UNIVERSITE DE NANTES

FACULTE DE PHARMACIE
ANNEE 2003 N°14

MEMOIRE
DU DIPLOME D’ETUDES SPECIALISEES DE
BIOLOGIE MEDICALE
Soutenu devant le Jury Interréginal
Le 06 MAI 2003
Par M. GENTILHOMME HERVE
Conformément aux dispositions de l’arrêté
Du 10 Septembre 1990 tient lieu de :

THESE
POUR LE DIPLOME D’ETAT
DE DOCTEUR EN PHARMACIE

LA PENICILLIOSE A PENICILLIUM MARNEFFEI :

MISE POINT ET EVALUATION D’UNE
APPROCHE DE DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE

JURY

PRESIDENT : Mme le Professeur B.M. IMBERT laboratoire de Virologie – Nantes

DIRECTEUR : Mr le Docteur P. LE PAPE laboratoire de Parasitologie – Nantes
MEMBRES : Mr le Professeur D. CHABASSE laboratoire de Parasitologie – Angers
Mr le Professeur F RAFFI Médecine Interne B – Nantes
Mr le Docteur M. MIEGEVILLE laboratoire de Parasitologie – Nantes

1
A Sandrine, « compagne de toujours » et récente épouse,
Qui attendait la fin du présent ouvrage avec impatience. Avec tout mon
amour.

A Fanny et Adrien, nos petits monstres,

Source de joie quotidienne, à tout le temps que nous allons passer
ensemble…

A mes parents,
Je vous doit tout, merci pour votre soutien inconditionnel.

A mes grands parents,

En témoignage de ma profonde reconnaissance.

A Dominique mon frère, et Géraldine sa moitié,

Pour tout ce qui nous unit.

A tous mes collègues et amis biologistes en particulier Franck, Seb, Tonio, Xav
et Thomas….
Que notre amitié dure toujours.

Aux « berniques »,
Ils se reconnaîtront, merci pour votre accueil.

A tous mes amis, d’ici ou d’ailleurs, que je ne vois pas assez souvent.
Qu’ils sachent combien leur amitié est précieuse.

A tous ceux qui ont relu cette thèse

Merci pour votre aide.

2
 REMERCIEMENTS
Menbres du Jury

A Madame le Professeur Berthe-Marie IMBERT,

Vous me faîtes l’honneur d’accepter la présidence de cette thèse et de
prendre le temps de juger ce travail. Soyez remerciée de l’intérêt que vous lui
porterez. Merci également pour votre gentillesse et votre disponibilité.

A Monsieur le Docteur Patrice LE PAPE,

Merci pour vos précieux conseils, votre disponibilité et pour tout le temps
que vous avez consacré à ce travail. Merci enfin de m’avoir fait confiance,
trouvez ici le témoignage de ma profonde gratitude.

A Monsieur le Professeur CHABASSE,

Je vous remercie de l’honneur que vous me faites en jugeant ce travail.
Recevez le témoignage de ma gratitude et de mon profond respect.

A Monsieur le Docteur Michel MIEGEVILLE,

Votre « dévouement » pédagogique, votre patience et votre sérieux
resteront pour moi un exemple. Je vous dois l’intérêt que je porte à cette
discipline. Recevez le témoignage de mon profond respect.

A Monsieur le Professeur RAFFI,

Je vous remercie de l’honneur que vous me faites en jugeant ce travail.
Recevez le témoignage de ma gratitude et de mon profond respect.

3
A Nidia, son efficacité et ses précieux conseils furent des atouts sérieux pour
la réalisation des actes techniques.

Au Dr Odile Morin, pour sa participation gracieuse, sa disponibilité et ses

conseils précieux, qu’elle reçoive toute ma considération.

Au Professeur Dupont, Institut Pasteur de Paris,

Pour sa contribution.

Au Professeur Cam, Institut d’Hygiène et d’Epidémiologie de Hanoï ;

Pour l’intérêt qu’il a porté à ce travail et pour sa collaboration.

A tous les Praticiens Hospitaliers qui nous forment quotidiennement « à la

paillasse », ils sont nos vrais pères.

A toute l’équipe du laboratoire de Parasitologie,

Pour son accueil « breton » chaleureux, ses conseils de paillasse et ses
encouragements. Restez toujours aussi sympathique et disponible.

Au laboratoire de Virologie,
Pour m’avoir donné la possibilité d’utiliser sa sérothèque, rendant possible
l’étude de nombreux sérums sélectionnés.

A Monsieur François Maloizel et au laboratoire Pfizer,

Votre participation à l’élaboration du document m’a permis de mettre en
valeur ce travail, soyez-en remerciés.

4
SOMMAIRE…..…………….……..…………………..………….......5

ABREVIATIONS UTILISEES..……..…………...…………………10

LISTE DES FIGURES…pour voir les figures, demander la thèse

papier par Prêt Entre Bibliothèques 11

LISTE DES TABLEAUX…………………………..…………..……13

INTRODUCTION…………………..…….....……………………….15

1èrePARTIE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES…….…..........18

5I HISTORIQUE.............................................................................. 21

II MYCOLOGIE.............................................................................. 24

II.1 LE GENRE PENICILLIUM..........................................................................................24

II.1.1 MODE DE REPRODUCTION ASEXUEE.........................................................25
II.1.2 MODE DE REPRODUCTION SEXUEE............................................................27
II.2 PENICILLIUM ET FLORE FONGIQUE ATMOSPHERIQUE................................28
II.3 PENICILLIUM D’UTILISATION INDUSTRIELLE ....................................................29
II.4 PENICILLIUM MARNEFFEI : UN CAS UNIQUE PARMI LES PENICILLIUM ......31
II.4.1 PAR SA NICHE ECOLOGIQUE .....................................................................31
II.4.2 PAR SON CARACTERE DIMORPHIQUE ....................................................31
II.4.3 PAR SON MODE DE REPRODUCTION PARASITAIRE .............................32
II.4.4 PAR SON POUVOIR PATHOGENE ..............................................................33
II.5 LA CULTURE...............................................................................................................35
II.5.1 LES MILIEUX DE CULTURE. .......................................................................35
II.5.1.1 Pour obtenir la forme filamenteuse ..................................................................35
II.5.1.2 Pour obtenir la forme levure.............................................................................35
II.5.2 LES CONDITIONS DE CULTURE.................................................................35
II.5.3 ASPECT MACROSCOPIQUE DES CULTURES...........................................36
II.5.3.1 A température ambiante ...................................................................................36
II.5.3.2 A température corporelle..................................................................................37
II.5.4 ASPECT AU MICROSCOPE OPTIQUE.........................................................37
II.5.4.1 A température ambiante ...................................................................................37
II.5.4.2 A température corporelle..................................................................................38
II.5.5 ASPECT AU MICROSCOPE ELECTRONIQUE ...........................................38

III EPIDEMIOLOGIE...................................................................... 39

5
 III.1 REPARTITION GEOGRAPHIQUE ............................................................................39
III.2 MODE DE CONTAMINATION .................................................................................42
III.2.1 CONTAMINATION DE L’HOMME................................................................42
III.2.1.1 Inhalation de spores......................................................................................42
III.2.1.2 Inoculation de spores ou de levures .............................................................42
III.2.1.3 Ingestion de spores ou de levures.................................................................43
III.2.2 CONTAMINATION DU RAT DU BAMBOU...............................................43
III.3 SOURCE DE CONTAMINATION..............................................................................44
III.3.1 A PARTIR D’HOMMES EUX-MEMES ATTEINTS. ....................................44
III.3.2 A PARTIR DU RAT DU BAMBOU..............................................................44
III.3.3 A PARTIR DU SOL..........................................................................................44
III.4 FACTEURS FAVORISANTS .......................................................................................45
III.4.1 TERRAIN.............................................................................................................45
III.4.1.1 L’âge.............................................................................................................45
III.4.1.2 Le sexe..........................................................................................................45
III.4.1.3 Le terrain héroïnomane ................................................................................45
III.4.1.4 L’alcoolisme chronique................................................................................46
III.4.2 FACTEURS IATROGENES ...............................................................................46
III.4.3 PATHOLOGIES SOUS-JACENTES ..................................................................47

IV CLINIQUE ................................................................................... 49

IV.1 INCUBATION ..............................................................................................................49

IV.2 MANIFESTATIONS CLINIQUES ...............................................................................49
IV.2.1 MANIFESTATIONS GENERALES ..................................................................50
IV.2.2 MANIFESTATIONS RESPIRATOIRES...........................................................50
IV.2.3 MANIFESTATIONS CUTANEO-MUQUEUSES ............................................51
IV.2.4 AUTRES MANIFESTATIONS..........................................................................52
IV.3 DIFFERENCE ENTRE SUJETS VIH+ ET « IMMUNOCOMPETENTS » .............53
IV.4 EVOLUTION ET PRONOSTIC..................................................................................53
IV.5 DIAGNOSTIC CLINIQUE DIFFERENTIEL.............................................................55
IV.5.1 AVEC LES AUTRES MYCOSES « EXOTIQUES » .....................................55
IV.5.1.1 Histoplasmose américaine ou Histoplasmose « à petites formes » ...........55
IV.5.1.2 Histoplasmose africaine ou Histoplasmose « à grandes formes »............56
IV.5.1.3 Coccidioïdomycose ......................................................................................56
IV.5.1.4 Paracoccidioidomycose ................................................................................57
IV.5.1.5 Blastomycose................................................................................................57
IV.5.1.6 Sporotrichose................................................................................................57
IV.5.1.7 Les nouvelles mycoses d’importation. .........................................................58
IV.5.2 AVEC LES MYCOSES SYSTEMIQUES COSMOPOLITES ...........................58
IV.5.2.1 La Cryptococcose .........................................................................................59
IV.5.2.2 Les Candidoses profondes............................................................................59
IV.5.2.3 Les Aspergilloses .........................................................................................60
IV.5.2.4 Les mycoses viscérales cosmopolites émergentes .......................................62
IV.5.3 AVEC LA TUBERCULOSE .............................................................................62
IV.5.4 AVEC LA LEISHMANIOSE VISCERALE ....................................................63
IV.5.5 AVEC LA SARCOIDOSE.................................................................................64

6
V DIAGNOSTIC PARACLINIQUE ........................................... 65

VI DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE ................................................ 65

VI.1 CONTEXTE BIOLOGIQUE........................................................................................65

VI.2 DIAGNOSTIC MYCOLOGIQUE ................................................................................66
VI.2.1 LES PRELEVEMENTS......................................................................................66
VI.2.2 L’EXAMEN DIRECT:........................................................................................67
VI.2.3 LA CULTURE .....................................................................................................68
VI.2.3.1 Aspect macroscopique..................................................................................68
VI.2.3.2 Aspect microscopique ..................................................................................68
VI.2.3.3 L’interprétation.............................................................................................69
VI.2.4 L’INOCULATION A L’ANIMAL ....................................................................70
VI.3 DIAGNOSTIC ANATOMOPATHOLOGIQUE ...........................................................72
VI.4 DIAGNOSTIC IMMUNOLOGIQUE...........................................................................74
VI.4.1 LES PRELEVEMENTS.......................................................................................74
VI.4.2 METHODES DIAGNOSTIQUES BASEES SUR LA DETECTION
D’ANTICORPS....................................................................................................................74
VI.4.2.1 Détection par technique d’immunodiffusion................................................75
VI.4.2.2 Détection par technique d’immunofluorescence..........................................76
VI.4.2.3 Détection par techniques immunoenzymatiques..........................................76
VI.4.3 METHODES DIAGNOSTIQUES BASEES SUR LA DETECTION
D’ANTIGENES CIRCULANTS ........................................................................................77
VI.4.3.1 Détection par des hyperimmunsérums .........................................................78
VI.4.3.2 Détection par des anticorps monoclonaux....................................................78
VI.4.3.3 Détection d’antigènes urinaires ....................................................................78
VI.4.4 COMBINAISON DE LA DETECTION D’ANTIGENES ET D’ANTICORPS.79
VI.5 DIAGNOSTIC PAR BIOLOGIE MOLECULAIRE.......................................................81

VII TRAITEMENT ........................................................................... 82

2ème PARTIE: MATERIELS ET METHODE

VIII LA TECHNIQUE E.L.I.S.A..................................................... 85

VIII.1 PROTOCOLE OPERATOIRE..................................................................................85

VIII.1.1 PRESENTATION DE LA TROUSSE E.L.I.S.A. ...........................................85
VIII.1.2 PREPARATION DES REACTIFS AVANT USAGE.....................................85
VIII.1.3 MODE OPERATOIRE ....................................................................................86
VIII.1.3.1 Etape I : Incubation des sérums échantillons ...............................................86
VIII.1.3.2 Etape II : Incubation avec le conjugué .........................................................86

7
 VIII.1.3.3 Etape III : Incubation avec le substrat ..........................................................87
VIII.1.3.4 Etape IV : Mesure de la Densité Optique.....................................................87
VIII.1.3.5 Etape IV : Expression des résultats-Interprétation .......................................87
VIII.2 CONTROLE DE QUALITE......................................................................................87
VIII.2.1 ETUDE DE REPETABILITE..........................................................................88
VIII.2.2 ETUDE DE REPRODUCTIBILITE................................................................88
VIII.3 ETUDE DE LA SENSIBILITE..................................................................................88
VIII.4 ETUDE DE LA SPECIFICITE.................................................................................88
VIII.4.1 SUR SERUMS NEGATIFS.............................................................................89
VIII.4.2 ETUDE DES REACTIONS CROISEES .........................................................89
VIII.4.2.1 Candidoses profondes ..................................................................................90
VIII.4.2.2 Cryptococcoses.............................................................................................90
VIII.4.2.3 Aspergilloses ................................................................................................91
VIII.4.2.4 Histoplasmoses.............................................................................................91
VIII.4.2.5 Fusariose.......................................................................................................91

IX HEMAGGLUTINATION ET IMMUNO-ELECTROPHORESE…93

IX.1 L’HEMAGGLUTINATION INDIRECTE .....................................................................93

IX.1.1 PRINCIPE ............................................................................................................93
IX.1.2 MODE OPERATOIRE ........................................................................................94
IX.1.3 INTERPRETATION ............................................................................................94
IX.2 L’IMMUNOELECTROPHORESE ...............................................................................94
IX.2.1 PRINCIPE ............................................................................................................94
IX.2.2 MODE OPERATOIRE ........................................................................................95
IX.2.3 INTERPRETATION ............................................................................................95

X L’IMMUNOEMPREINTE OU WESTERN BLOT ................. 96

X.1 PRINCIPE DE LA TECHNIQUE.................................................................................96

X.2 PREPARATION DE L’ANTIGENE METABOLIQUE .................................................96
X.3 PROTOCOLE OPERATOIRE......................................................................................97
X.3.1 ELECTROPHORESE ..........................................................................................97
X.3.2 ELECTROTRANSFERT .....................................................................................98
X.3.3 PREPARATION DES BANDELETTES.............................................................98
X.3.4 IMMUNOEMPREINTE ......................................................................................98
X.3.4.1 Etape I : Lavage des bandelettes réactives .......................................................99
X.3.4.2 Etape II : Incubation des sérums échantillons ..................................................99
X.3.4.3 Etape III : Incubation avec le conjugué............................................................99
X.3.4.4 Etape IV : Incubation avec le substrat et révélation.........................................99
X.3.4.5 Etape V : Calcul des masses moléculaires apparentes ...................................100

XI APPLICATION DES OUTILS DIAGNOSTIQUES A UNE

ETUDE SEROEPIDEMIOLOGIQUE À HANOI........................ 101

8
 3ème PARTIE:RESULTATS ET DISCUSSIONS

I RESULTATS DES CULTURES ............................................ 103

I.1 CULTURE A 22°C .....................................................................................................103

I.2 CULTURE A 30°C .....................................................................................................104
I.3 CULTURE A 37°C .....................................................................................................108

II EVALUATION DE L’ E.L.I.S.A.............................................. 112

II.1 ETUDE DES PERFORMANCES ...............................................................................112

II.1.1 ETUDE DE REPETABILITE............................................................................112
II.1.2 ETUDE DE REPRODUCTIBILITE..................................................................113
II.2 ETUDE DE LA SENSIBILITE....................................................................................114
II.3 ETUDE DE LA SPECIFICITE...................................................................................117
II.3.1 SUR SERUMS NEGATIFS...............................................................................117
II.3.2 ETUDE DES REACTIONS CROISEES ...........................................................119
II.3.2.1 Etude des réactions croisées avec Candida sp ...............................................119
II.3.2.2 Etude des réactions croisées avec Cryptococcus neoformans........................121
II.3.2.3 Etude des réactions croisées avec Histoplasma capsulatum ..........................124
II.3.2.4 Etude des réactions croisées avec Aspergillus sp...........................................125
II.3.2.5 Etude des réactions croisées avec Fusarium oxysporum................................128
II.4 CONCLUSIONS .........................................................................................................130

III MISE AU POINT DU WESTERN BLOT ............................... 132

III.1 CHOIX DE L’ANTIGENE..........................................................................................132

III.2 ETUDE DE L’ANTIGENE METABOLIQUE.............................................................133
III.2.1 CONCENTRATION PROTEIQUE.................................................................134
III.2.2 PROFIL ELECTROPHORETIQUE .................................................................134
III.3 EVALUATION DES PERFORMANCES ....................................................................136
III.3.1 ETUDE DE LA SENSIBILITE .........................................................................136
III.3.2 ETUDE DE LA SPECIFICITE..........................................................................137

IV ETUDE SEROEPIDEMIOLOGIQUE EN ZONE D’ENDEMIE142

IV.1 RESULTATS DU TEST DE DEPISTAGE. .................................................................142

IV.2 RESULTAT DU WESTERN BLOT DE CONFIRMATION. .......................................146

CONCLUSION

BIBLIOGRAPHIE

9
ANNEXES

10
 ABREVIATIONS UTILISEES

AAE = Alvéolite Allergique Extrinseque.

ABPA = Aspergillose Broncho-Pulmonaire Allergique.

AEG = Altération de l’Etat Général.

APCN = Aspergillose Pulmonaire Chronique Nécrosante.

API = Aspergillose Pulmonaire Invasive.

APO = Aspergillome.

BHI = Brain-Heart Infusion

BPCO = Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive

BSA = Sérum Albumine Bovine

CHAI et AHAI = Hémmaglutination Indirecte Aspergillaire et Candidosique

CV = Coefficient de Variation

D.O.= Densité Optique

ELISA = Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay.

IEA et IEC = ImmunoElectrophorèse Aspergillaire et Candidosique

IgM = Immunoglobuline d’isotype M

INHE = Institut National d’Hygiène et d’Epidémiologie

kDa = kiloDaltons = g/mol

LBA = liquide de Lavage Broncho-Alvéolaire.

LCR = Liquide Céphalo-Rachidien

MGG = May-Grundwald-Giemsa

NC = Non Communiqué

PBS = Phosphate Buffer Saline

11
PCR = Polymérase Chain Réaction

SDS = Sodium Dodécyl Sulfate

SIDA = Syndrome d’ImmunoDéficience Acquise

TEMED = N,N,N’,N’, TétraMEthyl-EthyleneDiamine

TRIS = Tris[hydroxyméthyl]aminométhane

VIH = Virus de l’Immunodéficience Humaine

12
 LISTE ET LEGENDE COMPLETES
DES FIGURES.

Figure n°1 : Détail d’un pinceau de Penicillium sp (conidiophore triverticillé)…….p 24

Figure n°2 : Cycle de reproduction asexuée des Penicillium sp……………….…………....p 24

Figure n°3 : Classification des Penicillium en fonction des ramifications du

conidiophore……………………………………………………………………………………………………………………. p 25

Figure n°4 : Aspect macroscopique et microscopique de quelques Penicillium

saprophytes…………………………………………………………………………………………………….…………………p 28

Figure n°5 : Aspect levuriforme de Penicillium marneffei en microscopie optique (bleu

lactophénol)………………..……………………………………………………………………………………….….p 30

Figure n°6 : Stade levuriforme avec septation centrale de Penicillium marneffei en

culture sur milieu BHI…………………………………………………………………………………………………….p 30

Figure n°7 : Aspect macroscopique d’une culture de Penicillium marneffei à

température ambiante (Sabouraud J 15)……………………………………………………………………p 35

Figure n°8 : Répartition géographique des zones d’endémies de la pénicilliose à

Penicillium. marneffei………………………………………………………………………………………………….….p 38
Figure n°9 : Aspect le plus typique de lésions cutanées de pénicilliose à Penicillium

marneffei………………………………………………………………………………………………………………………..….p 49
Figure n°10 : Profil d’immunoélectrophorèse, exemple de deux sérums positif en

aspergillose…………..…………………………………………………………………………………………………………….p 93

Figure n°11 : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 22°C………………..…p104

Figure n°12 : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 30°C…………………p 106

Figure n°13 : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 37°C……………..…p 108

Figure n°14 : Représentation graphique de l’étude de répétabilité……….…………….p 112

Figure n°15 : Représentation graphique de l’étude de réproductibilité……………..p 113.

Figure n°16 : Représentation graphique des index des 36 sérums négatifs...p 117.

Figure n°17 : Récapitulatifs des résultats sérologiques des 92 sérums …….………p129.

13
Figure n°18 : Immunoempreinte des antigènes somatiques de phase levure après

réaction avec des sérums de patients atteints de pénicilliose (I) après réaction de

sérums de patients atteints de candidose (CAN) et d’aspergillose broncho-pulmonaire

allergique (ASP)………………………………………………………………………………………….p.131

Figure n°19 : Profil électrophorétique de l’antigène métabolique (11ème Jour)….p133

Figure n°20 : : Immunoempreinte des antigènes métaboliques de la phase levure de

Penicillium marneffei après réaction avec deux sérums de patient atteints de

pénicilliose d’importation : (1) patient Rai, (2) patient Pit………………………………….….p 135

Figure n°21: Profil d’immunoblot des pools ‘’d’aspergillose’’ (1) et de ‘’candidose’’ (2)…p137

Figure n°22 : Profils immunoblot de l’étude de spécificité du Western Blot

(1)= Pool de sérum négatif, (2 et 3)= ABPA 1 et 2, (4)=API 3, (5)=APO 6, (6, 7 et 8)=H

2, H 3 et H 5, (9et 10)=P.m positif, (11, 12 et 13)= C 8, C 2 et C10, (14, 15 et 16)=CRC 2,

CRC 3 et CRC 4, (17)=CRP………………………………………………………..………………p 138

Figure n°23: Représentation graphique des index de l’étude

séroépidémiologique……………………………………………………………………………………………………....p143.

Figure n°24: Immunoempreinte des sérums vietnamiens positif ou en zone grise pour

l’ELISA………….………………………………………………………………………………………………………..p 144.

Figure n°25: Profil western blot des sérums issus des nouveaux cas de pénicilliose ..p145

14
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Infections à P. marneffei diagnostiquées en dehors de la zone d’endémie

(cas d’importation répertoriés)………………………………………………………………….…22

Tableau II : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 22°C………….………103

Tableau III : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 30°C…………………105
Tableau IV : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 37°C…………………107.
Tableau V : Valeurs index de l’étude de répétabilité………..……………………………………111
Tableau VI : Valeurs index de l’étude de reproductibilité………………………………….…112
Tableau VII : Caractéristiques des pénicillioses prouvées et valeurs index des sérums
correspondants……………………………………………………………………………………………………..114
Tableau VIII : Valeurs index des sérums négatifs………………………………………………….117
Tableau IX : : Résultats sérologiques de 11 sérums ‘’candidoses profondes’’
……………………………………………………………………………………………………………………………………………….119.

Tableau X : Caractéristiques de la cryptococcose pulmonaire et des huit

cryptococcoses neuroméningées sélectionnées…………………………………………………………….121

Tableau XI : Caractéristiques des quatre cryptococcoses cutanées retenues ………….121

Tableau XII : Résultats sérologiques des 13 sérums de cryptococcoses………….…122
Tableau XIII : Résultats sérologiques des cinq ‘’sérums d’histoplasmoses……..…123’’
Tableau XIV : Résultats sérologiques des sept ‘’aspergilloses invasives…………...124’’
Tableau XV : Résultats sérologiques des cinq ‘’aspergilloses chroniques

nécrosantes’’………………………………………………………………………………………………………………………..125

Tableau XVI : Résultats sérologiques des six aspergillose broncho pulmoba

allergique……………………………………………………………………………………………………………………………..126

Tableau XVII : Résultats sérologiques des six ‘’aspergillomes’…………………………….127’

Tableau XVIII : Résultat sérologique de la ‘’fusariose’’………………………………………….127
Tableau XIX : Concentration en protéines en fonction du temps de culture....…132
Tableau XX : Concentration protéique de trois lots d’antigènes………………………….134

15
Tableau XXI: Constitution de deux pools immunologiquement très

positifs…………………………………………………………………………………………………………………….136

Tableau XXII : Résultats sérologiques et renseignement cliniques des 59 patients

dont la présentation est compatible avec le diagnostic de pénicilliose………………….141

16
INTRODUCTION

17
 Chez le patient VIH+ du Sud-est asiatique, la pénicilliose à Penicillium marneffei

est l’une des plus fréquentes infections opportunistes. Cette mycose exotique, encore

rare, connaît une expansion galopante en relation avec le développement de l’épidémie

de SIDA. Penicillium marneffei est l’unique Penicillium dimorphique et n’a actuellement

été retrouvé, à l’état parasitaire, que chez un seul autre mammifère, le rat du Bambou.

Filamenteux dans sa forme saprophyte mais lévuriforme dans sa forme parasitaire, il

possède un pouvoir pathogène sur le système réticulo-histiocytaire principalement des

patients à immunité cellulaire déficiente. Quelques cas ont toutefois été décrits chez

le patient immunocompétent.

La symptomatologie peu spécifique retarde la prise en charge du patient et

explique que la pénicilliose soit trop souvent étiquetée tuberculose ou histoplasmose.

Or c’est une pathologie de très mauvais pronostic où la thérapeutique antifongique,

pour être efficace, doit être instaurée de façon précoce. C’est pourquoi l’intérêt d’un

diagnostic immunologique présomptif est incontestable. Prenant en compte ces

considérations, nous avons réalisé, dans un premier temps une étude succincte portant

sur la mise en évidence du caractère dimorphique, élément clé du diagnostic

mycologique de ce champignon. Dans un second temps, nous avons participé à la mise en

place d’une stratégie de diagnostic immunologique de la pénicilliose, initiée dans le

laboratoire de Parasitologie et de Mycologie médicale de l’UFR de Pharmacie de

Nantes. Celle-ci comporte une technique ELISA de dépistage et une technique

d’immunoempreinte ou western blot de confirmation.

Notre étude concerne l’évaluation des performances du test ELISA en terme de

répétabilité, reproductibilité, sensibilité et spécificité. Puis nous présenterons la mise

au point d’un western blot utilisant l’antigène métabolique de P. marneffei. Nous

présenterons enfin l’utilisation de cette stratégie, en zone d’endémie, dans une étude

prospective de séroprévalence à l’institut d’hygiène et d’épidémiologie de Hanoï,

bénéficiant d’une antériorité de collaboration avec le Dr Miegeville.

18
 Après des rappels bibliographiques concernant la pénicilliose à Penicillium

marneffei, nous présenterons, dans une deuxième partie, la méthodologie utilisée pour
réaliser notre étude. Dans une troisième partie, nous présenterons et discuterons les

résultats de notre travail.

19
Première partie : RAPPELS
BIBLIOGRAPHIQUES

20
I HISTORIQUE

En 1956, Penicillium marneffei est isolé, fortuitement, pour la première fois

par Capponi chez des rats du bambou (Rhizomys sinensis ) capturés sur les hauts

plateaux du Nord-Vietnam et destinés à l’expérimentation de l’institut Pasteur

d’Indochine à Dalat, Sud-Vietnam (Capponi et al., 1956).

Le champignon isolé de ces rats, morts spontanément en captivité de réticulose

macrophagique diffuse avec splénomégalie et ascite, est inoculé à une souris. Rats et

souris sont alors envoyés pour expertise à l’institut Pasteur de Paris où le Pr Segretain

identifie Penicillium marneffei comme une nouvelle espèce. Il la nomme marneffei en

hommage au Dr Henri Marneffe, alors directeur de l’institut Pasteur d’Indochine.

Les travaux du Pr Segretain mettent en évidence le grand pouvoir pathogène de

ce champignon (réticulose semblable à l’histoplasmose ou à la leishmaniose) chez le rat,

la souris, le hamster mais son absence chez le lapin et le cochon de Guinée. C’est

également ces travaux qui, en 1959, mettent en évidence le pouvoir pathogène sur

l’Homme, de façon accidentelle, puisque Segretain lui-même se pique le doigt avec une

aiguille destinée à inoculer le champignon à des hamsters. Il développe alors un nodule

au point de piqûre (au douzième jour) suivi de lymphangite et d’adénopathie axillaire

d’où il isole le Penicillium. Il se traite avec succès par nystatine (tout premier

antifongique per os qui venait d’être commercialisé) pendant 30 jours avec 20 millions

d’Unités, c’est-à-dire 13 fois la dose recommandée. La guérison est cependant plutôt à

mettre sur le compte de l’immunocompétence puisqu’il sera montré plus tard la très

faible absorption digestive de la nystatine (Segretain, 1959).

Il faut attendre 1973 pour que la toute première infection humaine à

Penicillium marneffei « naturellement » acquise soit décrite par Di Salvo (DiSalvo et

al., 1973). Le diagnostic est posé chez un prêtre de 61 ans vivant en Caroline du Sud,

21
ayant voyagé au Vietnam et en Asie du Sud-est, dont la maladie de Hodgkin avait été

traitée par radiothérapie et splénectomie (splénectomie ayant permis une découverte

fortuite de P. marneffei ).

Onze ans plus tard, en 1984 est décrit par Pautler (Pautler et al., 1984) le

deuxième cas de pénicilliose importé aux U.S.A. chez un autre américain de 59 ans

revenant du Sud-est asiatique et présentant des hémoptysies récurrentes

(pneumonectomie avec granulome et mise en culture positive). C’est cette même année

que sont publiés les cinq premiers cas autochtones à Bangkok (Thaïlande)

diagnostiqués en fait entre 1972 et 1982. Ces cinq Thaïlandais atteints de

pathologies sous-jacentes lourdes (trois tuberculoses, un lupus érythémateux

disséminé et un lymphome) présentaient tous une fièvre, des adénopathies et des

lésions cutanées à type de nodules, papules ulcérées ou d’abcès sous-cutanés résultant

d’embolisation septique (Jayanetra et al., 1984).

La connaissance de ce nouveau pathogène diffusant, c’est en 1985, après

réexpertise, que sont publiés les huit premiers cas chinois initialement étiquetés

histoplasmose entre 1964 et 1983 dans la province du Guangxi, Chine du Sud (où les

ruraux consomment du rat de bambou) (Deng and Connor, 1985). Cette année là est

aussi déclaré le premiers cas à Hong-Kong (So et al., 1985).

En 1986, Deng montre que la plupart des rats du bambou sont infectés par P.
marneffei au niveau pulmonaire, splénique, hépatique ou ganglionnaires digestifs (100%
des individus de l’espèce dominante au Vietnam : Rhizomis sinensis contre 66% des

Rhizomis pruinosus en chine et 10% des Cannomys badius en Thaïlande) (Deng et al.,
1986).

