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Mécanismes d’antibiorésistance de bactéries lactiques

Thesis · September 2020

DOI: 10.13140/RG.2.2.32429.36322

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1 author:

Taha Ahmed Benabbou

University of Saida Dr Moulay Tahar
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 REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE ORAN1 AHMED BEN BELLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

N° d’Ordre

DEPARTEMENT DE BIOTECHNOLOGIE

Thèse de Doctorat en Sciences

Option Biotechnologie

Spécialité Génie microbiologique

Mécanismes d’antibiorésistance de bactéries

lactiques

Présenté par : Mr BENABBOU Taha Ahmed

Soutenue le :

Devant le jury composé de :

Présidant Pr. ROUDJ Salima Université Oran1

Examinateur Pr. DALACHE Fatiha Université Mostaganem

Examinateur Pr. ABOUNI Bouziane Université Sidi Bel Abbès

Examinateur Pr. BEKKADA Mohamed Ahmed Ali CU Tissemsilt
Examinateur Pr. AOUES Abdelkader Université Oran1

Invité Pr. SLIMANI Miloud Université Saida

Directeur de thèse Pr. KARAM Nour-Eddine Université Oran1

Année universitaire 2019/2020

 ‫إهداء‬

‫إهداء‬

‫الح مد هلل كما ين بغي ل جالل وجهه وعظ يم سلطانه على منه وعونه إلتمام هانه األطروحة‬

‫ج‬ ‫َّ‬ ‫ُ ف ِّ ع نف ِل َ‬
‫إلى من أ ضلها لى سي‪ ،‬و م ال؛ فلقد ضحت من أ لي‬

‫ولم ت َّدخر ُج ًهدا في سن يل إسعادي على َّ‬

‫الدوام‬
‫ُ‬
‫إلى صاحنة السيرة العطرة‪ ،‬والقكر المستنير؛‬

‫ب‬ ‫فلقد كان لها الفضل َّ‬

‫األول في تلوغي ال عل يم العالي‬
‫ُ ِّ‬
‫(أمي الح ب تنة)‪.‬‬

‫إلى من وضع ني على طريق الح ياة‪ ،‬وجعل ني رانط ال جأش‪،‬‬

‫ُ‬
‫نسير في دروب الح ياة‪ ،‬و يبقى من ن طر لى أذهاي يا في ل مسلك ن لكه‬
‫س‬ ‫ك‬ ‫ع‬ ‫ب‬ ‫س‬

‫صاحب الوحه الظ تب‪ ،‬واألفعال ا حل سنة‪.‬‬

‫(والدي العزيز)‪.‬‬

‫إلى إخوتي؛ و اين ني و زوج ني و كل أهلي و من كان لهم تا لغ األير في تذل يل كنير من العق يات والصعاب‪.‬‬

‫إلى أصدفاتي‪ ،‬وجم بع من وففوا جبواري وساعدوتي نكل ما تملكون‪ ،‬وفي أضعدة كنيرة‬

‫إلى جم بع أسا تذتي الكرام؛ ممن لم ي توايوا في مد تد العون لي على رأسهم أس ياذي القاصل كرم يور الدين‬

‫ع‬ ‫ت َّ‬ ‫ل‬ ‫ِّ‬ ‫ُ‬

‫ك‬ ‫م‬ ‫ك‬
‫أفدم م هانه األطروحة‪ ،‬وأ نى أن بجوز لى رصا م ‪.‬‬

‫ين ع تو طه أجمد‬
 Remerciement

Remerciement

Je tiens à remercier vivement le professeur KARAM Nour-

eddine, Professeur à l'Université d'Oran1 pour la confiance qu’il

m’a témoigné en acceptant la direction scientifique de mes travaux.

Je lui suis reconnaissant de m’avoir fait bénéficier tout au long de

ce travail de sa grande compétence, de sa rigueur intellectuelle, de

son dynamisme, et de son efficacité certaine que je n’oublierai

jamais. Soyez assuré de mon attachement et de ma profonde

gratitude.

J’exprime tous mes remerciements à l’ensemble des membres

de mon jury : Pr. ROUDJ Salima, Pr. DALACHE Fatiha, Pr.

ABOUNI Bouziane, Pr. BEKKADA Mohamed Ahmed Ali, Pr.

AOUES Abdelkader et notre invité Pr. SLIMANI Miloud.

Je tiens à exprimer mes plus vifs remerciements à tous les

enseignants qui ont contribué à notre formation tout au long de

cette carrière universitaire.

J’adresse toute ma gratitude à tous mes ami(e)s et à toutes les

personnes qui m’ont aidé dans la réalisation de ce travail.

Mes vifs remerciements vont aussi à toute la promotion de

Biotechnologie option génie microbiologique 2005/2006.

Finalement, je remercie mes parents et mon épouse pour

leurs soutiens qui m’a été bien utile durant ma thèse.

 Liste des abréviations

Liste des abréviations

ABC : ATP-Binding Cassette

AL : Acid lactique
AMP : Ampicilline
AMC : Amoxicilline + Acide clavulanique
AX : Amoxicilline
AZM : Azithromycine
BL : Bactéries lactiques
BLSE : β-lactamases à spectre élargi
C : Chloramphénicol
C3G : Céphalosporine de 3eme génération
CAZ : Céftazidime
CA-SFM : Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de
Microbiologie
CL: Céfalexine
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
CMI : Concentration minimale inhibitrice
CN : Gentamicine
CZ : Céfazoline
DA : Clindamycine
DSA : Direction des services agricole
E : Erythromycine
EGM : Elément génétique mobile
EMP: Embden–Meyerhof–Parnas
EPS: Exopolysaccharides
FAO: Food and agriculture organization
FF: Fosfomycines
FOX: Céfoxitine
GRAS: Generaly recognised as safe
THG: Horizontal gene transfer
IPM: Imipéneme
MADR : Ministère de l’agriculture et du développement rural

i
 Liste des abréviations

MATE: Multidrug and Toxic Compound Extrusion

MFS: Major Facilitator Superfamily
MRS: Man, Rogosa et Sharp
MRSA : Methicillin - resistant Staphylococcus aureus
OMS : Organisation mondiale de la santé
P : Pénicilline
PBP : Penicilin binding protein
PKP : Phosphoketolase
PLP : Protéine liant la pénicilline
QPS: Qualified Presumption of Safety
RAM : Résistance aux antimicrobiens
RD : Rifampicine
RND: Resistance-Nodulation-Division
SMR: Small Multidrug Resistance
TF : Type fermentaire
UFC : Unité formant colonie
V : Variable
ERV : Enterococci - Resistant à la vancomycin
WHO : World health organization

ii
 Liste des tableaux

Liste des tableaux

Tableau 1: Bactéries lactiques résistantes aux antibiotiques isolées des

aliments. ................................................................................................................ 22

Tableau 2: Origine biologiques de BL. .............................................................. 38

Tableau 3: Origine, identification et désignation BL du souchier du

laboratoire de LBMB de l'Université d’Oran ......................................................... 59

Tableau 4: Origine et désignation des 241 isolats bactériens ............................. 60

Tableau 5: Profil de résistance aux antibiotiques de BL selon les genres .......... 81

Tableau 6: Profil de résistance aux antibiotiques de BL en fonction de

l’origine d’isolement ............................................................................................... 81

Tableau 7: Distribution des CMI pour le genre Lactobacillus (n=95). .............. 88

Tableau 8: Distribution des CMI pour le genre Lactococcus (n=62). ............... 88

Tableau 9: Distribution des CMI pour le genre Enterococcus (n=54)............... 88

Tableau 10: Distribution des CMI pour le genre Streptococcus (n=17). ........... 89

Tableau 11: Distribution des CMI pour le genre Leuconostoc (n=13). ............. 89

Tableau 12: Taux d'entérocoques isolés avant et après 3, 5 et 7 jours de

traitement par l'ampicilline à 20 mg/kg. ............................................................... 94

Tableau 13: Distribution des CMI d'ampicilline (μg/mL) et niveau de

résistance chez les Enterococcus spp aux jours 0, 3, 5 et 7 du traitement. ............ 95

Tableau 14: Données d'étalonnage de la méthode............................................. 97

Tableau 15: Résultats du contrôle de qualité de l'ADN génomique ................ 100

Tableau 16: Résultat de la qualité des données brutes.................................... 101

Tableau 17: Résultat de la qualité des données brutes après nettoyage. ......... 103

Tableau 18: Résultats de l'assemblage du génome entier de E. faecium

FA4 ..................................................................................................................... 106

iii
 Liste des tableaux

Tableau 19: Résultats de l’assemblage des reads utilisant un génome

référence .............................................................................................................. 107

Tableau 20: Comparaison de l'annotation de E. faecium DO accession

CP003583.1 .......................................................................................................... 108

Tableau 21: Résultats de l'annotation du génome de E. faecium FA4............ 109

Tableau 22: Description des fichiers de sortie Prokka ..................................... 110

Tableau 23: Liste des gènes de résistance présents dans E.faecium FA4 ........ 113

Tableau 24 : Modifications des acides aminés dans la séquence pbp5 de

la souche de E. faecium FA4. .............................................................................. 115

Tableau 25: Liste des gènes de virulence présents dans E. faecium FA4 ........ 122

Tableau 26: Liste et position des prophages de E. faecium FA4 ..................... 125

Tableau 27: Composants EGM du plasmide 1 de E. faecium FA4 ................. 128

Tableau 28: Composants du Tn916 du plasmide 3 de E. faecium FA4........... 129

Tableau 29: Agents antimicrobiens pour la détermination de la

sensibilité phénotypique utilisés dans les études I à III. ....................................... 173

Tableau 30: Procédé de dilution des antibiotiques .......................................... 177

Tableau 31 : Caractéristiques différenciant les 12 genres de BL ..................... 179

Tableau 32: Différenciation du lactocoque et des coques similaires à

Gram positif ........................................................................................................ 179

Tableau 33: Caractéristiques des isolats de lait de vaches. ............................. 180

Tableau 34: (Suite) Caractéristiques des isolats de lait de vaches. ................. 181

Tableau 35: Caractéristiques des isolats de lait de chamelles.......................... 182

Tableau 36: (Suite) Caractéristiques des isolats de lait de chamelles.............. 183

Tableau 37: Caractéristiques des isolats de camemberts. ................................ 184

Tableau 38: Caractéristiques des isolats de Jben. ........................................... 185

Tableau 39: Caractéristiques des isolats des jéjunums de poules..................... 186

iv
 Liste des tableaux

Tableau 40: Valeurs de CMI fixées par CLSI pour le genre Lactobacillus ....... 187

Tableau 41: Normes d'interprétation du diamètre de la zone et de la

CMI fixées par CLSI pour le genre Enterococcus ................................................ 187

Tableau 42: Valeurs de CMI fixées par CLSI pour le genre Leuconostoc........ 187

Tableau 43: Normes d'interprétation du diamètre de la zone et de la

CMI fixées par CLSI pour le genre Streptococcus................................................ 188

Tableau 44: Valeurs de CMI fixées par FEEDAP........................................... 188

v
 Liste des figures

Liste des figures

Figure 1: Mode et site d’action des antibiotiques ............................................... 5

Figure 2: Mécanismes de la résistance aux antibiotiques de BL ........................ 16

Figure 3: Mécanismes de transfert horizontal de gènes chez les BL ................... 20

Figure 4: Proposition d'un système d'évaluation de la résistance aux

antibiotiques des BL utilisées comme probiotiques et en culture starter. .............. 29

Figure 5: Stratégies et cibles bactériennes utilisées pour lutter contre la

résistance aux antibiotiques ................................................................................... 30

Figure 6: Lecture du test de Hodge ................................................................... 45

Figure 7: Présentation de la méthode de préparation de la banque

d'ADN Illumina Nextera. ...................................................................................... 51

Figure 8: Génération des NGS Clusters et lecture de séquençage ...................... 52

Figure 9: Aspect des colonies bactériennes sur milieu Ml7 solide de

LVS2 (Lactococcus spp) ........................................................................................ 61

Figure 10: Aspect des cultures bactériennes en milieu liquide. .......................... 63

Figure 11: Cultures bactériennes en présence de 0,1% et 0,3% de bleu

de méthylène. ........................................................................................................ 63

Figure 12: Type fermentaire des cultures bactériennes en milieu liquide........... 64

Figure 13: Aspect de la galerie API 20 Strep inoculée par la souche

FA12 après 24 h d’incubation à 30°C. ................................................................... 72

Figure 14: Capture d’écran de l’affichage de grille d’identification de la

souche FA12 par le PIBWin .................................................................................. 72

Figure 15: Capture d’écran de l’affichage de l’onglet d’identification de

la souche FA12 par PIBWin. ................................................................................. 73

Figure 16: Aspect de la galerie API 50CH inoculée par la souche LVC15
après 24 h d’incubation à 30°C .............................................................................. 74

vi
 Liste des figures

Figure 17: Captures d'écran de l'affichage de la grille d'identification de

la souche LVC15 sur site d’identification UBPM .................................................. 74

Figure 18: Cladogramme, utilisant une la matrice de distance

(neighbor-joining) de séquences de gènes d'ADNr 16S........................................... 75

Figure 19: Spectre de masse obtenu par MALDI-TOF/MS pour l’isolat

JP3. ....................................................................................................................... 76

Figure 20: Antibiogramme de la souche Lactococcus spp (LVS15). .................. 77

Figure 21: Taux de résistances de BL aux différents antibiotiques. .................. 78

Figure 22: Projections des antibiotiques sur l'espace F1-F2 sur la base
de la résistance des genres à ces antibiotiques. ...................................................... 82

Figure 23: Regroupement hiérarchique des antibiotiques sur la base de

leurs projections en figure 22. ................................................................................ 82

Figure 24: Projections des antibiotiques sur l'espace F1-F2 basées sur la
résistance des BL en fonction de leur origine d'isolement. ..................................... 85

Figure 25: Regroupement hiérarchique des antibiotiques sur la base de

leurs projections en figure 24. ................................................................................ 86

Figure 26: Détermination de la CMI des souches de BL vis-à-vis de

l’oxytétracycline par la méthode de dilution en milieu solide. ............................... 87

Figure 27: Détermination de la CMI de la vancomycine (µg/mL) pour

la souche FA4 par la méthode de dilution en bouillon. .......................................... 87

Figure 28: Pourcentages d’Enterococcus spp résistant à l'ampicilline

pour chaque groupe. .............................................................................................. 93

Figure 29: Répartition des espèces d’Enterococcus isolées de fèces de

rats traités par ampicilline ..................................................................................... 93

Figure 30: Distribution des CMI d'ampicilline (μg/mL) parmi E.

faecium, E. hirae, E. faecalis et E. avium isolés aux jours 0, 3, 5 et 7 du
traitement. ............................................................................................................. 95

Figure 31: Chromatogrammes RP-HPLC de fèces de rats................................. 96

vii
 Liste des figures

Figure 32: Concentration d'ampicilline. ............................................................ 97

Figure 33: Mesures moyennes de l'ampicilline par RP-HPLC dans les

fèces des rats traités par l'ampicilline 16 µg/mL ................................................... 98

Figure 34: Scores de qualité des bases (Sanger/Encodage Illumina 1.9)

avant nettoyage. .................................................................................................. 102

Figure 35: Scores de qualité des bases (Sanger/Encodage Illumina 1.9)

après nettoyage. ................................................................................................... 103

Figure 36: Capture d’écran de résultats du pipeline RASTtk ......................... 110

Figure 37: Séquence protéique du gène pbp5 et les différentes variations

en acides aminés (surlignées en gris) dans pbp5 de la souche E. faecium
FA4. .................................................................................................................... 116

Figure 38: Disposition des prophages sur le chromosome de E. faecium

FA4. .................................................................................................................... 124

Figure 39: Structure prévue de la séquence oriT du Tn916 de E.

faecium FA4. ....................................................................................................... 129

Figure 40: Structure prévue de 11 gènes T4SS du Tn916 de E. faecium

FA4 ..................................................................................................................... 129

Figure 41: Séquençage "Paire ends reads" selon illumina ................................ 190

viii
 Résumé

Résumé

L'objectif principal de cette thèse est de déterminer le profil de

résistance aux antibiotiques de bactéries lactiques isolées de différents
biotopes. Les résultats montrent que certaines souches ont présenté des
résistances inhabituelles à plusieurs classes d’antibiotiques, en particulier à
la famille des β-lactamines, tétracyclines et macrolides. Les bactéries
multi-résistantes ont été identifiées à l’aide de galeries API 50CH (n=16)
ou API 20STREP (n=23). Les bactéries multi-résistantes exprimant en
plus des CMI élevées par rapport à l'ampicilline ont aussi été identifiées
par le séquençage de l'ADNr 16S (n=2) et/ou par Maldi-Tof (n=3).
L’ACP a montré que le lait de vache et le jéjunum de poulets sont les
biotopes les plus riches en bactéries lactiques résistantes aux antibiotiques,
dont Enterococcus comme étant le genre le plus résistant parmi ces
bactéries lactiques. Les résultats de l'administration orale d'ampicilline sur
le microbiote intestinal des rats montrent que les animaux traités
excrétaient des pourcentages significativement plus élevés d'entérocoques
résistants que le groupe de contrôle (P ≤ 0,05) pendant et après le
traitement. L'espèce prédominante sélectionnée après le début du
traitement était E. faecium. Les CMI de l'ampicilline pour tous les isolats
d'E. faecium étaient de 32 à 64 μg/mL, à l'exception de deux souches
(FA4, FA8), qui se sont avérées très résistantes (CMI ≥ 128 μg/mL). La
quantification de l'ampicilline dans les fèces par la RT-HPLC a montré
que l'augmentation significative du nombre d'entérocoques résistants à
l'ampicilline était associée à l'accumulation progressive de niveaux élevés
d'ampicilline non absorbée dans les fèces. L’analyse génomique de la
souche FA4 montre qu’en plus de son chromosome elle dispose de trois
plasmides. L’annotation a montré que le génome porte 3244 gènes dont 20
gènes de résistance aux antibiotiques (AAC(6')-Ii, aph(3')-IIIa, msrC,
msrA, efmA, ponA, fosX, dfrF, tetA, vanZ, SAT4, aph(3’)-IIa, ant(6)-Ia,
cat et erm(B). tetS, tetM, tetL, lnu(B) et dfrG), 3 gènes de virulences
efaAfm, acm et hylEfm, 8 prophages tempérés, et 2 EGM. La recherche
des mutations génétiques a révélé un ensemble de 20 mutations
chromosomiques ponctuelles identifiées dans le gène pbp 5 conférant une
résistance à l'ampicilline. Nos résultats suggèrent que les BL sont
susceptibles d'acquérir des gènes de résistance aux antibiotiques, mais
peuvent également agir comme un grand réservoir de gènes transmissibles
à d'autres bactéries partageant le même écosystème.
Mot clés : bactéries lactiques, antibiorésistance, microbiote
intestinal, E. faecium, séquençage de génome, gènes de résistance,
transfert horizontal.

