Année 2019/2020 N°

Mémoire de Diplôme d’études spécialisées

spécialité Biologie Médicale
tenant lieu de thèse d’exercice
Pour le
DOCTORAT EN MEDECINE
Diplôme d’État
par

Sébastien Charles Raymond EYMIEUX

Né le 10/01/1991 à Tours (37000)

Mise au point de modèles innovants d’étude du virus de l’hépatite B :

élaboration d’une nouvelle lignée cellulaire infectable in vitro
Présentée et soutenue publiquement le 27/09/2019 devant un jury composé de :
Président du Jury : Professeur Philippe ROINGEARD, Biologie cellulaire, Faculté de Médecine -
Tours

Membres du Jury :

Professeur Catherine GAUDY-GRAFFIN, Bactériologie-Virologie-Hygiène hospitalière, Faculté de

Médecine - Tours

Professeur Gilles THIBAULT, Microbiologie-Immunologie-Bioépidemiologie, Faculté de Pharmacie,

Tours

Docteur Louis D’ALTEROCHE, Hépatologie, PH, CHU Tours

Docteur Fanny DUJARDIN, Anatomie et cytologie pathologique, PH, CHU Tours

Directeur de thèse : Professeur Christophe HOURIOUX, Biologie cellulaire, Faculté de

médecine – Tours
2
 Résumé
Mise au point de modèles innovants d’étude du virus de l’hépatite B :
élaboration d’une nouvelle lignée cellulaire infectable in vitro
Le virus de l’hépatite B (VHB) est un agent infectieux d’importance majeure en
pathologie humaine. Du fait de la persistance d’ADN super-enroulé (ADNccc) dans les
hépatocytes infectés, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement permettant une guérison
complète et définitive de l’infection. La mise au point de nouvelles thérapeutiques passe par
une meilleure compréhension du cycle viral, notamment l’étape de formation de l’ADNccc.
L’absence de modèle d’étude optimal in vitro a motivé ce projet, qui consistait en la mise au
point de lignées cellulaires innovantes au travers de deux stratégies de transduction par un
vecteur lentiviral : la première par l’immortalisation d’hépatocytes primaires humains via les
oncogènes C-myc et h-TERT, la seconde par l’élaboration de cellules FLC4 exprimant le
récepteur NTCP du VHB afin de les rendre infectables par le virus. L’obtention d’hépatocytes
primaires humains via l’activité de chirurgie hépatique a été permise grâce à la mise en place
du protocole « Hepaprim ».

La complexité de la procédure d’isolement des hépatocytes, ainsi que leur grande

fragilité lors des étapes de transduction, se sont révélées des facteurs limitants pour l’obtention
de cellules immortalisées. L’obtention d’hépatocytes primaires humains lors de notre première
tentative confirme cependant la faisabilité de ce protocole au CHRU de Tours.

Notre seconde stratégie a permis la mise au point d’une lignée FLC4-NTCP. La

caractérisation de cette lignée, notamment par la détection du génome du virus en intracellulaire
après infection in vitro, a confirmé sa capacité à être infectée par le VHB. Les valeurs des
paramètres d’infection mesurés étaient supérieures, en termes de rendement et de cinétique, à
celles obtenues sur la lignée standard HepG2-NTCP. L’obtention d’une nouvelle lignée
infectable par le VHB représente une avancée significative vers une meilleure compréhension
de son cycle.

Mots clés : VHB, modèles cellulaires, foie, hépatocytes primaires humains, C-myc, h-TERT,
FLC4, NTCP, lentivirus, immortalisation, infection in vitro

3
 Abstract
Development of innovative hepatitis B virus study models: establishment of
a new cell line sensitive to in vitro infection
Hepatitis B virus (HBV) is an infectious agent of major importance in human pathology.
Due to the persistence of super-coiled DNA (cccDNA) in infected hepatocytes, there is
currently no treatment for a complete and definitive cure of the infection. The development of
new therapeutics requires a better understanding of the viral cycle, in particular of the cccDNA
formation stage. This project was motivated by the absence of optimal in vitro model which led
to the development of innovative cell lines through two transduction strategies using a lentiviral
vector. The first strategy consisted in immortalizing primary human hepatocytes via the C-myc
and h-TERT oncogenes. The second aimed at developing a FLC4 cell line expressing
constitutively the HBV NTCP receptor in order to make it prone to infection by this virus. The
development of the “Hepaprim” protocol allowed us to obtain primary human hepatocytes from
hepatic surgery activity.

The complexity of the hepatocyte isolation procedure, as well as their great fragility
during the transduction stages, were two limits on the path to obtain immortalized cells.
However, the fact we obtained primary human hepatocyte on our first attempt confirms the
feasibility of this protocol at the University Hospital of Tours.

Our second strategy resulted successfully in the obtention of a FLC4-NTCP cell line. Its
characterization, in particular by the detection of the intracellular genome of the virus after the
in vitro infection stage, has confirmed its ability to be infected with HBV. The values of the
infection parameters measured were better, in terms of efficiency and kinetic, than those
obtained on the HepG2-NTCP standard cell line. This new cell line, susceptible to HBV in vitro
infection, represents a significant step towards a better understanding of its cycle.

Keywords: HBV, cellular models, liver, primary human hepatocyte, C-myc, h-TERT, FLC4,
NTCP, lentivirus, immortalization, in vitro infection

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 SERMENT D’HIPPOCRATE

En présence des Maîtres de cette Faculté,

de mes chers condisciples
et selon la tradition d’Hippocrate,
je promets et je jure d’être fidèle aux lois de l’honneur
et de la probité dans l’exercice de la Médecine.

Je donnerai mes soins gratuits à l’indigent,

et n’exigerai jamais un salaire au-dessus de mon travail.

Admis dans l’intérieur des maisons, mes yeux

ne verront pas ce qui s’y passe, ma langue taira
les secrets qui me seront confiés et mon état ne servira pas
à corrompre les mœurs ni à favoriser le crime.

Respectueux et reconnaissant envers mes Maîtres,

je rendrai à leurs enfants
l’instruction que j’ai reçue de leurs pères.

Que les hommes m’accordent leur estime

si je suis fidèle à mes promesses.
Que je sois couvert d’opprobre
et méprisé de mes confrères
si j’y manque.

9
 Remerciements

Je remercie le Professeur Philippe Roingeard pour son soutien de longue date à mon projet
de carrière hospitalo-universitaire, et pour la confiance qu’il m’a accordée dès le départ. Sa
vision globale de la biologie fondamentale et de la médecine, son optimisme et sa bienveillance
forment ensemble une source d’inspiration quotidienne. Je le remercie de m’avoir fait l’honneur
d’être président de ce jury et de me permettre d’exercer ma profession, avant tout au service du
patient, dans son unité de recherche et son unité hospitalière.

Au Professeur Christophe Hourioux

Je le remercie de m’avoir encadré depuis la réalisation de mon master 1, au cours de mon master
2 et finalement dans le cadre de cette thèse d’exercice de médecine. Je le remercie pour sa
patience, sa disponibilité, sa bienveillance et ses précieux conseils tout au long de ce parcours.
C’est par lui que j’ai appris les bases du raisonnement scientifique, et son approche originale
de la biologie cellulaire appliquée à la virologie m’a fait aimer le monde de la recherche et
incité à poursuivre dans cette voie.

Au Professeur Catherine Gaudy-Graffin

Je la remercie de m’avoir appris la pratique de la virologie hospitalière, et de m’avoir accordé
sa confiance en m’impliquant dans de nombreux projets en rapport avec l’enseignement, la
qualité et la recherche clinique. Je la remercie également d’avoir accepté de faire partie de ce
jury.

Au Professeur Gilles Thibault, Aux Docteurs Fanny Dujardin et Louis D’Alteroche

Merci d’avoir accepté d’être membres de ce jury, et de me faire l’honneur de juger ce travail,
dans lequel l’interdisciplinarité tient une place importante.

Je remercie également le laboratoire d’anatomie et cytologie pathologique du CHRU de

Tours pour sa participation au protocole HepaPrim.

Au Professeur Ephrem Salamé, au Docteur Louise Barbier et à toute l’équipe du service

de chirurgie hépato-biliaire et digestive du CHRU de Tours
Merci de leur soutien pour la mise en place du protocole HepaPrim, et de m’avoir permis d’être
directement en contact avec leurs patients dans le cadre de ce projet de recherche fondamentale.

Je remercie le Docteur Sophie Guyetant du Centre de Ressources Biologiques pour son aide
essentielle concernant les aspects éthiques et administratifs du protocole HepaPrim.

Au Professeur Emmanuelle Blanchard-Laumonnier

Merci de m’apprendre la pratique de la microscopie électronique hospitalière, de faire preuve
de patience et d’être présente pour répondre à mes nombreuses interrogations. Je la remercie
également d’avoir accepté de m’encadrer dans mon projet à venir de réaliser une thèse de
science.

10
Au Professeur Francis Barin
Je le remercie pour toutes les connaissances qu’il m’a transmises, pour ses précieux conseils et
sa grande expérience concernant la virologie hospitalière. Je le remercie également pour sa
bienveillance et pour m’avoir fait aimer cette discipline.

A toute l’équipe de l’unité de recherche INSERM U1259 « Morphogénèse et antigénicité

du VIH et des virus des hépatites »
Merci d’avoir permis la réalisation du versant fondamental de ce projet, par vos conseils, et le
temps consacré à transmettre la maîtrise de nouvelles techniques, dans une ambiance aussi
agréable que studieuse. C’est un vrai plaisir de travailler à vos côtés.

Je remercie plus particulièrement Charline Herrscher pour l’aide précieuse qu’elle m’a
apporté concernant la technique d’infection des cellules, et qui a permis l’aboutissement de ce
projet. Merci Charline pour ta grande disponibilité, ta patience et pour la persévérance dont tu
fais preuve.

Je remercie également Florentin Pastor pour les nombreuses techniques que j’ai apprises grâce
à lui et le temps qu’il m’a accordé.

Je remercie Amélie Dumans, Marianne Maquart, et Clara Visdeloup pour leur aide, leur
disponibilité et leurs conseils, en particulier concernant l’utilisation des lentivirus.

Je remercie Alain Moreau et Florian Seigneuret pour leurs conseils concernant la biologie
moléculaire, et Elodie Beaumont pour son expérience concernant la culture cellulaire.

Je remercie Romuald Patient, Hugues De Rocquigny et Philippe Chouteau pour leur

expérience et leurs nombreux conseils.

Enfin je remercie Jade, Stéphanie, Virgile, Yannick, Aurélie, Julie et Elsa pour leur bonne
humeur et les bons moments partagés dans le monde de la recherche, encore nombreux à
l’avenir je l’espère.

A toute l’équipe de l’unité hospitalière de Biologie cellulaire et Microscopie du CHRU de

Tours
Merci de m’accompagner dans l’apprentissage de cette nouvelle discipline qu’est la
microscopie électronique, dans cette ambiance chaleureuse et accueillante.

Je remercie plus particulièrement Julien Gaillard et Pierre-Ivan Raynal pour leur aide
apportée concernant les techniques de microscopie.

A toute l’équipe de l’unité hospitalière de Virologie du CHRU de Tours

Merci pour ces dernières années d’internat où j’ai appris la virologie grâce à vous. Votre passion
pour cette discipline est communicative et votre dévouement au rendu de résultat des patients
est inspirant.

11
Je remercie en particulier Karl Stefic et Julien Marlet, dont la rigueur, le professionnalisme
et la grande bienveillance représentent pour moi une source d’inspiration pour le début de ce
parcours hospitalo-universitaire.

Je remercie également les membres du service d’hématologie-hémostase, de jour et de nuit,

pour ces trois années de gardes très formatrices que je n’oublierai pas.

A tous mes co-internes, anciens et actuels

Merci pour ces années d’internat qui me laissent d’innombrables souvenirs, sur le plan
personnel et professionnel.
Je garde un attachement très fort à notre promotion de quatre internes médecins et quatre
internes pharmaciens de l’année 2014, dont Jean-Baptiste et Luc faisaient partie. Rien n’est
plus gratifiant que ce sentiment de former une équipe, et de progresser ensemble. J’aurai grand
plaisir à continuer de travailler avec vous.
Merci également pour toutes ces soirées partagées dans notre belle ville de Tours

Je remercie Adélaïde pour ces deux années de représentation partagées, et pour tous ces bons
souvenirs biochimiques.

Je remercie Caroline et Eve-Anne pour leur gentillesse et leur bonne humeur communicative.

Je remercie Clémence pour ces très bons moments consacrés à l’apprentissage de la

microbiologie.

Je remercie Coralie pour ces derniers semestres d’internat, là encore sous le signe d’une passion
commune pour la microbiologie.

Au Docteur Thierry Lepetit

Je le remercie pour ses conseils et son soutien, notamment au cours de mes années d’externat
de médecine, et dont l’humanité dont il fait preuve vis-à-vis de ses patients m’a toujours inspiré.

A mes ami(e)s

Je remercie Agathe et Camille, qui m’ont accompagné depuis nos jeunes années, et qui ont
également étaient présentes au cours de ces années d’études de médecine. Merci aussi pour ces
discussions philosophiques et votre gentillesse.

Je remercie Kévin et Romain, ainsi que Mathilda et William, eux aussi présents depuis tant
d’années, et que je considère comme des membres de ma famille. Merci pour ces innombrables
fous rires.

Je remercie aussi Johanna et Jean-Grégoire pour leur soutien et pour tous ces souvenirs
partagés.

12
A ma famille

Je remercie Pascale et Denis, des beaux-parents en or que j’admire pour leur immense
gentillesse, pour tous ces bons moments passés en leur compagnie.

Je remercie Françoise, Martine, Patrick et Alain, mes très chers oncles et tantes, ainsi que
ma super cousine Frédérique, qui ont toujours cru en moi et soutenu dans mon parcours de
mes premiers pas à aujourd’hui. Merci aussi pour ces si bons moments passés en votre
compagnie.

Je remercie Yolande, Jeanne, Raymond et Charles, mes quatre grand-parents qui m’ont
entouré de leur affection et m’ont transmis leur curiosité pour le monde qui nous entoure. Je
n’aurai pas entrepris ce parcours s’ils ne m’avaient pas montré la voie. Je pense fort à eux.

Je remercie Robin, mon frère, que j’ai vu grandir, dont je suis très fier, et avec qui je partage
tant de choses. Merci pour cette joie que tu m’apportes à chacune de nos conversations.

Maman, Papa, c’est grâce à vous que je me trouve là aujourd’hui. Vous êtes les meilleurs
parents que l’on puisse souhaiter avoir et m’avez toujours entouré de votre amour. Papa, tu
m’as transmis ton intérêt pour l’enseignement et ta passion pour les sciences. Maman, tu m’as
transmis ton imagination et ton esprit littéraire. Je vous remercie de m’avoir fait découvrir le
monde, et d’avoir été toujours présents, dans les bons moments comme dans les moments
difficiles.

Enfin, je remercie l’amour de ma vie, Anne-Cécile. Je suis si fier de partager ta vie, de ton
parcours et de ton esprit créatif. Merci de me rendre heureux chaque jour que je passe à tes
côtés. Merci de m’avoir tenu la main tout au long de ce parcours. J’ai passé dix ans de bonheur
avec toi et suis impatient d’en vivre tant d’autre. Je t’aime chérie.

13
 Table des matières
Résumé……………………………………………………………………………………………….. 3
Abstract………………………………………………………………………………………………. 4
Remerciements………………………………………………………………………………………. 10
Table des matières…………………………………………………………………………............... 14
Liste des figures……………………………………………………………………………………... 16
Liste des tableaux…………………………………………………………………………................ 17
Abréviations…………………………………………………………………………………………. 18
I. INTRODUCTION .................................................................................................................................... 22
A. LE VIRUS DE L’HEPATITE B ...............................................................................................................................22
1. Caractéristiques virales et phylogénie..................................................................................................22
2. Génome viral et transcrits viraux .........................................................................................................22
3. Structure et fonction des protéines virales ...........................................................................................24
4. Cycle viral et morphogenèse ................................................................................................................28
B. INFECTION PAR LE VHB ET CARCINOME HEPATOCELLULAIRE ...................................................................................30
1. Historique .............................................................................................................................................30
2. Épidémiologie .......................................................................................................................................32
3. Génotypes et variants ..........................................................................................................................36
4. Physiopathologie ..................................................................................................................................39
a) Organe cible du VHB : le foie ............................................................................................................................ 39
b) Cellule cible du VHB : l’hépatocyte primaire humain ....................................................................................... 43
c) Hépatite virale B : inflammation et fibrose ...................................................................................................... 45
d) CHC et transformation cellulaire ...................................................................................................................... 49
5. Clinique et histoire naturelle ................................................................................................................51
6. Dépistage, diagnostic et prévention.....................................................................................................55
a) Marqueurs virologiques et biochimiques ......................................................................................................... 55
b) Diagnostic histologique .................................................................................................................................... 57
c) Biomarqueurs pronostiques et prédictifs ......................................................................................................... 60
7. Prophylaxie ...........................................................................................................................................60
8. Thérapeutique ......................................................................................................................................63
9. Populations spécifiques ........................................................................................................................68
a) Patients immunodéprimés ............................................................................................................................... 68
b) Patients co-infectés .......................................................................................................................................... 68
C. MODELES D’ETUDE DU VHB ............................................................................................................................70
D. OBJECTIFS ....................................................................................................................................................74
II. MATERIEL ET METHODES ...................................................................................................................... 76
A. CONSTRUCTIONS PLASMIDIQUES .......................................................................................................................76
B. PRODUCTION DES PARTICULES LENTIVIRALES .......................................................................................................77
C. QUALIFICATION DES PARTICULES LENTIVIRALES ....................................................................................................80
D. ISOLEMENT DES HEPATOCYTES PRIMAIRES HUMAINS ET PROTOCOLE HEPAPRIM .........................................................81
E. CULTURE CELLULAIRE ET TRANSDUCTION ............................................................................................................83
F. CARACTERISATION DES LIGNEES CELLULAIRES TRANSDUITES ....................................................................................85
1. Contrôle de l’expression de la protéine d’intérêt .................................................................................85
2. Évaluation de la susceptibilité vis-à-vis de l’infection par le VHB .........................................................86
a) Production des lots de virus sur cellules en culture ......................................................................................... 86
b) Infection in vitro par le VHB.............................................................................................................................. 86
c) Détection de l’ARN prégénomique sur lysats cellulaires .................................................................................. 86

III. RESULTATS ....................................................................................................................................... 88

A. CONSTRUCTIONS PLASMIDIQUES .......................................................................................................................88

14
 B. PRODUCTION DES PARTICULES LENTIVIRALES .......................................................................................................88
C. QUALIFICATION DES PARTICULES LENTIVIRALES ....................................................................................................88
D. ISOLEMENT DES HEPATOCYTES PRIMAIRES HUMAINS ET PROTOCOLE HEPAPRIM .........................................................90
E. CULTURE CELLULAIRE ET TRANSDUCTION ............................................................................................................96
1. Hépatocytes primaires humains ...........................................................................................................96
2. Lignée FLC4...........................................................................................................................................97
F. CARACTERISATION DES LIGNEES CELLULAIRES TRANSDUITES ....................................................................................97
1. Contrôle de l’expression de la protéine d’intérêt .................................................................................97
2. Évaluation de la susceptibilité vis-à-vis de l’infection par le VHB .........................................................98
IV. DISCUSSION .................................................................................................................................... 101

Bibliographie……………………………………………………………………………….............. 105

15
 Liste des figures
Figure 1: Relations phylogénétiques des Hepadnaviridae en fonction de l’hôte............................ 23
Figure 2 : Carte des trajets de diffusion du génotype A du VHB à l'échelle mondiale ................. 23
Figure 3: Structure du génome viral et des ARN viraux transcrits du VHB ................................. 25
Figure 4 : Représentation schématique de la particule virale mature du VHB ............................. 25
Figure 5 : Représentation schématique des glycoprotéines d’enveloppe du VHB ......................... 27
Figure 6 : Représentation schématique et micrographie en coloration négative des particules
virales et sous-virales circulantes du VHB......................................................................................... 27
Figure 7 : Cycle du virus de l’hépatite B............................................................................................ 29
Figure 8 : Modèle de la morphogenèse des particules sous-virales du VHB .................................. 31
Figure 9 : Chronologie des principales découvertes scientifiques en rapport le VHB .................. 31
Figure 10 : Chronologie d'apparition et structure moléculaire des traitements médicamenteux
validés dans le cadre de l'infection par le VHB ................................................................................. 33
Figure 11 : Prévalence de l’antigène HBs au niveau mondial en 2016 ............................................ 35
Figure 12 : Incidence des cancers du foie au niveau mondial en 2012 ............................................ 35
Figure 13 : Relations phylogénétiques des génotypes du VHB ........................................................ 37
Figure 14 : Distribution des génotypes du VHB au niveau mondial ............................................... 37
Figure 15 : Structure du foie du niveau anatomique au niveau histologique ................................. 40
Figure 16 : Organisation fonctionnelle du foie au niveau histologique ........................................... 42
Figure 17 : Zonation métabolique du lobule hépatique.................................................................... 42
Figure 18 : Microenvironnement hépatocytaire................................................................................ 44
Figure 19 : Organisation ultrastructurale de l'hépatocyte primaire humain ................................ 46
Figure 20 : Polarité structurale et fonctionnelle de l'hépatocyte primaire humain....................... 46
Figure 21 : Mécanismes immunologiques de l'hépatite virale B...................................................... 48
Figure 22 : Rôle du couple cellule endothéliale sinusoïdale - cellule stellaire hépatique dans la
fibrogénèse au cours d’une hépatopathie chronique ........................................................................ 50
Figure 23 : Cinétique des marqueurs virologiques et biochimiques lors des phases successives de
l'infection chronique par le VHB ........................................................................................................ 52
Figure 24 : Profils de réplication et devenir des patients infectés chroniquement par le VHB .... 54
Figure 25 : Marqueurs virologiques : de l'hépatocyte infecté vers le sérum .................................. 56
Figure 26 : Stades histologiques selon le score METAVIR .............................................................. 58
Figure 27 : Évolution de la couverture vaccinale anti-VHB à l'échelle mondiale de 1989 à 2017 62
Figure 28 : Répartition de la couverture vaccinale anti-VHB au niveau mondial en 2016........... 62
Figure 29 : Objectifs du traitement de l'infection par le virus de l'hépatite B ............................... 64
Figure 30 : Cascade mondiale du traitement de l’infection par le virus de l'hépatite B ............... 67
Figure 31 : Évolution des modèles d’étude animaux et cellulaires du VHB ................................... 71
Figure 32: Caractéristiques des modèles cellulaires vis-à-vis de l’infection par le VHB .............. 71
Figure 33 : Structure et fonction du co-transporteur sodium-taurocholate (NTCP) .................... 73
Figure 34 : Fonctionnement du vecteur lentiviral intégratif et non réplicatif utilisé .................... 78
Figure 35 : Schéma récapitulatif des étapes de production des particules lentivirales et de
transduction .......................................................................................................................................... 79
Figure 36 : Représentation schématique du système d’isolement d’hépatocytes primaires
humains par perfusion d’une pièce de résection hépatique avec une solution de collagénase...... 82
Figure 37 : Schéma récapitulatif des étapes d’isolement des hépatocytes primaires humains par
centrifugation et enrichissement sur gradient de Percollâ .............................................................. 84
Figure 38 : Schéma récapitulatif de l'analyse cinétique de l'infection sur cellules HepG2-NTCP
et FLC4-NTCP par technique de qRT-PCR ..................................................................................... 87
Figure 39 : Profil de restriction du vecteur pLenti-puro linéarisé et de l’insert NTCP obtenus
après digestion enzymatique par BamHI et XhoI ............................................................................. 89