Les premières associations PENICILLIUM-INFECTION VIH après voyage

dans une zone d’endémie, sont décrites en 1988 :

- chez un Américain par Piehl (Piehl et al., 1988).

22
 - chez un 2ème Français, ayant voyagé en Indonésie (Ancelle et al., 1988).

- chez un Anglais ayant voyagé en Chine (Piehl et al., 1988).

Dès l’année suivante, en 1989, cette association PENICILLIUM-VIH+ est

publiée chez un « autochtone » du Sud-est asiatique puis c’est « l’explosion » :

Plus de 2000 cas de pénicilliose dans le Sud-est asiatique :

► 1173 cas thaïlandais rien que dans la région de Chiang Maï de 91 à 97, avec

une croissance parallèle à celle du SIDA, au point d’atteindre dans les pays les plus

endémiques le rang de 3ème maladie opportuniste derrière la pneumocystose et la

tuberculose, avec plus de 10% des patients VIH+ concernés (Wong and Lee, 1998).

► L’analyse des 200 premiers cas de Hong Kong révèle qu’il a fallu 10 ans pour

les 100 premiers contre 2 ans pour les 100 suivants (Wong and Lee, 1998). Plus de

quarante cas indiens en moins de deux ans (Avril 98, Novembre 99) alors que

seulement quatre étaient été décrits avant 1998 (Ranjana et al., 2002).

► Plus d’une trentaine de cas d’importation (chez des sujets non asiatiques

VIH+) sont déjà décrits avec notamment 11 nouveaux cas français. (A noter que les

cas occidentaux rapportés sont surtout européens et plus majoritairement français,

bien devant les cas américains, anglais et italiens. Le tableau I répertorie les

différentes pénicillioses d’importation, on y retrouve notamment les 13 cas français

sur les 37 décrits en dehors des zones d’endémie.

Tableau n°I :Infections à P. marneffei diagnostiquées en dehors de la zone d’endémie

ZONE de
Année Nbre VILLE/PAYS Référence VIH
CONTAMINATION
1959 1 Paris/France Vietnam (Dalat) (Drouhet, 1993) -
1973 1 Colombia/USA Asie du Sud-est (Drouhet and Dupont, -
1984 1 Tampa/USA Extrême orient 1995) -

23
 1 Londres/GB Chine du Sud-est (Peto et al., 1988) +
1988 1 Chicago/USA NC (Piehl et al., 1988) +
1 Paris/France Indonésie (Ancelle et al., 1988) +
1 Milan/Italie Thaïlande (Coen et al., 1989) +
1989
1 Paris/France Thaïlande, Inde, Birmanie (Stern et al., 1989) +
1990 1 Rotterdam/P.Bas Thaïlande (Drouhet, 1993) +
1 Paris/France Thaïlande (Drouhet, 1993) +
1 Paris/France Asie du sud-est, Inde (Hilmarsdottir et al., +
1991 1 Paris/France Birmanie, Laos, Thaïlande 1993) +
1 Alberta/Canada Thaïlande -
1 Otawa/Canada Chine -
(Drouhet and Dupont,
1 Rotterdam/P.Bas Sumatra (Indonésie) +
1992 1995)
1 Sidney/Australie Hong-Kong +
1 Paris/France Pas de zone d’endémie +
1993 1 Italie Thaïlande (Viviani et al., 1993) +
1 Australie Thaïlande, Birmanie (Heath et al., 1995) +
2 Canton/USA NC (Borradori et al., 1994) NC
1994
2 Genève/Suisse Thaïlande, Chine (Remadi et al., 1995) +
1 Elbeuf/France Sri Lanka, Thaïlande +
1995 (Grise et al., 1997)
1 Elbeuf/France Afrique Tropicale +NC NC
1 Alès/France Thaïlande (Chiang maï) (Lachaud et al., 1998) +
1997
1 Huddinge/Suède Thaïlande (Julander and Petrini, +
2 Anvers/Belgique Thaïlande (Depraetere et al., 1998) +
1998 1 Nantes/France Thaïlande (Chiang maï) (Miegeville et al., 1998) +
1 Oxford/GB Hong-Kong (McShane et al., 1998) +
1 Heidelberg/Allem Thaïlande (Rimek et al., 1999) +
1999
1 Paris/France Thaïlande (Chiang maï) (Valeyrie et al., 1999) +
1 Hambourg/Allema Ghana !!! (Lo et al., 2000) +
2000 1 Nice/France Asie du Sud-est (Rosenthal et al., 2000) +
1 Manchester/GB Thailande (Vilar et al., 2000) +
2001 1 Baltimore/USA NC (Nelson and Sirisanthana, +
2002 1 Southampton/GB Thaïlande (Bateman et al., 2002) +

II MYCOLOGIE

II.1 LE GENRE PENICILLIUM

24
 Ce sont des champignons microscopiques (« micromycètes ») communément

appelés « moisissures », largement répandus dans la nature à l’état de saprophyte.

Leur thalle se développe de façon centrifuge aux dépens des débris organiques, qu’ils

contribuent à dégrader. Ces moisissures, véritables agglomérats de filaments

mycéliens et d’organes fructifères, sont capables de se développer sur différents

substrats organiques (sol, herbe, arbre…) et notamment sur les denrées alimentaires.

C’est donc à partir de leurs habitats naturels que ces champignons dispersent une

quantité extraordinaire de spores qui, véhiculées par le vent, sont présentes dans l’air

de manière permanente.

Il s’agit de champignons filamenteux cloisonnés ou « septés » (par opposition

aux zygomorphes comme les mucors) et à cytoplasme hyalin d’où leur appartenance aux

Hyphomycètes (par opposition aux hyphes pigmentés des champignons dématiés

comme Cladosporium ou Alternaria).

II.1.1 MODE DE REPRODUCTION ASEXUEE

Le mode de reproduction asexuée prédomine et les spores ou conidies sont

synthétisées par une cellule conidiogène allongée dont la forme évoque une amphore ou

une bouteille renflée au milieu appelée : phialide (figure 1), ce qui les fait appartenir

aux phialosporés comme les Aspergillus. A la différence des ceux-ci, les phialides ne

sont pas disposées sur une « tête aspergillaire » mais disposées en verticille à

l’extrémité de stipes terminaux ou latéraux non renflés évoquant l’aspect d’un pinceau,

« penicillium » en latin (figure 2).

25
Figure n°1 : Détail d’un ‘’pinceau’’ de Penicillium sp (conidiophore triverticillé).

Figure n°2 : Cycle de reproduction asexuée des Penicillium.

En fonction des types de pinceaux, on distingue trois groupes de Penicillium :

Conidiophore simple ou ramifié avec insertion directe des phialides pour les

monoverticillés, insertion en verticille par l’intermédiaire d’une rangée de métules,

elles-mêmes disposées en verticille, pour les biverticillés. Quant à l’insertion des

26
phialides par l’intermédiaire de deux rangées successives, elle caractérise les

Penicillium triverticillés (figure 3).

Monoverticillé (a) Biverticillé asymétrique(bl) symétrique (bll) Triverticillé (c)

Fig n°3: Classification des Penicillium en fonction des ramifications du conidiophore.

II.1.2 MODE DE REPRODUCTION SEXUEE

Pour la plupart des espèces, il n’est pas connu, ce qui les fait appartenir au

phyllum des deutéromycètes (forme sexuée ou « téléomorphe » inconnue). Leur place

taxonomique n’est donc pas totalement établie (puisque basée sur la reproduction

sexuée) et c’est d’ailleurs pour cela que ce groupe artificiel est également

[désigné/appelé] champignon imparfait ou « Fungi imperfecti ». Pour quelques uns, un

cycle sexué avec ascospores a été découvert, ils sont alors classés parmi les

Talaromyces (ou « Eupenicillium »).

Il faut d’ailleurs noter que presque tous les champignons pathogènes ou

opportunistes en mycologie médicale appartiennent à ces deutéromycètes qui sont

divisés en trois classes :

27
 ► Les levures ou blastomycètes avec notamment tous les Candida,

Cryptococcus et autres Trichosporon et Blastomyces…

► Les champignons filamenteux ou « hyphomycètes » avec notamment

Aspergillus, Fusarium, Acremonium, Scedosporium, Alternaria et Penicillium…

► Enfin les coelomycètes, thalle filamenteux ou levuriforme où les

spores sont formées dans des pycnides comme Hendersonula toruloïda.

Actuellement plus de 220 espèces de Penicillium ont été identifiées et sont

très répandues. C’est ainsi que nous inhalons régulièrement des spores de Penicillium

puisque ces derniers appartiennent à la flore fongique atmosphérique. A noter que le

taux d’exposition aux spores peut être très élevé dans certains contextes

professionnels. Nous ingérons même occasionnellement la forme filamenteuse, très

utilisée dans l’industrie agro-alimentaire (fromage, saucisson).

II.2 PENICILLIUM ET FLORE FONGIQUE

ATMOSPHERIQUE.

De façon cosmopolite et permanente, l’air atmosphérique renferme de

nombreuses spores fongiques et leur présence peut parfois se manifester par le

syndrome des « bâtiments malsains » (« sick-building syndrome »). C’est toujours en

période estivale que leur nombre est maximal. Les différentes enquêtes aéro-

mycologiques révèlent que les spores de Penicillium viennent en troisième position

derrière celles des champignons « noirs » (dématiés) : Cladosporium et Alternaria et

devant les spores aspergillaires (les plus souvent citées comme « contaminant des

étuves »).

En pratique, citons P. frequentans (Penicillium monoverticillé), P. italicum,

P.digitatum, et P. expansum et bien sûr P. chrysogenum comme étant les espèces les
plus répandues et très souvent responsables de la pourriture des fruits. Quelques

28
critères de diagnostic mycologique des principaux Penicillium sont présentés en annexe

1.

Leur omniprésence dans l’environnement ainsi que leur croissance facile

(du moins à température ambiante) en font des contaminants des cultures

mais également, en amont, des prélèvements non stériles comme les

expectorations, l’écouvillonnage nasal ou auriculaire voire cutané.

II.3 PENICILLIUM D’UTILISATION INDUSTRIELLE

► Pour l’affinage des fromages, P. roquefortii et P. camembertii

sont ajoutés aux où leurs capacités métaboliques (production d’exoenzyme) assurent

la production de composés aromatiques type méthyl-cétones à partir des acides gras

du lait. Moins connu mais encore plus largement utilisé, P. casei est le plus

immunogène des Penicillium du fromage.

► P. nalviogense est utilisé dans l’industrie du saucisson. Pulvérisé sur

la peau du saucisson, P. nalviogense (moisissure blanche) a pour but d’améliorer l’arôme

du saucisson mais surtout de limiter le développement de bactéries et des moisissures

sauvages, surtout les moisissures vertes dues à P. chrysogenum .

► P. notatum fut, en 1928, la moisissure qui permit à Fleming de

découvrir « accidentellement » la pénicilline et d’en assurer la production

pharmaceutique, même si ce contaminant le plus courant est surtout connu sous la

terminologie retenue en nomenclature de P. chrysogenum .

► Parmi les Penicillium, on trouve aussi des espèces capables de produire des

substances dirigées contre d’autres champignons, notamment les dermatophytes,

puisque la griséofulvine est produite par le P. griséofulvum.

29
Figure n°4 : Aspect macroscopique (a, b) et microscopique (c, d, e) des formes
saprophytes de Penicillium sp. c (P. marneffei) et d = conidiophore (bi-verticillé) en microscopie
optique. e = conidiophore (triverticillé) en microscopie électronique (P. italicum).

30
 II.4 PENICILLIUM MARNEFFEI : UN CAS UNIQUE
PARMI LES PENICILLIUM

II.4.1 PAR SA NICHE ECOLOGIQUE

La plupart des Penicillium sont cosmopolites tandis que P. marneffei est limité

au Sud-est Asiatique. Sa niche écologique (actuellement décrite !!!) exclusivement

rurale est même restreinte aux zones de proximité des bambous ou des rats vivant

proches de ces bambous. Plus précisément, les spores et les filaments mycéliens ont

été retrouvés sur les racines et les tiges de bambous, dans les terriers de rats, et

plus généralement sur le sol par dissémination fécale (élimination digestive chez le

rat) (Chariyalertsak et al., 1997).

II.4.2 PAR SON CARACTERE DIMORPHIQUE

On devrait dire « thermiquement dimorphique » puisque P. marneffei est le

seul Penicillium possédant un stade lévuriforme à la température corporelle, similaire

à celui observé dans les tissus (figure 5) et un stade filamenteux aux autres

températures (figure 4-c). En effet, les rares autres Penicillium isolés en pathologie

humaine se développent uniquement sous forme de filaments mycéliens.

C’est donc le seul Penicillium appartenant au cercle restreint des champignons

dimorphiques constitué par : - Histoplasma capsulatum

- Blastomyces dermatitidis

- Coccidioides immitis

- Paracocccidioides brasiliensis

- Sporothrix schenkii

- Emmonsia crescens, E. parva.

- Certaines souches de Paecilomyces

31
 Figure n° 5 : Aspect levuriforme en microscopie optique (bleu de lactophénol).

II.4.3 PAR SON MODE DE REPRODUCTION PARASITAIRE

C’est en plus, le seul dimorphique dont la reproduction asexuée de la forme

parasitaire n’est pas le bourgeonnement mais la fission binaire ou scissiparité qui, en

faisant apparaître des septa, donne un aspect allongé caractéristique en «saucisse

cloisonnée» (figure 6).

Figure n° 6 : Stade levuriforme avec septation centrale (en culture sur milieu BHI)

32
 II.4.4 PAR SON POUVOIR PATHOGENE

A l’opposé des Penicillium cosmopolites, P. marneffei est un pathogène

incontestable chez l’immunodéprimé mais également chez l’immunocompétent. Il

possède un pouvoir pathogène direct «vrai», ciblé sur le système réticulo-

histiocytaire. Plus encore, c’est l’agent d’une anthropozoonose puisque certains rats

d’une partie limitée du globe sont eux aussi atteints de réticulose.

C’est d’ailleurs, à cause de ce pouvoir pathogène élevé, combiné avec la notion

d’un inoculum infestant très faible et de l’expérience malheureuse de deux cas de

contaminations de laboratoire, que les autorités ont considéré la manipulation des

cultures de P. marneffei comme hautement contagieuse (risque biologique n° 3).

Les autres Penicillium, quant à eux, ont un pouvoir pathogène direct faible, c’est

le pouvoir pathogène indirect (allergie) et la capacité de production de mycotoxine

alimentaire qui domine.

Tout au plus, certaines espèces de Penicillium sont capables de provoquer des

mycoses superficielles. Ces pénicillioses localisées, surtout à la sphère O.R.L.

(otomycoses) et aux phanères (onychomycoses), sont communes même si des infections

oculaires ont également été décrites (ulcères cornéens, endophtalmies, kératites).

Dans certains contextes, surtout en cas de neutropénie, le caractère invasif semble

indiscutable puisque depuis 1951, 31 pénicillioses invasives profondes ont été publiées.

Notamment douze cas prouvés de pénicillioses pulmonaires avec cinq isolements de P.

crustaceum , six cas de péritonites et quatre endocardites sur valves prothétiques

ainsi que trois nouveaux cas en 2002 (Lyratsopulos et al., 2002).

En fait le pouvoir pathogène des Penicillium non P. marneffei se restreint

principalement aux réactions d’hypersensibilité qu’ils peuvent induire sur des terrains

33
atopiques ou chez des personnes intensément exposées aux spores de Penicillium

(exposition professionnelle). Des phénomènes de sensibilisation (augmentation des

taux d’anticorps spécifiques) sans symptomatologie existent chez presque 50% des

personnes hyperexposées. Dans quelques cas seulement se déclare une allergie au

Penicillium avec rhinites ou conjonctivites allergiques et parfois d’authentique

« pneumopathies d’hypersensibilité ». La symptomatologie est alors une dyspnée

fébrile avec toux non productive et la notion de circonstance déclenchante (4 à 8

heures après l’exposition à l’allergène). Citons la « maladie des brosseurs de

saucissons » avec alvéolites allergiques extrinsèques (A.A.E.) décrits pour P.

nalgiovensis et P. chrysogenum, l’asthme à P. candidum chez les « laveurs de

fromage », la « subérose » à P. frequentans chez les ouvriers travaillant le liège.

Le dernier rôle pathogène que l’on peut attribuer aux Penicillium, est la

production dans les aliments, de toxines à l’origine de mycotoxicose d’implication

essentiellement vétérinaire (« contamination » des céréales). Dans l’alimentation

humaine, les denrées les plus touchées sont les fruits, jus de fruits, blé, riz et

fromage avec production de patuline ou de citrine. Même en cas de respect de la

chaîne du froid, cette production de toxine peut poser un problème puisque de

nombreuses espèces de Penicillium dites « psychrophiles » peuvent se développer à

des températures très basses (<4°C) voire négatives.

P. MARNEFFEI EST LE SEUL PENICILLIUM CAPABLE D’INDUIRE

CLASSIQUEMENT UNE MYCOSE PROFONDE

ALORS QUE POUR LES PENICILLIUM COSMOPOLITES,

LE POUVOIR PATHOGENE EST FAIBLE ET SURTOUT INDIRECT

(CONTEXTE PARTICULIER D’HYPERSENSIBILISATION AUX PENICILLIUM)

34
 II.5 LA CULTURE

P. marneffei pousse facilement in vitro, mais comme souvent en mycologie

médicale, et encore plus ici, l’aspect de la culture dépend du milieu de culture utilisé

et des conditions de température et de la durée d’incubation.

II.5.1 LES MILIEUX DE CULTURE.

II.5.1.1 Pour obtenir la forme filamenteuse

De nombreux milieux peuvent être utilisés, le plus courant pour obtenir la forme

saprophyte filamenteuse est le milieu de SABOURAUD. Des milieux plus pauvres,

habituellement utilisés pour favoriser le développement de fructification conviennent

également, c’est le cas du milieu P.C. (Pomme de terre-Carotte), du milieu au moût de

bière ainsi que le milieu Czapek.

Dans le contexte d’un examen bactériologique, il est possible d’isoler P.

marneffei car la plupart des milieux de bactériologie peuvent assurer son

développement, dès lors qu’ils contiennent du sang (géloses au sang de cheval simples,

les géloses Müller-Hinton au sang, et les géloses sang-cerveau-cœur).

II.5.1.2 Pour obtenir la forme levure

Par contre, la culture de la forme levure, stade rencontré en clinique, est plus

difficile. Il faut utiliser une infusion de cœur et de cerveau, le milieu B.H.I que l’on

incube à 37°C.

II.5.2 LES CONDITIONS DE CULTURE.

Qu’ils soient coulés en boîte de Pétri ou en tube, les milieux de culture sont

incubés en aérobiose dans des étuves, classiquement à deux températures : 25°C (ou

35
22°C) et 37°C. Pour éviter les contaminations bactériennes, des antibiotiques

(chroramphénicol ou gentamicine) sont incorporés aux milieux de mycologie. Par

contre, l’actidione (cycloheximide), souvent ajoutée au milieu pour éliminer la plupart

des contaminants fongiques, est à proscrire puisque les Penicillium en font partie. P.

marneffei, malgré toutes ces particularités, n’échappe pas à la règle.

Le milieu de référence est donc le milieu de SABOURAUD glucosé ou dextrosé, avec

chloramphénicol, sans actidione.

II.5.3 ASPECT MACROSCOPIQUE DES CULTURES

II.5.3.1 A température ambiante

Tous les milieux permettent un développement rapide du P. marneffei. Le

développement sur milieu de SABOURAUD dextrosé ou glucosé (milieu de référence)

est rapide avec apparition en 24 à 48 heures de colonies reconnaissables en 3 jours

(délai rapide pour un filamenteux). La culture de P. marneffei se présente comme une

culture floconneuse à cause des conidiophores érigés, d’abord lisse puis plissée telles

les circonvolutions d’un cerveau au sein desquels peuvent apparaître des gouttelettes

d’exsudat. Elle atteint classiquement 4 cm de diamètre en un mois de développement

(figure 7).

Cette culture est caractérisée par la présence d’un pigment rouge brique

intense, très hydrosoluble donc très diffusible envahissant toute la gélose en 15

jours, et donnant un aspect caractéristique au revers.

Le recto, quant à lui, présente un aspect de Penicillium classique c’est à dire de

duvet épais. Initialement blanc, il évolue du jaune doré au vert devenant parfois coloré

en « rose fleur de pêcher » puisqu’il rougit en vieillissant (à cause du pigment rouge

produit en dessous) (Drouhet and Dupont, 1995).

36
Figure n°7: Aspect macroscopique à température ambiante de Penicillium marneffei
sur Sabouraud au 15ème jour.

II.5.3.2 A température corporelle

L’aspect macroscopique est proche des colonies obtenues avec les levures,

c'est-à-dire des colonies lisses, muqueuses voire crémeuses très peu pigmentées en

général beige clair. Le développement est beaucoup plus lent et ne s’accompagne

jamais du pigment rouge caractéristique.

II.5.4 ASPECT AU MICROSCOPE OPTIQUE

II.5.4.1 A température ambiante

L’aspect microscopique est celui d’un enchevêtrement de filaments mycéliens

septés mais non pigmentés sur lesquels s’individualisent de nombreux pinceaux,

générateurs de nombreuses chaînes de spores. Les spores formées restent en effet

plus ou moins accolées, formant des chaînes basipètes non ramifiées où la spore la plus

jeune est au contact de la phialide (figure 4-e). Les spores prennent volontiers l’aspect

37
de citrons séparés par disjoncteur. A noter que sur milieu au moût de bière et sur

milieu PC, les filaments mycéliens peuvent prendre la forme d’arc, pouvant donner

naissance à de multiples vrilles (Drouhet and Dupont, 1995).

II.5.4.2 A température corporelle

A 37°C, les filaments mycéliens existent mais il y a tendance au

raccourcissement par fragmentation avec présence d’arthrospores ou arthroconidies,

d’abord rectangulaire puis s’arrondissant en vieillissant correspondant à la

transformation en levures. On observe donc un mélange de levure avec présence de

cloison centrale sans étranglement et de forme d’hyphe court.

II.5.5 ASPECT AU MICROSCOPE ELECTRONIQUE

Elle permet de visualiser l’ultrastructure des levures et l’évolution dans les

phagosomes des macrophages. Les éléments lévuriformes sont entourés d’une paroi

épaisse et d’une cloison transversale, témoin du mode de reproduction par scissiparité.

En observant les macrophages, on note la présence intracytoplasmique de

phagolysosomes avec multiplication intra-vacuolaire des levures jusqu’à rupture

expliquant le nombre élevé de levures intracytoplasmiques.

P. MARNEFFEI A DONC DEUX MORPHOLOGIES ET DEUX MODALITES

DE REPRODUCTION ASEXUEE.:

► L’une levuriforme dans sa forme parasitaire à 37°C (donc tissulaire)

avec l’aspect caractéristique donné par la reproduction par fission binaire

(présence de septum central).

► L’autre mycélienne dans sa forme saprophyte, c'est-à-dire en culture

à 22°C ou dans le sol, produisant de nombreuses spores.

38
III EPIDEMIOLOGIE

La pénicilliose à P. marneffei est une anthropozoonose puisque P. marneffei

infecte une (seule) autre espèce de mammifère: le rat du bambou ; qui n’est autre

que le rat « commun » du Sud-est asiatique. Deux genres et quatre espèces sont

décrits: Rhizomys sinensis, le premier signalé comme porteur de P. marneffei, R.

pruinosus, est le plus répandu, R. sumatrensis, le plus gros, pouvant atteindre 50 cm

et Cannomys badius, est beaucoup plus petit. Globalement, la répartition de ces

quatre rats couvre l’ensemble du sud-est asiatique.

L’épidémiologie du P. marneffei est encore imparfaitement connue. Le rôle du

rat du bambou est difficile à préciser : simple hôte accidentel, réservoir ou

disséminateur…? Il a été montré que sa présence n’est pas absolument nécessaire à la

contamination (Chariyalertsak et al., 1997).

III.1 REPARTITION GEOGRAPHIQUE

Les infections à P. marneffei sont endémiques dans les zones rurales d’Asie du

Sud-est, plus précisément au sud de la Chine (province du Guangxi), et surtout dans le

Nord de la Thaïlande mais également à Hong-Kong,Taiwan (Sirisanthana and

Supparatpinyo, 1998) et indonésie (Deng et al., 1986). Plus récemment, de nouvelles

zones d’endémies sont décrites : l’Inde (Singh et al., 1999), le Laos, la Malaisie, le

Vietnam et tout dernièrement le Cambodge (figure 8).

La région de Chaing Maï (Thaïlande du nord) concentre à elle seule plus de la

moitié des cas répertoriés dans la littérature (Breton et al., 1998a). Elle représente

déjà la troisième infection opportuniste du stade SIDA après la tuberculose et la

pneumocystose avec près de 10% des VIH+ concernés (Wong and Lee, 1998).

39
Figure n°8 : Répartition géographique des zones d’endémies de la pénicilliose

40
 Inéluctablement, de nombreux nouveaux pays déclarent leur premier cas de

pénicilliose, c’est le cas de Taïwan (Chiang et al., 1998), de la Malaisie avec cinq cas

d’importation (Kurup et al., 1999) et un cas autochtone (Saadiah et al., 1999).

En 2000, c’est au tour du Japon avec un cas d’importation (Mohri et al., 2000), puis le

Vietnam (Hien et al., 2001);(Le Pape et al., 2002). Enfin, très récemment, au

Cambodge, description de deux premiers cas chez des sujets n’ayant jamais voyagé

(Bailloud et al., 2002).

Il est vraisemblable qu’à l’avenir, ce champignon sera retrouvé dans d’autres

régions du Sud-est asiatique, tels que la Birmanie et le Bangladesh où les conditions

écologiques sont très voisines.

Pour contracter une pénicilliose il faut :

-SOIT ETRE ORIGINAIRE D’ASIE du SUD-EST.
-SOIT Y AVOIR SEJOURNE.

Il existe cependant deux exceptions :

Deux cas de pénicilliose chez deux patients non asiatique n’ayant jamais

voyagé en zone d’endémie et n’ayant pas été en contact avec des personnes

originaires ou revenant de cette zone, mais dont le point commun est un contact avec

P. marneffei au sein d’un laboratoire.

- Le premier cas est la pénicilliose d’inoculation du Pr Segretain.

- Le deuxième cas, avait même été publié comme le premier cas africain

de pénicilliose à P. marneffei. Il concerne un médecin congolais venu à l’institut Pasteur

pour suivre des cours d’immunologie, dans une salle de travaux pratiques du laboratoire

où des cultures de P. marneffei avaient été préalablement manipulées. Ce médecin qui

ignorait sa séropositivité pour le VIH, décèdera de cette pénicilliose (Hilmarsdottir et

al., 1994).

41
 III.2 MODE DE CONTAMINATION

Le mode de contamination n’est pas parfaitement établi mais il semble que P.

marneffei puisse pénétrer de trois manières différentes chez l’Homme et chez le rat.

III.2.1 CONTAMINATION DE L’HOMME

III.2.1.1 Inhalation de spores

La voie de contamination la plus évidente est l’ inhalation de spores de P.

marneffei, argumentée par:

► La contamination du médecin congolais. Cette expérience

malheureuse suggère en plus la notion qu’un inoculum très faible peut suffire le

médecin n’est resté qu’un temps très court dans cette salle et que les analyses de l’air

effectuées, certes a posteriori, n’ont pas décelé la présence de spores de P. marneffei

► Le fait que P. marneffei produise une quantité élevée de spores et

que ces spores très petites (2 à 3 µm), facilement aéroportées, autorise un passage

jusqu’aux alvéoles pulmonaires (< 5 µm).

► Le fait que le poumon possède un système réticulo-histiocytaire très

développé et que l’infection pulmonaire est souvent la première manifestation avant la

dissémination (Jayanetra et al., 1984).

► Le fait que c’est la voie d’entrée des autres mycoses systémiques

(cryptococcose, aspergillose, histoplasmose…) et des autres réticuloses comme la

tuberculose.

III.2.1.2 Inoculation de spores ou de levures

La contamination par inoculation est possible, prouvée par Segretain mais

également par un cas de contamination par un clou (Heath et al., 1995). Elle est

accidentelle et donc minoritaire mais elle est sans doute sous estimée puisque le

42
développement du nombre de toxicomanes Intra-Veineux (IV), population à forte

prévalence pour le VIH, augmente le risque potentiel de transmission par échange de

seringues souillées. C’est le seul cas où la contamination se ferait à partir de la forme

parasitaire lévuriforme.

III.2.1.3 Ingestion de spores ou de levures

Bien qu’inhabituelle pour un champignon filamenteux, la contamination par

ingestion a ici été envisagée. A noter que dans la série de Deng (Deng et al., 1986), un
patient sévèrement atteint était végétarien ce qui semble écarter la consommation de

rat comme unique voie de contamination. D’ailleurs, l’étude de Chariyalertsak n’a pas pu

établir de corrélation statistiquement significative entre cette consommation, par

certains indigènes de la province du Guangxi, et l’infection à P. marneffei ni même pour

la consommation de pousses de bambou (Chariyalertsak et al., 1997).

III.2.2 CONTAMINATION DU RAT DU BAMBOU

La prévalence chez le rat est plus élevée que chez l’homme. En effet, Deng

montre que la prévalence, observée sur 19 Rhizomys sinensis vietnamiens est de 100%

(Deng et al., 1986). Plus tard, en Thaïlande cette fois, Ajello montre que c’est 75%

des Rhizomys puinosus et presque 20% des Cannomys badius qui sont atteints avec

prédominance de l’atteinte pulmonaire (83% des cas) et pancréato-hépatique (33% des

cas) (Ajello et al., 1995).

► L’ingestion est très probable, les rats se nourrissant des pousses de

bambou, or P. marneffei a été retrouvé sur les racines et les tiges de bambou (Deng

et al., 1986).

43
 ► L’inhalation également puisque les rats construisent leurs terriers

dans ces bambous et qu’il a été prouvé l »existence de spores tellurique au niveau des

terriers (Drouhet and Dupont, 1995).

► L’inoculation ne peut pas être exclue (morsures, blessures), elle est

en effet possible puisque réalisée lors de l’expérimentation animale (injection intra-

péritonéale)]

III.3 SOURCE DE CONTAMINATION

III.3.1 A PARTIR D’HOMMES EUX-MEMES ATTEINTS.

Cette source de contamination est très peu probable (faible excrétion

parasitaire). Cependant, la transmission directe sanguine lors d’un échange de seringue

en cas de toxicomanie IV ne peut être exclue. D’autant que la pénicilliose est

caractérisée par des fongémies fréquentes et élevées. Cette voie de contamination n’a

cependant pas encore été prouvée pourtant dans la série récente de Ranjana, 31 des

36 patients sont des toxicomanes IV. (La toxicomanie IV constitue de toute façon un

facteur favorisant l’installation de la pénicilliose) (Ranjana et al., 2002).

III.3.2 A PARTIR DU RAT DU BAMBOU

L’étude de Chariyalertsak n’a pas pu démontrer que le rat pouvait constituer un

réservoir pour l’homme. Le contact direct avec le rat et sa consommation semble

pouvoir être écartée (Chariyalertsak et al., 1997).