ix
 Abstract

Abstract

The main objective of this thesis is to determine the antibiotic

resistance profile of lactic acid bacteria (LAB) isolated from different
biotopes. The results show that some strains showed unusual resistance to
several classes of antibiotics in particular to the family of β-lactam
antibiotics, tetracyclines and macrolides. Multi-resistant strains were
identified by the API 50CH (n=16) or API 20STREP (n=23) galleries,
however multi-resistant strains expressing additionally high MICs
compared to ampicillin were identified by 16S rDNA sequencing (n=2)
and/or by Maldi-Tof (n=3). PCA showed that cow's milk and chicken
jejunum represent the biotopes richest in antibiotic-resistant LAB, with
Enterococcus as the most resistant genus among the LAB. Results of the
effect of oral ampicillin administration on the intestinal microbiota of rats
showed that treated animals excreted significantly higher percentages of
resistant enterococci than the control group (P ≤ 0.05) during and after
treatment. The most predominant species selected after the start of
treatment was E. faecium. Ampicillin MICs for all E. faecium isolates
were 32-64 μg/mL, with the exception of two strains (FA4, FA8), which
were found to be highly resistant (MIC ≥ 128 μg/mL). Quantification of
ampicillin in the faeces by RT-HPLC showed that the significant increase
in the number of ampicillin-resistant enterococci was associated with the
progressive accumulation of high levels of unabsorbed ampicillin in the
faeces. Genomic analysis of the FA4 strain shows that in addition to its
chromosome it has three plasmids whose annotation showed that the
genome carries 3244 genes including 20 antibiotic resistance genes
AAC(6')-Ii, aph(3')-IIIa, msrC, msrA, efmA, ponA, fosX, dfrF, tetA,
vanZ, SAT4, aph(3')-IIa, ant(6)-Ia, cat and erm(B). tetS, tetM, tetL,
lnu(B) and dfrG, 3 virulence genes efaAfm, acm and hylEfm, 8 tempered
prophages, and 2 MGEs. In addition, genetic mutation testing revealed a
set of 20-point chromosomal mutations identified in the pbp 5 gene
conferring resistance to ampicillin. Our results suggest that LAB are likely
to acquire antibiotic resistance genes, but may also act as a large reservoir
of genes transmissible to other bacteria sharing the same ecosystem.
Keywords: lactic acid bacteria, antibiotic resistance, intestinal
microbiota, E. faecium, genome sequencing, resistance genes, horizontal
transfer.

x
 ‫ملخص‬

‫ملخص‬
‫الهدف الرئيسي من هذه الرسالة هو تحديد خصائص مقاومة المضادات الحيوية لـبكتيريا حمض اللبن )‪(LAB‬‬
‫المعزولة من مختلف المساكن حيوية‪ .‬أظهرت النتائج أن بعض السالالت أظهرت مقاومة غير عادية لعدة فئات من‬
‫المضادات الحيوية على وجه الخصوص لعائلة المضادات الحيوية بيتا‪-‬الكتام و التتراسيكلين و الماكروليدات‪ .‬تم تحديد‬
‫السالالت متعددة المقاومة بواسطة أجهزة وطرق التعريف ‪) API 50CH‬العدد = ‪ (16‬أو ‪API 20STREP‬‬
‫(العدد = ‪ )23‬ومع ذلك تم تحديد السالالت متعددة المقاومة التي تعبر عن ارتفاع الحد األدنى من تركيز المثبط ‪MICs‬‬
‫مقارنة باألمبيسيلين بواسطة تسلسل الحمض النووي ‪( rDNA 16S‬العدد = ‪ )2‬و ‪ /‬أو بواسطة ‪( Maldi-Tof‬العدد‬
‫= ‪ .)3‬كما أظهر تحليل المكون الرئيسي‪ ACP‬أن حليب البقر و الصائم عند الدجاج يمثالن المساكن حيوية‪ .‬األكثر‬
‫ثراء ببكتيريا حمض اللبن المقاوم للمضادات الحيوية ‪ ،‬مع المكورات المعوية كأكثر األنواع المقاومة بين بكتيريا حمض‬
‫اللبن‪ .‬أظهرت نتائج تأثير إعطاء األمبيسلين عن طريق المسلك الفموي على الجراثيم المعوية للفئران أن الحيوانات‬
‫المعالجة تفرز نسبًا أعلى بكثير من المكورات المعوية المقاومة من المجموعة الضابطة (‪ )P ≤ 0.05‬أثناء وبعد العالج‪.‬‬
‫أكثر األنواع شيوعًا التي تم عزلها بعد بدء العالج هي ‪ .E. faecium‬الحد األدنى من تركيز المثبط ‪ MICs‬لألمبيسيلين‬
‫لجميع عزالت ‪ E. faecium‬ما بين ‪ 32-64‬ميكروغرام ‪ /‬مل ‪ ،‬باستثناء ساللتين ( ‪ ، )FA8 ،FA4‬وجد أنهما‬
‫عالتي المقاومة (‪ 128 ≥ MIC‬ميكروغرام ‪ /‬مل)‪ .‬أظهر القياس الكمي لألمبيسيلين في البراز بواسطة ‪RT-HPLC‬‬
‫أن الزيادة الكبيرة في عدد المكورات المعوية المقاومة لألمبيسيلين ارتبطت بالتراكم التدريجي لمستويات عالية من‬
‫األمبيسلين غير الممتص في البراز‪.‬‬

‫أظهر التحليل الجيني لساللة ‪ FA4‬أنه باإلضافة إلى الكروموسوم الخاص بها أنها تحتوي على ثالثة بالزميدات‪،‬‬
‫كما أظهر شرح الجينوم أنه يحمل ‪ 3244‬جينًا بما في ذلك ‪ 20‬جين لمقاومة المضادات الحيوية ‪،AAC (6')-Ii‬‬
‫‪،aph(3')-IIa ،SAT4 ،vanZ ،tetA ،dfrF ،fosX ،ponA ،efmA ،msrA ،msrC ،aph(3')-IIIa‬‬
‫‪ dfrG ، lnu(B) ، tetL ، tetM ، tetS، erm (B)، cat ،ant(6)-Ia‬و ‪ 3‬جينات ضراوة ‪ efaAfm‬و ‪acm‬‬
‫و ‪ hylEfm‬و ‪ 8‬ملتهمات البكتيريا و ‪ 2‬من العناصر الجينية المتحركة ‪ .MGEs‬باإلضافة إلى ذلك ‪ ،‬كشف اختبار‬
‫الطفرة الجينية عن مجموعة من ‪ 20‬طفرة كروموسومية تم تحديدها في الجين ‪ pbp 5‬الذي يمنح مقاومة لألمبيسيلين‪.‬‬

‫تشير نتائجنا إلى أن بكتيريا حمض اللبن من المحتمل أن تكتسب جينات مقاومة المضادات الحيوية ‪ ،‬ولكنها قد‬
‫تعمل أيضًا كمستودع كبير للجينات التي تنتقل إلى البكتيريا األخرى التي تشترك معها في نفس النظام البيئي‪.‬‬

‫الكلمات المفتاحية‪ :‬بكتيريا حمض اللبن ‪ ،‬مقاومة المضادات الحيوية ‪ ،‬ميكروبات معوية ‪، E. faecium ،‬‬
‫تسلسل الجينوم ‪ ،‬جينات المقاومة ‪ ،‬النقل األفقي‪.‬‬

‫‪xi‬‬
 Table des matières

Table des matières

Liste des abréviations .......................................................................................... i

Liste des tableaux .............................................................................................. iii

Liste des figures ..................................................................................................vi

Résumé ...............................................................................................................ix

Abstract ..............................................................................................................x

‫ ملخص‬...................................................................................................................xi

1. Introduction ........................................................................................................ 1

Résistance des microorganismes aux antimicrobiens ..................................... 4

Les bactéries lactiques .................................................................................. 7

Résistance des bactéries lactiques aux antibiotiques ................................... 12

Mécanismes de résistance dans les BL ........................................................ 14

Résistance intrinsèque .......................................................................... 17
Résistance extrinsèque et transfert horizontal de gènes ........................ 18

Résistance aux antibiotiques chez les bactéries lactiques ............................ 21

Résistance des entérocoques aux antibiotiques ..................................... 22
Résistance des lactobacilles aux antibiotiques ...................................... 24

Transfert horizontal de gènes de BL vers le microbiote intestinal .............. 25

Procédure d'évaluation des BL résistantes aux antibiotiques utilisés dans les

aliments .................................................................................................................. 27

2. Matériel et méthodes......................................................................................... 34

Techniques relatives aux prélèvements d’échantillons et isolement de

bactéries lactiques .................................................................................................. 35
Prélèvements d’échantillons et isolement de bactéries lactiques ........... 35
Purification des isolats bactériens......................................................... 37
Bactéries lactiques de référence (I) ....................................................... 37
Conservation des souches bactériennes ................................................. 38

xii
 Table des matières

Techniques relatives à l’identification des BL ............................................. 39

Caractérisation phénotypique des isolats .............................................. 39
Identification moléculaire des isolats par séquençage de l’ADNr 16S ... 40
Identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF ...................... 43
Techniques relatives à l’étude de la sensibilité aux antibiotiques ......... 44
Profils de sensibilité/résistance aux antibiotiques .......................... 44
Test de synergie ............................................................................. 44
Test Hodge..................................................................................... 44
Analyse statistique multivariée ............................................................ 45

Expérimentation animale (III) .................................................................... 46

Animaux et conditions d’élevage .......................................................... 46
Administration d’antibiotiques ............................................................. 46
Mesure du niveau de résistance de la flore intestinale .......................... 46
Niveau de résistance au sein de la flore intestinale ........................ 46
Mesure des résidus d'ampicilline dans des échantillons de fèces par
RP‑HPLC........................................................................................................ 48
Isolement et identification d’entérocoques des fèces de rats ................. 49

Séquençage haut-débit Illumina (IV) .......................................................... 49

Préparation de l’ADN pour le séquençage ............................................ 49
Analyses bioinformatiques des données de séquençage ......................... 52
Nettoyage des données brutes ........................................................ 52
Evaluation de la qualité des données bruites ................................. 53
Enlèvement de la dernière base ...................................................... 53
Elimination des séquences contaminantes ...................................... 53
Elimination des parties de reads de mauvaise qualité .................... 53
Assemblage .................................................................................... 54
Assembleurs utilisés ....................................................................... 54
Annotation du génome et génomique fonctionnelle ........................ 54
Annotation spécialisée .................................................................... 55

3. Résultats et discussion ...................................................................................... 57

xiii
 Table des matières

Isolement et purification des BL ................................................................. 58

Pré-identification des BL ............................................................................ 61

Caractéristiques des BL isolées à partir d'échantillons de laits (I) ....... 64
Isolats provenant du lait de vache ................................................. 64
Isolats provenant du lait de chamelles ........................................... 67
Isolats provenant des échantillons de fromages (I) ............................... 68
Isolats provenant du camembert .................................................... 68
Isolats provenant du Jben .............................................................. 69
Isolats du jéjunum de poules (II) .......................................................... 69
Isolats de fèces de rat (III) ................................................................... 70
Identification phénotypique des bactéries ............................................. 71
Identification à l’aide de galeries API 20STREP ........................... 71
Identification à l’aide de galeries API 50CH .................................. 73
Identification moléculaire des bactéries ................................................ 74
Identification par séquençage de l’ADNr 16S ................................. 74
Identification par Maldi-TOF ........................................................ 75

Profils de sensibilité de BL aux antibiotiques (I-II) .................................... 77

Antibiogramme..................................................................................... 77
Analyse statistique multivariée : Analyse en composantes principales et
regroupement hiérarchique des résistances aux antibiotiques ............................. 80
Identification des genres de BL les plus résistants aux antibiotiques
........................................................................................................................ 80
Identification des sources d'isolement présentant les BL les plus
résistantes aux antibiotiques ........................................................................... 84
Mesures de la concentration minimale inhibitrice (CMI)...................... 87
Détection phénotypique des mécanismes de résistance aux β-lactamines
........................................................................................................................... 91

Effet de l'ampicilline sur l'équilibre écologique du microbiote intestinal du

rat (III) .................................................................................................................. 91
Evaluation de la résistance des entérocoques à l’ampicilline................. 92

xiv
 Table des matières

Distribution des espèces d'entérocoques ......................................... 93

Détermination de la concentration minimale inhibitrice
d’ampicilline .................................................................................................... 94
Mesure des résidus d'ampicilline dans les échantillons fécaux par
analyse RP-HPLC ........................................................................................... 96

Séquençage haut débit illumina (IV) .......................................................... 99

Contrôle de qualité de l’ADN génomique ............................................. 99
Analyses des données de séquençage .................................................. 101
Evaluation de la qualité des données brutes ................................ 101
Nettoyage des données bruites ..................................................... 102
Résultats de l’assemblage de novo du génome.............................. 104
Assemblage des reads utilisant un génome de référence ............... 105
Gènes et mécanismes de résistance aux antibiotiques ......................... 111
Résistance aux β-lactamines ......................................................... 112
Résistance aux macrolides, lincosamide, streptogramine (MLS) et
quinolone ....................................................................................................... 116
Résistance aux aminoglycosides ................................................... 117
Résistance aux tétracyclines......................................................... 118
Résistance aux glycopeptides ....................................................... 119
Résistance aux phénicolés ............................................................ 119
Résistance aux diaminopyrimidines.............................................. 119
Résistance aux fosfomycines......................................................... 120
Mécanisme de résistance par système d’efflux actif bactérien MFS
...................................................................................................................... 120
Annotation des facteurs de virulences ................................................ 121
Annotation des prophages d’E. faecium FA4 ..................................... 122
Annotation des éléments génétiques mobiles d’E. faecium FA4 ......... 127

4. Conclusion et perspectives .............................................................................. 131

5. Références bibliographiques ............................................................................ 134

6. Annexes........................................................................................................... 168

xv
 Table des matières

Annexe 1 : Méthodes de caractérisation phénotypique des isolats. .................. 169

Annexe 2 : Procédures de détermination des profils de sensibilité/résistance aux

antibiotiques. ........................................................................................................ 173

Annexe 3 : Critères morphologiques et biochimiques de BL. ........................... 179

Annexes 4 : Caractéristiques des isolats de différents biotopes (I-II). .............. 180

Annexe 5 : Valeurs de CMI de BL fixées par CLSI et FEEDAP. .................... 187

Annexe 6 : Définitions importantes dans l’analyse bioinformatique des génomes.

............................................................................................................................. 189

xvi
 Introduction

1. Introduction

1 | Page
 Introduction

Les bactéries lactiques (BL) sont un groupe hétérogène de bactéries,

dont beaucoup ont reçu un statut de sécurité généralement reconnu
(GRAS) ou de présomption d’innocuité reconnue (QPS). Ces bactéries
sont largement présentes dans la nature, y compris dans les voies gastro-
intestinales et urogénitales des humains et des animaux, et sont présentes
dans de nombreux aliments fermentés comme les cornichons salés, les
olives et différents produits à base de lait comme les fromages et les
yaourts. Les BL sont traditionnellement associées à ces produits laitiers et
aux aliments fermentés à base de céréales, de légumes et de viande, soit en
tant qu'intrants intentionnellement ajoutés, soit en raison de leur présence
naturelle entraînant une fermentation spontanée. Certaines BL sont
également utilisées comme probiotiques ajoutés pour conférer des
avantages sanitaires aux consommateurs ou pour améliorer la production
animale. À cet égard, les espèces de BL sont économiquement très
importantes pour l'industrie de l'alimentation humaine et animale
(Mendes et al., 2013; de Lacerda et al., 2016; Chiocchetti et al., 2019; da
Costa et al., 2019).

Au cours des dernières décennies, on s'est inquiété de la possibilité

d'une propagation de la résistance aux antibiotiques dans l'environnement.
Selon l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (EFSA) (2005), on
estime qu'entre un et dix millions de tonnes d'antibiotiques ont été
libérées dans la biosphère au cours des 60 dernières années. Cela a conduit
à une très forte pression sélective pour l'apparition de souches bactériennes
résistantes. Les bactéries pathogènes et leur résistance aux antibiotiques
ont été au centre des préoccupations, car les infections causées par ces
micro-organismes résistants sont non seulement plus compliquées à traiter,
mais le traitement est beaucoup plus coûteux en raison des soins plus
intensifs et plus longs nécessaires dans ces cas. Comme les BL sont
présentes dans le tractus gastro-intestinal en grandes quantités et sont
également ajoutées intentionnellement à notre alimentation, la résistance
aux antibiotiques de ces espèces bactériennes bénéfiques a suscité des

2 | Page
 Introduction

inquiétudes. Par exemple, les BL résistantes à certains antibiotiques

pourraient être bénéfiques pour l'hôte (humain ou animal) en contribuant
à maintenir l'équilibre du tube digestif en cas de diarrhée causée par un
traitement antibiotique (Vieco-Saiz et al., 2019). Cependant, il existe un
risque associé à la capacité de ces souches résistantes à transmettre leur
facteur de résistance (gène) à d'autres bactéries, éventuellement
pathogènes. Cela pourrait compliquer le traitement d'un patient atteint
d'une infection ou d'une maladie bactérienne résistante aux antibiotiques
(Semedo-Lemsaddek et al., 2018).

L'objectif principal de cette thèse est d'examiner les profils de

résistance aux antibiotiques de BL. Le travail a commencé par l’isolement
et la caractérisation de BL de différentes origines, et s'est poursuivi par la
détermination des profils de résistance aux antibiotiques appartenant à
différentes classes, puis de l’identification précise des espèces résistantes de
BL. L’étude de l’effet de l’administration orale d’antibiotique sur
l’écosystème intestinal des rats et la détermination des mécanismes de
résistance aux antibiotiques chez Enterococcus faecium sont les parties
principales de notre travail.

