique (certains colorants sont visibles en
-1
solution à une concentration inférieure à 1 mg.l ) (Husain et Husain, 2012 ; Khan et al.,
2013).

10
Partie I Synthèse bibliographique

III- Traitement biologique des eaux usées textiles

III-1 Généralités sur les traitements biologiques

Le secteur textile fait partie des six branches d’activités générant la moitié des flux
industriels. Les effluents issus de ce secteur peuvent être très colorés et difficiles à traiter.
La coloration de ces eaux usées est de plus en plus perçue comme une nuisance
importante. La plus grande part des effluents est représentée par l’ennoblissement qui englobe
les prétraitements (désencollage, blanchissement), la teinture ou l’impression et les opérations
qui confèrent aux fibres textiles des propriétés particulières.

Figure I. 4: Présentation d’un procédé d’ennoblissement textile (Hao et al., 2000).

Les procédés d’épuration par voie biologique sont basés sur la biotransformation
microbienne des colorants. Des recherches ont démontré la biodégradation partielle ou
complète des colorants par des cultures bactériennes, des champignons et d’algues. Par
ailleurs, le traitement biologique pour la dégradation des effluents textiles peut être aérobie,
anaérobie ou combiné selon le type de micro-organisme utilisé (; Zimmermann et al., 1984 ;
Vijaya et Sandhya, 2003 ; Singh et Singh, 2015 ).

11
Partie I Synthèse bibliographique
III.1.1.Décoloration par les champignons

Les champignons blancs de putréfaction (white-rot fungi) sont capables de dégrader la

lignine: structure polymère des plantes. Phanerochae techrysosporium est le champignon le
plus étudié en regard de la dégradation des xénobiotiques tels que les dioxines, les
hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et autres composés organiques chlorés
(Fujian et al., 2001).

Contrairement aux bactéries, la dégradation des colorants par les champignons est
extracellulaire. Le mécanisme d’action des deux enzymes LiP et MnP est similaire : le
mécanisme commence par l’oxydation de ces enzymes durant leur cycle catalytique par H 2O2,
la forme oxydée ainsi formée serait immédiatement réduite à sa forme d’origine par un
substrat qui est le colorant azoïque.

La différence entre ces deux enzymes est que la LiP oxyde les composés aromatiques
phénoliques et non phénoliques, alors que le MnP oxyde le Mn2+ en Mn3+, ce dernier étant
responsable de l’oxydation des composés phénoliques uniquement (Banat et al., 1996;
Fujian et al., 2001; Eichlerova et al., 2005; Harazono et Nakamura, 2005).

Le traitement des rejets textiles chargés en colorants par les champignons pose
beaucoup de problèmes. En effet, l’effluent textile n’est pas l’environnement adéquat pour la
croissance et la conservation de la biomasse fongique (Robinson et al., 2001), car le
traitement des colorants dans un volume d’eau important (unité de traitement biologique)
étant très difficile, il est donc nécessaire de concentrer les colorants en réduisant la quantité
d’eau (Nigam et Marchant, 1995; Nigam et al., 1996).

III.1.2. Décoloration par les actinobactéries

Les actinobactéries, en particulier le genre Streptomyces, produisent les peroxydases
extracellulaires qui jouent un rôle primordial dans la biodégradation de la lignine (Oxydation),
aboutissant à la production de composés polymériques hydrosolubles. La capacité des
actinobactéries à décolorer mais aussi à minéraliser les colorants textiles, notamment
azoïques, a été étudiée initialement par trois groupes de chercheurs.
Ball et al., (1989) ont testé 20 souches d’actinobactéries, représentant un large éventail
de ce genre, pour leur capacité à décolorer le Poly R (colorants alimentaire). Ces auteurs ont

12
Partie I Synthèse bibliographique
observé que seulement trois souches (Streptomyces badius 252, Streptomyces sp. souche
EC22 et Thermomonospora fusca MT800) décolorent significativement le colorant.

Zhou et Zimmermann (1993) ont testé séparément l’aptitude de 159 actinobactéries à

dégrader les colorants synthétiques. Cette étude a été réalisée dans des conditions aérobie sur
des effluents textiles similaires contenant séparément des colorants réactifs de structures
différentes (le rouge réactif 147 et le bleu réactif 116). Les auteurs ont isolé83 souches
capables de décolorer et de minéraliser ces colorants. Enfin, un groupe de l’Université de
l’Idaho a testé la capacité des microorganismes ligninolytiques: champignons blancs de
putréfaction et Streptomyces, à décolorer et minéraliser des colorants textiles. Dans cette
étude, 14 souches de Streptomycètes se sont révélées efficaces sur la dégradation de deux
colorants : le Poly B 411 et le Poly R 478. Les auteurs ont suggéré l’implication de
peroxydases dans le processus de décoloration (Pasti et al., 1990).

