Institut des techniciens spécialisés en agriculture de Tétouan

Thème:

Réalisation de la pratique du métier dans le contrôle des établissements

agroalimentaires

Réalisé au sein de:

Office National de Sécurité Sanitaire Des Produits Alimentaire De Tanger

ENCADRE PAR: MLLE HAJAR HACHOUM,

REALISE PAR: JANNATE CHABANA
AYOUB ROUIHNI MR MOHAMMED BENLGHAI, ET

MLLE IBTISSAM EL MAGHNINE

1
 DEDICACE

Nous dédions ce travail :

A nos parents, respect, amour et reconnaissance sont les moindres sentiments que nous
puissions vous témoigner. Aucune dédicace ne saurait exprimer notre respect, notre considération et
notre grande admiration. Que dieu vous garde.

A nos formateurs, qui nous ont dirigé vers le chemin de succès. Leur compréhension et leurs conseils
nous ont permis de mieux apprécier la formation disposée à l’ITSA de Tétouan.

A tous ceux qui nous aiment et tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de notre
stage.

2
 REMERCIEMENT

Au terme de ce travail, il nous est particulièrement agréable d’exprimer notre reconnaissance

et notre vif remerciement à toutes les personnes qui ont contribué à la réussite de cette expérience,
principalement :

Monsieur le directeur EL MAADOUDI MOHAMMED pour son accueil au sein du laboratoire d’Analyses
et de Recherches de Tanger, section de microbiologique alimentaire et physique-chimie et pour
l’opportunité qu’il nous a offerte à travers ce stage pour acquérir une enrichissante expérience
pratique.

Madame BOUCHRA EL MEFADEL, pour la confiance qu’elle nous a accordée tout au long de ce travail,
sa disponibilité sa rigueur, ses précieux conseils méthodologiques et cognitifs qui nous ont permis de
progresser dans de nombreux domaine et ont grandement contribué à la qualité du travail accompli.

Mlle Hajar Hachoum, Mr Mohammed Benlghai, et Mlle IBtissam El Maghnine les responsables à la
section microbiologique, pour les conseils précieux, la disponibilité et la patience dont nous avons
bénéficiés pour bien préparer ce travail, et nous les remercier d’avoir guidé notre première pas dans
le domaine de la recherche, de leur assistances pour la réalisation de ce travail et de leur constante
disponibilité.

Nos vifs remerciements vont également à tous les enseignants et responsables administratifs de L’ITSA
DE BEN KARRICH.

3
 Table des matières
INTRODUTION ......................................................................................................................................... 5
Cahier journal.................................................................................................. Erreur ! Signet non défini.
I. PRESENTATION DE L’UNITE ........................................................................................................ 9
1. Sa localité dans la région ........................................................................................................ 9
2. Sa relation avec le milieu environnant .................................................................................. 9
3. Description de l’unité : ........................................................................................................... 9
II. Description des activités de stage ............................................................................................ 14
Les analyses microbiologiques : ........................................................................................................... 14
1. Milieu de culture ................................................................................................................... 14
2. Les types des milieux de culture .......................................................................................... 14
3. Préparation des milieux de culture ...................................................................................... 14
III. La recherche des bactéries dans les produits alimentaires ................................................. 17
1. La recherche des Salmonelles : ............................................................................................ 17
2. La recherche de la Listeria Monocegenes : .......................................................................... 20
3. Dénombrement de staphylococcus aureus ......................................................................... 22
4. Le dénombrement d’E. Coli, coliformes totaux et fécaux, les entérobactéries, et FMAT
(technique d’ensemencement en profondeur) ........................................................................... 23
Les analyses chimiques ......................................................................................................................... 27
I. Dosage d’Histamine : ................................................................................................................ 27
1. Préparation d’échantillon..................................................................................................... 28
2. Purification d’histamine ....................................................................................................... 28
3. Complexation d’histamine ................................................................................................... 29
4. Expression des résultats : ..................................................................................................... 30
II. Dosage de Dioxyde de soufre (SO2) ......................................................................................... 31
1. Préparation des échantillons................................................................................................ 31
2. Entrainement ........................................................................................................................ 32
3. Titrage ................................................................................................................................... 33
III. Hygiène, sante et sécurité en milieu de travail ................................................................... 33
1. Les précautions hygiéniques ................................................................................................ 33
IV. Evaluation de la gestion des risques .................................................................................... 35
V. Le nettoyage et la désinfection des locaux et des matériels .................................................. 36
1. Entretien du matériel et locaux :.......................................................................................... 36
2. Nettoyage et désinfection des locaux .................................................................................. 36
3. Nettoyage et désinfection des matériels : ........................................................................... 36
Conclusion ............................................................................................................................................. 37

4
 INTRODUTION

Garantir la sécurité et la qualité des aliments a été pendant longtemps un problème majeur de
plusieurs sociétés, qui font appel aux laboratoires des analyses agroalimentaire pour répondre aux
exigences des consommateurs concernant la salubrité des produits de consommation.