Les objectifs de chaque partie de l’étude étaient les suivants :

• Isoler, identifier et déterminer le profil de sensibilité aux

antibiotiques chez les espèces de BL isolées de différents biotopes (I) ;
• Déterminer le phénotype de sensibilité/résistance aux antibiotiques
chez les espèces de BL isolées à partir du jéjunum des poules (II) ;
• Etudier l'impact de l'administration orale d'ampicilline sur la flore
des entérocoques du microbiote intestinal des rats pendant et après le
traitement en explorant les relations entre le niveau de résistance des
entérocoques, la distribution des espèces, la détermination des CMI
d'ampicilline des isolats et la mesure par RP-HPLC de l’ampicilline non-
absorbé dans les selles des rats traités (III).

3 | Page
 Introduction

• Séquençage, assemblage et annotation d’un génome entier

d’Enterococcus faecium multirésistant, identification des gènes
responsables de la résistance aux antibiotiques, des gènes de virulences,
ainsi que les éléments génétiques mobiles comme plasmides conjugatifs,
transposons et prophages (IV).

Résistance des microorganismes aux antimicrobiens

La résistance aux antimicrobiens est devenue l'un des principaux

problèmes de sécurité pour l'humanité, et plusieurs organisations, telles
que l'Organisation mondiale de la santé (OMS), l'Organisation des Nations
unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO), l’Agence américaine des
produits alimentaires et médicamenteux (FDA) et l'Autorité européenne
de sécurité des aliments (EFSA), entre autres, ont sensibilisé l'opinion à
cette question.

La résistance aux antimicrobiens peut survenir lorsque des micro-

organismes (bactéries, champignons, virus et parasites) sont
continuellement exposés à des antimicrobiens (antibiotiques, antiviraux,
antifongiques, etc.) et qu'à la suite d'un processus d'adaptation, certains
micro-organismes peuvent survivre et se développer en présence de
l'antimicrobien, qui, dans des conditions normales, les désactiverait
(Mendelson & Matsoso, 2015). En particulier, les antibiotiques sont des
médicaments utilisés pour traiter les infections bactériennes chez les
humains et les animaux, en empêchant la croissance de bactéries ou les
inactivant par plusieurs mécanismes (figure 1), soit en inhibant la synthèse
de la paroi cellulaire ou de la membrane cytoplasmique, soit en bloquant
la protéosynthèse ou les processus de réplication de l'ADN, soit en altérant
le métabolisme, soit en agissant directement contre la voie de résistance
bactérienne (Kapoor et al., 2017; Sanseverino et al., 2018).

L'utilisation d'antibiotiques chez l'homme (céphalosporines,

pénicillines à large spectre et fluoroquinolones) a augmenté de 36 % entre
2000 et 2010, principalement en raison de leur prescription et de leurs

4 | Page
 Introduction

consommations inappropriées pour le traitement d'infections virales plutôt

que bactériennes (Fraqueza, 2015; Mermelstein, 2018). Ce fait peut être
mis en corrélation avec le rapport mondial sur la résistance aux
antimicrobiens qui indique que plus de 700 000 décès humains sont
associés chaque année à la résistance aux antimicrobiens, ce qui porte le
nombre de décès à 10 millions d'ici 2050 (WHO, 2015; O’Neill, 2018).

Figure 1: Mode et site d’action des antibiotiques (Sanseverino et al., 2018)

La résistance aux antimicrobiens implique plusieurs mécanismes

associés à la présence de gènes résistants qui permettent l'inactivation
directe de la molécule antimicrobienne active ainsi que la perte de
sensibilité à l'antimicrobien par la modification du site cible ou la
réduction de l'absorption de l'antimicrobien (Fraqueza, 2015). Par
conséquent, les antimicrobiens deviennent inefficaces, et les micro-
organismes résistants peuvent survivre et transférer leur machinerie
résistante à d'autres micro-organismes et devenir une menace pour la santé
publique (WHO, 2015). La présence de micro-organismes résistants aux
antimicrobiens n'affecte pas seulement la santé humaine et animale, mais
augmente également le risque de propagation et de contamination des
aliments, des cultures, du bétail et de l'aquaculture (Mermelstein, 2018).

5 | Page
 Introduction

En particulier, la FAO affirme que 27 classes d'antimicrobiens

différentes sont fréquemment utilisées chez les animaux sans qu'un
système de notification précis ne soit mis en place pour recueillir les
données relatives à leur utilisation et à leur contrôle (O’Neill, 2018). C'est
pourquoi les partenaires de l'OMS ont lancé une campagne mondiale en
2017 pour sensibiliser le public à la résistance aux antimicrobiens dans le
cadre d'un programme mondial (WHO, 2015; O’Neill, 2018). La campagne
constitue une action mondiale qui implique les gouvernements, les
professionnels de la santé, les industriels de l'alimentation humaine et
animale et la société pour s'informer sur la résistance aux antibiotiques et
aux antimicrobiens. Elle comprend également des lignes directrices pour la
prévention et le contrôle des Enterobacteriaceae, Acinetobacter et
Pseudomonads résistantes dans les établissements de santé. En outre,
l'OMS recommande aux agriculteurs et au secteur de l'industrie
alimentaire de cesser d'utiliser des antibiotiques chez les animaux en bonne
santé, afin de préserver l'efficacité des antibiotiques actuellement utilisés
en médecine humaine (WHO, 2015; FAO, 2016; Mermelstein, 2018). Le
plan d'action mondial sur la résistance aux antimicrobiens souligne que ce
problème est devenu une menace de plus en plus sérieuse pour la santé
publique et la production alimentaire durable. Une réponse rapide et
efficace devrait impliquer la société et les gouvernements, ainsi que les
secteurs de la santé, de l'alimentation et de l'agriculture et les spécialistes
de l'environnement pour promouvoir des pratiques qui évitent la
propagation de la résistance aux antimicrobiens parmi les agents
pathogènes courants, en particulier ceux responsables des infections
nosocomiales et courantes (WHO, 2015; FAO, 2016; O’Neill, 2018).

La croissance de la population mondiale entraîne une augmentation

de la demande d'aliments, où les antimicrobiens, tels que les antibiotiques
et les fongicides, sont fréquemment utilisés pour traiter les infections chez
les animaux producteurs d'aliments (bovins, porcs, volailles et poissons),
ainsi que dans les cultures, pour prévenir les maladies et comme

6 | Page
 Introduction

stimulateurs de croissance (D’Costa et al., 2011; Mermelstein, 2018). Cette

pratique est fréquemment observée dans les pays en développement où l'on
utilise des quantités élevées d'antibiotiques non autorisés qui ont été
associés à l'apparition de souches d'Enterococcus et de Lactobacillus
multirésistants aux antibiotiques chez les volailles indiennes (Preethi et al.,
2017; Mermelstein, 2018; O’Neill, 2018). La FAO signale également que 90
% des antibiotiques peuvent être excrétés dans l'eau et le sol, contaminant
ainsi l'environnement, avec pour conséquence une augmentation de
l'exposition et le développement de micro-organismes RA qui peuvent
transférer leurs gènes de résistance à d'autres micro-organismes (Cerniglia
& Kostarski, 2005; Holmes et al., 2016; O’Neill, 2018). Par exemple, les
populations bactériennes provenant de l'intestin d'animaux exposés aux
antibiotiques (tétracycline, pénicilline, sulfonamide et polymyxines)
avaient cinq fois plus de chances d'être résistantes (Fraqueza, 2015). Les
micro-organismes résistants peuvent être transmis à l'homme par des
aliments et de l'eau contaminés ou par l'environnement (Mermelstein,
2018; O’Neill, 2018). Diverses pratiques telles que la vaccination adéquate
des animaux et l'utilisation d'additifs qui favorisent la santé et l'efficacité
de la conversion alimentaire, en combinaison avec de bonnes pratiques
d'hygiène et d'élevage, permettraient de réduire le besoin d'antimicrobiens
et d'antibiotiques pour la production alimentaire (FAO, 2016).

Les bactéries lactiques

Le terme de bactéries lactiques désigne un groupe taxonomiquement

diversifié de bactéries Gram positif, des cocci, coccobacilles ou bâtonnets
anaérobies facultatifs, non sporulés, non mobiles et tolérants aux acides,
qui apparaissent comme des cellules individuelles ou formant des couples,
des tétrades ou de longues chaînes, avec un métabolisme et une physiologie
communs capables de fermenter les sucres principalement en acide
lactique.

7 | Page
 Introduction

Les espèces BL se retrouvent dans deux phyla, les Firmicutes et les

Actinobactéries ; pour le premier, les genres Aerococcus, Alloiococcus,
Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella qui
ont un faible G+C (31-49%) appartiennent à la classe des Bacilli et à
l'ordre des Lactobacillales. Le genre Bifidobacterium, avec une teneur
élevée en G+C (58-61%), appartient au phylum Actinobacteria
(Kleerebezem & Hugenholtz, 2003; Giraffa, 2014; Fraqueza, 2015), qui est
classé en homofermentaires et hétérofermentaires selon les produits finaux
dérivés du métabolisme du glucose. La bactérie homofermentaire convertit
le glucose principalement en acide lactique par la voie d'Embden-
Meyerhof, tandis que la bactérie hétérofermentaire BL transforme le
glucose en acide lactique, en dioxyde de carbone et en éthanol ou en acide
acétique par la voie du 6-phosphogluconate.

Les BL constituent l'un des plus importants groupes de micro-

organismes présents dans plusieurs habitats ; elles sont présentes en grand
nombre dans le tractus gastro-intestinal des animaux et des humains et
font partie du microbiote de plusieurs aliments. Historiquement, les BL
ont été reconnues comme sûres avec un statut GRAS (généralement
reconnu comme sûr) et QPS (présomption qualifiée de sécurité) donné par
les autorités de la FDA et de l'EFSA (Dilna et al., 2015). Cependant, la
détection récente de BL résistantes aux antibiotiques et l'exposition
continue aux conditions environnementales peuvent favoriser le fait que les
BL sont devenues des réservoirs intrinsèques ou extrinsèques de gènes RA,
qui peuvent être transmis horizontalement aux agents pathogènes par la
chaîne alimentaire (Ammor et al., 2007; Coetzee et al., 2016; Liu et al.,
2016). La résistance à un antimicrobien spécifique peut être intrinsèque
(lorsqu'un micro-organisme ne possède pas de sites cibles pour
l'antimicrobien) ou acquise. La résistance acquise est plus complexe et
implique la présence d'enzymes qui inactivent l'antimicrobien, des
modifications post-transcriptionnelles ou post-traductionnelles du site cible

8 | Page
 Introduction

ou une réduction de l'absorption et de l'effusion active de l'antimicrobien ;

ces mécanismes découlent du gain d'ADN exogène ou de la mutation de
l'ADN indigène (Martínez-Martínez & Calvo, 2010; Kapoor et al., 2017;
Preethi et al., 2017). En général, les gènes RA peuvent être transférés
horizontalement d'un micro-organisme à un autre par transduction (via les
bactériophages) ou par transformation entre les micro-organismes (lorsque
l'ADN libéré est absorbé par un autre micro-organisme). Cependant, on
prétend que le principal mécanisme d'acquisition de la résistance est le
contact direct de cellule à cellule ou la conjugaison entre différents genres
de bactéries, en particulier lorsque les gènes résistants sont présents sur
des éléments génétiques mobiles tels que les plasmides et les transposons
(Shao et al., 2015; Dowling et al., 2017; Kapoor et al., 2017). Les BL sont
très adaptables et capables de développer une résistance aux antibiotiques
; la plupart des études sur les RA ont porté sur des micro-organismes
pathogènes, mais récemment, certains chercheurs ont remis en question la
sécurité des BL commensales, car certaines souches de Lactococcus lactis,
Enterococci et Lactobacillus isolées d'aliments fermentés ont montré des
gènes de résistance à la tétracycline, à l'érythromycine et à la vancomycine
(Mathur & Singh, 2005). La résistance bactérienne aux antibiotiques est
une préoccupation publique émergente qui peut compromettre l'efficacité
des agents utilisés pour le traitement des maladies infectieuses (Erginkaya
et al., 2018).

Les BL sont capables d'inhiber la croissance des bactéries pathogènes

et de détérioration en raison de la compétition pour les nutriments et les
niches d'adhérence, grâce à leur tolérance aux grands acides et à leur
capacité d'adaptation aux changements d'oxydoréduction (Liu et al., 2009;
Giraffa, 2014). En outre, les BL sont capables de produire des métabolites
antimicrobiens tels que les acides lactique et acétique, l'éthanol, le
peroxyde d'hydrogène, le diacétyle, les antifongiques (acides gras à chaîne
courte dérivés des réactions de lipolyse), les peptides antimicrobiens
connus sous le nom de bactériocines, et d'autres protéines antibactériennes

9 | Page
 Introduction

comme les peptidoglycanes hydrolases (PGH) capables de cliver la paroi

cellulaire des peptidoglycanes des bactéries à Gram-positif et à Gram-
négatif (Giraffa, 2014; Gontijo et al., 2020).

Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens ribosomaux actifs

contre des souches bactériennes sensibles étroitement liées et non liées en
formant des pores dans la membrane cytoplasmique et responsables de la
réduction des concurrents microbiens des BL dans des conditions de stress.
Plusieurs études ont démontré le potentiel des bactériocines pour la
conservation des aliments et dans l'industrie pharmaceutique pour leur
action contre les micro-organismes d'altération et les pathogènes tels que
Listeria monocytogenes et Staphylococcus aureus (Schneider et al., 2006;
Yang et al., 2014; Woraprayote et al., 2016).

Les BL ont été utilisées sans danger pendant des siècles dans de
nombreuses fermentations alimentaires indigènes jusqu'à l'industrie
moderne actuelle dans les processus d'élaboration de produits laitiers, de
légumes, de viandes, de café, de cacao, d'ensilages, de pain au levain et de
vin. Les BL contribuent au goût, à la saveur et à la texture de ces
produits fermentés, mais inhibent également le développement de la
détérioration et des micro-organismes pathogènes par acidification et
production d'antimicrobiens (Giraffa, 2014; Sharma et al., 2014). Par
conséquent, les BL sont largement utilisés comme cultures de démarrage
dans l'industrie alimentaire pour accélérer la maturation ou pour contrôler
le microbiote adventice pour l'élaboration et la conservation de plusieurs
aliments fermentés, y compris les produits laitiers (fromages, yaourts,
beurre et crème), les viandes, le pain au levain et les légumes. Les BL
contribuent au goût, à la saveur et à la texture de ces produits fermentés
grâce à plusieurs réactions, notamment la lipolyse, la protéolyse et la
conversion du lactose en citrates et pyruvates intermédiaires qui peuvent
être convertis en divers composés aromatiques, tels que le diacétyle,
l'acétoïne, l'acétaldéhyde et l'acide acétique. Les processus protéolytiques
induisent l'accumulation de petits peptides et d'acides aminés libres qui

10 | P a g e
 Introduction

sont ensuite transformés en alcools, aldéhydes, acides et esters

responsables du profil de saveur et des caractéristiques organoleptiques des
aliments fermentés (Giraffa, 2014). En outre, certaines souches de BL
telles que Lactococcus lactis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus rhamnosus,
Lactobacillus helveticus et Streptococcus thermophilus peuvent produire
des exopolysaccharides (EPS) qui non seulement confèrent une protection
au producteur de cellules, mais peuvent également être utilisés dans
l'industrie alimentaire comme épaississants pour augmenter la viscosité et
la fermeté, améliorant ainsi la texture et la sensation en bouche du yaourt
et d'autres produits laitiers à faible teneur en matières grasses. Les EPS
produits par BL varient de 10 à plus de 2000 kDa et peuvent être classés
comme homopolysaccharides ou hétéropolysaccharides selon leur
composition en monomères, le galactose, le glucose et le rhamnose étant les
monomères les plus courants (Dertli et al., 2016; Zannini et al., 2016).

Certaines BL sont présentes dans les voies respiratoires, gastro-

intestinales et génitales des humains et des animaux. Elles sont utilisés
comme probiotiques pour améliorer la santé en raison de leur influence sur
le système immunitaire pour la prévention et le contrôle de certaines
infections pendant la grossesse ou dans le cadre du traitement de la
diarrhée, de la constipation et des inflammations intestinales dues aux
antibiotiques, ainsi que pour gérer les allergies et l'intolérance au lactose et
prévenir les infections urinaires (Lim et al., 2009; Gad et al., 2014).
L'OMS et la FAO décrivent les probiotiques comme des micro-organismes
vivants qui, en quantité suffisante, présentent des avantages pour la santé
de l'hôte (Ángel & Flórez, 2017; Castañeda Guillot, 2018).

Plusieurs souches de Lactoccocus, Lactobacillus, Streptococcus,

Enterococcus, Bifidobacterium, Pediococcus et Propionibacteria présentes
dans les aliments et dans les compléments alimentaires sont couramment
utilisées comme probiotiques et considérées comme des membres
souhaitables du microbiote intestinal pouvant être utilisés pour
administrer des vaccins et d'autres métabolites directement dans le tractus

11 | P a g e
 Introduction

gastro-intestinal (Gad et al., 2014). La consommation de probiotiques BL

peut contribuer à la modulation du système immunitaire et à la réduction
des agents pathogènes, améliorant ainsi la fonctionnalité intestinale. Les
autres avantages pour la santé associés à la consommation de probiotiques
BL comprennent un effet antihypertenseur, une réduction du taux de
cholestérol sérique, un effet antioxydant, une protection contre le cancer
du côlon, une réduction des symptômes d'allergie, une réduction des caries
dentaires et une réduction de l'indice d'obésité (Dicks & Botes, 2010; Gad
et al., 2014). De plus, les métabolites secondaires ayant des propriétés
bénéfiques pour la santé comprennent l'enzyme de conversion de
l'angiotensine antihypertensive produite par le système protéolytique de
Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus et Lactobacillus
delbrueckii (Dicks & Botes, 2010; Giraffa, 2014).