III.1.3. Décoloration par des algues

L’action décolorante des algues a fait l’objet d’un nombre très limité de travaux. Une
étude réalisée par Jinqi et Houtian (1992) a montré que les espèces Chlorella, Oscillatoria et
Spirogyra étaient capables de dégrader les colorants azoïques. Leurs action décolorante dérive
de l’expression d’une azoréductase (enzyme responsable de la fission de la liaison
azote‑azote) aboutissant à la production des amines aromatiques correspondantes qui sont par
la suite complètement oxydées.

III.1.4. Décoloration par les levures

Les études portant sur la dégradation des colorants azoïques par des levures sont très
limitées. Ramalho et al (2002) ont testé la souche de levure Candida zeylanoides pour réduire
des colorants azoïques comme modèles. En 2004, cette même équipe a pu caractériser
l’activité enzymatique responsable de la dégradation des colorants azoïques chez Issatchenkia
occidentalis et présenter un an plus tard le système enzymatique d’azoréduction impliqué
dans un travail avec Saccharomyces cerevisiae (Ramalho, 2005).

Le nombre de travaux réalisés sur les levures reste très limité en raison de la difficulté
à les manipuler et des inconvénients majeurs qu’elles procurent. En effet, outre la difficulté à
les cultiver, l’efficacité des levures vis-à-vis des colorants est très faible (la cinétique de
décoloration est lente et peut prendre plusieurs dizaines de jours).

13
Partie I Synthèse bibliographique

III.1.5. Décoloration par les bactéries

Les bactéries impliquées dans la dégradation des colorants peuvent êtres isolées du sol, de
l’eau et même des animaux, les réactions de transformations sont de type oxydation ou
réduction selon la présence ou l’absence de l’oxygène. (Aspland, 1997; PPAH, 1998;
Kodam et Kolekar, 2015).

De nombreuses études ont montré la capacité des bactéries à dégrader les colorants.
Contrairement aux champignons et aux actinobactéries, qui dégradent les colorants par voie
extracellulaire (implication des LiP, MnP, laccases, etc.), les bactéries agiraient plutôt par
voie intracellulaire. L’action décolorante dépendrait alors non seulement de l’activité
enzymatique cytoplasmique mais aussi de la filtration des molécules à travers la membrane
cellulaire. (Aspland, 1997; PPAH, 1998; Kodam et Kolekar, 2015).

La dégradation complète ou « minéralisation » de colorants azoïques par les bactéries

est décrite par la succession de deux étapes essentielles : une azoréduction anaérobie suivie
d’une oxydation aérobie des amines aromatiques formées lors de l’étape précédente par une
communauté bactérienne mixte. L’azoréduction est décrite comme l’étape clé de la
minéralisation des colorants, notamment cette étape est suffisante pour la décoloration des
molécules (Aspland, 1997; PPAH, 1998; Kodam et Kolekar, 2015).

III.1.5.1. Dégradation des colorants dans des conditions limitées en oxygène

La dégradation des colorants azoïques par les bactéries, dans des conditions anaérobie,
a été très largement étudiée : on y distingue des bactéries strictement anaérobies (Bacteroides
sp., Eubacterium sp., Clostridium sp., Fusobacterium sp., etc.), anaérobies/aérobies
facultatives (Proteus vulgaris, Streptococcus faecalis, etc.) et aérobies (Bacillus sp.,
Aeromonas hydrophia, Pseudomonas sp., etc.).
Les conditions de dégradation dans la digestion anaérobie sont adaptées à la réduction des
colorants azoïques par clivage de la double liaison N = N appelée azoréduction, entraînant une
destruction subséquente des groupes chromophores (celle du système d’électrons π largement
délocalisé) mais pas une minéralisation complète. Les amines aromatiques résultantes étant
généralement incolores, la réduction azoïque du colorant est aussi désignée dans ce cas par «
décoloration » (Aspland, 1997; PPAH, 1998; Kodam et Kolekar, 2015).

14
Matériel & Méthodes
Partie II Matériel et méthodes
IV.1. Introduction

Le présent travail a été réalisé au sein des laboratoires de microbiologie et de chimie

analytique de l’université Mohamed El Bachir El Ibrahimi B.B.A. Dans cette partie du
document, nous exposons la méthodologie expérimentale avec le matériel utilisé.