16
Figure 40 : Analyse au microscope à épifluorescence de l'expression de la protéine C-myc en
cellules Huh7 transduites avec une gamme croissante de lentivirus ............................................... 89
Figure 41 : Analyse au microscope à épifluorescence de l'expression de la protéine h-TERT en
cellules Huh7 transduites ..................................................................................................................... 91
Figure 42 : Analyse au microscope à épifluorescence de l'expression de la protéine NTCP sur
cellules FLC4 transduites .................................................................................................................... 91
Figure 43 : Photographie du montage utilisé pour l’isolement d’hépatocytes primaires humains à
partir de fragments de résection hépatique ....................................................................................... 94
Figure 44 : Photographies du fragment de résection hépatique issu de l’hépatectomie du patient
1-12010618 ............................................................................................................................................ 94
Figure 45: Photographie du culot brun constitué d’hépatocytes obtenu après digestion des tissus
du prélèvement n°1 par la collagénase et étapes de centrifugation ................................................. 95
Figure 46 : Observation en microscopie optique des hépatocytes primaires isolés à partir du
prélèvement n°1 après 24 heures de culture en flasque coatée au collagène .................................. 95
Figure 47 : Analyse en immunoblot de l'expression du récepteur NTCP en cellules FLC4 ......... 99
Figure 48: Analyse au microscope à épifluorescence (A) et au microscope confocal (B) de
l'expression du récepteur NTCP en cellules FLC4 ........................................................................... 99
Figure 49 : Cinétique d’apparition et quantification de l'ARN prégénomique du VHB mesurées
par qRT-PCR en cellules HepG2-NTCP et FLC4-NTCP infectées............................................... 100

Liste des tableaux

Tableau 1 : Score METAVIR.............................................................................................................. 58
Tableau 2 : Liste récapitulative et compositions des solutions de perfusion utilisées pour
l’isolement d’hépatocytes primaires humains ................................................................................... 82
Tableau 3 : Séquences des amorces nécessaires à l’amplification de l'ARN prégénomique du
VHB par qRT-PCR .............................................................................................................................. 87
Tableau 4 : Séquences des amorces nécessaires à l’amplification du gène HPRT par qRT-PCR 87
Tableau 5 : Quantification de la production de particules lentivirales par le dosage en ELISA de
la protéine p24 (kit « Innotest HIV antigen mAB ») ............................................................................ 89
Tableau 6 : Caractéristiques clinico-biologiques des patients inclus dans le protocole HepaPrim
................................................................................................................................................................ 93

17
 Abréviations
aa : acides aminés
AASLD : American Association for the Study of Liver Diseases
ADCC : Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity
ADN: Acide DesoxyriboNucléique
ADNccc: ADN Circulaire Clos de façon Covalente
ADNrc : ADN Circulaire Relâché
ALAT : Alanine AminoTransférase
APASL : Asian Pacific Association for the Study of the Liver
ARN : Acide Ribonucléique
ARNpg : ARN prégénomique
ASAT : Aspartate AminoTransférase
BCP : Basal Core Promoter
BHBV: Bat Hepatitis B Virus
BSA : Bovine Serum Albumin
C-myc : C-myelocytomatosis protein
Cas9 : CRISPR associated protein 9
CD : Cluster of Differentiation
CHC : Carcinome HépatoCellulaire
CHRU : Centre Hospitalier Régional et Universitaire
CIP : Calf Intestinal Phosphatase
CLIA : Chemiluminescence ImmunoAssay
CNIL : Commission Nationale de l'Informatique et des Libertés
CREB : C-AMP Response Element-Binding protein
CRISPR : Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Ct : Cycle threshold
D-PBS : Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline
DAA : Directly Acting Antivirals
DAMPs : Damage-Associated Molecular-Patterns
DAPI : 4',6-Diamidino-2-Phénylndole
DDB1 : DNA Damage-Binding protein 1
DHBV : Duck Hepatitis B Virus
DMEM : Dulbecco Modified Eagle's minimal Essential Medium
DMSO : DiMéthylSulfOxyde
EASL : European Association for the Study of Liver

18
ECL : Enhanced ChemiLuminescent
EGR-1 : Early Growth Response protein 1
ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EPO : érythropoïétine
ERGIC : ER-Golgi Intermediate Compartment
FAS : Fatty Acid Synthase
FLC4 : Functional Liver Cell 4
GFP : Green Fluorescent Protein
h-TERT : human Telomerase Reverse Transcriptase
HEK-293T : Human Embryonic Kidney 293T
HHBV: Human Hepatitis B Virus
HMM : Hepatocyte Maintenance Medium
HNF-4α : Hepatocyte Nuclear Factor-4 alpha
HPRT : Hypoxanthine-guanine PhosphoRibosylTransférase
Hsp : Heat Shock Proteins
HSPG : Heparan Sulfate ProteoGlycan
HTLV : Human T-Lymphotropic Virus
IFN: interferon
IGF-1: Insulin-like Growth Factor-1
IgG : immunoglobuline G
IgM : immunoglobuline M
IL : InterLeukine
IRM : Imagerie par Résonance Magnétique
ISG : Interferon-Stimulated Gene
IUT : International Unit of Transduction
JAK : Janus Kinase
kb : kilobase
kPa : kilopascal
LB : Lysogeny Broth
LTR : Long Terminal Repeats
mA: milliampère
mL : millilitre
MOI : Multiplicity Of Infection
NF-κB : Nuclear Factor-kappa B
ng : nanogramme
NIH : National Institute of Health

19
NK : Natural Killer
nm : nanomètre
NTCP : Na+-Taurocholate Cotransporting Polypeptide
NUCs: Nucleoside analogs
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
ORF: Open Reading Frame
PBS : Phosphate-Buffered Saline
PCR : Polymerase Chain Reaction
PEG : Polyéthylène Glycol
PEG-IFNα‑2a : interferon alpha-2 pégylé
pg : picogramme
pH : potentiel hydrogène
PBH: Ponction Biopsie Hépatique
PHH : Primary Human Hepatocyte
PI3k : Phosphoinositide 3-kinase
PMSF : PhenylMethylSulfonyl Fluoride
PNGase F : Peptide:N-glycosidase F
PTH : Primary Tupaia Hepatocytes
PVDF : PolyVinyliDene Fluoride
Ras : Rat sarcoma
RE: Réticulum endoplasmique
RIPA : RadioImmunoPrecipitation Assay buffer
RNase: Ribonucléase
RT-qPCR : Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction
SCL10A : Solute Carrier Family 10A
siARN : small interfering RNA
STAT : Signal Transducers and Activators of Transcription
SVF : Sérum de Veau Fœtal
TAF : Ténofovir AlaFénamide
TDF : Ténofovir Disoproxil Fumarate
TDM : TomoDensitoMétrie
TLR : Toll-Like Receptor
TNF : Tumor Necrosis Factor
TP : Taux de Prothrombine
TP domain : Terminal Protein domain
TPO : thrombopoïétine

20
UI : Unités Internationales
VHA : Virus de l’Hépatite A
VHB : Virus de l’Hépatite B
VHD : Virus de l’Hépatite Delta
VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine
WHBV: Woodchuck Hepatitis B Virus
WHO : World Health Organization
WMHBV: Woolly Monkey Hepatitis B Virus
µg : microgramme
µL : microlitre

21
I. Introduction
A. Le virus de l’hépatite B
1. Caractéristiques virales et phylogénie

Les Hepadnaviridae sont une famille de virus enveloppés à capside de symétrie

icosaédrique mesurant environ 42 nm de diamètre, très homogène sur le plan de l’organisation
génétique. Le support du génome viral est un ADN partiellement double-brin, et leur cycle
comporte une étape de rétrotranscription via un intermédiaire ARN. Cette famille virale est
probablement issue d’un processus de coévolution vieux de plusieurs millions d’années chez
plusieurs classes d’animaux vertébrés, marqué par de nombreux événements de transmission
croisée inter-espèces (Figure 1) (1,2). C’est cette histoire évolutive qui explique la présence de
virus de l’hépatite B proches phylogénétiquement chez les oiseaux (Avihepadnavirus) dont le
canard (DHBV), et chez certains mammifères (Orthohepadnavirus) dont la marmotte (WHBV),
le singe (WMHBV), la chauve-souris (BHBV) et l’homme (HHBV). Du fait d’une transcriptase
inverse sujette aux erreurs lors de la réplication, le virus de l’hépatite B humain est lui-même
caractérisé par une importante hétérogénéité génétique, dont est issue une division en 9
génotypes (A à I) (3). Celle-ci présente une répartition géographique et ethnique complexe à
l’échelle du globe, ainsi que des différences en termes de pathogénicité. L’origine de cette
répartition, révélatrice de la longue histoire coévolutive entre l’être humain et le virus, est
étudiée par certaines études paléogéographiques (4). Cette dernière est en grande partie
expliquée par les mouvements de populations humaines, qu’ils soient anciens (« Out of Africa »
paléolithique) ou plus récents (colonisation depuis l’Europe et commerce triangulaire de
l’Afrique vers l’Amérique) (Figure 2).

2. Génome viral et transcrits viraux

Le génome du virus de l’hépatite B (VHB) est formé d’un ADN circulaire partiellement
bicaténaire dont la longueur est d’environ 3,2 kb (5). Ce génome code pour un nombre très
limité de protéines, les cadres de lecture codant ces protéines se recouvrent largement, ce qui
conduit à une compacité remarquable du génome. Du fait de cette compacité, mais aussi du
petit nombre de protéines codées par le virus, il est généralement admis que le VHB possède
une forte dépendance vis à vis des cellules qu’il infecte. Ceci permet de mieux comprendre
pourquoi le VHB possède une haute spécificité d’infection, d’une part vis à vis de l’hôte infecté
(le HHBV ne peut par exemple infecter que les humains, le DHBV uniquement le canard…),
et d’autre part vis-à-vis des cellules infectées avec un tropisme strictement hépatocytaire (6).

22
Figure 1: Relations phylogénétiques des Hepadnaviridae en fonction de l’hôte
L’arbre présente les relations de coévolution au sein de différentes espèces de vertébrés ainsi que les
composants viraux innovants issus de cette évolution. La présence d’un ORF codant pour la protéine X
est par exemple spécifique au genre mammalien des Orthohepadnavirus et absent chez les virus aviaires.
(Source : Lauber et al. Cell Host Microbe. 2017 Sep 13;22(3):387-399.e6.)

Figure 2 : Carte des trajets de diffusion du génotype A du VHB à l'échelle mondiale

L’origine supposée du génotype A est localisée au Moyen-Orient/Asie centrale. Les flèches en trait plein
représentent les itinéraires de dispersion anciens des sous-génotypes A, les flèches en pointillés les
itinéraires de dispersion récents. Les cercles colorés représentent les zones où chaque sous-génotype est
le plus répandu.
(Source: Kostaki et al. eLife. 2018 Aug 7;7:e36709.)

23
Notre étude s’intéressera uniquement au virus de l’hépatite B humain, pour lequel l’abréviation
« VHB » sera utilisée par souci de simplification.
Le génome viral comporte quatre cadres de lecture (ORF) chevauchants (Figure 3) : S,
C, P et X. L’ORF S et C comportent plusieurs codons d’initiation précédés de promoteurs au
sein de leur séquence, donnant lieu à la traduction de plusieurs protéines apparentées mais
distinctes sur le plan fonctionnel. L’ORF S code pour les protéines d’enveloppe du virus, et
peut-être divisé en région pré-S1, pré-S2 et S. Ainsi la traduction à partir du domaine pré-S1
conduit à la synthèse de la grande protéine L (pour Large) tandis que la traduction à partir de
pré-S2 et S génère respectivement la protéine M (pour Medium) et la protéine S (pour Small).
L’ORF C code pour la protéine de capside HBc et l’antigène HBe, selon que la traduction est
initiée à partir de la région core ou pré-core respectivement. La séquence pré-core code pour un
peptide signal qui adresse le produit de la traduction vers le RE où la protéine sera maturée pour
former l’antigène secrété HBe. L’ORF P code pour la polymérase et l’ORF X pour la protéine
HBx (7).
A partir du génome viral, quatre ARN viraux sont transcrits. Un ARN prégénomique de
3,5 kb à partir duquel sera synthétisé l’antigène HBe, l’antigène HBc et la polymérase. Il servira
également de matrice, une fois encapsidé, pour la synthèse du brin d’ADN génomique
complémentaire lors de la maturation de la particule virale. Deux ARN de 2,5 kb et 2,1 kb qui
permettront respectivement la synthèse la protéine HBs-L et des deux protéines HBs-M et HBs-
S. Enfin, la protéine HBx sera synthétisée à partir d’un petit ARN de 0,7 kb (8).

3. Structure et fonction des protéines virales

Au cours de son cycle viral, le VHB synthétise quatre protéines structurales (la protéine
de capside HBc, et les trois glycoprotéines d’enveloppe, S pour Small, M pour Medium, L pour
Large) intervenant directement dans la formation de la particule virale (Figure 4) et trois
protéines non structurales (l’ADN polymérase avec activité de transcriptase inverse, la protéine
transactivatrice X et la protéine pré-core HBe).
Concernant les glycoprotéines d’enveloppe du VHB, il a été démontré que les
protéines S (226 aa) et L (400 aa) étaient indispensables à la formation et au pouvoir infectieux
des particules virales. A l’inverse, le rôle de la protéine M (281 aa) au cours du cycle viral
demeure encore mal élucidé à ce jour, et son absence dans les cellules infectées ne semble pas
perturber la morphogenèse ou l’infectiosité des virions produits. Ceci suggère que cette protéine
a un rôle mineur voire inexistant dans la formation de la particule infectieuse, une hypothèse
renforcée également par son absence de production chez les Avihepadnavirus. Ces protéines
d’enveloppe possèdent deux domaines transmembranaires clairement identifiés, associés à

24
Figure 3: Structure du génome viral et des ARN viraux transcrits du VHB
Le génome viral contient plusieurs éléments fonctionnels d’importance : deux séquences répétées (DR1
et DR2) à l’extrémité 5’ du brin sens nécessaire à la synthèse du brin d’ADN antisens lors de la
réplication, et deux promoteurs (EN1 et EN2) conférant une expression strictement hépatocytaire des
protéines virales. Au sein de la particule virale mature, la polymérase du virus est attachée de manière
covalente à l’extrémité 5’ du brin négatif. Les transcrits viraux se terminent tous par une séquence poly-
adenylée.
(Source : Tarik Asselah, Paris hepatology conference, janvier 2018)

Figure 4 : Représentation schématique de la particule virale mature du VHB

Les deux configurations de la protéine HBs-L sont représentées (cf. figure 5)
(Source : Hepatology, a clinical textbook, 9th edition)

25
deux domaines prédits comme structurés en hélice alpha (en partie C-terminale de S), dont la
topologie membranaire n’est pas encore clairement établie. Si la protéine S constitue l’élément
moteur du bourgeonnement viral, la protéine L, qui possède deux topologies membranaires
distinctes, est à la fois importante pour l’interaction avec la nucléocapside au cours du
bourgeonnement, mais aussi cruciale pour la reconnaissance de l’hépatocyte dans les phases
initiales de l’infection (Figure 5). De façon tout à fait originale, la sécrétion de virus
s’accompagne de particules sous-virales non infectieuses divisées en sphère de 22 nm et
filaments de longueur variable, uniquement constitués de protéines d’enveloppe (Figure 6).
Bien que leur existence soit connue depuis les prémices de la recherche sur le VHB, leur rôle
exact dans la pathogenèse de l’infection n’est toujours pas entièrement compris à ce jour.
Certaines études émettent l’hypothèse que les particules non infectieuses largement majoritaires
joueraient un rôle de leurre pour les anticorps neutralisants du patient (9). Les différentes formes
de ces particules s’expliquent par leur contenu différent pour les trois protéines d’enveloppe du
VHB. Les trois types de particules (virus, sphères et filaments sous-viraux) contiennent toutes
les trois la protéine S, au sein desquelles elle est majoritaire. Les virions et les filaments sont
riches en protéine L, laquelle est quasiment absente des particules sphériques sous-virales.
Finalement, la capacité des protéines d’enveloppe à s’auto-assembler pour bourgeonner en
particules sous-virales a été exploitée pour le développement de vaccins préventifs.
Aujourd’hui, l’expression des protéines d’enveloppe est réalisée en l’absence de tout autre
composants viral, par génie génétique (10) le plus souvent en modèle levure.
La protéine de capside (183 à 185 aa selon le génotype) comporte deux domaines : la
région N-terminale appelée domaine d’assemblage, suffisante pour l’auto-assemblage des
protéines en nucléocapsides, et la région C-terminale (ou domaine protamine) riche en résidus
arginines basiques conférant à celle-ci sa charge positive et essentielle pour l’encapsidation de
l’ARN prégénomique complexé à la polymérase. Les protéines de capside s’assemblent tout
d’abord en dimères, puis en particules virales composées de 120 dimères, mesurant 34 nm de
diamètre et obéissant à une symétrie T=4.
La polymérase du VHB (832 à 845 aa selon le génotype) est une enzyme qui
possède au moins trois activités : ADN-polymérase ARN dépendante, RNAase H, et ADN-
polymérase ADN dépendante. Dans un premier temps, l’activité ADN polymérase ARN-
dépendante permet la synthèse du brin d’ADN génomique négatif à partir de l’ARN
prégénomique. La synthèse de l’ADN est permise par le domaine TP N-terminal de la
polymérase qui reconnaît une structure tige-boucle de l’ARNpg. Cette reconnaissance liée à la
présence d’une tyrosine très conservée du domaine TP, va ensuite permettre l’initiation de la
synthèse du brin d’ADN viral négatif. Une fois la matrice ARN dégradée par son domaine
RNase H,

26
Figure 5 : Représentation schématique des glycoprotéines d’enveloppe du VHB
Les deux configurations de la protéine L sont représentées : la forme i-préS cytosolique (à droite)
interagissant avec la nucléocapside lors de l’assemblage, et la forme e-préS luminale (à gauche)
interagissant avec la surface des cellules lors de la phase d’attachement.
Myr: myristoylation N-terminale
(Source : https://viralzone.expasy.org)

Figure 6 : Représentation schématique et micrographie en coloration négative des particules

virales et sous-virales circulantes du VHB
(Sources : Patient et al., https://viralzone.expasy.org)

27
l’enzyme utilise alors son activité ADN polymérase ADN-dépendante afin de synthétiser le brin
d’ADN génomique positif.
La protéine X mesure 154 acides aminés. Sa séquence ne comporte aucune homologie
avec un gène connu, et sa structure demeure mal élucidée du fait de la difficulté à la produire
en quantités suffisantes in vitro (11). Malgré de nombreuses études, le rôle précis de cette
protéine au cours de l’infection demeure lui aussi mal élucidé, principalement du fait de
l’absence de modèle d’étude pertinent, ou de résultats publiés qui peuvent parfois être
contradictoires selon les études. Il est cependant établi que cette protéine possède un rôle
transactivateur de nombreux gènes, et module une large variété de processus impliqués dans le
cycle cellulaire, l’apoptose ou les mécanismes de réparation de l’ADN. Il a été montré qu’elle
interférait avec les grandes voies de la signalisation cellulaire (p53, NF-κB, Ras/MAPK…),
notamment via la modulation du calcium cytosolique (12) ou l’induction de facteurs liés à
l’hypoxie (13). En outre, la protéine X intervient très probablement dans le processus
multifactoriel de transformation maligne des hépatocytes au cours des hépatites chroniques,
aboutissant à l’émergence d’un carcinome hépatocellulaire (CHC) au bout de quelques
décennies.

4. Cycle viral et morphogenèse

Le VHB est, au même titre que les autres virus hépatotropes, un virus de petite taille (<
100 nm), prérequis indispensable pour passer dans les pores de l’endothélium hépatique fenêtré,
traverser l’espace de Disse et atteindre sa cellule cible : l’hépatocyte primaire humain. La phase
initiale d’attachement du VHB à la surface de l’hépatocyte met en jeu l’interaction de faible
affinité de la région pré-S1 de la protéine L d’enveloppe et des molécules glycosylées en surface
de l’hépatocyte comme les HSPG (Heparan Sulfate ProteoGlycan), résultant en une
augmentation localisée de la concentration en virion (14) (Figure 7). Les virions vont
reconnaître secondairement le NTCP (sodium taurocholate co-transporting polypeptide, un
transporteur de composants biliaires spécifique du foie), identifié comme un récepteur majeur
d’entrée du VHB (15). Une fois la capside relarguée dans le cytoplasme, elle est ensuite
adressée vers un pore nucléaire, où elle sera désassemblée afin de libérer le génome viral dans
le noyau. Une étape cruciale du cycle du VHB est la formation de l’ADNccc (covalently closed
circular DNA) à partir de l’ADNrc (relaxed circular DNA), par un mécanisme moléculaire qui
reste à élucider. Ce dernier met en jeu de nombreux facteurs cellulaires dont certains impliqués
dans les mécanismes de réparation de l’ADN, ainsi que des facteurs viraux (principalement la
protéine de capside et la protéine X) (16). Une fois synthétisé, l’ADNccc se complexe aux

28
Figure 7 : Cycle du virus de l’hépatite B
MVB : MultiVesicular Body
(Source : Morikawa et al. Hepatology research : the official journal of the Japan Society of Hepatology.
2016;46(9):871–7.)

29
histones de l’hôte pour former une structure apparentée à un mini-chromosome, responsable de
la persistance du virus dans la cellule (et l’organisme), et contre lequel les traitements antiviraux
actuels sont inopérants. L’ADNccc sert ensuite de matrice pour la synthèse des différents ARN
viraux. Parmi ces ARN, l’ARN prégénomique complexé à la polymérase virale constitue
l’acide nucléique qui est incorporé au sein de la nucléocapside en formation. Par la suite, la
polymérase virale assure la formation par transcription inverse du brin d’ADN viral négatif,
puis la synthèse du brin d’ADN viral positif formant l’ADNrc. Les nucléocapsides néoformées
suivent ensuite deux voies : soit elles vont constituer de nouveaux virions par acquisition de
leur enveloppe au niveau de membranes internes à la cellule, soit elles sont recyclées vers le
noyau afin d’amplifier la quantité d’ADNccc disponible (17). Les mécanismes qui régulent
l’adressage de la nucléocapside soit vers la production de virion, soit vers le compartiment
nucléaire demeurent pour l’instant inconnus. Concernant la morphogenèse des particules sous-
virales il a été montré que la protéine S est essentielle et suffisante pour leur bourgeonnement.
Ces protéines s’auto-assemblent pour former des filaments dans la lumière du réticulum
endoplasmique, ces filaments étant ensuite repliés et stockés sous forme de structures pseudo-
cristallines dans des vésicules dérivées du RE (ERGIC) (Figure 8). Ces longs filaments sont
ensuite progressivement dépliés et fragmentés en filaments plus courts ou en particules
sphériques avant d’être sécrétés. Il est aujourd’hui établi que les virions complets et infectieux
comportant un génome sous forme d’ADNrc (particule de Dane) représentent une infime partie
des particules excrétées par la cellule, au milieu d’un ensemble d’autres particules d’origine
virale mais hétérogènes, comme des particules sous-virales d’enveloppe, des virions dépourvus
de génome, des virions non matures comportant un ARN prégénomique et des capsides nues et
vides (18).