Résistance des bactéries lactiques aux antibiotiques

Les BL sont considérées comme naturellement résistantes à plusieurs

antibiotiques et peuvent potentiellement acquérir une résistance à d'autres
antimicrobiens ou disséminer la résistance aux pathogènes présents dans le
tractus gastro-intestinal des animaux et des humains (Preethi et al., 2017).
Par exemple, Shao et al., (2015) ont démontré que deux isolats de L.
plantarum possédaient les gènes aad(A) et ant(6)-I associés à la résistance
à la streptomycine, et la surexposition à cet antibiotique a augmenté de
façon spectaculaire la concentration minimale inhibitrice (CMI) et a accru
une résistance croisée à d'autres antibiotiques de la même classe. D'autre
part, la présence de 6% de souches isolées de certains produits
pharmaceutiques et laitiers d'Egypte avec des gènes résistants à la
tétracycline tet(M) et/ou à l'érythromycine erm(B) a été signalée (Gad et
al., 2014). Dans une étude similaire, une forte incidence de Lactobacillus
résistants à la vancomycine (58%), à l'érythromycine (10,8%), à la
tétracycline (4,3%), à la gentamicine (48%) et à la ciprofloxacine (26%) a
été signalée dans des produits laitiers fermentés turcs (Erginkaya et al.,
2018). Cependant, des études réalisées par Flórez et Mayo., (2017)

12 | P a g e
 Introduction

indiquent qu'aucun transfert des gènes de résistance à la tétracycline

tet(M) et à l'érythromycine erm(B) de S. thermophilus à L. delbrueckii n'a
été détecté pendant la production et le stockage du yaourt. En outre, la
chaîne alimentaire peut faciliter la transmission de bactéries résistantes
aux antibiotiques entre les animaux, les aliments et les humains, le lait
fermenté et les produits carnés étant le véhicule le plus courant des
bactéries résistantes aux antibiotiques pour la flore indigène du tractus
gastro-intestinal, car ces produits sont consommés sans traitement
thermique (Mathur & Singh, 2005). Même si certains rapports confirment
la transmission de déterminants de la résistance, les deux gènes de
résistance les plus courants dans les BL sont les gènes de résistance à la
tétracycline tet(M) et à l'érythromycine erm(B), suivis par les gènes cat
codant pour la résistance au chloramphénicol (Moračanin et al., 2017).
Compte tenu du large éventail d'applications potentielles des BL dans
l'industrie et dans la santé humaine et animale, il est nécessaire de
procéder à un examen détaillé de ces produits, qui implique la détection
des gènes résistance aux antibiotiques (RA).

Pour que les antibiotiques fonctionnent et inhibent la croissance

microbienne, ils doivent être à la concentration appropriée afin qu'ils
puissent traverser la paroi cellulaire et interagir avec leur cible. Comme
mentionné précédemment, la RA est la capacité d'un micro-organisme à
résister à l'activité inhibitrice d'un antibiotique au-delà de la sensibilité
normale d'espèces bactériennes similaires (Verraes et al., 2013). D'autre
part, les différents mécanismes de la RA sont basés sur la modification du
site cible de l'antibiotique ainsi que sur la réduction de la concentration
d'antibiotique qui parvient à atteindre la cible cellulaire.

Les BL sont considérées comme des porteurs de gènes de résistance

qui pourraient propager leurs gènes dans la chaîne alimentaire entre les
aliments et les humains, ainsi que dans l'environnement par différents
mécanismes (Verraes et al., 2013; Bonham et al., 2017). Selon la FAO et
l'OMS (FAO/WHO, 2002), il est important de déterminer si les cultures

13 | P a g e
 Introduction

de starters ou de probiotiques destinées à la consommation humaine ou

animale possèdent des gènes de résistance mobiles qui pourraient être
transférés à d'autres micro-organismes (Gueimonde et al., 2013; Fraqueza,
2015). En outre, certains auteurs ont démontré que l'utilisation
d'antibiotiques chez les animaux destinés à la consommation, soit comme
stimulateurs de croissance, soit comme inhibiteurs de pathogènes, est
directement liée à la présence de microbiote RA dans le tractus gastro-
intestinal humain (Forslund et al., 2013; Verraes et al., 2013). D'autre
part, Gad et al., (2014) ont isolé certaines souches de Lactobacillus, de
Streptococcus et de Lactococcus dans des produits laitiers
pharmaceutiques et probiotiques, mais les tests de la RA des isolats
probiotiques pharmaceutiques étaient exempts de gènes de résistance,
contrairement aux BL isolés dans des produits laitiers qui présentaient des
profils de résistance comparables à ceux des agents pathogènes tels que les
Staphylococcus spp, En outre, certaines souches d'Enterococcus faecium
ont démontré le transfert de gènes de résistance à la vancomycine de
Lactobacillus acidophilus La5 "in vitro" et "in vivo" le tractus
gastrointestinal des souris (Mater et al., 2007).

Mécanismes de résistance dans les BL

L'exposition aux antibiotiques peut permettre aux bactéries de

développer différents mécanismes pour contrer l'effet bactéricide ; une
seule bactérie peut développer différents types de résistance ; ces systèmes
comprennent un mode de résistance intrinsèque ou inné et le mode de
résistance acquis. Parmi ceux-ci, le mécanisme qui prévaut au sein des
bactéries varie selon la nature de l'antibiotique, le site cible, l'espèce
bactérienne, et/ou selon que le gène de résistance fait partie du
chromosome ou d'éléments mobiles tels que les plasmides ou les
transposons (Imperial & Ibana, 2016; Sharma et al., 2014).

Deux éléments pertinents doivent être présents pour l'interaction

antibiotique-cible, tout d'abord l'antibiotique doit reconnaître la cible, et

14 | P a g e
 Introduction

la concentration de l'antibiotique dans la cible doit être suffisante pour

inhiber la croissance bactérienne. Un mécanisme de résistance conduit à
l'incapacité de l'antibiotique à inhiber la croissance bactérienne en raison
d'une interaction antibiotique-cible inefficace, qui peut être classée comme
passive et active. Le mécanisme passif ne peut être transféré à d'autres
cellules que par un transfert clonal qui implique des modifications du site
cible ou une diminution de l'absorption antimicrobienne, sans affecter la
structure de l'antibiotique ; cette résistance est également connue sous le
nom de résistance intrinsèque. En revanche, le mécanisme actif implique la
réduction de la concentration de l'antibiotique intracellulaire par
modification ou dégradation de sa structure avec des enzymes par l'action
de pompes d'efflux (Martínez & Baquero, 2014; Munita & Arias, 2016).

La figure 2 montre les mécanismes par lesquels certaines bactéries

peuvent présenter une résistance aux antibiotiques, ce qui implique (1) la
réduction de la concentration intracellulaire d'antibiotiques par
l'activation de pompes d'efflux ou par la modification de la perméabilité de
la paroi cellulaire (2) la modification de l'antibiotique par des complexes
enzymatiques qui empêchent l'interaction entre l'antibiotique et la cible,
(3) la dégradation enzymatique des antibiotiques et (4) l'altération des
sites de fixation de l’antibiotique (Sharma et al., 2014).

Le principal mécanisme de résistance aux antibiotiques des BL a été

lié aux pompes d'efflux de multirésistances (MDR) impliquées dans
l'expulsion de composés structurellement non apparentés (Mazurkiewicz et
al., 2005; Gueimonde et al., 2013). Wacher-Rodarte et al., (2015) ont
analysé des BL isolées du pozol (une boisson à base de maïs fermenté
traditionnelle), en identifiant que les souches multirésistantes telles que
Lactococcus lactis et Lactobacillus plantarum présentent des pompes
d'efflux actives, y compris le type ABC codé par chromosome avec le
transporteur LmrA (gène lmrA). D'autre part, Poelarends et al., (2002)
ont démontré que la présence du transporteur LmrA dans Lactococcus
lactis est associée à la résistance intrinsèque de 17 à 21 antibiotiques

15 | P a g e
 Introduction

cliniquement pertinents, y compris des aminoglycosides (kanamycine et

gentamicine), des lincosamides (clindamycine), des macrolides
(érythromycine), des quinolones (ciprofloxacine) et des tétracyclines.
D'autres auteurs tels que Casado Muñoz et al., (2014) ont signalé que
Lactobacillus pentosus et Leuconostoc pseudomesenteroides isolés d'olives
fermentées sont résistants aux céphalosporines, à la streptomycine et à la
kanamycine en raison de la variation de la perméabilité de la paroi
cellulaire comme principal mécanisme de résistance ; ils ont également
souligné que les deux souches présentaient un système complexe AcrAB-
TolC impliqué dans les pompes d'efflux MDR pour les β-lactamines, les
fluoroquinolones, le chloramphénicol, la tétracycline, et d'autres gènes liés
aux pompes de la superfamille portés par le chromosome comme norA et
MDE (multi-drug efflux) qui confèrent une résistance au chloramphénicol
et aux fluoroquinolones.

Figure 2: Mécanismes de la résistance aux antibiotiques de BL : (1)

pompes d'efflux enzymatique (2) modification enzymatique, (3)
dégradation enzymatique, et (4) modification de la cible. Adapté de
Sharma et al., (2017).

16 | P a g e
 Introduction

La résistance aux aminoglycosides dans les BL n'a pas été signalée,

bien que ces dernières années, les BL isolés d'origine agricole se soient
révélés résistants à la gentamicine, à la kanamycine et à la streptomycine,
dont le mécanisme de résistance est associé à une altération du transport
ou à une inactivation enzymatique par trois principales enzymes modifiant
les aminoglycosides (AME), à savoir les N-acétyltransférases (AAC), les
O-phosphotransférases (APH) et les O-nucléotidyltransférases (ANT)
codées par des EGM (éléments génétiques mobiles) tels que les
transposons et la séquence d'insertions (Jaimee & Halami, 2015).

Certaines bactéries appartenant aux genres Enterococcus,

Lactobacillus, Pediococcus et Bifidobacterium présentent des AR
intrinsèques ou innées et extrinsèques ou acquises, qui peuvent être un
facteur de sécurité alimentaire car elles peuvent transmettre la résistance à
d'autres bactéries par transfert vertical (entre espèces) ou horizontal
(entre genres bactériens) (Clementi & Aquilanti, 2011; Gueimonde et al.,
2013; Flórez & Mayo, 2017).

Résistance intrinsèque

La résistance intrinsèque est la capacité naturelle ou innée d'une

bactérie à survivre à l'effet des antibiotiques, à la suite de mutations
dérivées de changements dans l'état physiologique de la bactérie ou d'une
exposition incontrôlée aux antibiotiques (Zhang et al., 2018). La résistance
intrinsèque a un potentiel de propagation minimal entre les genres
bactériens, car les gènes de résistance sont situés dans le chromosome avec
un transfert limité vers d'autres genres, ce qui représente un faible risque
au sein des bactéries non pathogènes. Tout gène responsable de la
résistance intrinsèque pourrait être disséminé et transféré à d'autres
bactéries s'il est flanqué de séquences d'insertion susceptibles de favoriser
sa mobilisation (Mathur & Singh, 2005). Par exemple, les souches de
Bifidobacterium sont couramment utilisées comme cultures starter et/ou
prébiotiques dans les aliments fermentés traditionnels et industrialisés,

17 | P a g e
 Introduction

bien qu'elles présentent une résistance intrinsèque aux quinolones

(ciprofloxacine et acide nalidixique), à la mupirocine, aux tétracyclines et
aux aminoglycosides tels que la streptomycine ; cependant, tous les gènes
sont situés dans le chromosome avec un transfert limité à d'autres genres
(Kushiro et al., 2009; Imperial & Ibana, 2016). Il a été rapporté que
certains genres de BL ont une résistance intrinsèque à la bacitracine, la
vancomycine, la kanamycine, la téicoplanine et les quinolones (Imperial &
Ibana, 2016). Les mécanismes de résistance intrinsèque présentés par BL
comprennent :

• Modification de la paroi cellulaire, couramment observée dans la

résistance aux glycopeptides (vancomycine et téicoplanine) et aux
antibiotiques non ribosomiques (bacitracine). En particulier,
Lactobacillus plantarum et Enterococcus faecium présentent une
résistance innée à la vancomycine, due à la substitution des résidus de
D-alanine de la paroi cellulaire du muramyl pentapeptide par du D-
lactate (résistance de haut niveau) ou de la D-sérine (résistance de bas
niveau) dans la structure chimique du peptidoglycane, évitant ainsi
l'interaction avec les antibiotiques (Miller et al., 2014; Munita & Arias,
2016; Zhang et al., 2018).
• L'inactivation enzymatique, comme pour les aminoglycosides
(néomycine, kanamycine, streptomycine) ou les quinolones
(ciprofloxacine, norfloxacine, acide nalidixique), empêche la liaison de
ces antibiotiques avec leurs cibles spécifiques, comme observé pour
Lactobacillus et Enterococcus pour l'ARNr 16S, 30S et l'ADN gyrase,
respectivement, qui expliquent la résistance intrinsèque aux deux
groupes d'antibiotiques (Clementi & Aquilanti, 2011; Jaimee & Halami,
2015).

Résistance extrinsèque et transfert horizontal de gènes

La résistance extrinsèque ou acquise est celle où les bactéries peuvent

incorporer dans leur structure cellulaire un matériel génétique mobile

18 | P a g e
 Introduction

capable de conférer une résistance à certains antibiotiques. Contrairement

à la résistance intrinsèque, la résistance acquise ne se trouve que pour
certains caractères ou certaines sous-populations bactériennes. La
propagation des gènes peut se produire entre des bactéries de différents
genres ou entre des organismes différents. Le transfert horizontal de gènes
(THG) se produit lorsque la bactérie est capable d'acquérir de nouveaux
gènes qui peuvent augmenter son spectre de résistance intrinsèque, ou
qu'elle peut transférer la résistance à d'autres micro-organismes ou
directement aux humains ou aux animaux, ce qui est déjà considéré
comme un risque sanitaire, selon l'OMS. Par conséquent, les protocoles
d'analyse des gènes de résistance dans les BL sont en augmentation car ils
ont une grande capacité d'acquisition de la RA et ont une relation étroite
avec la transformation des aliments (Gueimonde et al., 2013; Sharma et
al., 2014; Abriouel et al., 2015; Zheng et al., 2017).

La figure 3 montre les trois principaux mécanismes de la THG, dont

certains ne sont pas considérés comme pertinents pour le transfert de la
résistance aux antibiotiques dans les bactéries lactiques, par exemple la
transduction (par les bactériophages) et la transformation (lorsque l'ADN
est libéré d'une bactérie et absorbé par une autre), la conjugaison étant le
principal mécanisme observé chez les bactéries lactiques (Mathur & Singh,
2005; Huddleston, 2014; Sharma et al., 2014; Von Wintersdorff et al.,
2016).

La conjugaison est le transfert de matériel génétique mobile à partir

de plasmides ou de transposons à l’aide d’un pilus sexuel (Fraqueza, 2015).
Les plasmides sont des molécules d'ADN extrachromosomiques capables de
se répliquer de manière autonome et qui peuvent conférer une résistance
aux micro-organismes contre les antibiotiques. Ils représentent l'un des
principaux éléments mobiles pour la dissémination des gènes de résistance
aux antibiotiques contre les β-lactamines, les aminoglycosides, les
tétracyclines, le chloramphénicol, les sulfonamides, la triméthoprime, les

19 | P a g e
 Introduction

macrolides et les quinolones (Clementi & Aquilanti, 2011; Huddleston,

2014; Von Wintersdorff et al., 2016).

2. Transformation
1. Conjugation

3. Transduction

Figure 3: Mécanismes de transfert horizontal de gènes chez les BL

(1) La conjugaison est un processus nécessitant un contact de cellule à cellule par
l'intermédiaire de pili de surface cellulaire ; (2) la transformation cellulaire par intégration
d'ADN extracellulaire ; (3) la transduction, les bactériophages peuvent transférer de
l'ADN bactérien d'une cellule donneuse préalablement infectée à la cellule réceptrice.
Adapté de Sharma et al., (2014) et de Von Wintersdorff et al., (2016).

Les plasmides ont un grand nombre de déterminants génétiques qui

peuvent conférer une résistance par conjugaison, et il est important de
considérer qu'une seule bactérie peut avoir plusieurs plasmides (Brown-
Jaque et al., 2015). Certains auteurs indiquent que la diversité génétique
de la résistance est proportionnelle au nombre de plasmides présents dans
l'environnement, sans oublier qu'il existe d'autres éléments mobiles tels
que les transposons et les intégrons, bien que ces éléments ne s'auto-
répliquent pas et doivent être transportés par un plasmide ou un phage
approprié (Ma et al., 2014; Brown-Jaque et al., 2015). Parmi les
transposons conjugatif utilisés comme vecteurs des gènes de résistance aux
antibiotiques dans les BL, on peut citer Tn916, Tn918, Tn920, Tn925,
Tn2702 (E. faecalis), Tn5233 (E. faecium), Tn5276 et Tn5301
(Lactococcus lactis) (Sharma et al., 2014).

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 Introduction

Résistance aux antibiotiques chez les bactéries lactiques

Comme mentionné, la présence de gènes de résistance dans les BL est

considérée comme un problème de santé publique, c'est pourquoi l'EFSA,
par l'intermédiaire du panel des additifs et produits ou substances utilisés
en alimentation animale (FEEDAP), a élaboré un guide technique pour
identifier les bactéries qui présentent une résistance acquise aux
antibiotiques tels que l'ampicilline, la vancomycine, la gentamicine, la
kanamycine, la streptomycine, l'érythromycine, la clindamycine, les
tétracyclines et le chloramphénicol (EFSA, 2012). La plupart des BL qui
présentent une résistance acquise dans la chaîne de production alimentaire
comprennent les genres homofermentaires obligatoires de Lactobacillus (L.
helveticus, L. acidophilus, L. delbrueckii), les genres hétérofermentaires
obligatoires de Lactobacillus (L. reuteri, L. fermentum), Lactobacillus
hétérofermentaires facultatifs (L. plantarum, L. rhamnosus, L. paracasei),
Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Pediococcus spp,
Leuconostoc spp et Enterococcus spp (EFSA, 2012; Gueimonde et al.,
2013). D'autre part, les BL peuvent être incorporées dans les aliments sous
forme de cultures probiotiques ou de ferments ou faire partie du
microbiote naturel des aliments fermentés traditionnels, mais certains
auteurs ont constaté que la grande majorité de ces bactéries sont
résistantes aux antibiotiques (Gueimonde et al., 2013; Sharma et al., 2014;
Abriouel et al., 2015; Fraqueza, 2015; Jaimee & Halami, 2015).