La maitrise de la qualité microbiologique de ces denrées alimentaire passe par un ensemble de

démarches (HACCP), et des analyses qui ont été souvent l’apanage de laboratoire spécialisent qui sert
à évaluer la qualité hygiénique, et de donner des résultats précis et faible pour la consommation
humaine.

L’analyse microbiologique s’avère, de ce fait indispensable dans la vie nutritionnelle d’un

individu. Il s’agit des normes, des référentiels communs, nationaux ou internationaux, indiquant un
ensemble des exigences spécifications, et des règles techniques dont m’objectif est d’assurer certains
caractéristiques des produits et la vérification de la conformité de nos aliments.

Ces analyses microbiologique et chimique visent à déterminer le nombre obtenu est toujours
comparé avec celui qu’il est accoutumé de considérer comme normal, selon un bulletin officiel et des
crinières microbiologiques et chimique préétablies.

5
 Cahier journal

La date Tache et opération

26/09/22  Visite générale dans le laboratoire de

Microbiologie d’ONSSA
 Observation la salle de milieux de
culture
27/09/22  Commencer à préparer les milieux de
culture (EPT, MKTTN, RVS)
28/09/22  Préparer les milieux de culture (BP, XLD
HEkTOEN)
29/09/22  Préparer les milieux de culture (ALOA,
PALCAM, PCA, VRBG)
30/09/22  Préparer les MD (L’eau demi fraser, B
Parker, VRBL, TBX)
01/10/22  Observation dans la salle des prises
d’essai (préparation d’échantillon)
02/10/22  Préparation d’échantillon (prise d’essai)
 Ensemencement
 Isolement
03/10/22  Préparation des échantillons
 Ensemencement, Isolement
 Enrichissement
04/10/22  Préparation des échantillons
 Enrichissement
 Lecture des résultats (observation)
05-07/10/22  Visiter l’audit
08-09/10/22  Repos

6
10/10/22  AId Al-Maoulid AnnaBoui
11/10/22  Visite générale dans le laboratoire
chimique
12/10/22  La connaissance de 2 départements :
-Le département des analyses de
concentration d’histamine
- Section de dosage dioxyde de souffre
13-14/10/22  Préparations des échantillons
 Purification d’histamine (observation)
15-16/10/22  repos
17/10/22  complexation (obserbation)
18/10/22  Préparation des échantillons
 Purification de l’histamine
19/10/22  Complexation de l’histamine
(observation)
20/10/22  Préparation des échantillons
 Purification de l’histamine
21/10/22  Complexation de l’histamine
(observation)
 Lecture des résultats dans le
spectromètre (observation)
22-23/10/22  repos
24/10/22  Préparation des échantillons
 Purification de l’histamine
25/10/22  Complexation de l’histamine
 Lecture des résultats dans le
spectromètre (observation)
26/10/22  Préparation des échantillons de SO₂
(crevette)

7
27/10/22  Préparation des échantillons de dioxyde
de soufre
 Distillation
 Titrage
28/10/22  préparation des échantillons de SO₂
 Distillation
 Titrage
29-30/10/22  repos
31/10/22  Préparation des échantillons
 Purification de l’histamine
01/11/22  Complexation d’histamine
02/11/22  préparation des échantillons (sardine)
 Purification d’histamine
03/11/22  Complexation de l’histamine
(observation)
 Lecture des résultats dans le
spectromètre (observation)
04/11/22  Préparation d’échantillon (prise d’essai)
 Ensemencement
 Isolement
05-06/11/22  repos
07/11/22  Préparation des échantillons (fromage)
 Enrichissement
 Lecture des résultats
08-10/11/22  préparation des échantillons
 ensemencement
 isolement
11/11/22  lecture des résultats
12-17/11/22  préparation du milieu de culture
MKTTN/ RVS/ HEKTOEN/ XLD/ALOA
17-23/11/22  les analyses microbiologiques sur le
fromage
24/11/22  Repos

8
 I. PRESENTATION DE L’UNITE

1. Sa localité dans la région

On a effectué notre stage au sein de laboratoire

régional d’analyse et de recherche ONSSA (l’office
national de sécurité sanitaire des produits
alimentaires) est une organisation publique
marocaine responsable de la sécurité sanitaire des
produits alimentaires et de la conformité des
aliments importés au MAROC. Il est placé sous la
tutelle du le ministère de l’agriculture et de la pêche
maritime, du développement rural et des eaux et
forêts.