III.3.3 A PARTIR DU SOL

C’est, pour de nombreux auteurs, la plus probable. Pour Chariyalertsak, Homme

et rat semblent tous deux exposés à une source de contamination environnementale

44
commune vraisemblablement issue du sol (Chariyalertsak et al., 1997). Ces études

n’ont cependant pas pu prouver que ce réservoir était le bambou (pourtant fortement

évoqué). Quoi qu’il en soit, les cas de pénicillioses sont plus nombreux pendant la saison

des pluies ce qui suggère une expansion du réservoir pendant cette saison, argument

supplémentaire en faveur d’un réservoir au niveau du sol (Chariyalertsak et al., 1996).

III.4 FACTEURS FAVORISANTS

III.4.1 TERRAIN

III.4.1.1 L’âge

L’âge auquel le risque est le plus élevé est compris entre 16 et 30 ans, mais des

cas de pénicillioses ont été décrits à tout âge (de 4 mois à 70 ans). Il ne semble donc

pas représenter un facteur de risque particulier.

III.4.1.2 Le sexe

Il y a une nette prédominance du sexe masculin parmi les pénicillioses (sexe

ratio à 9). Elle semble due au fait que c’est la population exposée qui est à

prédominance masculine (prédominance masculine des VIH+, travail essentiellement

masculin du bambou...). Une femme pourrait avoir autant de risques de la contracter si

elle était aussi exposée ; d’ailleurs, sur les 28 premiers cas décrits, il n’y a « que » 53

% d’hommes.

III.4.1.3 Le terrain héroïnomane

Le développement rapide de la toxicomanie IV est, avec celui du VIH, un

problème de santé publique dans le Sud-est asiatique. L’étude de Ranjana expose, dans

45
sa série de pénicilliose, une « troublante » morbidité chez les héroïnomanes : 31 sur 36

soit 83% (Ranjana et al., 2002). Ce terrain ne doit pas être négligé puisqu’il apporte

de nouvelles possibilités épidémiologiques, à l’instar de ce qui a été retenu pour

expliquer le premier cas de leishmaniose viscérale au Vietnam.

III.4.1.4 L’alcoolisme chronique

Rappelons que l’alcoolisme chronique au stade de cirrhose hépatique est une des

causes majeures d’immunodéficience acquise ; Louthrenoo en fait un facteur

favorisant du développement de formes ostéo-articulaires de pénicilliose (Louthrenoo

et al., 1994).

III.4.2 FACTEURS IATROGENES

Les médicaments pouvant favoriser la survenue d’une pénicilliose sont des

médicaments qui interfèrent avec le système immunitaire.

- La corticothérapie au long cours mais également de façon ponctuelle, pouvant

en plus constituer un facteur de dissémination. Il a été constaté que les corticoïdes

provoquent une extension des lésions initiales et l’apparition de nouvelles atteintes

viscérales. Jayanetra a en effet signalé, lors d’une corticothérapie, l’apparition de

lésions cutanées, témoins d’embols septiques (Jayanetra et al., 1984).

- Les autres immunosuppresseurs, surtout s’ils sont donnés dans des contextes

dysimmunitaires comme les maladies auto-immunes ou s’ils sont associés aux

corticoïdes. Citons l’azathioprime IMUREL® et le cyclophosphamide ENDOXAN®

utilisés couramment comme traitement des maladies auto-immunes sévères. Par

analogie, les traitements utilisés pour les greffes, surtout de rein et de moelle

46
osseuse, dont on sait qu’ils provoquent des immunodépressions cellulaires profondes

seront sans doute cités comme facteurs favorisant à l’avenir.

III.4.3 PATHOLOGIES SOUS-JACENTES

Elles sont fortement favorisantes puisque dans tous les cas d’importations

actuellement décrits, une pathologie sous-jacente génératrice d’immunodépression est

présente. Il existerait cependant quelques cas autochtones pour lesquels aucune

pathologie sous-jacente n’explique l’immunodépression observée (So et al., 1985) et de

rares cas sans pathologie sous-jacente, ni immunodépression où la pénicilliose est alors

plus localisée (adénite suppurée par exemple).

► Le principal facteur favorisant est l’immunodépression liée au VIH.

En effet, l’immunodéficience générée par le VIH, portant principalement sur

l’immunité cellulaire, est présente dans plus de 90% des cas décrits. Il existe une

réelle corrélation entre l’expansion du SIDA et la pénicilliose en Thaïlande

(Supparatpinyo and Sirisanthana, 1994). La pénicilliose à P. marneffei se déclare

quand les sujets VIH+ ont une immunodépression profonde avec des taux de

lymphocytes CD4 inférieur à 50 CD4/mm3. Dans les 80 cas étudiés par Supparatpinyo,

les CD4+ variaient entre 1 et 44/mm3 avec une moyenne à 9 CD4+/ mm3, pour un

rapport CD4/CD8 effondré, en moyenne à 0,06 (Supparatpinyo et al., 1993).

► En dehors de l’immunodépression liée au VIH, les circonstances les plus

souvent décrites sont :

- Les syndromes lymphoprolifératifs, surtout la maladie de Hodgkin et les

autres lymphomes sans oublier la macroglobulinémie de Waldenström. En revanche, les

leucoses aigües et les pathologies myéloïdes sont beaucoup moins décrites.

47
 - Les maladies auto-immunes et notamment le lupus érythémateux disséminé

(Lam et al., 1997; Lo et al., 1995), le syndrome de Gougerot-Sjögren et la

dermatomyosite.

- La tuberculose (Louthrenoo et al., 1994).

- Les cancers et les infections.

L’ARCHETYPE STATISTIQUE du candidat à la pénicilliose est donc :

Un homme, de préférence jeune, séropositif pour le VIH, qui vit en zone
rurale du Sud-est asiatique ou qui y voyage pendant la saison des pluies.

Le nombre de cas de pénicilliose reste faible, mais l’augmentation du nombre de

terrain immunocompromis d’un côté (essentiellement due à l’explosion galopante du

SIDA et à l’utilisation de thérapeutique de plus en plus agressive pour le système

immunitaire) et l’attrait grandissant du tourisme asiatique de l’autre (encore

abordable), risquent de faire augmenter sa morbidité.

Le « pénicillium rouge » est considéré comme un « nouveau géant réveillé » et

suggère que tout immunodéprimé voyageant en zone d’endémie devrait être informé

du risque qu’il encourt (Drouhet, 1993).

48
IV CLINIQUE

P. marneffei est caractérisé par son affinité pour le système réticulo-

endothélial (réticulo-histiocytaire) et sa capacité à proliférer à l’intérieur des

histiocytes (Segretain, 1959). Comme la localisation de ce système est diffuse,

l’atteinte est donc polyviscérale avec envahissement des poumons, de la rate, des

ganglions, du foie, de la moelle osseuse mais également de la peau, du tube digestif,

des os…

Rappelons qu’à l’initiative du ministre de la Santé Thaï, la pénicilliose appartient

aux pathologies définissant le stade clinique de S.I.D.A depuis 1992.

IV.1 INCUBATION
La durée d’incubation pour une primo-infection est de 4 à 8 semaines, mais

peut être beaucoup plus longue puisqu’il existe des formes asymptomatiques

d’infection à P. marneffei, dites latentes, pouvant devenir symptomatiques à la faveur

d’une diminution de l’immunité (Cooper and McGinnis, 1997).

IV.2 MANIFESTATIONS CLINIQUES

Elles sont très variables et ne sont pas spécifiques. Ainsi, la pénicilliose à P.

marneffei peut rester d’expression localisée ou se généraliser, réalisant alors un

tableau de syndrome septicémique avec souffrance multi-viscérale.

► Les formes localisées existent mais sont très rares. C’est dans ce groupe que

l’on retrouve les patients sans immunodépression apparente ou une immunodépression

non liée au V.I.H.

► Les formes disséminées représentent la quasi-totalité des cas et sont en

général associées aux infections par le V.I.H.

49
 Quoi qu’il en soit, il existe un tropisme cutanéo-muqueux et pulmonaire de P.

marneffei associé à un syndrome général ; Les signes les plus constants étant la
fièvre, l’altération de l’état général avec amaigrissement puis des signes cutanés et

une toux persistante. Les différentes manifestations cliniques sont classées par

ordre décroisant :

IV.2.1 MANIFESTATIONS GENERALES

Un syndrome général est toujours présent avec, avec quasiment dans tous les

cas, une fièvre, parfois élevée, persistante ou intermittente, pouvant s’accompagner

de frissons ou de sueurs nocturnes et une altération de l’état général. Celle-ci,

est souvent au premier plan et s’exprime par:

► Un amaigrissement (72% chez le VIH+) souvent secondaire à

l’anorexie et/ou à la dysphagie (Duong, 1996; Hilmarsdottir et al., 1993).

► Une pâleur et une asthénie dues à l’anémie (74% des cas)

(Duong, 1996; Hilmarsdottir et al., 1993).

S’y associe souvent une poly-adénopathie généralisée superficielle ainsi qu’une

hépato-splénomégalie due à des micro-abcès. Les adénopathies sont le plus souvent

indolores, mobiles, fermes généralement bilatérales, avec localisation cervicale très

fréquente.

IV.2.2 MANIFESTATIONS RESPIRATOIRES

Elles sont très fréquentes chez le sujet V.I.H.+ et la symptomatologie est

proche de la tuberculose pulmonaire avec une toux persistante, maître symptôme,

généralement non productrice mais pouvant être dyspnéisante, oppressive et même

s’accompagner d’hémoptysie (Sekhon et al., 1994).

50
 IV.2.3 MANIFESTATIONS CUTANEO-MUQUEUSES

! Les signes cutanés sont importants à connaître car très évocateurs s’ils

sont associés à des manifestations respiratoires. Ils traduisent la dissémination

hématogène de P. marneffei.

L’atteinte cutanée type est une éruption papuleuse érythémateuse avec

ombilication nécrotique centrale (figure 9) pouvant être confondue avec celle du

molluscum contagiosum, des mycobactérioses, mais surtout de l’histoplasmose à

Histoplasma capsulatum, et de la cryptococcose cutanée. (Supparatpinyo et al., 1992a).

L’éruption peut être pustuleuse, acneïforme, maculo-papuleuse voire papuleuse mais

sans ombilication centrale. L’ulcération de ces lésions est possible, surtout chez

l’immunocompétent, aboutissant à la formation d’abcès ou de granulomes septiques.

Enfin, des érythèmes palmo-plantaires et des purpura pétéchial des paupières ont été

signalés (Jayanetra et al., 1984). Toutes ces lésions diffuses siègent principalement au

niveau de la face, du tronc et des extrémités.

Figure n°9 : Aspect typique de lésions cutanées ulcérées de pénicilliose.

51
 ! Les atteintes muqueuses, regroupe essentiellement des lésions bucco-

pharyngées, provoquant des ulcérations, des éruptions buccales, des angines

pustuleuses et souvent des pharyngites à l’origine d’une dysphagie expliquant aisément

l’anorexie souvent décrite (Vanittanakom and Sirisanthana, 1997). L’atteinte des

muqueuses génitales est parfois décrite.

IV.2.4 AUTRES MANIFESTATIONS.

! Digestives : Quand la pénicilliose est disséminée, la manifestation digestive

majeure est une diarrhée liquide plus ou moins sanglante due aux ulcérations diffuses

de la muqueuse intestinale (Supparatpinyo et al., 1992b).

! Osseuses : A l’instar de la tuberculose, de l’histoplasmose africaine, de la

blastomycose systémique et de la cryptococcose, des abcès osseux avec ostéolyse

sont décrits (Drouhet, 1993).

! Articulaires : P. marneffei peut être responsable d’arthrite siégeant

essentiellement aux poignets et aux chevilles, soit primitive, soit secondaire à

l’extension d’un abcès osseux. A noter que ces arthralgies semblent épargner le

squelette axial.

! Cardiaques : D’authentiques péricardites à P. marneffei ont été décrites

(So et al., 1985).

En conclusion, la pénicilliose à P. marneffei se traduit par une

altération de l’état général dans un contexte fébrile avec polyadénopathies

associée à un ou plusieurs tableaux suivants : Pneumopathie avec toux (avec

ou sans atteinte pleurale), affection cutanéomuqueuse, atteinte ostéo-

articulaire, et plus rarement, abcès hépatique, péricardite.

52
 IV.3 DIFFERENCE ENTRE SUJETS VIH+ ET

« IMMUNOCOMPETENTS »
Globalement, le type de symptomatologie est identique, même pourcentage de

fièvre, d’éruptions cutanées…. Par contre, c’est l’intensité des symptômes et

l’évolution vers la dissémination qui font toute la différence : l’immunodépression

engendrée par l’infection à VIH favorise la survenue d’une pénicilliose disséminée

grave, avec une fièvre volontiers plus élevée, une éruption plus intense, mais rarement

abcédée. Wong montre en effet que l’incidence de la fongémie est significativement

plus fréquente chez le VIH+ (Wong et al., 2001).

Quelques différences sont à noter tout de même : l’atteinte des muqueuses

génitales se rencontre électivement chez le patient VIH+, celle du pharynx et du

palais préférentiellement chez ces mêmes patients. A l’inverse, c’est chez

« l’immunocompétent » que les lésions cutanées peuvent évoluer en abcès cutanés et

que les lésions osseuses (ostéolyse avec abcès à polynucléaires) sont fréquentes.

IV.4 EVOLUTION ET PRONOSTIC

Cette mycose disséminée du système réticulo-histiocytaire est une pathologie

plutôt chronique avec une moyenne d’évolution à 10 mois (2 à 36 mois). (Jones and

See, 1992);(Sobottka et al., 1996)

Le pronostic est globalement très mauvais puisqu’en l’absence de

traitement, la mort est inévitable chez un patient VIH+ et quasi-inévitable (91,3% des

cas) chez le patient non-VIH+ (Deng and Connor, 1985);(Drouhet and Dupont, 1995).

Il dépend essentiellement de deux facteurs :

► Le degré d’immunodépression : Le pronostic dépend donc surtout du

terrain et l’immunodépression liée au VIH est le plus défavorable. Suivent ceux

associés aux hémopathies malignes ou aux maladies auto-immunes.

53
 ► Du stade évolutif au moment du diagnostic et de la rapidité de prise

en charge thérapeutique : Elle apporte un bénéfice d’autant plus grand qu’elle est

précoce.

UNE THERAPEUTIQUE ANTIFONGIQUE PRECOCE ASSOCIEE A

UNE RESTAURATION IMMUNITAIRE PEUT REVOLUTIONNER

UN PRONOSTIC A PRIORI TRES SOMBRE

54
 IV.5 DIAGNOSTIC CLINIQUE DIFFERENTIEL

De par sa symptomatologie peu spécifique, le diagnostic différentiel peut se

poser avec de nombreuses autres pathologies mycosiques (histoplasmose,

cryptococcose surtout cutanée, candidose profonde) mais aussi bactériennes

(tuberculose) ou parasitaires (leishmaniose viscérale)

IV.5.1 AVEC LES AUTRES MYCOSES « EXOTIQUES »

La pénicilliose à P. marneffei appartient au groupe des mycoses systémiques

ou viscérales dites « exotiques ». Ces différentes mycoses d’importation,

cliniquement très proches, rendent le diagnostic différentiel difficile. Elles ont

toutes en commun d’être provoquées par l’inhalation de spores d’un champignon

dimorphique responsable d’une granulomatose aux symptômes peu spécifiques : la

primo-infection en général pulmonaire est le plus souvent asymptomatique (tout au

plus un syndrome pseudo-grippal) pouvant secondairement disséminer, en fonction du

degré d’immunocompétence, par voie hématogène pour atteindre la peau, les os et/ou

le cerveau.

IV.5.1.1 Histoplasmose américaine ou Histoplasmose « à

petites formes »

Principal diagnostic différentiel, la maladie de Darling (due à Histoplasma

capsulatum var. capsulatum) est la mycose opportuniste d’importation la plus

fréquente. Même si elle existe en Asie du Sud-Est, elle se contracte essentiellement

aux Antilles, en Guyane française et dans une moindre mesure au centre et à l’Est des

Etats-Unis, en Amérique du Sud, en Afrique du Sud et Tropicale et en Océanie

(notamment en Nouvelle-Calédonie).

55
 Fréquente, la primo-infection est en général asymptomatique et de toute façon

résolutive, ce n’est donc qu’en cas d’immunodépression de l’immunité cellulaire

(SIDA, immunosuppresseurs) qu’elle peut évoluer en forme secondaire disséminée avec

fièvre, altération de l’état général, adénopathies volumineuses, hépato-spénomégalie,

cytopénies, lésions cutanées plus ou moins ombiliquées et ulcérées ainsi que des

ulcérations buccales assez évocatrices.

IV.5.1.2 Histoplasmose africaine ou Histoplasmose « à

grandes formes ».

L’histoplasmose africaine, due à Histoplasma capsulatum var. duboïsii pose

beaucoup moins de problème de diagnostic différentiel car :

► Elle est limitée à une zone d’endémie restreinte à l’Afrique de l’Ouest

et centrale (surtout Madagascar), la notion de double voyage est alors nécessaire

pour que le diagnostic différentiel puisse se poser.

► Elle évolue souvent sans fièvre avec des lésions cutanées ou osseuses

plus localisées, voire uniques, d’évolution suppurative chronique: on parle volontiers

d’abcès froid avec adénopathies intenses.

► L’immunodépression est rarement présente, l’histoplasmose africaine

n’est d’ailleurs pas considérée comme une pathologie « opportuniste ».

N’existant que sur le continent américain, Coccidioïdomycose (Amérique du

nord) et Paracoccidioïdomycose (Amérique du Sud) ne seront évoquées que s’il y a la

notion, même ancienne, d’un voyage en Asie et sur le continent américain.

IV.5.1.3 Coccidioïdomycose

Elle est due à Coccidioïdes immitis, autre dimorphique dont la forme parasitaire

n’est pas une levure mais des sphérules, qui, inhalées après les pluies d’orage des

régions désertiques américaines, provoquent une mycose essentiellement respiratoire

56
le plus souvent asymptomatique et en général spontanément résolutive. Elle peut

devenir chronique avec notamment des atteintes articulaires (« rhumatisme du

désert ») et même disséminer chez les sujets VIH+, les femmes enceintes et

certaines ethnies comme les noirs et les asiatiques déterminant alors des atteintes

cutanées, osseuses ou méningées.

IV.5.1.4 Paracoccidioidomycose

Provoquée par Paracoccidioïdes brasiliensis, la primo-infection est respiratoire

et asymptomatique mais devient presque toujours chronique unifocale. Ce n’est qu’en

cas de déficit immunitaire cellulaire qu’elle devient multifocale avec fièvre, A.E.G,

adénopathies, hépato-splénomégalie, manifestations oro-cutanéo-pulmonaires avec des

atteintes buccopharyngées fréquentes (stomatite ulcérante).

IV.5.1.5 Blastomycose

Due à Blastomyces dermatitidis, c’est une anthropozoonose (chat, chien,

cheval…) chronique granulomateuse américaine et africaine, essentiellement

pulmonaire, d’abord aigüe lors de primo-infection puis d’évolution volontiers chronique

avec lésions cutanées, ostéo-articulaires mais rarement neurologiques.

L’immunodépression engendrée par le VIH accentue la dissémination, la rendant plus

diffuse et plus profonde avec atteintes multi-viscérales et neurologiques.

IV.5.1.6 Sporotrichose.

Provoquée par Sporothrix schenckii, la sporotrichose pose peu de problème de

diagnostic différentiel car c’est avant tout une pathologie d’inoculation avec un nodule

primaire très symptomatique qui s’étend le long du trajet lymphatique.

57
 IV.5.1.7 Les nouvelles mycoses d’importation.

Un nouveau dimorphique dont la phase parasitaire est constituée de levures

polymorphes (les petites évoquant Histoplasma et les grosses Blastomyces) a été isolé

(en 1995) à partir de lésions cutanées généralisées érythémateuses et ulcérées d’une

malade en phase terminale de SIDA, et nommé Emmonsia pasteuriana (en

hommage à Louis Pasteur puisque isolé l’année de commémoration du centenaire de sa

mort).

Enfin, en 2001, un nouveau Penicillium pathogène à 37°C a été isolé d’une

fongémie mortelle, Penicillium piceum qui appartient aux Penicillium biverticillés

semble partager les mêmes facteurs de virulence que P. marneffei (Horre et al.,

2001).

Le diagnostic de mycoses viscérales exotiques doit être

envisagé chez tout immunodéprimé (ou non !!) ayant déjà voyagé
en zone d’endémie et qui présente un syndrome pseudo-grippal
avec lésions cutanées ou un tableau évocateur de tuberculose.

IV.5.2 AVEC LES MYCOSES SYSTEMIQUES COSMOPOLITES

La pénicilliose est en effet très proche des mycoses systémiques ou viscérales

cosmopolites qui surviennent également sur des terrains particuliers:

► Immunodépression liée au VIH .pour la cryptococcose

► Immunodépression liée aux thérapeutiques récentes (cortico-

thérapie au long cours, sujet neutropénique et a fortiori aplasique) ou aux

hémopathies malignes pour les aspergilloses, candidoses et autres mycoses viscérales

cosmopolites « émergentes » comme la Scedosporiose, la Fusariose, et autres

Trichosporose…

58
 IV.5.2.1 La Cryptococcose

Avec la tuberculose et l’histoplasmose, c’est la pathologie qui peut poser le plus

de problème de diagnostic différentiel : c’est également une infection à levures à

point de départ pulmonaire et à tropisme cutané par dissémination, mais c’est

malheureusement le tropisme neurologique (fréquent) qui l’a rendue aussi célèbre que

grave. Cryptococcus neoformans variété neoformans possède une capsule quasi

pathognomonique qui confère un caractère muqueux aux colonies. Elle est

particulièrement sphérique, de taille hétérogène et se multiplie par un mode de

bourgeonnement particulier : la blastosporulation multiple.

Cette infection opportuniste cosmopolite touche tout particulièrement les

patients infectés par le VIH. La symptomatologie classique est dominée par les

manifestations de méningo-encéphalites où coexiste un syndrome méningé souvent

incomplet (fièvre inconstante et peu élevée) associée à des signes neurologiques. Les

manifestations cutanées, quand elles existent, (5% des cas) sont le plus souvent

secondaires à une dissémination hématogène à partir du foyer pulmonaire provoquant

des lésions multiples papulo-pustulleuses, acnéiformes, papuleuses ou nodulaires plus

ou moins ulcérées siégeant surtout sur la face et aux extrémités. Parfois, la lésion

cutanée est « primaire », unique et correspond à une inoculation.

IV.5.2.2 Les Candidoses profondes

Globalement, les candidoses sont les infections fongiques les plus fréquentes

mais restent le plus souvent superficielles. La survenue d’une candidose dite

« profonde » ou « viscérale », qui ne se développe que sur des terrains fragilisés

(surtout chez les patients en soins intensifs), est une complication redoutable en

raison d’une mortalité élevée, comparable à celle du choc septique (40-60%). Les

facteurs de risques de candidose profonde sont dominés par la neutropénie,

l’antibiothérapie à large spectre, l’existence d’une voie veineuse centrale et la

colonisation de plusieurs sites par Candida sp.

59
 L’expression la plus commune est la candidémie, avec simple état fébrile

intermittent (décharges à partir d’un cathéter) allant jusqu’au syndrome septique

grave avec dissémination multiviscérale rapidement fatale s’accompagnant d’éruption

papulo-érythémateuse ou de myalgies diffuses. Les cibles viscérales sont

essentiellement le foie (abcès hépatique), la rate, le poumon, l’endocarde et surtout

l’œil (endophtalmies dans 10 à 40% des candidémies). Cliniquement, les candidoses

profondes ne posent donc pas vraiment de problème de diagnostic différentiel avec la

pénicilliose : la primo-infection est rarement pulmonaire et la contamination ne se fait

pas par inhalation mais est généralement endogène à partir d’une colonisation. Pittet a

d’ailleurs proposé un indice de colonisation permettant la discrimination précoce des

patients à haut risque candidémique : c’est le rapport du nombre de sites colonisés sur

le nombre de sites explorés (Pittet et al., 1994).

IV.5.2.3 Les Aspergilloses

Les aspergilloses (Germaud et al., 2001) sont un ensemble de pathologies

diverses et variées, essentiellement respiratoires et provoquées par diverses espèces

d’ Aspergillus (surtout A. fumigatus). Ce sont des moisissures très répandues,

cosmopolites et ubiquistes aussi bien en milieu rural qu’urbain, à l’extérieur qu’à

l’intérieur avec des spores très petites (2 à 5µm). Les spores sont normalement

éliminées par le tapis muco-ciliaire, les macrophages et les polynucléaires neutrophiles.

Pour s’implanter et se développer, ces pathogènes opportunistes nécessitent donc des

conditions favorables locales (cavité broncho-pulmonaire ou pleurale pré-existante,

dilatation des bronches, mucoviscidose, BPCO) ou générales (surtout la neutropénie

prolongée, hémopathies, corticothérapie, granulomatose septique chronique).

A partir d’une implantation pulmonaire, l’aspergillose reste localisée chez

l’immunocompétent mais devient d’autant plus invasive et redoutable que

l’immunodépression est profonde. On distingue schématiquement :

" Chez l’immunocompétent :

60
 ► L’aspergillome, véritable boule fongique (« truffe aspergillaire ») bien

délimitée dans une caverne pré-existante (séquelle de tuberculose) qui provoque une

toux plus ou moins associée à des hémoptysies. Les signes paracliniques majeurs sont

l’image radiologique « du grelot » et une sérologie aspergillaire très positive. Le

traitement est essentiellement chirurgicale complété ou non par l’injection intra-

cavitaire de pâte d’amphotéricine B.

► L’inhalation et la persistance des spores aspergillaires chez les asthmatiques

et les BPCO peuvent entraîner une réaction d’hypersensibilité avec asthme réaginique

ou alvéolite allergique extrinsèque : c’est l’aspergillose broncho-pulmonaire allergique

(ABPA). Au niveau paraclinique, on retrouve des « bronchectasies proximales » à la

radiologie et une sérologie fortement positive (IgG mais également IgE). Le

traitement associe les corticoïdes et l’itraconazole.

" Chez l’immunodéprimé :

► L’aspergillose peut devenir invasive, déterminant l’aspergillose pulmonaire
invasive (API) qui est devenue en deux décennies l’infection la plus redoutée en

d’Hématologie clinique par son grand risque de dissémination vasculaire (hémocultures

restant négatives) avec tropisme cutané, cérébral et défaillance multiviscérale

rapidement fatale. Elle est facilement suspectée (pneumopathie infectieuse résistante

aux antibiotiques chez un patient à haut risque d’API) mais difficile à confirmer

(nécrose objectivée par un halo de densité atténué périlésionnel puis par l’aspect en

croissant gazeux, sérologie faiblement positive mais antigénémie positive).

► Elle peut devenir semi-invasive, déterminant l’aspergillose pulmonaire

chronique nécrosante (APCN) caractérisée par un envahissement plus lent avec

inflammation chronique sans invasion vasculaire ni dissémination. L’extension pleurale

ou pariétale se fait par contiguïté. Elle nécessite un traitement antifongique prolongé

par amphotéricine B ou itraconazole.

61
 IV.5.2.4 Les mycoses viscérales cosmopolites émergentes

Les nouveaux pathogènes opportunistes, qu’ils soient filamenteux

(Scedosporium, Fusarium) avec présence de spores dans l’air ou levuriformes

(Trichosporon qui colonise volontiers la peau), peuvent provoquer des mycoses

profondes, de pronostic redoutable, avec des symptômes peu spécifiques mais des

localisations cutanées fréquentes. Même s’ils sont encore exceptionnels, leur

caractère cosmopolite doit les faire évoquer devant toute infection profonde de

l’immunodéprimé d’autant que la prise en charge thérapeutique est différente du fait

d’une résistance fréquente à l’amphotéricine B.

IV.5.3 AVEC LA TUBERCULOSE

La tuberculose évolue en deux phases : d’abord une primo-infection pulmonaire

(la « tuberculose infection ») asymptomatique avec développement d’une réaction

immunitaire de type hypersensibilité retardée, expliquant la réactivité aux tests

cutanés (intradermo-réaction à la tuberculine). S’installe ensuite une phase de latence

définitive, sauf dans 10% des cas où elle se transforme en « tuberculose maladie »

de localisation essentiellement pulmonaire et parfois extra-pulmonaire par

dissémination hématogène. Bien que provoquée par une bactérie, la tuberculose est

très proche de la pénicilliose. En effet :

► Elle associe des signes respiratoires, comme une toux prolongée,

sèche ou productive, accompagnée parfois d’hémoptysies et de douleurs thoraciques, à

des signes généraux non spécifiques comme une asthénie, un amaigrissement,

l’anorexie et une fièvre avec sueur nocturne.

► Le développement de Mycobacterium tuberculosis est intra-

macrophagique sous forme granulomateuse avec micro-abcès et possibilité de

dissémination hématogène.

62
 ► Alors qu’elle ne faisait que diminuer depuis 1952 (apparition de

l’Isoniazide), depuis 1991, son niveau le plus bas, la tuberculose connaît une

recrudescence corrélée à l’extension de la pandémie de SIDA.

► C’est ici aussi l’infection par le VIH qui constitue le facteur

prédisposant majeur de développement mais également de dissémination, augmentant

les localisations extra-pulmonaires et la mortalité (plus du tiers des tuberculeux sont

VIH+).

Par contre, l’évolution caséeuse avec nécrose et calcification n’a pas

été décrite dans la pénicilliose. De même, les signes radiologiques sont différents

puisque pour la tuberculose, outre les éventuels adénopathies médiastinales, la

radiographie objective l’existence de nodules et de cavernes siégeant volontiers dans

les apex pulmonaires supérieurs. Enfin, l’évolution sans traitement est moins grave

pour la tuberculose qui n’est fatale « que » dans 50% des cas.

IV.5.4 AVEC LA LEISHMANIOSE VISCERALE

La leishmaniose viscérale ou « kala-azar » est une maladie parasitaire

généralisée des organes hématopoïétiques endémique dans le Sud de la France (foyer

méditerranéen). Elle est due à l’envahissement des monocytes/macrophages et des

polynucléaires par un protozoaire Leishmania infantum, transmis par la piqûre d’un

diptère, le phlébotome. Classiquement, Leishmania infantum touche essentiellement

l’enfant et provoque un tableau de pancytopénie ou tricytopénie fébrile avec

hypersplénisme mais s’exprime de plus en plus chez l’adulte comme opportuniste dans

deux circonstances d’immunodépression : l’infection VIH ou une corticothérapie,

rejoignant ainsi le contexte de pénicilliose.

Elle constitue donc un véritable diagnostic différentiel d’autant que:

► d’authentiques pénicillioses se présentent comme des

pancytopénies fébriles avec hépato-splénomégalie, sans lésions pulmonaire ni cutanée,

comme c’est le cas pour le dernier cas français décrit à Nice (Rosenthal et al., 2000).

63
 ► la leishmaniose viscérale s’associe très fréquemment à une

hépatomégalie, des poly-adénopathies et un amaigrissement intense.

IV.5.5 AVEC LA SARCOIDOSE

La sarcoïdose, par son retentissement ganglionnaire, fait partie du diagnostic

clinique différentiel de la pénicilliose mais, n’étant pas une pathologie infectieuse, elle

ne sera pas traitée dans ce travail.