L'objectif principal de ce travail de recherche, est la sélection de souches bactériennes

à haut potentiel en traitement des eaux usées textiles chargées en colorants de diverses
natures. Nous avons donc axé notre recherche sur les bactéries qui vivent à proximité de la
culture de la betterave rouge (Beta vulgaris) caractérisée par une coloration pourpre foncé.

IV.2 Matériel biologique

IV.2.1 Isolement et sélection des souches d’intérêt

VI.2.1.1 Collecte du matériel végétale

La betterave rouge a été collectée pendant le mois de Mars 2019 dans la région de
Leflaye, située dans la wilaya de Bejaia- Algérie.

VI.2.1.2 Préparation des suspensions mères

Afin de réalisé le screening sur un grand nombre d'espèces bactériennes, nous avons
sélectionné des bactéries à partir de deux solutions mères: la première a été obtenue par
dissolution de 10 g de sol prélevé autour des racines de betterave dans 250ml d'eau
physiologique stérile, tandis que la deuxième à été obtenue par lavage des racines de la
betterave sans les abimés avec de l'eau physiologique stérile jusqu'à l'obtention d'une solution
d'un volume total de 250ml.

Figure II. 1 : Les solutions mères des deux échantillons.

15
Partie II Matériel et méthodes
IV.2.1.3 Isolement des souches

Nous avons réalisé une série de dilutions décimales de chaque solution mère
comprises entre 10-1 jusqu’à 10-9 (1ml de solution mère dans 9ml d’eau physiologique).
Ensuite, 0,1ml de chacune de ces dilutions ensemencé en surface sur des boites de petri
contenant de la gélose nutritive avec un étalement en surface. Les boites sont mises ensuite
en incubation dans une étuve à 28°C pendant 24h. Les colonies bien séparées ainsi obtenues
subissent un isolement et une purification sur le même milieu de culture.

Figure II. 2: Dilutions décimales et ensemencement des boites de pétri.

IV.2.2 Préparation des colorants et méthodologie d'analyse

IV.2.2.1Préparation des colorants

Afin de tester les bactéries ainsi sélectionnées, nous avons choisi le rouge de Congo et
le bleu de méthylene comme colorants à dégrader. Le choix de ce deux colorants est motivé
par le fait que leur solubilité dans l'eau est élevée d'une part, et de leur utilisation en industrie
textile d'autre part. Les colorants choisis appartiennent à la classe des xanthines (le bleu de
méthylène: un colorant cationique d’indice CI52015, de formule chimique C16H18N3SCl et
une masse molaire de 319,85 g.mol-1) et la classe des azoïques (le rouge Congo: un colorant
anionique (acide) de formule brute chimique C32H22N6O6S2Na2, de masse molaire 696,7
g.mol-1) (Bandara et al., 1999).

16
Partie II Matériel et méthodes
IV.2.2.2 Dosage des colorants

Les colorants sujet à la présente étude, ont été préparés dans de l'eau distillée à raison
de 100 mg.L -1 , puis des solutions filles de concentration 2,5; 1,66; 1,25; 1; 0,83; 0,62 et 0,5;
-1
0,33; 0,25; 0,2; 0,16; 0,12 mg.L respectivement pour le RC et BM ont été préparées par
dilution de la solution mère.

Le spectre d'absorption des deux colorants a été réalisé à l'aide d'un spectrophotomètre
UV-visible avec l'eau distillée servant de control (blanc). Ensuite, l'absorbance des solutions
préparées one été mesuré à la longueur d'onde maximale. Les résultats obtenus, nous
permettra de construire une courbe étalon servant d'outil de dosage des colorants étudiés.

Figure II. 3 : Solutions mères des colorants BM et RC.

IV.2.3 Essai de biodégradation des colorants et sélection des souches

Afin de réaliser un screening des souches isolées à partir de la rhizosphère de la

betterave rouge, nous avons réalisé un test présomptif sur chaque isolat, par inoculation d'une
série de dilutions de la solution mère (10-10 à 10-20) avec les souches isolées. Afin d'éviter
toute limitation par manque de substrat, nous avons ajouté en excès une source d'azote (Na
NO3) et une source de phosphore (KH2PO4), avec un témoin abiotique servant de contrôle.
Les tubes ainsi inoculés ont été incubés à 37℃ avec une agitation modérée.

Le test est considéré positif, lorsqu’une diminution de l'intensité de la couleur est

observée après 48 heures d’incubation.

