Iso 16266 2 2018

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ISO/TC 147/SC 4

Date : 2018-07

ISO 16266-2:2018 (F)


ISO/TC 147/SC 4
Secrétariat : DIN

Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas


aeruginosa — Partie 2 : Méthode du nombre le plus probable
Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Part 2: Most probable
number method

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aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par
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Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
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CH-1214 Vernier, Genève
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Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................. vi
Introduction .................................................................................................................................................................. vii
1 Domaine d'application...................................................................................................................................1
2 Références normatives ..................................................................................................................................2
3 Termes et définitions .....................................................................................................................................2
4 Principe ...............................................................................................................................................................3
5 Appareillage et verrerie ................................................................................................................................3
6 Milieux de culture, diluants et réactifs ....................................................................................................4
6.1 Substances de base ..........................................................................................................................................4
6.2 Diluant .................................................................................................................................................................4
6.3 Antimousse B.....................................................................................................................................................4
7 Échantillonnage................................................................................................................................................4
8
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Mode opératoire ..............................................................................................................................................4
8.1
8.2 (standards.iteh.ai)
Transport et conservation des échantillons ..........................................................................................4
Préparation de l'échantillon et ensemencement des milieux .........................................................5
8.2.1 Préparation des échantillons de 100 ml .................................................................................................5
8.2.2 Préparation des échantillonsISO de 250 ml .................................................................................................5
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8.3 https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/5ff03cfc-42cd-4bd7-ac40-9283f198f677/iso-
Incubation et différenciation ......................................................................................................................5
8.4 Examen des résultats .....................................................................................................................................6
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9 Expression des résultats ...............................................................................................................................6
10 Assurance qualité ............................................................................................................................................6
11 Rapport d'essai .................................................................................................................................................7
Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur Pseudomonas
aeruginosa ..........................................................................................................................................................8
Annexe B (normative) Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats ........................................................9
Annexe C (normative) Composition du milieu Pseudalert ...................................................................... 131
Annexe D (informative) Caractéristiques de performance ..................................................................... 132
Bibliographie ............................................................................................................................................................. 133

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ISO 16266-2:2018(F)

Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes


nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le
droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

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l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).

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Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
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Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
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spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant : www.iso.org/iso/fr/avant-propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.

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ISO 16266-2:2018(F)

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est un organisme pathogène pour l'homme, capable de croître dans l'eau à de
très faibles concentrations nutritives. Toute eau minérale naturelle et toute eau de source doivent être
exemptes de Pseudomonas aeruginosa à la source ainsi qu'à la date de commercialisation, dans 250 ml
d'échantillon examiné (voir, par exemple, la Directive du Conseil 2009/54/CE, Référence [1]). Les
autres eaux commercialisées en bouteille doivent aussi être exemptes de Pseudomonas aeruginosa,
dans 250 ml d'échantillon (voir, par exemple, la directive du Conseil 98/83/CE, Référence [2]). D'autres
eaux, dont les eaux de piscine et de spa, les eaux destinées à la consommation humaine et les eaux
destinées aux hôpitaux, peuvent parfois, pour des raisons de santé publique, faire l'objet d'une
recherche de Pseudomonas aeruginos. Des volumes de 100 ml sont alors généralement étudiés.

La méthode décrite dans le présent document peut être appliquée à différents types d'eau, par exemple,
les eaux destinées aux hôpitaux, l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la
consommation humaine, les eaux souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant
des nombres importants de bactéries hétérotrophes (voir Références [3], [4], [5], [6] et [7]).

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NORME INTERNATIONALE ISO 16266-2:2018(F)

Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas


aeruginosa — Partie 2 : Méthode du nombre le plus probable
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l'utilisateur de mettre en place des mesures de sécurité et d'hygiène appropriées.

IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais conduits conformément au présent
document soient réalisés par un personnel convenablement qualifié.

