Iso 16266 2 2018
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Date : 2018-07
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre,
aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par
aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un
Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
Publié en Suisse
Sommaire Page
Avant-propos ................................................................................................................................................................. vi
Introduction .................................................................................................................................................................. vii
1 Domaine d'application...................................................................................................................................1
2 Références normatives ..................................................................................................................................2
3 Termes et définitions .....................................................................................................................................2
4 Principe ...............................................................................................................................................................3
5 Appareillage et verrerie ................................................................................................................................3
6 Milieux de culture, diluants et réactifs ....................................................................................................4
6.1 Substances de base ..........................................................................................................................................4
6.2 Diluant .................................................................................................................................................................4
6.3 Antimousse B.....................................................................................................................................................4
7 Échantillonnage................................................................................................................................................4
8
iTeh STANDARD PREVIEW
Mode opératoire ..............................................................................................................................................4
8.1
8.2 (standards.iteh.ai)
Transport et conservation des échantillons ..........................................................................................4
Préparation de l'échantillon et ensemencement des milieux .........................................................5
8.2.1 Préparation des échantillons de 100 ml .................................................................................................5
8.2.2 Préparation des échantillonsISO de 250 ml .................................................................................................5
16266-2:2018
8.3 https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/5ff03cfc-42cd-4bd7-ac40-9283f198f677/iso-
Incubation et différenciation ......................................................................................................................5
8.4 Examen des résultats .....................................................................................................................................6
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9 Expression des résultats ...............................................................................................................................6
10 Assurance qualité ............................................................................................................................................6
11 Rapport d'essai .................................................................................................................................................7
Annexe A (informative) Informations microbiologiques complémentaires sur Pseudomonas
aeruginosa ..........................................................................................................................................................8
Annexe B (normative) Scelleuse Quanti-Tray et calcul des résultats ........................................................9
Annexe C (normative) Composition du milieu Pseudalert ...................................................................... 131
Annexe D (informative) Caractéristiques de performance ..................................................................... 132
Bibliographie ............................................................................................................................................................. 133
Avant-propos
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
(standards.iteh.ai)
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
ISO 16266-2:2018
https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/5ff03cfc-42cd-4bd7-ac40-9283f198f677/iso-
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
16266-2-2018
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant : www.iso.org/iso/fr/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa est un organisme pathogène pour l'homme, capable de croître dans l'eau à de
très faibles concentrations nutritives. Toute eau minérale naturelle et toute eau de source doivent être
exemptes de Pseudomonas aeruginosa à la source ainsi qu'à la date de commercialisation, dans 250 ml
d'échantillon examiné (voir, par exemple, la Directive du Conseil 2009/54/CE, Référence [1]). Les
autres eaux commercialisées en bouteille doivent aussi être exemptes de Pseudomonas aeruginosa,
dans 250 ml d'échantillon (voir, par exemple, la directive du Conseil 98/83/CE, Référence [2]). D'autres
eaux, dont les eaux de piscine et de spa, les eaux destinées à la consommation humaine et les eaux
destinées aux hôpitaux, peuvent parfois, pour des raisons de santé publique, faire l'objet d'une
recherche de Pseudomonas aeruginos. Des volumes de 100 ml sont alors généralement étudiés.
La méthode décrite dans le présent document peut être appliquée à différents types d'eau, par exemple,
les eaux destinées aux hôpitaux, l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la
consommation humaine, les eaux souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant
des nombres importants de bactéries hétérotrophes (voir Références [3], [4], [5], [6] et [7]).
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais conduits conformément au présent
document soient réalisés par un personnel convenablement qualifié.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode permettant de dénombrer Pseudomonas aeruginosa dans
l'eau. Cette méthode se fonde sur la croissance d'organismes cibles dans un milieu liquide et le calcul du
nombre le plus probable (NPP) d'organismes en se référant aux tables du NPP.
Le présent document s'applique à différents types d'eau. Par exemple, les eaux destinées aux hôpitaux,
l'eau potable et les eaux en bouteille non gazéifiées destinées à la consommation humaine, les eaux
iTeh STANDARD PREVIEW
souterraines, les eaux de piscine et de spa, y compris celles contenant des nombres importants de
bactéries hétérotrophes.