17
Partie II Matériel et méthodes
IV.2.4 Préparation et dénombrement des suspensions de souches positives

Des colonies d'une culture jeune des souches sélectionnées ont été mises en suspension
dans l'eau peptonée, afin de construire une suspension de base servant à préparer les
cinétiques de biodégradation des colorants étudiés. Chaque suspension ainsi préparée à subit
ensuite un dénombrement afin de déterminer sa charge initiale et de construire une courbe
étalon reliant la charge microbienne à la densité otique (à 660nm), afin de construire un outil
rapide de suivi de l'évolution de la biomasse au cours du temps.

IV.2.5 Etude cinétique de la biodégradation des colorants

L'étude cinétique a pour objectif de déterminer la vitesse ainsi que les conditions
optimales de biodégradation des polluants ciblés. C'est une démarche qui relève de la
construction d'un procédé et son optimisation. A cet effet, nous avons construit un réacteur
batch d'une capacité de 500ml dans lequel l'eau usée synthétique préparée par dissolution de
5mg de BM et 25mg de RC dans un litre d’eau distillée a été mise en contact avec la
biomasse décolorante avec un excès de source d’azote (NaNO3) et de phosphore (KH2PO4),
pour éviter toute limitation de la cinétique par manque de substrat. La concentration en
colorants des échantillons prélevés au cours de la cinétique a été déterminée par dosage
spectrophotométrique

IV.2.6 Recherche des souches

Dans le but de savoir le genre des souches sélectionnées, nous avons réalisé une
identification par repiquage sur des milieux sélectifs King A et King B par la méthode des
stries serrées et incubation à 30°C pendant 24 à 48h.

IV.2.6.1 Mise en évidence de l’activité enzymatique

Afin de déterminer la capacité des isolats à produire des enzymes d’intérêt industriel,
plusieurs enzymes ont été recherchées, tels que la protéase, cellulase, amylase, l’estérase et
lipase. Après repiquage des souches à partir des boites, le screening a été effectué par la
méthode des spots en duplicata. (Carrim et al., 2006).

18
Partie II Matériel et méthodes
IV.2.6.1.1 Screening de l’activité cellulasique

La présence de cellulase est révélée par le repiquage des isolats sur le milieu de
Carder (1986) qui contient en g/L: Na2HPO4 (6); KH2PO4 (3); NaCl (0,5); NH4Cl (1); extrait
de levure (3); cellulose (7); agar (15) ; pH 7,2. Le milieu a été autoclavé à 121°C pendant 20
min. Les boites ensemencées ont été incubées pendant 8jours à 37°C (Carrim et al., 2006).

A la fin de l’incubation, une solution de lugol (voir Annexe) préalablement préparée a

été dispersée sur toute la surface du milieu. Après cinq minutes de contact, l’excès a été
éliminé et les boites ont été lavées à l’eau distillée. La présence d’une cellulase extracellulaire
se manifeste par l’apparition d’un halo clair autour des colonies (Herculano et al., 2006).

IV.2.6.1.2 Screening de l’activité protéolytique

Le milieu de culture utilisé pour cette activité contient en g/l: Extrait de levure (2,5);
glucose (1), et agar (15). Le milieu a été ajusté à un pH de 7 et autoclavé pendant 20 min à
121ºC. Simultanément, 100 ml d’une solution de lait écrémé à 05 % stérile a été rajouté au
milieu. Ce dernier est ensuite ensemencé par la méthode des spots. L’activité protéolytique se
traduit par l’apparition d’un halo claire autour des colonies (Bach et Munch, 2000).

IV.2.6.1.3 Screening de l’activité estérasique

Le milieu de culture utilisé est celui utilisé par Sierra (1957). Il contient en g/L:
peptone (10); NaCl (5.0); CaCl22H2O (0.1); Tween 80 (1%, v/v) et agar (18). Le pH est ajusté
à 7,4. Le milieu est ensemencé et incubé à 30°C pendant 48h. La présence d’une activité
estérasique s’exprime par un halo autour des colonies (Sierra, 1957).

IV.2.6.1.4 Screening de l’activité lipolytique

La détermination de l’activité lipolytique est réalisée de la même manière que

l’activité estérasique, cependant, le tween 80 est remplacé par le tween 20, et le résultat positif
se traduit par la présence d’un halo autour des colonies (Sierra, 1957).