Figure N°1 : Localisation de laboratoire des

analyses et de recherches de Tanger

2. Sa relation avec le milieu environnant

Unité de chimie analytique

Contrôle de la qualité chimique des aliments et recherche sur la composition chimique de denrées
alimentaires (laits et produits laitiers, viandes et produits carnés et produits à la base de poissons ;
conserves et semi-conserves, etc…)

3. Description de l’unité :

9
 Direction régionale de l’ONSSA
Tanger- Tétouan

Direction du LRAR de Tanger

Comite technique Commission qualite

Responsable Réception des Responsable qualite Metrologie et

échantillons Facturation et remise Maintenance
des Rapport d’essai

Section Santé Animal Section Microbiologie Section Chimie

et Vegetale Alimentaire Alimentaire

Figure N°2: plan schématisé de l’organigramme du laboratoire

10
Matériels description et utilité Nombre Etat Entretiens
Est un outil qui sert à prélever un - Bien -
liquide, puis a le transférer d’un
contenant dans un autre.

Pipette
Est un récipient utilise en - Bien -
laboratoire, composé d’un tube
cylindrique étroit.

Tube
Boite de pétri Est utilisée en microbiologie pur la - Bien -
mise en culture de
microorganisme, de B ou de
cellules d’organismes supérieurs

vortex Est un matériel utilisé pour 9 Bien

mélanger des solutions,
notamment dans des micros tube.

Stomacher Broyeur à double action de 2 Bien

malaxage et d’agitation pour
l’homogénéisation des
échantillons directement dans ses
sachets stériles.
Spatule Est un outil permettant de Bien
prélever une quantité de matière.

Anse stérile On utilisé pour l’isolement des Bien

germes pathogènes

11
Bec Bunsen Est un appareil de laboratoire on 3 Bien
utilise pour la stérilisation du
matériel et pour laisser le champ à
travailler stérile.

Flacon On utilise pour porter à ébullition Bien

et conserver les milieux de culture.

Etuve Incubation des milieux cultures et 10 Bien

stérilisation des verreries.

Balance Mesure de pois 5 Bien

Autoclave Est utilisé pour la stérilisation par 2 Bien

traitement thermique à la vapeur
d’eau

La Hotte Filtration de l’air et stérilisation le 6 Bien

milieu de travail

Congélateur Congélation des produits analysés. 5 Bien

12
Bain marie Utilisée pour chauffage des milieux 4 Bien

Réfrigérateur Conservation des produits 2 Bien

analysés à basse Température.

Agitateur magnétique Est un élément d’une unité de 1 Bien

procédé ayant pour assurer
l’homogénéisation d’un milieu
d’une façon automatique.

Etaleur On utilise à l’ensemencement Bien

surface pour étalonner
l’échantillon.

Micro pipette Les micropipettes permettent de Bien

prélever et de transférer des
volumes très faibles de liquide
avec une grande précision

Ph metre Est un souvent électronique, 3 Bien

permettant la mesure du PH d’une
solution.

Broyeur Appareil très important pour 1 bien

electrique
moudre la viande, des légumes,
menager
des assaisonnements, des
céréales, etc.

Homogeneisateur est un appareil qui consiste à 2 bien

rendre homogène deux matières,
c'est-à-dire à les mélanger
efficacement

13
 II. Description des activités de stage

Les analyses microbiologiques :

Les analyses microbiologiques de tous les produits ont été réalisées selon les normes
marocaines en vigueur relatives à chaque microorganisme. La majorité des étapes a été faite sous la
hotte à flux lumineux et à côté de bec bunsen pour éviter toute les contaminations extérieur.

1. Milieu de culture
Introduction :

Un milieu de culture constitué à partir de substances biologiques ou chimiques reproduit un

environnement favorable (PH, Pression) a la culture d’un certain type de microorganisme.

2. Les types des milieux de culture

 Milieux sélectifs :

Comme leur nom l’indique, ils offrent de développement de façon exclusive d’un
microorganisme parmi tant d’autres présents. Ces milieux permettent l’isolement et la sélection d’un
germe précis en se basant sur des caractères biochimique révèle suite à un ensemble de test. La
synthèse des résultats permet l’orientation et surtout l’identification du germe.

 Milieux non sélectifs :

Contrairement aux précédents, il n’y a pas de molécule inhibitrice ou sélective comme les
antibiotiques. Ces milieux contiennent tous les constituants de base permettant la multiplication des
germes microbiens. A préciser que les milieux standards peuvent être enrichis.

 Milieux d’enrichissement :

Donne des conditions favorable à la croissance d’un seul microbe donne ce qui en favorise la
multiplication.