Le tableau 1 montre quelques BL RA isolés à partir d'aliments

fermentés traditionnels, industrialisés et probiotiques recommandés pour
améliorer le microbiote intestinal (Vaningelgem et al., 2004; Ma et al.,
2014; Brown-Jaque et al., 2015; Wacher-Rodarte et al., 2015). En
particulier, les genres Enterococcus et Lactobacillus peuvent être associés à
un risque pour la santé, car ils sont porteurs de gènes de résistance innés
et acquis et en raison de leur forte présence dans les aliments et dans le
microbiome gastro-intestinal des humains et des animaux (Mazurkiewicz
et al., 2005; Imperial & Ibana, 2016).

21 | P a g e
 Introduction

Tableau 1: Bactéries lactiques résistantes aux antibiotiques isolées des

aliments (Vaningelgem et al., 2004; EFSA, 2008; Brown-Jaque et al., 2015;
Wacher-Rodarte et al., 2015).

B actéries lactiques R ésistance aux antibiotiques* A lim ents

Lactobacillus sakei Vancomycine, gentamycine, érythromycine Chorizo, fouet et
Lactobacillus curvatus et tétracycline. saucisse.
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus sakei Streptomycine, gentamycine et Saucisse italien
Lactobacillus pentosaceus tétracycline.
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus
paraplantarum

Lactobacillus sakei Chloramphénicol, quinupristine- Saucisse fermentés

Lactobacillus plantarum dalfopristine, lincomycine, érythromycine, à sec du sud du
(ermA, ermB et ermC), rifampicine, Portugal
tétracycline (gènes tetM, tetO, tetS, tetW,
tetK et tetL), gentamycine, vancomycine et
pénicilline.
Enterococcus faecium Gentamycine, tétracycline (tetM), Saucisses
Enterococcus faecalis clindamycine, vancomycine (vanA),
Lactobacillus reuteri chloramphénicol(cat gen), ciprofloxacine,
Lactobacillus acidophilus pénicilline et nitrofurantoïne.
Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus
Lactobacillus johnsonii
Lactobacillus plantarum
Lactococcus lactis K214 Chloramphénicol, streptomycine, et Fromage au lait
tétracycline (tetS et tetM), érythromycine cru
(ermT)
Streptococcus Tétracycline (tetS), érythromycine (ermB) Lait cru
thermophilus
Lactobacillus pentosus Amoxicilline, ampicilline, chloramphénicol, Olive verte
Leuconostoc gentamycine, érythromycine,
pseudomesenteroides streptomycine, vancomycine et
téicoplanine.
Bifidobacterium spp Streptomycine, vancomycine, gentamycine, Probiotique
Lactobacillus spp ciprofloxacine et aztreonamine. commercial
Streptococcus
thermophilus
* Les lettres en italique indiquent les gènes de résistance identifiés par PCR

Résistance des entérocoques aux antibiotiques

Les entérocoques sont largement distribués dans les légumes, les

produits laitiers, les aliments préparés et les produits carnés et utilisés

22 | P a g e
 Introduction

comme probiotiques ; cependant, ils ont une résistance intrinsèque à un

grand nombre d'antibiotiques tels que β-lactamines et aminoglycosides.
Dans certains cas, ils peuvent présenter des profils de résistance similaires
à ceux des entérocoques considérés comme des pathogènes qui pourraient
présenter une résistance multiple aux antibiotiques (MDR) avec des
mécanismes de résistance qui comprennent la modification des cibles
pharmacologiques, l'inactivation des agents thérapeutiques, la
surexpression des pompes d'efflux (Miller et al., 2014; Álvarez-Cisneros et
al., 2017).

La streptomycine a été le premier aminoglycoside signalé pour lequel

une résistance est apparue dans les entérocoques (concentrations
supérieures à 2000 μg/mL) ; cette résistance s'effectue par adénylation de
la streptomycine, par l'action de l'enzyme streptomycine
adényltransférase, codée par le gène aad(A) (Miller et al., 2014; Munita &
Arias, 2016). La résistance à la gentamicine, à la kanamycine, à la
néomycine et à la nétilmicine (ainsi qu'aux aminoglycosides) est
principalement due à la production de l'enzyme bifonctionnelle 2′
phosphotransferase 6′ acetyltransferase, qui favorise la phosphorylation des
aminoglycosides en fonction de l'ATP (Miller et al., 2014).

Les souches d'entérocoques d'origine clinique entre 60 et 65%

présentent une résistance aux tétracyclines, bien que ces antibiotiques ne
soient pas utilisés de façon routinière dans le traitement des infections
causées par ces micro-organismes. Il existe deux mécanismes fondamentaux
de résistance aux entérocoques à tétracyclines : les pompes de flux et la
protection du ribosome, empêchant ainsi la fixation de l'antibiotique. Les
gènes tet(K) et tet(L) codent pour les protéines associées aux pompes à
efflux responsables de l'élimination de l'antibiotique à l'extérieur de la
cellule, tandis que les gènes tet(M), tet(O) et tet(S) codent pour les
protéines qui assurent la résistance aux tétracyclines pour la protection des
ribosomes. Les gènes tet(L) et tet(M) sont les plus fréquents dans le
chromosome et les déterminants mobiles (Miller et al., 2014; Enayati et

23 | P a g e
 Introduction

al., 2015; Álvarez-Cisneros et al., 2017). Enfin, la vancomycine

(glycopeptide) est la principale cause de préoccupation, car cet
antibiotique est considéré comme la dernière option de l'antibiothérapie
pour le traitement des bactéries à Gram positif. La résistance à la
vancomycine chez les entérocoques est variable, ayant décrit six génotypes
van(A), van(B), van(C), van(D), van(E) et van(G), le génotype van(A)
étant plus fréquent dans le genre Enterococcus (Miller et al., 2014).

Résistance des lactobacilles aux antibiotiques

En général, les lactobacilles présentent une résistance naturelle élevée

à la vancomycine, à la bacitracine, à la céfoxitine, au métronidazole, à la
nitrofurantoïne et à la sulfadiazine, ainsi qu'aux antibiotiques qui inhibent
la synthèse de protéines tels que la quinupristine/dalfopristine, et les
tétracyclines (Abriouel et al., 2015). Guo et al., (2017) ont observé 85% de
l'incidence de la résistance à la vancomycine dans des souches de
Lactobacillus isolées dans l'alimentation, en particulier chez Lactobacillus
plantarum et Lactobacillus casei, avec la fréquence la plus faible pour
Lactobacillus helveticus, mais ces résistances ne sont pas transférables, car
les gènes sont situés dans le chromosome (Guo et al., 2017). De plus, des
gènes codant pour la résistance à la tétracycline et à l'érythromycine ont
été détectés chez différentes espèces de Lactobacillus isolées de
probiotiques et d'aliments (Mathur & Singh, 2005; Devirgiliis et al., 2013;
Gueimonde et al., 2013). Le genre Lactobacillus est un excellent récepteur
de gènes exogènes par conjugaison, comme l'ont démontré Abriouel et al.,
(2015) pour le plasmide pAMβ1 conjugué trouvé dans Lactobacillus
plantarum et qui pouvait être obtenu à partir d'entérocoques et de
streptocoques. Les Lactobacillus sont généralement sensibles aux
antibiotiques, tels que les pénicillines (ampicilline, oxacilline et
pipéracilline), les inhibiteurs de β-lactamase et les céphalosporines
(céphalothine et céfuroxime), ceftriaxone et céfoxitine), mais depuis
quelques années, certains auteurs ont signalé une résistance à la pénicilline
G chez certaines souches de Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri

24 | P a g e
 Introduction

et Lactobacillus plantarum (Arbeloa et al., 2004; Wang et al., 2018).

D'autres études ont démontré que Lactobacillus rhamnosus peut être
utilisé en toute sécurité comme culture starter ou probiotique, malgré la
présence de gènes de résistance à la vancomycine, car cette résistance est
codée dans le chromosome (Huddleston, 2014; Von Wintersdorff et al.,
2016; Abriouel et al., 2015).

Transfert horizontal de gènes de BL vers le microbiote

intestinal

Le transfert horizontal de gènes (THG) implique l'échange de gènes

entre différentes bactéries par le biais d'éléments d'ADN mobiles tels que
les plasmides, les transposons conjugués, les intégrons et les bactériophages
(Verraes et al., 2013; Brown-Jaque et al., 2015; Von Wintersdorff et al.,
2016). Le transfert de gènes de résistance par THG commence chez les
animaux d'élevage qui ont été traités avec des antibiotiques utilisés comme
stimulateurs de croissance pour prévenir les maladies, mais ces traitements
non contrôlés peuvent induire une résistance dans leur microbiote
intestinal ; plus tard, ce biote peut atteindre les aliments et finalement
être transféré à l'homme (Mermelstein, 2018). La conjugaison dans les
matrices alimentaires a été signalée pour des bactéries commensales
(Enterococcus faecalis et Lactococcus lactis), et des souches
potentiellement pathogènes (Listeria spp., Salmonella spp., Staphylococcus
aureus et E. coli) et du lait fermenté (Verraes et al., 2013; Flórez & Mayo,
2017). De plus, le transfert de gènes de résistance à la tétracycline parmi
les BL a été signalé dans du lait fermenté et des saucisses fermentées
(Verraes et al., 2013). Martínez et Baquero, (2014) signalent le transfert
de gènes de résistance à la tétracycline et à la vancomycine chez
Enterococcus faecalis pendant le processus de fermentation du fromage et
des saucisses. Bonham et al., (2017) ont démontré que les fromages affinés
contiennent des Lactobacillus et Lactococcus qui ont acquis la résistance
par le biais de THG induit par la forte condition de sélection microbienne
pendant le processus de production et de maturation des aliments.

25 | P a g e
 Introduction

On trouve dans le tractus gastro-intestinal humain une grande

diversité d'espèces résistantes aux antibiotiques qui ont acquirent des
gènes de résistance par le THG ; ce fait est lié à la comparaison
métagénomique qui montre que la plupart des gènes de résistance trouvés
dans le microbiome humain sont ceux associés aux antibiotiques approuvés
utilisés dans le bétail, ce qui soutient l'hypothèse que les gènes de
résistance peuvent être transférés de la ferme aux consommateurs
(Huddleston, 2014). Par conséquent, l'OMS indique que les gènes THG
peuvent constituer un problème de santé important, car la plupart des
résistances aux antibiotiques sont acquises par le biais de THG (WHO,
2015).

Les méthodes d'antibiogramme les plus largement utilisées sont

basées sur (1) la détection phénotypique de la résistance aux antibiotiques
par la mesure de la croissance bactérienne en présence de l'antibiotique
testé et (2) l'identification moléculaire des génotypes résistants par la
réaction en chaîne de la polymérase (PCR) (Clementi & Aquilanti, 2011;
Casado Muñoz et al., 2014; Gad et al., 2014; Flórez & Mayo, 2017).
L'évaluation de la sensibilité phénotypique aux antibiotiques des bactéries
de l'acide lactique doit être effectuée à l'aide de méthodes reconnues qui
permettent d'identifier la concentration minimale inhibitrice (CMI) pour
les antibiotiques les plus couramment utilisés. La plupart des espèces LAB
utilisées dans les aliments peuvent être évaluées par la méthode décrite
dans la norme ISO 10932 : 2010, en tenant compte des conditions et des
milieux de culture pour les bifidobactéries et les BL qui n'appartiennent
pas au genre Enterococci (Mattia & Merker, 2008; Wang et al., 2018). En
cas de présence de souches d'Enterococcus, il est recommandé d'utiliser les
méthodes décrites par le Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI, 2016; Gad et al., 2014). Certaines des méthodes recommandées
pour déterminer la CMI dans les laboratoires d'analyses sont le test E, le
Kirby-Bauertest (méthode de diffusion) et la méthode de microdilution en
bouillon (MDIL) (Kushiro et al., 2009). En particulier, les valeurs limites

26 | P a g e
 Introduction

sont connues pour les genres Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus,

Streptococcus et Bifidobacteria. La méthode MDIL est largement utilisée
pour évaluer la CMI pour un grand nombre de souches et d'antibiotiques,
bien que la méthode ait certaines limites, en particulier pour les
antibiotiques pour lesquels une souche pourrait rapidement acquérir une
résistance (Kushiro et al., 2009). Cependant, l'évaluation de la CMI dans
les BL est quelque peu incohérente parmi les chercheurs, principalement en
raison du manque de milieu de culture qui peut assurer une croissance
correcte des BL sans interférer avec les résultats du test. Par conséquent,
une technique complémentaire implique la recherche de gènes RA à l'aide
de techniques de PCR (Clementi & Aquilanti, 2011; Flórez & Mayo, 2017;
Guo et al., 2017). La métagénomique fonctionnelle est une approche
importante dans l'étude des gènes de résistance aux antibiotiques (GRA)
car elle peut être utilisée pour identifier et caractériser de nouveaux GRA,
y compris ceux qui n'étaient pas associés auparavant à la résistance aux
antibiotiques (Huddleston, 2014; Dos Santos et al., 2016). C'est également
l'une des techniques les plus récentes dans l'étude de la résistance dans des
groupes de bactéries pures ou des échantillons plus complexes comme les
aliments ; certains travaux rapportés dans la littérature indiquent la
grande diversité des systèmes de résistance présents dans les aliments, en
considérant les bactéries cultivables et non cultivables. Les études de
métagénomique aident à comprendre les mécanismes de la résistance de
telle sorte qu'elles permettent des applications directes dans l'identification
de nouveaux médicaments et la synthèse de nouvelles molécules
antibiotiques actives (Dos Santos et al., 2016).

Procédure d'évaluation des BL résistantes aux

antibiotiques utilisés dans les aliments

Le groupe d'experts du FEEDAP a proposé un système d'évaluation

de la résistance présente dans les bactéries lactiques qui peuvent être
utilisées comme cultures probiotiques ou starters dans la transformation
alimentaire ; comme mentionné précédemment, il est essentiel de

27 | P a g e
 Introduction

distinguer entre la résistance intrinsèque et la résistance acquise dans le

cadre de la sécurité alimentaire des bactéries lactiques (EFSA, 2008;
Laulund et al., 2017). L'identification correcte de la bactérie (séquençage
et comparaison du gène ADNr 16S dans les bases de données
internationales) par taxonomie moléculaire est essentielle pour évaluer le
type de résistance, car la résistance intrinsèque est spécifique à une espèce
ou à un genre. Une fois l'espèce étudiée identifiée, on détermine la CMI
(concentration minimale inhibitrice) à laquelle la bactérie lactique est
sensible à l'antibiotique analysé. La bactérie peut être considérée comme
sûre lorsque la CMI est inférieure à la valeur seuil (CMI < seuil). En
revanche, si la CMI est supérieure à la valeur seuil (CMI > seuil), la
bactérie est considérée comme résistante à l'antibiotique, et sa résistance
doit être confirmée par des méthodes moléculaires comme la PCR (Casado
Muñoz et al., 2014; Guo et al., 2017). Cependant, les gènes de résistance
ne sont pas toujours exprimés mais peuvent être transférés à d'autres
bactéries si les conditions environnementales stimulent l'expression de ces
gènes (Martínez & Baquero, 2014). Si les bactéries ont une résistance
intrinsèque, celle-ci est considérée comme acceptable pour une utilisation
dans les aliments. Dans le cas contraire, il faut démontrer si la résistance
acquise se trouve dans du matériel génétique mobile ou si elle a été acquise
au cours d'un processus de mutation dans le chromosome bactérien
(également acceptable pour une utilisation dans les aliments). Enfin, la
bactérie n'est acceptée par aucun organisme de réglementation pour son
application dans les aliments s'il est démontré que la résistance est
exogène et facilement transférable (figure 4).

Depuis la découverte du premier cas de résistance aux antibiotiques

dans les années 1940, les laboratoires pharmaceutiques n’ont pas cessé de

28 | P a g e
 Introduction

développer des solutions et des stratégies, en particulier pharmacologiques,

afin de limiter sa survenue.

Taxonomie moléculaire

Détermination quantitative du MIC

(Concentration minimale inhibitrice)

CMI ≤ Seuil CMI ≥ Seuil

(Non résistant) (Résistant)

Acceptable Base génétique de la résistance

Démonstration de la résistance
Resistance acquise intrinsèque

Gènes supplémentaires Démonstration de la mutation

Acceptable
génomique

Non acceptable Généralement acceptable

Figure 4: Proposition d'un système d'évaluation de la résistance aux

antibiotiques des BL utilisées comme probiotiques et en culture starter.
Adapté de Laulund et al., (2017) et de l'EFSA., (2008).

Les principales stratégies actuelles de lutte contre la résistance aux

antibiotiques (figure 5) peuvent être résumées en plusieurs points :
l’amélioration de la structure des anciens antibiotiques et l’invention de
nouvelles molécules comme la ceftaroline développée en 2008 et qui
représente une molécule de la même famille des bêtalactamines (Zhanel et
al., 2009), son efficacité a été confirmée par la suite lors des études
cliniques chez plus de 2500 patients atteints des infections compliquées de
la peau et des tissus mous et des pneumopathies bactériennes
communautaires (File Jr et al., 2011). C’est aussi le cas de la plazomicine
qui est une nouvelle molécule appartenant à la classe des aminosides

29 | P a g e
 Introduction

(Bush, 2012; Becker & Cooper, 2013) et de l’éravacycline qui fait partie de
la nouvelle génération des tétracyclines et qui a été développée dans le
même objectif que celui de la plazomicine pour limiter la résistance des
anciennes générations des antibiotiques en particulier contre l’efflux actif
spécifique et à la protection ribosomale (Grossman et al., 2015).

Figure 5: Stratégies et cibles bactériennes utilisées pour lutter contre la

résistance aux antibiotiques (Lemaoui et al., 2017).

L’amélioration de la structure des anciens antibiotiques peut

également être associée aux inhibiteurs des β-lactamases comme l’acide
clavulanique (Matsuura et al., 1980), Sulbactam (Bush, 2012),
Tazobactam (Kuti et al., 2015), Avibactam (Olsen, 2015; Soroka et al.,
2017), Rélébactam (Olsen, 2015; Lucasti et al., 2016), ou en association
avec le sel de bismuth (sous-citrate de bismuth potassique), qui, avec le
métronidazole et la tétracycline, est remarquablement efficace contre
Helicobacter pylori (Bouyssou, 2014).