(standards.iteh.ai)
Le présent document ne s'applique pas aux eaux en bouteille gazéifiées, aux eaux en bouteille
aromatisées, aux eaux de tour de refroidissement ou à l'eau de mer, pour lesquelles cette méthode n'a
pas été validée. Par conséquent, cesISO eaux16266-2:2018
ne relèvent pas du domaine d'application du présent
https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/5ff03cfc-42cd-4bd7-ac40-9283f198f677/iso-
document. Les laboratoires peuvent utiliser la méthode présentée dans le présent document pour ces
matrices en prenant les mesures adéquates 16266-2-2018
de validation des performances de cette méthode avant son
utilisation.
L'essai se fonde sur une technologie de recherche des enzymes bactériennes qui signale la présence de
P. aeruginosa en hydrolysant un substrat de 7-amino-4-méthylcoumarine aminopeptidase présent dans
un réactif spécial. Les cellules de P. aeruginosa se développent et se reproduisent rapidement à l'aide de
l'apport important en acides aminés, vitamines et autres nutriments présents dans le réactif. Les
souches de P. aeruginosa en développement actif présentent une enzyme qui dissocie le substrat de
7-amido-coumarine aminopeptidase, générant un produit qui présente une fluorescence sous une
lumière ultraviolette (UV). L'essai décrit dans le présent document fournit un résultat confirmé dans un
délai de 24 h sans avoir besoin de confirmer les puits positifs.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 8199, Qualité de l'eau — Exigences et lignes directrices générales pour les examens microbiologiques
sur milieu de culture
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions de l'ISO/IEC Guide 2 ainsi que les
suivants, s'appliquent.
iTeh STANDARD PREVIEW
(standards.iteh.ai)
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes :
Note 1 à l'article : Voir l'Annexe A pour des informations supplémentaires sur P. aeruginosa.
4 Principe
Un sachet de milieu déshydraté est ajouté à un échantillon d'eau (100 ml ou 250 ml), ou à une dilution
d'un échantillon complété à 100 ml. L'échantillon contenant le milieu est doucement agité pour garantir
un mélange adéquat et pour dissoudre le milieu. Lorsque le dénombrement est exigé, l'échantillon
contenant le milieu (100 ml) est versé dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray 1) ou un
Quanti-Tray/20001) pour dénombrer jusqu'à 201 organismes ou 2 419 organismes respectivement par
échantillon de 100 ml. Le mode opératoire pour le dénombrement des échantillons de 250 ml est décrit
en 8.2. Les plateaux sont étanchéifiés à l'aide d'une scelleuse Quanti-Tray1). Les Quanti-Tray1) ou flacons
(pour les essais de type présence/absence) sont ensuite incubés à (38 ± 0,5) °C pendant 24 h à 28 h. Les
résultats sont confirmés au bout de 24 h, mais peuvent être consultés jusque dans un délai de 28 h.
Après l'incubation, les puits d'échantillon des flacons ou des Quanti-Tray1) qui présentent un certain
degré de fluorescence bleue sous une lumière ultraviolette de grande longueur d'onde (365 nm) sont
considérés comme étant positifs pour P. aeruginosa.
À l'aide de tables statistiques ou d'un simple programme informatique, le nombre le plus probable
(NPP) de P. aeruginosa dans 100 ml ou 250 ml d'échantillon peut être déterminé.
(standards.iteh.ai)
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier, le matériel ci-après.
5.6 Lampe à rayons ultraviolets, 365 nm, 6 watt, grande longueur d'onde.
1) Quanti-Tray est une appellation commerciale ou une marque déposée d'IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses
filiales aux États-Unis et/ou dans d'autres pays. Cette information est donnée à l'attention des utilisateurs du
présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve l'emploi du produit ainsi désigné.