3. Préparation des milieux de culture

Tableau 1 : Type des milieux de culture

Milieu de culture Micro-organisme Mode opératoire

EPT  Dilution  Mettre en solution 20g dans 1L d’eau
(Eau Peptonee  Pré-enrichissement distillée
Tamponnée) des Bactéries

14
  Agiter lentement jusqu’à dissolution
complète.
 Stériliser a l’autoclave à 121 °C pendant
15min
 Refroidir a la T ambiante
Palcam Agar  Listeria  Mettre en solution 35,3g dans 500 ml
Base Monocytogenes d’eau distillée
 Homogénéiser dans le bain marie
 Autoclaver a T de 121 °C pendant 15 min
 Ajouter un supplément sélectif
 Bien mélanger et couler en boite de pétri
stériles.
ALOA  Listeria  Mettre en solution 35,3g dans 500ml
(Agar Listeria Monocytogenes d’eau distillée
selon Ottaviani et  Autoclaver a T DE 121 °C pendant 15 min
Agosti)  Homogénéisation dans le bain marie
 Ajouter un suppl. sélectif
MKTTN  Salmonelle  Mettre en solution 55 g dans 500ml
(Muller- d’eau distillée.
Kauffmann au
Tetrathionate et  Ajouter 5ml d’iodine au milieu
Novobiocine)  Bien homogénéiser l’ensemble
 Couler sous la hotte dans les tubes.
Bouillon Demi  Listeria  Ajouter 57,4 g de BDF dans un litre d’eau
Fraser Monocytogenes distillée, après en mélange le B dans
l’agitateur.
 Stériliser en autoclave à 121°C pendant
15 min.
 Ajouter 5 ml de supplément de citrate
d’ammonium ferrique.
 Bien homogénéisation et distribuer dans
les récipients stériles.
HEKTOEN  Salmonelle  Mettre 76,6 g de HEKTOEN dans un
flacon de 1L d’eau distillée.

15
  On homogène la solution dans solution
dans le bain marie
 On coule la gélose dans les boites de
pétri.
RVS  Salmonelle  Verser 26,6 g de poudre dans un litre
(Rappaport d’eau distillée.
Vassiliadis Soja)  Repartir 10 ml en flacons ou en tubes.
 Stériliser 15 min à 121 °C à l’autoclave
XLD  Salmonelle  Mettre 54,9 g de POUDRE D’ XLD dans
un flacon de 1L d’eau distillée.
(Xylose Lysine
Desoxycholate)  Homogénéiser la solution dans le bain
marie
 Couler la solution dans les boites de
pétri directement après le sort de bain
M
Baird-Parker  Staphylococcus  Verser 50 g de poudre dans un litre
aureus
d’eau distillée.
 Stériliser 15 min à 121 °C à l’autoclave.
 Ajouter 5 ml de supplément de jaune
d’œufs
 Bien homogénéiser l’ensemble
 Couler sous la hotte dans les boites de
pétri.
VRBG  Les entérobactéries  Verser 41,5 g dans un 1L d’eau distillée

(Violet Red Bile  Homogénéisation

Glucose Agar)  Ne pas autoclaver
 Bien mélanger et repartir en les boites
de pétri.
VRBL  Coliformes totaux  Verser 41,2 g dans un 1L d’eau distillée
et fécaux  Homogénéisation
 Autoclaver a 121 °C pendant 15 min
PCA  Comptage de  Mettre dans un 1L 23g du poudre de PCA
colonies  Agiter la solution

16
  Repartir en flacons
 Autoclaver a 121 °C pendant 15min
TBX  Escherichia coli  Mettre dans 500ml d’eau distillée 18,3
g de la poudre de TBX
(Tryptone Bile X
Glucuronide)  On le met dans le bain marie
 Autoclaver a 121 °C pendant 15min

Tableau 2 : tableau récapitulatif des propriétés des milieux de culture utilisés au sein de la
section microbiologique
Milieu Type Fonction Organisme ciblé T° Durée
d’incubation d’incubation
EPT Bouillon Non sélectif Tous les 37 °C 18H
microorganismes 24H
D FRASER Bouillon Sélectif Listeria 37 °C 24H
RVS Bouillon Sélectif Salmonelle 41,5 °C 24H
MKTTN Bouillon Sélectif Salmonelle 37 °C 24H
48H
VRBG Gélose Sélectif Entérobactéries 37 °C 24H
TBX Gélose Sélectif E. Coli 44 °C 21H
VRBL Gélose Sélectif Bactéries 30 °C 24H
coliforme totaux 44 °C
B. P Gélose Sélectif Staphylocoques 37 °C 48H
PALCAM Gélose Sélectif Listeria 37 °C 48H
ALOA Gélose Sélectif Listeria 37 °C 48H
XLD Gélose Sélectif Salmonelle 37 °C 24H
HEKTOEN Gélose Sélectif Salmonelle 37 °C 24H
PCA Gélose Non sélectif Tous les 30 °C 72H
microorganismes

III. La recherche des bactéries dans les produits alimentaires

1. La recherche des Salmonelles :

La recherche de salmonelle se réalise en quatre étapes :

 Pré enrichissement.