B. Infection par le VHB et carcinome hépatocellulaire

1. Historique

En 1963, Baruch Blumberg, un généticien travaillant au NIH sur le polymorphisme des

lipoprotéines observe une réaction inhabituelle en gel d’immunodiffusion, entre le sérum d’un
patient hémophile polytransfusé et celui d’un aborigène australien. Il nomme ce nouvel antigène
« Australian antigen » (Au) (Figure 9) (19). En 1967, le suivi de cohorte de patients suggéra à
Blumberg que la présence de l’antigène Au ait un lien avec le développement d’une hépatite
virale (20). Peu de temps après, en 1968, Alfred Prince qui travaillait au New York Blood
Center isola par immuno-électrophorèse un antigène spécifiquement associé aux hépatites post-
transfusionnelles qu’il nomme « Serum Hepatitis antigen » (SH) (21). Il est rapidement établi
que l’antigène Au et l’antigène SH ne sont en fait qu’un seul et même antigène. De plus, les

30
Figure 8 : Modèle de la morphogenèse des particules sous-virales du VHB
(Source : Patient et al. Cell Microbiol. 2009 Nov;11(11):1561–70.)

Figure 9 : Chronologie des principales découvertes scientifiques en rapport le VHB

(Source: Liu et al. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2013 Sep 1;45(9):1987–96.)

31
sérums de patients dans lesquels ce dernier est détecté présentent des particules d’aspect viral
en microscopie électronique. En 1970, David Dane identifie clairement la particule éponyme
de 42 nm, le virion du VHB (22). En 1972 au Japon, Okochi met en évidence la corrélation
entre la présence de l’antigène Au/SH (qu’il renomme antigène HBs) chez les donneurs de sang
et le développement d’une hépatite virale chez les receveurs. Par la suite, le rôle protecteur des
immunoglobulines anti-HBs pour la prophylaxie des professionnels de santé est documenté. En
1974, Philippe Maupas, médecin hospitalier et chercheur tourangeau, effectue un stage de six
mois dans le service du Professeur Blumberg, où il confirme sur des arguments
épidémiologiques et virologiques, la relation étiologique entre le virus de l'hépatite B et le
cancer primitif du foie. Dans le même temps, Blumberg émet l’hypothèse qu’un vaccin pourrait
être obtenu à partir de plasma de patients porteurs chroniques présentant un titre élevé
d’antigène HBs. Dès son retour en France en 1975, Philippe Maupas met ce concept en
application pour produire le premier vaccin dirigé contre le VHB, dont l’innocuité et
l’immunogénicité sont contrôlées chez le chimpanzé. En octobre de la même année, la
vaccination est appliquée à l’homme, notamment chez des patients hémodialysés du CHRU de
Tours . En 1976, Blumberg reçoit le prix Nobel de médecine pour sa description du VHB et
pour son concept d’un vaccin contre le virus. En 1978, la vaccination contre le VHB est étendue
aux jeunes enfants au Sénégal, pays de forte endémie (23). Le vaccin est ensuite proposé pour
être ajouté aux programmes élargis de vaccination de l’OMS. En 1981, Philippe Maupas reçoit
pour ses travaux, reconnus par l’ensemble de la communauté scientifique, le prix Galien. Les
années 1980 voient ensuite l’apparition de vaccins recombinants obtenus par production de
l’antigène HBs sur lignées cellulaires de rongeurs en remplacement des vaccins dérivés du sang.
En termes de thérapeutique, la plupart des analogues nucléosidiques encore utilisés aujourd’hui
ont été validés dans les années 1990 et 2000 (Figure 10) (cf.I.B.8).

2. Épidémiologie

Le virus de l’hépatite B (VHB) est un agent infectieux d’importance majeure en

pathologie humaine d’une part en termes de morbi-mortalité (du fait des complications de
l’infection chronique) et d’autre part du fait de sa forte prévalence dans la population mondiale.
Le VHB se transmet via l’exposition au sang et dans une moindre mesure aux fluides corporels
(particulièrement le sperme et les sécrétions vaginales), l’allaitement ne semblant pas être un
vecteur de transmission (24). Très résistant, il peut survivre de manière prolongée hors de
l’organisme, notamment sur le matériel et les surfaces en milieu hospitalier. Au niveau mondial,
la plupart des infections sont acquises par transmission périnatale, par transmission horizontale
entre enfants en bas âge, et à partir de l’adolescence par voie sexuelle et via les drogues
32
Figure 10 : Chronologie d'apparition et structure moléculaire des traitements médicamenteux
validés dans le cadre de l'infection par le VHB
ETV : entecavir, PEG-IFN : pegylated-interferon, TDF : tenofovir, LAM : lamivudine, LdT :
telbivudine, TAF : tenofovir alafenamide
(Source : Schinazi et al. Liver Int. 2018;38 Suppl 1:102–14.)

33
injectables (25). Les autres modes de transmission, dont la fréquence a fortement diminué grâce
au renforcement des mesures de contrôle sanitaire, comprennent la contamination par les
produits dérivés du sang et les pratiques médicales non respectueuses des normes d’hygiène.
Malgré tout, les infections par le VHB associées aux soins demeurent une préoccupation
majeure dans les établissements des pays en voie de développement (26) comme dans les pays
développés (27), soulignant le caractère essentiel de la vaccination chez les professionnels de
santé et les patients hospitalisés.
L’estimation du nombre de patients chroniquement infectés par le virus oscille entre 240
millions (28) et 350 millions (29), avec un peu plus de 2 milliards d’individus ayant été en
contact avec le VHB au cours de leur vie. L’infection chronique par le VHB a été responsable
de 786 000 décès au cours de l’année 2010, principalement attribuables au carcinome
hépatocellulaire (341 000) et à la cirrhose (312 000), plaçant cette infection au 15ème rang des
causes de mortalité toutes pathologies confondues (30). Malgré cela, le groupe de patients
chroniquement infectés le plus important est celui des porteurs chroniques inactifs, qui
présentent le plus souvent une absence de fibrose hépatique mais dont l’évolution peut malgré
tout se faire vers des formes de mauvais pronostic (31).
L’épidémiologie de l’hépatite B peut être décrite en termes de prévalence de l’antigène
HBs dans une population (Figure 11), définissant des zones de forte (> 8 % AgHBs),
intermédiaire (2-7 %) et faible prévalence (< 2 %) (32). Les pays à forte prévalence sont
globalement répartis en Afrique subsaharienne et en Asie Pacifique. On estime que 45 % de la
population mondiale vit dans une zone de forte prévalence. La plus forte prévalence, supérieure
à 12 %, est observée en Afrique subsaharienne (Nigeria, Tchad, RDC…). Dans ces pays, la
majorité des individus est infectée à la naissance ou dans l’enfance, un facteur aggravant qui
expose à un risque élevé de passage à la chronicité. L’impact de la vaccination à grande échelle
et dès la petite enfance est particulièrement important dans ces populations. Les pays à
prévalence intermédiaire se situent au Moyen-orient, au Maghreb, en Europe de l’Est et du Sud,
ainsi qu’en Amérique latine. Les campagnes de prévention et d’immunisation produisent déjà
des effets mesurables, un certain nombre de régions autrefois catégorisées comme à forte
prévalence sont aujourd’hui considérées comme à prévalence intermédiaire (33). Les individus
vivants dans les pays de faible prévalence représentent seulement 12 % de la population
mondiale et sont regroupés en Europe de l’Ouest et du Nord, Amérique du Nord, Australie et
au Japon. Dans ces pays, l’incidence de la transmission périnatale et dans l’enfance est faible,
la plupart des infections ayant lieu à l’adolescence et à l’âge adulte par transmission sexuelle,
injections de drogues et infections liées aux soins. Les catégories de patients particulièrement
exposés au risque d’être infectés sont : les détenus, les travailleurs du sexe, les hommes ayant

34
Figure 11 : Prévalence de l’antigène HBs au niveau mondial en 2016
(Source : Polaris Observatory Collaborators, Lancet Gastroenterol Hepatol. 2018;3(6):383–403.)

Figure 12 : Incidence des cancers du foie au niveau mondial en 2012

Incidence estimée chez les hommes (A) et chez les femmes (B) exprimée en taux standardisé sur l’âge
pour 100 000 habitants (ASR per 100 000)
(Source: Global Cancer Observatory, International Agency for Research on Cancer)

35
des relations sexuelles avec des hommes, et les sans-abris (34). Les flux migratoires dirigés des
pays de forte prévalence vers des pays de faible prévalence jouent également un rôle dans
l’évolution de la prévalence de l’antigène HBs, la majorité des patients infectés chroniquement
par le VHB dans les régions de faible prévalence étant souvent nés dans des zones de forte
endémie où ils ont été infectés dès leur plus jeune âge (35).
Le carcinome hépatocellulaire est la forme de cancer du foie la plus fréquente, cancer
du foie qui représente, toutes étiologies et sexes confondus, la deuxième cause de décès liés à
un cancer, soit un décès sur dix (36). Au niveau mondial, les deux tiers des cancers du foie
surviennent dans la région du Pacifique occidental (« Western Pacific WHO region »),
répartition largement expliquée par la forte incidence de ce cancer en Chine, où survient la
moitié des cancers du foie mondiaux (Figure 12). Il existe clairement au niveau mondial un
lien entre la répartition géographique de la prévalence du VHB et du virus de l’hépatite C
(VHC) et celle de l’incidence des cancers du foie, ces deux virus étant responsables de la grande
majorité des cas de CHC. La prévalence du VHB influence également les causes de décès liés
à l’hépatite B chronique, les patients des pays de forte prévalence décédant majoritairement de
CHC et non pas de cirrhose. L’hétérogénéité de l’incidence du CHC à l’échelle mondiale
s’explique également par des facteurs non viraux, comme la contamination de végétaux destinés
à l’alimentation par l’aflatoxine B1 (mycotoxine aspergillaire qui exerce un effet cancérigène
synergique avec celui lié au virus), et des facteurs viraux comme le génotype du VHB. Malgré
des progrès importants dans la prise en charge des cancers toutes causes confondues, la
mortalité liée au cancer du foie continue à augmenter, même dans les pays développés ayant à
leur disposition l’option de la transplantation hépatique. Cela souligne la nécessité d’un
dépistage élargi de l’hépatite B et des autres virus hépatotrope, associé à la vaccination des
populations (37) et l’accès à une thérapie antivirale adaptée, permettant ainsi de réduire
indirectement l’incidence du CHC.

3. Génotypes et variants

Le génotype, reflet de l’hétérogénéité génétique du virus à l’échelle mondiale, est définit

arbitrairement pour le VHB par une divergence > 8 % du génome complet entre deux souches
virales (Figure 13). Ses neuf génotypes, répartis de manière inégale sur la planète (Figure 14),
revêtent une importance en termes d’épidémiologie, de physiopathologie et de réponse aux
traitements (38). L’hétérogénéité génétique est ainsi en partie responsable d’une hétérogénéité
de l’évolution de la maladie chez les patients. Le génotype A est plus présent en Europe et en
Afrique subsaharienne. Le génotype D prédomine en Europe, Afrique du Nord, Moyen-Orient
et Asie centrale. Les génotypes B et C se répartissent en Asie Pacifique. Le génotype E est

36
Figure 13 : Relations phylogénétiques des génotypes du VHB
Arbre phylogénétique non enraciné construit à partir de 2992 génomes par méthode de Neighbor-
Joining. Les nombres présents sur chaque clade correspondent au nombre de bootstrap réalisé.
(Source : Li et al. Sci Rep. 2017 May 16;7(1):1990–1990.)

Figure 14 : Distribution des génotypes du VHB au niveau mondial

Les diagrammes circulaires représentent la proportion relative de chaque génotype dans un pays
donné.
(Source : Velkov et al. Genes (Basel). 2018 Oct 15;9(10):495.)

37
restreint à l’Afrique de l’Ouest. Le génotype F se limite quant à lui à l’Amérique latine. Les
génotypes C et D sont globalement de moins bon pronostic que les génotypes A et B pour
plusieurs raisons : un taux de séroconversion HBe plus bas, un risque plus élevé de développer
un CHC ou une cirrhose, une fréquence des mutations de mauvais pronostic plus élevée, enfin
une moins bonne réponse aux traitements immunomodulateurs. Cette différence s’explique en
termes physiopathologiques in vitro, en particulier pour le génotype C, par des niveaux d’ADN
VHB, d’antigène HBc intracellulaire et d’antigène HBe extracellulaire, plus élevés que d’autres
génotypes. L’accumulation de ces composants viraux à des niveaux élevés dans les hépatocytes
est probablement à l’origine de lésions hépatiques plus importantes. Une étude récente a
également mis en évidence l’impact du génotype sur les caractéristiques des particules sous-
virales circulantes, avec une différence en termes de ratio [sphères / filaments] et une sécrétion
de filaments augmentée pour les génotypes B et D par rapport aux génotypes A, C et E (39).
Dans le cycle viral, l’apparition de mutations du génome se fait principalement à l’étape
de transcription de l’ARN prégénomique (40). Ce taux d’erreur associé à la pression du système
immunitaire de l’hôte génère l’apparition de mutants, les trois plus fréquents étant les mutants
de la région pré-core, du promoteur basal de la core (BCP) et de la région pré-S. En outre, il est
à noter que la pression de sélection liée aux traitements par analogues nucléosidiques est
également génératrice de mutations, situées dans la région codant pour la transcriptase inverse,
aboutissant à une résistance à ces traitements. La séroconversion HBe est une étape essentielle
dans l’histoire naturelle de l’hépatite B chronique, la disparition de l’antigène HBe marquant
l’entrée du patient dans la phase de portage chronique inactif. Les mutations des régions pré-
core (G1896A) et BCP (A1762T/G1764A) affectent toutes deux la production de l’antigène
HBe. Ainsi, les patients infectés par ces mutants présentent des niveaux d’antigène HBe
sériques très faibles voire indétectables mais une réplication virale persistante associée à un
risque de progression de leur hépatopathie vers des formes de mauvais pronostic. L’apparition
de ces mutants semble donc liée à une sélection lors de l’étape de séroconversion HBe, et
constitue un mécanisme d’échappement au système immunitaire. Du fait du chevauchement
des cadres de lecture, les mutations du BCP n’affectent pas seulement la synthèse de l’antigène
HBe mais également la séquence de la protéine HBx. Il est établi que la protéine X du VHB
joue un rôle majeur dans la transformation des hépatocytes favorisant l’apparition d’un CHC.
Chez les patients infectés par un mutant BCP, il a été suggéré que des mutations induites dans
la séquence de la protéine X augmentent le risque de développer un CHC (41). Les protéines
de surfaces du VHB comportent des épitopes majeurs reconnus par les lymphocytes T et B, et
représentent la cible des immunoglobulines vaccinales. Il n’est donc pas étonnant que la
pression du système immunitaire, augmentée par la pression vaccinale, soit génératrice

38
de mutations spontanées dans la séquence codant pour les trois protéines de surface du VHB,
survenant le plus fréquemment dans les régions pré-S1 et pré-S2. Là encore du fait de
cadres de lecture chevauchants, certaines mutations de la séquence de la transcriptase inverse
sélectionnées par les traitements ont également un impact sur la séquence codant pour les
protéines de surface. Ces mutations ont pour conséquence la diminution de l’expression des
protéines S et M en faveur de l’expression de la protéine L. Cela aboutit à une accumulation
intracellulaire de cette protéine, source de dégâts plus importants dans les hépatocytes infectés,
et donc à un risque d’évolution accru vers des formes de mauvais pronostic (42). Les autres
conséquences des épitopes modifiés chez les mutants pré-S peuvent être un échappement à la
réponse vaccinale humorale ou une mise en défaut de la détection de l’antigène HBs par les
tests sérologiques usuels (risque de sous-estimation voire de faux négatif). Ces mutations pré-
S semblent également jouer un rôle dans la survenue d’une hépatite B occulte (cf. I.B.5.).

4. Physiopathologie
a) Organe cible du VHB : le foie

Le VHB est un virus possédant un tropisme strictement hépatocytaire. A ce titre, les

principales conséquences d’une infection par ce virus seront d’ordre hépatique. Le foie est un
organe abdominal de l’appareil digestif à l’origine de fonctions vitales pour l’organisme. La
vascularisation afférente comprend l’artère hépatique propre, apportant le sang artériel
oxygéné, et la veine porte, issue du drainage du tube digestif apportant un sang veineux riche
en nutriments (Figure 15). Associés au canal biliaire hépatique commun, qui assure le transport
de la bile du foie vers le duodénum via le cholédoque, ces trois entités anatomiques forment
ensemble le pédicule hépatique, situé à la face inférieure du foie. La vascularisation efférente
correspond aux veines hépatiques situées sur sa face supérieure, et qui drainent le sang veineux
du foie vers la circulation systémique via la veine cave inférieure. Enfin, le foie est enveloppé
dans une capsule de tissu conjonctif principalement constitué de collagène de type IV, la
capsule de Glisson, qui s’invagine à l’intérieure du parenchyme hépatique et sert de support à
la vascularisation afférente. Au niveau anatomique et fonctionnel, le foie peut être divisé en
segments, chaque segment vascularisé par une branche de la circulation veineuse. Au niveau
histologique, l’unité structurale du foie est le lobule hépatique, un foie humain comportant
environ 106 lobules. Le lobule est un prisme à section plus ou moins hexagonale d’un diamètre
de 1 mm. Au milieu de chaque lobule se trouve une veine centro-lobulaire, connectée à la
circulation efférente. Chaque sommet de l’hexagone comporte une triade portale associant une
artériole interlobulaire, une veinule interlobulaire et un conduit biliaire,

39
Figure 15 : Structure du foie du niveau anatomique au niveau histologique

40
ramifications des gros vaisseaux du pédicule hépatique. Les triades portales circulent dans une
fine gaine de tissu conjonctif qui délimite le lobule. L’hexagone est rempli de travées
hépatocytaires, d’épaisseur monocellulaire, qui irradient depuis la veine centrale vers la
périphérie. On trouve entre chaque travée un capillaire sinusoïde veineux, qui relie une veinule
porte à la veine centrolobulaire. Les deux unités fonctionnelles du foie sont le lobule portal et
l’acinus hépatique, qui se superposent à l’organisation structurale (Figure 16). Un lobule portal
est un bloc triangulaire de parenchyme hépatique centré par une triade portale et dont chaque
sommet comporte une veine centrolobulaire. Au sein de ce lobule, la bile secrétée par les
hépatocytes via les canalicules biliaires puis les canaux de Hering circule des sommets du
triangle vers le conduit biliaire en son centre. Un acinus hépatique possède une structure
ellipsoïde dont le grand axe relie deux veines centrolobulaires, et dont le petit axe relie deux
triades portales. Au sein de l’acinus, les sangs artériel et veineux mêlés circulent au sein des
sinusoïdes de la triade portale vers la veine centro-lobulaire. Le sens de la microcirculation
génère un gradient décroissant d’oxygène et de nutriments, définissant trois zones
métaboliques : la zone 1 périportale, la zone 2 médiolobulaire, et la zone 3 péricentrale (43).
Les hépatocytes périportaux sont les premiers à recevoir l’oxygène artériel et les nutriments
digestifs, ils contiennent plus de mitochondries et moins de RE lisse que les hépatocytes
péricentraux, et sont le siège de processus oxydatifs (cycle de Krebs, phosphorylation
oxydative, néoglucogenèse, cycle de l’urée, synthèse protéique…) (Figure 17). Les
hépatocytes péricentraux sont quant à eux le siège de processus réducteurs (glycolyse, synthèse
de la glutamine, synthèse lipidique, biotransformation des xénobiotiques, catabolisme de
l’hème…). La zonation métabolique du foie revêt une importance en termes physiologiques.
Elle est également utile dans la compréhension de certains processus pathologiques
toxicologiques (44) (la zone périportale étant souvent la première touchée car située en première
ligne sur le réseau veineux) ou néoplasiques (45) (l’agressivité du cancer étant en partie liée au
phénotype hépatocytaire initial et donc à sa localisation).
D’un point de vue fonctionnel, le foie joue un rôle dans de nombreuses fonctions
métaboliques : la régulation de l’homéostasie interne de l’organisme (régulation du pH via le
métabolisme de l’urée) ; la prise en charge des nutriments d’origine digestive, notamment au
travers du stockage et de la libération de l’énergie, via le métabolisme et le catabolisme des
protéines, des lipides et des glucides ; la transformation de certaines hormones et vitamines ; la
détoxification de composés exogènes et endogènes. Il remplit également une fonction exocrine
par la production de bile, nécessaire pour la digestion des lipides au niveau intestinal et
l’excrétion de molécules biotransformées dans les selles, notamment la bilirubine issue du
catabolisme de l’hémoglobine. On lui associe aussi une fonction endocrine par la production de

41
Figure 16 : Organisation fonctionnelle du foie au niveau histologique

Figure 17 : Zonation métabolique du lobule hépatique

(Source: Arch Toxicol. 2013 Aug;87(8):1315–530.)