1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode permettant de dénombrer Pseudomonas aeruginosa dans
l'eau. Cette méthode se fonde sur la croissance d'organismes cibles dans un milieu liquide et le calcul du
nombre le plus probable (NPP) d'organismes en se référant aux tables du NPP.

Le présent document s'applique à différents types d'eau. Par exemple, les eaux destinées aux hôpitaux,
l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la consommation humaine, les eaux
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souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant des nombres importants de
bactéries hétérotrophes.
(standards.iteh.ai)
Le présent document ne s'applique pas aux eaux en bouteille gazéifiées, aux eaux en bouteille
aromatisées, aux eaux de tour de refroidissement ou à l'eau de mer, pour lesquelles cette méthode n'a
pas été validée. Par conséquent, cesISO eaux16266-2:2018
ne relèvent pas du domaine d'application du présent
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document. Les laboratoires peuvent utiliser la méthode présentée dans le présent document pour ces
matrices en prenant les mesures adéquates 16266-2-2018
de validation des performances de cette méthode avant son
utilisation.

L'essai se fonde sur une technologie de recherche des enzymes bactériennes qui signale la présence de
P. aeruginosa en hydrolysant un substrat de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans
un réactif spécial. Les cellules de P. aeruginosa se développent et se reproduisent rapidement à l'aide de
l'apport important en acides aminés, vitamines et autres nutriments présents dans le réactif. Les
souches de P. aeruginosa en développement actif présentent une enzyme qui dissocie le substrat de
7-amido-coumarine aminopeptidase, générant un produit qui présente une fluorescence sous une
lumière ultraviolette (UV). L'essai décrit dans le présent document fournit un résultat confirmé dans un
délai de 24 h sans avoir besoin de confirmer les puits positifs.

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ISO 16266-2:2018(F)

2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).

ISO 8199, Qualité de l'eau — Exigences et lignes directrices générales pour les examens microbiologiques
sur milieu de culture

ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture

ISO 19458, Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique

ISO/IEC Guide 2, Normalisation et activités connexes — Vocabulaire général

3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l'ISO/IEC Guide 2 ainsi que les
suivants, s'appliquent.
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(standards.iteh.ai)
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes :

— ISO Online browsing platform : disponibleISO


à l'adresse https://www.iso.org/obp
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— IEC Electropedia : disponible à l'adresse http://www.electropedia.org/./
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3.1
Pseudomonas aeruginosa
espèce de micro-organismes capable de se développer dans un bouillon sélectif et capable d'hydrolyser
un substrat de diagnostic de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans le réactif

Note 1 à l'article : Voir l'Annexe A pour des informations supplémentaires sur P. aeruginosa.

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ISO 16266-2:2018(F)

4 Principe
Un sachet de milieu déshydraté est ajouté à un échantillon d'eau (100 ml ou 250 ml), ou à une dilution
d'un échantillon complété à 100 ml. L'échantillon contenant le milieu est doucement agité pour garantir
un mélange adéquat et pour dissoudre le milieu. Lorsque le dénombrement est exigé, l'échantillon
contenant le milieu (100 ml) est versé dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray 1) ou un
Quanti-Tray/20001) pour dénombrer jusqu'à 201 organismes ou 2 419 organismes respectivement par
échantillon de 100 ml. Le mode opératoire pour le dénombrement des échantillons de 250 ml est décrit
en 8.2. Les plateaux sont étanchéifiés à l'aide d'une scelleuse Quanti-Tray1). Les Quanti-Tray1) ou flacons
(pour les essais de type présence/absence) sont ensuite incubés à (38 ± 0,5) °C pendant 24 h à 28 h. Les
résultats sont confirmés au bout de 24 h, mais peuvent être consultés jusque dans un délai de 28 h.

Après l'incubation, les puits d'échantillon des flacons ou des Quanti-Tray1) qui présentent un certain
degré de fluorescence bleue sous une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde (365 nm) sont
considérés comme étant positifs pour P. aeruginosa.