17
  Enrichissement en milieu sélectif.
 Isolement et identification.
 Confirmation.
 Pré-enrichissement :

On prend 25g de l’échantillon à analyser qu’on fait introduire dans un bocal contenant 225 ml

D’eau peptonée tamponnée. Ceci doit se faire aseptiquement à côté du bec benzène.

L’échantillon est incubé pendant 24h à 37°C. Cette étape favorise la récupération et la croissance des
salmonelles.

 Enrichissement en milieu sélectif :

Cette étape permet la multiplication de la salmonelle même en présence des autres

Microorganismes concurrents. Nous avons utilisé pour cette étape deux bouillons RVS et

MKTTN.

Avec une pipette stérile, transférer 1,0 ml de la culture de pré-enrichissement dans 9 ml de

Bouillon de MKTTN. Incuber ce bouillon pendant 24 h à 37°C. On refait la même chose mais cette fois
ci on change le bouillon et on utilise le bouillon RVS, on prend 0,1ml de la culture pré-enrichie, puis
incubé pendant 24h à 41,5°C.

Cette étape favorise le développement des salmonelles tout en retardant ou inhibant la croissance
des micro-organismes compétiteurs.

Figure N°3: Etapes d’enrichissement de la salmonelle.

18
  Isolement de la salmonelle :

L’isolement se fait sur 2 boites des 2 milieux XLD et HKTOEN.

Ensemencer en stries une anse de chaque culture d'enrichissement sélectif sur une gélose XLD et sur
une gélose HEKTOEN de façon à obtenir des colonies bien isolées.

Les cultures d'enrichissement peuvent également être ensemencées en stries sur d'autres géloses pour
l'isolement de Salmonella.

Incuber les boites de pétri pendant 24h à 37°C.

Après incubation, inspecter les boîtes pour déceler la présence de colonies de Salmonella. Sur milieu
XLD, les colonies de salmonelles sont de couleur rouge à centre noir. Sur le milieu HEKTOEN, elles sont
de couleur verte à centre noir.

Figure N°4 : Méthodes d’ensemencement en surface à partir d’un bouillon RVS et MKTTN.

 Lecture et identification :

L’identification des Salmonelles se fait à l’aide d’une galerie qui s’appelle la galerie API, cette
dernière Permet la confirmation des colonies suspectes qui apparaissent sur la gélose sont bien de la
salmonelle ou non

19
 Figure N°5: La galerie API 20E

 Lecture

Figure N°6 : Présence de salmonelle Figure N°7: Présence de salmonelle sur le

sur le milieu HEKTOEN milieu XLD

2. La recherche de la Listeria Monocegenes :

La recherche de la bactérie de Listeria se réalise en quatre étapes qui sont les suivantes :

 Le pré-enrichissement.
 L’enrichissement secondaire.
 L’isolement de la listeria26
 L’identification et la confirmation.

 Le pré-enrichissement
 Mettre 25g dans 225ml de bouillon demi fraser
 Mettre le sachet dans le stomacher pour l’homogénéisation
 Laisser le sachet 30 min (étape de repos de la suspension mère)
 Incuber le sachet (pré-enrichi) dans une étuve de 30C pendant 24h

20
  L’enrichissement secondaire

Ensemencement du bouillon fraser 10ml avec 0,1 de culture obtenu à partir de l’enrichissement
primaire et incubation pendant 24h à 37°C

 Premier isolement

A partir de l’enrichissement primaire réaliser

l’isolement sur deux géloses : ALOA et PALCAM, incuber
les boites pendant 48h a 37°C

 Deuxième isolement

A partir de l’enrichissement secondaire réaliser

l’isolement sur deux géloses : ALOA et PALCAM, incuber
les boites pendant 48h a 37°C

Figure N°8: L’isolement dans la gélose PALCAM

 La confirmation

Gélose ALOA colonies Gélose PALCAM :

vert entoure d’un halo colonies noirs entoure
opaque d’un halo noir

Figure N°9: listeria sur un milieu d’ALOA Figure N°10: Listeria sur un milieu de PALCAM

21
 3. Dénombrement de staphylococcus aureus
Le dénombrement de Staph se réalise en quatre étapes :

 Prélèvement
 Ensemencement
 Confirmation

 Prélèvement

 On pèse 25g d’échantillon +250 ml de l’eau peptonné tamponné.