42
l’IGF-1, de l’angiotensinogène, de l’hepcidine, ou encore de l’EPO et de la TPO en association
avec le rein. Il est à l’origine de la synthèse de la plupart des protéines plasmatiques, notamment
de l’albumine, de l’alpha-foetoprotéine, des facteurs de la coagulation (thrombine,
fibrinogène…), d’anti-protéases (alpha-2-macroglobuline, alpha-1-antitrypsine…) et des
apolipoprotéines. Enfin, le foie est impliqué dans une grande variété de processus immunitaires
par le biais de ses cellules résidentes (cellules de Kupffer, macrophages…). La destruction du
parenchyme hépatique lors d’une infection par le VHB, qu’elle soit brutale lors d’une hépatite
fulminante ou progressive du fait de l’évolution fibrosante d’une hépatite chronique, entraînera
la perte partielle ou totale de ces fonctions vitales, on parle alors d’insuffisance hépatocellulaire.

b) Cellule cible du VHB : l’hépatocyte primaire humain

D’un point de vue cellulaire, le foie est composé à 60 % de cellules parenchymateuses

épithéliales (i.e. les hépatocytes), et pour 40 % de cellules non parenchymateuses spécialisées,
formant un microenvironnement dans lequel est inclus l’hépatocyte primaire humain (PHH)
(Figure 18).
Au sein du lobule hépatique, les parois des sinusoïdes veineux sont formées par les
cellules endothéliales sinusoïdales dont la structure est fenêtrée par des pores de 0,1 µm
traversant la cellule de part en part. Cet endothélium fenêtré constitue une barrière à la fois
hautement perméable et protectrice, à l’interface des échanges entre la lumière du vaisseau
contenant le sang et l’hépatocyte. Les cellules endothéliales peuvent également fonctionner
comme des cellules présentatrices d’antigène, et à ce titre intervenir dans des mécanismes de
tolérance immune (46). L’espace de Disse, où ont lieu ces échanges, est délimité par la cellule
endothéliale d’une part et les microvillosités hépatocytaires d’autre part. La perméabilité est
également dépendante de l’absence de membrane basale sous la cellule endothéliale, la
cohérence de la structure étant assurée par une fine couche de fibronectine. Les cellules de
Kupffer appartiennent au système phagocytaire mononucléé et résident dans le foie à l’intérieur
de la lumière des sinusoïdes veineux. Elles jouent un rôle de sentinelle du système immunitaire,
le foie étant le premier organe filtre du sang drainé depuis le tube digestif, en phagocytant les
agents infectieux circulants, en recyclant les hématies âgées, et en captant les composés
toxiques (47). Les cellules stellaires hépatiques sont situées dans l’espace de Disse où elles
jouent un rôle essentiel dans la synthèse et la dégradation des composants matriciels, ainsi que
dans le métabolisme de la vitamine A (48). A l’état physiologique, les cellules endothéliales
sinusoïdales exercent une fonction inhibitrice sur les cellules stellaires, régulant ainsi la
production de matrice extracellulaire. Les cholangiocytes forment un épithélium cuboïde

43
Figure 18 : Microenvironnement hépatocytaire
Pit cells = cellules NK spécifiques du foie
(Source: Arch Toxicol. 2013 Aug;87(8):1315–530.)

44
constituant la paroi des conduits biliaires en continuité avec les canalicules biliaires
hépatocytaires. Enfin, les capacités remarquables de régénération du foie sont notamment
assurées par des cellules souches résidentes, probablement situées au niveau des canaux de
Hering, entre les cholangiocytes matures et les hépatocytes (49).
L’hépatocyte primaire humain est une cellule épithéliale mesurant de 20 à 30 µm, dont
la durée de vie moyenne en conditions physiologiques est de 5 mois. Cette cellule est polarisée
mais pas selon la polarité apicale/basolatérale classique. L’équivalent du domaine apical est
représenté ici par la membrane plasmique canaliculaire qui forme une structure tubulaire en
réseau correspondant aux canalicules biliaires. La composition originale de cette membrane,
riche en cholestérol et en sphingomyéline, la rend particulièrement résistante à la solubilisation
par les acides biliaires sécrétés par l’hépatocyte (50). Les membranes plasmiques latérales des
hépatocytes sont en contact via des desmosomes, et des jonctions communicantes permettant
les échanges intercellulaires. Enfin, ils présentent une membrane plasmique basale hérissée de
microvillosités sur leurs deux faces externes via lesquelles ils échangent avec le plasma
baignant l’espace de Disse. Leur noyau est central, avec une forte proportion de cellules
polyploïdes. Ils sont très riches en organites intracellulaires, notamment en RE lisse, et
contiennent d’abondants grains de glycogène et gouttelettes lipidiques, témoins d’une grande
activité métabolique (Figure 19). A la polarisation structurale est couplée une polarisation
fonctionnelle illustrée par la répartition des transporteurs membranaires, qui permettent de
puiser les composés chimiques nécessaires à la formation de la bile au niveau basolatéral et de
sécréter les composants biliaires au niveau canaliculaire (Figure 20). A titre d’exemple, le
NTCP, identifié comme le récepteur d’entrée du VHB, est situé sur le versant basolatéral de la
membrane de l’hépatocyte. C’est un co-transporteur qui permet de réabsorber les sels biliaires
présents au niveau du sang, en association avec deux ions sodium.

c) Hépatite virale B : inflammation et fibrose

Afin de comprendre la physiopathologie de l’infection par le VHB, il est nécessaire de

s’intéresser aux mécanismes immunologiques à l’œuvre au niveau du foie (Figure 21). Le virus
de l’hépatite B a pour particularité d’être un virus non directement cytopathique pour les
hépatocytes infectés (51) (l’accumulation intracellulaire anormale de certains composants
viraux peut cependant avoir un effet cytotoxique indirect à plus long terme). La cytolyse
observée lors d’une hépatite virale B aiguë ou chronique est donc essentiellement la
conséquence de la réponse immune de l’hôte. D’autre part, le VHB est considéré comme un

45
Figure 19 : Organisation ultrastructurale de l'hépatocyte primaire humain
(Source: Junqueira's Basic Histology: Text and Atlas 15th edition)

Figure 20 : Polarité structurale et fonctionnelle de l'hépatocyte primaire humain

(Source : Trauner et al. N Engl J Med. 1998 Oct 22;339(17):1217–27.)

46
virus « furtif » vis-à-vis de la réponse immunitaire innée initiale. A contrario le VHC, autre
virus hépatotrope majeur, déclenche précocement une importante réponse innée (52). A la phase
précoce de l’infection, le VHB fait usage de mécanismes de blocage des cellules impliquées
dans la réponse innée, grâce à son protéome. L’excès de production d’antigène HBs des
particules sous-virales inhibe significativement la réponse des lymphocytes NK et des
macrophages, en stimulant la production de l’IL-10 à l’action immunosuppressive (53). Quant
à l’antigène HBe il influe particulièrement sur les monocytes et les cellules de Kupffer, en
régulant négativement l’expression du TLR-2, des ISG, et des cytokines pro-inflammatoires
(TNF, IL-6, IL-8…) favorisant la persistance virale (54). En outre, cette furtivité du VHB se
reflète dans ses modalités de réplication : sa matrice de transcription (ADNccc) est placée à
l’abri dans le noyau, ses ARN messagers viraux sont coiffés et polyadénylés pour se rapprocher
de la structure des transcrits cellulaires, et les génomes viraux néo-synthétisés dans le
cytoplasme sont rapidement dissimulés dans les capsides en formation (55)
Il est aujourd’hui établi que la persistance d’une réplication virale, qui mène à la
chronicité de l’hépatite B, est en grande partie liée à l’incapacité du système immunitaire à
monter une réponse adaptative efficace et coordonnée de type CD4 et CD8 (56). Cette réponse
est forte et multi-spécifique chez les patients présentant une hépatite aiguë de résolution
spontanée, et faible chez les patients qui évoluent vers la chronicité. Elle dépend notamment
d’un amorçage précoce de la réponse CD4, amorçage d’autant moins efficace que l’inoculum
de départ est faible (57). Le principal acteur de la destruction des hépatocytes infectés par le
virus est le lymphocyte T cytotoxique CD8+ spécifique du VHB. Il exerce une action
cytolytique sur les hépatocytes via deux mécanismes : un effet pro-apoptotique déclenché par
le système FAS-FAS ligand et une lyse des cellules par la sécrétion de granzyme/perforine (58).
Il exerce en parallèle une action non cytolytique par la sécrétion d’IFNg, qui va inhiber
l’expression des gènes du VHB et la réplication virale, notamment en potentialisant la
dégradation de l’ARN prégénomique (59,60). Concernant l’immunité humorale, la production
d’anticorps neutralisants dirigés contre l’antigène HBs joue un rôle de blocage de l’entrée du
virus en extracellulaire dans les hépatocytes sains (61). Ils peuvent également être endocytés
dans les cellules déjà infectées et réduire la sécrétion d’antigène HBs par une interaction au
niveau intracellulaire (62). L’apparition relativement tardive de ces anticorps au cours de
l’infection indique un rôle secondaire par rapport à l’immunité adaptative cellulaire pour ce qui
est de la clairance précoce du virus. Ils peuvent cependant participer à la lyse des cellules
infectées par un mécanisme de type ADCC.
La destruction des hépatocytes infectés est salvatrice pour la clairance du virus si elle
demeure limitée dans le temps, délétère si elle persiste sur le long terme, aboutissant à des

47
Figure 21 : Mécanismes immunologiques de l'hépatite virale B
Les flèches rouges représentent un effet inhibiteur.
TRAIL: Tumor-Necrosis-Factor Related Apoptosis Inducing Ligand, NO: Nitric Oxide, APC:
Antigen-Presenting Cell, PDL1: Programmed Death-Ligand 1, MHC: Major Histocompatibility
Complex, TCR: T-Cell Receptor, FOXP3: Forkhead box P3
(Source : Yuen et al. Nature Reviews Disease Primers. 2018 Jun 7;4:18035.)

48
phénomènes de nécroinflammation. La lyse cellulaire prolongée libère en continu des corps
apoptotiques et des DAMPs (motifs moléculaires associés aux dégâts). Ces résidus cellulaires
induisent la production, par les macrophages activés, de radicaux libres et de médiateurs de
l’inflammation (63). Le stress oxydant joue notamment un rôle sur les cellules endothéliales
sinusoïdales qui vont se « capillariser » (perte de la structure fenêtrée et apparition d’une
membrane basale moins perméable) et perdre leur fonction inhibitrice vis-à-vis des cellules
stellaires (Figure 22) (64). Les corps apoptotiques vont également jouer un rôle activateur de
ces cellules (65). De plus, les cytokines pro-inflammatoires vont induire des signaux de survie
dans les cellules stellaires. Les cellules stellaires activées vont alors produire des composants
matriciels fibreux en quantité excessive, aboutissant peu à peu au remplacement du parenchyme
hépatique lysé au profit d’une structure fibreuse acellulaire non fonctionnelle. Au stade ultime
de ce processus, le tissu fibreux entoure des nodules hépatocytaires de régénération, on parle
alors de cirrhose.

d) CHC et transformation cellulaire

L’apparition d’un carcinome hépatocellulaire lors d’une infection chronique par le VHB
est un processus multifactoriel faisant intervenir des facteurs viraux et des facteurs d’hôtes,
aboutissant in fine à une prolifération incontrôlée d’hépatocytes transformés. On distingue
schématiquement trois groupes de mécanismes : les lésions cellulaires consécutives à
l’agression par le système immunitaire, l’intégration de l’ADN du VHB dans le génome des
hépatocytes, et l’action directe des protéines virales sur la cellule. Bien que ces mécanismes
aient été identifiés on ne connaît pas avec précision l’importance de leurs contributions
respectives dans la physiopathologie du CHC.
La destruction prolongée des hépatocytes infectés par le système immunitaire induit une
régénération permanente du parenchyme grâce aux capacités de prolifération des cellules
souches hépatiques, dans un environnement inflammatoire riche en radicaux libres. Ces
molécules vont entraîner des dommages sur l’ADN génomique, source de mutations et
d’anomalies chromosomiques. Le risque de survenue de telles anomalies est augmenté par les
erreurs de réplication du génome cellulaire induit par la prolifération ininterrompue des
hépatocytes, a fortiori si les mécanismes de réparation de l’ADN et de détoxification sont aussi
impactés. La survenue de ces anomalies au sein de gènes suppresseurs de tumeurs ou de
promoteurs d’oncogènes mène à une dérégulation croissante du cycle cellulaire et de la mitose,
souvent associée à la perte de fonctions proapoptotiques au profit de fonctions encourageant la
survie cellulaire.
Chez les patients développant un CHC au cours d’une infection par le VHB, il est depuis
longtemps établi que l’ADN tumoral contient de nombreuses séquences clonales intégrées
49
Figure 22 : Rôle du couple cellule endothéliale sinusoïdale - cellule stellaire hépatique dans la
fibrogénèse au cours d’une hépatopathie chronique
LSEC: Liver Sinusoidal Endothelial Cell, HSC: Hepatic Stellate Cell, BM: Basal Membrane, NO:
Nitric Oxide, E: endothelin, KLF2: Kruppel-Like Factor 2
(Source : Poisson et al. J Hepatol. 2017;66(1):212–27.)

50
d’ADN du VHB, la plupart du temps flanquées de micro-délétions de l’ADN cellulaire. Cette
intégration ne semble pas aléatoire, mais affecte préférentiellement certaines régions du
génome, notamment les sites chromosomiques rares et fragiles, les îlots CpG (66) et les
séquences codant pour la télomérase reverse-transcriptase. Ces phénomènes d’intégration
contribuent à augmenter l’instabilité génomique des cellules infectées, la probabilité
d’intégration étant augmentée par le turnover important des hépatocytes lors de la régénération
du parenchyme.
La protéine X du VHB semble jouer un rôle clef dans le processus de transformation
des cellules, avec un rôle transactivateur de gènes associés au contrôle de la croissance
cellulaire (Jun-fos, NF-κB) (67). Elle interfère également avec nombre de facteurs de
transcription (Egr1, CREB…) de systèmes de réparation de l’ADN (p53, DDB1…), de voies
de signalisation (Jak-STAT, PI3k, Ca2+…), de régulateurs du protéasome (PSAM1) et de
protéines chaperonnes (Hsp60) (68). En outre, la présence d’une protéine HBx délétée en C-
terminal est fortement associée au développement d’un CHC (69), une telle protéine ayant une
capacité accrue à interagir avec les oncogènes ras et myc. Les protéines de surface HBs-L et
HBs-M semblent également jouer un rôle transactivateur (70). Enfin, l’accumulation excessive
de HBs-L en intracellulaire exerce un effet cytotoxique in vitro qui s’ajoute probablement à la
destruction cellulaire médiée par le système immunitaire (71).

5. Clinique et histoire naturelle

L’histoire naturelle de l’infection par le VHB est caractérisée par sa grande complexité.
C’est un processus dynamique influencé par de nombreux facteurs : viraux (génotype,
mutations virales, niveau de réplication) ou d’hôte (âge au moment de l’infection, sexe, statut
immunitaire, co-infection par un autre virus hépatotrope, éthylisme chronique).
L’infection aiguë par le virus de l’hépatite B peut être asymptomatique ou se manifester
par des signes non spécifiques en rapport avec l’atteinte hépatique : fièvre, asthénie, ictère,
douleur de l’hypochondre droit, hépatomégalie… L’âge au moment de la primo-infection est
déterminant pour le risque de passage à la chronicité. Il est particulièrement élevé, environ 90
%, en cas de transmission périnatale, modéré en cas de transmission horizontale dans la petite
enfance (25-30 %) et plus faible en cas de transmission horizontale tardive (5-7 %) (72).
L’infection chronique est classiquement décrite en trois phases, mais recouvre en réalité
un large spectre clinique selon le profil du patient (Figure 23) (73). Une première phase
d’immunotolérance (ou d’infection chronique HBe positive) caractérisée par la présence des
antigènes HBs et HBe dans le sang associée à une réplication élevée. Durant cette phase, le
patient présente un niveau normal ou peu élevé d’alanine aminotransférase (ALAT) et une
51
Figure 23 : Cinétique des marqueurs virologiques et biochimiques lors des phases successives de
l'infection chronique par le VHB
(Source: d’après European Association for the Study of the Liver 2017 guidelines)

52
activité histologique hépatique minime, reflet d’une réponse immune très faible contre les
hépatocytes. Cette phase est souvent rencontrée chez les patients infectés en périnatal et peut
durer plusieurs décennies. La disparition de l’effet tolérogène marque l’entrée dans la seconde
phase dite immunoactive (ou hépatite chronique HBe positive), avec une diminution
significative de la réplication virale, une augmentation des ALAT et de l’activité histologique
dans le foie, témoignant de la lyse des hépatocytes par le système immunitaire. Cette phase est
d’une durée variable, de plusieurs mois à plusieurs années. Enfin, la séroconversion HBe
(disparition de l’AgHBe au profit d’anticorps anti-HBe) marque l’entrée dans la troisième phase
non réplicative de contrôle immunitaire (ou infection chronique HBe négative), avec une charge
virale très faible voire indétectable, une normalisation du bilan hépatique et la résolution des
phénomènes de nécroinflammation et de fibrose au niveau du foie. Les patients sont alors
considérés comme porteurs chroniques inactifs de l’antigène HBs (« HBsAg inactive
carriers »), et constituent le plus vaste groupe de patients chroniquement infectés avec environ
300 millions d’individus au niveau mondial (74).
Bien que la majorité des patients présente une rémission biochimique et histologique
durable, 20 à 30 % d’entre eux sont susceptibles de subir une ou plusieurs réactivations
spontanées de leur hépatite B, parfois asymptomatiques, chaque épisode occasionnant des
dommages tissulaires hépatiques grevant le pronostic (Figure 24) (75), on parle alors d’hépatite
chronique HBe négative. Ce risque de réactivation est présent chez tout patient ayant déjà
rencontré le virus, même ceux ayant évolué favorablement et acquis les anticorps immunisant
anti-HBs. Il est lié à la persistance de l’ADNccc dans les cellules infectées, et survient le plus
souvent lors d’un épisode d’immunodépression. Certains patients peuvent présenter une
cirrhose inactive si celle-ci s’est développée préalablement pendant la phase chronique active.
De plus, le risque de développer un carcinome hépatocellulaire (CHC) est très faible mais bien
réel. Une fraction minime des porteurs chroniques (0,05 à 2 % par an selon l’âge au moment de
l’infection) peut spontanément évoluer vers une séroconversion HBs, une forme de bon
pronostic avec des patients identifiés comme ayant évolué favorablement, bien que le risque de
développer un CHC persiste là encore (76). La surveillance prolongée des porteurs chroniques
inactifs est donc essentielle compte tenu de l’évolution imprévisible de ces patients vers des
formes de mauvais pronostic.
Hormis les complications liées à l’atteinte hépatique, les patients infectés
chroniquement par le VHB sont également à risque de présenter des manifestations extra-
hépatiques dont le mécanisme est immunologique et indirect. Les plus fréquemment
rencontrées sont la périartérite noueuse, une glomérulonéphrite, une cryoglobulinémie ou une
neuropathie périphérique.

53
Figure 24 : Profils de réplication et devenir des patients infectés chroniquement par le VHB
(Source : Liaw et al. Lancet. 2009 Feb 14;373(9663):582–92.)

54
 L’hépatite B occulte est une entité particulière définie par la présence d’ADN du VHB
dans le sérum et/ou dans le foie d’un patient dont l’antigène HBs n’est pas détectable par les
tests sérologiques usuels. La physiopathologie à l’œuvre est encore largement méconnue. Elle
combine certainement la persistance de l’ADNccc dans les hépatocytes infectés avec des
mécanismes de suppression de l’expression des gènes viraux, d’origine cellulaire ou virale dans
le cadre d’une co-infection VHC, VHD ou VIH (77) (à titre d’exemple, les protéines du virus
de l’hépatite delta sont connues pour exercer un fort effet inhibiteur sur l’expression des gènes
du VHB). La grande hétérogénéité des séries publiées dans la littérature concernant l’hépatite
B occulte rend difficile une estimation précise de sa prévalence, vraisemblablement hétérogène
au regard de la zone géographique et de la population étudiée. La très grande sensibilité des
techniques actuellement disponibles (PCR en temps réel) en permet cependant la détection
fiable (78). Le dépistage de ces patients est nécessaire du fait de quatre conséquences cliniques :
la réactivation virale dans les situations de forte immunosuppression, la transmission virale à
l’occasion de dons de sang ou d’organes (principalement de foie), le possible mais non prouvé
cofacteur d’aggravation des lésions de fibrose en cas d’hépatopathie chronique associée et,
surtout, son rôle promoteur d’un développement futur du CHC, sur foie non cirrhotique comme
sur foie cirrhotique.

6. Dépistage, diagnostic et prévention

a) Marqueurs virologiques et biochimiques

Les transaminases (ALAT et ASAT), sont des enzymes physiologiquement contenues

dans les hépatocytes. Leur dosage dans le sang, par méthode enzymatique permet d’objectiver
une cytolyse hépatique, qu’elle soit d’étiologie virale ou non. L’augmentation sanguine de la
phosphatase alcaline et de la γ-glutamyltransférase est le témoin d’une cholestase, liée à un
trouble de l’excrétion biliaire par atteinte du parenchyme fonctionnel.
La détection de l’antigène HBs circulant (Figure 25) (protéines de surface contenues
dans les particules de Dane et sous-virales) par méthode immuno-enzymatique est le marqueur
sérologique clef permettant de diagnostiquer une infection par le VHB. L’infection chronique
par le VHB est biologiquement définie par la persistance de l’antigène HBs dans le sérum sur
deux tests à 6 mois d’intervalle. A l’inverse, dans le cas d’une infection aiguë par le VHB ayant
évolué favorablement, l’antigène HBs devient indétectable. La concentration de l’antigène HBs
varie en fonction de la phase considérée, elle est en règle générale plus élevée chez les patients
positifs pour l’antigène HBe. L’antigène HBs demeure détectable chez les patients dont la
charge virale diminue et même si celle-ci devient indétectable. La séroconversion de l’antigène

55
Figure 25 : Marqueurs virologiques : de l'hépatocyte infecté vers le sérum
(Source : d’après Yuen et al. Nature Reviews Disease Primers. 2018 Jun 7;4:18035. et Revill et al. Nat Rev
Gastroenterol Hepatol. 2016;13(4):239–48.)

56
HBs peut, dans de rare cas survenir spontanément (0,1 à 2 % par an) auquel cas il devient
indétectable au profit de l’apparition d’anticorps anti-HBs (anti-protéines de surface). La
détection et la quantification de l’anticorps anti-HBs par méthode immuno-enzymatique sont
réalisées afin de confirmer la présence d’une immunité protectrice chez les patients vaccinés.
Les anticorps anti-protéine de capside (anti-HBc) apparaissent dès la phase aiguë de l’infection,
d’abord de classe IgM puis IgG, ils persisteront sur le long terme quelle que soit l’évolution de
l’hépatite B, et ce même en l’absence de réplication. Ils sont donc le témoin d’un contact, récent
ou ancien, avec le virus et attestent d’un risque potentiel de réactivation. Au cours d’un hépatite
B fulminante, les IgM anti-HBc sont souvent le seul marqueur détectable.
Il est nécessaire de compléter le bilan des patients dépistés positifs pour l’antigène HBs
par la mesure de la charge virale, réalisée via la quantification de l’ADN du VHB circulant par
technique de PCR. Là où la détection de l’antigène HBs prend en compte la totalité des
particules virales et sous-virales circulantes, la détection de l’ADN du VHB prend uniquement
en compte les particules infectieuses comportant une copie du génome, elle est donc un meilleur
reflet de la réplication virale dans les hépatocytes. L’importance de la charge virale représente
un critère de mise sous traitement, dont l’efficacité sera attestée par sa décroissance.
L’augmentation de la charge virale sous traitement par analogues nucléosidiques doit mener à
rechercher une mutation de résistance dans le gène de la polymérase par méthode de
séquençage. La détection de l’antigène HBe et de son anticorps associé par méthode immuno-
enzymatique permet de caractériser plus finement une hépatite B chronique, en différenciant
les patients en phase de clairance des patients en phase de contrôle immunitaire.

b) Diagnostic histologique

La démarche diagnostique d’une infection chronique par le VHB implique

nécessairement d’évaluer la sévérité des lésions hépatiques qui lui sont associées. L’objectif de
cette évaluation est d’une part pronostique, et s’intègre d’autre part dans les critères d’initiation
d’un traitement antiviral. Elle permet également la recherche de pathologies associées ou la
présence de complications (une cirrhose ou un CHC). Le gold standard demeure l’analyse
anatomopathologique d’une biopsie hépatique obtenue par ponction (PBH). Les classifications
actuellement utilisées visent à quantifier les lésions histologiques en établissant un score
numérique basé sur le degré d'activité inflammatoire et de fibrose présent dans le foie. Le score
le plus utilisé en France, validé dans un premier temps dans le cadre de l’hépatite C puis de
l’hépatite B chronique, est le score METAVIR (79), qui permet de quantifier le grade et le stade
de l’atteinte hépatique (Tableau 1) (Figure 26). Le grade est le reflet de l'atteinte nécrotico-
inflammatoire de l'infection et par conséquent de son activité (A0 à A3). Le stade détermine

57
Tableau 1 : Score METAVIR
(Source : HAS, Évaluation des méthodes non invasives de mesure de la fibrose hépatique dans l’hépatite B
chronique - Rapport d'évaluation Juin 2014)

Figure 26 : Stades histologiques selon le score METAVIR

(Source : Asselah et al. Gut. 2009 Jun 1;58(6):846–58.)