19
Résultats et discussion
Partie III Résultats et discussion
V. Résultats et discussion

V.1. Isolement et purification des souches

Les colonies bien séparées ainsi obtenu ont subit un isolement et une purification sur
le même milieu de culture (GN) par un repiquage successif. Nous avons isolé 4 souches que
nous allons par la suite testé leurs potentiel de biodégradation des deux colorants choisi à
savoir le rouge de Congo et le bleu de méthylène.

V.2. Spectre d'absorption des colorants étudiés

La détermination des spectres d'absorption des colorants étudiés (le bleu de méthylène
et le rouge de Congo) a été réalisée par la fonction ''balayage'' d'un spectrophotométre UV-
visible, dont les résultats sont illustrés dans les figures III.1 et III.2. Les longueurs d’ondes
maximales (λmax) des deux colorants sont 584nm et 664nm pour le rouge de Congo et le bleu
de méthylène respectivement.

3,5

2,5
DO (nm)

1,5

0,5

0
0 100 200 300 400 500584nm600 700 800
λ max

Figure III. 1: Spectre d'absorption du rouge de Congo.

20
Partie III Résultats et discussion
2,5

1,5
DO (nm)

0,5

0
0 200 400 600 664 nm 800

-0,5
λ max

Figure III. 2: Spectre d'absorption du bleu de méthylène.

La détermination des absorbances de la gamme étalon des deux colorants au λmax,

nous a permis de tracer les courbes étalons, afin de pouvoir les utiliser comme outil de dosage
du colorant au cours des cinétiques de biodégradation. Les valeurs obtenues sont illustrées
dans les figures III. 3 et III. 4.

0,6
y = 0,3473x - 0,0215
R² = 0,9862
0,5

0,4
DO (664nm)

0,3

0,2

0,1

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
Concentration mg.l-1

Figure III. 3 : Courbe d’étalonnage du bleu de méthylène.

21
Partie III Résultats et discussion

0,5
0,45
0,4
y = 0,178x
DO (584nm) 0,35 R² = 0,9595
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Concentration (mg.L-1)

Figure III. 4: Courbe d’étalonnage du rouge de Congo.

V.3. La sélection des souches ayant un potentiel de biodégradation

Afin de réaliser un screening des souches isolées, nous avons réalisé dans un premier
temps un test présomptif afin de sélectionner les souches ayant un potentiel en biodégradation
des colorants. Les résultats obtenus sont regroupés dans le tableau IV :

Tableau IV: Résultats du test présomptif

Souche 1 Souche 2 Souche 3 Souche 4

Rouge Congo + + - -
Bleu de + + - -
méthylène

+ : Test positif.

- : Test négatif.

Le test est considéré positif, lorsque l'intensité de la coloration diminue par rapport au
témoin abiotique. D'après le tableau ci-dessus deux souches sur quatre, soit un taux de 50%
ont montré une aptitude à dégrader le rouge de Congo et le bleu de méthylène.

22
Partie III Résultats et discussion

Souche Souche Souche Souche

01 02 01 02

Témoin
Rouge Congo Témoin bleu
de méthylène

Figure III. 5 : Résultat du test présomptif.

V.4. Cinétiques de biodégradation des colorants

Afin de mettre en évidence l'activité des souches choisies, et dans un souci d'optimiser
les conditions de la bioréaction de dégradation des colorants sujet de cette étude, nous avons
mis la biomasse enrichie des deux souches en contact avec les colorants avec des quantités
suffisantes en azote et en phosphore dans un réacteur batch, afin d'éviter les limitations par le
manque de substrat. Les colorants utilisés servent de source de carbone.

Les résultats obtenus (Figures III. 6 et III. 7) montrent que la vitesse cinétique est
linéaire et d'ordre 1. La vitesse de dégradation du colorant (rouge Congo) par la souche 2 est
meilleure comparativement à la souche 1. En effet, la souche 2 avait montré une grande
aptitude à dégrader le rouge Congo avec une vitesse cinétique de 0,044mg.L-1.h-1, alors que la
vitesse enregistrée avec la souche 1 était de 0,15 mg.L-1.h-1. Cette différence observée est due
probablement aux capacités de la souche 2 de s'adapter à cette nouvelle source de carbone, la
bactérie synthétise donc facilement les outils nécessaires pour la dégradation du rouge de
Congo en vue de l'utiliser comme source de carbone.

23
Partie III Résultats et discussion

0,32

0,31 A

Concentration (mg/L)
0,3

0,29

0,28

0,27 y = -0,0153x + 0,3328

0,26
0 1 2 3 4 5
Temps (heure)

0,2
0,18
0,16 B
Concentration (mg/L)

0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02 y = -0,0441x + 0,2014
0
0 1 2 3 4 5
Temps (heure)

Figure III. 6: Cinétique de dégradation de RC par les souches sélectionnées (A- Souche 1,
B-Souche 2).