 Mettre le sachet dans le stomacher pour l’homogénéisation
 Laisser le sachet 30 min (étape de repos de la suspension mère)

 Ensemencement

 Transférer à l’aide d’une pipette stérile à la surface d’une boite de Baird Parker 1ml de pré
enrichi
 Répartir l’inoculum à la surface de milieu BP a l’aide d’un étaleur stérile
 Laisser sécher les boites pendant environ 15min à la température ambiante
 Incuber les boites 24h à 37 °C

Figure N°11: Etalonnage d’échantillon sur le milieu de BP

22
 Aspect caracteristique

Colonies Non Caracteristiques (CNC) Colonies Caracteristiques (CC)

4. Le dénombrement d’E. Coli, coliformes totaux et fécaux, les entérobactéries, et FMAT

(technique d’ensemencement en profondeur)

Un ensemencement en profondeur est le plus souvent réalise afin de dénombrer des micro-
organismes. Un volume de 1ml d’inoculum est disperse dans le fond d’une boite de pétri, et le
milieu de culture est ensuite coule par-dessus

Figure N°12: Technique d’ensemencement en profondeur

23
 Définition de chaque type de bactéries
 Escherichia coli : est une bactérie (gram négatif) en forme de bâtonnet, très commune chez
l’être humain. E .coli est une B anaérobie facultative que l’on trouve dans l’intestin des
vertébrés.
 Les coliformes : décrivent des bactéries à coloration de gram négatif, ce sont des bacilles non
sporulant, donnant une réponse négative au test a l’oxydase, aérobies ou anaérobies
facultatives.
 Les entérobactéries : sont des bacilles gram négatif retrouves partout dans le sol, dans l’eau
et surtout dans l’intestin de l’homme et animaux, immobiles ou mobiles par ciliature
peritriche, aero-anaerobies, non sporulés.
 La flore mésophile aérobie totale(FMAT) : est un indicateur sanitaire qui permet d’évaluer le
nombre d’UFC (Unité Formant une Colonie) présentes dans un produit ou sur une surface
 Mode opératoire

Mode operatoire

Si l’echantillon solide Si l’echantillon liquide

Mettre 10g dans 90ml de l’eau peptone

L’ensemencement direct
tamponnée.

Mettre le sachet dans le stomacher pour

l’homogénéisation

Laisser le sachet (pré-enrichi) 30min

étape de repos de la suspension mère

24
 Ensemencement

Transférer à l’aide d’une pipette stérile 1

ml de pré-enrichi dans une boite de pétri
vide, puis mélanger a un milieu gélosé

Laisser sécher les boites pendant

environ 15min à la température
ambiante.

Ajouter une deuxième couche de milieu

gélosé

Figure N°13: les étapes du l’ensemencement

 l’incubation et milieu de culture de chaque bactérie

Escherichia coli Coliformes Les enterobacteries FMAT

Gelose TBX Gelose VRBL Gelose VRBG Gelose PCA

Pour C.T incuber

Incuber les boites les boites à 30°C Incuber les
à 44°C pendant Incuber les boites à
pendant 24h boites à 30°C
24h 37°C pendant 24h
pendant 72h
Pour C.F incuber à
44°C pendant 24h

25
 La Confirmation :

Figure N°14: l’aspect des colonies E. Figure N°15: L’aspect des colonies
Coli sur la gélose TBX coliformes sur la gélose VRBL

Figure N°16: l’aspect des colonies Figure N°17: l’aspect des colonies
caractéristiques des entérobactéries caractéristiques du FMAT sur la gélose
sur le milieu VRBG PCA

26
 Les analyses chimiques
La chimie alimentaire est la branche de la
chimie qui étudie la composition des aliments et
leur évolution au cours de la fabrication, du
stockage, de la préparation et de la digestion.

Elle s’intéresse aux réactions chimiques

impliquant les substances présentes dans les
aliments.

I. Dosage d’Histamine :

L’intoxication histaminique, résulte de la dégradation de l’histamine présente chez le

poisson en histamine par décarboxylation (réaction chimique) sous l’action d’enzymes
bactériennes.

Principe

La méthode consiste en l’extraction de l’histamine par une solution d’acide

trichloracétique TCA, purification sur résine échangeuse de cation, élution par

L’acide chlorhydrique et dosage par spectrofluorimétre après Complexation de

L’histamine avec l’orthophtalaldéhyde l’OPA.

27
1. Préparation d’échantillon
 on prélève 10g de la chair pour chaque individu de l’échantillon après homogénéisation dans
un broyeur (l’analyse est réalisée sur la partie comestible)
 Chaque prélèvement est mélangé avec 90ml de solution TCA à 10% (pour précipiter les
protéines)
 Homogénéiser pendant deux minutes
 Filtrer le mélange sur papier filtre.
 Une fois la filtration terminée, la partie liquide des neuf filtrats est récupérée des tubes de
10ml

Figure N°18: les étapes de préparation d’échantillon d’histamine

2. Purification d’histamine
Dans un bécher placer :
 20ml de la solution tampon acétate (PH normal : 4.62)
 0.2ml du filtrat (L’extrait trichloracétique)
 Transférer dans la colonne
 Rincer le bécher avec 30ml de la solution tampon acétate
 Faire écouler le liquide au débit de 10gouttes/min
 Laver la colonne deux fois avec 50ml de la solution tampon
 Eliminer les solutions de lavage
 Eluer l’histamine retenue dans la colonne avec 20ml de HCL 0.2N et Recueillir l’éluas dans un
tube de 25ml

28
 Figure N°19: Les étapes de purification

3. Complexation d’histamine
Transférer 2 ml d’éluas dans un tube de 10 ml. Ajouter
dans l’ordre avec agitation après chaque addition.