58
l'importance et l'extension de la fibrose et est difficilement réversible (F0 à F4). Les limites de
la PBH sont : la nécessité de réaliser un bilan prébiopsie, ses contre-indications (troubles
hémorragiques, patient non compliant, ascite abondante…), ses complications (hématome
intra-hépatique, hémorragie intra-péritonéale, infections…), son coût, et les contraintes
pratiques qu’il engendre (nécessité d’une courte hospitalisation, acceptabilité de la part du
patient…). De ce fait, on observe un recours croissant à des méthodes non invasives
d’évaluation de la fibrose, dans la mesure où celles-ci ont été validées dans le cadre d’une
hépatite B chronique. Les plus usitées sont de deux types : les méthodes d’élastographie
impulsionnelles ultrasonores (ex : Fibroscanâ) et les score biocliniques composites
comprenant le dosage de marqueurs spécifiques (ex : Fibromètreâ). Ces deux méthodes sont
dans la plupart des cas bien corrélées au score METAVIR, il existe cependant des discordances,
le résultat anatomopathologique primant sur ceux des tests non invasifs. Le Fibroscanâ
s’appuie sur l’augmentation du paramètre d’élasticité du tissu hépatique (autrement dit sa
rigidité, exprimée en unité de pression, le kilopascal) en cas de fibrose, qu’il mesure par le biais
des ultrasons. Dans le cadre d’une fibrose consécutive à une hépatite B chronique, le seuil
pathologique est fixé à 7 kPa, avec une valeur le plus souvent supérieure à 11 kPa en cas de
cirrhose. Cette technique comporte certaines limites : aspect opérateur-dépendant ; mesure
biaisée par la congestion hépatique des patients insuffisants cardiaques, une cholestase
importante ou un stéatose évoluée ; diminution du signal chez les patients obèses ou présentant
une ascite volumineuse (80).
Le Fibromètreâ est un score composé d’éléments appartenant à trois catégories : les
caractéristiques cliniques du patient (sexe et âge), les marqueurs indirects et les marqueurs
directs de fibrose. Les marqueurs indirects reflètent les altérations de la fonction hépatique (TP,
alpha-2-macroglobuline, plaquettes, ALAT, ASAT, urée, γ-glutamyltransférase, bilirubine) les
marqueurs directs sont le reflet sérique de la formation et de la dégradation de la matrice
extracellulaire (acide hyaluronique) (81). Le résultat est délivré sous la forme d’un score dont
la valeur est comprise entre 0 et 1, à titre d’exemple, un score inférieur à 0,2 est corrélé à un
METAVIR F0-F1, un score supérieur à 0,8 à un METAVIR F3-F4. En cas de score élevé au
Fibromètreâ, un second score adapté au foie cirrhotique est réalisé (Cirrhomètreâ). Ces scores
biocliniques sont susceptibles d’être modifiés par un certain nombre d’états physiologiques ou
pathologiques : grossesse, syndrome inflammatoire, hépatite aiguë ou insuffisance rénale.

59
 c) Biomarqueurs pronostiques et prédictifs

Afin d’améliorer la prise en charge des patients chroniquement infectés, certains

biomarqueurs présentant une valeur pronostique ont été identifiés ces dernières années.
Un certain nombre de publications réalisées à partir de cohortes de patients asiatiques a
montré une corrélation entre la survenue d’un CHC et le niveau élevé de la charge virale
hépatite B (82). A l’inverse, il a été montré qu’un faible niveau de réplication du virus était
prédictif de la survenue d’une séroconversion HBe (83). De même, une concentration sérique
faible en antigène HBs est un facteur prédictif de la survenue d’une séroconversion HBs chez
les porteurs chroniques HBe négatifs (84). La concentration sérique en antigène HBs peut
également être utilisée comme un facteur prédictif de survenue d’un CHC, indépendamment de
la charge virale (85). La mesure de la charge virale hépatite B et la quantification sérique de
l’antigène HBs apparaissent donc comme deux marqueurs complémentaires afin de prédire
l’évolution de l’hépatopathie. De nombreuses études suggèrent également une influence du
génotype du VHB sur le pronostic à long terme de l’infection chronique comme nous l’avons
déjà décrit précédemment, avec des génotypes C et D de moins bon pronostic
Certaines mutations dans le génome viral (BCP A1762T/G1764A)(86) ou de l’hôte
(SNP rs12979860 dans la région intronique de l’interféron λ-4, S267F dans le gène du récepteur
NTCP) (87) ont aussi été identifiées comme associées à une plus grande survenue de formes de
mauvais pronostic.
Très récemment, une étude a montré que la quantification de la protéine L par Western-
blot dans le sérum des sujets chroniquement infectés par le VHB pourrait constituer un
biomarqueur d’une évolution active de l’infection chronique B (88). Cependant, ce test ne
permet pas de faire la différence entre la protéine L des virus et celle des filaments sous-viraux.

7. Prophylaxie

La prévention de l’infection par le VHB repose actuellement sur plusieurs éléments :

l’immunisation active des populations, la mise en place de mesures d’hygiène en milieu
hospitalier, le dépistage des produits dérivés du sang et la prise en charge de la transmission
mère-enfant.
L’immunisation active est obtenue par la vaccination. Le vaccin contre l’hépatite B est
un vaccin sous-unité contenant de l’antigène HBs sous forme de particules sous-virales non
infectieuses. Il est aujourd’hui recombinant, obtenu par insertion du gène du VHB codant la
protéine d’enveloppe virale dans des cellules de levures. Il existe sous forme monovalente (ex :

60
Engerix Bâ), sous forme bivalente (VHA-VHB, Twinrixâ) et sous forme hexavalente
(Diphtérie-Tétanos-Coqueluche-Poliomyélite-Haemophilus-VHB, Infanrix hexaâ). Le
schéma complet de primovaccination chez l’enfant ou chez l’adulte comprend trois injections
à 0, 1 et 6 mois. La vaccination des nourrissons par le vaccin hexavalent comprend, d’après le
calendrier vaccinal, une injection à 2, 4 et 11 mois de vie. Dans la majorité des cas le sujet est
répondeur et acquiert une immunité mémoire qui persistera à vie. Il n’est donc pas recommandé
de réaliser une injection de rappel si le schéma a été correctement suivi. Chez certains patients,
notamment les patients immunodéprimés, la réponse vaccinale peut être fortement diminuée. Il
est alors possible d’évaluer l’immunité par le titrage immuno-enzymatique de l’anticorps anti-
HBs, un titre supérieur à 10 UI/mL étant considéré comme protecteur. Des injections de rappel
sont possibles afin de maintenir une immunité suffisante chez les patients présentant un titre
trop faible. Depuis 1992, les programmes de l’OMS visent la vaccination universelle des
enfants, en particulier dans les régions à forte prévalence de l’antigène HBs (Figure 27). En
France, la vaccination contre le VHB est devenue obligatoire pour tous les enfants nés à partir
du 1er janvier 2018. Elle est également obligatoire pour le personnel de santé et de laboratoire,
la vérification du statut vaccinal par la médecine du travail est également obligatoire au moment
de la prise de fonction. Elle vise d’autres populations à risque, notamment les patients
hémodialysés. Fin 2016, 186 pays avaient introduit à l’échelle nationale le vaccin contre
l’hépatite B (89). La couverture mondiale des individus recevant 3 doses de vaccin anti-hépatite
B est estimée à 84 % et évaluée aux environs de 92 % dans la région du Pacifique occidental
(Figure 28).
La prévention de la transmission mère-enfant est basée sur l’association d’une
immunisation passive par l’injection d’immunoglobulines anti-hépatite B et d’une
immunisation active par la sérovaccination contre l’hépatite B dès la naissance. Cette
association permet de faire chuter le taux de transmission de manière drastique (90). En 2016,
101 pays ont introduit l’administration d’une dose de vaccin anti-hépatite B aux nouveau-nés
dans les 24 heures suivant la naissance ; la couverture mondiale des nouveau-nés est estimée à
39 %. Il est important de noter que le risque de transmission mère-enfant est maximal chez les
patientes HBe positives et/ou présentant une charge virale élevée. Les recommandations
actuelles préconisent la mise en place d’un traitement par analogue nucléosidique (TDF)
pendant le troisième trimestre de grossesse chez les patientes présentant une charge virale
supérieure à 200 000 UI/mL, afin de la réduire autant que possible avant la fin de la grossesse
(91), et de réaliser une césarienne en cas de charge virale toujours élevée au moment de
l’accouchement.

61
Figure 27 : Évolution de la couverture vaccinale anti-VHB à l'échelle mondiale de 1989 à 2017
L’estimation de la couverture vaccinale se base sur la proportion d’enfants vaccinés avec trois doses
de vaccin une année donnée.
(Source: WHO/UNICEF, coverage estimate revision 2017)

Figure 28 : Répartition de la couverture vaccinale anti-VHB au niveau mondial en 2016

(Source: WHO/UNICEF, coverage estimate revision 2016)

62
 8. Thérapeutique

L’indication à démarrer un traitement médicamenteux dépend principalement de trois

facteurs : le niveau de la charge virale, l’augmentation des ALAT et dans une moindre mesure
la sévérité de l’atteinte hépatique. Entrent également en ligne de compte : l’âge élevé du patient,
les antécédents familiaux de cancer du foie, les comorbidités (obésité ou éthylisme chronique),
le risque de transmission du VHB (cf. prophylaxie et grossesse) ainsi que la présence de
manifestations extra-hépatiques. Schématiquement, sont concernées par la mise en place d’un
traitement les deux phases d’hépatite chronique (HBe positive et HBe négative). Selon la source
considérée (EASL, AASLD ou APASL), il est généralement recommandé d’instaurer un
traitement chez tout patient ayant une charge virale > 2000 UI/mL (ou > 20 000 UI/mL), et/ou
présentant des ALAT supérieure à la normale (92–94). La présence d’une fibrose au minimum
modérée peut également être prise en compte dans certains cas, par exemple chez un patient
âgé avec un niveau d’ALAT normal ou subnormal. En cas d’infection aiguë par le VHB, le
traitement est essentiellement symptomatique, à l’exception de la survenue d’une hépatite
fulminante responsable d’une insuffisance hépatocellulaire.
Les objectifs de l’instauration d’un traitement sont multiples, reflétant une fois de plus
la complexité de l’histoire naturelle et de la physiopathologie de cette infection (Figure 29). La
rémission biochimique est définie par la résolution de la cytolyse hépatique, avec un retour à la
normale du niveau des ALAT. Un objectif aujourd’hui fréquemment atteint chez les patients
traités par NUCs est l’obtention d’une réponse virologique soutenue, associant l’indétectabilité
de la charge virale +/- la séroconversion HBe. La séroclairance de l’antigène HBs (ou « cure
fonctionnelle ») sous traitement est plus rarement atteinte (3-11 % des patients sous NUCs),
celle-ci permet de réduire le risque de survenue de complications chez le patient (95). La mise
en place précoce du traitement permet une quasi-disparition du risque d’évolution vers la
cirrhose. A l’inverse, le risque de développer un CHC diminue sans pour autant disparaître,
nécessitant une surveillance à vie des patients concernant ce risque, en particulier chez les
patients de plus de 50 ans. Les traitements disponibles à l’heure actuelle ne permettent pas
d’obtenir la disparition de l’ADNccc présent dans les cellules infectées, prérequis indispensable
à la guérison définitive de l’infection (concept de « HBV cure »),
Les molécules validées pour le traitement de l’infection par le VHB appartiennent à
deux classes : les agents immunomodulateurs (PEG-IFNα‑2a) et les agents antiviraux /
analogues nucléosidiques (lamivudine, entecavir, TDF et TAF).
Les traitements basés sur l’utilisation d’interféron alpha pegylé sont administrés à un
rythme hebdomadaire par voie sous-cutanée, le plus souvent pour une durée d’un an. Son mode
d’action complexe en fait une molécule non spécifique à large spectre avec un impact élevé sur

63
Figure 29 : Objectifs du traitement de l'infection par le virus de l'hépatite B
(Source : d’après Tarik Asselah, Paris hepatology conference, janvier 2018)

64
le fonctionnement cellulaire. Une fois fixé à la membrane, l'interféron déclenche une séquence
complexe de réactions intracellulaires, notamment l'induction de certaines enzymes via les ISG
(gènes stimulés par l’interféron). Ce processus est responsable de diverses réponses, telles que
l'inhibition de la réplication virale, la suppression de la prolifération cellulaire et des activités
immunomodulatrices comme l'augmentation de l'activité phagocytaire des macrophages, ou
l'augmentation de la cytotoxicité spécifique des lymphocytes pour les cellules cibles. Ses
indications sont aujourd’hui limitées du fait d’un taux de réponse modeste (environ 30 % des
patients traités à 6 mois sont indétectables) et du risque de survenue de nombreux effets
indésirables (neutropénie sévère, syndrome pseudo-grippal, malaise, thyrotoxicité, syndrome
dépressif…) nécessitant une surveillance clinique et biologique rapprochée (96,97). Le
principal avantage de l’interféron est un taux plus élevé de séroconversion HBs sous traitement
(environ 11 % des patients à 3-4 ans post-traitement) par rapport à la plupart des analogues
nucléosidiques. L’interféron peut par exemple être envisagé comme traitement de première
ligne chez un patient jeune sans comorbidité infecté par un génotype A ou B. Il est en revanche
contre-indiqué chez les patients présentant une cirrhose décompensée.
Les analogues nucléosidiques ont un mode d’action plus spécifique, par inhibition de la
polymérase du VHB. Ils sont de ce fait beaucoup mieux tolérés sur le plan clinique, mais
potentiellement impactés par l’émergence de mutations de résistance dans la séquence de cette
enzyme, la lamivudine étant particulièrement concerné par ce risque. Le tenofovir disproxil
(TDF), tenofovir alafenamide (TAF) et l’entecavir sont les NUCs les plus largement utilisées,
respectivement du fait d’un risque de résistance absent pour le tenofovir, ou faible (1,2 % à 7
ans) pour l’entecavir. L’entecavir est indiqué chez les patients naïfs de traitement (98). A
contrario, les patients ayant reçu par le passé un traitement par lamivudine sont à risque de
développer plus facilement des mutations de résistance à l’entecavir, d’où la nécessité d’utiliser
le tenofovir dans ce cas. Le TAF permet d’atteindre une plus forte concentration intra-hépatique
de molécule active par rapport au TDF, et donc d’obtenir un même niveau de suppression virale
avec une dose plus faible. Ainsi, les patients traités par TAF sont moins sujets aux effets
indésirables qu’avec le TDF (déminéralisation osseuse et impact sur la fonction rénale) (99).
Bien que les traitements courts par NUCs permettent déjà une forte diminution de la charge
virale et une normalisation des ALAT, le bénéfice d’un traitement à long terme (> 5 ans) a été
démontré, en particulier concernant le risque d’évolution vers la cirrhose et de développement
d’un CHC (100,101).
La combinaison d’un analogue nucléosidique et de PEG-IFNα ne fait pour l’heure pas
partie des recommandations. Certaines études ont mis en évidence un taux de séroclairance HBs
plus élevé chez les patients ayant reçu un traitement combiné par rapport à une monothérapie

65
(principalement infectés par un génotype A ou B) (102), quand d’autres études ne mettent pas
en évidence de différence significative (103).
Chez les patients présentant un CHC ou une cirrhose décompensée, la transplantation
hépatique est une option thérapeutique à considérer. Un risque majeur encouru par les patients
transplantés infectés chroniquement par le VHB est celui de la récurrence de l’infection sur le
greffon, en particulier en cas de charge virale circulante élevée au moment de la greffe.
L’utilisation d’immunoglobulines anti-HBs associée à un NUCs permet de réduire ce risque
(104).
Malgré l’existence des NUCs comme traitement de l’infection chronique par le VHB,
le faible nombre de patients traités au niveau mondial par rapport au nombre de patients infectés
s’explique par le fait qu’une grande partie d’entre eux n’ont pas été diagnostiqués (Figure 30).
La mise en place de campagnes de dépistage dans les zones à forte prévalence est donc une
étape essentielle vers l’éradication de l’infection.
La mise au point de nouveaux traitements de l’infection par le VHB est un domaine en
pleine effervescence (105,106). Les analogues nucléosidiques aujourd’hui utilisés ciblent
uniquement l’étape de réplication du génome du viral. Le bulevirtide (Myrcludex B), un
inhibiteur compétitif du récepteur NTCP, permet de cibler l’étape d’entrée du virus dans la
cellule. Une autre famille de molécules à l’étude est celle des inhibiteurs de l’assemblage de la
nucléocapside, avec pour cible la protéine core du VHB (HBc), dont la plupart agissent en
modifiant sa conformation (modulateurs allostériques). Les agonistes des TLR sont basés sur
des mécanismes cellulaires d’immunomodulation, et font principalement appel à la réponse
immunitaire innée afin d’augmenter la clairance virale. Enfin, la cible principale des nouvelles
molécules mises au point est l’ADNccc présent dans les cellules infectées. Il est possible d’agir
sur trois niveaux : l’inhibition de la formation de l’ADNccc, l’inhibition de l’expression des
gènes viraux, et la destruction de l’ADNccc. Les inhibiteurs de la formation de l’ADNccc
ciblent des mécanismes cellulaires impliqués dans la réparation de l’ADN. Les inhibiteurs de
l’expression des gènes viraux font appel à des ARN interférents spécifiques de la séquence à
inhiber (siARN). Du fait de l’interaction entre la protéine core et l’ADNccc, les inhibiteurs de
la core participent à cibler indirectement ce dernier, au même titre que les inhibiteurs de la
protéine HBx. Les options permettant la destruction directe de l’ADNccc sont principalement
représentées par les techniques ciblées d’édition du génome, au premier rang desquelles
CRISPR-Cas9 (107,108).

66
Figure 30 : Cascade mondiale du traitement de l’infection par le virus de l'hépatite B
(Source: WHO, Global hepatitis report 2017)

67
 9. Populations spécifiques
a) Patients immunodéprimés

La réactivation d’une infection par le VHB ayant évolué favorablement est un risque
encouru en cas de survenue d’un état d’immunodépression (109). Ce risque concerne : les
patients sous chimiothérapie, les patients infectés par le VIH en particulier pendant la phase de
reconstitution immune, les patients transplantés d’organe ou de moelle osseuse, les patients
sous agent déplétant les lymphocytes B (rituximab), les patients sous inhibiteurs du TNF. Cette
réactivation prend la forme d’une reprise brutale ou d’une augmentation majeure de la
réplication (i.e. de la charge virale), chez les patients positifs pour l’antigène HBs, voire les
patients négatifs pour l’antigène HBs et positif en anti-HBc (contact ancien ayant évolué
favorablement). Cliniquement, les dommages hépatiques occasionnés vont de l’hépatite
subclinique à l’hépatite sévère, et peuvent rapidement évoluer vers une insuffisance
hépatocellulaire fatale. Afin de prévenir ce risque, il est recommandé de mettre en place un
traitement antiviral préemptif, ainsi que de contrôler le statut sérologique avant
l’immunodépression, voire de monitorer régulièrement la charge virale chez les patients à
risque.

b) Patients co-infectés

Le principal agent responsable de co-infection chez les patients chroniquement infectés

par le VHB est le virus de l’hépatite delta (VHD) (110). Il s’agit d’un virus à ARN défectif, le
support de son génome est un ARN circulaire simple brin de polarité négative de 1,7 kb, qui
code seulement deux protéines : le petit (HDAg-S) et le grand (HDAg-L) antigène delta. Ces
deux ribonucléoprotéines s’assemblent avec le génome du virus dans le noyau des hépatocytes.
Afin de compléter son cycle, le VHD a nécessairement besoin d’une cellule infectée par le
VHB, qui lui fournira une enveloppe virale par l’assemblage de ses protéines de surface. On
estime, au niveau mondial, que 6 à 8 % des patients chroniquement infectés par le VHB sont
co-infectés avec le VHD. L’infection par le VHD peut survenir de manière concomitante, ou à
distance de l’infection par le VHB (on parle alors de surinfection). Dans le premier cas la
majorité des patients n’évolue pas vers un portage chronique, dans le second cas il existe un
risque élevé de développer une hépatite fulminante et d’évoluer vers un portage chronique. La
co-infection par le VHD augmente significativement le risque d’évolution vers une hépatite
chronique sévère, avec un risque d’évolution vers la cirrhose et le CHC plus important que pour

68
les patients mono-infectés VHB. Le diagnostic est posé par la réalisation d’une sérologie à la
recherche d’anticorps anti-VHD, la réalisation de charges virales delta par technique de RT-
qPCR permet la confirmation du diagnostic et le suivi des patients co-infectés. La clairance de
l’ARN du VHD est directement dépendante de la clairance de l’antigène HBs. Le traitement
repose actuellement sur l’utilisation de PEG-IFNα, aboutissant à l’indétectabilité de la charge
virale delta à 6 mois chez seulement 25 % des patients. D’autres traitements sont actuellement
à l’étude, notamment le lonafarnib, un inhibiteur de la farnesyltransferase responsable de la
prénylation de l’HDAg-L, étape essentielle de l’assemblage des virions (111).
Du fait de modes de transmission communs, notamment par voie sexuelle, les co-
infections VHB-VIH constituent un groupe de patients non négligeable, estimé à environ 10 %
des patients infectés par le VIH à travers le monde (112). Chez l’adulte, cette co-infection
augmente le risque de passage à la chronicité de l’infection par le VHB. La sérologie VHB peut
présenter des profils atypiques, avec une forte prévalence de patients négatifs pour l’antigène
HBs associé à des anti-HBc isolés malgré un ADN du VHB détectable (cf. hépatite B occulte).
Il est recommandé de traiter systématiquement ces patients, quel que soit le niveau de la charge
virale VHB ou des ALAT, par le biais de deux molécules actives contre le VHB (TDF/TAF +
lamivudine, TDF/TAF + emtricitabine). Ce traitement devra être poursuivi à vie, son
interruption pouvant conduire à des phénomènes de réactivation du VHB potentiellement
létaux. Ces molécules, également actives sur la polymérase du VIH, ne doivent pas être
administrées en monothérapie, facteur favorisant la sélection de variants VIH résistants.
Deux situations plus rarement rencontrées sont : les patients co-infectés VHB-VHC et
les patients triplement infectés VHB-VHC-VIH (113). La co-infection VHB-VHC est
responsable d’une augmentation des phénomènes de fibroses et accélère l’évolution vers la
cirrhose (114). L’infection par le VHB n’altère en rien l’efficacité des antiviraux à action directe
(DAAs) anti-VHC, cependant la mise sous DAAs semble favoriser la précocité et l’intensité
des réactivations de l’hépatite B sous-jacente (115). Ainsi, il est recommandé de traiter dans un
premier temps l’infection par le VHB avant de mettre en place le traitement de l’infection par
le VHC. La surveillance régulière de la charge virale VHB et du niveau des ALAT apparaît
donc comme essentielle chez ces patients.