Le diagnostic différentiel est donc très difficile, de nombreuses confusions sont

possibles : en cas d’atteinte viscérale, les pénicillioses sont trop souvent étiquetées

tuberculose (Tsang et al., 1988) ou histoplasmose (Drouhet, 1993). En cas de

symptomatologie cutanée prédominante, c’est la cryptococcose cutanée ou un

molluscum contagiosum qui peuvent être évoqués.

LE CARACTERE PEU SPECIFIQUE DES SIGNES CLINIQUES :

« LESIONS CUTANEES AVEC FIEVRE ET TOUX PERSISTANTE »
EXPLIQUE LA DIFFICULTE DU DIAGNOSTIC DIFFERENTIEL.

LA NOTION DE VOYAGE DANS LE SUD-EST ASIATIQUE RESTE UN ELEMENT CLEF

64
V DIAGNOSTIC PARACLINIQUE

L’imagerie médicale n’a qu’une valeur d’orientation, la radiographie pulmonaire

est souvent normale, c’est le cas pour plus de 60 % des 80 pénicillioses rapportées par

Supparatpinyo (Supparatpinyo and Sirisanthana, 1994). C’est plutôt le scanner qui

permet d’objectiver des lésions pulmonaires le plus souvent interstitielles, des lésions

ostéolytiques multiples bien délimitées, les adénopathies, et l’éventuelle hépato-

splénomégalie.

VI DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE

Le diagnostic présomptif de pénicilliose peut être évoqué rapidement grâce à

l’examen direct ou aux réactions sérologiques. Ce n’est qu’en isolant P. marneffei par

culture ou après inoculation à un animal sensible, que le diagnostic de certitude sera

établi.

VI.1 CONTEXTE BIOLOGIQUE

Sur le plan hématologique, la pénicilliose s’accompagne classiquement d’une

anémie volontiers sévère, mais thrombopénie, neutropénie et lymphopénie CD4+ sont

souvent associées, en particulier chez le VIH+ (Wortman, 1996;Bailloud et al., 2002).

Cette pancytopénie souvent décrite peut s’expliquer par l’envahissement médullaire

mais également par un syndrome d’hémophagocytose (Chim et al., 1998) qu’il est

important de rechercher puisqu’il faut alors compléter le traitement antifongique par

des immunoglobulines (Chokephaibulkit et al., 2001). L’hyperleucocytose avec

polynucléose est également possible.

65
 De nombreuses anomalies biochimiques sont décrites, citons :

► un bilan hépatique très souvent perturbé avec notamment une

cholestase portant essentiellement sur l’augmentation marquée des phosphatases

alcalines (Kantipong et al., 1998) plus ou moins accompagnée de transaminases

augmentées avec ASAT>ALAT (profil habituellement retrouvé dans les atteintes

hépatiques sévères).

► Un syndrome inflammatoire chronique avec une vitesse de

sédimentation élevée et une hypergammaglobulinémie polyclonale à IgG, qui existe

cependant chez la plupart des patients VIH+ même en l’absence de pénicilliose.

► Une atteinte rénale est également possible.

Le fait que le contexte d’infection par le VIH soit classique d’une part, et que

la pénicilliose définisse le stade SIDA d’autre part, impose de rechercher une

séropositivité pour le VIH si ce statut sérologique n’est pas connu.

VI.2 DIAGNOSTIC MYCOLOGIQUE

VI.2.1 LES PRELEVEMENTS

P. marneffei peut être isolé de nombreux liquides biologiques, témoins du

caractère disséminé des pénicillioses: la moelle osseuse (MO), le liquide broncho-

alvéolaire (LBA), les ganglions lymphatiques, mais de façon moins invasive, la recherche

peut être effectuée dans le sang, les selles ou les urines. Les hémocultures sont en

effet positives dans 44 % des pénicillioses (Drouhet and Dupont, 1995).

Quand les lésions cutanées existent, un simple grattage puis étalement du

matériel sur lame permet d’obtenir un frottis qui, après coloration objectivera la

présence de levures d’aspect caractéristique. En fait, tout écoulement purulent

(cutané, osseux ou muqueux), tout épanchement (pleural, synovial) et toute pièce

opératoire (biopsie oesophagienne, hépatique…) peut contribuer à l’isolement et donc

66
au diagnostic de certitude d’infection à P. marneffei. Les prélèvements doivent être

adaptés à la clinique ; ainsi une pancytopénie ou une hépato-splénomégalie évoquent

une atteinte hématopoïétique devant faire privilégier l’hémoculture et la myéloculture.

PONCTION DE MOELLE OSSEUSE, LIQUIDE DE LAVAGE BRONCHO-ALVEOLAIRE,

CYTOPONCTION GANGLIONNAIRE SONT LES PRELEVEMENTS LES PLUS
CONTRIBUTIFS MAIS DE NOMBREUX AUTRES ECHANTILLONS
MOINS INVASIFS PEUVENT FACILEMENT PERMETTRE D’ISOLER P.marneffei :
(HEMOCULTURES, URINES, FROTTIS DE LESIONS CUTANNEES)

VI.2.2 L’EXAMEN DIRECT:

Cet examen est essentiel puisqu’à lui seul, il peut très vite orienter le clinicien

vers un diagnostic présomptif de pénicilliose, devançant de quelques jours une

culture positive qui reste l’élément clef du diagnostic de certitude.

L’examen direct de frottis, biopsies ou de coupes histologiques après coloration

à l’acide périodique de Schiff (P.A.S.), au Giemsa, au Musto ou à l’imprégnation

argentique de Gomori-Grocott est donc le moyen le plus simple et le plus rapide pour

évoquer le diagnostic de pénicilliose. Les éléments fongiques sont le plus souvent

intracellulaires, « libres » (par rupture des phogolysosomes) dans le cytoplasme des

macrophages. Il s’agit d’éléments levuriformes non bourgeonnants. Ce qui « frappe »,

c’est l’aspect très polymorphe de ces cellules fongiques, surtout quand elles sont

extracellulaires. Majoritairement ronde (2 à 3 µm), elles peuvent s’ovaliser, s’allonger

et s’incurver jusqu'à devenir de vraies « saucisses cloisonnées » (5 à 10 µm). Ces

dernières formes sont cloisonnées par des septa prenant bien la coloration.

Le diagnostic différentiel peut se poser avec Histoplasma capsulatum var

capsulatum mais ces levures sont de taille légèrement inférieure, restent toujours
ovale et se multiplient par bourgonnement. Il peut aussi se poser avec Cryptococcus

sp, la différence se fait sur l’absence de capsule à l’encre de chine et sur le mode de

67
reproduction (fission contre bourgeonnement multiple). Il peut enfin se poser avec

Leishmania sp, sur le myélogramme ou sur une ponction ganglionnaire, la coloration au

MGG permet de visualiser des formes ovalaires le plus souvent intracellulaire de 2,5

sur 5 µm qui présentent un noyau et un kinétoplaste très réfringent les différenciant

de P. marneffei.

VI.2.3 LA CULTURE

► Si la pénicilliose est suspectée, un milieu gélosé, glucosé de Sabouraud sera

ensemencé à deux températures, 25°C (ou « température ambiante ») et à 37°C.

► Sinon, le Penicillium, pourra de toute façon se développer à 37°C même sur les
milieux de bactériologie comme une gélose Muller-Hinton ou d’autres géloses au sang, il

faut alors penser à mettre les milieux à température ambiante et la colonie blanc

beige reprendra très vite un développement macroscopique caractéristique

(surélèvement du centre et apparition du pigment rouge)

VI.2.3.1 Aspect macroscopique

► A 22°C, apparition en 48 à 72h d’une colonie duveteuse, floconneuse,

initialement jaune d’or virant au vert puis au rose, avec parallèlement diffusion d’un

pigment rouge « groseille » dans toute la gélose. Sur le recto peut apparaître un

exsudat condensé en fines gouttelettes.

► A 37°C, apparition, en 72h, d’une colonie beige muqueuse ou crémeuse d’abord

lisse d’aspect très particulier, membraneux et glabre, ressemblant à certaines

cultures bactériennes ou à des cultures de Geotrichum. La colonie se plisse

secondairement avec apparition de circonvolutions cérébriformes.

VI.2.3.2 Aspect microscopique

► A 22°C, présence d’innombrables spores lisses et ovales, prenant volontiers la

forme de citron (2 à 3µm) produites par des pinceaux biverticillés disposés sur des

68
 filaments mycéliens. En effet, les conidiophores lisses portent 3 à 5 métules

disposées en verticilles portant elles mêmes 3 à 5 phialides produisant les chaînes de

spores. D’après Segretain, en observant attentivement le pinceau de P. marneffei, on

distingue une dissymétrie dans l’implantation des métules, ce qui permet de subdiviser

le groupe des biverticillés en asymétriques et symétriques (figure 3, page 22). P.

marneffei appartient donc au groupe des biverticillés asymétriques (Segretain,

1959).

► A 37°C, présence de filaments mycéliens coexistant avec des formes de

raccourcissement aboutissant à des articles séparés type arthrospore (arthroconidie)

correspondant à la transformation en levure. A noter qu’il n’y a aucune fructification

(absence de spore) puisque la scissiparité remplace la condiogénèse. Ceci explique le

caractère moins dangereux de cette culture. Au début la forme est celle de bâtonnets

à bouts rectangulaires mais en vieillissant, les bouts s’arrondissent et les formes

deviennent sphériques. Avec l’apparition de cloison sans rétrécissement, elles

s’allongent et s’incurvent en « saucisse ».

L’aspect macroscopique des cultures, déjà très évocateur peut être

complété si besoin par un examen microscopique.
Si l’on dispose en plus de la différence de croissance entre 22° et 37°C
le diagnostic de ce champignon thermiquement dimorphique
devient sans équivoque

VI.2.3.3 L’interprétation

L’isolement d’un P. marneffei en dehors de sa zone d’endémie suffit, pour

affirmer son caractère pathogène. Par contre, la présence d’une espèce de Penicillium

autre que P. marneffei et son interprétation biologique comme agent pathogène est

69
très délicate et devrait tenir compte de la présence ou non de filaments mycéliens à

l’examen direct, de la rapidité de la culture et de la présence ou non d’autres

contaminants. Si en plus le type de prélèvement est potentiellement contaminable,

c’est l’isolement multiple d’un même Penicillium sur plusieurs prélèvements qui signe son

caractère infectieux.

► L’isolement d’un Penicillium autre que P. marneffei en mycologie

médicale est habituellement considéré comme une contamination car leur

pouvoir pathogène est faible et leurs spores très petites sont aéroportées.

► L’isolement d’un Penicillium marneffei doit toujours être

considéré comme un agent infectieux, ne serait-ce que parce qu’il est isolé en

dehors de sa zone d’endémie, limitée à l’Asie du sud-est et parce qu’il est

responsable de mycose disséminée grave chez l’homme.

VI.2.4 L’INOCULATION A L’ANIMAL

L’approche est plus lourde à mettre en œuvre puisqu’il faut disposer d’une

animalerie ; cepandant elle présente un avantage de taille : son caractère moins

dangereux puisqu’il s’agit du stade parasitaire levuriforme et qu’il n’y a donc pas de

production de spores.

Le diagnostic est posé lorsque l’animal développe une réticulose, objectivée par

une grosse rate, un gros foie, des ganglions inguinaux hypertrophiés, un abcès du

péritoine et/ou un abcès au point d’injection intra-péritonéal. Les éléments fongiques

intra-histiocytaires caractéristiques sont mis en évidence par l’examen direct de ces

différents prélèvements. En cas de difficultés, des « rétrocultures » de foie, rate ou

de nodules peuvent être effectuées mais elles retardent encore le rendu du résultat,

déjà très long par cette méthode.

70
 Les animaux les plus sensibles à la pénicilliose sont les rats et les hamsters

dorés, les souris et les cobayes ont une sensibilité intermédiaire alors que les lapins

sont résistants.

71
 VI.3 DIAGNOSTIC ANATOMOPATHOLOGIQUE

Les examens anatomopathologiques sont réalisés sur des coupes histologiques

réalisées à partir de biopsies fixées dans du formol à 10% Elle sont colorées par la

coloration de Gomori-Grocott ou de PAS (acide périodique de Schiff).

Les aspects observés dépendent de l’état immunitaire de l’hôte puisque les

anatomopathologistes observeront certes l’agent pathogène mais surtout la réaction

histologique qu’il induit. Rappelons qu’en matière de réticulose, l’immunité

principalement cellulaire se traduit essentiellement par la formation de granulome

ayant pour but de circonscrire l’infection pour prévenir sa dissémination (Duong,

1996). Mais ici, les histiocytes grossissent et prolifèrent pour s’adapter au

développement intracellulaire (rupture des vacuoles) du champignon puis se nécrosent

libérant les levures qui provoque l’accumulation des polynucléaires et la formation d’un

abcès central. En 1996, Kudeken (Kudeken et al., 1996) montre en effet que la

réaction cellulaire est capitale contre P. marneffei et en 1997 (sur un modèle animal),

que cette granulomatose cellulaire peut même avoir des effets délétères en cas de

forte inoculation il parle de réaction « hyperinflammatoire » (Kudeken et al., 1997).

En fait, il y a trois types possibles de réactions inflammatoires: Le granulome ou

la suppuration chez l’immunocompétent et la réaction anergique chez l’immunodéprimé.

► La granulomatose qui caractérise l’immunocompétent est observée à la

phase précoce de la pénicilliose surtout dans les organes riches en système réticulo-

histiocytaire (poumon, foie, rate, moelle osseuse, ganglions lymphatiques...). C’est le

résultat de la formation d’un amas d’histiocytes épithélioïdes entouré d’une couronne

lymphocytaire.

► La réaction suppurative ou purulente est moins fréquente, elle

concerne également surtout l’immunocompétent. Il y a formation d’abcès multiples

72
surtout pulmonaires ou cutanés constitués de polynucléaires et de fibrine avec

présence de nombreuses levures de P. marneffei.

► La réaction anergique et nécrotique est le reflet d’une réaction

immune totalement inadaptée avec tout au plus un infiltrat de macrophages distendus

où prolifère P. marneffei. Essentiellement retrouvée dans le poumon, le foie ou la peau,

elle est de mauvais pronostic puisque l’infection est alors rapidement progressive. Cet

aspect est identique à la réaction anergique rencontrée dans l’histoplasmose, la

leishmaniose viscérale et la lèpre lépromateuse (Deng and Connor, 1985).

73
 VI.4 DIAGNOSTIC IMMUNOLOGIQUE

Compte tenu de la confusion possible avec l’histoplasmose et la cryptococcose,

mais également de l’absence possible des manifestations cutanées évocatrices,

l’apport de l’immunologie dans le diagnostic de la pénicilliose est incontestable.

Cependant, à ce jour, aucune méthodologie n’est unanimement admise. Il n’y a en effet

aucune standardisation et les quelques techniques publiées sont des techniques

« maisons » qui utilisent des sources antigéniques diverses. Malgré la multiplication

des publications récentes concernant le diagnostic sérologique et antigénique, aucune

trousse n’est encore disponible sur le marché mondial du Dispositif Médical de

Diagnostic In Vitro (D.M.D.I.V.) pour le dépistage sérologique de la pénicilliose.

Rappelons que le diagnostic immunologique reste surtout présomptif avec

comme avantage majeur sa rapidité permettant d’initialiser la thérapeutique

antifongique dans l’attente du résultat des cultures et ainsi de gagner quelques jours

précieux en matière de prise en charge (Supparatpinyo and Sirisanthana, 1994).

VI.4.1 LES PRELEVEMENTS

Un autre avantage du diagnostic immunologique est le caractère non invasif de

ces prélèvements (simple prise de sang). La recherche d’antigène, peut même

s’effectuer sur simple échantillon urinaire permettant d’envisager le dépistage de

masse, notamment pour déterminer la prévalence.

VI.4.2 METHODES DIAGNOSTIQUES BASEES SUR LA

DETECTION D’ANTICORPS

74
 Le diagnostic sérologique de P. marneffei est basé sur la détection des

anticorps anti-P. marneffei présents de façon précoce, lors du contact profond avec

le champignon. Vanittanakom décrit en effet un cas avec une réponse anticorps nette

plus de deux mois avant que le diagnostic mycologique soit confirmé (Vanittanakom et

al., 1997).

VI.4.2.1 Détection par technique d’immunodiffusion

Après les premiers travaux réalisés sur l’immunodiffusion (Sekhon et al., 1982),

des anticorps précipitants spécifiques ou « précipitines » sont également détectés par

immunodiffusion, dans deux cas importés de pénicilliose (Viviani et al., 1993) (Sekhon

et al., 1994). Plus tard, les travaux de Kaufman mettent en évidence deux profils

d’immunoprécipitation différents selon que l’on utilise des antigènes solubles ou

métaboliques, obtenus par filtration de surnageant de culture de levures ou des

antigènes somatiques, obtenus par broyat des levures (Kaufman et al., 1996).

En terme de spécificité, les anticorps ne sont détectés qu’en utilisant des

antigènes des formes levures de P. marneffei puisque aucune réactivité n’est obtenue

avec les antigènes issus du stade filamenteux. Les sérums de patient atteints de

pénicilliose à P. marneffei, restent négatifs vis-à-vis des antigènes de plusieurs autres

espèces de Penicillium. Il n’y a pas non plus de réactivité croisée avec l’antigène de

Candida. Par contre, les anticorps de patients atteints de pénicilliose reconnaissent

des antigènes du stade levure d’H. capsulatum. Ces réactions croisées peuvent être

éliminées par adsorption sur des histoplasmes avant réalisation du test.

Le manque de sensibilité des techniques d’immunoprécipitation pour la

recherche d’anticorps anti-P. marneffei chez le VIH+, rappelé par Kaufman est

confirmé plus tard. En effet, seulement deux sur dix sept (Kaufman et al., 1996) et

deux sur huit (Imwidthaya et al., 1997) sérums de patients VIH+ atteints de

pénicilliose présentent de telles précipitines.

75
 VI.4.2.2 Détection par technique d’immunofluorescence

Par une technique d’ immunofluorescence indirecte, Yuen met en évidence, chez

huit patients, pour la plupart immunocompétents puisqu’un seul était VIH+, des

anticorps de classe IgG à un titre supérieur au 1/160ème tandis que 78 sérums

« contrôles » et 95 sérums de patients présentant des fièvres d’étiologies diverses ne

dépassent pas le 1/40ème (Yuen et al., 1994).

VI.4.2.3 Détection par techniques immunoenzymatiques

Afin de développer des techniques plus sensibles répondant au contexte

d’immunodépression, presque toujours présent au cours de la pénicilliose, certains

auteurs ont, dans un premier temps, tenté de caractériser plus précisément la réponse

humorale aux antigènes de P. marneffei. Ainsi, l’ immunoempreinte (Western Blot),

après séparation électrophorétique et transfert d’un antigène métabolique de P.

marneffei , a pu mettre en évidence l’existence de protéines de 61, 54 et 50 kDa qui

sont reconnues respectivement chez 86%, 66% et 53% de patients sidéens atteints

de pénicilliose prouvée. Il a été montré que la protéine de 61 kDa possède une

homologie de séquence (80%) avec les catalases fongiques d’A. fumigatus et d’H.

capsulatum tout en étant antigéniquement différente. Elle serait en outre un marqueur

précoce d’infection (Jeavons et al., 1998).

Les auteurs signalent également une bande de 38 kDa qui semble beaucoup plus

spécifique de ce dimorphique puisque aucun antigène de 38 kDa n’est mis en évidence

par ces mêmes sérums dans les antigènes d’Aspergillus sp, de Cryptococcus

neoformans, d’H. capsulatum, de Candida albicans ni de deux autres espèces de

Penicillium (Chongtrakool et al., 1997; Jeavons et al., 1998; Vanittanakom et al., 1997).
Chongtrakool montre par ailleurs que la bande de 38 kDa est présente chez un nombre

significatif de patient VIH+ atteint de pénicilliose confirmée (30 sur 65) mais qu’elle

76
est également retrouvée, chez plus de 10% des patients VIH+ complètement

asymptomatique (46 sur 430) ce qui suggère l’existence de pénicilliose infraclinique.

Toutefois, l’antigène de 38 kDa étant très immunogène, l’absence de réponse humorale

contre celui-ci dans certains cas pourrait s’expliquer par un degré d’immunodépression

plus avancé. A noter qu’il existe également dans le surnageant des cultures d’H.

capsulatum une bande légèrement inférieure à 38 kDa. Celle-ci n’est pas détectée par
les sérums de patients atteints d’Histoplasmose disséminée….D’autres auteurs ont

tenté de caractériser les protéines antigéniques présentent dans l’antigène somatique

de la phase levure : la plupart des constituants de cette phase sont des glycoprotéines

Ces antigènes somatiques affichent en outre des réactions croisées avec les anticorps

dirigés contre Candida sp alors qu’il n’y a pas d’interférence avec les anticorps anti-

Aspergillus.

Les stratégies de diagnostic immunologique se sont ensuite portées sur

l’utilisation d’antigènes purifiés (voire recombinants) dans des systèmes

immunoenzymatiques E.L.I.S.A. associant ainsi respectivement spécificité et

sensibilité. Ainsi, Cao et al isolent une protéine spécifique de P. marneffei

appartenant aux galactomannoprotéines, protéines structurales majeures des

menbranes fongiques. Nommée Mp1p, son clonage en protéine recombinante (Cao et al.,

1998a) permet la mise en évidence d’anticorps de manière spécifique dans 42% (Cao et

al., 1998b) et 80% (Cao et al., 1999) des patients VIH+ avec pénicilliose.

VI.4.3 METHODES DIAGNOSTIQUES BASEES SUR LA

DETECTION D’ANTIGENES CIRCULANTS

La recherche d’antigènes sériques circulants est théoriquement plus prédictive

d’une infection active que la recherche d’anticorps qui ne permet pas de différencier,

du moins sur un prélèvement isolé, une infection ancienne d’une infection en cours.

77
 VI.4.3.1 Détection par des hyperimmunsérums

Les premières techniques rapportées par Kaufman sont basées sur l’utilisation d’

hyperimmunsérum de lapin, produit par immunisation à l’aide d’un antigène métabolique

obtenu à partir d’arthroconidies de P. marneffei. La recherche d’antigène est alors

réalisée par immunodiffusion et par agglutination de particules de latex sensibilisées.

Ces travaux, portant exclusivement sur des pénicillioses associées au VIH, montrent la

supériorité de la détection d’antigènes par rapport à celle d’anticorps en

immunoprécipitation. L’agglutination est la plus sensible (76,5% contre 59% pour

l’immunodiffusion). Elle est en outre plus simple d’utilisation et semi-quantitative.

Quant à la spécificité, elle est, pour les deux techniques, excellente, avec absence

totale de réactions croisées vis-à-vis de six cryptococcoses et douze histoplasmoses

(Kaufman et al., 1996).

VI.4.3.2 Détection par des anticorps monoclonaux

Compte tenu de la grande variabilité inter-lot d’un hyperimmunsérum et afin de

définir le ou les antigènes détectés, certains travaux se sont portés vers les anticorps

monoclonaux. L’utilisation d’un anticorps monoclonal anti-Mp1p dans une technique

E.L.I.S.A permet d’obtenir une sensibilité de 65% sur 26 sérums de pénicilliose (Cao

et al., 1999). Plus récemment, Panichakul et al ont développé un anticorps de nature

IgM utilisé dans un test E.L.I.S.A où la capture antigénique est révélée par des

anticorps polyclonaux biotinylés. Les résultats sont très satisfaisants avec une

sensibilité de 90%, une spécificité de 100% ainsi qu’une valeur prédictive positive de

100% et négative de 97% (Panichakul et al., 2002).

VI.4.3.3 Détection d’antigènes urinaires

Parallèlement à ces travaux visant à poser un diagnostic de pénicilliose à partir

d’un prélèvement de sang, d’autres auteurs ont explorés l’intérêt des urines. Ainsi

78
Wheat et al montrent qu’il est possible de détecter, à l’aide d’un test normalement

utilisé pour la recherche d’antigène polysaccharidique d’Histoplasma, des antigènes

similaires au cours de la pénicilliose (17 sur 18 patients). Plus tard, Desakorn montre

que des antigènes de P. marneffei peuvent être spécifiquement détectés, à des titres

élevés, dans les prélèvements urinaires de 97% des patients atteints de pénicilliose

par E.L.I.S.A. utilisant des IgG polyclonaux de lapin (Desakorn et al., 1999). Puis, à

l’aide de ce même hyperimmunsérum, un Dot Blot et un test d’agglutination au latex

ont été développés et comparés à l’E.L.I.S.A. en zone d’endémie. L’agglutination

présente une fois de plus des performances supérieures avec une sensibilité de 100%

sur 37 patients, une spécificité de 99,3% et une valeur prédictive positive de 96,9%.

Conjugué à une simplicité d’utilisation, la recherche d’antigènes par agglutination au

latex pourrait s’avérer un atout majeur dans le diagnostic d’une pénicilliose surtout

dans les zones d’endémie où la présence d’antigènes urinaires signe le caractère

évolutif de la pathologie (Desakorn et al., 2002).

VI.4.4 COMBINAISON DE LA DETECTION D’ANTIGENES ET

D’ANTICORPS

A l’instar de ce qui existe pour le diagnostic de l’aspergillose, la recherche

d’antigènes et d’anticorps est tout à fait complémentaire. C’est ainsi que Kaufman

obtient une sensibilité de 82,5% (versus 76,5% pour l’antigène seul) en associant les

deux techniques (Kaufman et al., 1996) et que Cao fait passer la sensibilité du

diagnostic de 65% à 88% en y associant la recherche d’anticorps anti-Mp1p,

permettant surtout d’atteindre une valeur prédictive négative de 97% et une positive

de 100% (Cao et al., 1999). Toujours par la recherche couplée d’antigène Mp1p et

d’anticorps anti-Mp1p avec un E.L.I.S.A. « sandwich », Wong et al rappellent la

précocité de la réponse immunologique par rapport au diagnostic mycologique puisque

les anticorps mais surtout les antigènes sont constamment détectables avant la

79
fongémie, dans certains cas, au moins trente jours avant toute culture positive (Wong

et al., 2001).

Dans l’aspergillose invasive, la détection de l’antigène aspergillaire est utilisée

pour suivre la réponse thérapeutique. Cette utilisation reste en cours d’évaluation pour

les antigènes de Penicillium mais Wong a d’ores et déjà démontré qu’une thérapeutique

antifongique adaptée, négative puis maintient négatif, à la fois les antigènes et les

anticorps (Wong et al., 2001). Viviani rapporte également une diminution des

précipitines au cours d’une thérapeutique efficace chez le premier cas italien (Viviani

et al., 1993)

Même si la réponse sérologique a peu de rôle dans les mécanismes

de défense, elle est présente de façon précoce et peut donc être
considérée comme le témoin d’un contact profond avec P.
marneffei. L’association avec une recherche d’antigène, augmente
considérablement les performances et constitue une démarche
diagnostic plus cohérente en zone d’endémie

80
 VI.5 DIAGNOSTIC PAR BIOLOGIE MOLECULAIRE

La biologie moléculaire prend une place de plus en plus importante dans la

recherche concernant le diagnostic de la pénicilliose mais manque encore de

standardisation.

Initialement, le génome de P. marneffei a été détecté à partir d’échantillon de

sang par hybridation moléculaire. Puis le récent séquençage de l’ARN ribosomal 18 S

(Vanittanakom et al., 1998) a permis l’utilisation de nouvelles amorces spécifiques de P.

marneffei utilisées seules dans des PCR simples ou associées à une deuxième paire
cette fois universelle (amorce externe panfongique) dans une Nested PCR

(Vanittanakom et al., 2002). Ces techniques de biologies moléculaires peuvent être

utilisées pour la mise en évidence directe du génome de P. marneffei dans les

prélèvements biologiques. Elles ont également été développées pour identifier

rapidement une culture fongique. L’identification d’une culture mesurant à peine 2 mm

de diamètre prend moins de 12 heures en Nested PCR et moins de 9 heures en PCR

simple, accélérant ainsi le diagnostic mycologique conventionnel (Vanittanakom et al.,

2002).

Actuellement aucune étude n’a validé l’apport de la biologie moléculaire dans le

diagnostic de routine de la pénicilliose à P. marneffei.…

81
VII TRAITEMENT

Le traitement d’une pénicilliose doit être instauré rapidement et ne doit pas

être uniquement antifongique, en effet l’état immunitaire du patient est essentiel pour

l’efficacité, il faut donc assurer parallèlement une restauration immune (traitement

de la cause de l’immunodépression).

Les différentes souches de P. marneffei isolées sont, in vitro, hautement

sensibles aux principaux antifongiques d’usage systémique, à savoir : la 5

fluorocytosine (ANCOTIL®), l’itraconazole (SPORANOX®) et même le kétoconazole

(NIZORAL®) et le miconazole (DAKTARIN®). Par contre la sensibilité à l’amphotéricine

B (FUNGIZONE®, AMBISOME®, ABELSET®) est un peu moins grande et une

résistance est souvent décrite pour le fluconazole (TRIFLUCAN®) (Drouhet and

Dupont, 1995).

En pratique, différents choix sont possibles pour traiter une pénicilliose puisque

l’amphotéricine B (0,3 à 0,6 mg/kg/jour pendant 6 à 8 semaines) et l’itraconazole (400

mg/jour pendant 8 à 12 semaines) ont montré une efficacité clinique identique. Malgré

les résultats, in vitro, moins probants pour l’amphotéricine B, elle reste pourtant

recommandée pour traiter les formes sévères (0,6mg/kg/jour pendant 2 semaines)

relayée secondairement par de l’itraconazole (400mg/jour pendant 10 semaines); Ce

schéma a donné un taux de réponse clinique de 97% dans la série de Sirisanthana

portant sur 74 patients VIH+ ayant une infection disséminée. (Sirisanthana et al.,

1998) L’itraconazole en première intention représente une alternative intéressante

pour les infections modérées ou bénignes (focales) (Nittayananta, 1999) ou en cas de

contre-indication à l’amphotéricine B.

82
 Devant l’existence, chez le VIH+, de rechutes fréquentes à l’arrêt du

traitement antifongique (25% (Sirisanthana, 1997) à 50% des cas (Supparatpinyo et

al., 1993)), une prophylaxie secondaire à vie a montrer son efficacité.

La durée minimale du traitement d’une pénicilliose est donc de deux mois auquel

s’ajoute, chez l’immunodéprimé, un traitement d’entretien (ou « chimioprophylaxie

secondaire ») à vie par voie orale de 200mg/jour d’itraconazole permettant d’éviter

les rechutes (Supparatpinyo et al., 1998)

Les nouveaux antifongiques comme le voriconazole (Kappe, 1999) et même les

échinocandines (capsofungine) possèdent une très bonne activité sur P. marneffei

Cependant les outils actuellement disponibles ne manque pas d’efficacité et les

perspectives thérapeutiques devraient plutôt se tourner vers d’autres stratégie de

prise en charge (plus rapide) ou même prophylactique chez certains patients à haut

risques.

Le traitement doit être précoce, de préférence initié par de

l’amphotéricine B et maintenu pendant au moins deux semaines puis
relayé par l’itraconazole (400mg per os) pendant dix semaines
suivi, chez l’immunodéprimé, d’une chimioprophylaxie secondaire à vie
par itraconazole (200mg per os) afin d’éviter les rechutes

83
Deuxième partie : MATERIELS

ET METHODES

84
VIII LA TECHNIQUE E.L.I.S.A.

VIII.1 PROTOCOLE OPERATOIRE

VIII.1.1 PRESENTATION DE LA TROUSSE E.L.I.S.A.