 1 ml d’hydroxyde de sodium NaOH 1N favorise la

réaction : le milieu doit être basique pour que
l’histamine fixe sur l’OPA
 0.1ml de l’OPA 1% la formation d’une molécule
chromophore après 3 min 30 s. Stopper la réaction
avec 2 ml d’HCL 0,7 N. Figure N°20: l’eluas dans les tubes

Traiter dans les mêmes conditions :

 2 ml d’HCL 0,2 N ; La valeur obtenue par ce dernier sera considéré comme blanc pour les
échantillons
 2ml de la solution étalon ; la valeur obtenue par ce dernier sera considérée comme standard
directe.
 Mesurer la fluorescence à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission respectives de 360
et 450 nm à l’aide du spectrofluorimétre préalablement étalonné en mode LINEAIR.

29
 4. Expression des résultats :
Les résultats sont exprimés en ppm ou mg d’histamine par 1 kg de produit.

 Etalonnage de spectrofluorimètre

Régler la spectrofluorimètre à des longueurs d’onde

d’excitation et d’émission respectives de 360 et 450
nm et mesurer en mode LINEAIR d’au moins 4 des 5
solutions de la gamme étalon préparée comme suit
: Figure N°21: La spectrofluorimetre

Blanc 1 2 3 4 5

Tube n°

Niveaux des 0 12,5 25 50 100 200

concentrations des
solutions de la
gamme
étalon préparée
(exprimés en µl de
solution étalon
niveau 20 20 20 20 20 20
d’affleurement
par HCL 0.2N (7.5)
(ml)
Concentration 0 12,5 25 50 100 200
finale en
équivalent mg
histamine/kg
d’échantillon

30
II. Dosage de Dioxyde de soufre (SO2)

Le dioxyde de soufre (SO2), un gaz sans couleur et avec une odeur forte, qui est utilisé dans
l'industrie alimentaire comme conservateur (antiseptiques et anti-oxydantes).

Le nom commun d'un conservateur qui est utilisé pour l'étiquetage des produits contenant
du Dioxyde de soufre

Celui-ci doit être utilisé en quantités très limitées sinon il est responsable d’odeurs et de
goûts désagréables, il peut favoriser certains troubles au cours du vieillissement et par
ailleurs, il est toxique

Principe

Cette méthode se base sur l’entrainement par courant d’azote le dioxyde de soufre extrait à
partir du produit acidifié et chauffé, sa fixation et son oxydation par barbotage dans une
solution neutre diluée de peroxyde d’hydrogène puis le dosage de l’acide sulfurique formé par
une solution titrée d’hydroxyde de sodium

1. Préparation des échantillons

L’analyse s’effectue sur des échantillons et décortiqués broyés.

 Peser 100 g de crevettes croutées et compter le nombre d'unités pour connaître le nombre
d'unités/ kg.
 Décorticages des crevettes
 Broyage des crevettes crues
 Peser 50 g de crevettes décortiquées (prise d’essai)
 Ajouter 95 ml d’eau distillée contenant 5% d’éthanol.
 Mélanger à l’aide de baguette en verre avant d’introduire homogénat dans le ballon

31
 Figure N°22: l’étape de prise d’essai de la crevette

2. Entrainement
 Ajouter dans Ampoule d’incubation (A) 90
ml HCL (33%) : acidifier de milieu.
 Mettre dans le barboteur (B) 30 ml H₂O₂ +
0.1 ml de méthyle (indicateur coloré) +
0.01 ml de NaOH (neutralisation).
 Remplacé le ballon (C) Dans le montage
 Faire écouler dans le ballon la solution
diluée d’HCl à 33% contenue dans
l’ampoule.
 On Fait circuler un courant d'azote pour
chasser l'air contenu dans le ballon et
l'ensemble du dispositif.
 Vérification de l’eau (début)
(réfrigérateur)
 Ampoule à Barbotage (80-90 gouttes /min)
 Activer la chauffe ballon Figure N°23: montage de SO₂

 Ouvrir l’azote
 Attendre 1h45min

32
 3. Titrage
Après la distillation d’échantillon ; Titrer l’acide sulfurique formé par une solution d’hydroxyde sodium
NAOH 0.01N ou 0,1N si nécessaire.