69
 C. Modèles d’étude du VHB

Bien que le VHB ait été identifié depuis plus de quarante ans, de nombreuses étapes de
son cycle demeurent mal comprises à l’heure actuelle, du fait de l’absence de modèle d’étude
optimal in vivo comme in vitro (Figure 31).
Du côté des modèles animaux, le chimpanzé permet l’infection par le VHB humain et
l’étude de l’aspect immunitaire, du développement de la pathologie hépatique ainsi que du cycle
complet du virus. Indépendamment des problèmes éthiques qu’il pose, ce modèle est lourd et
coûteux, ce qui le réserve à de rares laboratoires. Une grande partie des connaissances acquises
concernant le cycle l’ont été avec des virus des hépatites B existant chez d’autres modèles
animaux, en particulier avec le WHBV ou le DHBV. Toutefois, ces modèles ne reflètent que
très partiellement le virus humain. En particulier, on sait que l’infection chronique humaine
s’accompagne de phénomènes d’intégration dans les chromosomes, notamment dans les
régions promotrices de l’expression de la télomérase, ou à proximité de régions régulatrices de
l’expression de certaines cyclines cellulaires (116). Dans le cas du WHBV, les mécanismes sont
sensiblement différents, puisque cette intégration se fait de façon préférentielle au voisinage du
proto-oncogène myc (117). Ainsi le développement de carcinomes hépatocellulaire chez la
marmotte ne mime que très partiellement les événements impliqués dans les carcinomes
humains. Chez le canard, le génome du DHBV étant dépourvu de la région HBx, l’infection
chronique par le DHBV n’induit pas les mécanismes de dérégulation cellulaire qui conduisent
au développement de l’hépatocarcinome viro-induit. Plus récemment, un nouveau modèle
animal de propagation du VHB a été obtenu grâce au développement de souris doublement
humanisées (foie et système immunitaire), cependant l’obtention de ces souris reste très
complexe, ce qui en fait là encore une approche réservée à des laboratoires hautement
spécialisés (118).
Concernant les modèles cellulaires, il est nécessaire de définir un certain nombre de
termes en rapport avec l’infection par le VHB (Figure 32). Une lignée cellulaire est dite
permissive si celle-ci permet la réplication virale et la libération de virions infectieux. Elle est
dite susceptible à l’infection si elle permet l’entrée d’un virion et la libération de son génome
au niveau nucléaire. Si une cellule combine la susceptibilité et la permissivité à l’infection par
le virus, ce dernier peut effectuer un cycle complet aboutissant à la libération de nouveaux
virions infectieux ayant la capacité d’infecter de nouvelles cellules, on parle alors de modèle
cellulaire propagatif. Les lignées dérivées d’hépatocarcinome (Huh7, HepG2…) sont utilisées
depuis de très nombreuses années pour répliquer le virus en raison de leur facilité d’utilisation
(119,120). Cependant, ces lignées ne permettent pas de mimer une propagation et une sécrétion
naturelle du virus, elles se révèlent notamment peu efficaces pour la formation et l’entretien de
70
Figure 31 : Évolution des modèles d’étude animaux et cellulaires du VHB
(Source : Thomas et al. Nat Rev Gastroenterol Hepatol; 13(6): 362–374. 2016)

Figure 32: Caractéristiques des modèles cellulaires vis-à-vis de l’infection par le VHB
(Source: d’après Camille Sureau, Mechanism of HBV/HDV entry into hepatocytes)

71
l’ADNccc, ce qui limite naturellement leur utilité pour l’étude de la persistance virale. De
même, leur non-susceptibilité à l’infection par le VHB obligeait à utiliser des techniques
artificielles comme la transfection de génomes viraux complets au sein de plasmides, pour
initier une réplication virale. Une étape significative a été franchie ces dernières années avec la
découverte du récepteur cellulaire spécifique du VHB, le NTCP (Figure 33), ce qui a permis la
mise au point de lignées dérivées d’hépatocarcinome exprimant ce récepteur, les rendant
infectables par des particules virales produites in vitro, et donc d’aboutir à un modèle
véritablement propagatif. En outre, le protocole permettant l’infection à partir de lots de virus
a été mis en place au sein de notre unité. La lignée cellulaire la plus largement utilisée pour
étudier l’infection par le VHB in vitro est la lignée HepG2 exprimant le récepteur NTCP (121).
Cette lignée dérivée d’hépatocarcinome a pour inconvénient d’avoir perdu une grande partie de
son phénotype hépatocytaire initial. Les mécanismes observés dans ces cellules concernant les
étapes de l’infection par le VHB s’éloignent donc probablement de ce qui se produit réellement
dans les PHH in vivo. A contrario, la lignée cellulaire FLC4 a été sélectionnée pour ses niveaux
d’expression élevés de facteurs spécifiques des hépatocytes, comme l’albumine, le HNF-4α, et
certains cytochromes (122,123). Cette lignée a notamment été évaluée dans le cadre d’études
toxicologiques. En revanche, l’absence d’expression du récepteur NTCP par ces cellules les
rend non infectables par le VHB. La seule évaluation de cette lignée dans le cadre de cette
infection consistait en la transfection de plasmides contenant le génome viral (124).
Toujours parmi les lignées hépatocytaires, la lignée HepaRG, occupe une position
particulière. Cette lignée cellulaire obtenue il y a plusieurs années peut être différenciée in vitro
en hépatocytes, devenant ainsi naturellement permissive pour le VHB (125). Ce processus de
différenciation est cependant complexe, puisqu’il dure plusieurs semaines, et utilise des milieux
de cultures spécifiques contenant notamment de l’hydrocortisone et du DMSO
(diméthylsulfoxyde). Ces étapes longues pour obtenir des cellules infectables rendent leur
intérêt finalement assez limité pour l’étude du VHB. Enfin, un dernier modèle d’étude du VHB
réside en l’utilisation d’hépatocytes primaires. Bien qu’il existe les hépatocytes primaires de
Tupaia belangeri (PTH), un petit mammifère d’Asie du sud-est, qui sont sensibles à l’infection
par le VHB (126), le modèle cellulaire optimal reste l’utilisation d’hépatocytes primaires
d’origine humaine (PHH). Après isolement, ces cellules conservent leur état de différenciation
pendant plusieurs semaines in vitro permettant la production de facteurs cellulaires clés pour la
réplication du VHB. Ces divers éléments font que les PHH demeurent la cellule de choix pour
l’étude de l’infection naturelle à l’aide de préparations de virus infectieux (127). Cependant,
plusieurs facteurs limitent leur utilisation, comme leur absence de division en culture, ou le fait
qu’elles perdent progressivement leurs caractéristiques phénotypiques d’hépatocyte. Plusieurs
pistes sont à l’étude afin de maintenir ces cellules dans un état

72
Figure 33 : Structure et fonction du co-transporteur sodium-taurocholate (NTCP)
Dans la première conformation, deux ions sodium et un sel biliaire conjugué se lient à une poche
située au niveau du site actif du récepteur. Les ions sodium induisent un changement conformationnel
du récepteur entraînant le passage transmembranaire et la libération du sel biliaire dans le cytoplasme.
Le site de liaison au myrcludex B est coloré en vert. La zone colorée en rouge correspond à la région
variable qui diffère entre le NTCP murin et le NTCP humain, et qui explique la non susceptibilité
d’une cellule hépatocytaire murine vis-à-vis du VHB humain.
(Source : Urban et al. Gastroenterology. 2014 Jul;147(1):48–64.)

73
différencié, comme l’utilisation de facteurs chimiques de différenciations dans le milieu de
culture (128), la culture en système micro-fluidique simulant la circulation sanguine, et/ou la
co-culture en présence de cellules du microenvironnement hépatocytaire (129). En outre, leur
obtention est tributaire des activités de chirurgie en lien avec les résections hépatiques larges et
leur cryopréservation reste un véritable défi. Enfin, il faut également prendre en compte la
variabilité interindividuelle qui peut être importante en fonction des données clinico-
biologiques des patients et qui rend difficile la standardisation des protocoles d’étude. Bien que
ces hépatocytes primaires restent un modèle à privilégier pour l’étude du VHB, la quantité de
virus pour infecter ces cellules (MOI, Multiplicity Of Infection, ratio entre le nombre de cellules
et le nombre de particules virales infectieuses) reste élevée, même si l’efficacité d’infection est
plus satisfaisante qu’avec des lignées d’hépatocarcinome produisant le récepteur NTCP de
façon ectopique.

D. Objectifs

Du fait de l’absence de modèle d’étude optimal concernant le VHB, l’objectif de notre

projet a été d’envisager la mise au point de lignées cellulaires innovantes, par le biais de deux
stratégies : partir de cellules différenciées non cultivables in vitro sur le long terme et les
dédifférencier a minima pour les immortaliser en réenclenchant leur cycle cellulaire afin
d’obtenir une lignée cultivable indéfiniment (approche « descendante »), ou partir de cellules
dédifférenciées issues d’une lignée tumorale et leur faire exprimer un facteur de différenciation
afin de les rendre infectables par le virus (approche « ascendante »).
La première stratégie (ou approche « descendante ») consistait à s’affranchir des
limitations inhérentes à l’utilisation d’hépatocytes primaires humains en ayant recours à leur
immortalisation afin d’obtenir une lignée cellulaire stable et cultivable in vitro tout en
préservant au maximum leur phénotype initial. Afin de se procurer des hépatocytes primaires
en quantité suffisante et pendant toute la durée de notre étude, nous avons mis en place le
protocole HepaPrim, qui repose sur une collaboration entre notre unité de recherche (INSERM
U1259), le service de chirurgie digestive et hépatobiliaire du CHRU de Tours (Pr Ephrem
Salame et Dr Louise Barbier), le service d’anatomie pathologique (Dr Fanny Dujardin) et le
service de virologie hospitalière (Pr Francis Barin et Pr Catherine Gaudy-Graffin). Ce protocole
s’appuie sur l’activité de chirurgie hépatique comme source de tissu hépatique normal (patients
présentant une lésion nécessitant une exérèse volumineuse). Sur un plan légal, la conservation
des données des patients concernés est enregistrée auprès de la CNIL via le fichier CIL du CHU
(n° 2018_040). La récupération et la conservation des fragments de tissu hépatique s’appuie sur

74
une collection biologique déjà déclarée (dossier DC-2008-308) auprès du Centre de Ressources
Biologiques (Dr Sophie Guyetant). Notre protocole a été examiné par le comité d’éthique du
CHRU de Tours. Tous les patients ont été informés de la nature de notre étude et donné leur
accord libre et éclairé par la signature d’un consentement écrit. Une fois les hépatocytes isolés,
l’étape suivante consistait à les immortaliser par le biais d’une stratégie déjà éprouvée par
transduction de vecteurs lentiviraux recombinants exprimant soit le proto-oncogène C-myc soit
la télomérase reverse-transcriptase humaine, ou par les deux vecteurs en co-expression (130–
132). L’objectif de cette stratégie est de préserver au maximum le phénotype hépatocytaire
initial. La protéine myc est un facteur de transcription qui active l'expression d'un grand nombre
de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et les processus d’apoptose. La
télomérase est une enzyme inhibant l’érosion des télomères (extrémités des chromosomes) au
cours des divisions successives. De telles lignées hépatocytaires immortalisées ont déjà été
utilisées pour des études pharmacologique et de thérapie cellulaire (133), mais peu dans le cadre
d’études virologiques.
La seconde stratégie (ou approche « ascendante ») consistait à utiliser une lignée
cellulaire exprimant plus de caractères phénotypiques hépatocytaires que la lignée HepG2
classiquement utilisée, à savoir la lignée FLC4. Afin de la rendre infectable par le VHB, notre
objectif était de lui faire exprimer constitutivement le récepteur NTCP après transduction par
un vecteur lentiviral exprimant la séquence codant pour ce récepteur. De fait, après sélection,
l’objectif était de caractériser les lignées obtenues pour leur capacité à être infectées, répliquer
et propager le VHB, notamment au travers de la comparaison avec la lignée classique HepG2-
NTCP.

75
II. Matériel et méthodes
A. Constructions plasmidiques

La puromycine et l’hygromycine sont les deux antibiotiques utilisés pour la sélection de

cellules transduites par un vecteur lentiviral. Pour des raisons essentiellement liées à leur coût,
nous avons fait le choix d’utiliser un vecteur puromycine comportant la séquence codant pour
le récepteur NTCP, vecteur que nous avons mis au point.
Le vecteur d’expression lentiviral exprimant un gène de résistance à la puromycine
pLenti-puro a été linéarisé par les enzymes de restriction BamHI et XhoI : 5 µL du plasmide à
1 µg/µL, mis en présence de 2,5 µL de tampon 4 (tous les réactifs de biologie moléculaire
proviennent du fournisseur New England Biolabs, sauf si mention spécifique) et de 0,5 µL de
chaque enzyme dans un milieu réactionnel de 30 µL, contenant également 2 µL de CIP
permettant la déphosphorylation du plasmide afin d’éviter sa recircularisation spontanée, le tout
incubé à 37 °C pendant 2 heures.
En parallèle, le vecteur pLenti-hygro-NTCP contenant notre insert, a également été
digéré par BamHI et XhoI afin de le libérer.
Le vecteur d’expression lentiviral linéarisé/déphosphorylé et l’insert ont subi une
migration en gel d’agarose 1 %, les fragments correspondants ont ensuite été découpés sur gel
et purifiés à l’aide du kit « Gel and PCR clean up » (Macherey-Nagel). Une seconde migration
sur gel a permis de quantifier visuellement la quantité d’ADN présente dans les produits de
purification afin d’optimiser les conditions de ligation. La ligation a été réalisée en incubant à
16 °C pendant 16 heures : 50 ng de vecteur lentiviral, 50 ng d’insert, 2 µL de tampon T4 DNA
ligase et 1 µL d’enzyme T4 DNA ligase dans un volume réactionnel de 20 µL.
Le produit de ligation a ensuite été utilisé pour la transformation de bactéries
chimiocompétentes. Les bactéries ont été mises en culture sur gélose LB/Ampicilline pendant
16 heures à 37 °C. Des mini-préparations ont été réalisées pour chaque colonie sélectionnée, la
présence de l’insert dans le vecteur d’expression lentiviral a été contrôlée par migration sur gel
d’agarose après digestion par BamHI et XhoI. Une amplification par la réalisation d’une midi-
préparation a été effectuée (kit « NucleoBond® Xtra Midi » Macherey-Nagel) à partir de 250
mL de milieu de culture LB/Ampicilline incubés 16 heures à 37 °C sous agitation douce. La
quantité d’ADN présente pour notre construction a ensuite été dosée par spectrophotométrie à
260 et 280 nm, puis diluée à la concentration standard de 1 µg/µL. Ce vecteur d’expression
lentiviral comportant notre séquence d’intérêt a ensuite été utilisé pour la production de lots de
particules lentivirales.

76
 B. Production des particules lentivirales

Un des problèmes majeurs de biosécurité liés à la production de particule lentivirales

est l’éventuelle génération de lentivirus compétents et infectieux pouvant se propager de
cellules en cellules. Le système de 3ème génération utilisé au laboratoire repose sur l’utilisation
de lentivirus intégratifs mais non réplicatifs et auto-inactivés (délétion de la région LTR-5’),
produits à partir de trois plasmides devant être co-transfectés simultanément (Figure 34). Le
premier est le vecteur d’expression lentiviral contenant la séquence d’intérêt s’exprimant dans
les cellules transduites associée à un gène de résistance à l’antibiotique de sélection
(hygromycine ou puromycine) permettant la génération de l’ARN lentiviral, et comportant un
signal d’encapsidation (Psi). Le second est un plasmide d’encapsidation de l’ARN lentiviral
contenant les séquences codantes de Gag et Pol (p8.74). Le troisième est un plasmide
d’enveloppe codant pour la glycoprotéine d’enveloppe du vésiculovirus (pVSV-G) assurant à
la particule un tropisme cellulaire large.

Les quatre vecteurs d’expression suivants ont été utilisés pour la production de lentivirus
recombinants (Figure 35) :

- le plasmide lentiviral pLenti-puro-NTCP élaboré précédemment comportant un

gène de résistance à la puromycine
- un plasmide lentiviral déjà construit codant pour la télomérase Reverse-
transcriptase humaine (h-TERT) comportant un gène de résistance à
l’hygromycine (pLV-hTERT-IRES-hygro) (134)
- un plasmide lentiviral déjà construit codant pour l’oncogène C-myc comportant
un gène de résistance à la puromycine (pCDH-puro-cMyc) (135)
- un plasmide lentiviral codant pour la GFP afin de servir de témoin de
transduction
Vingt-quatre heures avant la transfection, des cellules HEK-293T ont été ensemencées
à raison de 7,5.106 cellules par flasque de 75 cm2 (une flasque par construction) en milieu
DMEM-glutamax (Invitrogen) supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal décomplémenté,
100 UI/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine, cultivées à 37 °C sous 5 % de CO2.
Une fois à 60 % de confluence, les cellules ont été transfectées par méthode du chlorure de
calcium avec une picomole totale d’ADN (quantité standardisée pour le protocole) pour les
trois plasmides (pLenti comportant le gène d’intérêt NTCP/h-TERT/C-myc ou la GFP, p8.74
et pVSV-G) et le plasmide codant pour la GFP servant de témoin de transfection. Le milieu de

77
Figure 34 : Fonctionnement du vecteur lentiviral intégratif et non réplicatif utilisé
La séquence codant pour notre protéine d’intérêt est insérée au niveau du site de clonage multiple.
Le gène de sélection utilisé dans nos vecteurs conférait une résistance à l’hygromycine ou à la
puromycine selon le vecteur considéré.

78
 Figure 35 : Schéma récapitulatif des étapes de production des particules lentivirales et de transduction

79
culture a été changé 24 heures après transfection et la production de GFP a été contrôlée au
microscope à épifluorescence. Les milieux ont ensuite été récoltés à 48 heures et 72 heures,
filtrés à 0,45 µm, puis concentrés par ultracentrifugation sur coussin de sucrose 20 % à 4 °C
pendant 90 minutes à 28 000 g. Les culots contenant les lentivirus ont été repris dans 500 µL
de tampon phosphate (PBS) puis aliquotés et conservés à -80 °C jusqu’à transduction des
cellules. La titration des unités lentivirales de transduction (IUT) de chaque lot de lentivirus a
été réalisée par dosage de la protéine p24 par ELISA via le kit « Innotest HIV antigen mAB »
selon les recommandations du fabricant, dont la valeur a servi au calcul du nombre d’unités de
transduction.

C. Qualification des particules lentivirales

La capacité de nos lots de particules lentivirales à infecter les cellules, à intégrer la

séquence d’intérêt dans leur génome, ainsi que l’expression de la protéine d’intérêt par ces
cellules transduites, ont été évaluées avant l’obtention d’hépatocytes primaires. En l’absence
de ces cellules, les lentivirus recombinants C-myc et h-TERT ont été qualifiés sur cellules Huh7
(lignée dérivée d’hépatocarcinome) par immunofluorescence. Le lentivirus pLenti-puro-NTCP
a été directement évalué sur cellules FLC4.
La MOI (Multiplicity Of Infection) est définie comme le ratio entre le nombre de
particules lentivirales et le nombre de cellules dans le puits. Les cellules ont été platées à raison
de 2.105 par puits, au fond desquels des lamelles de verres ont été déposées afin d’obtenir un
tapis cellulaire homogène. Le milieu de culture était composé de DMEM-glutamax (Invitrogen)
supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal décomplémenté, 100 UI/mL de pénicilline et 100
µg/mL de streptomycine, placé à 37 °C sous 5 % de CO2. Elles ont ensuite été transduites avec
des MOI croissantes de particules lentivirales (exemple pour C-Myc : MOI 1 ; 2,5 ; 5 et 10) en
présence de polybrène (un polymère cationique augmentant l’efficacité de transduction en
maintenant les particules lentivirales au contact de la surface des cellules). Le milieu a été
changé le lendemain de la transduction, et les cellules maintenues en culture 3 jours afin de leur
laisser un temps suffisant pour exprimer les protéines d’intérêt. Les cellules ont ensuite été
fixées en paraformaldéhyde 4 % dont l’action a été neutralisée en glycine 0,1 % puis conservées
en PBS à 4 °C jusqu’à réalisation de l’immunomarquage.
Une perméabilisation douce des cellules a été réalisée par la saponine 0,05 % en
présence de BSA 0,2 % (Bovine Serum Albumine). Le marquage primaire a été réalisé en
incubant les cellules pendant 60 minutes avec 50 μL d’anticorps primaire à la dilution adéquate

80
en saponine/BSA, suivi par un lavage en tampon PBS. Le marquage secondaire a été réalisé
dans les mêmes conditions, comprenant une incubation de 50 μL d’anticorps secondaire (couplé
à un fluorochrome) à la dilution adéquate en saponine/BSA pendant 30 minutes à l’abri de la
lumière, suivi par un second lavage en PBS. Enfin, un marquage des noyaux cellulaires a été
réalisé au cours du montage entre lame et lamelle en déposant les lamelles sur du DAPI (4',6-
diamidino-2-phénylindole) en Fluoromount (Thermofischer). Les lames ont ensuite été
conservées à 4 °C puis observées au microscope à épifluorescence.
La détection de l’expression de la protéine C-myc en cellules Huh7 a été réalisée grâce
à l’anticorps primaire lapin anti-C-myc dilué au 100ème. En parallèle, et sur des puits différents,
la détection de l’expression de la protéine h-TERT en cellules Huh7 a été réalisée grâce à
l’anticorps lapin anti-TERT dilué au 100ème. La détection du récepteur NTCP en cellule FLC4
a été réalisée grâce à l’anticorps primaire lapin anti-SCL10A dilué au 100ème. Pour ces trois
conditions, les anticorps primaires ont été mis en présence d’un anticorps secondaire chèvre
anti-lapin couplé à l’Alexa 488 dilué au 2000ème, fluorochrome émettant une fluorescence verte
une fois excité par un laser émettant à 488 nm.