L’E.L.I.S.A. a été standardisée au laboratoire de Parasitologie et de Mycologie

médicale de la Faculté de Pharmacie de Nantes (Dr Le Pape). Il s’agit d’une méthode en

phase hétérogène. La phase solide est constituée de polystyrène présenté sous forme

de microplaque « immunosorb » Nunc® permettant une lecture photométrique directe.

L’antigène fixé est un antigène métabolique de P. marneffei. Chaque trousse contient

le matériel nécessaire pour réaliser 96 tests immunoenzymatiques. Les réactifs

nécessaires à la sérologie sont fournis dans la trousse : Douze barrettes sécables de

huit puits sensibilisés par de l’antigène métabolique de P. marneffei, un conjugué

polyclonal de lapin anti-IgG humaines marqué à la péroxydase et un substrat TMB (3,

3’, 5, 5’ tétramethylbenzidine). Tous les réactifs de la trousse sont conservés entre 2

et 8°C.

Un témoin négatif, un témoin positif, ainsi qu’un seuil sont testés dans chaque

série. Ce « seuil » ou cut off a été préalablement défini à partir des valeurs de

Densités Optiques (D.O.) obtenues pour les sérums de 30 femmes enceintes suivies

pour leur sérologie toxoplasmique par le laboratoire de parasitologie du CHU de

Nantes. Sa valeur est définie comme la moyenne des D.O. à laquelle sont ajoutées trois

déviations standard (Voller et al ). La préparation des microplaques est détaillée en

annexe 2.

VIII.1.2 PREPARATION DES REACTIFS AVANT USAGE

Tous les réactifs doivent être sortis de la chambre froide une demi-heure avant

utilisation.

85
 ► Barrettes sensibilisées : Ne sortir du sachet que le nombre de barrettes

nécessaire, refermer le sachet aluminium en vérifiant la présence d’un dessiccateur

type silicagel.

► Diluant PBS-Tween : Le diluant concentré est à 10X, le diluer au 10ème avec de

l’eau distillée.

► Solution de lavage PBS : Diluer 50mg de poudre pour 1 litre d’eau distillée.

► Conjugué anti IgG humaines marqué à la péroxydase : préparer la quantité

nécessaire à la manipulation en diluant au 1/1OOème dans du TBS-Tween.

► Témoins négatif, positif et cut off : Diluer 10µl de chaque échantillon dans

190µl de TBS-Tween. Ils sont alors prêts à être déposés dans les puits.

► Solution de substrat et d’arrêt sont prêtes à l’emploi, veiller cependant à ce

que le substrat soit ramené à température ambiante.

VIII.1.3 MODE OPERATOIRE

VIII.1.3.1 Etape I : Incubation des sérums échantillons

Remplir le premier puit de la barrette avec 100µl de diluant échantillon (blanc) et

les trois puits suivants avec 100µl des sérums témoins (négatif et positif) et de cut

off. Les autres puits sont remplis par 100µl des sérums à tester, préalablement dilués

au 201ème (10µl de sérum dans 2ml de diluant). Recouvrir la barrette d’un film

protecteur adhésif et placer dans une étuve à 37°C pendant 1 heure. Vider ensuite les

barrettes par retournement puis effectuer 4 lavages successifs par du tampon de

lavage.

VIII.1.3.2 Etape II : Incubation avec le conjugué

Dans chacun des puits, distribuer 100 µl de conjugué anti-IgG humaine

préalablement dilué, couvrir et incuber 1 heure à 37°C. Les puits sont vidés et lavés

par 4 lavages successifs à l’aide du tampon de lavage.

86
 VIII.1.3.3 Etape III : Incubation avec le substrat

Dans chacun des puits, distribuer 100µl de la solution de substrat chromogène de

TMB, couvrir et incuber 30 minutes à 37°C. Cette solution, initialement incolore,

permet le développement d’une coloration jaune stoppée par ajout de 50µl de solution

d’arrêt (acide sulfurique molaire).

VIII.1.3.4 Etape IV : Mesure de la Densité Optique

L’absorbance obtenue à 450nm (contre 620nm) est directement proportionnelle

à la quantité d’anticorps spécifiques fixés, est mesurée dans l’heure qui suit à l’aide

d’un photomètre après avoir fait le zéro sur le puit « blanc ».

VIII.1.3.5 Etape IV : Expression des résultats-

Interprétation

Pour simplifier l’interprétation et pallier les variations entre chaque essai, les

résultats sont exprimés en index par rapport à la valeur du seuil (« de positivité ») La

valeur index est égale au rapport de la différence de D.O. du sérum à tester moins

celle du blanc sur la différence DO du seuil moins celle du blanc. Un index supérieur

ou égal à 1,2 définit une réaction positive. Une valeur entre 0,8 et 1,2 est en zone dite

grise correspondant à une réaction douteuse qui impose normalement un nouveau

prélèvement (impossible dans notre étude du fait du caractère rétrospectif). Dans ce

cas, nous avons choisi de réévaluer le même prélèvement et de retenir la moyenne des

deux index. Une série ELISA est validée si la D.O. du seuil est comprise entre 0,5 et

0,8.

VIII.2 CONTROLE DE QUALITE

Une étude des performances à été réalisée en terme de répétabilité et

reproductibilité.

87
 VIII.2.1 ETUDE DE REPETABILITE
La répétabilité (reproductibilité intra-essai) peut être définie comme la

« précision dans la série » d’une méthode. Le même opérateur applique la technique

sur le même échantillon, dans le même laboratoire, avec les mêmes appareils et les

mêmes réactifs au cours d’une même série d’analyses. A partir des résultats, on

objective le manque de précision ou « imprécision » par le coefficient de variation

intra-série.

Notre étude de répétabilité du test ELISA, est effectuée à partir d’un sérum

positif en ELISA (index proche de 1) déposé quinze fois dans la même série.

VIII.2.2 ETUDE DE REPRODUCTIBILITE

La reproductibilité (inter-essai) caractérise la « précision entre plusieurs

séries » qui est obtenue à partir d’un aliquot du même échantillon distribué au hasard

dans différentes séries d’analyses par des opérateurs différents.

L’étude a été effectuée sur le même sérum dont l’index en E.L.I.S.A. est proche

de 1. Il est testé dans neuf séries différentes réalisées sur plus d’un mois, par deux

opérateurs différents.

VIII.3 ETUDE DE LA SENSIBILITE

Dans le cadre de cette pathologie émergente, sévissant exclusivement en Asie

du Sud-est, l’obtention de sérum de patient dont le diagnostic est confirmé par la

mycologie est difficile. C’est pourquoi l’étude de la sensibilité a été réalisée

uniquement sur les sérums de quatre cas français de pénicilliose importée diagnostiqué

respectivement à Rouen, Alès, Nantes et Paris.

VIII.4 ETUDE DE LA SPECIFICITE

88
 La spécificité d’un test est l’aptitude à mesurer l’ « analyte » désiré et

seulement celui-ci, même si des substances de structure proche se trouvent en

quantité importante dans le spécimen. Différents niveaux de spécificité doivent être

analysés. Pour ce faire, nous avons choisi deux populations : une population de sérums à

très faible risque d’interférence (« sérums négatifs ») et une population à fort risque

de réactions croisées. Ces derniers, ayant été sélectionnés en fonction de critère de

diagnostic clinique différentiel (sérums de patients cliniquement compatible avec une

pénicilliose) mais également en fonction de pathologies causées par des organismes

taxonomiquement proches.

VIII.4.1 SUR SERUMS NEGATIFS

Ce premier niveau d’étude de la spécificité de la trousse a été évalué de façon

rétrospective, sur 36 sérums issus de patients immunocompétents a priori indemnes

de toutes mycoses profondes (sérologie candidosique et aspergillaire négative) et dont

le risque statistique de contact avec P. marneffei est quasi nul. Ces patients sont

essentiellement des femmes jeunes, enceintes, ayant une sérologie toxoplasmique

négative (6 Hommes et 30 Femmes). Ces sérums sont issus de la sérothèque du

laboratoire de Parasitologie, mycologie médicale et immunologie parasitaire (Pr

Marjolet) du CHU de Nantes.

VIII.4.2 ETUDE DES REACTIONS CROISEES

Dans un premier temps, une recherche de sérums immunologiquement positifs

pour les sérologies aspergillaire et candidosique a été réalisée à partir d’une

exploitation des résultats de laboratoire de 1997 à 2001 inclus. Les premiers critères

de positivité étaient, une hémagglutination supérieure ou égale à 1/320 et/ou 2 arcs

d’immunoélectrophorèse. A partir d’une centaine de dossiers, une deuxième sélection

a été réalisée par confrontation des données cliniques. Les 33 patients retenus ont

89
été classés selon que leur pathologie est « prouvée », « hautement probable » ou

« fortement suspectée ». Selon le même principe, à partir d’antigène cryptococcique

positif, 13 cryptococcoses prouvées ont été sélectionnées.

Les sérums étudiés sont issus du CHU de Nantes ou de ces périphériques, la

Roche/Yon et St Nazaire et sont conservés congelés à -20°C dans les sérothèques du

laboratoire de Mycologie médicale et immunologie parasitaire (Pr Marjolet) mais

également de Virologie, Hygiène et bactériologie (Pr Drugeon). Ils ont tous été

aliquotés et conservés au congélateur à -20°C.

VIII.4.2.1 Candidoses profondes

Nous avons choisi des candidoses prouvées par une culture positive de Candida

sp sur des sites profonds comme des abcès hépatiques, des liquides d’ascite, des
hémocultures... Devant le faible nombre de candidoses prouvées, le recrutement est

élargi à des candidoses « hautement probables » avec colonisation de sites

périphériques multiples ou suspicion immunologique par l’hémagglutination (CHAI) et

l’immunoélectrophorèse (IEC). Les 11 candidoses profondes retenues sont présentées

en annexe 3.

VIII.4.2.2 Cryptococcoses

Tous les sérums retenus possèdent une confirmation mycologique de la présence

de cryptocoques par une culture positive dans au moins un des sites suivants, LCR

et/ou hémoculture pour le groupe des cryptococcoses neuroméningées (n=9) et biopsie

cutanée pour les cryptococcoses cutanées (n=4). Les cryptococcoses cutanées sont

présentées en annexe 4

90
 VIII.4.2.3 Aspergilloses

Cinq sérums d’aspergillose chronique nécrosante ont été retenus parmi des

patients possédant tous au moins trois des cinq critères suivants : Isolement

pulmonaire d’Aspergillus sp, augmentation de la sérologie aspergillaire, majoration

relativement rapide de la symptomatologie ou des opacités radiologiques, caractère

semi-invasif prouvé par l’anatomopathologie.

Sept sérums d’aspergillose invasive, avec au moins deux des quatre critères

suivants : terrain d’immunodépression cellulaire, apparition ou augmentation du titre

d’antigène aspergillaire circulant, présence au scanner d’un aspect de nodules diffus ou

d’une image en croissant gazeux.

Quatre sérums d’aspergillose broncho-pulmonaire allergique dont les critères

de sélection sont : sérologie aspergillaire très positive, présence d’un taux élevé d’IgE

non spécifiques et d’IgE spécifiques.

Six sérums d’aspergillome avec comme critères de sélection : image radiologique

du grelot, truffe aspergillaire, cavité pré-existante pulmonaire, sérologie fortement

positive.

Au total, 22 pathologies aspergillaires seront testées, leurs caractéristiques

sont résumées dans l’annexe 5, 6, 7 et 8.

VIII.4.2.4 Histoplasmoses

Cinq sérums issus de patients atteints d’histoplasmoses prouvées nous ont été

gracieusement confiés par le Pr Dupont, service de mycologie médicale de l’institut

Pasteur de Paris.

VIII.4.2.5 Fusariose

Il nous a semblé intéressant de tester un sérum, obtenu chez une patiente

d’hématologie clinique présentant une fusariose confirmée par une biopsie cutanée et

trois hémocultures positives à Fusarium oxysporum.

91
92
IX HEMAGGLUTINATION ET IMMUNO-

ELECTROPHORESE

Pour rechercher les anticorps anti-Aspergillus et anti-Candida, nous avons fait

appel aux deux techniques utilisées en routine au laboratoire de parasitologie du CHU

de Nantes. L’ hémagglutination comme méthode quantitative pour le dépistage et l’

immunoélectrophorèse comme méthode de confirmation.

IX.1 L’HEMAGGLUTINATION INDIRECTE

Cette méthode, commercialisée par Fumouze® (paris, France) présente

l’avantage de donner une réponse quantitative sous forme de titre d’anticorps : inverse

de la dernière dilution donnant une hémagglutination positive. Son caractère simple et

rapide couplé à une grande sensibilité explique son utilisation en dépistage. On parlera

d’hémagglutination aspergillaire (AHAI) et candidosique (CHAI).

IX.1.1 PRINCIPE
Les hématies de mouton recouvertes d’antigènes métaboliques jouent le rôle de

particules inertes sensibilisées. Elles sédimentent s’il n’y a pas d’anticorps spécifiques

formant un bouton au fond du puit. Elles s’agglutinent entre elles formant un voile

uniforme si les anticorps sont présents.

93
 IX.1.2 MODE OPERATOIRE
Des dilutions du sérum à tester sont mises en contact avec la suspension

d’hématies sensibilisées pendant deux heures. Un témoin positif de titre connu ainsi

qu’un témoin « réactif » (sans sérum) sont testés dans les mêmes conditions pour

apprécier la qualité de l’hémagglutination et s’affranchir des phénomènes d’auto-

agglutinations. Dans chaque série est également testé un témoin « sérum »

(sérum/hématies non sensibilisées) pour vérifier l’absence d’agglutinines naturelles

anti-mouton. Le mode opératoire détaillé est présenté en annexe 9.

IX.1.3 INTERPRETATION
L’hémagglutination est considérée comme positive lorsque le voile s’étend sur

plus de la moitié du diamètre du puit. Un sérum est considéré comme positif pour un

titre supérieur ou égal au 1/320.

IX.2 L’IMMUNOELECTROPHORESE
L’immunoélectrophorèse (IEF) aspergillaire (IEA) ou candidosique (IEC) est la

méthode de référence de détection des anticorps précipitants mais elle est longue et

consommatrice de sérum et d’antigène.

IX.2.1 PRINCIPE
L’IEF s’opère en deux temps, une étape de migration et de séparation

électrophorétique des différents composés protéiques de l’antigène suivie d’une

diffusion perpendiculaire des immunoglobulines sériques pour que leur rencontre

provoque un arc de précipitation. Pour Aspergillus sp, l’activité catalasique (et/ou

chymotrypsique) est ensuite mise en évidence.

94
 IX.2.2 MODE OPERATOIRE
Le système utilisé au laboratoire de

parasitologie est une méthode adaptée

par Beckman sur gel Paragon®, réalisée

en 48h avec dépôt d’antigène métabolique

et somatique directement sur le gel.

Les différents arcs de précipitation sont

mis en évidence par du bleu de Coomassie

et l’activité catalasique est recherchée

(figure 10). Le protocole détaillé est

présenté en annexe 10.

Un contrôle positif est passé en parallèle

(sérum de lapin sensibilisé par des antigènes Figure n°10: Exemple de deux sérums

mixtes d’A. fumigatus ). très positif en immunoélectrophorèse.

IX.2.3 INTERPRETATION
Un sérum est considéré comme positif à partir de trois arcs de précipitation.

Deux arcs peuvent suffire si l’un des arcs possède une activité catalasique (arc J)

considérée comme spécifique d’A. fumigatus.

95
X L’IMMUNOEMPREINTE OU WESTERN BLOT

X.1 PRINCIPE DE LA TECHNIQUE

Le but de l’immunoempreinte (Western Blot) est de fractionner l’antigène en

fonction du poids moléculaire des protéines qui le composent par électrophorèse en

condition dénaturante (gel de polyacrylamide à 10% en présence de SDS), puis de les

transférer (‘’Blotting’’) sur une membrane de nitrocellulose. La membrane est séchée

puis découpée en bandelette. Chaque bandelette est alors mise en contact avec un

sérum et la fixation des anticorps sur un site antigénique sera révélée par un conjugué

marqué et se matérialisera alors par une bande colorée lors de l’ajout du substrat. En

comparant la position de chaque bande obtenue avec celle d’un témoin constitué de

protéines de masses moléculaires connues placé en parallèle dans chaque série de

Western Blot, on déterminera le poids moléculaire de la protéine reconnue. La

description des bandes (nombre et masse moléculaire apparente) caractérise un profil

particulier.

X.2 PREPARATION DE L’ANTIGENE METABOLIQUE

La solution antigènique est obtenue par culture du stade levuriforme à 37°C sur

milieu liquide BHI d’une souche de P. marneffei, entretenue sur milieu gélosé au Malt.

Cette souche (PM NAN01) provient d’une patiente Nantaise VIH+ d’origine

thailandaise (Miegeville et al., 1998). Le milieu de culture contenant les protéines

métaboliques est récupéré par centrifugation (3000g pendant 30min) puis concentré

lors d’une dialyse contre du polyvinylpyrolidone. Afin de conserver l’antigène, une

lyophilisation est finalement réalisée.

96
 Les antigènes de 4, 6 et 11 jours de culture ont été contrôlés, afin de définir

l’antigène à utiliser pour le Western Blot. Ce contrôle a porté sur la concentration

protéique déterminée par la méthode colorimétrique de Bradford (1976) utilisant le

bleu de Coomassie (annexe 11). Elle est exprimée en µg de protéines par milligramme

de lyophilisat. Parallèlement, les profils électrophorétiques après SDS-PAGE à 10% et

coloration au nitrate d’argent (annexe 11 bis) ont été comparés.

X.3 PROTOCOLE OPERATOIRE

X.3.1 ELECTROPHORESE

La première étape consiste en une séparation électrophorétique de la solution

antigénique en système discontinu (pour concentrer les protéines juste avant la

séparation), en SDS et en condition dénaturante (2 mercaptoéthanol) pour que la

séparation se fasse selon le poids moléculaire indépendamment de la charge et de la

forme initiale. Puits

Elle est réalisée sur gel de

polyacrylamide qui se polymérise Gel de concentration

extemporanément par ajout successif, d’un

initiateur : du persulfate d’ ammonium

Gel de séparation
et d’un activateur de polymérisation : du

T.E.M.E.D.

En présence d’un détergent, le SDS, tous les résidus aminés se chargent

négativement et par action de 2 mercaptoéthanol, qui coupe les ponts disulfures, les

structures tridimentionnelles sont perdues. C’est pour ces deux raisons que la

migration en SDS PAGE se fait de façon inversement proportionnelle à la masse

moléculaire des protéines. Elle est d’ailleurs déterminée par comparaison avec un

97
marqueur de taille placé aux deux extrémités du gel. L’ensemble est alors soumis à un

champ électrique continu généré par une différence de potentiel de 100 V pendant 90

min. La référence de poids moléculaires ainsi que la préparation et la composition des

gels sont détaillés dans l’annexe 12.

X.3.2 ELECTROTRANSFERT

La deuxième étape est une méthode de transfert des protéines présentes au

sein du gel à la surface d’un support que l’on pourra conserver et découper: une

membrane de nitrocellulose. Ce « blotting » se fait en milieu liquide comme indiqué en

annexe 13.

X.3.3 PREPARATION DES BANDELETTES

La troisième étape consiste à bloquer les sites non-réactifs avec du tampon PBS

1% BSA. Sécher ensuite la membrane, puis, la découper en bandelettes (5mm X 10cm)

qui sont numérotées et conservées dans un tube. Les deux pistes correspondant aux

marqueurs de poids moléculaires sont conservées et colorées au bleu de méthylène. La

visualisation des différentes bandes permettra de valider l’étape de migration et de

transfert mais surtout de calculer les masses moléculaires apparentes des protéines

reconnues par le sérum.

X.3.4 IMMUNOEMPREINTE

Tous les réactifs sont amenés à température ambiante avant emploi

► Ne sortir que les bandelettes qui seront utilisées, refermer immédiatement

le tube et le replacer à 2-8°C.

► Déposer individuellement les bandelettes dans les rigoles d’un plateau

d’incubation.

98
 X.3.4.1 Etape I : Lavage des bandelettes réactives

Laver les bandelettes pendant environ 5 minutes avec 2 ml de solution tampon

de lavage (annexe 14) sur une plate-forme à bascule ou sur un agitateur horizontal, le

tampon devant se déplacer librement sur toute la longueur de chaque bandelette.

Aspirer le tampon de lavage hors de chaque puits.

X.3.4.2 Etape II : Incubation des sérums échantillons

Distribuer l’échantillon dilué au 101ème (20 µl de sérum à tester dans 2 ml de

tampon échantillon = tampon de saturation). Incuber une heure à température

ambiante (toujours sur la plate forme à bascule) avant d’aspirer la solution. Laver à

trois reprises pendant trois minutes chaque bandelette avec la solution de lavage.

X.3.4.3 Etape III : Incubation avec le conjugué

Immédiatement après avoir aspiré la dernière solution de lavage, ajouter 2ml de

conjugué IgG anti-humaine marqué à la peroxydase et incuber pendant 30 mn. Aspirer

la solution et laver trois fois avec la solution de lavage puis laver trois fois trois

minutes en eau déionisée

X.3.4.4 Etape IV : Incubation avec le substrat et

révélation

Ajouter 2 ml de substrat (diaminobenzidine-méthanol) sur chaque bandelette et

incuber jusqu’à ce que les bandelettes soient clairement révélées sans qu’il y ait de

coloration significative sur le contrôle négatif (bruit de fond). La révélation qui dure

environ 8 à 10 minutes est arrêtée en aspirant la solution de substrat et en rinçant les

bandelettes au moins trois fois avec de l’eau déionisée.

99
 X.3.4.5 Etape V : Calcul des masses moléculaires

apparentes

La masse moléculaire apparente des bandes révélées est calculée grâce à la

droite obtenue avec le contrôle de poids moléculaire sur papier logarithmique en

plaçant en abscisse la valeur de Rf ou mobilité relative et en ordonné la masse

moléculaire apparente. La valeur de Rf n’est autre que la distance de migration de la

protéine divisé par la distance du front de migration.

100
XI APPLICATION DES OUTILS DIAGNOSTIQUES

A UNE ETUDE SEROEPIDEMIOLOGIQUE À HANOI

Des kits ELISA ont été confiés à l’Institut National d’Hygiène et

d’Epidémiologie de Hanoï (INHE) du Professeur Phung Dac Cam, chef de la section

entéropathologies. L’étude séro-épidémiologique prospective est réalisée dans une

population de patient VIH+ (issus de provinces du Nord du Vietnam) admis dans les

hopitaux de Bach Maï et de St Paul de Hanoï. Les critères d’inclusion sont les

suivants : patients VIH+ présentant une symptomatologie compatible avec une

pénicilliose à savoir une fièvre et/ou des lésions cutanées et/ou une perte de poids

significative.

101
Troisième partie : RESULTATS
ET DISCUSSION

102
I RESULTATS DES CULTURES

La littérature présente l’aspect de P. marneffei généralement sur milieu de

Sabouraud et plus exceptionnellement sur BHI (Brain Heart Infusion). Il nous a donc

semblé intéressant de comparer l’aspect obtenu sur ce milieu de référence à celui

obtenu sur trois autres milieux utilisés en mycologie médicale : le milieu de Malt

(milieu considéré comme riche tout comme le Sabouraud) et deux milieux dits

‘’pauvres’’ qui favorisent la fructification, le milieu PC (Pomme de terre, Carotte) et le

milieu PDA (Potatoes Dextrose Aguar). La composition des milieux est présentée en

annexe 15. Les milieux ont été ensemencés à partir d’une culture de P. marneffei

entretenue, à température ambiante, sur gélose au Malt. Aux deux températures

classiquement décrites dans la littérature 22°C et 37°C, nous avons ajouté une

température d’incubation intermédiaire de 30°C.

I.1 CULTURE A 22°C

Sur milieu de Sabouraud, nous avons observé, comme décrit dans la littérature

(Drouhet and Dupont, 1995) le développement relativement rapide (2cm en 7 jours)

d’un duvet d’abord jaune intense évoluant successivement du vert pâle, au brun

devenant rose en vieillissant, avec apparition d’une couronne brune de gouttelettes

d’exsudat après quinze jours d’incubation (figure 11-5). Un pigment rouge est présent

dès 48h à la périphérie de la colonie, puis il diffuse s’étendant à l’ensemble de la boîte

de pétri en 20 jours (figure 11-1).

Les aspects macroscopiques obtenus sur les autres milieux sont résumés dans le

tableau II. Les caractéristiques intéressantes sont mises en valeur (cases grisées).

Tableau II : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 22°C.

103
 Malt PC PDA
Délai
48h 48h 48h
d’apparition
Développe- Lent Lent Rapide
ment (1cm au 7ème jour) (1,5cm au 7ème jour) (2,5cm au 7ème jour)
Aspect et
Duvet Duvet Duvet
coloration du
jaune intense jaune/vert jaune puis vert pâle
recto
Pigment
Pigment rouge intense diffusible recouvrant la boite en 20 jours
rouge
Duvet surélevé avec
Particula- Duvet blanc au Cercle concentrique
gouttelettes
rités centre de la colonie de croissance
d’exsudat
Figure 11 Image 2 Image 3 Image 4

Le développement est aussi rapide sur milieu PDA que sur Sabouraud. C’est

également le seul milieu permettant l’expression des gouttelettes d’exsudat (figure 11-

6). Les deux autres milieux n’autorisent qu’un développement lent. A noter que tous les

milieux permettent l’expression du pigment rouge caractéristique et que les colonies

duveteuses évoquent un développement sous forme de filaments mycéliens.

I.2 CULTURE A 30°C

Sur milieu Sabouraud, nous observons le développement plus rapide (2,5 cm en 7

jours) d’une colonie poudreuse non colorée au recto, légèrement surélevée, avec

présence de plis radiés. A noter que le pigment rouge, intense et diffusible est encore

présent. L’aspect sur les autres milieux est présenté dans le tableau III.

104
Figure n°11 : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 22°C, culture
de 18 jours sur Sabouraud (1), culture de 13 jours sur Malt (2), culture de 29 jours
sur PC (3) culture de 18 jours sur PDA (4). Détail des gouttelettes d’exsudat, 29ème
jours sur Sabouraud (5), 9ème jour sur PDA (6)

Tableau III : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 30°C.

105
 Malt PC PDA
Délai
48h 48h 48h
d’apparition
Développe- Rapide Rapide Rapide
ment (2,5cm au 7ème jour) (2,5cm au 7ème jour) (3cm au 7ème jour)
Aspect et
Poudreux Duvet jaune-orange Duvet rapidement
coloration du
jaune-orange/vert qui devient rose jaune-vert puis brun
recto
Pigment Pigment rouge très Pigment rouge
Pas de pigment rouge
rouge faible diffusible
Centre surélevé
Particula-
Pleiomorphisme avec circonvolution
rités
cérébriforme
Figure 12 Image 2 Image 3 Image 4
.

L’incubation à 30°C s’est avérée intéressante car elle permet d’obtenir une

croissance plus rapide qu’à 22°C. Ici encore, le milieu PDA montre sa supériorité

puisque c’est le seul qui permet un développement macroscopique évocateur d’un

Penicillium (plis radiés, duvet surélevé) et, où le pigment diffusible est intense.
L’aspect est même plus proche (figure 12-6) de celui qui fait référence (celui à 22°C

sur Sabouraud) que celui obtenu sur Sabouraud à 30°C où le recto de la colonie n’est

pas colorée (figure 12-5). On remarque, qu’à cette température, l’aspect

macroscopique est encore compatible avec un développement mycélien.

106
Figure n°12 : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 30°C, culture
de 9 jours sur Sabouraud (1), culture de 19 jours sur Malt (2), culture de 18 jours sur
PC (3), culture de 9 jours sur PDA (4), détail du recto au 9ème jour sur Sabouraud (5),
au 9ème jour sur PDA (6).

107
 I.3 CULTURE A 37°C
Sur Sabouraud, il existe un développement lent (4 jours) d’une colonie blanc

beige, lisse et crémeuse (proche de l’aspect d’une colonie de Candida) avec apparition

d’excroissances centrales surélevées. La colonie est totalement dépourvue de

pigment rouge (figure 13, image 1). L’aspect sur les autres milieux est présenté dans le

tableau IV.

Tableau IV : Aspect macroscopique à 37°C de Penicillium marneffei

Malt PC PDA
Délai
4ème jour 4ème jour 3ème jour
d’apparition
Développe- Lent Lent Lent
ment (1cm au 7ème jour) (1cm au 7ème jour) (1,5cm au 7ème jour)
Aspect et Colonie sèche Colonie sèche, Colonie grise d’emblée
coloration du très rasante, Poudreuse, non surélevée, périphérie
recto beige puis violet pigmentée rouge/violet
Pigment
Pas de pigment rouge diffusible Pigment rouge faible
rouge
Au 6ème jour, la Circonvolution
Particula- La colonie reste
colonie devient cérébriforme +
rités toujours beige
violet/brun plis radiés
Figure 13 Image 2 Image 3 Image 4

C’est à cette température que les plus grandes différences sont observées mais

dans tous les cas, le développement est lent. Il n’y a que sur Sabouraud que la colonie

prend un aspect lisse muqueux fortement évocateur d’un développement levuriforme.

Sur milieu PC et Malt, les colonies sont sèches et peu surélevées. Par contre, sur milieu

PDA, la colonie garde un aspect duveteux surélevé avec plis radiés et une périphérie

qui se colore en rouge, tout à fait évocateur d’un Penicillium ‘’filamenteux’’ (figure13,

image 4a et 4b). Par ailleurs, c’est le seul milieu sur lequel la pigmentation rouge

108
diffusible est présente (pigmentation rouge relativement faible, surtout visible en

début de croissance).

Figure n°13 : Aspect macroscopique de Penicillium marneffei à 37°C, culture

de 11 jours sur Sabouraud (1), culture de 29 jours sur Malt (2), culture de 18 jours sur PC (3),
culture de 5 jours (4a) et de 7 jours sur PDA (4b).

En conclusion, tous les milieux ensemencés permettent le développement de P.

marneffei, confirmant les données de la littérature sur les faibles exigences de ce

champignon. Bien que ralenti à 37°C, le développement macroscopique des colonies

reste globalement rapide pour un champignon filamenteux puisque en quatre jours,

tous les milieux présentent une colonie d’au moins trois millimètres de diamètre.

109
 L’expression macroscopique du dimorphisme thermique, bien que constatée sur

tous les milieux, est remarquable sur Sabouraud. L’augmentation de température

provoque la perte de la capacité d’excrétion du pigment caractéristique et la perte

de l’aspect duveteux ou poudreux de la culture au profit d’un développement d’aspect

lisse, crémeux ou sec. Le milieu PDA fait exception : il garde non seulement un aspect

surélevé avec circonvolution cérébriforme mais également la capacité de production

du pigment caractéristique.

Le milieu PDA peut s’avérer très intéressant pour le diagnostic mycologique

de P. marneffei. Il fait jeu égal avec le milieu de référence pour les caractéristiques

macroscopiques classiques des Penicillium (circonvolution cérébriforme, plis radiés,

gouttelettes d’exsudat) mais il est plus contributif à 37°C. En effet, en dehors de

l’aspect typique de Penicillium, il existe une coloration rouge de la périphérie mais c’est

surtout le seul qui permette la diffusion (en début de croissance) du fameux pigment

rouge (figure 13-4). Cette observation souligne la grande influence (outre de la

température), de la composition du milieu de culture sur le métabolisme du P.

marneffei.