24
Partie III Résultats et discussion

4
3,5
Concentration (mg/L)
3
2,5
y = -0,2968x + 3,7525
2
1,5
A
1
0,5
0
0 1 2 3 4 5
Temps (heure)

4,5
4
3,5
Concentration (mg/L)

3 y = -0,2622x + 4,391
2,5
2
1,5 B
1
0,5
0
0 1 2 3 4 5
Temps (heure)

Figure III. 7: Cinétique de dégradation du bleu de méthylène par les souches sélectionnées
(A- Souche 1, B-Souche 2).

Pour le bleu de méthylène, les vitesses spécifiques enregistrées sont de même ordre
quelque soit la souche utilisé (0,26 mg.L-1.h-1), ceci peut être expliqué par la difficulté de
dégradation du bleu de méthylène par les souches bactériennes, surtout lorsqu’en compare les
vitesses spécifique de dégradation enregistrées pour les deux colorants. On s'aperçoit donc
que le bleu de méthylène est difficilement biodégradable, comparativement au rouge de
Congo.

25
Partie III Résultats et discussion
V.5. Identification des souches 1 et 2

Après l’incubation des boites contenants les milieux King A et King B à 30° C
pendant 24 à 48h les résultats sont les suivants :

S2 S2

S1 S1

Figure III. 8 : Aspect des colonies sur les milieux King A et King B.

En se basant sur l’aspect des colonies sur milieu solide, ces dernières représentent une
diversité de taille (grande, moyenne et petite colonies), forme (colonies bombées), et
consistance ce qui nous orientent vers le genre de Pseudomonas.

V.5.1. Caractérisation phénotypique des souches sélectionnées

Afin de bien orienter l’identification des souches sélectionnées, il faut exploiter les
caractères de différenciation des genres bactériens. Le choix de tests biochimiques à effectuer
est fait en se basant sur les observations des bactéries à l'état frais et le Gram, (annexe) et
d'autres caractères propres à certaines espèces bactériennes.

V.5.2. Mise en évidence de l’activité enzymatique

Les deux isolats (souche 1 et 2) ont été testés pour évaluer leur capacité à produire
diverses enzymes tels que la cellulase, estérase, protéase et lipase.

V.5.2.1. Activité cellulasique

Ce test permet de mettre en évidence la capacité des bactéries à décomposer la

cellulose, l’apparition d’un halo jaune orangé autour des colonies indique la présence d’une
cellulase (Figure III. 9).

26
Partie III Résultats et discussion

Figure III. 9: Résultat de l’activité cellulasique.

Les cellulases bactériennes jouent un rôle important dans la dégradation des débris de
plantes, des parois cellulaires fongiques, l'inhibition de la germination des spores, de
l’élongation du tube germinatif et de la croissance fongique, ainsi que dans le bio contrôle des
pathogènes et des maladies de plantes.

V.5.2.2. Activité protéolytique

Cette activité se traduit par la présence d’un halo clair autour des colonies, visible sans l’ajout
d’aucun réactif (Figure III. 10).

Figure III. 10 : Résultats de l’activité protéolytique.

Dans notre travail les deux isolats ont été capables de dégrader les protéines sur gélose au lait
écrémé (Figure III. 10).

27
Partie III Résultats et discussion
Les protéases d’origine microbienne sont parmi les enzymes les plus secrétées
(Ningthoujam et al., 2009). La dégradation des protéines par les protéases microbiennes joue
un rôle important dans le cycle d’azote au niveau du sol en le rendant disponible pour les
plantes et les micro-organismes (Petit et Jobin, 2005). Les protéases sont les enzymes les
plus importantes dans le domaine industriel, elles comptent environ 40% des ventes
mondiales. Elles sont généralement utilisées dans les détergents, l’industrie alimentaires, le
cuir, le traitement de la fabrication du fromage, la récupération de l'argent et certains
traitements médicaux et pharmaceutiques (Muthulakshmi et al., 2011).

V.5.2.3. Activité lipolytique et estérasique

La présence d’une activité estérasique et lipolytique s’exprime par la présence d’un

halo autour des colonies (Figure III. 11).

Figure III. 11: Résultats de l’activité lipolytique et de l’activité estérasique.

L’activité lipolytique et l’activité éstérasique sont observées chez les deus souches
selectionées.