D. Isolement des hépatocytes primaires humains et protocole HepaPrim

Les patients éligibles pour notre protocole ont été sélectionnés en amont de leur
chirurgie programmée lors de la réunion de concertation pluridisciplinaire de chirurgie
hépatobiliaire. Les critères retenus étaient : l’absence de cirrhose, une chirurgie avec une
résection hépatique volumineuse (hépatectomie droite ou gauche) dans un contexte de tumeur
primitive du foie ou de métastase hépatique avec des marges larges à distance du tissu tumoral
permettant l’obtention d’une quantité suffisante de tissu « sain ». Par ailleurs, la négativité des
sérologies vis-à-vis du VIH, VHB, VHC et HTLV a été vérifiée par le laboratoire de virologie
hospitalière (sérologies automatisées par technique CLIA sur Architect i1000, Abott).
Une fois le fragment d’exérèse hépatique récupéré, l’isolement des hépatocytes
primaires humains a été réalisé en adaptant deux protocoles déjà décrits dans la littérature
(136,137). Les solutions de perfusion du fragment tissulaire (Tableau 2) ont été préparées la
veille de chaque isolement à raison de 1 litre par solution, filtrées stérilement à 0,22 µm puis
chauffées à 39 °C au bain-marie 1 heure avant perfusion. Un système de tubulures associé à
une pompe péristaltique permettait le pompage séquentiel des solutions chauffées et une
perfusion via le système veineux du fragment hépatique (Figure 36). Le débit de perfusion a
été adapté selon la masse du fragment et le nombre de canules utilisées (le plus souvent 30
mL/min/canule). Une fois les canules en place dans les vaisseaux une première perfusion a
permis de laver le prélèvement en éliminant les hématies et les caillots, tout en préservant la

81
Tableau 2 : Liste récapitulative et compositions des solutions de perfusion utilisées pour
l’isolement d’hépatocytes primaires humains
(Source : Lee et al. J Vis Exp JoVE. 2013 Sep 3;(79))

Figure 36 : Représentation schématique du système d’isolement d’hépatocytes primaires

humains par perfusion d’une pièce de résection hépatique avec une solution de collagénase

82
viabilité des hépatocytes (perfusion avec 1 litre de la solution 1, puis 10 minutes avec la solution
2 et enfin avec 500 mL de solution 3). La solution 4 a ensuite été préparée extemporanément
en dissolvant la collagénase déshydratée (Liberaseâ ou Collagenase de Clostridium
hystolyticum, Roche) dans le volume approprié de solution 3, puis perfusée à 37 °C pendant 20
minutes afin de laisser le temps à l’enzyme de digérer le prélèvement en dissociant les
hépatocytes des liaisons cellule-matrice et cellule-cellule. La Liberaseâ est un cocktail
enzymatique comportant trois enzymes (une collagénase, une protéase et une dispase) qui
permet une dissociation optimale des cellules mais est plus coûteuse qu’une simple collagénase.
Une fois le fragment ramolli (voire liquéfié), l’action de la collagénase a été stoppée par
utilisation de la solution tampon 5 afin de préserver au maximum la viabilité des cellules. Le
lysat tissulaire était ensuite filtré à 100 µm afin d’éliminer les agrégats mal dissociés et les
résidus vasculaires ou matriciels. Les hépatocytes étaient ensuite isolés des autres types
cellulaires (fibroblastes, cellules de Kupffer…) par trois centrifugations de 50 g à 4 °C pendant
5 minutes (les hépatocytes étant plus denses ils forment un culot brun au fond des tubes). Afin
d’éliminer les cellules mortes, une purification par centrifugation de 20 à 1250 g sur gradient
de Percollâ à 25 % était ensuite effectuée (Figure 37). Une fois le culot repris en milieu de
culture adapté (Hepatocyte Maintenance Medium, Lonza) un dénombrement des cellules avec
estimation de la viabilité sur cellule de Kova® Slide en présence de bleu de trypan a été réalisé,
puis les hépatocytes ont été mis en culture en flasque ou plaque multi-puits préalablement
coatées avec du collagène (Rat-tail collagen, Thermo Fischer).

E. Culture cellulaire et transduction

L’objectif de notre étude est d’une part l’obtention d’hépatocytes primaires humains
exprimant la télomérase humaine et l’oncogène C-myc dans le but de les immortaliser, d’autre
part l’obtention de cellules FLC4 exprimant stablement le récepteur NTCP du HBV.
Vingt-quatre heures avant la transduction, les cellules ont été mises en culture en plaque
6 puits à raison de 2.105 cellules par puits. Les hépatocytes primaires humains ont été mis en
culture à 37 °C sous 5 % de CO2 en milieu HMM supplémenté avec 100 UI/mL de pénicilline
et 100 µg/mL de streptomycine. Les cellules FLC4 ont été mises en culture en milieu DMEM-
glutamax (Invitrogen) supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal décomplémenté, 100
UI/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine, à 37 °C sous 5 % de CO2. Les cellules
ont été transduites avec différentes MOI en présence de polybrène. Pour les PHH, plusieurs
conditions ont été testées : C-myc-puro seul (MOI 2,5 et 5), et h-TERT-hygro (MOI 1) combiné
à C-myc-puro (MOI 2,5).

83
Figure 37 : Schéma récapitulatif des étapes d’isolement des hépatocytes primaires humains par
centrifugation et enrichissement sur gradient de Percollâ
Seules les étapes A, B C et D ont été réalisées (les étapes 1 et 2 concernant l’isolement des cellules de
la fraction non hépatocytaire).
NPC : Non Parenchymal Cells
(Source: Kegel et al. Journal of Visualized Experiments: JoVE, (109), e53069)

84
Les FLC4 ont été transduites avec le lentivirus NTCP-puro construit précédemment à une MOI
de 2,5. Le milieu de culture a ensuite été changé 24 heures après transduction. La sélection des
cellules transduites a été effectuée par l’utilisation d’hygromycine ou de puromycine, deux
molécules antibiotiques de la famille des aminosides qui inhibent la synthèse des protéines avec
une action sur les cellules eucaryotes, et dont le gène de résistance est présent sur le vecteur
lentiviral. Une partie des cellules n’a pas été transduite afin de réaliser deux gammes de
concentrations croissantes d’hygromycine (Thermofischer) (200 μg/ml, 300 μg/ml, 400 μg/ml,
500 μg/ml, 600 μg/ml, 800 μg/ml) et de puromycine (Thermofischer) (0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 2
μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml) afin d’évaluer la mortalité en l’absence de transduction et la
concentration optimale pour la sélection. Les cellules transduites ont été mises en présence
d’hygromycine et/ou puromycine (selon la combinaison de lentivirus utilisée) quatre jours après
transduction, puis les milieux de culture contenant l’antibiotique ont été changés toutes les 48
heures afin de maintenir une pression de sélection optimale tout en éliminant les cellules mortes.

F. Caractérisation des lignées cellulaires transduites

1. Contrôle de l’expression de la protéine d’intérêt

L’expression de la protéine d’intérêt dans la population cellulaire résistante à

l’antibiotique a été contrôlée par immunofluorescence et immuno-blot.
L’immunofluorescence a été réalisée selon le protocole détaillé précédemment (cf. II.C),
les cellules ont ensuite été observées au microscope confocal.
Pour la réalisation de l’immunoblot, des extraits protéiques ont été réalisés en lysant un
culot de 10 millions de cellules dans 200 μL de tampon RIPA auquel a été ajouté
extemporanément trois anti-protéases (PMSF, aprotinine, leupeptine). Le lysat a été incubé 1
heure à 4 °C puis centrifugé à 15 000g pendant 15 minutes avec récupération du surnageant
contenant les protéines. Le récepteur NTCP étant glycosylé, un prétraitement par l’enzyme
PNGase a été réalisé, les différents niveaux de glycosylation étant responsables d’une
hétérogénéité de la taille mesurée pour une même protéine et pouvant gêner l’interprétation de
l’immunoblot (obtention d’une bande étendue et diffuse au lieu d’une bande nette). Les lysats
cellulaires ont été soumis à une électrophorèse en gel d’acrylamide 12 % pendant 1h30 à 50
mA. Un électrotransfert du gel a ensuite été réalisé en tampon TG 1X – méthanol sur une
membrane de PVDF (polyfluorure de vinylidène). Cette membrane a ensuite été saturée
pendant 15 minutes en tampon de saturation (Lait 5 %, PBS-tween 0,2 %) avant incubation de
l’anticorps primaire puis de l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase. La révélation finale
a été réalisée par chimioluminescence à l’aide du kit de révélation ECL (GE Healthcare).
85
 2. Évaluation de la susceptibilité vis-à-vis de l’infection par le VHB
a) Production des lots de virus sur cellules en culture

La lignée HepAD38 est une lignée cellulaire hépatocytaire comportant un génome VHB
intégré (sérotype ayw, génotype D) dont l’expression est inductible par la tétracycline (120).
Pour la production de lots de particules de VHB infectieuses, les HepAD38 ont été cultivées en
milieu DMEM supplémenté avec 2 % de DMSO. Les particules de VHB ont été concentrées à
partir des surnageants de culture par une précipitation sur la nuit avec 8 % de PEG 8000
(Euromedex) puis centrifugées à 5000 g à 4 °C pendant 1 heure. Les culots ont ensuite été
resuspendus en milieu opti-MEM (Gibco/Invitrogen).

b) Infection in vitro par le VHB

Les lignées cellulaires obtenues ont été comparées à la lignée HepG2-NTCP, fournie
par le professeur Urban (Heidelberg University Hospital), cultivée en milieu DMEM-glutamax
(Invitrogen) supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal décomplémenté à 37 °C sous 5 %
de CO2, et entretenue sous pression de sélection par 5 µg/mL de puromycine. Les cellules ont
été platées à J0 à raison de 2.105 par puits en plaque coatée au collagène, puis maintenues en
culture entre 1 et 2 jours jusqu’à atteindre 80 % de confluence. Les particules virales de VHB
ont ensuite été ajoutées dans les puits à raison de 50 équivalent génome par cellule en présence
de 1 % de DMSO et de 4 % de PEG 8000 en milieu opti-MEM. L’inoculum a été retiré après 2
heures d’incubation à 37 °C, avant de laver le tapis cellulaire trois fois en D-PBS 1X
(Gibco/Invitrogen) puis d’ajouter du milieu frais supplémenté par 1 % de DMSO.

c) Détection de l’ARN prégénomique sur lysats cellulaires

La quantification relative de l’expression de l’ARN prégénomique généré en culture a

été réalisée à 3, 5 et 10 jours post-infection (Figure 38). Les ARN totaux ont été extraits des
lysats cellulaires grâce au kit « Nucleospin RNA isolation » (Macherey Nagel) en suivant les
recommandations du fabricant. Les ARN ont été rétrotranscrits grâce au kit « Protoscript II
cDNA Synthesis » (New England Biolabs). La quantification a été effectuée en utilisant les
amorces décrites ci-contre (Tableau 3). Les échantillons ont été mesurés en triplicatas et les
valeurs ont été normalisées par mesure des niveaux d’expression du gène de ménage de
l’hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) avec les amorces décrites ci-contre
(Tableau 4), les calculs ont été réalisés par la méthode des ∆∆Ct décrite précédemment (138).

86
Figure 38 : Schéma récapitulatif de l'analyse cinétique de l'infection sur cellules HepG2-NTCP
et FLC4-NTCP par technique de qRT-PCR

Tableau 3 : Séquences des amorces nécessaires à l’amplification de l'ARN prégénomique du

VHB par qRT-PCR
L’amorce sens « HBV forward » et l’amorce antisens « HBV reverse » s’hybrident à la fin de la
séquence codant pour la protéine HBc et permettent l’amplification d’un fragment d’ADN de 122 paires
de bases.

Tableau 4 : Séquences des amorces nécessaires à l’amplification du gène HPRT par qRT-PCR

87
III. Résultats
A. Constructions plasmidiques

Le vecteur pLenti-puro linéarisé et l’insert NTCP ont subi une migration sur gel
d’agarose après digestion enzymatique (Figure 39).
Les fragments observés sur gel étaient tous compatibles avec les tailles théoriques
attendues.
Le vecteur lentiviral et l’insert ont ensuite été utilisés afin de réaliser la réaction de
ligation, produit de ligation amplifié par midi-préparation et ayant servi à la production de
lentivirus.

B. Production des particules lentivirales

Avant leur transfection en cellule HEK-293T, les vecteurs d’expression lentiviraux

pLV-hTERT-IRES-hygro, pCDH-puro-cMyc, pLenti-GFP (témoin de transduction), le
plasmide d’encapsidation p8.74, le plasmide d’enveloppe pVSV-G et le plasmide pGFP
(témoin de transfection) ont été contrôlés par digestion enzymatique suivi d’une migration sur
gel, puis amplifiés par la réalisation de midi-préparations.
Vingt-quatre heures après co-transfection en chlorure de calcium des plasmides
permettant la production de lentivirus recombinants, l’efficacité de la transfection a été évaluée
par l’observation au microscope optique de la fluorescence verte émise par les cellules ayant
incorporé le plasmide témoin pGFP.
Après récupération des surnageants de culture et concentration des particules par
ultracentrifugation sur coussin de sucrose, le dosage de l’antigène p24 par ELISA a permis
d’estimer la concentration en particules (pg/mL) à partir de la densité optique mesurée, puis de
calculer le nombre d’unité de transduction (UT/mL). Les calculs ont été réalisés sur la base des
équivalences suivantes : 8.10-17 grammes de p24 = 1 Particules lentivirale, 1000 Particules
lentivirales = 1 Unité de transduction (Tableau 5). Ce résultat a servi de base pour le calcul des
MOI au moment de la transduction des cellules.

C. Qualification des particules lentivirales

La réalisation d’une gamme croissante d’infection par les lentivirus sur cellules Huh7 a
permis de confirmer l’efficacité de notre lentivirus codant pour la protéine C-myc. L’analyse
88
Figure 39 : Profil de restriction du vecteur pLenti-puro linéarisé et de l’insert NTCP obtenus
après digestion enzymatique par BamHI et XhoI
Les tailles théoriques sont indiquées à droite du gel.
M = Marqueur de taille (Smartladder, Eurogentec)

Tableau 5 : Quantification de la production de particules lentivirales par le dosage en ELISA de

la protéine p24 (kit « Innotest HIV antigen mAB »)

Figure 40 : Analyse au microscope à épifluorescence de l'expression de la protéine C-myc en

cellules Huh7 transduites avec une gamme croissante de lentivirus
La détection de C-myc a été réalisée grâce à un marquage primaire utilisant un anticorps lapin anti-C-
myc associé à un marquage secondaire utilisant un anticorps chèvre anti-lapin couplé à un
fluorochrome vert Alexa 488. Les noyaux de toutes les cellules ont été marqués au DAPI.

89
des cellules transduites au microscope à épifluorescence après immunomarquage spécifique
anti-C-myc, trois jours après transduction, a permis de mettre en évidence une fluorescence
localisée au niveau nucléaire d’intensité croissante et corrélée avec la MOI utilisée (Figure 40).
La concentration plus faible en particules infectieuses mesurée par ELISA p24 pour le lot de
lentivirus codant pour h-TERT n’a pas permis de réaliser une gamme complète, cependant la
transduction des cellules Huh7 avec une MOI de 5 a permis la détection d’une fluorescence
nucléaire spécifique en immunofluorescence (Figure 41).
La transduction de cellules FLC4 avec une MOI de 2,5 en lentivirus codant pour le
NTCP a permis d’obtenir une fluorescence majoritairement localisée au niveau de la membrane
plasmique et dans une moindre mesure dans le cytoplasme (Figure 42).
L’ensemble de ces résultats valide l’efficacité de nos lentivirus sur cellules Huh7
(lentivirus C-myc et h-TERT) et FLC4 (lentivirus NTCP).

D. Isolement des hépatocytes primaires humains et protocole HepaPrim

Dans le cadre de la mise en place du protocole HepaPrim, quatre patients (numéros

d’anonymat : 1-12010618, 2-16051301, 3-12051301, et 4-16121005) ayant une chirurgie
hépatique programmée ont été sélectionnés selon leurs antécédents et leurs données clinico-
biologiques (Tableau 6). Les trois premiers patients présentaient tous un antécédent
d’adénocarcinome colique ayant été traité par radio-chimiothérapie, avec mise en évidence
d’une métastase hépatique métachrone (apparue après le traitement du cancer primitif)
nécessitant une hépatectomie droite (résection des segments 5, 6, 7 et 8) ou gauche (résection
des segments 2,3 et 4) avec un foie sain péri-lésionnel suffisamment volumineux à l’imagerie
(TDM ou IRM abdominale). Le quatrième patient présentait un cholangiocarcinome nécessitant
une hépatectomie droite. L’absence de cirrhose au niveau du foie sain a été évaluée par des
critères d’imagerie et/ou confirmée par des critères histologiques en cas de réalisation d’une
biopsie hépatique. Pour les quatre patients, la négativité des sérologies HIV, HBV, HCV et
HTLV a été confirmée par le laboratoire de virologie hospitalière avant la chirurgie. Les quatre
patients ont signé leur consentement libre et éclairé pour leur inclusion dans le protocole.
Une fois la chirurgie effectuée, le chirurgien a déterminé macroscopiquement la
localisation de la lésion cancéreuse et réalisé une recoupe au scalpel du foie sain en respectant
au maximum la vascularisation tout en s’assurant de la présence de vaisseaux de calibre
suffisant pour la future perfusion. L’anatomopathologiste a ensuite réalisé un second examen
macroscopique afin de s’assurer du caractère sain de la recoupe en parallèle du foie comportant

90
Figure 41 : Analyse au microscope à épifluorescence de l'expression de la protéine h-TERT en
cellules Huh7 transduites
La détection de h-TERT a été réalisée grâce à un marquage primaire utilisant un anticorps lapin anti-h-
TERT associé à un marquage secondaire utilisant un anticorps chèvre anti-lapin couplé à un
fluorochrome vert Alexa 488

Figure 42 : Analyse au microscope à épifluorescence de l'expression de la protéine NTCP sur

cellules FLC4 transduites
La détection du NTCP a été réalisée grâce à un marquage primaire utilisant un anticorps lapin anti-
NTCP associé à un marquage secondaire utilisant un anticorps chèvre anti-lapin couplé à un
fluorochrome vert Alexa 488

91
la lésion. D’un point de vue structural, les quatre prélèvements hépatiques comportaient tous
une face de résection avec une vascularisation apparente du fait de la recoupe, et une face dont
l’intégrité était préservée et rendue imperméable du fait de la conservation de la capsule de
Glisson (capsule séreuse constituée de tissu conjonctif enveloppant le parenchyme hépatique).
Les délais entre l’heure de fin de la chirurgie au bloc opératoire (début de l’ischémie du
prélèvement) et l’acheminement au laboratoire de confinement L2 étaient de 1 heure (+/- 15
minutes) pour les trois prélèvements. La durée moyenne de préparation de la pièce sur le
montage était d’environ 15 minutes, suivi par la perfusion par la solution 1. La digestion du
prélèvement par la collagénase débutait 2 heures après la fin de la chirurgie pour une durée de
20 minutes. L’isolement proprement dit des hépatocytes primaires par les étapes successives de
centrifugation durait environ 2 heures. Toutes étapes cumulées, la mise en culture des
hépatocytes en flasques placées à l’incubateur a donc eu lieu environ 5 heures après la fin de la
chirurgie.
L’intervention chirurgicale du patient 1-12010618 n’a pas présenté de difficulté majeure
et a duré 3 heures entre le début de l’incision par le chirurgien et la résection complète de
l’hémi-foie. Le fragment d’exérèse pesait 55 grammes. La procédure d’isolement d’hépatocytes
primaires a été effectuée en utilisant la Liberaseâ (Figures 43, 44 et 45). Elle s’est révélée
fructueuse pour le premier prélèvement, aboutissant à l’obtention d’environ 40 millions
d’hépatocytes primaires dont la moitié a été placée en flasques coatées au collagène (Figure
46), et l’autre moitié en flasques non coatées. La présence du collagène dans le milieu de culture
apparaissait comme facultative dans les publications méthodologiques sur lesquelles nous nous
sommes appuyés, cependant les hépatocytes ensemencés sur collagène ont formé un tapis
cellulaire confluent et organisé dès 16 heures après la mise en culture, là où les hépatocytes
ensemencés sans collagène restaient désorganisés, formant un tapis cellulaire toujours non
confluent même après 48 heures de culture. Les hépatocytes mis en culture ont ensuite servi à
la réalisation de lysats cellulaires et de culots avec pour objectif l’étude transcriptomique et
protéomique de facteurs strictement hépatocytaires par d’autres membres de l’équipe de
recherche. La qualité probablement médiocre des culots et des lysats n’a cependant pas permis
l’obtention de données exploitables permettant de caractériser avec précision les hépatocytes
primaires isolés. Après discussion avec le Dr Abderrahmane Bengrine (CHU Amiens, membre
d’une équipe de recherche possédant une expertise sur les procédures d’isolement des
hépatocytes) le rendement nombre d’hépatocytes isolés/masse du prélèvement était cependant
assez faible (moins de 1 million de cellules par gramme de foie dans notre cas) et pouvant au
regard de son expérience atteindre 10 millions de cellules par gramme de foie en conditions
optimales.

92
Tableau 6 : Caractéristiques clinico-biologiques des patients inclus dans le protocole HepaPrim

93
Figure 43 : Photographie du montage utilisé pour l’isolement d’hépatocytes primaires humains à
partir de fragments de résection hépatique
Le bain-marie chauffant les solutions de perfusion se situe à gauche, le fragment au centre et la pompe
péristaltique à droite du montage, le tout placé sous un PSM de classe II au sein du laboratoire de
confinement de niveau 2.

10 cm

Figure 44 : Photographies du fragment de résection hépatique issu de l’hépatectomie du patient

1-12010618
A droite, les canules ont été placées dans les vaisseaux apparents et le tissu hépatique pâlit du fait de
l’élimination des hématies par la perfusion de solution 1.