L’inhibition du transfert de matériel génétique entre les souches

bactériennes a été discutée comme une stratégie pour de limiter la

30 | P a g e
 Introduction

résistance aux antibiotiques. Plusieurs chercheurs se sont récemment

intéressés à ces transferts observés in vitro à l’état naturel (Dimitriu et al.,
2014; Cabezón et al., 2017; Getino & De la cruz, 2019). Par exemple,
l’inhibition des protéines intervenant dans la conjugaison (relaxase, pili et
d’autres) empêche le transfert de plasmides dans différents hôtes,
favorisant l'extinction des plasmides dans les populations bactériennes. Ces
observations suggèrent que l’inhibition des échanges de plasmides entre les
bactéries permettrait diminuer les cas de résistance aux antibiotiques.

L’utilisation des peptides antimicrobiens (PAMs) représente une

autre stratégie très efficace contre un large éventail de microorganismes
tels que les bactéries et les champignons pathogènes en perturbant leurs
membranes tout en ne provoquant qu'une résistance bactérienne limitée
contrairement aux antibiotiques couramment. La plupart des PAMs ont
un effet bactéricide par insertion dans la membrane, entraînant ainsi une
perméabilisation puis une lyse cellulaire. Certains sont également capables
de traverser la membrane et cibler des molécules anioniques telles que les
acides nucléiques ou des enzymes, interférant ainsi avec les processus
biologiques de la cellule utilisés (Mahlapuu et al., 2016; Spohn et al.,
2019).

Les riborégulateurs agissent soit en stoppant la synthèse de molécules

essentiels qui sont en excès, soit en activant leur synthèse lorsque celles-ci
sont en manque. Cette stratégie a été proposée en 2007, l’idée est de
perturber la synthèse des protéines essentielles chez la bactérie (Ogawa &
Maeda, 2007). Des années plus tard, un autre groupe de chercheurs a ciblé
un riborégulateur de la guanine chez S. aureus grâce à une molécule
appelée PC1. Cette dernière provoque l’inhibition de la croissance
bactérienne in vitro et in vivo chez la souris (Mulhbacher et al., 2010).

La bédaquiline est l’une de nouvelles molécules antituberculeuses qui

présente la propriété de résister à l’action de l’ATP synthase impliquée
dans la résistance par l’inhibition de celle-ci. Une stratégie développée

31 | P a g e
 Introduction

pour lutter contre Mycobacteriums, dont Mycobacterium tuberculosis

(Lakshmanan & Xavier, 2013; Hards et al., 2015; Chia, 2019).

L’utilisation de la nanotechnologie constitue une approche

intelligente dans l’amélioration des traitements de nombreuses maladies
sévères. Il s’agit d’une administration de médicaments à l’aide des
nanovecteurs. Ces derniers permettent de transporter et de libérer le
principe actif au niveau de sa cible pharmacologique. Des études récentes
ont montré que des constituants des nanoparticules comme l’argent (Ag),
l’oxyde de zinc (ZnO), l’oxyde de cuivre (CuO) et l’oxyde ferrique (Fe2O3)
ont des propriétés antibiotiques en particulier contre les bactéries à Gram
positif comme S. aureus et Bacillus subtilis et contre les bactéries Gram
négatif comme P. aeruginosa et l’E. coli (Franci et al., 2015; Marslin et
al., 2015; Yu et al., 2020).

Une autre stratégie prometteuse de lutte contre la résistance aux

antibiotiques fait appel à l’utilisation de courts fragments d’ARN de
synthèse, appelés short interfering RNA. Le principe consiste à trouver
dans l’ADN ou l’ARN d’une bactérie certains sites qui contrôlent la
synthèse des protéines responsables de la résistance aux antibiotiques,
comme par exemple, les gènes qui codent pour les β-lactamases. On
synthétise alors des segments d’ARN d’une vingtaine de paires de bases
capables de se lier exclusivement avec ces sites. Cette liaison spécifique
aboutit au blocage la synthèse des protéines impliquées dans la résistance
(Yanagihara et al., 2006).

Le concept de la phagothérapie a été envisagé pour le traitement des

maladies infectieuses avant même l’apparition des antibiotiques. L’idée est
d’utiliser des virus qui neutralisent les bactéries pathogènes par le
processus de la bactériophagie. Cette méthode n’a pas abouti à des effets
thérapeutiques en raison de ses effets indésirables en particulier
immunitaires. Cependant, cette stratégie pourrait être prometteuse si on
arrive dans le futur de limiter ces effets. À l’heure actuelle, on est d’avis

32 | P a g e
 Introduction

qu’il vaut mieux éviter d’utiliser les phages intacts, qui sont rapidement
neutralisés par des souches de bactéries résistantes. En revanche, on peut
imaginer la mise au point d’antimicrobiens pratiques à partir de peptides
phagiques capables de tuer les bactéries par cytolyse (Lin et al., 2017).

33 | P a g e
Matériel et méthodes

34 | P a g e
 Matériel et méthodes

Techniques relatives aux prélèvements d’échantillons et

isolement de bactéries lactiques

Prélèvements d’échantillons et isolement de bactéries

lactiques

Les échantillons de lait, fromage, jéjunum et fèces ont été traités

comme suit pour isoler des bactéries lactiques :

• Lait (I)

Nous avons prélevé un total de 10 échantillons de lait cru de vaches

et de chamelle dans différentes fermes situées dans des régions de l’Ouest
algérien (Saida, Bechar, Chlef, Naama, El Bayad).

Pour éviter les contaminations lors du prélèvement, une asepsie locale a

été assurée : le pis et la mamelle de l’animal ont été lavés à l’eau javellisée
(3 à 4 gouttes par litre d’eau), puit, rincés à l’eau stérile et essuyés avec
une compresse stérile.

Après élimination des premiers jets de lait en pressant la mamelle de

l’animal, un volume de 50 mL environ de lait a été recueilli dans un flacon
stérile (un flacon représente un échantillon de lait). L'échantillon a été
immédiatement refermé et placé dans une glacière.

Avant toute manipulation le lait est soumis à un examen rapide

permettant de détecter des anomalies de couleur, d’aspect et d’odeur.

Les échantillons de laits (vache et chamelle) ont été incubés à 30 °C ou à

45 °C durant 48h. Le but de cette incubation est de favoriser le
développement de la flore lactique endogène mésophile d’une part et
thermophile d’autre part.

• Fromage (I)

Nous avons prélevé un total de 3 échantillons de fromages, deux

échantillons de camembert algérien fabriqués dans la région de Tizi-Ouzou
à partir du lait cru complet de vache et quatre échantillons de fromage

35 | P a g e
 Matériel et méthodes

traditionnel de chèvres (Jben) collectés dans des régions rurales près de

Saida.

L’échantillon de fromage a été prélevé à l’aide d’une spatule stérile

du milieu du fromage, placé directement dans un récipient stérile et pesé
de manière aseptique à raison de 10 g par échantillon. L’échantillon a été
homogénéisé dans 90 mL d’une solution à 2% de citrate de sodium (pH
7,5), préalablement chauffé à 45 °C et soigneusement mélangé par vortex
jusqu’à homogénéisation complète (Grujović et al., 2018).

• Jéjunum (II)

Un nombre de trois échantillons de jéjunum ont été prélevés du

tractus gastrointestinal de trois poulets collectés de différentes fermes
avicoles situés dans la région de Saida.

Dès l'abattage de l'animal, le tube digestif est soigneusement retiré

de la cavité abdominale, le foie et la rate sont détachés et l'intestin est
déroulé. La zone du jéjunum est précisément découpée et pesée, puis
hachée dans un volume d'eau physiologique stérile. La suspension a été
filtrée à travers une gaze, puis un volume a été récupéré après 15 minutes
de sédimentation des fines particules alimentaires.

• Fèces (III-IV)

Des échantillons de fèces de rats ont été prélevés dans des sacs
stériles et homogénéisés dans de l'eau physiologique à 0,5 g dans 49,5 ml.
La suspension filtrée par une gaze a ensuite été recueillie dans un récipient
stérile.

Des dilutions décimales ont été réalisées à partir des solutions mères
(lait, fromage, jéjunum et fèces) en utilisant une solution stérile d'eau
physiologique. Ensuite, un volume de chaque dilution a été soigneusement
étalé sur la surface d'un milieu sélectif. Pour Lactobacillus : gélose MRS
(pH 6,8) ; Lactococcus : gélose M17 (pH 7,2) ; Streptococcus et
Enterococcus : Slanetz et Burtely (pH 7) ou M17 (pH 7,2). Contrairement
aux autres genres, les lactobacilles ont une sensibilité relative à l’oxygène ;

36 | P a g e
 Matériel et méthodes

de sorte que les boîtes de MRS ont été incubées en anaérobiose (obtenue
par la "méthode de la bougie"). L’incubation des boites de Petri peut être
prolongée dans l’étuve jusqu’à l’apparition des colonies bactériennes.

Purification des isolats bactériens

Après incubation, quatre à cinq colonies isolées ont été prélevées au

hasard de chaque boite Petri incubée à 30 °C ou à 45 °C. Seules les
colonies présentant des aspects morphologiques similaires à ceux
mentionnés pour les bactéries lactiques dans le Bergey’s Manual of
Bacteriology, Vol. 2, (1986) ont été prélevées, c’est-à-dire l’élévation, le
pourtour, l’aspect, la pigmentation, le diamètre et l’opacité de la colonie.

Chaque colonie prélevée est ensuite repiquée selon sa provenance, soit

en bouillon MRS soit en bouillon M17 ou en bouillon BHI. Après
incubation à température souhaité, l'apparition des cultures en milieu
liquide a été constatée (formation de voile, dépôt, gaz…).

A ce stade les isolats bactériens peuvent être purifiés par isolement

par la méthode des stries. L’opération de purification a été renouvelée à
deux reprises en prenant chaque fois une colonie bien isolée dans la gélose.
On obtient ainsi une culture dont la pureté est estimée par observation
macroscopique et microscopique. Après purification, des répliques de ces
isolats ont été conservées.

Bactéries lactiques de référence (I)

Au total, 49 souches de BL provenant du souchier du laboratoire de

Biologie des Microorganismes et Biotechnologie (LBMB) de l’Université
d’Oran, ont été revivifiées dans du lait écrémé à 10%. Après incubation à
température souhaitée et dès coagulation du lait, les souches ont été
repiquées dans un bouillon MRS ou M17 puis ont subi une série de tests
de purification et de caractérisation morphologiques et biochimiques afin
de vérifier leurs appartenances aux genres de BL.

37 | P a g e
 Matériel et méthodes

Les origines des 288 isolats de BL utilisées dans les tests de

sensibilité aux antibiotiques dans les études I-IV sont présentées dans le
tableau 2.

Tableau 2: Origine biologiques de BL.

Nombre de souches
Etude Etude Etude Etude
I II III IV
Poulet Jéjunum 01 38
Animal
Rat Fèces 47 01
Lait de vache 70
Lait de chamelle 68
Fromage
35
Produit (Camembert)
laitier Fromage de chèvre
19
Aliment (Jben)
Beurre 01
Viande Bovine 5
Blé (Hamoum) 01
Plante Dattes (Ghers) 02
Olive 01
Total 203 38 47

Conservation des souches bactériennes

Les bactéries sont conservées à 4°C et à 20°C.

• Conservation à +4 °C

Les bactéries ont été ensemencées dans des tubes de gélose inclinés
qui ont ensuite été incubés à 30°C. Lorsque la croissance était visible, les
tubes étaient placés à +4°C où ils ont été conservés durant plusieurs
semaines.

• Conservation à -20°C

Les bactéries ont été ensemencées dans du milieu MRS ou M17 ;

après 18h d’incubation à 30 °C, les cellules ont été récupérées par

38 | P a g e
 Matériel et méthodes

centrifugation à 4000 t/min pendant 10 min. Une fois le surnageant

éliminé, le milieu de culture de conservation a été ajouté au culot, qui
contenait 70% de lait écrémé à 10% (enrichi par 0.05 % d’extrait de
levure) et 30% de glycérol. Les cellules ont été conservées en suspension
dense et en tubes Eppendorf à -20 °C.

Avant leur utilisation, les bactéries ont été revivifiées par une ou
deux subcultures dans du lait écrémé à 10% stérile, bouillon MRS ou M17
(suivant les souches) à 30 °C pendant 18 à 24h.

Techniques relatives à l’identification des BL

Dans un premier temps, une caractérisation microbiologique,

biochimique et physiologique des isolats a été effectuée grâce aux différents
tests bactériologiques décrits pour les BL. Ces tests ont été réalisés pour
éliminer les bactéries non lactiques d’une part et d’autre part pour
caractériser et pré-identifier les isolats de BL.

Dans une deuxième étape, l’identification des isolats a été réalisée à

l’aide de galeries biochimiques API 20Strep ou API 50CH. Cela conduit à
l’identification de l’espèce ou parfois même la sous-espèce bactérienne.

Dans une troisième étape, l’identification moléculaire de certains

isolats multirésistants par le séquençage d’ADNr 16s et/ou par MALDI-
TOF a permis une identification précise de l’espèce.

Dans une quatrième étape, un séquençage du génome entier d’un

isolat a permis de poursuivre l'identification, fournissant ainsi toutes les
informations sur la génétique structurelle et fonctionnelle du micro-
organisme.

Caractérisation phénotypique des isolats

La caractérisation des souches isolées du milieu MRS ou M17 a été

réalisée selon des critères morphologiques, physiologiques et biochimiques.

Les méthodes utilisées sont décrites en annexe 1.

39 | P a g e
 Matériel et méthodes

Identification moléculaire des isolats par séquençage

de l’ADNr 16S

L’identification moléculaire des souches a été réalisée par deux

méthodes.

L'analyse des séquences d'ADNr 16S est une des méthodes les plus
utilisées pour identifier et caractériser une espèce bactérienne. Le principe
sur lequel elles reposent consiste à amplifier un gène entier ou non, avec
des amorces spécifiques, qui peut être ultérieurement révélé par
électrophorèse sur gel, ou encore séquencé et comparé avec des séquences
déposées dans des banques de données (par exemple, EMBL, NCBI).

• Extraction d’ADN génomiques des isolats

L'extraction de l'ADN a été réalisée à partir de cultures bactériennes

de 24 à 48 heures dans un bouillon de MRS. Les cultures des souches
étudiées ont été centrifugées à 5000 tours/minute pendant 10 min. Le
culot a été lavé avec 0,5 ml de Tris-EDTA à pH 8. Après élimination du
surnageant, l'extraction de l'ADN a été effectuée selon le protocole du kit
"Qiagen, Valencia, CA, USA".

Le dosage de la concentration de l’ADN extrait à partir des souches

multirésistantes a été réalisé par le Nanodrop 8000.

• Amplification du fragment d’ADNr 16S

L’amplification de l’ADN in vitro a été effectuée par la technique de

la PCR (Polymerase Chain Reaction) qui permet d’obtenir un très grand
nombre de copies d’une séquence d’ADN. La séquence choisie dans cette
étude était le gène ribosomal 16S.

Les gènes codant l’ARN ribosomal 16S des souches ont été amplifiées
par l’utilisation des amorces suivantes :

- p8FPL (5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’);

- p806R (5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’).

40 | P a g e
 Matériel et méthodes

L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur de type

MyCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) dans un volume de
50 µl contenant 100 ng de matrice d'ADN, 25 pmol de chaque amorce
oligonucléotidique, 25 µl d'un mélange de RedTaq, ReadyMix (Sigma-
Aldrich, St, Louis, MO, USA) comprenant un tampon de réaction, des
dNTP, du chlorure de magnésium, de l'ADN polymérase Taq, de l’eau
bidistillée jusqu'à 50 µL.

Les conditions d'amplification ont commencé par une dénaturation

initiale à 94°C pendant 7 minutes, suivie de 35 cycles de 60 secondes de
dénaturation à 94°C, 60 secondes d'hybridation à 55°C, 60 secondes
d’élongation à 72 °C et enfin une élongation finale à 72 °C pendant 15
min.

• Purification des produits de PCR

La purification des produits de la PCR visait à éliminer les amorces

et les nucléotides (dNTPS) non utilisés pendant la réaction PCR. Elle a
été réalisée selon le protocole du kit ExoSAP-IT (GE Healthcare,
Amersham Biosciences, Uppsala, Suède) qui consistait à mélanger d'abord
5 µL du produit de la réaction PCR et 2 µL de l'ExoSAP-IT dans des
plaques de réaction « MicroAmp optical 96 », pour un volume final de 7
µL. Ensuite, la plaque de réaction a été incubée à 37°C pendant 15
minutes dans le thermocycleur pour dégrader les amorces et les nucléotides
libres. Enfin, incuber la plaque de réaction à 80°C pendant 15 minutes
pour inactiver l'ExoSAP-IT. Le produit de la PCR était donc prêt à être
analysé pour le séquençage.

Après amplification, les échantillons ont été analysés par

électrophorèse dans un gel d'agarose à 1% en présence d'un marqueur de
poids moléculaire de 100 paires de bases. Après migration, le gel a été
examiné sous lumière ultraviolette pour détecter les bandes amplifiées.

41 | P a g e
 Matériel et méthodes

• Séquençage

La méthode de séquençage utilisée est celle qui utilise un séquenceur

automatique capable d'effectuer à la fois les réactions et la détermination
de la séquence nucléotidique du fragment d'ADN étudié. Dans ce travail,
on a utilisé le séquenceur automatique ABI 3730 Genetic Analyser
(séquenceur 16 capillaires de la société Applied Biosystems, modèle 3730,
de Genomed S.A). La méthode utilisée était la méthode de Sanger basée
sur la technologie ddNTP (Société Applied Biosystems). Les réactions de
séquences ont été réalisées dans des plaques PCR de 96 puits en utilisant
le kit de séquençage (Big Dye Terminator version 3.1 ou version 1.1 cycle
sequencing–Applied Biosystems, Foster City, Californie, États-Unis).

• Analyse des séquences nucléotidiques

Les résultats du séquençage des fragments d'ADNr amplifiés avaient

été obtenus sous forme d’électrophorégrammes bruts. Ces derniers avaient
été visualisés par le logiciel et analysés par le logiciel Mega 7.0.26 (Kumar
et al., 2016), Les alignements du couple des séquences sens/antisens ont
été effectués par le logiciel ClustalW (Thompson et al., 1994) pour définir
la séquence consensus. Les séquences obtenues ont été comparées à des
séquences homologues dans la banque informatique internationale de
données «GenBank» à l’aide de Blast (Basic Local Alignment Search
Tool) (Zoetendal et al., 2008) dans le site web de Genbank «
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi » afin de déterminer leur affiliation
phylogénétique. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de similarité
de la souche à identifier avec les espèces les plus proches, et sous forme
d’arbres phylogénétiques qui montrent la position taxonomique de chaque
isolat.