Parmi les nombreuses espèces de Penicillium contaminants, il y en a deux qui

constituent encore plus que les autres un diagnostic différentiel car elles synthétisent

également un pigment rouge intense et diffusible : il s’agit de P. purpurogenum et P.

rubrum qui, selon certains auteurs, appartiennent à la même espèce avec des conidies
rugueuses, ornementées pour purpurogenum et lisses pour rubrum. Appartenant tous

deux au groupe des biverticillés, le diagnostic différentiel est surtout macroscopique.

En effet même s’ils ont parfois la capacité de pousser à 37°C (Breton et al., 1998b), ils

ne sont alors jamais thermiquement dimorphiques et restent filamenteux sur la

culture à 37°C.

110
 Par ailleurs, les caractéristiques macroscopiques ne doivent pas faire oublier

que d’autres espèces de champignons dimorphiques peuvent produirent à 25°C un

pigment diffusible de couleur similaire à celui de P. marneffei. En effet, certaines

souches de Paecilomyces lilacinus et Paecilomyces viridis, qui ressemblent

morphologiquement à P. marneffei sont également responsables d’infections chez le

patient immunodéprimé (Drouhet, 1993). Toutefois, à 37°C, le stade levuriforme est

une blastoconidie (Cooper and McGinnis, 1997).

Ainsi, dans le cadre d’une mycose profonde, où le prélèvement peut n’être incubé

qu’à 37°C, le milieu PDA associé au Sabouraud permet un diagnostic aisé de ce

Penicillium dimorphique puisque levuriforme sur Sabouraud et filamenteux rouge sur

PDA.

En parallèle au diagnostic mycologique, le diagnostic sérologique de cette

penicilliose doit être développé, c’est le sujet de la seconde partie de notre travail.

111
II EVALUATION DE L’ E.L.I.S.A.

La souche de P. marneffei utilisée comme source d’antigène, entretenue sur

gélose au Malt, a été isolée d’une patiente nantaise HIV+ d’origine thaïlandaise. Le

stade levuriforme est obtenu par culture dans du milieu BHI à 37°C. L’antigène

métabolique est récupéré par filtration de cette culture, dialyse puis concentration.

II.1 ETUDE DES PERFORMANCES

II.1.1 ETUDE DE REPETABILITE

Une étude de répétabilité du test est effectuée à partir d’un sérum, dont

l’index en ELISA est proche de 1. Il est déposé quinze fois dans la même série. Les

résultats de cette série figurent dans le tableau V.

Tableau V : Valeurs index de l’étude de répétabilité.

Valeur Valeur
N° N°
Index Index
1 1,18 9 1,04
2 1,14 10 1,23
3 1,19 11 1,18
4 1,11 12 1,14
5 1,13 13 1,14
6 1,10 14 1,16
7 1,20 15 1,14
8 1,20

La moyenne obtenue est de 1,15 avec un écart-type de 0,046. Ces deux valeurs

permettent de calculer le Coefficient de Variation (CV) intrasérie.

112
Avec un CV de 4,0%, la répétabilité du test est très satisfaisante. Elle montre

l’homogénéité des différents puits en terme d’adsorption et de présentation de

l’antigène.

1,4
1,2
Valeur index

1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Figure n°14 : Représentation graphique de l’étude de répétabilité

II.1.2 ETUDE DE REPRODUCTIBILITE

L’étude de reproductibilité est effectuée à partir du même sérum, testé dans

neuf séries d’analyses différentes, par deux opérateurs différents sur une période

d’environ 1 mois (tableau VI).

Tableau VI : Valeurs index de l’étude de reproductibilité.

Série
Valeur Index Série N° Valeur Index
N°
1 1,15 6 0,75
2 1,14 7 0,69
3 1,18 8 0,96
4 0,71 9 0,94
5 0,99

113
 Une représentation graphique des valeurs obtenues est présentée dans la figure

24. La moyenne est de 0,945, la variance de 0,0329 ce qui fait un écart-type de 0,1812

soit un CV inter-série de 19,0%. La reproductibilité entre plusieurs séries est bien

moins satisfaisante mais reste cependant acceptable.

1,4
1,2
1
Valeur Index

0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10

Figure n°15 : Représentation graphique de l’étude de reproductibilité.

II.2 ETUDE DE LA SENSIBILITE

L’étude de la sensibilité de l’ELISA vise principalement à valider l’outil dans un

but épidémiologique. La pénicilliose étant un évènement rare en maladie d’importation,

l’étude est limitée à quatre cas importés en France (tableau VII). Ces cas sont tous

confirmés par l’isolement de P. marneffei dans un ou plusieurs prélèvements profonds

chez des patients VIH+ susceptibles de présenter une faible réponse humorale.

La sérologie est positive pour les quatre patients avec des index très élevés

pour les patients Pit., Lav. et Ber. La moyenne des index est de 2 ±0,35

114
Tableau VII : Caractéristiques des pénicillioses prouvées et valeurs index des
sérums correspondants.
Date de ELISA
Patient Réf Pays Isolement
prélèvement index
LBA puis
(Lachaud et al.,
Rai. Thaïlande hémoculture et 25/09/1997 1,46
1998)
BOM
(Miegeville et LBA et
Lav. Thaïlande 04/1997 2,14
al., 1998) Hémoculture
BOM, Ganglion,
(Valeyrie et al.,
Ber. Thaïlande biopsie hépatique 24/09/1997 2,42
1999)
et hémoculture
(Grise et al.,
Pit. NC LBA 25/09/1996 1,95
1997)

Pour la patiente Rai., le diagnostic mycologique est posé en Septembre 1997 au

retour d’un séjour en Thaïlande. A cette date, seul le LBA est positif à l’examen direct
3
et en culture, le taux de CD4 est à 110 éléments/mm . Alors qu’elle refuse tout

traitement antifongique, la patiente est revue en consultation en Mai 1998 : les

expectorations, le sang et la moelle osseuse sont alors positifs.

Mme Lav., d’origine Thaïlandaise, est hospitalisée en avril 1997 dans un

contexte d’altération de l’état général (AEG), fébrile avec toux et expectorations

blanchâtres. Une séropositivité pour le VIH est découverte avec un taux de 8

CD4/mm3 Cette pneumopathie à P. marneffei sans manifestation cutanée est

diagnostiquée sur un LBA et 48h après sur une hémoculture.

Le patient Ber., séropositif, vit en zone rurale dans la région de Chang Maï où il

travaille de façon artisanale le bambou. Il est hospitalisé en août 1997 pour des signes

non spécifiques (fièvre à 39°C et AEG avec perte de poids depuis un mois) sans

manifestation cutanée, adénopathie périphérique ni symptomatologie pulmonaire. Il

possède alors 40 CD4/mm3. P. marneffei est isolé de la biopsie ostéo-médullaire, d’un

115
ganglion mésentérique et du sang. Il est traité efficacement par amphotéricine B

auquelle est ajoutée de l’itraconazole et une trithérapie antivirale.

Mr Pit., séropositif pour le VIH, est hospitalisé en juin 1996 pour une diarrhée

fébrile (38,5°C), des lombalgies et des myalgies au retour d’un séjour en Afrique

tropicale. Sa radiologie pulmonaire montre un syndrome interstitiel prédominant aux

bases. Un LBA permet d’isoler de nombreuses colonies de P. marneffei. Ce patient, peu

coopératif, ne recevra qu’un traitement antirétroviral. Son taux de CD4 est à 193

CD4/mm3.

A noter qu’aucune des quatre pénicillioses ne présente de symptomatologie

cutanée, deux d’entre elles (Pit, Rim) sont des formes relativement peu disséminées

avec des taux de CD4/mm3 supérieurs à ceux décrits dans la littérature. Même si le

nombre de sérums étudiés est faible, il est à noter que la sérologie est fortement

positive dans tous les cas (y compris pour le patient à 8 CD4/mm3), ce qui confirme la

haute sensibilité des systèmes ELISA malgré le contexte d’immunodépression

accompagnant l’infection VIH. Notons que la réponse humorale est d’ailleurs conservée

en début d’infection VIH qui s’accompagne même volontiers d’une

hypergammagloblinémie polyclonale. Ce n’est qu’en cas d’infection terminale qu’elle est

profondément déficiente pouvant alors expliquer des résultats sérologiques

faussement négatifs (Chongtrakool et al., 1997)

La sensibilité de l’ELISA utilisée dans ce travail, est supérieure à celle de

l’immunoprécipitation puisque les précipitines sont absentes chez 15 des 17 patients

VIH+ atteints de pénicilliose rapportés par Kaufman (Kaufman et al., 1996) et chez 6

des 8 patients étudiés par Inwidthaya (Imwidthaya et al., 1997). Quant à

l’immunofluorescence indirecte, parmi les 4 patients VIH+ de la série de Singh, un seul

possède une sérologie positive (Singh et al., 1999). En parallèle à l’utilisation d’antigène

brut ou semi purifié, le choix de certains auteurs s’est porté sur l’utilisation

116
d’antigènes recombinants. Si cette approche apporte plus de spécificité, elle est

parfois pénalisée en terme de sensibilité lorsque les réponses humorales des patients

sont très « polymorphes », ce qui est le cas de la pénicilliose (Vanittanakom et al.,

1997). Les résultats concernant l’utilisation en ELISA de la mannoprotéine Mp1p

illustrent ce propos puisque 14 des 18 patients VIH+ soit 80% (Cao et al., 1998b) puis

seulement 42% (Cao et al., 1999) des patients atteints de pénicilliose à P. marneffei

ont des anticorps dirigés contre cette protéine recombinante. Toutefois, l’influence du

degré d’immunodépression de la population étudiée sur les résultats ne doit pas être

négligée.

II.3 ETUDE DE LA SPECIFICITE

II.3.1 SUR SERUMS NEGATIFS

Ce premier niveau d’étude de la spécificité est réalisé sur 36 sérums issus de

patient VIH-, immunocompétents, a priori indemnes de toute pathologie fongique

profonde. Les résultats sont répertoriés dans le tableau VII.

Tous les sérums testés ont des valeurs index nettement inférieurs au seuil de

positivité (figure 25). La moyenne des index est de 0,16 ±0,083. Pour les deux

valeurs les plus élevées, l’absence de voyage en zone d’endémie a pu être vérifiée et

les sérologies aspergillaires et candidosiques se sont avérées négatives (<80). Le calcul

de la spécificité de l’ELISA est de 100% pour ces 36 sérums

Tableau VIII : Valeurs index des sérums négatifs.

Sérum Index

117
 Sérum Index
1 0,09 19 0,23
2 0,09 20 0,15
3 0,08 21 0,12
4 0,08 22 0,13
5 0,00 23 0,17
6 0,16 24 0,18
7 0,37 25 0,14
8 0,23 26 0,17
9 0,18 27 0,15
10 0,27 28 0,45
11 0,26 29 0,13
12 0,00 30 0,00
13 0,14 31 0,18
14 0,15 32 0,14
15 0,22 33 0,15
16 0,19 34 0,21
17 0,00 35 0,18
18 0,20 36 0,18

1,2
1
Valeur Index

0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

Figure n°16 : Représentation graphique des index des 36 sérums négatifs.

L’étude de spécificité pourrait être élargie, dans le futur, à des sérums tout-

venant de patients vivant en zone d’endémie et donc supposés être en contact avec le

champignon. Dans ce cas et à l’instar d’autres agents pathogènes, l’existence d’un taux

118
résiduel d’anticorps dirigés contre P. marneffei n’est pas à exclure. Vanittanakom a

d’ailleurs mis en évidence des sérologies positives chez des patients totalement

asymptomatiques(Vanittanakom et al., 1997) C’est sur cette notion que le seuil de

l’ELISA avait antérieurement été fixé à trois déviations standard au dessus de la

moyenne afin de pallier cette éventualité.

II.3.2 ETUDE DES REACTIONS CROISEES

Cette étude a essentiellement pour but de déterminer les performances de la

trousse vis-à-vis de sérums sélectionnés, provenant de sujets atteints d’infections

fongiques autres que la pénicilliose et donc susceptibles de provoquer des réactions

croisées. En effet, les champignons filamenteux (Aspergillus, Fusarium) proches

taxonomiquement mais également les levures ou les stades levuriformes (Candida,

Cryptococcus, Histoplasma), dans le cadre de ce dimorphique pourraient partager des

antigènes communs comme décrit antérieurement dans les rappels bibliographiques

(Chongtrakool et al., 1997). Par ailleurs, certaines de ces mycoses constituent un

diagnostic clinique différentiel de la pénicilliose.

II.3.2.1 Etude des réactions croisées avec Candida sp

La sélection des sérums de patients atteints de candidoses a permis de retenir

11 candidoses profondes. Trois d’entre elles sont prouvées (C1, C2 et C3), six sont

classées, par ordre de présomption décroissant, comme hautement probables (C4, C5,

C6, C7, C8, C9) et deux fortement suspectées (C10 et C11). Les résultats obtenus sont

répertoriés dans le tableau VIII. Un descriptif nosologique succinct de chaque patient

est présenté en annexe 3.

Tableau IX : Résultats sérologiques de 11 sérums ‘’candidoses profondes’’.

119
 Valeur Index CHAI CIE AHAI et IEA
Réf
ELISA P. m Titre Nbre d’arc Titre
C1 0,34 640 2 <80

C2 1,18 puis 0,82 1280 3 80, et 1 arc

C3 0,31 320 3 <80

C4 0,25 640 2 160

C5 0,45 160 2 <80

C6 0,09 320 2 <80

C7 0,74 320 3 160 et 0 arc

C8 1,07 puis 0,76 640 6 <80

C9 0,64 640 1 <80

C 10 0,35 320 3 80

C 11 0,73 640 3 <80

La moyenne des Index est de 0,52 ±0,29. Aucun sérum n’est positif, toutefois,

deux sérums (C2 et C8) possèdent un index dans la zone grise. Testés une deuxième

fois, le sérum C8 est conclu négatif tandis que C2 reste une sérologie douteuse. Il est

à noter que ces deux sérums présentent le taux d’anticorps anti-candida le plus élevé,

respectivement en CHAI (C2) et en nombre d’arcs de précipitation (C8). L’existence

de taux d’anticorps significatifs pour quelques sérums confirme certaines études de la

littérature (Chongtrakool et al., 1997)

120
 II.3.2.2 Etude des réactions croisées avec Cryptococcus

neoformans

Dans un premier temps huit sérums de patients atteints de cryptococcoses

neuroméningées (CR) et un de cryptococcose pulmonaire (CRP) ont été retenus. Six

d’entre eux sont VIH+, deux sont VIH- et une seule sérologie VIH n’est pas

documentée.

Nous avons également retenus quatre sérums de patients atteints de

cryptococcoses cutanées. Aucun de ces patients n’étaient atteints par le VIH (tableau

X) mais deux d’entre eux avaient d’autres facteurs d’immunodépression et

présentaient des cryptococcoses cutanées disséminées (CRC1 et CRC2), les opposant

aux deux autres patients considérés comme immunocompétents (CRC3 et CRC4) pour

lesquels l’atteinte cutanée était secondaire à une inoculation (cage de pigeon et

morceau de bois). Les principales caractéristiques sont rapportées dans les tableaux

IX et X. Un descriptif plus complet se trouve en annexe 4.

Globalement les valeurs d’index obtenues avec toutes les cryptococcoses sont

faibles avec une moyenne de 0,32 ±0,25. Ces résultats sont en partie expliqués par le

fait que les infections cryptococciques sont connues pour provoquer de faibles

réponses humorales dues, principalement au masquage antigénique par la capsule.

Aucune réaction croisée n’est observée, cependant un sérum de cryptococcose cutanée

(CRC 2) possède un index en zone grise. Il est à noter que ce patient ne présente pas

d’antigènémie malgré une infection disséminée (culture positive de l’urine, du LBA, des

biopsies cutanées). Pour ce patient, l’absence de voyage en Asie du Sud-est n’a pas pu

être vérifiée.

Tableau X : Caractéristiques des cryptococcoses neuroméningées et pulmonaire

121
 Séroty
Réf N° Sérum Arguments biologique et/ou cliniques
pe/VIH
LCR, hémocultures, et LBA donnent une culture très
CR 1 20117886 A/+ positive, l’antigénémie est aussi très positive. Le patient
décèdera d’une septicémie à P. aeruginosa
VIH – mais lymphome en aplasie et lymphopénie à 400
CR 2 17113064 A/- CD4/mm3. Les cultures de l’urine et du LCR restent
négative mais, hémoculture et antigénémie positives
Cultures de LCR et urines positives
CR 3 17111995 D/NC
Antigènemie positive
74 CD4/mm3, Culture positive du LCR,
CR 4 17079987 A/+
Antigénémie positive dans le LCR et dans le sérum
Fièvre, céphalée, culture positive dans le sang et urine,
CR 5 17079414 A/+
antigène urinaire très positif+++. 18 CD4/mm3
Culture et antigène positifs dans LCR, sang et urine.
CR 6 17079184 A/+
Inaugure l’infection VIH, 7 CD4/mm3
Culture du LCR et antigènémie
CR 7 17035624 NC/+
Positives
Culture positive dans du LCR, hémocultureet LBA
CR 8 17047651 A/+
positives. Antigène positif dans le sang et dans le LBA.
VIH – mais cancer (mélanome avec métastases
CRP 09950806 NC/- pulmonaires et hépatiques). Culture positive dans le LBA
mais antigènémie négative #cryptococcose pulmonaire

Tableau XI : Caractéristiques des quatre cryptococcoses cutanées retenues

Réf VIH/Statut Arguments cliniques et/ou

N° Sérum
Sérum immunitaire/sérotype biologiques
Corticothérapie depuis 15 ans,
VIH- / Immuno- infection pulmonaire à M.A.C.
CRC 1 17097369
déprimé / D Antigène Cryptococcique + à
160
Lésion temporale et pulmonaire
VIH- / Immuno-
CRC 2 07075830 révélant une lymphopénie
déprimé / NC
idiopatique à 55 CD4
Phlegmon auriculaire (main
VIH- / Immuno-
CRC 3 17114444 droite) après nettoyage d’une
compétent / NC
cage de pigeon
VIH- / Immuno- Cellulite de l’index, antigène
CRC 4 09764220
compétent/ A Cryptococcique positif à 8

122
 A noter que les index les plus élevés (CRC 4, CRC 2 et CRP) sont obtenus chez

les patients ayant les trois antigénémies les plus basses. En effet, lorsque la réponse

existe, les anticorps formés sont complexés par les antigènes circulants, ce qui

pourrait expliquer qu’en cas d’antigénémie négative ou faible, le niveau d’anticorps

détectable soit plus élevé. Il faut remarquer que la moyenne des index des

crytococcoses cutanées est plus élevée que celle obtenue avec les cryptococcoses

neuroméningée et pulmonaire (0,56 ±0,38 contre 0,216 ±0,10)

Tableau XII : Résultats sérologiques des 13 sérums de cryptococcoses.

Valeur Index Antigènes CHAI AHAI
Réf
ELISA P. m cryptococciques (et IEC) (et IEA)
CR 1 0,35 1280 <80 <80

CR 2 0,24 64 <80 <80

CR 3 0,14 80 <80 <80

CR 4 0,19 16 <80 <80

CR 5 0,13 2560 <80 <80

CR 6 0,07 640 <80 <80

CR 7 0,21 160 <80 80

CR 8 0,22 1280 80 <80

CRP 0,40 0 80 80

CRC 1 0,15 160 <80 <80

CRC 2 1,04 puis 0,90 0 80 (0 arc) 80 (0 arc)

CRC 3 0,38 16 <80 <80

CRC 4 0,74 8 <80 <80

123
 II.3.2.3 Etude des réactions croisées avec Histoplasma

capsulatum

Elle porte sur cinq sérums de patients atteints d’histoplasmose, issus de la

sérothèque de l’institut Pasteur (Pr Dupont).

Tableau XIII : Résultats sérologiques des cinq ‘’sérums d’histoplasmoses’’

Valeur Index AHAI CHAI

Réf
ELISA P. m Titre Titre
H 1 0,25 <80 <80

H 2 0,36 <80 80

H 3 0,85 puis 0,60 80 80

H 4 0,18 <80 <80

H 5 0,42 <80 160

La moyenne des index est de 0,387 ± 0,19. Ces résultats sont importants, car

aucun des cinq sérums issus de patients atteints d’histoplasmose prouvée, diagnostic

différentiel clé de la pénicilliose, ne présente de réactions croisées. Pourtant des

communautés antigéniques ont été mises en évidence entre P. marneffei et

Histoplasma. Elles portent sur les composés de nature protéique comme l’ont montré
les travaux en immunoprécipitation mais également sur un antigène polysaccharidique

puisque le test au latex utilisé pour la recherche des exoantigènes urinaires

d’Histoplasma capsulatum a permis de détecter un antigène commun dans 17 des 18 cas

de pénicilliose (Wheat et al., 1997) … Malgré ces considérations, aucune étude

n’explore les éventuelles réactions croisées vis-à-vis de Penicillium marneffei en

utilisant des sérums de patients atteints d’histoplasmose.

124
 Après avoir testé les réactions croisées dans un contexte d’agents fongiques

levuriformes, nous avons étudié la spécificité de l’ELISA vis-à-vis de pathologies

causées par des champignons filamenteux taxonomiquement plus proches et ce,

d’autant que des antigènes communs ont été décrits.

II.3.2.4 Etude des réactions croisées avec Aspergillus sp

Nous avons testé sept sérums de patients atteints d’aspergilloses invasives,

Trois sont prouvées : API 1, API 2, API 3 et quatre hautement probables API 4, API

5, API 6 et API 7. Deux survienne sur terrain a priori immunocompétent (API 3 et API

7 ) Descriptif en annexe 5 et résultats dans le tableau XIII

Tableau XIV : Résultats sérologiques des sept ‘’aspergilloses invasives’’.

Référence Valeur Index Antigène

IEA AHAI CHAI
Sérum ELISA P. m aspergillaire
API 1 0,12 1 arc <80 <80 Sérum, LBA

API 2 0,71 0 arc 80 <80 Sérum, LCR

API 3 1,11puis1,18 0 arc 320 <80 Nég

API 4 0,26 0 arc <80 <80 Nég

API 5 0,12 0 arc 160 <80 Sérum

API 6 0,29 0 arcs <80 80 Sérum

API 7 0,56 3 arcs 640 <80 Nég

Les valeurs d’index obtenues avec les aspergilloses invasives sont relativement

faibles (moyenne de 0,45 ±0,34) mais compte tenu du degré d’ immunosuppression

cellulaire et humorale important de ces patients, elles ne doivent pas être négligées.

Les cinq premiers patients possèdent, en effet, tous une lymphopénie et une

hypogammaglobulinémie. D’ailleurs les index obtenus avec les deux aspergilloses

125
invasives des deux patients apparemment non immunodéprimés (API 3 et API 7) dont

la sérologie aspergillaire est positive, sont tous les deux supérieurs à la moyenne. Un

des deux sérums (API 3) présente même une réaction en zone grise confirmée. Ce

jeune patient apparemment immunocompétent, décédé brutalement, n’avait jamais

voyagé en zone d’endémie. Cette série évoquerait la possibilité de réactions croisées

avec Aspergillus sp dans le cadre d’entités cliniques de patients immunocompétents.

C’est pourquoi nous avons également testé cinq sérums issus d’aspergilloses

pulmonaires chroniques nécrosantes (APCN) ou aspergilloses semi-invasives. Trois

sont prouvées (APCN 1 et APCN 2 et APCN 3), une autre est hautement probable

(APCN 4) et une fortement suspectée (APCN 5) (annexe 6)

Tableau XV : Résultats sérologiques des cinq ‘’aspergilloses chroniques

nécrosantes’’.
Valeur Index IEA AHAI CHAI
Réf
ELISA P. m Nbre d’arc Titre Titre
APCN 1 0,67 4 arcs 160 <80

APCN 2 0,24 1 arc 80 <80

APCN 3 0,14 0 arc 320 <80

APCN 4 0,38 4 arcs 80 80

APCN 5 0,38 2 arcs 320 <80

Aucune réaction croisée n’est observée avec les aspergilloses semi-invasives, le

niveau de réactivité de ses sérums est même plus faible que pour les API avec une

moyenne de l’index à 0,36 ±0,18.

126
 Nous avons sélectionné et testé des formes d’aspergilloses rencontrées chez

l’immunocompétent et notamment six aspergillomes tous prouvés :

Tableau XVI : Résultats sérologiques des six ‘’aspergillomes’’.

Valeur Index IEA AHAI CHAI
Réf
ELISA P. m Nbre d’arc Titre Titre
APO 1 0,67 6 arcs +J 640 <80

APO 2 0,46 5 arcs + J 1280 80

APO 3 0,38 10 arcs + J 160 <80

APO 4 0,79 7 arcs 640 80

APO 5 0,44 6 arcs 320 <80

APO 6 0,90 puis 0,78 5 arcs +J 1280 <80

A noter qu’il n’y a pas de réelles réactions faussement positives puisque APO 6

est en zone grise la première fois puis en dessous la seconde. En revanche, il est

important de noter que tous les index sont relativement forts avec une moyenne à

0,60 ±0,18. Ils sont en relation avec des taux d’anticorps anti-Aspergillus plus élevés

que dans les autres formes d’aspergilloses, ce qui suggère que ce type de sérums

serait capable de réagir faiblement, ou pour une faible partie, avec l’antigène

métabolique de P. marneffei.

Enfin, nous avons testé quatre sérums d’aspergillose broncho-pulmonaire

allergique (ABPA) prouvée parce qu’elle s’accompagne régulièrement d’un taux élevé

d’anticorps anti-Aspergillus lors des poussées (IgE mais également IgG).

Un des quatre sérums croise avec l’antigène métabolique de P. marneffei puisque

la moyenne des deux index obtenus s’élève à 1,4. Un autre possède un index en zone

grise. Avec un index moyen de 0,87 ±0,37, c’est dans ce groupe que les niveaux

réactionnels sont les plus importants.

127
 Tableau XVII : Résultats sérologiques des quatre ‘’ABPA’’.

Valeur Index IEA AHAI CHAI

Réf
ELISA P. m Nbre d’arc Titre Titre
ABPA 1 1,16 puis 1,64 2 arcs 1280 <80
ABPA 2 0,95 puis 1,15 3 arcs + J 1280 80
ABPA 3 0,56 2 arc 640 <80
ABPA 4 0,49 0 arc 640 <80

A ce sujet, la prépondérance des glycoprotéines à radicaux mannose ou glucose

a été mise en évidence chez Aspergillus fumigatus (Le Pape and Morin, 1986) et plus

récemment chez Penicillium marneffei (Le Pape et al., 2003). Certaines de ces

glycoprotéines sont communes aux antigènes somatiques et métaboliques. Par ailleurs,

certains auteurs (Van Cutsem et al., 1990) ont montré qu’il était possible de détecter

Penicillium marneffei à l’aide de l’anticorps monoclonal (EB2) dirigé contre le

galactomannane d’Aspergillus fumigatus. Cette réaction croisée pourrait être

supportée par la mannoprotéine Mp1p de 75 kDa décrite par Cao (Cao et al., 1998b).

II.3.2.5 Etude des réactions croisées avec Fusarium

oxysporum

Par sa position taxonomique proche et le caractère disséminé de la fusariose

chez ce patient, ce sérum aurait pu croiser. Toutefois la valeur obtenue est très basse

(tableau XVIII).

Tableau XVIII : Résultat sérologique de la ‘’fusariose’’.

Valeur Index CHAI

Réf
ELISA P. m AHAI
F 0,10 <80

128
 On ne peut bien sûr pas exclure de réactions croisées sur un seul sérum d’autant

que la patiente était immunodéprimée avec une hypogammaglobulinémie majeure.

La spécificité relative, calculée à partir de notre cohorte à haut risque de

réactions croisées, est de 98%. Sur les 52 sérums sélectionnés, il n’a pas été

constaté de réactions très positives c’est-à-dire à la hauteur des index rencontrés

chez trois des quatre patients atteints de pénicilliose mycologiquement confirmée.

Seule une aspergillose broncho-pulmonaire allergique donne une réaction faussement

positive (index à 1,41). Toutefois, une réaction douteuse est observée dans 6 cas :

deux candidoses (index à 1,0 et 0,91), une cryptcoccose cutanée (index à 0,97), une

aspergillose invasive (index à 1,14), une autre aspergillose broncho-pulmonaire

allergique (index à 1,05), et un aspergillome (index à 0,84). En matière de diagnostic

clinique différentiel, aucune des pathologies testées ne donne de réactions croisées.

Compte tenu des communautés antigéniques mentionnées dans la littérature, on peut

s’étonner qu’aucune étude concernant l’évaluation d’une approche diagnostique de la

pénicilliose n’ait inclus une évaluation approfondie de la spécificité.

A titre d’exemple, l’ELISA, utilisant la mannoprotéine Mp1p, n’est évaluée que

vis-à-vis de patients atteints de fièvres typhoïdes ou de tuberculose (Cao et al.,

1998b). Une étude portant sur le diagnostic de la pénicilliose par immunofluorescence

indirect s’intéresse à la spécificité vis-à-vis de sérums de patients présentant des

fièvres d’étiologies diverses mais peu d’infections fongiques sont prises en compte

(Yuen et al., 1994).

129
 II.4 CONCLUSIONS
La figure 26 présente l’ensemble des résultats de l’étude menée avec la

technique ELISA. Elle concerne un total de 92 sérums.

2,8
2,6
2,4
2,2
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figu

re n°17 : Récapitulatifs des résultats sérologiques des 92 sérums :

1) Des sérums négatifs n=36 2) Des sérums de pénicillioses confirmées n=4

3) De candidoses profondes n=11 4) De cryptococcoses n=13
5) D’histoplasmose n=5 6) D’aspergilloses chez l’immunodéprimé n=12: API+APCN.
7) D’aspergilloses chez l’immunocompétent n=10: ABPA+APO. 8) De fusariose

La sensibilité de la technique ELISA permet de détecter un taux significatif

d’anticorps chez les 4 patients atteints de pénicilliose à P. marneffei. La spécificité

sur l’ensemble de l’étude est de 98,9%. Malgré ces résultats encourageants,

l’utilisation de cette technique lors d’enquêtes séroépidémiologiques en zone d’endémie

pourrait nécessiter une technique de confirmation, telle que l’immunoempreinte ou

western blot.

130
131
III MISE AU POINT DU WESTERN BLOT

Compte tenu de l’existence de six sérums en zone grise (6,5%) il semblait

opportun d’associer à la technique ELISA, une technique de confirmation telle que

l’immunoempreinte. Ceci nécessitait donc une sélection de l’antigène à utiliser.

III.1 CHOIX DE L’ANTIGENE

Les premiers essais de western blot, réalisés au laboratoire de Parasitologie et

Biologie animale, Faculté de Pharmacie de Nantes, utilisaient des antigènes

somatiques du stade filamenteux, puis du stade levuriforme de P. marneffei . Nous

commenterons brièvement une partie des résultats de l’étude concernant l’antigène de

la forme levure (Le Pape et al., 2003) afin de présenter clairement notre démarche.