94
Figure 45: Photographie du culot brun constitué d’hépatocytes obtenu après digestion des tissus
du prélèvement n°1 par la collagénase et étapes de centrifugation

Figure 46 : Observation en microscopie optique des hépatocytes primaires isolés à partir du

prélèvement n°1 après 24 heures de culture en flasque coatée au collagène
Les cellules isolées présentent une forme polyédrique et sont parfois binucléées, ce qui correspond bien
aux caractéristiques morphologiques classiques de l’hépatocyte primaire en culture.
(grossissement x100)

95
 Du fait d’une lésion métastatique placée près du hile du foie et donc au contact des gros
vaisseaux, l’intervention du patient 2-16051301 s’est révélée plus complexe et a duré 6 heures,
ce qui a potentiellement altéré la qualité du prélèvement obtenu. Le fragment d’exérèse pesait
80 grammes. La digestion du prélèvement a été effectuée avec la Liberaseâ. Malgré une
digestion satisfaisante du prélèvement, les premières étapes de centrifugation n’ont pas permis
la formation d’un culot individualisé semblable à celui obtenu pour le premier prélèvement.
Cette deuxième tentative n’a donc pas permis l’isolement d’hépatocytes primaires.
L’intervention chirurgicale du patient 3-12051301 ne présentait pas de difficulté
majeure et a duré 2h30. Le fragment d’exérèse pesait 110 grammes. La digestion a été effectuée
avec une collagénase simple (Clostridium hystolyticum Collagenase), moins onéreuse que la
Liberaseâ, ce qui a permis d’augmenter le volume de perfusion, probablement au prix d’une
dissociation de moins bonne qualité. Ce troisième prélèvement a permis l’isolement d’une
faible quantité d’hépatocytes associée à une grande quantité d’hématies, probablement du fait
d’une perfusion incomplète du prélèvement lors des étapes de préparation, ce qui n’a pas permis
leur développement malgré leur mise en culture. La cause est probablement la cytotoxicité des
substances relarguées lors de l’hémolyse et l’encombrement stérique des hématies gênant les
contacts cellule-cellule et donc la formation d’un tapis cellulaire viable, homogène et organisé.
Concernant le patient 4-16121005, la digestion incomplète du prélèvement n°3 nous a
incité à privilégier un fragment de plus petit volume (70 grammes) et à utiliser de nouveau la
Liberaseâ. La difficulté résidait cette fois dans un choix plus limité de vaisseaux de bon calibre
où placer nos canules, difficulté responsable une fois de plus d’une digestion de mauvaise
qualité par la collagénase. En outre, bien que le cholangiocarcinome du patient était localisé, la
dilatation des voies biliaires constatée lors de l’examen anatomopathologique touchait
également le foie sain. Ces anomalies ont pu être à l’origine d’une moins bonne viabilité des
hépatocytes en amont de la procédure d’isolement.

E. Culture cellulaire et transduction

1. Hépatocytes primaires humains

Les difficultés rencontrées lors de la procédure d’isolement des hépatocytes n’ont pas
permis de répéter plusieurs fois les tentatives de transductions par nos lentivirus immortalisants
C-myc et h-TERT. Afin de s’affranchir de l’étape d’isolement des PHH, un essai a cependant
été réalisé sur des hépatocytes primaires humains obtenus auprès de la société Biopredicâ
(spécialisée dans l’isolement et la cryopréservation de cellules hépatocytaires). Bien que les
concentrations en antibiotique étaient relativement faibles, l’étape de sélection des hépatocytes

96
transduits par la puromycine et/ou l’hygromycine a été responsable d’une importante mortalité
cellulaire, soulignant une fois encore la grande fragilité de ces cellules en culture, et n’a donc
pas permis l’obtention de cellules immortalisées à l’issue de cette procédure.

2. Lignée FLC4

Les cellules FLC4 transduites par le lentivirus pLenti-puro-NTCP à la MOI de 5 ont été
placées sous pression de sélection constante pendant 30 jours par la puromcyine à la
concentration de 3 µg/mL, permettant l’obtention d’une population cellulaire résistante à
l’antibiotique. Ces cellules ont ensuite été cultivées en permanence à la concentration
d’entretien plus faible de 1 µg/mL de puromycine afin d’éviter une dérive de la population
cellulaire résistante au profit de cellules sensibles à la puromycine ayant perdu le transgène. Il
n’a pas été réalisé de sélection clonale, les analyses ultérieures ont donc été effectuées sur une
population cellulaire exprimant de manière hétérogène le récepteur NTCP. Une partie des
cellules a été congelée dans l’azote liquide en milieu de cryoconservation (90 % SVF, 5 %
DMSO, 5 % milieu DMEM complémenté) après avoir vérifié l’absence de contamination par
des mycoplasmes.

F. Caractérisation des lignées cellulaires transduites

1. Contrôle de l’expression de la protéine d’intérêt

Les lysats cellulaires de cellules FLC4 résistantes à la puromycine ont été prétraités à la
PNGase afin de déglycosyler le récepteur NTCP. Le marquage en immunoblot a mis en
évidence une bande à 30 kilodalton, correspondant à la taille théorique attendue pour la protéine
NTCP sous sa forme non glycosylée. Cette bande est absente pour les cellules FLC4 non
transduites, et clairement présente pour notre population cellulaire de cellules FLC4 transduites
et résistantes à la puromycine (Figure 47).
L’analyse des cellules au microscope à épifluorescence a permis de réaliser une
estimation du nombre de cellules exprimant la protéine d’intérêt : sur 100 cellules marquées au
DAPI, 70 cellules présentaient une fluorescence verte avec le marquage anti-NTCP (Figure 48
A). Parmi ces cellules, on observe de surcroît une hétérogénéité de l’intensité de fluorescence,
et donc de l’expression du récepteur NTCP d’une cellule à l’autre. Ces observations
s’expliquent par l’absence de sélection clonale de notre population cellulaire résistante à la
puromycine, les niveaux d’expression observés semblaient toutefois suffisants pour réaliser une
tentative d’infection. De plus, les cellules n’étant pas synchronisées au niveau de leur cycle
cellulaire, il est possible que l’expression du récepteur NTCP varie en fonction de l’étape du

97
cycle dans laquelle se trouve chaque cellule. Une analyse plus fine au microscope confocal a
permis de mettre en évidence une fluorescence majoritairement localisée au niveau
membranaire, secondairement localisée au niveau cytoplasmique (Figure 48 B), en cohérence
avec la localisation théorique d’un récepteur membranaire parfois détecté lors de son transit au
sein de la cellule avant son adressage vers la membrane plasmique. L’analyse en
immunofluorescence a été répétée au cours du temps, notamment après décongélation des
cellules, avec des résultats comparables à ceux décrits précédemment même après plusieurs
mois de culture.
L’ensemble de ces données nous a permis de mettre en évidence l’expression
constitutive, durable et stable, bien qu’hétérogène, du récepteur NTCP dans la population de
cellules FLC4 résistantes à la puromycine, confirmant l’établissement d’une lignée cellulaire
FLC4-NTCP.

2. Évaluation de la susceptibilité vis-à-vis de l’infection par le VHB

La mesure de l’expression des ARN prégénomiques du VHB par technique de qRT-

PCR en cellules HepG2-NTCP et FLC4-NTCP infectées a été réalisée en présence et en absence
de myrcludex B (molécule inhibitrice du NTCP), à 3 jours, 5 jours et 10 jours après l’infection.
L’expression des ARN viraux a été normalisée par rapport à l’expression du gène de ménage
HPRT, cette mesure a été répétée sur deux expériences indépendantes.
La quantité d’ARN prégénomique mesurée en cellules FLC4-NTCP était
systématiquement plus élevée qu’en cellules HepG2-NTCP, et ce dès 3 jours post-infection.
Les niveaux d’expressions en cellules FLC4-NTCP étaient respectivement, pour les trois temps
de la cinétique, 5 fois, 2 fois, et 1,7 fois plus élevés que ceux mesurés en cellules HepG2-NTCP
(Figure 49).
Si ces données confirment la susceptibilité à l’infection par le VHB de la lignée
cellulaire FLC4-NTCP mise au point dans le cadre de notre projet, elles sont également en
faveur d’un meilleur fitness des cellules FLC4 pour la réplication du VHB, pouvant expliquer
une quantité d’ARN prégénomique synthétisée supérieure par rapport aux cellules HepG2-
NTCP, un phénomène observé dès les premiers jours après infection.

98
Figure 47 : Analyse en immunoblot de l'expression du récepteur NTCP en cellules FLC4
Le marquage primaire a été réalisé avec un anticorps lapin anti-NTCP, le marquage secondaire avec
un anticorps anti-lapin couplé à la peroxydase. La détection de l’actine a permis de s’assurer du dépôt
et de la migration correcte de nos lysats cellulaires

Figure 48: Analyse au microscope à épifluorescence (A) et au microscope confocal (B) de

l'expression du récepteur NTCP en cellules FLC4

99
Figure 49 : Cinétique d’apparition et quantification de l'ARN prégénomique du VHB mesurées
par qRT-PCR en cellules HepG2-NTCP et FLC4-NTCP infectées
Chaque échantillon a été analysé trois fois : les barres de l’histogramme représentent la moyenne et
l’écart-type des valeurs mesurées pour chaque triplicata.
La valeur du « fold change » traduit la différence de niveau d’expression d’un même ARN entre deux
conditions. Son calcul a été effectué par la différence entre la valeur du Cycle threshold (nombre de
cycles pour franchir le seuil) de l’infection en l’absence myrcludex et la valeur du Ct de l’infection en
présence de myrcludex. La valeur du « fold change » de la condition myrcludex a été arbitrairement
fixée à 1. Un « fold change » à 4 pour la condition sans myrcludex signifie que l’ARN prégénomique
s’exprime 4 fois plus par rapport à la condition avec myrcludex.

100
IV. Discussion

La mise au point de nouvelles thérapeutiques curatives ciblant le VHB ne sera possible

que par une meilleure compréhension des différentes étapes de son cycle cellulaire. Cette
méconnaissance persiste à l’heure actuelle du fait de l’absence de modèle d’étude animal ou
cellulaire optimal. En particulier, les modèles cellulaires in vitro actuels, qu’ils soient utilisés
pour des infections ou des transfections de génomes du VHB restent peu efficaces pour
répliquer le virus sur de longues périodes (supérieures à quelques semaines). Ceci est
directement lié au modèle utilisé dans certains cas (hépatocytes primaires), mais aussi au fait
que ces systèmes in vitro de propagation ne sont pas optimaux pour la formation de l’ADNccc,
un intermédiaire clé de la réplication virale mais aussi de la persistance (139). Bien que cela
reste largement méconnu, dans le cas des lignées dérivées d’hépatocarcinome classiquement
utilisées (HepG2, Huh7), la perte de différenciation est sûrement liée à la perte de facteurs
strictement hépatocytaires clés pour la réplication du virus. L’objectif de notre étude était donc
de mettre au point de nouvelles lignées cellulaires d’intérêt conservant un haut degré de
différenciation et de ce fait plus aptes pour l’étude de l’infection par le VHB. Deux approches
originales ont été développées : d’une part l’utilisation d’hépatocytes primaires humains (PHH)
immortalisés ; d’autre part l’élaboration d’une lignée cellulaire FLC4 (certes dérivée
d’hépatocarcinome mais présentant des caractéristiques phénotypiques proche d’un hépatocyte)
exprimant de manière constitutive le récepteur NTCP.
La mise en place de notre première stratégie de préparation de PHH suivie d’un
processus d’immortalisation a permis de mettre en évidence un certain nombre de facteurs
limitants la concernant. Bien que décrits avec précision dans la littérature, les protocoles
d’isolement des hépatocytes primaires demeurent des approches lourdes et complexes. La
qualité comme la quantité de cellules obtenues dépend d’un grand nombre de facteurs comme
ceux liés au patient (pathologie métabolique, prise de médicament hépatotoxique…), au
prélèvement (état du foie en zone non tumorale, délai de prise en charge après exérèse…) ou à
l’efficacité de la procédure de perfusion elle-même. Une première difficulté concerne la taille
du prélèvement recoupé par le chirurgien : un fragment trop volumineux ne sera pas digéré
entièrement par la collagénase, tandis qu’un fragment plus petit risque de présenter trop peu de
vaisseaux de calibre suffisant et devient donc difficile à perfuser efficacement. Pour pallier le
volume trop important du prélèvement, la recoupe au scalpel du fragment se heurte au risque
de sectionner un gros vaisseau utilisable pour perfuser. Un autre facteur limitant est la qualité
de la collagénase utilisée. La Liberaseâ, un cocktail enzymatique de qualité supérieure à une
simple collagénase, se révèle bien plus coûteuse et limite de fait le volume d’enzyme perfusable

101
et donc le volume de foie à traiter. L’utilisation d’une collagénase simple a permis d’augmenter
significativement le volume de la solution de perfusion, probablement au détriment d’une
dissociation optimale. Les différentes étapes de perfusion sont également critiques, puisqu’il
est difficile d’éviter les fuites et de réaliser une imperméabilisation de la face de résection du
fragment. En effet, là où la capsule de Glisson rend imperméable la face postérieure du
fragment, la face antérieure réséquée comporte les sections des gros vaisseaux, mais également
celles des capillaires situés en distalité. De fait, un volume non négligeable de solution de
perfusion, contenant ou non la collagénase dissoute, ne diffuse pas convenablement dans
l’ensemble du prélèvement et est de ce fait perdu. L’utilisation d’une colle chirurgicale n’a pas
permis de régler entièrement le problème d’étanchéité, son utilisation n’étant de surcroît pas
recommandée en raison de la cytotoxicité induite par sa composition. Enfin, l’étape de
purification au Percollâ est également apparue critique. Si celle-ci permet l’élimination des
cellules mortes, elle réduit significativement la quantité d’hépatocytes isolés. Le fait d’avoir
isolé avec succès des PHH lors de notre première tentative prouve cependant la faisabilité de
ce protocole au CHRU de Tours. Le succès de sa mise en place, avec des tentatives fructueuses
plus fréquentes, réside probablement dans la formation de personnel dédié pour ce type de
protocole, ayant acquis une expérience suffisante pour réaliser chaque étape de manière
optimale. Concernant l’immortalisation des hépatocytes, l’utilisation de vecteurs lentiviraux
s’est révélée particulièrement délicate sur ces cellules d’une grande fragilité, bien que
l’efficacité de tels vecteurs ait été vérifiée au préalable sur cellules Huh7. La transduction en
elle-même est un processus occasionnant un stress cellulaire important, auquel il faut rajouter
l’étape de sélection par antibiotique responsable d’une mortalité cellulaire élevée. Faute d’avoir
pu répéter ce processus d’immortalisation, il est difficile d’établir précisément les raisons de
cet échec n’ayant pas permis l’établissement de lignées. L’objectif de ces transductions était de
court-circuiter les signaux de régulation négative du cycle cellulaire via la télomérase et C-myc,
afin de réenclencher le processus de division cellulaire. Les facteurs explicatifs de cet échec
sont potentiellement multiples : mauvaise efficacité de la transduction sur PHH par rapport aux
Huh7, fragilité des cellules vis-à-vis des antibiotiques ou des lentivirus eux-mêmes, ou encore
l’absence de reprise de la division cellulaire malgré une transduction efficace.
En comparaison de la première, notre seconde approche, plus simple dans sa conception,
comportait beaucoup moins de variables à prendre en compte. L’efficacité de transduction d’un
lentivirus dépend à la fois de la protéine que l’on cherche à exprimer et de la lignée cellulaire à
transduire. En l’occurrence, le vecteur lentiviral pLenti-puro-NTCP utilisé sur cellules FLC4
fournissait un taux élevé de transduction, même pour des MOI faibles, ce qui a grandement
facilité l’étape de sélection en puromycine et l’obtention d’une population résistante.
L’expression constitutive du récepteur NTCP a été confirmée dans cette population
102
sélectionnée, une expression d’un niveau satisfaisant bien qu’hétérogène au regard de l’absence
d’étape de sélection clonale. Cette hétérogénéité d’expression devra faire l’objet d’exploration,
toutefois il est probable qu’elle soit en lien, d’une part avec une expression qui varie au cours
du cycle cellulaire et d’autre part avec le fait que sans sélection clonale spécifique, les clones
constituant notre lignée expriment différents niveaux de NTCP en relation directe avec
l’intégration aléatoire des vecteurs lentiviraux dans le génome cellulaire. De plus, il est à noter
qu’un niveau élevé d’expression du récepteur NTCP en surface des cellules n’est pas
nécessairement prédictif d’une meilleure susceptibilité à l’infection, les quelques particules
virales en cours d’entrée utilisant une fraction de la totalité des récepteurs. La maîtrise dans
notre unité du protocole complexe d’infection par le VHB s’est justement révélée être une
opportunité pour évaluer plus finement la susceptibilité de cette lignée exprimant le NTCP.
Ceci a notamment permis d’étudier la propagation du virus dans un contexte plus proche de
l’infection naturelle que la technique classique de transfection de plasmide codant pour le
génome viral. Pour rappel, il n’existe à l’heure actuelle que deux lignées cellulaires identifiées
comme infectables par le VHB in vitro : les hépatocytes primaires humains (avec toutes les
limites que leur utilisation comporte) et la lignée HepG2-NTCP. Les résultats obtenus en qRT-
PCR ont d’une part confirmé la susceptibilité de la lignée FLC4-NTCP à l’infection, d’autre
part les niveaux d’expression de l’ARN prégénomique en cellule FLC4-NTCP se sont révélés
significativement, et de façon reproductible, plus élevés que ceux obtenus en cellules HepG2-
NTCP, laissant présager d’une plus grande susceptibilité à l’infection. La lignée FLC4-NTCP
apparaît donc comme particulièrement intéressante, ce qu’il conviendra d’étayer par d’autres
analyses. Il pourra notamment être intéressant d’évaluer l’impact dans la mise en place du cycle
viral de la production de certains facteurs hépatocytaires produits spécifiquement dans cette
lignée FLC4 (140). Si les résultats préliminaires obtenus sur une population hétérogène sont
déjà intéressants, la sélection d’un clone cellulaire exprimant très fortement le NTCP pourrait
permettre l’obtention d’une lignée particulièrement susceptible au VHB, tout en disposant d’un
modèle standardisé assurant une meilleure reproductibilité expérimentale. En outre, la lignée
HepG2-NTCP étant clonale, la comparaison des performances des deux lignées n’aura de sens
que si l’on étudie un clone FLC4-NTCP. Si la susceptibilité de notre modèle à l’infection a été
démontrée, sa capacité à produire et sécréter des virions complets et infectieux reste à
confirmer. Ceci sera prochainement évalué par la réinfection de cellules FLC4-NTCP ou
HepG2-NTCP naïves à l’aide de surnageants issus d’une première culture de cellules infectées.
L’utilisation de virions infectieux à la place de la transfection de plasmide évite d’apporter aux
cellules des copies de génome viral qui pourrait persister et interférer avec la détection de
l’ADNccc. Rendu possible de ce fait, il sera opportun de quantifier la formation de l’ADNccc
de façon comparative avec la lignée HepG2, la mise en évidence d’une différence pourrait

103
expliquer une réplication virale supérieure dans la lignée FLC4-NTCP. La mise en place de la
technique de détection de l’ADNccc au sein de notre laboratoire apparaît donc comme une
priorité. Une analyse ultrastructurale des cellules FLC4-NTCP en microscopie électronique à
transmission semble également pertinente, elle pourrait permettre de détecter plus facilement
des particules en formation dans la cellule infectée, ou faciliter l’étude des étapes d’entrée du
virus dans la cellule. Enfin, il pourra être intéressant d’étudier la réplication virale sur le long
terme, afin d’évaluer la persistance de l’infection au cours des passages successifs en culture.
Ceci permettra également d’étudier un éventuel mécanisme d’adaptation du virus à la lignée
FLC4-NTCP, à l’instar de ce que l’on a pu observer dans le passé avec le virus de l’hépatite C
(141). Ce modèle de cellules infectées depuis une longue période de temps pourrait alors se
rapprocher des hépatocytes chroniquement infectés in vivo, et constituer un système opportun
dans la recherche de nouvelles approches thérapeutiques. Enfin, il est à noter que la facilité de
culture (dissociation cellulaire non nécessaire au moment des passages) et les propriétés
optiques des cellules FLC4-NTCP (des cellules fines formant un tapis cellulaire plan et
homogène) en font un modèle de choix pour la réalisation d’immunofluorescence permettant
une analyse précise de la localisation subcellulaire des composants viraux en microscopie
confocale, par opposition aux HepG2-NTCP dont la croissance génère en culture des
agglomérats de cellules qui rendent difficiles ces analyses.
L’obtention d’une nouvelle lignée cellulaire FLC4-NTCP infectable in vitro représente
une avancée significative, dans le contexte actuel de carence en modèles d’étude du VHB. Elle
ouvre de nombreuses perspectives en raison de sa simplicité de mise en œuvre et des avancées
potentielles qu’elle laisse entrevoir. La mise au point de nouveaux modèles d’étude représente
un enjeu majeur de la lutte contre le VHB, pour mieux comprendre son cycle dans la cellule
infectée et dans l’optique de la mise au point de thérapeutiques innovantes.

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113
Vu, le Directeur de Thèse

Vu, le Doyen
De la Faculté de Médecine de Tours
Tours, le

114
Sébastien EYMIEUX

116 pages – 6 tableaux – 49 figures

Résumé :
Le virus de l’hépatite B (VHB) est un agent infectieux d’importance majeure en
pathologie humaine. Du fait de la persistance d’ADN super-enroulé (ADNccc) dans les
hépatocytes infectés, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement permettant une guérison
complète et définitive de l’infection. La mise au point de nouvelles thérapeutiques passe par
une meilleure compréhension du cycle viral, notamment l’étape de formation de l’ADNccc.
L’absence de modèle d’étude optimal in vitro a motivé ce projet, qui consistait en la mise au
point de lignées cellulaires innovantes au travers de deux stratégies de transduction par un
vecteur lentiviral : la première par l’immortalisation d’hépatocytes primaires humains via les
oncogènes C-myc et h-TERT, la seconde par l’élaboration de cellules FLC4 exprimant le
récepteur NTCP du VHB afin de les rendre infectables par le virus. L’obtention d’hépatocytes
primaires humains via l’activité de chirurgie hépatique a été permise grâce à la mise en place
du protocole « Hepaprim ».
La complexité de la procédure d’isolement des hépatocytes, ainsi que leur grande
fragilité lors des étapes de transduction, se sont révélées des facteurs limitants pour l’obtention
de cellules immortalisées. L’obtention d’hépatocytes primaires humains lors de notre première
tentative confirme cependant la faisabilité de ce protocole au CHRU de Tours.
Notre seconde stratégie a permis la mise au point d’une lignée FLC4-NTCP. La
caractérisation de cette lignée, notamment par la détection du génome du virus en intracellulaire
après infection in vitro, a confirmé sa capacité à être infectée par le VHB. Les valeurs des
paramètres d’infection mesurés étaient supérieures, en termes de rendement et de cinétique, à
celles obtenues sur la lignée standard HepG2-NTCP. L’obtention d’une nouvelle lignée
infectable par le VHB représente une avancée significative vers une meilleure compréhension
de son cycle.
Mots clés : VHB, modèles cellulaires, foie, hépatocytes primaires humains, C-myc, h-TERT,
FLC4, NTCP, lentivirus, immortalisation, infection in vitro

Jury :

Président du jury : Professeur Philippe ROINGEARD

Directeur de thèse : Professeur Christophe HOURIOUX

Membres du jury : Professeur Catherine GAUDY-GRAFFIN

Professeur Gilles THIBAULT
Docteur Louis D’ALTEROCHE
Docteur Fanny DUJARDIN

Date de soutenance : 27 septembre 2019

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