À l'aide de tables statistiques ou d'un simple programme informatique, le nombre le plus probable
(NPP) de P. aeruginosa dans 100 ml ou 250 ml d'échantillon peut être déterminé.

Cette méthode est également adaptée en tant que procédure qualitative.

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5 Appareillage et verrerie

(standards.iteh.ai)
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, le matériel ci-après.

5.1 Appareil de stérilisation à la vapeur (autoclave).


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Tout appareil ou toute verrerie fourni(e) non stérile doit être stérilisé(e) conformément aux
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instructions de l'ISO 8199.
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5.2 Four à air chaud, pour la stérilisation à la vapeur.

5.3 Incubateur, contrôlé par thermostat réglable à (38 ± 0,5) °C.

5.4 Scelleuse Quanti-Tray1) et insert en caoutchouc.

5.5 Flacons stériles à col large d'au moins 110 ml.

5.6 Lampe à rayons ultraviolets, 365 nm, 6 watt, grande longueur d'onde.

5.7 Quanti-Tray1) ou Quanti-Tray/20001), conformément à l'Annexe B.

1) Quanti-Tray est une appellation commerciale ou une marque déposée d'IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses
filiales aux États-Unis et/ou dans d'autres pays. Cette information est donnée à l'attention des utilisateurs du
présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve l'emploi du produit ainsi désigné.

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ISO 16266-2:2018(F)

6 Milieux de culture, diluants et réactifs

6.1 Substances de base

La méthode utilise Pseudalert 2), un milieu disponible sous la forme d'une poudre prête à l'emploi
répartie dans des sachets. Chaque sachet contient suffisamment de milieu (2,45 g pour des échantillons
de 100 ml) pour un seul essai. Pour le dénombrement quantitatif des échantillons de 250 ml, un sachet
de 2,45 g est ajouté à chaque aliquote d'échantillon divisé tel que décrit en 8.2. Il convient que le réactif
Pseudalert2) soit de couleur beige et fluide. Le milieu contient des nutriments tels que des acides aminés
et des vitamines, un tampon, du chlorure de sodium, du sulfate de magnésium, des indicateurs de
développement, des antibiotiques et des sources d'azote. Le milieu est conservé dans des conditions
ambiantes (2 °C à 30 °C) à l'abri de la lumière directe du soleil et il convient de l'utiliser avant la date de
péremption indiquée sur le sachet. Le réactif présente une durée de conservation de 12 mois à compter
de la date de fabrication.

La composition du milieu Pseudalert2) doit être conforme à l'Annexe C. Les caractéristiques de


performance pour la présente méthode sont fournies à l'Annexe D.

6.2 Diluant

Pour les dilutions à employer avec Pseudalert2), n'utiliser que de l'eau stérile, non inhibitrice et exempte
d'oxydants. L'utilisation de diluants à base d'eau saline ou peptonée tamponnée interfère avec les
performances de l'essai. iTeh STANDARD PREVIEW
6.3 Antimousse B (standards.iteh.ai)
Antimousse B utilisé comme une suspension de silicone hydrosoluble active à 1 %. Ce réactif est ajouté
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aux échantillons afin de réduire autant que possible la formation de bulles d'air pendant le mélange.
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NOTE Des flacons préremplis d'antimousse sont16266-2-2018
disponibles.

7 Échantillonnage
Procéder au prélèvement, à la conservation et à la manipulation des échantillons comme spécifié dans
l'ISO 19458.

8 Mode opératoire

8.1 Transport et conservation des échantillons

Il convient de transporter et de conserver les échantillons conformément à l'ISO 19458. Il convient de


commencer l'analyse le jour du prélèvement ou dans les 12 h qui le suivent. Dans certains cas

2)Pseudalert est une appellation commerciale ou une marque déposée d'IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses filiales
aux États-Unis et/ou dans d'autres pays. Cette information est donnée à l'attention des utilisateurs du présent
document et ne signifie nullement que l'ISO approuve l'emploi du produit ainsi désigné.