L’analyse de la réactivité de l’antigène somatique du stade levuriforme vis-à-vis

de trois sérums de patients atteints de pénicilliose confirmée (Rai., Pit., Lav.) montre

une grande diversité des profils d’immunoempreinte (figure 27-I). Seules trois bandes

sont communes aux trois patients, il s’agit des bandes de 75, 66 et de 62 kDa. Les

bandes de 88, 54, 50 et de 31 kDa sont présentes pour deux des trois sérums.

Alors que cet antigène somatique ne croise pas avec un pool de sérums

d’aspergillose, neuf bandes (24, 29, 35, 48, 52, 56, 90, 100 et 125 kDa) sont obtenues

avec un pool ‘’Candidose’’ (figure 27-II). Parmi ces bandes, six sont communes à celles

obtenues pour les sérums de patients atteints de pénicilliose (24, 29, 35, 50, 90, 125

kDa) elles perdent donc leur spécificité pour P. marneffei. Ces raisons expliquent que

notre choix se soit porté sur l’utilisation des antigènes métaboliques de la forme

levure.

132
Figure 18 : Immunoempreinte des antigènes somatiques de phase levure après réaction
avec des sérums de patients atteints de pénicilliose (I) après réaction de sérums de
patients atteints de candidose (CAN) et d’aspergillose broncho-pulmonaire allergique
(ASP)

III.2 ETUDE DE L’ANTIGENE METABOLIQUE

La qualité du western Blot dépend essentiellement de la composition de

l’antigène. Afin de faciliter l’interprétation, il faut disposer d’un antigène présentant

une diversité antigénique suffisante pour réagir avec le plus grand nombre de sérums,

tout en gardant une bonne spécificité c’est à-dire peu de bandes supportant des

réactions croisées.

L’antigène produit a été évalué à différents temps de culture (J4, J6 et J11) de

manière quantitative (concentration de protéines par la méthode de Bradford) et

qualitative (profil électrophorétique en SDS-PAGE).

133
 III.2.1 CONCENTRATION PROTEIQUE

Le dosage des protéines de l’antigène métabolique, réalisé par la méthode de

Bradford sur trois filtrats est présenté dans le tableau XIX:

Tableau XIX : Concentration en protéines en fonction du temps de culture.

Temps de culture 4ème Jour 6ème Jour 11ème Jour

Concentration protéique
1,8 0,8 11,6
(µg/10µl)

L’antigène de 11jours est plus riche en protéines.

III.2.2 PROFIL ELECTROPHORETIQUE

Le filtrat de culture est analysé par électrophorèse SDS-PAGE à 10% au

quatrième, sixième et onzième jour de culture. Les fractions protéiques sont révélées

par une coloration à l’argent.

L’analyse électrophorétique montre l’apparition au 6ème jour d’une bande de

66kDa, tandis que l’antigène de 11 jours est constitué de 10 protéines de poids

moléculaire apparent compris entre 27 et 88 kDa (88, 80, 62, 54, 45, 41, 38, 35, 31 et

27 kDa)

Ces résultats sont en accord avec les travaux de Vanittanakon et al

(Vanittanakom et al., 1997) qui montrent qu’en milieu BHI, P. marneffei entre en phase

stationnaire à partir du 7ème jour, s’accompagnant alors d’une sécretion–excrétion des

constituants les plus importants dans le milieu de culture. L’antigène métabolique

obtenu par Vanittanakom possède plus de 10 fractions antigéniques.

134
Figure n° 19 : Profil électrophorétique de l’antigène métabolique (11ème Jour)

L’antigène métabolique ne présente pas de fractions majoritaires. Il comporte

moins de fractions protéiques que l’antigène somatique qui est constitué de plus de 15

fractions de poids moléculaires compris entre 24 et 150 kDa. Il est à noter que les

deux types d’antigènes partagent sept bandes de poids moléculaire communs : 27, 31,

38, 41, 54, 62 et la 80 kDa.

Une étude de reproductibilté inter-lot a été réalisée sur trois lots d’antigènes

produits au onzième jour. Elle révèle une bonne homogénéité de production entre les

différents lots tant qualitative (profil protéique identique) que quantitative

(concentration protéique présentée dans le tableau XIX).

En conclusion, l’analyse qualitative et quantitative au cours de la culture a révélé

des variations importantes de concentration et de profil protéique. C’est le onzième

jour de culture qui allie le meilleur rendement protéique et le profil le plus

complet. Au-delà de 11 jours, l’antigène se ‘’contamine’’ par des fractions antigéniques

d’origine somatique et perd ainsi sa spécificité métabolique.

135
 Tableau XX : Concentration protéique pour les trois lots d’antigènes.

Densité optique µg de prot/mg de lyophilisat

Lot 1 0,431 13,3

Lot 2 0,329 9,1

Lot 3 0,268 8,4

Il est possible à présent d’évaluer l’intérêt de cet antigène dans la mise au point

d’une technique de western blot.

III.3 EVALUATION DES PERFORMANCES

III.3.1 ETUDE DE LA SENSIBILITE

Afin de démontrer la capacité de notre test à détecter des « vrais positifs »,

nous avons testé deux des sérums de patients (Pit et Rai), atteints de pénicilliose

prouvée par culture mycologique (figure 25).

Les deux sérums présentent une réaction positive en immunoempreinte avec

présence de deux bandes. Le patient Rai possède une bande principale de 80 kDa et

une bande très faible de 54 kDa. Le patient Pit possède la bande de 54 kDa comme

bande majoritaire et une bande très faible de 31 kDa. Les bandes 31 et 54 kDa sont

également retrouvées avec l’antigène somatique.

136
Figure n°20 : Immunoempreinte des antigènes métaboliques de la phase levure de
Penicillium marneffei après réaction avec deux sérums de patient atteints de
pénicilliose d’importation : (1) patient Rai, (2) patient Pit.

La bande commune de 54 kDa est décrite par Vanittanakom comme l’une des

bandes immunoréactive principale. En effet, elle est reconnue par 20 des 33 patients

sidéens atteints de pénicilliose à P. marneffei (Vanittanakom et al., 1997). Deux autres

protéines, non détectées dans notre étude, 200 et 88 kDa sont reconnues

respectivement par 72 et 94% de ces patients. Toutefois, il faut souligner la plus

grande valeur prédictive de la bande de 54 kDa puisque dans un groupe de patients

sidéens vivant en zone non endémique pour P. marneffei, aucune réactivité n’est

retrouvée vis-à-vis de la protéine de 54 kDa tandis que 22 et 56% des sérums

reconnaissent la bande de 200 et 88 kDa. Vanittanakom décrit d’autres bandes

mineures mais aucune de 31kDa puisque la plus petite bande qu’il met en évidence est

de 39 kDa.

III.3.2 ETUDE DE LA SPECIFICITE

La première étude de spécificité est réalisée sur deux pools de sérums. Chacun

ayant été constitué de 5 sérums choisis parmi les sérologies candidosiques et

137
aspergillaires les plus positives d’une nouvelle exploitation de la sérothèque (tableau

XXI ).

Ces deux pools ont été testés en western blot, les bandelettes

d’immunoempreinte sont présentées dans la figure 21. Les anticorps anti-Aspergillus

reconnaissent une fine bande de 27 kDa alors que les anticorps anti-Candida

reconnaissent une bande de 62 kDa et une autre de 33 kDa. Aucune des bandes

révélées par les sérums positifs de pénicilliose ne sont reconnue par ces pools.

Tableau XXI: Constitution de deux pools immunologiquement très positifs

Pool de candidoses Pool d’aspergilloses

immunologiquement suspectées immunologiquement suspectées

N° Sérum CHAI/IEC N° Sérum AHAI/IEA

17060942 1280/4 arcs 17110168 2560/8 arcs/J

17090980 320/6 arcs 17111500 2560/8 arcs/J

17059618 >2560/2 arcs 17113803 1280/7 arcs/J

17048098 >2560/4 arcs 17123766 1280/4 arcs/J

17036099 2560/3 arcs 17112934 1280/8 arcs/J

Notons que cette bande de 33 kDa, faible et mal délimitée, n’est pas révélée par

la coloration à l’argent, il s’agit donc d’une bande minoritaire de l’antigène métabolique.

138
 Figure n°21 : Profil d’immunoblot des pools ‘’d’aspergillose’’ (1) et de ‘’candidose’’ (2).

Une deuxième étude de spécificité, a été réalisée dans des conditions de

stratégie diagnostique c’est à dire sur les profils individuels de tous les sérums

sélectionnés ayant donné des index positifs ou en zone grise en ELISA. (n=7 : ABPA 1,

ABPA 2, APO 6, API 3, CRC 4, C 2, C 8). Nous avons volontairement ajouté différents

sérums parmi ceux constituant plus le diagnostic clinique différentiel et ayant une

valeur non négligeable en ELISA : n= 7, H 2, H 3, H 5, C 11, CRC 3, CRC 4 et CRP.

Le panel de sérums retenus pour l’étude des profils de spécificité du western

blot est répertorié dans la figure 22, un pool des sérums négatifs ainsi que deux

sérums de pénicilliose confirmée ont été testé en parallèle.

139
 Figure n°22: Profils immunoblot de l’étude de spécificité du Western Blot
(1)= Pool de sérum négatif, (2 et 3)= ABPA 1 et 2, (4)=API 3, (5)=APO 6, (6, 7 et 8)=H
2, H 3 et H 5, (9et 10)=P.m positif, (11, 12 et 13)= C 8, C 2 et C10, (14, 15 et 16)=CRC 2,
CRC 3 et CRC 4, (17)=CRP

Aucune bande n’est observée avec les sérums d’histoplasmose, confirmant les

résultats de l’ELISA sur l’absence de réaction croisée.

Aucun sérum issu de patients atteints d’aspergillose ne montre de bande, tout

au plus une zone floue dans les hauts poids moléculaires pour les sérums qui avaient

des index les plus élevés (ABPA 1, ABPA 2 et API 3)

Sur les trois sérums de candidose testés, seul celui qui avait l’index le plus élevé

(C 2) présente une bande large mais de faible intensité de 62 kDa. Cette bande est

également retrouvée pour les deux cryptococcoses cutanées qui ont les index les plus

élevés. Enfin, il n’existe aucune réaction avec la cryptococcose pulmonaire. Il s’agirait

donc d’un antigène commun aux levures cosmopolites et au stade levure de P.

marneffei. Cette protéine de 62 kDa pourrait correspondre à celle de 61 kDa décrite

par Jeavons (Jeavons et al., 1998).

140
 Au total, seuls trois sérums ont montré une bande immunoréactive avec

l’antigène métabolique de P. marneffei, une candidose profonde prouvée et deux

cryptococcoses cutanées qui avaient toutes un index ELISA en zone grise.

Cette étude confirme donc l’existence de réactions croisée avec Candida mais, à

la différence de ce que l’on peut observer avec les blot de l’antigène cellulaire, ici le

profil obtenu ne correspond à aucune bande spécifique de Penicillium. Le western blot

permet donc de différencier la positivité de l’ ELISA due aux réactions faussement

positive. Elle apporte également la preuve de l’existence de réactions croisée avec

cryptococcus (surtout de localisation cutannée).

L’étude de la spécificité étant réalisée, les outils diagnostiques peuvent être

appliqués sur le terrain.

141
IV ETUDE SEROEPIDEMIOLOGIQUE EN ZONE

D’ENDEMIE
Cette étude prospective est la première enquète de séroprévalence de

l’infection à P. marneffei dans les provinces du Nord-Vietnam.

IV.1 RESULTATS DU TEST DE DEPISTAGE.

Elle concerne 59 patients VIH+ dont 5 stades SIDA. Les renseignements

cliniques sont présentés dans le tableau XXII. Sur l’ensemble des 56 patients

renseignés, 39 présentent une fièvre, associée dans 19 cas à des lésions cutanées et

dans 10 cas se surajoute une perte de poids. L’étude séroépidémiologique montre que

parmi les 59 sérums testés, 4 soit 6,8% possèdent une sérologie positive, dont le 43

avec un index à 2,6. Sur ces 4 patients, deux (sérums n° 1 et 43) possèdent une

symptomatologie évocatrice avec lésions cutanées et fièvre mais des sérologies

aspergillaires et candidosiques négatives. Par contre pour le sérum n° 3, qui présente

en outre une sérologie candidosique nettement positive, confirmée par la présence de

3 arcs de précipitation, nous n’avons pas pu vérifier la présence de fièvres et/ou de

perte de poids mais nous savons qu’il ne présentait pas de signes cutanés. Enfin pour le

sérum n°339, qui présente de la fièvre sans signes cutanés ni perte de poids, la faible

quantité de sérum ne nous a pas permis de réaliser l’étude des sérologies aspergillaires

et candidosiques.

La moyenne des index est de 0,73.±0,37. A noter que la moyenne des index est

élevée, proche du début de la zone grise avec 25% des patients qui sont en zone grise

(14 sur 56).

Une attention toute particulière doit être portée au sérum n° 43 puisque c’est

devant cette valeur élevée de l’index, que des examens mycologiques ont été pratiqués.

Une hémoculture s’est avérée positive à P. marneffei. Le kit ELISA a donc permis le

diagnostic du premier cas vietnamien de pénicilliose confirmée mycologiquement.

142
 Tableau XXII : Résultats sérologiques et renseignement cliniques des 59 patients dont

le diagnostic est compatible avec une pénicilliose.

PERTE DE ELISA
Réf FIEVRE SIDA / LESIONS CUTANEES CHAI AHAI
POIDS Index
1 OUI NON SIDA/Pigmentée, pustule 1,40 1/160 <1/160

2 NC NC NC 0,52 <1/160 <1/160

3 NC NC NON 1,28 1/640 1/160

4 NC NC NC 0,62 1/160 <1/160

5 NON OUI Pigmentée, macule, papule 0,56 <1/160 <1/160

6 OUI OUI SIDA/Pigmentée, macule, papul 0,77 <1/160 <1/160

7 OUI OUI SIDA/Papule, macule 1,00 <1/160 <1/160

8 OUI NON Pigmentée, papule 0,56 <1/160 <1/160

9 OUI OUI Papule 0,99 <1/160 <1/160

10 OUI NON Ulcérée, pustule 0,41 <1/160 <1/160

11 NON NON Pigmentée, papule 0,50 <1/160 <1/160

12 OUI OUI Pigmentée, papule 0,54 <1/160 1/160

13 OUI OUI Pigmentée, macule, papule 0,99 <1/160 1/160

14 OUI OUI Pigmentée, macule, papule 1,19 <1/160 1/160

15 OUI NON Pigmentée, macule, papule 1,04 <1/160 <1/160

16 OUI NON Papule 0,48 <1/160 <1/160

17 OUI NON Pigmentée, papule 0,69 <1/160 <1/160

30 OUI NON NON 0,81

43 OUI OUI SIDA / Verruqueuse, pustule 2,66 <1/160 <1/160

53 NON NON NON 0,32 1/160 <1/160

54 NON NON NON 0,43

55 OUI NON NON 0,66

112 NON NON NON 0,35 <1/160 <1/160

113 OUI NON NON 0,54 <1/160 <1/160

143
115 OUI NON NON 1,07 <1/160 <1/160

PERTE DE ELISA
Réf FIEVRE LESIONS CUTANEES CHAI AHAI
POIDS Index
124 OUI NON NON 0,286 <1/160 <1/160

188 NON NON NON 0,595

239 OUI NON Pustule 0,97

279 OUI NON NON 0,243 <1/160 <1/160

336 OUI OUI Pigmentée 0,328

339 OUI NON NON 1,545

396 NON NON NON 0,592

397 NON NON Pigmentée, papule 1,075

398 NON NON NON 0,332 <1/160 <1/160

399 OUI OUI NON 0,903 <1/160 <1/160

400 OUI OUI NON 1,157 1/160 1/320

401 OUI NON SIDA / Pigmentée, ulcérée, 0,286 <1/160 <1/160

402 OUI NON NON 0,712 <1/160 <1/160

403 OUI NON Papule 0,839 <1/160 <1/160

404 OUI NON Pustule 0,628 <1/160 <1/160

405 OUI NON Papule 0,777 <1/160 <1/160

406 OUI NON Papule 0,589 <1/160 <1/160

407 NON NON Papule, ulcéree 0,655 <1/160 <1/160

408 OUI NON Papule, ulcéree 0,765 <1/160 <1/160

409 OUI NON Verruqueuse, papule 0,719 <1/160 <1/160

410 NON NON Verruqueuse, papule, pustule 0,550 <1/160 1/160

411 OUI NON Ulcérée, pustule 0,640 <1/160 1/160

412 NON NON NON 0,236 <1/160 <1/160

413 OUI OUI Ulcérée 0,757 1/160 <1/160

414 NON NON Papule 0,665 <1/160 <1/160

144
 PERTE DE ELISA
Réf FIEVRE LESIONS CUTANEES CHAI AHAI
POIDS Index
415 OUI NON Papule 0,864 <1/160 <1/160

416 NON NON Papule, pustule, ulcérée 0,798 <1/160 1/160

417 OUI NON Papule 0,64 <1/160 <1/160

418 NON NON Papule 0,879 <1/160 1/320

419 NON NON Papule, pustule, ulcérée 0,765 <1/160 <1/160

420 OUI NON Papule, pustule, ulcérée 0,807 <1/160 <1/160

421 OUI NON Papule 0,761 <1/160 <1/160

422 NON NON Papule, pustule, pigmentée 0,426 <1/160 <1/160

423 OUI OUI Ulcérée, pustule 0,308 1/160 <1/160

2,8
2,6
2,4
2,2
2
Valeur Index

1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 10 20 30 40 50 60

Figure n°23 :Représentation graphique des index de l’étude séroépidémiologique.

Aucun cas de pénicilliose n’avait été publié au Vietnam ou en provenance de

celui-ci avant 2001 (Hien et al., 2001) contre 1984 pour les cinq premiers cas

145
thaïlandais (Jayanetra et al., 1984) Or le Vietnam est situé entre l’épicentre

historique de la pénicilliose, la région du Guangxi (Chine du Sud) et la province de

Chang Maï (Thaïlande) où l’on recense le plus grand nombre de cas de pénicilliose. Ceci

laissait présager que le Vietnam pouvait être une zone d’endémie stable ; d’ailleurs le

champignon n’a-t-il pas été isolé pour la première fois chez des rats vietnamiens ?

IV.2 RESULTAT DU WESTERN BLOT DE

CONFIRMATION.
Parmi les 18 sérums vietnamiens possédant un index positif ou en zone grise, les

quantités de sérums restantes après analyses (ELISA, CHAI, AHAI), nous ont permis

de tester, en western blot, seulement 6 sérums vietnamiens (3, 7, 9, 15, 43, 403). Les

résultats de ces immunoempreintes sont exposés dans la figure 24

Figure n°24 : Immunoempreinte des sérums vietnamiens positif ou en zone grise

pour l’ELISA.

146
 Les patients 3 et 9 possèdent tous les deux le même profil : deux bandes

intenses de 54 et 66 kDa. Le patient 7 présente une bande intense de 31 kDa et une

plus faible de 35 kDa, le patient 43 possède la même bande de 35 kDa mais d’intensité

faible. Quant au patient 403, il présente deux bandes d’intensité très faible de 25 et

35 kDa. Seul le patient 15 ne présente aucune bande.

Nous ne discuterons pas ces résultats à ce niveau puisqu’une nouvelle enquête

réalisée sur une autre cohorte, de 26 patients vietnamiens VIH+ hospitalisés, a permis

de confirmer mycologiquement trois nouveaux cas de pénicilliose à P. marneffei.

L’analyse en western blot (figure 25) des sérums de ces trois patients (800, 801 et

803) complète l’étude des sérums français de pénicillioses prouvées et permet de

préciser de nouveaux profils de bandes spécifiques et donc d’affiner les critères

diagnostiques.

Figure n°25 : Profil western blot des sérums issus des nouveaux cas de pénicilliose.

147
 Le sérum n° 800 présente 5 bandes (31, 35, 38, 54, et 140) dont deux de forte

intensité (31 et 54 kDa). Le sérum n°801 possède un profil beaucoup plus discret sans

bande de forte intensité, néanmoins, 2 faibles bandes sont identifiables (29 et 54

kDa). Quant au sérum n°803 il possède sept bandes (25, 31, 35, 38, 41, 54 et 66 kDa)

dont la 31 de forte intensité.

Les trois nouveaux cas de pénicilliose possèdent donc tous la bande 54 kDa et au

total, cinq des six patients atteints de pénicilliose prouvée (deux français et quatre

vietnamiens) possèdent des anticorps dirigés contre cet antigène de 54 kDa.

Vanattanakom la retrouve chez 20 des 33 patients de sa série (Vanittanakom et al.,

1997). La bande de 31 kDa est retrouvée chez 3 des 6 patients atteints de pénicilliose.

La bande de 80 kDa, présente chez un patient français, n’est retrouvée chez aucun

des sérums de patients vietnamiens.

Par contre de nouvelles bandes sont mises en évidence. Elles sont à considérer

comme spécifiques de pénicilliose puisque non retrouvées avec les sérums

correspondant aux autres pathologies fongiques. En premier lieu, mentionnons la bande

très fine de 35kDa que l’on ne décrit que dans les sérums vietnamiens, dans trois des

quatre cas. C’est d’ailleurs l’unique bande retrouvée pour le premier cas (43) de

pénicilliose au Vietnam. Parmi ces nouvelles bandes figurent également la bande de

38kDa considérée comme très spécifique par certains auteurs (Chongtrakool et al.,

1997) mais qui n’est retrouvée que chez deux des six cas de pénicilliose prouvée.

Notons enfin que la bande de 62 kDa qui constitue une bande non spécifique n’est

retrouvée chez aucun des sérums vietnamiens.

Les bandes les plus contributives au diagnostic de pénicilliose sont

donc la 54 kDa pour sa large distribution, la 31 kDa pour son intensité et

la 35 kDa.

148
 Tenant compte de ces nouvelles considérations, l’analyse des westerns blots de

l’étude séroépidémiologique indique que tous les sérums testés, à l’exception du 15,

sont considérés comme immunologiquement suspect de pénicilliose. Aucun

prélèvement n’ayant été réalisé chez ces patients, la confirmation mycologique n’a pu

être apportée.

149
 CONCLUSION

Dans ce travail, nous avons mis en évidence l’influence, certes de la

température, mais également de la composition du milieu sur le développement

microscopique et macroscopique de ce champignon dimorphique. Le milieu PDA

pourrait, à ce titre, s’avérer utile au diagnostic puisque, associé au milieu de

Sabouraud, il permet d’évoquer le caractère dimorphique à la seule température de

37°C. On obtient, en effet, simultanément des colonies de développement levuriforme

sur Sabouraud contre un développement de Penicillium classique filamenteux sur PDA,

présentant de surcroît une pigmentation rouge tout à fait évocatrice.

En ce qui concerne le diagnostic sérologique notre étude a permis de révéler la

supériorité de l’antigène métabolique sur l’antigène somatique en terme de spécificité,

ainsi que d’autres performances justifiant son utilisation dans un test ELISA de

dépistage. L’ELISA affiche une spécificité et une sensibilité élevée, même sur une

population cible essentiellement immunodéprimée par le VIH. Son fractionnement au

sein d’un western blot lui confère un pouvoir discriminant très grand. Cette stratégie

de diagnostic sérologique trouvera sans doute toute sa place dans le diagnostic

présomptif de cette mycose exotique émergeante.

Les qualités de cet antigène ont pu s’exprimer en pratique clinique puisque

l’application de cette stratégie lors d’une enquête séroépidémiologique prospective,

réalisée dans le Nord-Vietnam (Hanoï), a permis de suspecter puis de confirmer

mycologiquement les premiers cas de pénicilliose à P. marneffei dans ce pays. Une

enquête similaire devrait être mise en place prochainement dans le Sud-Vietnam.

150
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157
ANNEXE n° I : Quelques éléments d’identification des principaux Penicillium15

!Conidiogénèse faible ou absente à 25°C. Mycélium, exsudat et/ou milieu de culture

pigmenté en orange, rouge ou brun. ………………………………….……..P. nalgiovense.

!Bonne croissance sur milieu Czapek……………………………………….…………………P. oxalicum.

!Thalle sur milieu n’excédant pas 25 mm de diamètre en 7 jours à 25°C. Revers jaune

vif. Métules d’égale longueur………….……………………………….………………….P. citrinum.

!Thalle pigmenté en rouge sur milieu CYA à 25°C……………….………..P. purpurogenum.

!Thalle à croissance rapide à 25°C. Pénicille lâche, pigment jaune diffusible, exsudat

jaune plus ou moins foncé…………………………………..………………...P. chrysogenum.

!Phialides courtes, moins de 6,5 µm de long…………………………………..…P. griseofulvum.

!Conidies cylindriques. Odeur arômatique……………………………………..………….P. italicum.

!Conidies subglobuleuses à elliptiques, odeur de pomme…………………...P. expamsum.

!Thalle floconneux. Conidies blanches ou vert pâle………………………….P. camenbertii.

!Conidiophores grossièrement granuleux. Conidies de 4 à 5 µm. Pas d’odeur forte.

Sclérotes parfois présents dans les vieilles cultures…………………………P. roquefortii.

158
 ANNEXE 2 : PREPARATION DES MICROPLAQUES - ELISA -

Objectif :

Sensibilisation des plaques par l’antigène métabolique à l’aide d’une adsorption

passive dans les puit.

Protocole :

- Préparation de la solution antigénique : 16 mg de lyophilisat d’antigène sont

dilué dans 30 ml de tampon bicarbonaté.

- Sensibilisation des microplaques : 100 µl de la solution d’antigène précédente

sont introduit dans chacun des puits. Incuber 1 heure à 37°C puis 1 nuit à 4-8°C. Vider
les puits et sécher la plaque.

- Blocage par l’albumine : Une solution d’albumine de sérum bovin (BSA) à 3%

est utilisée pour effectuer le blocage. Préparé par 1,1 g de BSA dilué dans 30 ml du
tampon de lavage PBS à pH=7,2, 150 µl son déposé dans chaque puits et incubé 1 heure
à 37°C. Les plaques sont ensuite conservées en sachet Aluminium* avec dessiccateur.

Réactifs de l’ELISA:

Tampon de lavage
Tampon bicarbonaté :
Albumine bovine fraction V A9056 lot 91 H03325 de SIGMA*

159
 ANNEXE 3 : SERUMS DE PATIENTS ATTEINTS
DE CANDIDOSES PROFONDES

1) Candidoses prouvées :

C 1, dans le cadre d’une tumeur pancréatique et devant un choc septique est

découvert au scanner un abcès hépatique volumineux qui, ponctionné ramène un liquide
d’aspect bilio-hémorragique où est isolé un Candida glabrata ainsi qu’un staphylocoque
blanc et un entérocoque. Plus tard, trois hémocultures s’avèreront positive à Candida
glabrata ainsi qu’une sérologie candidosique. Au total, il s’agit d’une septicémie
candidosique à point de départ hépatique. [sérum n° 17126270, 5 jours après
première hémoculture positive]
C 2, dans le cadre d’une toxicomanie IV, avec injection IV de son traitement
subtitutif per os, monsieur S. développe un abcès à Candida albicans au site
d’injection (pli du coude) puis une choriorétinite candidosique (abcès para-maculaire)
post-sépticémique. La culture est positive sur le prélèvement de vitrée ainsi que sur
l’abcès du coude, elle est complétée par une sérologie très positive Au total, il s’agit
d’une candidose systémique d’inoculation par toxicomanie IV. [sérum n° 17145421]
C 3, dans le cadre d’une cirrhose alcoolique, décompensation œdèmato-ascitique
avec encéphalopathie compliquée d’une candidose profonde (asciculture positive) à
Candida albicans immunologiquement confirmée par une sérologie candidosique
positive. [sérum n° 17048098, J8 après l’asciculture positive]

2) Candidoses hautement probables

C 4, ex C11 un patient sans déficit immunitaire apparent présente un choc

septique (frissons, pics fébriles, douleurs abdominales) à Candida albicans résolutif
après traitement par TRIFLUCAN* mais avec candidémie récidivante J8 après chaque
arrêt du traitement. La sérologie candidosique est positive (2 arcs et 640 en CHAI) et
six hémocultures sont revenues positives. Au total, il s’agit d’une sépticémie
communautaire à Candida albicans. [sérum n° 17125563, J4 après 1ère hémoculture
positive]
C 5, chez un patient tabagique atteint d’artériopathie et opéré d’un pontage
aorto-bifémoral se développe une sépticémie à Candida tropicalis (nombreuses
hémocultures positives) à partir d’une thrombophlébite septique jugulaire sur cathéter
sous clavier. Le patient est en outre colonisé par Candida (indice de Pittet = 1 sur trois
sites : urine, bouche et liquide gastrique) et présente une sérologie candidosique
légèrement positive (2 arcs et 160 en CHAI). [sérum n° 17138609, J5 après 1ère
hémoculture positive]
C 6, chez un patient gastrostomisé, se développe un volumineux abcès de paroi
abdominal à Candida albicans à partir d’une fuite de la sonde de gastrostomie puis un

160
tableau de sepsis étiqueté péritonite à Candida. (pas de cause bactérienne retrouvée)
En effet, outre les prélèvement per-opératoire (pus d’abdomen) qui sont positifs à
Candida albicans, le patient est colonisé (urine, orifice de trachéotomie) et la
sérologie est positive. [sérum n° 20136042, J13 après le prélèvement per-opératoire]
C 7, un greffé bipulmonaire pour mucoviscidose conditionné par cyclosporine
puis PROGRAF* et corticoïdes, développe une septicémie à partir d’un site
implantable infecté par Candida glabrata. La sérologie est positive et s’associe à de
nombreuses cultures positives à C. glabrata comme le cathéter fémoral, de nombreux
pièges bronchiques, le site implantable bien sûr, ainsi que six hémocultures positives.
[sérum n° 17138686, J12 après 1ère hémoculture positive]
C 8, un autre patient atteint de mucoviscidose, gréffé cœur-bipulmonaire,
initialement colonisé sur son poumon natif par Candida (indice de Pittet à 1 sur quatre
prélèvements) mais aussi à Aspergillus, présente, après sa greffe, une sérologie très
positive (6 arcs et 640 en CHAI) et développe malgré un traitement par
TRIFLUCAN*, une sépticémie à Candida albicans (cinq hémocultures positives et deux
cathéters). Le point de départ est vraisemblablement une thrombose septique sur
cathéter central jugulaire (car non résorbé après 11 jours d’anticoagulation efficace).
[sérum n° 17143223, J7 après 1ère hémoculture positive]
C 9, un brûlé à 35%, préalablement colonisé à Candida sp (indice de Pittet > 0,5)
avec une sérologie candidosique très positive développe une fièvre qui est traitée de
façon empirique, avec succès par TRIFLUCAN* 400mg/jour. [sérum n° 17090980]

3) Candidoses fortement suspectées

C 10, un patient ayant un mélanome stade III avec métastases hépatiques et
ganglionnaires ; traité par chimiothérapie lourde, développe une fièvre inexpliquée
dans un contexte de colonisation par Candida albicans (indice de Pittet > 0,5)
accompagné d’une sérologie candidosique très positive. [sérum n° 17036099, J10 après
début de fièvre]
C 11, il s’agit d’un patient ayant présenté une infection sans étiologie
bactérienne retrouvée à partir d’un site implantable infecté qui, retiré, c’est avéré
positif à Candida albicans. La sérologie candidosique réalisée a posteriori c’est révélée
très positive. [sérum n° 17114539, J12 après le début de l’infection]

ANNEXE 4 : SERUMS DE PATIENTS ATTEINTS

DE CRYPTOCOCCOSES CUTANEES

CRC 1, patient sous corticothérapie au long court (depuis 15 ans, 30 mg de

CORTANCYL*) pour un asthme consécutif à l’inhalation de gasoil. Considéré comme
immunodéprimé (188 CD4/mm3, hypo-gammaglobulinémie G à 3g/l, antécédents

161
d’infections opportunistes notamment une pneumopathie à mycobactérium avium), il
développe une cryptococcose du membre supérieur avec isolement de levures dans la
peau et l’urine ainsi que la présence d’antigènes dans le sang (2 à 164) et les urines. Il
sera traité avec succès par un traitement prolongé associant amphotéricine B +
ANCOTIL* relayé par du TRIFLUCAN*.