La méthode utilise Pseudalert 2), un milieu disponible sous la forme d'une poudre prête à l'emploi
répartie dans des sachets. Chaque sachet contient suffisamment de milieu (2,45 g pour des échantillons
de 100 ml) pour un seul essai. Pour le dénombrement quantitatif des échantillons de 250 ml, un sachet
de 2,45 g est ajouté à chaque aliquote d'échantillon divisé tel que décrit en 8.2. Il convient que le réactif
Pseudalert2) soit de couleur beige et fluide. Le milieu contient des nutriments tels que des acides aminés
et des vitamines, un tampon, du chlorure de sodium, du sulfate de magnésium, des indicateurs de
développement, des antibiotiques et des sources d'azote. Le milieu est conservé dans des conditions
ambiantes (2 °C à 30 °C) à l'abri de la lumière directe du soleil et il convient de l'utiliser avant la date de
péremption indiquée sur le sachet. Le réactif présente une durée de conservation de 12 mois à compter
de la date de fabrication.
6.2 Diluant
Pour les dilutions à employer avec Pseudalert2), n'utiliser que de l'eau stérile, non inhibitrice et exempte
d'oxydants. L'utilisation de diluants à base d'eau saline ou peptonée tamponnée interfère avec les
performances de l'essai. iTeh STANDARD PREVIEW
6.3 Antimousse B (standards.iteh.ai)
Antimousse B utilisé comme une suspension de silicone hydrosoluble active à 1 %. Ce réactif est ajouté
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aux échantillons afin de réduire autant que possible la formation de bulles d'air pendant le mélange.
https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/5ff03cfc-42cd-4bd7-ac40-9283f198f677/iso-
NOTE Des flacons préremplis d'antimousse sont16266-2-2018
disponibles.
7 Échantillonnage
Procéder au prélèvement, à la conservation et à la manipulation des échantillons comme spécifié dans
l'ISO 19458.
8 Mode opératoire
2)Pseudalert est une appellation commerciale ou une marque déposée d'IDEXX Laboratories, Inc. ou de ses filiales
aux États-Unis et/ou dans d'autres pays. Cette information est donnée à l'attention des utilisateurs du présent
document et ne signifie nullement que l'ISO approuve l'emploi du produit ainsi désigné.
exceptionnels, les échantillons peuvent être conservés à (5 ± 3) °C pendant une durée maximale de 24 h
jusqu'à ce qu'ils soient examinés. Dans ce cas, le temps de stockage doit figurer dans le rapport d'essai.
Pour le dénombrement des échantillons de 100 ml, ajouter, dans des conditions aseptiques, un seul
sachet de milieu Pseudalert2) à chaque échantillon ou dilution d'échantillon de 100 ml dans un flacon
stérile et transparent, puis bien mélanger. Une fois que le milieu est complètement dissous, l'échantillon
contenant le milieu est versé dans des conditions aseptiques dans un Quanti-Tray1) ou Quanti-
Tray/20001) puis étanchéifié à l'aide de la scelleuse Quanti-Tray1). Pour réduire au minimum la
formation de bulles d'air dans les puits, les échantillons peuvent être préparés dans des flacons
préalablement stérilisés contenant l'antimousse B. L'antimousse B peut aussi être ajouté dans chaque
flacon à l'aide d'un flacon compte-gouttes. Une autre méthode du NPP consiste à répartir l'échantillon
d'eau dans lequel le Pseudalert2) a été dissous dans des tubes stériles pour déterminer le NPP selon un
format NPP plus classique (par exemple, 1 × 50 ml et 5 × 10 ml).
NOTE Le mélange de réactif Pseudalert2) peut devenir trouble en raison de la teneur élevée en minéraux (en
particulier, magnésium et/ou calcium), mais cela n'affecte en rien le résultat de l'essai.
Incuber les Quanti-Tray1) ensemencés pendant 24 h à 28 h à (38 ± 0,5) °C pour détecter P. aeruginosa.
11 Rapport d'essai
Le rapport d'essai doit contenir au moins les informations suivantes :
d) tout phénomène particulier observé au cours de l'analyse et toute opération non spécifiée dans le
présent document ayant pu influencer les résultats.
Si, dans certains cas exceptionnels, l'échantillon est conservé à (5 ± 3) °C pendant une durée maximale
de 24 h jusqu'à ce qu'il soit examiné, le temps de stockage doit figurer dans le rapport d'essai.