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ISO 16266-2:2018(F)

exceptionnels, les échantillons peuvent être conservés à (5 ± 3) °C pendant une durée maximale de 24 h
jusqu'à ce qu'ils soient examinés. Dans ce cas, le temps de stockage doit figurer dans le rapport d'essai.

8.2 Préparation de l'échantillon et ensemencement des milieux

8.2.1 Préparation des échantillons de 100 ml

Pour le dénombrement des échantillons de 100 ml, ajouter, dans des conditions aseptiques, un seul
sachet de milieu Pseudalert2) à chaque échantillon ou dilution d'échantillon de 100 ml dans un flacon
stérile et transparent, puis bien mélanger. Une fois que le milieu est complètement dissous, l'échantillon
contenant le milieu est versé dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray1) ou Quanti-
Tray/20001) puis étanchéifié à l'aide de la scelleuse Quanti-Tray1). Pour réduire au minimum la
formation de bulles d'air dans les puits, les échantillons peuvent être préparés dans des flacons
préalablement stérilisés contenant l'antimousse B. L'antimousse B peut aussi être ajouté dans chaque
flacon à l'aide d'un flacon compte-gouttes. Une autre méthode du NPP consiste à répartir l'échantillon
d'eau dans lequel le Pseudalert2) a été dissous dans des tubes stériles pour déterminer le NPP selon un
format NPP plus classique (par exemple, 1 × 50 ml et 5 × 10 ml).

NOTE Le mélange de réactif Pseudalert2) peut devenir trouble en raison de la teneur élevée en minéraux (en
particulier, magnésium et/ou calcium), mais cela n'affecte en rien le résultat de l'essai.

8.2.2 Préparation des échantillons de 250 ml


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Pour le dénombrement des échantillons de 250 ml, diviser l'échantillon dans trois flacons stériles et
(standards.iteh.ai)
transparents, de manière à obtenir deux échantillons avec des aliquotes de 100 ml et un échantillon
avec une aliquote de 50 ml. Compléter l'échantillon de 50 ml à 100 ml en ajoutant 50 ml d'eau stérile,
non inhibitrice et exempte d'oxydants. Ajouter, dans des conditions aseptiques, un seul sachet de milieu
Pseudalert2) à chacun des trois échantillons de 100 ml, puis bien mélanger. Une fois que le milieu est
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complètement dissous, les trois échantillons de 100 ml contenant le milieu sont chacun versés dans des
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conditions aseptiques dans trois Quanti-Tray1) ou Quanti-Tray/20001) séparés, puis étanchéifiés à l'aide
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de la scelleuse Quanti-Tray1). Pour réduire au minimum la formation de bulles d'air dans les puits, les
échantillons peuvent être préparés dans des flacons préalablement stérilisés contenant l'antimousse B.
L'antimousse B peut aussi être ajouté dans chaque flacon à l'aide d'un flacon compte-gouttes. Il est
essentiel de prévoir un étiquetage adéquat des trois Quanti-Tray1) permettant de distinguer clairement
le plateau contenant la portion d'échantillon de 50 ml (c'est-à-dire la portion diluée) des deux plateaux
contenant les portions d'échantillon non diluées de 100 ml. Ceci est important pour le calcul correct du
dénombrement final.

8.3 Incubation et différenciation

Incuber les Quanti-Tray1) ensemencés pendant 24 h à 28 h à (38 ± 0,5) °C pour détecter P. aeruginosa.