• Critères d’identification

L’identification du genre ou de l’espèce a été effectuée selon les

critères suivants (Drancourt et al., 2000) :

42 | P a g e
 Matériel et méthodes

-Si la comparaison de la séquence obtenue avec une séquence d’une

espèce de référence classifiée avait rapporté des pourcentages de similitude
≥ 99%, l’isolat inconnu sera assigné à cette espèce.

-Si les pourcentages ont été entre 97% et 98% l’isolat inconnu sera
assigné au genre correspondant.

-Si les pourcentages ont été < 97%, l’isolat inconnu sera assigné à
une famille.

Identification par spectrométrie de masse MALDI-

TOF

La technique de type MALDI-TOF MS permet l'identification des

microorganismes au niveau de l'espèce par analyse de leurs protéines
totales (Bizzini & Greub, 2010). Pour les bactéries, cette technique est
basée sur la génération de spectres de masse à partir de colonies entières
(Fenselau & Demirev, 2001). Leur spectre de masse est très
majoritairement constitué de protéines ribosomales et membranaires.

Dans ce travail, le MALDI Microflex LT/SH (Bruker Daltonics,

Brême, Allemagne) a été utilisé pour l'identification des isolats présentant
une multirésistance.

La technique utilisée nécessite une étape préliminaire de

cristallisation, sur un support inerte, d'une colonie de culture de 24 heures
mélangée à 1µl de matrice (Acide α-cyano-4-hydroxycinnamique). Le
complexe ainsi formé a été bombardé par un faisceau laser émettant dans
la zone d’absorption de la matrice. L’irradiation du mélange cristallin
conduit à la désorption d’ions caractéristiques de l’échantillon (MALDI).
Les molécules ionisées ont ensuite été accélérées dans un champ électrique
et dirigées vers un analyseur séparant les ions en fonction de leur temps de
vol (TOF). Ainsi, en fonction de leur rapport m/z (m=masse et
z=charge), les ions ont atteint plus ou moins rapidement le détecteur, où
ils ont été transformés en un signal électrique qui a été amplifié et analysé.
Une fois l'analyse terminée, le MALDI affichait les résultats dans le

43 | P a g e
 Matériel et méthodes

programme "Maldi Biotyper Automation control" et indiquait le

pourcentage d'identification.

Techniques relatives à l’étude de la sensibilité aux

antibiotiques

Profils de sensibilité/résistance aux antibiotiques

Après l'identification des isolats, nous avons procédé à l'étude de la

sensibilité aux antibiotiques en déterminant les profils de sensibilité/
résistance des souches par des méthodes phénotypiques utilisant la
méthode de diffusion sur disque solide (Antibiogramme) et la méthode de
dilution en bouillon et gélose (CMI).

Ces tests de sensibilités ont été effectués selon les recommandations

du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI, 2012).

Les procédures sont décrites en annexe 2.

Test de synergie

La production d’une β-lactamase à spectre étendue (BLSE) a été

étudiée en utilisant des tests de synergie sur gélose MRS ou MH. Des
disques de céphalosporines de 3éme génération (C3G) (céftazidime) ont été
placés à 2 ou 3 cm d’un disque d’amoxicilline + acide clavulanique (Jarlier
et al., 1988). La présence d’une BLSE a été caractérisée par la description
d’une image de synergie en « bouchon de champagne » en raison de l’effet
inhibiteur de l’acide clavulanique (Siu et al., 2003).

Test Hodge

Le test Hodge est utilisé pour révéler la production de

carbapénémases. Ceci était obtenu en inoculant les souches des BL
conjointement avec une souche indicatrice sensible au carbapénème et en
évaluant le diamètre de la zone d'inhibition de la souche indicatrice en
raison de la production de carbapénèmes par les isolats des souches
lactiques (Pasteran et al., 2011).

44 | P a g e
 Matériel et méthodes

La technique consistait à ensemencer la souche E.coli ATCC à 0,5

MacFarland sur la gélose BHI par écouvillonnage, par la suite dans une
ligne droite, les souches à tester ont été inoculées à partir de quelques
colonies d'une culture sur milieu gélosé MRS ou BHI du centre de la boite
vers la périphérie. Après 15 mn, le disque d’imipenème a été déposé au
centre (à l’extrémité de la strie). Les boites sont ensuite incubées 24 heures
à 37 °C.

L’hydrolyse de l’imipenème par la souche à tester se traduit par

échancrure de la zone d’inhibition de la souche d’E.coli indicatrice (figure
6).

Figure 6: Lecture du test de Hodge (Anderson et al., 2007)

Analyse statistique multivariée

Dans cette section, nous avons essayé d'identifier les genres de BL les
plus résistants aux antibiotiques ainsi que les origines de l'isolement qui
semblent être les sources les plus riches de bactéries résistantes aux
antibiotiques. Pour ce faire, nous avons mis en œuvre l'analyse en
composantes principales (ACP) (Joe Qin, 2003; Kourti, 2005) sous Xlstat
pour réduire les dimensions des données afin de pouvoir visualiser chaque
ensemble de données dans un espace bidimensionnel. Sur la base de
l'espace de données réduit caractérisé par l'ACP. Le regroupement
hiérarchique est l'une des approches les plus couramment utilisées pour
séparer les points de données tout en fournissant une analyse de similarité

45 | P a g e
 Matériel et méthodes

entre les points de données (Wang et al., 2006), ce traitement a été

effectué à l'aide de la version 3.5.3 du logiciel R (Team, 2013).

Expérimentation animale (III)

Animaux et conditions d’élevage

L’expérience a été menée conformément aux directives

internationales de l’expérimentation animale. Nous avons utilisé huit rats
Wistar (Rattus norvegicus) mâles de notre élevage (Faculté des Sciences,
Université de Saida, Algérie), âgés de 90 jours, pesant entre 210 et 230 g
chacun et n'ayant jamais reçu d'antibiotiques. Ces rats ont été placés
séparément dans des cages individuelles pendant toute l’expérience.

Les animaux ont reçu une alimentation El Alf standard et de l'eau ad

libitum. La litière et la sciure ont été changées tous les deux jours pour
assurer une bonne hygiène aux animaux.

Administration d’antibiotiques

Le prémélange médicamenteux (Ampicilline, SAIDAL Algérie) a été

dissous dans de l'eau et administré par intubation gastrique à des rats à
jeun (n=4) traités une fois par jour à 20 mg/kg pendant 7 jours. Quatre
rats ont été utilisés comme témoins sans aucun traitement. Les doses
d’ampicilline ont été basées sur les doses approuvées d’ampicilline chez le
rat (20 mg/kg par jour) (Carpenter et al., 2001).

Mesure du niveau de résistance de la flore intestinale

Dans l’optique de comparer le niveau d’excrétion fécale de bactéries

résistantes suite du traitement à l’ampicilline par voie orale, il est
indispensable de quantifier le niveau de résistance de la flore intestinale.
Cette partie présente la méthodologie utilisée pour quantifier ce niveau de
résistance.

Niveau de résistance au sein de la flore intestinale

La quantification de la résistance au sein de l’écosystème bactérien

intestinale est nécessaire pour le suivi des niveaux de résistance dans les

46 | P a g e
 Matériel et méthodes

enquêtes épidémiologiques, pour étudier l’impact de l’administration

d’antibiotiques sur la sélection ou l’émergence de résistance dans
l’écosystème intestinale. Il n’existe pas de recommandations sur les
méthodes pour mesurer quantitativement la résistance dans ces
populations bactérienne. D’après Davison (2000), évaluer la résistance de
manière quantitative représente un véritable challenge en termes de
méthodologies et d’échantillonnages.

La mesure de la résistance à un antibiotique au sein de l’écosystème

intestinal peut se faire grâce à des souches qu’on va les nommées bactéries
indicatrices. Dans cette étude nous avons utilisé les entérocoques comme
des indicateurs, vu leurs mises en culture facile et qu’ils ont une plus
grande importance dans l’émergence de l’antibiorésistance chez l’Homme
et l’animal par rapport aux autres genres de BL.

Une façon d’estimer quantitativement la résistance est de calculer le

rapport entre le dénombrement de bactéries qui se développent sur un
milieu supplémenté en ampicilline et en absence d’ampicilline.

• Évaluation de la résistance à l'ampicilline

Après défécation spontanée, les fèces ont été recueillies dans des
tubes de prélèvement stériles, aux jours 0, 1, 3, 5 et 7 au cours du
traitement, et 4 et 8 jours après l’arrêt de traitement. Des échantillons ont
été obtenus des rats témoins aux mêmes moments. Dans les deux heures
suivant le prélèvement, les échantillons ont été traités
microbiologiquement. Pour le dénombrement, cent microlitres de dilutions
appropriées ont été étalés de manière aseptique sur gélose Slanetz et
Burtely. Afin de sélectionner les souches résistantes à l'ampicilline, les
mêmes dilutions ont également été appliquées sur des géloses Slanetz et
Burtely contenant 16 µg/mL d'ampicilline (la concentration minimale
inhibitrice proposée par (CLSI) est de 16 µg/mL) (CLSI, 2012). Les
colonies ont été comptées après une incubation à 37°C pendant 48h. Le
nombre d'unités formant des colonies (UFC) a été déterminé par comptage

47 | P a g e
 Matériel et méthodes

direct. À titre de dénombrement, nous avons pris les boites contenant 30 à

300 UFC.

• Traitement statistique

Les résultats sont présentés sous forme de pourcentages

d’entérocoques résistants à l'ampicilline entre les 2 groupes de rats. Les
données ont été analysées pour l’évaluation de la précision par analyse de
variance (ANOVA). L'analyse statistique a été réalisée par le logiciel
XLSTAT version 2014.5.03. Les différences entre les groupes ont été
considérées comme significatives au niveau P ≤ 0,05.

Mesure des résidus d'ampicilline dans des

échantillons de fèces par RP‑HPLC

Nous avons utilisé la méthode de chromatographie liquide à haute

performance en phase inverse (RP-HPLC) pour la détermination et la
quantification des résidus d’ampicilline dans les matières fécales des rats
aux jours 0, 1, 3, 5 et 7 au cours du traitement et 4 et 8 jours après le
traitement. Un système RP-HPLC (Shimadzu LCMS 2020) a été utilisé. Il
est équipé d'une colonne Ascentis Express C18 (15 cm × 4,6 mm)
contenant des particules partiellement poreuses de 2,7 µm (Supelco,
Bellefonte, PA, USA). L'effluent de colonne a été contrôlé à une longueur
d'onde de 280 nm.

• Préparation des échantillons

Des échantillons fécaux (1g) provenant des rats traités ont été
prélevés et homogénéisés par agitation dans 9 ml de méthanol, puis
centrifugés à 5 000 tr/min pendant 10 min à 4 °C. La phase surnageante
claire a été récupérée à l’aide d’une seringue jetable en évitant de prendre
la couche de graisse supérieure, puis filtrée à travers un filtre en nylon de
porosité 0,45 µm (diamètre 13 mm). L'extrait filtré a été injecté (5 µl)
dans un système RP-HPLC.

48 | P a g e
 Matériel et méthodes

• Préparation des étalons

Les solutions d’étalonnage d’ampicilline ont été préparées dans du

méthanol à partir d’une solution mère de 100 mg/mL. Les concentrations
des étalons sont de 1,56 µg/mL, 3,12 µg/mL, 6,25 µg/mL, 12,5 µg/mL, 25
µg/mL et 50 µg/mL. Les solutions ont été filtrées à travers des filtres de
porosité 0,45 µm et stockées à -20 °C jusqu'à leur utilisation (pas plus d'un
mois).

La quantification de l'ampicilline dans les échantillons a été réalisée

en injectant les solutions d’étalonnages, un témoin négatif (J0) et les
échantillons à analyser durant le traitement et le post-traitement.

Isolement et identification d’entérocoques des fèces de

rats

Pour chaque rat traité, trois colonies ont été prélevées au hasard sur
les boites de Slanetz et Burtely sans ampicilline aux jours 0, 3, 5 et 7.
Toutes les souches d'entérocoques isolées ont été testées pour la croissance
dans un bouillon à 6,5% de NaCl, à un pH de 9,6, dans 0,1% de lait
SHERMAN et à des températures de 10°C et 45°C comme recommandé
par Facklam et Collins (1989), Manero et Blanch (1999). Tous les isolats
ont été confirmés comme étant Enterococcus spp en utilisant le système
d’identification des streptocoques API 20 Strep (BioMerieux, Marcy
l’Etoile, France).

Les CMI ont été déterminées envers l’ampicilline par la méthode de

dilution en gélose conformément aux recommandations du CLSI (CLSI,
2012) détaillée dans l’annexe 2. La souche E. faecalis ATCC 29212 est
utilisée comme témoin.

Séquençage haut-débit Illumina (IV)

Préparation de l’ADN pour le séquençage

Une colonie pure de la bactérie multirésistante à tester est repiquée

sur 2 mL du milieu MRS bouillon et incubée à 30 °C pendant 18 heures.

49 | P a g e
 Matériel et méthodes

L'ADN génomique total a été extrait par le kit DNAMITE DNA bacterial
(Microzone Ltd, UK). L'ADN génomique ainsi purifié est élué dans 50 µl
du tampon AE du même kit et envoyé au prestataire (Diag-Gene, Angers
et Biofidal, Vaulx-en-Velin, France) après avoir vérifié sa concentration
sur Qubit et Nanodrop.

Dans la présente étude le séquençage a été effectué sur l’Illumina

MiSeq, à l’aide d’une préparation de librairie avec des kits de réactifs v3
de 2x300 pb Nextera XT DNA Library Prep (Illumina, San Diego, CA).

Le kit de construction de la bibliothèque Nextera (Illumina, San

Diego, CA) est considéré comme l’une des approches les plus pratiques et
conviviales. En adaptant le mécanisme de « copier / coller » des
tagmentase (transposase modifiée) à la construction de bibliothèques,
Nextera peut combiner la fragmentation de l’ADN et la ligature
d’adaptateurs en une seule réaction, ce qui réduit le temps de construction
standard de la bibliothèque de 9 h à seulement 90 min pour 96
échantillons.

Dans l’étape suivante, l'ADN fragmenté est amplifié par PCR à

cycles limités, en utilisant des amorces ciblées sur la séquence du
transposon. Ces amorces ajoutent les adaptateurs spécifiques i7-index1
pour le brin sens et i5-index2 pour le brin antisens comme montre la figure
7.

Les fragments sont liés par la suite à une surface d’une puce (la flow
cell) tapissée de séquences adaptatrices complémentaires aux adaptateurs
sur les fragments d'ADN et amplifiés par PCR. L'ensemble des fragments
(clusters) seront séquencés par synthèse simultanément. Le processus de
séquençage permet d'identifier les bases d'ADN lorsqu'elles sont
incorporées dans la chaîne d'acide nucléique.

50 | P a g e
 Matériel et méthodes

Figure 7: Présentation de la méthode de préparation de la banque

d'ADN Illumina Nextera.

A. Le transposome Nextera XT avec des adaptateurs est combiné à un ADN matrice ; B.

Tagmentation pour fragmenter et ajouter des adaptateurs ; C. PCR à cycle limité pour
ajouter les séquences d'amorces de séquençage et des index.

Chaque base émet un signal de fluorescence unique lorsqu'elle est

ajoutée au brin en cours de synthèse, ceci est utilisé pour déterminer la
séquence d'ADN. La totalité des séquences générées sera assemblée créant
une séquence consensus (figure 8).

51 | P a g e
 Matériel et méthodes

Figure 8: Génération des NGS Clusters et lecture de séquençage

(A) Mécanisme de séquençage de NGS Cluster. Les fragments d'ADN se lient aux
séquences adaptatrices de la flow cell et sont amplifiés par pontage. Les fragments
originaux sont ensuite clivés et lavés de la flow cell. (B) Analyse de séquençage des
fragments à l'aide de nucléotides marqués par fluorescence (C) Préparation des séquence
paired-end pour séquençage.

Analyses bioinformatiques des données de séquençage

Nettoyage des données brutes

Filtrer les lectures d'un séquençage est une étape indispensable dans
l'objectif d'obtenir un assemblage cohérent. La présence d'un trop grand
nombre d'erreurs dans les séquences peut conduire à la formation de
contigs chimériques et l'obtention d'un mauvais assemblage. Pour les reads
(lectures) obtenues par la méthode Solexa/lllumina, la filtration des reads
s'est faite en se basant sur les scores de qualité attribués à chaque base par
le séquenceur. Ainsi, les séquences possédant des scores élevés ont été
conservées pour l'assemblage.

52 | P a g e
 Matériel et méthodes

Evaluation de la qualité des données bruites

Les fichiers récupérés sont des séquences brutes issues d'un

séquençage par la méthode Illumina. Avant de commencer à les utiliser, la
qualité des séquences a été contrôlé utilisant le software FastQC
(Andrews, 2010).

Enlèvement de la dernière base

La taille des lectures attendue est 2x300 et non pas 2x301. Lors de
séquençage, une base supplémentaire est toujours séquencée car les bases
n+1 sont utilisées pour calculer les statistiques des bases à la position n, la
dernière base surnuméraire a été supprimée à l'aide du software sous
Linux fastx-toolkit (Hannon, 2010).

Elimination des séquences contaminantes

Les adaptateurs sont utilisés pour construire la banque, créer des

clusters et les séquencer. Selon la taille des séquences initiales (avant
formation des clusters) et la qualité de la construction initiale de la
banque, les adaptateurs peuvent être présents en quantités variables. Ces
séquences non génomiques peuvent poser un problème lors de l'assemblage.
Pour éliminer ces séquences, nous avons utilisé le logiciel Trimmomatic
sous Linux (Bolger et al., 2014), qui est capable de découper les séquences
d'adaptateurs (entières ou non, avec index/mismatches) et d'éliminer les
contaminants résiduels du multiplexage (séquençage de plusieurs individus
en même temps) sans risque d'éliminer trop de séquences réelles. Le seuil
de qualité choisi permet également d'éliminer les bases de mauvaise qualité
situées à la fin des séquences.