La synthèse des lipases et des estérases par les bactéries testées contribue à la
dégradation de la matière grasse et par conséquent, ces bactéries pourraient participer au
recyclage de la matière organique en fournissant les éléments nécessaires aux plantes (Azrou
et Guettafi, 2014).

28
Partie III Résultats et discussion
V.5.3. Observation phénotipique

Nous avons réalisé une observation microscopique des bactéries à l'état frais pour
vérifier la pureté des isolats, leur taille, la forme et le type de regroupement des cellules
bactériennes ainsi qu'une coloration de Gram.

Apres l’observation microscopique, les souches obtenues sont des bacilles de forme
bâtonnée, à paroi Gram négatif.

Les résultats des testes réalisés ont permis de classer les souches obtenues de genre
Pseudomonas qui forment un large groupe colonisant le sol, les plantes et l’eau (Allaire,
2005).

Dans le sol les Pseudomonas représentent une grande fraction de la communauté

microbienne partageant leur milieu avec des commensaux appartenant principalement aux
genres Bacillus et Actinomyces. On les retrouve un peu partout, particulièrement sur les
systèmes racinaires des plantes (Allaire, 2005).

Les différentes espèces de Pseudomonas qui colonisent la rhizosphère possèdent

plusieurs caractéristiques qui les rendent particulièrement intéressantes pour une utilisation
comme agents de lutte biologique. Elles sont connues pour produire les composés
antimicrobiens et les enzymes extracellulaires (lipase, estérase, xylanase, pectinase, amylase,
protéase et cellulase) (Allaire, 2005).

29
Conclusion générale
 Conclusion générale
Conclusion :

L’objectif du présent travail est de contribuer à l’amélioration des procédés de

traitement des effluents issues de l’industrie textile chargés en colorants, qui constituer une
nuisance à l’homme et à l’environnement dans la mesure ou la plupart d’autre eux sont
toxiques et se dégradent lentement.

Notre travail s'intègre dans le cadre du développement des procédés biologiques de

traitement de la pollution de eaux de l'industrie du textile, par la recherche de souches
bactériennes à haut potentiel en biodégradation des colorants, afin de construire une biomasse
performante permettant de traiter efficacement les effluents rejetés en vue d'une meilleure
protection des ressources hydriques.

Nous nous somme donc arrivés à isoler deux souches bactériennes avec un bon
potentiel en biodégradation des colorants synthétiques à partir des racines de la betterave
rouge, avec une appartenance au genre Pseudomonas.

L'étude cinétique de la biodégradation du bleu de méthylène et du rouge de Congo

avec les souches sélectionnées a montré que le bleu de méthylène est difficilement
biodégradable, comparativement au rouge de Congo, ou les souches bactériennes le dégradent
facilement.

30
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Annexes
Annexe I :

Materiels :

Les instruments

 Flacons stériles
 Micropipette
 Tube à essai stériles
 Pipette Pasteur
 Portoir
 Boites de Petri
 Balance électrique
 Bec Bunsen
 Autoclave
 Etuve
 Agitateur-plaque chauffante
 Un spectrophotomètre
 Bain marie
 Vortex
 Distillateur
 Compteur de colonies
Annexe II :

Milieux de culture :

 Gélose nutritive(GN) :

Dissoudre 28g dans un litre d’eau distillé, autoclaver à 121°C pendant 15min .

Composants Quantité en g/l

extrait de viande 1,0g/L

extrait de levure 2,5g/L

peptone 5,0g/L

chlorure de sodium 5,0g/L

Agar 15g/L

Gelose KingA :

La gélose King A est utilisée pour la caractérisation des Pseudomonas par la mise en
évidence de la production de pyocianine.

Dissoudre 45 g de poudre dans un litre d’eau distillé, autoclaver à 121°C pendant 15min .
Ajouter 10 cm3 de glycérol après autoclavage.

Composants Quantité en g/l

peptone dite "A" 20 g

glycérol 10 g
sulfate de potassium 10 g
chlorure de magnésium 1,4 g
agar purifié 12 g
pH 7,2
Gélose King B

La gélose King B permet la production de la pyoverdine , pigment jaune vert fluorescent sous
lumière ultra-violette, par certains Pseudomonas .

Dissoudre 37 g de poudre par un litre. Stérilisation classique. Ajouter 10 mL de glycérol après

autoclavage.