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8.4 Examen des résultats

Examiner les Quanti-Tray1) ou Quanti-Tray/20001) après incubation sous rayonnement ultraviolet


(365 nm) dans une pièce sombre ou dans une chambre dont la lumière ambiante est tamisée. S'assurer
que la lumière ultraviolette est éloignée des yeux et dirigée vers l'échantillon. Il convient de vérifier
l'efficacité de la lumière à rayons ultraviolets régulièrement à l'aide d'un témoin positif à fluorescence
conformément à l'Article 10. Il convient également de remplacer la lampe conformément à la durée de
vie de la lampe indiquée par le fabricant (par exemple, 6 000 h) ou tous les ans, l'échéance la plus courte
étant retenue. Considérer comme positifs à P. aeruginosa et dénombrer tous les puits présentant un
certain degré de fluorescence bleue. À des fins d'interprétation, comparer avec un témoin négatif. En
cas de doute concernant la fluorescence d'un puits au bout de 24 h, remettre le plateau dans
l'incubateur pour une incubation supplémentaire en veillant à ne pas dépasser un temps d'incubation
maximal de 28 h. Le positionnement de l'insert en caoutchouc du Quanti-Tray1) ou Quanti-Tray/20001)
sur l'échantillon peut faciliter l'identification des puits fluorescents.

9 Expression des résultats


D'après le nombre de puits positifs présents sur un Quanti-Tray1) ou Quanti-Tray/20001), le
NPP/100 ml de P. aeruginosa peut être calculé en référence aux tables statistiques ou à l'aide d'un
programme informatique de génération de NPP (voir les Tableaux B.1 et B.2). Pour le dénombrement
des échantillons de 250 ml, le NPP est calculé en utilisant la somme des dénombrements des deux
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Quanti-Tray1) contenant les portions d'échantillon non diluées, comme premier dénombrement, et le
dénombrement du Quanti-Tray1) contenant la portion d'échantillon diluée, comme deuxième
dénombrement (voir le Tableau B.3).
(standards.iteh.ai)
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Le laboratoire doit être doté d'un système de contrôle de la qualité clairement défini garantissant que
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l'appareillage, les réactifs et les techniques sont adaptés à l'essai. L'utilisation de contrôles positifs, de
contrôles négatifs et de blancs fait partie de l'essai.

Pour la définition de la productivité et de la sélectivité, se référer à l'ISO 11133. Les performances de


Pseudalert2) doivent être soumises à essai conformément aux méthodes et critères décrits dans
l'ISO 11133 (voir le Tableau 1).

Tableau 1 — Essai de performance de Pseudalert2)


Souche de Milieu de Méthode de Réactions
Fonction Incubation Critères
contrôlea référence contrôle caractéristiques

Productivité 24 h à 28 h/ P. aeruginosa TSA Quantitative PR ≥ 0,5 Fluorescence


(38 ± 0,5) °C WDCM 00024 ou bleue
WDCM 00025
Sélectivité 24 h à 28 h/ P. fluorescens — Qualitative Inhibition Absence de
(38 ± 0,5) °C WDCM 00115 totale fluorescence
bleue
a Se référer au catalogue des souches de référence disponible à l'adresse :
http://www.wfcc.info/pdf/WDCM_Reference_Strain_Catalogue.pdf pour connaître les numéros de collection des souches
de culture et les détails de contact.

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ISO 16266-2:2018(F)

11 Rapport d'essai
Le rapport d'essai doit contenir au moins les informations suivantes :

a) la méthode d'essai employée ainsi que la référence du présent document, à savoir


ISO 16266-2:2018 ;

b) toutes les informations nécessaires à l'identification complète de l'échantillon ;

c) les résultats exprimés conformément à l'Article 9 ;

d) tout phénomène particulier observé au cours de l'analyse et toute opération non spécifiée dans le
présent document ayant pu influencer les résultats.

Si, dans certains cas exceptionnels, l'échantillon est conservé à (5 ± 3) °C pendant une durée maximale
de 24 h jusqu'à ce qu'il soit examiné, le temps de stockage doit figurer dans le rapport d'essai.

iTeh STANDARD PREVIEW


(standards.iteh.ai)
ISO 16266-2:2018
https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/5ff03cfc-42cd-4bd7-ac40-9283f198f677/iso-
16266-2-2018

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