Figure N°24: Titrage par NAOH

III. Hygiène, santé et sécurité en milieu de travail

1. Les précautions hygiéniques

Les règles générales des précautions hygiéniques prise
lors de l’exécution des analyses afin d’éviter les risques
de contamination et de réduire tous les facteurs
pouvant influencer sur ces analyses :

Figure N°25: Hygiène et sécurité

Principales taches Bonne pratiques pour assurer l’hygiène, la

sante la sécurité du manipulation
 Porter une blouse en coton et à manches
longues et une coiffe
Avant l’analyse  S’assurer que la zone de travail est
propre

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  Décontaminer la surface de travail avec
un désinfectant approprié
 Eviter les déplacements
 Procéder à la pesée des échantillons
dans l’ordre du produit le moins
contaminé au produit le plus contaminé
 Ouvrir les tubes à essais et les flacons à
proximité d’une flamme
Pendant l’analyse  Effectuer le travail le plus rapidement
possible sans faire de mouvements
inutiles
 Placer les pipettes, spatules, pipette
pasteur dans des récipients spécifiques
contenant un désinfectant
 Placer les boites de pétri, milieux de
culture et tout autre matériel dans des
récipients spécifiques avant la
Apres l’analyse décontamination
 Placer le matériel à usage unique dans
des récipients appropriés avant la
décontamination
 Le port des bijoux est strictement
interdit au laboratoire
 Ne pas manger, ne pas boire, ni fumer
dans le laboratoire
En tous le temps  Repérer les issues et dégagements
 Repérer les extincteurs et apprendre à
les utiliser
 Avant de quitter le laboratoire, se laver
les mains et ôter les vêtements de travail

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IV. Evaluation de la gestion des risques

Question relatives à la gestion des Oui Non Observation commentaire

risques professionnels
Les dangers sont-ils clairement identifiés  Ils sont évidents partout
par des panneaux d’avertissement ? dans le laboratoire
Les manipulateurs sont-ils équipés des  Tous les manipulateurs sont
équipements de protection individuelle équipés des équipements
? de protection individuelle
Existe-t-il des équipements de  Le laboratoire contient des
protection collective ? équipements de protection
collective.
Le matériel et l’équipement de travail  Tout le matériel et
sont-ils munis des dispositifs de sécurité l’équipement de travail
? munis des dispositifs de
sécurité.
Existe-il un responsable de secours sur  le responsable de secours
le lieu de travail ? est présent tous les jours
sur le lieu de travail.
Existe-il des procédures relatives en cas  tout est précis dans une
d’urgence et/ou accidents ? procédure d’instructions
Les trousses de premiers soins de  Ils sont situés dans un
secours sont-elles disponibles ? endroit où tout le monde
peut l’obtenir facilement.
Existe-t-il des bacs par catégories des  Tous les déchets sont jetés
déchets ? au même bac.

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 V. Le nettoyage et la désinfection des locaux et des matériels

1. Entretien du matériel et locaux :

Le nettoyage des locaux et matériels doivent être effectués par des personnes qualifiées, qui ont reçu
une formation appropriée afin qu’aucune pratique n’influence la valeur des résultats d’analyse.

2. Nettoyage et désinfection des locaux

Surfaces Etapes Actions

Locaux (sols, murs, portes, Préparation Evacuation des déchets
fenêtre) dégagement des supports
Structures (tables, Enlèvement des souillures
paillasses, armoires) grossières
Sanitaires (vasque, robinets, Nettoyage Eau+ détergent+ action
toilette) mécanique
Rinçage Eau clair
Désinfection Eau+ désinfectant+ temps
d’action
Séchage Raclette (sols), papier à
usage unique (surface)

3. Nettoyage et désinfection des matériels :

Matériels Etapes Actions

Etuve, Bain d’eau, Préparation Vider l’enceinte
Autoclave Débrancher le matériel
Nettoyage Eau+ détergent+ action
mécanique
Rinçage Eau clair

Séchage Papier à usage unique

Désinfection Alcool

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 Conclusion
Un stage de formation reste toujours un point très fondamental pour découvrir le monde de travail
et de mettre en pratique les théories acquises.

D’une autre partie, lors de déroulement de mon stage au sein d’Office National de Sécurité Sanitaire
Des Produits Alimentaire De Tanger, j’ai acquis des connaissances techniques importantes en ce qui
concerne les analyses microbiologiques et chimiques des produits alimentaires à la consommation
humaine.

En fin, je recommande qu’ONSSA soit un milieu riche en information pour les stagiaires.

Je exprime également à toute l’équipe ma gratitude pour toutes ces journées passées ensemble et
souhaite à tous une très bonne continuation.

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