Composants Quantité en g/l

Peptone dite B 20g

Glycérol 10g
Hydrogénophosphate de potassuim 1,5g

Sulfate de magnésuim heptahydraté 1,5g

12g
Agar purifié
7,2g
pH

Eau physiologique (EP)

Dissoudre 9g de NaCl dans 1000ml d’eau distillé (pH = 7), autoclaver à 121°C pendant 15mn
Annexe III

Les étapes de coloration de Gram

 Réaliser un frottis ou un étalement : A l’aide d’une pipette Pasteur stérile, on dépose

une goutte d’eau physiologique stérile sur une lame bien propre ;
 Ensuite, une colonie bien isolée sera prélevée avec une pipette Pasteur et dissociée
dans la goutte ;
 Fixer la préparation à la flamme du bec bunsen, la faire sécher soigneusement puis la
laissée refroidir ;
 La lame sera totalement imbibée par le violet de gentiane pendant 1 min ;
 Rinçage de la lame avec de l’eau distillé ;
 le frottis sera recouvré par le Lugol pendant 1 min ;
 Lavage de nouveau avec de l’eau distillé ;
 L’ajout de l’alcool jusqu'à la disparition de la couleur violette pendant une dizaine de
secondes puis un lavage rapide sera effectué ;
 Coloration de nouveau avec une solution de fuchsine diluée pendant 1 min ;
 Lavage de nouveau avec de l’eau distillé puis séchage à l’air ;
 Observation au microscope optique, à l’aide d’huile d’immersion ;

Classification de la souche Pseudomonas

Régne Bacteria

Division Proteobacteria

Classe Gammaproteobacteria

Ordre Pseudomonadales

Famille Pseudomonadaceae

Genre Pseudomonas
 ‫ملخص‬

.‫حٍذف ٌزي الذساست إلى اخخٍبس سالالث بكخٍشٌت عبلٍت اإلمكبوبث فً المعبلجت البٍُلُجٍت لخلُد المٍبي بُاسطت أصبغت الىسٍج‬

ً‫ َببلخبل‬,‫فً الُاقع حم اخز ٌزي البكخٍشٌب مه جزَس الشمىذس األحمش ٌَعخمذ اخخٍبس ٌزي المىطقت على حقٍقت أن المحصُل المحذد رَ لُن احمش قُي‬
.‫َجُد سالالث حخكٍف مع ٌزي البٍئت فً حٍه أظٍشث الىخبئج اوً مه بٍه السالالث المعضَلت حُجذ اثىخبن رَ وشبط جٍذ لضَال الصبغت‬

‫ كمب اظٍش الخعشف على السالالث‬,ً‫كشفج الذساست الحشكٍت أن السالالث المخخبسة لٍب قذسة عبلٍت فً إصالت األحمش الكُوغُ مقبسوت ببألصسق المٍثٍل‬
.Pseudomonas ‫المخخبسة اوخمبئٍب الى وُع‬

.‫ أصبغت الىسٍج‬,‫ الشمىذس األحمش‬,‫ سالالث بكخٍشٌت‬,‫ حلُد المٍبي‬,‫ المعبلجت البٍُلُجٍت‬:‫الكلمات المفتاحية‬

Résumé

Cette étude a pour objectif de sélectionner des souches bactériennes à haut potentiel en traitement biologique de
la pollution des eaux par les colorants textiles. En effet, une sélection à été faite à partir de la rhizosphère de la
betterave rouge. Le choix de cette zone, est fondé sur le fait que la culture choisie est fortement colorée en rouge,
et par conséquent la présence de souches adaptés à cet environnement.

Les résultats ont montré que parmi les souches isolées, deux présentent une bonne activité de dégradation des
colorants. L'étude cinétique à révélée que les souches choisies ont d'un grand potentiel de dégradation vis-à-vis
du rouge Congo comparativement au bleu de méthylène.

L'identification des souches sélectionnées à montré une appartenance de ces dernieres au genre Pseudomonas.

Mots clés : traitement biologique des eaux, les eaux usées, souches bactériennes, la betterave rouge,
colorants textiles.

Abstract

The aims of this study is to select bacterials strains with hight potential in textile wastewater treatment from red
beet. The choice of this area is based on the fact that the selected crop is strongly colored red, and therefore the
presence of strains adapted to this environment.

The results showed that of the isolated strains, two show good dye degradation activity.

The kinetic study revealed that the selected strains have a high degradation potential vis-à-vis the red Congo
compared to the methylene blue. The identification of the selected strains showed their belonging to the kind of
Pseudomonas.

Key words: biological treatment, water pollution, bacterial strains, red beet, textile dyes.