CRC 2, patient VIH- présentant un syndrome d’imunodéficience acquise non lié

au VIH avec une lymphopénie idiopathique à CD4 (55 CD4/mm3 sans hypo-
gammaglobulinémie) révélé par une cryptococcose cutanée (temporale gauche) mais
aussi pulmonaire (nodule pulmonaire). Les urines et la biopsie cutanée seront positives
à cryptococcus, alors que l’antigène restera négatif.

CRC 3 et CRC 4, sont des cryptococcoses d’inoculation survenant sur des patients a
priori immunocompétents

162
 ANNEXE 5 : SERUMS DE PATIENTS ATTEINTS
D’ ASPERGILLOSE PULMONAIRE INVASIVE

1) Aspergillose pulmonaire invasive prouvée :

API 1, sur un terrain d’hémopathie maligne (LAM 1) deux fois allogreffés et

traité par cyclosporine et méthotrexate, apparition d’antigène aspergillaire dans le
sérum mais également dans le LBA. Ce dernier s’avèrera positif en Aspergillus
fumigatus. Au scanner, présence de nombreux nodules dans le parenchyme pulmonaire
dont un avec une image en croissant gazeux évoquant fortement une nécrose
aspergillaire. [sérum n° 17129084, J9 après début API]
API 2, également sur un terrain d’hémopathie maligne (LAM 2) mais
autogreffé, apparition d’une otite (dont le pus est positif en Aspergillus nidulans) qui
progresse très rapidement au niveau cérébral établissant une aspergillose neuro-
méningée avec abcès bilatéral au niveau temporal rapidement mortelle malgré un
traitement par voriconazole. Sur le plan biologique, l’antigène aspergillaire est positif
dans le sérum mais également dans le LCR. [sérum n° 17097116, J15 après début de
l’API]
API 3, Mr M. tabagique mais apparemment immunocompétent (aucun facteur
d’immunodépression retrouvé) présente une aspergillose pulmonaire fulminante
aboutissant, très rapidement, à son décès en réanimation médicale. Une biopsie post-
mortem révélera une réaction granulomateuse avec aspect de miliaire aspergillaire
invasive et une culture positive d’A. fumigatus. Un piège bronchique et un LBA avaient
déjà été positifs à A. fumigatus, par contre la sérologie aspergillaire est faiblement
positive (AHAI=320 et absence d’arc). Le diagnostic de granulomatose septique
[familiale] sera évoquée. [sérum n° 09637641 J4 après le début de son hospitalisation]

2) Aspergillose pulmonaire invasive hautement probable

API 4, Mr M., allogreffé pour une hémopathie maligne (LAL) présente des
hémorragies intra-alvéolaires avec présence au scanner de micronodules et
d’Aspergillus fumigatus dans un piège bronchique sans que l’antigénémie ne se positive.
[sérum n° 17097836]
API 5, une patiente VIH+ profondément immunodéprimée (CD4 = 0/mm3)
décède très probablement d’une API. Elle était en effet connue pour avoir des
antécédents d’ ABPA avec une colonisation aspergillaire persistante, et a présenté un
syndrome interstitiel s’aggravant de jour en jour associé à une antigénémie

163
aspergillaire très positive. [sérum n° 17124248, J7 après début du syndrome
interticiel]
API 6, traité pour une leucémie aigüe (LAL 2 préB) chimio-résistante par
allogreffe, Mr E. développe deux GVH malgré l’utilisation de nombreux
immunosuppresseurs justifiant l’utilisation de sérum antilymphocytaire. Il décèdera
peu de temps après dans un tableau de défaillance multiviscérale infectieuse malgré un
traitement par amphotéricine B et itraconazole relayé par SCH 56592. Une
antigénémie aspergillaire positive, la présence de micronodule au scanner et l’isolement
d’A. fumigatus dans ces crachats et sa gorge sont autant d’arguments qui permettent
de suspecter une API. [sérum n° 09960220, J30 après début API]

API 7, sur un terrain de BPCO post tabagique, une pneumopathie à

pneumocoque se complique d’un syndrome interstitiel pulmonaire gauche rapidement
progressif associé à une sérologie aspergillaire fortement positive. Après traitement,
il sera mis en évidence une truffe aspergillaire dans le sinus maxillaire droit,
vraisemblablement due à une localisation secondaire par dissémination. [sérum n°
17124472, J5 de la pneumopathie]

164
 ANNEXE 6 : SERUMS DE PATIENTS ATTEINTS
D’ ASPERGILLOSE PULMONAIRE CHRONIQUE NECROSANTE

1) Aspergillose pulmonaire chronique nécrosante prouvée :

APCN 1, APCN apicale gauche sur séquelle de pleurectomie avec majoration

relativement rapide des opacités radiologiques et des crachats hémoptoïdiques,
contrôlé par itraconazole puis voriconazole. Le caractère invasif étant prouvée par
l’anatomopathologie. [sérum n° 17091896 J8 après crachats]
APCN 2, sur un terrain de BPCO post-tabagique avec emphysème,
développement d’un aspergillome du lobe supérieur gauche (image radiologique en
grelot) aggravé par une pneumopathie nécrotique excavée du lobe supérieur droit
accompagnée d’une augmentation de la sérologie aspergillaire. Malgré un traitement
par itraconazole puis amphotéricine B, le patient décédera rapidement. [sérum n°
17121744]
APCN 3, sur terrain d’hémopathie maligne (LAL 1) chimiorésistante
doublement allogreffée, se développe une aspergillose semi invasive évoquée au
scanner (foyer initialement unique puis micro-abcès pulmonaires) malgré un traitement
par itraconazole puis voriconazole. Devant cette évolution non satisfaisante, une
lobectomie sera décidée et le caractère invasif de l’atteinte aspergillaire sera montré
par l’anatomopathologie sur la pièce opératoire. [sérum n° 07071701 à J12 du scanner]

2) Aspergillose pulmonaire chronique nécrosante hautement

probable :

APCN 4, pneumopathie excavée sur BPCO post-tabagique avec augmentation

de la dyspnée et des hémoptysies jusqu’à formation, malgré un traitement par
amphotéricine B et itraconazole, d’un abcès pulmonaire imposant un drainage
chirurgical. [sérum n° 09923006 à J4 après le drainage]

3) Aspergillose pulmonaire chronique nécrosante fortement

suspectée :

APCN 5, aspergillose évoluant rapidement mais qui sera contrôlée par un

traitement antifongique, avec négativation de la sérologie et des images radiologiques.
A noter que la sérologie aspergillaire du sérum disponible est négative (1 arc et 160 en
AHAI). [sérum n° 17057599].

ANNEXE 7 : SERUMS DE PATIENTS ATTEINTS

D’ ASPERGILLOME

165
APO 6, aspergillome pulmonaire apical droit sur séquelles de tuberculose traité par
pneumothorax, avec toux, hémoptysie, aspect radiologique en grelot, sérologie très
positive. Il est traité par chirurgie avec ablation d’une truffe aspergillaire de 4,5 cm
de diamètre. [sérum n°17123766 à J 4 après opération, antigène aspergillaire abscent]

APO 2, Mme L. présente une toux importante avec expectoration d’où est isolé
Aspergillus fumigatus. L’aspect typique de truffe aspergillaire au scanner fait
découvrir un aspergillome sur une cavité séquellaire de pneumothorax extra-pleurale.
[sérum n°17124091]

APO 1, APO 4, APO 5 et APO 6 possèdent tous une image d’épaississement pleural à
la radio ou de grelot au scanner, un isolement pulmonaire d’Aspergillus sp et une
sérologie aspergillaire très positive. [sérum n°17139362, 17111500, 17114288, et
17057369]

ANNEXE 8 SERUMS DE PATIENTS ATTEINTS

D’ ASPERGILLOSE BRONCHO-PULMONAIRE ALLERGIQUE

ABPA 1, sur un terrain atopique (IgE globales augmentées), développement d’un

asthme avec expectorations bronchiques riche en mycélium aspergillaire et en
éosinophile. A la radiologie sont découvert des infiltrats labiles associés à une hyper-
éosinophilie sanguine et une sérologie aspergillaire très positive. [sérum n°17118275]
ABPA 2, sur un terrain asthmatique et tabagique se développe une ABPA sévère
(IgE globales et spécifiques augmentées (>100 kU/I), hyper-éosinophilie, sérologie
aspergillaire très positive, bronchospasmes) qui se complique secondairement d’un
aspergillome pleuropulmonaire.

ABPA 3, patient hospitalisé pour l’exacerbation de son asthme (dyspnée

continue avec fébricule et bronchospasme). A la radiologie pulmonaire, découverte de
bronchectasies proximales associées à une hyperéosinophilie, une sérologie
aspergillaire très positive et un taux d’IgE spécifiques très élevé. [A noter que le seul
sérum disponible n’est pas très positif car obtenu 2 mois après l’épisode aigu
d’évolution favorable]
ABPA 4, patient atteint de mucoviscidose, qui développe un asthme inquiétant
avec isolement multiple d’A. fumigatus dans ces expectorations, une réaction cutanée
immédiate positive aux antigènes aspergillaires et une élévation du taux d’IgE
spécifiques.

166
167
 ANNEXE 9 : SERODIAGNOSTIC DE L’ASPERGILLOSE PAR
HEMAGGLUTINATION INDIRECTE FUMOUZE*

MODE OPERATOIRE :

Les réactifs et les sérums à examiner doivent être à température ambiante.

1/ Dilution mère au 1/40 de tous les sérums a examiner : 0,05 ml du sérum à

examiner dans 1,95 ml de solution tampon phosphate pH 7,2.

2/ Réaction en microplaque :

a) $A l’aide d’une micropipette automatique, distribuer 50µl de solution tampon

dans 8 cupules en utilisant la plaque dans le sens de la largeur.
b) $ Distribuer 50µl de la dilution mère du sérum dans la première cupule,
mélanger avec le tampon et reporter, de préférence à l’aide d’un micro-diluteur
(« tulipe »), 50µl de la 1ère cupule dans la 2ème, de la 2ème dans la 3ème, et ainsi de
suite jusqu'à la 6éme cupule, en rejetant 50µl de cette dernière cupule. On
obtient donc des dilutions au 1/80 jusqu’au 1/2560.
$ Distribuer 50µl de la dilution mère du sérum dans la 7ème cupule, mélanger
avec le tampon et rejeter 50µl. Cette dilution au 1/80 constitue le témoin
« sérum » pour détecter les agglutinines naturelles anti-mouton de certains
sérums.
c) $ Agiter soigneusement les suspensions d’hématies avant utilisation.
Déposer une goutte (16,66µl) d’hématies sensibilisées dans les 6 premières
cupules.
$ Déposer une goutte (16,66µl) d’hématies non sensibilisées dans la 7ème cupule
(témoin « sérum »).
$ Déposer une goutte (16,66µl) d’hématies sensibilisées dans la 8ème cupule
(témoin « réactif »), dont le rôle est contrôler la validité du tampon et des
hématies.
d) $ Homogénéiser très soigneusement le contenu des cupules par tapotements
latéraux sur les cotés de la plaque, posée à plat (pas d’agitateur orbital). Laisser
ensuite la plaque immobile, à l’abri des vibrations pendant deux heures puis lire
l’éventuelle hémagglutination.
e) $ Sérums de contrôle : Un sérum positif de titre connu et un témoin négatif
doit être traité comme deux sérums à examiner.

168
ANNEXE 10 : TECHNIQUE D’IMMUNOELECTROPHORESE ADAPTE
SUR GEL PARAGON (Beckman*) SANS ANTISERUM REFERENCE
446070.

1/ PROCEDURE D’ELECTROPHORESE :

a) Préparer les échantillons et les contrôles.

b) Remplir chaque compartiment de la cuve d’électrophorèse Paragon avec 45ml de
tampon B-2 Barbital.
c) Retirer le gel IEP de son emballage et le placer sur une feuille de papier, le
sécher délicatement avec un buvard pour gel puis jeter le buvard.
d) Appliquer la matrice échantillon sur le gel suivant les points de positionnement
sur les côtés du gel.
e) Déposer 3 à 5µl des différents sérums et contrôles, laisser diffuser 10 minutes.
f) Sécher délicatement la matrice de dépôt et jeter le buvard et matrice utilisée.
g) Placer le gel sur son support et le support dans la cuve et fermer le couvercle.
h) Sélectionner la tension de 100 volts, laisser migrer 20 minutes.
i) Retirer le gel de la cuve, buvarder délicatement et jeter le buvard.

2/ PROCEDURE D’IMMUNODIFFUSION :

j) Appliquer la matrice antisérum sur le gel.

k) Déposer 20 µl d’antigène (Bio Rad*) métabolique (filtrats de cultures après 10
jours à 30°C) et somatique (broyats mycéliens de cultures jeunes à 30°C sans
spores), laisser diffuser 10 minutes puis retirer la matrice.
l) Placer le gel dans une boite d’incubation sur un buvard imprégné d’eau
désionisée. Fermer le couvercle et laisser diffuser entre 18 et 24 heures à
température ambiante.

3/ PROCEDURE DE LAVAGE ET DE COLORATION :

m) Retirer le gel de la boite, le placer dans un cadre.

169
n) Plonger l’ensemble dans la solution saline I pendant 10 minutes.
o) Placer ensuite successivement sur le socle de la presse buvard, gel, buvard,
buvard imbibé de solution saline et de 2 buvards secs et presser pendant 10
minutes.
p) Mettre le gel dans un cadre et le placer dans la solution saline II pendant 10
minutes.
q) Répéter l’étape de séchage sous presse pendant 10 minutes.
r) Placer le gel dans l’étuve jusqu’au séchage complet.
s) Coloration par du Bleu Paragon puis décoloration par de l’acide acétique à 5%.,
séchage final du gel.
t) Interprétation du gel à l’œil nu en observant la forme et la position des arcs de
précipitation.

4/ REVELATION DE L’ACTIVITE CATALASIQUE :

Pour mettre en évidence l’activité catalasique des arcs, recouvrir le gel d’une
solution d’eau oxygénée à 1 V préparée extemporanément (à partir d’une solution 10
V). La présence d’arc est visualisée immédiatement par dégagement de bulles
emprisonnées dans le gel au niveau de l’arc lui-même.
Laver et colorer immédiatement.

170
 ANNEXE 11 :..ETUDE DE LA CONCENTRATION EN
ANTIGENE : METHODE DE BRADFORD

PRINCIPE ET UTILISATION :

Méthode colorimétrique simple et sensible couramment utilisé pour quantifier

des concentrations faibles de protéines. Ce dosage repose sur la mesure de
l’absorbance à 595 nm d’une solution de bleu de Coomassie qui passe du brun-vert au
bleu en se fixant aux protéines. La confrontation de la densité optique obtenue avec
une gamme d’étalonnage réalisée par dilution successive d’une solution d’Albumine
bovine (BSA), permet de déduire la concentration protéique.

MODE OPERATOIRE :

a) ! Pour préparer la gamme d’étalonnage, diluer respectivement, 2,5, 5, 10, 15 et

20 µl d’une solution mère de BSA à 1mg/l dans 50 µl de soude molaire. Réaliser en
parallèle un blanc de lecture en remplaçant la BSA par 20 µl d’eau distillée.

! Pour préparer l’échantillon, reprendre la totalité du lyophilisat d’un flacon

par 500µl d’eau distillée, puis diluer de la même façon 20 µl de cette solution
d’antigène dans 50 µl de soude molaire.

b) Ajouter ensuite à chaque tube la quantité suffisante pour 1 ml de bleu de

Coomassie, on agite et on laisse au moins cinq minutes.

c) L’ absorbance à 595 nm doit alors être lue dans l’heure.

171
 ANNEXE 11 bis .COLORATION AU NITRATE D’ARGENT
DES PROTEINES DANS UN GEL

Le but de cette coloration, très sensible, est de révéler les bandes protéiques
après migration dans un gel. Elle est réalisée à l’aide du kit SILVER STAIN TRIAL
PACK AG-5.

REACTIFS ET SOLUTIONS :

- Nitrate d’argent et nitrate d’ammonium (Sigma, réf S-6028)

- Acide tungstosilique (Sigma, réf T-4791)
- Formaldéhyde (Sigma, réf F-5775)
- Carbonate de sodium (Sigma, réf S-5903)
- Solution fixatrice d’argent (Sigma, réf G-6153)
Méthanol……………………………………………….100 ml
Acide acétique pur……………………………… 20 ml
H2O………………………………………………..qsp 200 ml

- Solution de coloration :
Nitrate d’argent……………………………………5 ml
Acide tungstosilique…………………………….5 ml
Formaldéhyde……………………………………….5 ml
Carbonate de sodium……………………….. 50 ml
H2O……………………………………………………….35 ml

- Solution d’arrêt :
H2O………………………………………………………190 ml
Acide acétique pur ……………………………..10 ml

MODE OPERATOIRE :

- Placer le gel de polyacrylamide dans une cuve en plastique et le recouvrir de solution

fixatrice.
- Agiter doucement pendant 30 minutes à température ambiante.
- Jeter la solution de fixation, ajouter de l’eau ultrat-pure et agiter doucement
pendant 10 minutes. Recommencer cette étape une deuxième fois.
- Placer le gel dans la solution de coloration pendant 20 à 30 minutes d’incubation ou
jusqu’à obtention de bande nette (grise) sans trop de bruit de fond.
- Arrêter la coloration en transférant le gel dans la solution d’arrêt et conserver ce
gel dans de l’eau.

172
 ANNEXE 12 :.MODE OPERATOIRE DE LA SEPARATION
DES PROTEINES PAR ELECTROPHORESE EN CONDITION
DENATURANTE

REACTIFS :

- Acrylamide (Sigma, ref A-3553)

- bis-acrylamide (N-N’-méthylène-bis-acrylamide) (Sigma, ref M-7279)
- TRIS (Sigma, ref T-6066)
- SDS (Dodécyl Sulfate de Sodium) (Serva, ref 20760)
- Persulfate d’ammonium (Sigma, ref A-3678)
- TEMED (Serva, ref 35925)
- Glycérol (Merck, ref 4094)
- Béta-mercaptoéthanol (Prolabo, ref 25 350 188)
- Bleu de bromophénol (Sigma, ref B-8026)
- Marqueur de poids moléculaire

MODE OPERATOIRE :

- Assembler le dispositif pour couler les gels (kit moni Protéane III-Biorad) en
utilisant les espaceurs de 1,5 mm.

- Préparer dans un erlenmeyer le gel de séparation (selon le tableau ci-dessous). Après

avoir ajouté le catalyseur et le TEMED, remuer doucement pour homogénéiser. Avec
une pipette, couler immédiatement le gel entre les deux plaques, attendre 15 à 20
minutes pour que la polymérisation (gélification) soit complète.

- Préparer ensuite le gel de concentration (tableau ci-dessous), ajouter le catalyseur

et le TEMED, agiter puis couler le gel entre les deux plaques au contact du premier
gel. Insérer le peigne au sommet du gel de concentration et attendre 15 à 20 minutes
que ce gel se polymérise, puis retirer délicatement le peigne.

- Placer le gel dans la cuve à électrophorèse puis la remplir avec du tampon

d’électrophorèse 1 X SDS (Solution 8) jusqu’à immersion complète.

- Préparer des dilutions d’échantillons avec le tampon échantillon 2 X SDS (Solution 7)

afin de déposer ultérieurement 20 à 40 µg de protéines dans chaque puit. Porter
ces dilutions d’échantillon à 100°C pendant 3 à 5 minutes puis déposer avec précaution

173
15 µl d’extrait protéique dans chacun des puits échantillons alors que les deux puits
d’extrémités sont destinés à recevoir 5µl de marqueur de poids moléculaire.

- Faire migrer les échantillons sous un courant continu de 60 volts jusqu’à la fin du gel
de concentration (la migration étant visualisée en suivant l’avancement du marqueur de
taille colorée en bleue) puis passer à 100 volts jusqu’à la fin du gel de séparation
(environ 1 à 2 heures).

COMPOSITION DES SOLUTIONS :

! Solution 1 :Solution d’acrylamide : 30% acrylamide/ 0,8% bisacrylamide qui doit

être conservée à 4°C et à l’obscurité.
Acrylamide…………………………………….58,4 g
Bisacrylamide…………………………………..1,6 g
H2O…………………………………………qsp 200 ml

! Solution 2 : Solution pour gel de séparation : Tris-HCl 4X, pH=8,8

(1,5 M Tris-HCl)
Tris ………………..……………………………..36,3 g
H2O…………………………………………qsp 200 ml
Ajuster le pH à 8,8 avec du HCl

! Solution 3 : Solution pour gel de concentration : Tris-HCl 4X, pH=6,8 (0,5 M

Tris-HCl)
Tris…………………………………………………….3,0 g
H2O…………………………………………….qsp 50 ml
Ajuster le pH à 8,8 avec du HCl

! Solution 4 Solution à 10% en SDS

SDS…………………………………………………….50 g
H2O………………………………………….qsp 500 ml

! Solution 5 : Solution catalyseur

Persulfate d’ammonium…………………0,5 g
H2O…………………………………………….qsp 5 ml

! Solution 6: Solution de bleu de bromophénol à 0,5%

Bleu de bromophénol…………………..…….50 mg
H2O………………………………………………...qsp 10 ml

174
! Solution 7 : Tampon de traitement échantillon SDS concentré 2X (0,125 M
Tris-HCl pH 6,8, 4% SDS,10% glycérol, 10% 2-mercaptoéthanol, 0,5% bleu de
bromophénol)
Trisma base pH 6,8…………………………..2,5 ml
SDS 10% ………………………………………………..4 ml
Glycérol……………………………………………………1 ml
2-mercaptoéthanol……………………………….1 ml
Bleu de bromophénol 0,5% …………………1 ml
H2O……………………………………………..….qsp 10 ml

! Solution 8 : Tampon d’électrophorèse

Trisma base……………………………………………3 g
Glycine………………………………………………..14,4 g
SDS 10% …………………………………………….10 ml
H2O……………………………………………….qsp 10 ml

PREPARATION ET COMPOSITION DES GELS :

Si gel à 10% ?:

Gel à 10% d’acrylamide

Solutions Gel de séparation Gel de concentration
Solution 1 10 ml 1,33 ml
Solution 2 7,5 ml X
Solution 3 X 2,5 ml
Solution 4 0,3 ml 0,1 ml
H20 12 ml 6 ml
A g i t e r
Solution 5 330 µl 100 µL
TEMED 30 µl 10 µl

COMPOSITION DU MARQUEUR DE POIDS MOLECULAIRE, (Sigma Chemical Co) Il

est constitué de six protéines :
L’anhydrase carbonique (29 kDa), l’ovalbumine (45 kDa), l’albumine bovine (66
kDa), une phosphorylase (97 kDa), une bêta galactosidase d’E. coli (116 kDa) et enfin,
de la myosine de lapin (205kDA).

175
 ANNEXE 13 : ELECTRO-TRANSFERT DE PROTEINES

Le but de cette manipulation, encore appelée « blotting » ?, est de transférer

les protéines ayant migrées dans un gel sur une membrane de nitrocellulose qui pourra
être incubée avec des sérums puis conservée.

REACTIFS ET SOLUTIONS :

- TRIZMA Base (TRIS) (Sigma, réf T-6066)

- Glycine (Sigma, réf G-8898)
- Méthanol
- Tampon de transfert :
TRIS……………………………………………..5,8 g
Glycine………………………………………….2,9 g
Méthanol…………………………………..200 ml
H2O………………………………………qsp 1 litre

# Ajouter 7,5 ml de SDS 10% à 1,5 ml de tampon de transfert juste avant utilisation.

MODE OPERATOIRE :

- Lorsque l’électrophorèse des protéines est terminée, récupérer le gel prisonnié dans
les deux plaques de verre et l’immerger dans du tampon de transfert pendant 15
minutes.
- Monter le gel en sandwich dans une cassette et remplir la cuve de tampon de
transfert de manière à recouvrir celle-ci. Placer la cassette dans l’appareil à
électrotransfert en orientant le gel face à la cathode.
- Laisser transférer pendant 45 minutes à 100 volts.

176
 ANNEXE 14 : REVELATION DES BANDELETTES DE
NITROCELLULOSE PAR IMMUNO-EMPREINTE = WESTERN BLOT

Cette manipulation permet d’identifier (et de semi-quantifier) différentes

protéines immunogènes pour lequel il existe des anticorps spécifiques in vivo. La
révélation de ces anticorps se fait par l’utilisation d’anticorps (anti-anticorps)
conjugués à une enzyme.

REACTIFS ET SOLUTIONS :

- Tampon Tris-HCl à pH=7,5

- Tampon TS (Tris 10 nM, NaCl 0,9%) ajusté à pH=7,5 par de l’HCl.
Tris…………………………………………………….1,2 g
NaCl…………………………………………………..9,0 g
H2O…………………………………………..qsp 1 litre

- Tampon TST (tampon Tris-HCl, 0,05% Tween, pH=7,5) = tampon de lavage????

Tween 20………………………………………500 ml
Tampon TS………………………………….1000 ml

- Tampon de saturation (TST-lait 5%) = tampon échantillon.

Lait déshydraté écrémé……………………5 g
Tampon TST………………………………….100 ml

MODE OPERATOIRE :

- A la fin de l’électrotransfert, immerger les membranes dans le tampon de saturation

et incuber toute une nuit à 4°C.
- Laver les membranes par du tampon Tris-HCl
- Diluer l’anticorps primaire dans du tampon TST-lait 5%, incuber toute la nuit (18
heures) à 4°C.
- Réaliser trois lavages successifs de 5 minutes chacun dans du tampon TST puis
diluer l’anticorps secondaire au 2000ème et incuber 2 heures à température ambiante.

177
 ANNEXE 15 : COMPOSITION DES MILIEUX DE
CULTURE.

MILIEU PC (Pomme de terre – Carotte) :

Réactifs :

- Pulpe de carotte…………………………………………………………………………………………………….20 g
- Pulpe de pomme de terre……………………………………………………………………………………..20 g
- Agar………………………………………………………………………………………………………………………….20 g
- Eau distillée………………………………………………………………………………………………………1000 ml

Technique :
- Eplucher et râper carottes et pommes de terre en spirale, faire macérer 20 g de
chaque pulpe dans 750 ml d’eau distillée pendant 1 heure puis porter à ébullition
pendant 5 minutes.
- Après avoir filtré sur une gaze, ajouter l’agar à ce filtrat, porter à ébullition pour
solubiliser l’agar et compléter avec la quantité suffisante pour 1000 ml d’eau distillée.
Ajuster le pH après autoclave à 5,6 (+ ou – 0,2)

MILIEU AU MALT ou A L’EXTRAIT DE MALT :

Réactifs :

- Extrait de malt………………………………………………………………………………………………………20 g
- Agar………………………………………………………………………………………………………………………….20 g
- Eau distillée………………………………………………………………………………………………………1000 ml

Technique :
- Additionner les différents réactifs à l’eau distillée, mélanger et porter à ébullition 1
à 2 minutes puis diminuer la température à 50-55°C et ajuster la pH, après autoclave,
à 7 (+ou – 0,2) qui est l’optimum des filamenteux (contre 6,2 à 6,5 pour les levures)..

178
 MILIEU PDA :

Réactifs :

- Potatoes Dextrose Agar (Difco 0013-15-8)…………………………………………………….39 g

- Eau distillée………………………………………………………………………………………………………..1000ml

Technique :
- Additionner les différents réactifs à l’eau distillée, mélanger et porter à ébullition 1
à 2 minutes puis diminuer la température à 50-55°C et ajuster la pH, après autoclave,
à 5,6 (+ou – 0,2).

Mode opératoire : Commun aux trois milieux.

- Le conditionnement et la stérilisation sont identique à savoir : répartition de

80 ml dans des flacons de 125 ml, puis autoclaver 20 minutes à 120°C, identifier et
dater les milieux (date de péremption de 2 ans après la fabrication) puis les stocker
au congélateur à -20°C.
- De même, à partir des milieux congelés, la répartition en tube ou en boite de
pétri est identique pour les trois milieux: placer un flacon de milieu dans une casserole
d’eau et faire bouillir. Lorsque le milieu est bien régénéré, le mettre au bain marie à
50°C puis répartir stérilement 6 ml par tube à bouchon à vis, (incliner immédiatement
pour obtenir une pente) ou 10 ml ? par boite de pétri. Identifier et dater (date de
péremption 3 mois après la répartition) puis stocker à +4°C. Enfin contrôler la stérilité
en plaçant ces milieux 48 heures à 37°C.

NB : Le milieu de Sabouraud que l’on a utilisé est un milieu commercialisé.

179
UNIVERSITE DE NANTES Année de la soutenance
FACULTE DE PHARMACIE 2003

Nom – Prénom : GENTILHOMME Hervé

Titre de la Thèse : La pénicilliose à Penicillium marneffei : Mise au point et

évaluation d’une approche de diagnostic sérologique.

Résumé de la Thèse : La pénicilliose à P. marneffei est une mycose émergeante chez le

VIH+ dans le Sud-est asiatique. Quelques cas importés ont été décrits. Notre travail
expose la mise au point d’une stratégie de diagnostic comportant une technique ELISA
de dépistage et un western blot de confirmation. L’utilisation d’un antigène
métabolique de P. marneffei confère au test ELISA, une sensibilité et une spécificité
élevée ainsi qu’un pouvoir discriminant au western blot. Ce dernier montre que
certaines bandes ont une valeur prédictive importante. L’ELISA a été évaluée de façon
prospective à l’Institut d’Hygiène et d’Epidémiologie de Hanoï. Un cas
immunologiquement suspecté a été confirmé secondairement par une culture positive,
permettant le diagnostic du premier cas de pénicilliose au Vietnam.

MOTS CLES :
Sérodiagnostic/ pénicilliose / Penicillium marneffei / ELISA /
Western Blot / spécificité / diagnostic mycologique.

JURY
PRESIDENT :
Mme le professeur B.M. IMBERT, Laboratoire de Virologie- Nantes.
ASSESEURS :
Mr le Docteur P. LE PAPE, Laboratoire de Parasitologie-Nantes.
Mr le Professeur D. CHABASSE, Laboratoire de Parasitologie-Angers.
Mr le Professeur F. RAFFI, Médecine Interne B-Nantes.
Mr le Docteur M. MIEGEVILLE, Laboratoire de Parasitologie-Nantes

Adresse de l’auteur :
6 bis Cité Kerloët 56500 LOCMINE

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