Elimination des parties de reads de mauvaise qualité

Des séquences de nucléotides de mauvaise qualité à la fin des reads

peuvent induire des variantes mal détectées. Afin de ne conserver que les
séquences de bonne qualité, nous avons retiré les nucléotides et les
séquences de mauvaise qualité à l'aide du logiciel sous Linux fastx-toolkit
(Hannon, 2010).
53 | P a g e
 Matériel et méthodes

Assemblage

En bio-informatique, l'assemblage consiste à aligner et/ou fusionner

des fragments d'ADN ou d'ARN issus d'une plus longue séquence afin de
reconstruire la séquence originale. Il s'agit d'une étape d'analyse in silico
qui succède au séquençage de l'ADN ou de l'ARN d'un organisme unique,
d'une colonie de clones (bactériens par exemple), ou encore d'un mélange
complexe d'organismes.

Assembleurs utilisés

Dans la présente étude, divers assembleurs ont été utilisés sur les
mêmes données à des fins de comparaison. Les softwares utilisés sont :
MIRA v4.9.6 (Mimicking Intelligent Read Assembly) (Chevreux et al.,
2004) ; SPAdes (Bankevich et al., 2012) ; SOAPdenovo (Luo et al., 2012) ;
Velvet v1.2.09 et VelvetOptimizer v2.2.6 (Zerbino et al., 2009) ; Abyss
GNU Make v4.1 (Jackman et al., 2017) ; Megahit v1.1.3 (Li et al., 2015),
Ray mpiexec (OpenRTE) 2.1.1 (Boisvert et al., 2012).

Tous les assemblages ont été exécutés sur une machine Intel CPU i7
8700k overclocké, contenant 12 cœurs (threads) de 5 GHz et un total de
64Go de RAM sous Linux Ubuntu 18.04 LTS. Cependant, l’utilisation de
ce module demande à l’utilisateur d’être familier avec l’environnement
linux et l’invite de commande.

Annotation du génome et génomique fonctionnelle

L'annotation générale de l'ensemble du génome de la bactérie à tester

a été réalisée par deux annotateurs :

• Rapid Annotation using Subsystem Technologv (RASTtk) (Aziz et

al., 2008; Brettin et al., 2015) qui est un outil d’annotation
automatisé largement utilisé pour l'annotation des génomes
bactériens et d’archéobactéries.
• Prokka (Seemann, 2014) est un package utilisé aussi pour une
annotation rapide des génomes de petite taille.

54 | P a g e
 Matériel et méthodes

Annotation spécialisée

• Annotation des résistances aux antibiotiques

La recherche de gènes de résistance aux antibiotiques a été menée à

l'aide de trois outils pour confirmer ou identifier tous les gènes de
résistance.

✓ ResFinder (Acquired antimicrobial resistance gene finder) est un

outil fonctionnant sous Linux qui utilise le BLAST pour
l'identification des gènes de résistance aux antibiotiques acquis, et
aussi pour détecter les mutations génétiques qui codent pour un
phénotype de résistance dans les données du génome entier. La
méthode de recherche peut utiliser à la fois des génomes
préassemblés, complets ou partiels, et des reads de courtes séquences
(Zankari et al., 2012).
✓ ARG-ANNOT (Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation) est un
nouvel outil qui a été créé pour détecter les gènes de résistance aux
antibiotiques existants et supposés nouveaux dans les génomes
bactériens. ARG-ANNOT utilise un programme de dynamitage local
dans le logiciel Bio-Edit qui permet à l'utilisateur d'analyser des
séquences sans interface web (Gupta et al., 2013).
✓ CARD (The Comprehensive Antibiotic Resistance Database)
représente une collection rigoureusement conservée de déterminants
de la résistance connus et d'antibiotiques associés, organisée par
l'Antibiotic Resistance Ontology (ARO) et les modèles de détection
des gènes de la résistance aux antibiotiques RAM (Jia et al., 2016).
• Annotation des facteurs de virulence et des prophages

La recherche des facteurs de virulence a été réalisée par

VirulenceFinder-2.0 (Joensen et al., 2014) qui assure l'identification et le
typage rapides et précis des agents pathogènes qui sont essentiels à une
surveillance efficace et à la détection des éclosions.

55 | P a g e
 Matériel et méthodes

L’annotation des phages a été réalisée par PHAge Search Tool

Enhanced Release (PHASTER) (Zhou et al., 2011; Arndt et al., 2016) qui
est un serveur web conçu pour identifier, annoter et afficher
graphiquement de manière rapide et précise des séquences de prophages au
sein de chromosomes bactériens ou de plasmides.

• Annotation des éléments génétiques mobiles

Chez les bactéries, les gènes de résistance aux antibiotiques sont

portés par le chromosome et le plasmide, structures génétiques capables de
se répliquer et de se transmettre aux cellules filles. Ces supports génétiques
sont souvent associés à des éléments génétiques mobiles capables de
mobiliser les gènes de résistance soit au niveau intracellulaire (les
transposons, les séquences d'insertion ou les cassettes des intégrons) ou
intercellulaire (les plasmides conjugatifs et mobilisables ou les éléments
intégratifs conjugatifs ICE).

La recherche d'éléments génétiques mobiles a été effectuée à l'aide du

logiciel en ligne OriTfinder (Li et al., 2018), qui détecte les sites d'origine
du transfert de l'ADN (oriT), ainsi que les relaxases.

ICEfinder (Liu et al., 2019) est un autre logiciel en ligne qui

recherche les éléments intégratifs conjugatifs ICE.

56 | P a g e
Résultats et discussion

57
 Résultats et discussion

La majorité de nos connaissances actuelles sur la diversité des BL

d'Algérie dérive principalement d’une approche de microbiologie classique
reposant sur la quantification de flores par dénombrement sur milieux plus
ou moins sélectifs, suivie de l'isolement et l'identification phénotypique
d'isolats. C’est ainsi que la population microbienne endogène de différents
produits artisanaux algériens (lait et ces dérivés, viande et végétaux) a été
décrite, montrant que de nombreux genres (Lactococcus, Enterococcus,
Streptococcus, Leuconostoc et Lactobacillus) sont présents simultanément
dans ces produits (Zadi-Karam, 1998; Kacem et al., 2003; Roudj et al.,
2005; Lazreg et al., 2015)

Le groupe de BL colonisent aussi le tractus gastro-intestinal des

mammifères, et peuvent être utilisées en tant que probiotiques pour
rééquilibrer la composition du microbiote intestinal (Touret et al., 2018;
Peres et al., 2012). Un travail d'isolement de BL à partir de Jéjunum et
des fèces de rat a été entamé au laboratoire. Cette étude a permis
l'isolement et l’identification de souches dont certaines sont multi-
résistantes aux antibiotiques.

Isolement et purification des BL

Dans ce travail, nous avons utilisé des BL du souchier du Laboratoire

de Biologie des Microorganismes et Biotechnologie (LBMB) de l'Université
d’Oran, isolées de différents produits (tableau 3).

Les 49 souches de BL de la collection du laboratoire LBMB ont été

revivifiées. Parmi elles, 27 sont sous forme de bâtonnets et 22 sous forme
de cocci.

Les souches sont codées : CHM (8 souches isolées de lait cru de

chamelle de Mauritanie), LVK (8 souches isolées de lait cru de vache d’El-
Kerma), CHTD (3 souches isolées de lait cru de chamelle de Tindouf), BH
(4 souches isolées de lait cru de chamelle d’Illizi), GHB (2 souches isolées
de « Ghers » de Biskra), CHT (10 souches isolées de lait cru de chamelle
de Tindouf), LV (2 souches isolées de lben d’Oran), V (5 souches isolées de

58 | P a g e
 Résultats et discussion

viande bovine fraiche de Mostaganem) et enfin les souches H3, J3, OV5 et
BO2 isolées respectivement de « Hamoum » (Rélizane), Jéjunum de poulet
(Jijel), Olive (Sig) et Beurre (Oran). Le tableau 3 montre l’origine,
l’identification et désignation de ces bactéries.

Tableau 3: Origine, identification et désignation BLa du souchier du

laboratoire de LBMB de l'Université d’Oran

C ode de la souche Origine Identifiée à

CHM9, CHM11, CHM12, CHM16, Lait cru de chamelle
CHM17, CHM18, CHM19, CHM20 (Mauritanie)
Lactobacillus spp.
LVK9, LVK11, LVK12, LVK13, LVK14, Lait cru de vache (El-
LVK15, LVK29, LVK30, LVK31, LVK32 Kerma)
Lait cru de chamelle
CHTD26, CHTD27, CHTD29
(Tindouf) Lactobacillus brevis
BH21
Lait cru de chamelle
BH14, BH15 Lactobacillus plantarum
(Illizi)
BH16 Lactobacillus bavaricus
H3 Hamoum (Rélizane) Lactobacillus acidophilus
J3 Jéjunum de poulet Lactobacillus helveticus
GHB15, GHB20 Ghers (Biskra) Enterococcus spp
Lactococcus lactis subsp
OV5 Olive (Sig)
diacetylactis
Lactococcus lactis subsp
BO2 Beurre (Oran)
lactis
CHT5 Lactococcus lactis
CHT3, CHT16, CHT19, CHT22, CHT24, Lait cru de chamelle
CHT25, CHT26, CHT27, CHT28, (Tindouf) Enterococcus faecalis
CHT29
LV4, LV12 Leben (Oran) Lactococcus lactis subsp
V2, V11, V17, V26-2 lactis
Viande bovine fraiche
Lactococcus lactis subsp
V18 (Mostaganem)
cremoris
a
Toutes les bactéries sont Gram positif et catalase négative.

Nous avons aussi isolé des BL à partir de 25 échantillons de laits de

vaches et de chamelles, de camembert, de Jben, de jéjunum et de fèces de
rat (tableau 4). Comme nous l’avons indiqué plus haut dans le chapitre
des méthodes, les cultures bactériennes sont cultivées sur milieu solide
59 | P a g e
 Résultats et discussion

M17 ou MRS. Après 48 heures d'incubation, nous avons examiné les boîtes
de Petri puis prélevé au hasard 4 à 5 colonies ce qui permet une bonne
discrimination des espèces présentes.

Tableau 4: Origine et désignation des 241 isolatsa bactériens

Nb d’isolats
Echantillon Région Nb d’éch Code
Coque Bacille
Saida 02 10 15 LVS
Lait de vache (I) Bechar 01 7 0 LVB
Chlef 03 18 8 LVC
EL Bayad 01 8 3 MCE
Lait de chamelle (I) Bechar 01 9 4 MCB
Naama 02 12 6 MCN
Camembert (I) Tizi ouzou 02 28 7 CB
Jben (I) Saida 01 11 9 JB
Jéjunum (II) Saida 03 22 16 JP
Fèces (III) - 16 47 00 FA
a
Toutes les bactéries sont Gram positif et catalase négative ; Nb : nombre ; éch :
échantillon.

Afin de déterminer si les bactéries appartiennent au groupe BL, nous

avons utilisé les critères classiques suivants :

• Observation macroscopique : qui révèle la taille, la forme,

l'apparence et la couleur des colonies.
• Observation microscopique après coloration de Gram : qui révèle le
Gram, la morphologie et le mode d'association des cellules
bactériennes. Les BL sont à Gram positif.
• Recherche de l'activité catalasique : dans le but d'éliminer les
bactéries catalase positives car les BL sont catalase négative.

Pendant cette étape d'isolement de BL, nous avons remarqué la

présence de levures dans presque toutes les boîtes de M17 ou de MRS.
Celles-ci ont été systématiquement exclues de notre étude.

La plupart des colonies bactériennes d'un diamètre d'environ 1 mm

sur le milieu Ml7 ou de 2 mm sur les MRS, de couleur blanchâtre ou
laiteuse, semi-bombées, à surface lisse et à pourtour circulaire régulier ont

60 | P a g e
 Résultats et discussion

été prélevées puis cultivées en milieu liquide M17 ou MRS selon leur
provenance.

Lors de la purification des bactéries (après coloration de Gram et test

de la catalase), nous avons sélectionné 241 isolats présentant les
caractéristiques décrites dans la littérature pour les BL, c'est-à-dire des
bactéries à Gram positif, catalase négative, sous forme cocci ou bâtonnet
disposés par paires ou en chaîne.

Comme le montre le tableau 4, les isolats bactériens sont désignés

par un code composé de lettres et de chiffres : (LVS, LVB, LVC) et
(MCE, MCM, MCB), provenant respectivement de vaches et de chamelles
; (CB) de camembert ; (JB) de jben ; (JP) de jéjunum et enfin (FA) des
excréments. Quelques exemples d'aspect des colonies en milieu solide sont
montrés dans la figure 9. Les isolats purs sont ensuite conservés à +4 °C
en gélose inclinée M17 ou MRS.

Figure 9: Aspect des colonies bactériennes sur milieu Ml7 solide de LVS2
(Lactococcus spp)

Pré-identification des BL

Pour déterminer le genre des isolats, nous avons utilisé les critères
morphologiques et biochimiques décrits dans la littérature pour les 12
groupes de BL. Ces critères sont présentés dans les tableaux 31 et 32
(annexe 3).

61 | P a g e
 Résultats et discussion

Comme décrit dans la section "Revue de la littérature", le groupe des

BL contient plusieurs genres distincts. Ces genres sont : Carnobacterium,
Lactobacillus, Aerococcus, Enterococcus, Lactococcus, Vagococcus,
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus et
Weissella.

Rappelons que tous les isolats étaient à Gram positif, catalase

négative et en forme de coques ou des bâtonnets disposés en paires ou en
chaînes plus ou moins longues. Ce résultat exclu la présence des trois
genres Aerococcus, Pediococcus et Tetragenococcus car les cellules de ces
derniers se disposent en tétrades.

En plus de ces tests basés sur la morphologie bactérienne, nous avons

utilisé d'autres tests physiologiques et biochimiques pour déterminer le
genre de nos isolats.

Ces tests sont :

• La croissance dans des conditions hostiles : c'est-à-dire le test de

croissance des bactéries en présence de 6,5% de NaCl, à 45 °C, à pH
9,6 et le test de thermorésistance. Ceci nous a permis de différencier les
lactocoques des entérocoques. Tous les coques qui se développent dans
de telles conditions sont des entérocoques (Devriese et al., 1995). La
figure 10 montre des exemples de cultures bactériennes de 18 heures
d'incubation à 45 °C en milieu liquide ; de cultures en présence de
6,5% NaCl ou de cultures à pH 9,6.
• La réduction du Bleu de méthylène nous a également permis de
différencier entre les lactocoques, les entérocoques et les streptocoques.
Les lactocoques réduisent le bleu de méthylène à 0.3% avec coagulation
et les Entérocoques à 0.1%, en revanche les streptocoques thermophiles
sont sensibles à ce colorant. La figure 11 montre des exemples de
cultures bactériennes de 18 heures en présence de 0,1% et 0,3% de bleu
de méthylène.

62 | P a g e
 Résultats et discussion

• L'étude du type fermentaire nous a permis de distinguer les coques

lactiques "homofermentaires" des coques lactiques
"hétérofermentaires" (Leuconostoc), d'une part, et d'autre part, entre
lactobacilles hétérofermentaires obligatoires et lactobacilles
homofermentaire obligatoires. Cependant ce test ne permet pas de
différencier les lactobacilles hétérofermentaires facultatifs (Kandler,
1986).

à gauche au milieu à droite

Cultures à 45 °C Cultures à 6.5 % NaCl Cultures à 45 °C
Tube 1 : Témoins (milieu M17) Tube 1 : Témoins (milieu Tube 1 : Témoins (milieu
Tube 2 : Lactococcus spp M17) MRS)
(LVS2) Tube 2 : E. faecium (LVB2) Tube 2 : E. faecium (JP19)

Figure 10: Aspect des cultures bactériennes en milieu liquide.

1 2 3
1 2 3
à droite
à gauche
Cultures à 0,3% bleu de méthylène
Cultures à 0,1% bleu de méthylène
Tube 1 : Témoins (lait écrémé)
Tube 1 : Témoins (lait écrémé)
Tube 2 : Streptococcus spp (CB13)
Tube 2 : Streptococcus spp (CB13)
Tube 3 : E. faecium (CB3)
Tube 3 : E. faecium (CB3)

Figure 11: Cultures bactériennes en présence de 0,1% et 0,3% de

bleu de méthylène.

63 | P a g e
 Résultats et discussion

La figure 12 montre des exemples de cultures bactériennes de 18

heures d'incubation à 30 °C en milieu liquide muni d’une cloche de
Durham.

1 2
Cultures sur milieu MRS
Tube 1 : L. acidophilus (CB21) (homofermentaire)
Tube 2 : Leuconostoc spp (CB5) (hétérofermentaire)

Figure 12: Type fermentaire des cultures bactériennes en milieu liquide

Caractéristiques des BL isolées à partir d'échantillons

de laits (I)

Les laits de vache et de chamelle que nous avons collectés (10

échantillons au total) avaient l'apparence décrite par Van Es (1975),
Sandström (1983) et Farah (1993). Ils sont de couleur blanchâtre, opaques,
et le pH est proche de la neutralité (pH 7) pour tous les échantillons.

Les tableaux 33-36 (annexe 4) montrent les résultats de la

caractérisation physiologique et biochimique des différents isolats du lait.

Isolats provenant du lait de vache

Un total de 58 isolats ont été isolés et purifiés à partir de 6

échantillons de lait de vache. Ces échantillons sont codés : LVS (25
isolats) pour ceux isolés de la wilaya de Saida, LVB (7 isolats) pour ceux
isolés de la wilaya de Bechar et enfin LVC (26 isolats) pour ceux isolés de
la wilaya de Chlef.

Parmi les 10 coques isolées du lait de vache de la wilaya de Saida :

- 4 isolats homofermentaires, croissent à pH 9,6, à 45 °C, en présence

de 6,5% NaCl, en présence de 0,1% de bleu de méthylène et sont
64 | P a g e
 Résultats et discussion

thermorésistants. Ceci conduit à la pré-identification de ces bactéries au

genre Enterococcus spp.

- 5 isolats ne sont pas résistants à 6,5% de NaCl, produisent ou non

de l'arginine dihydrolase (ADH), se développent en présence de 0,1 et
0,3% de bleu de méthylène. Ces critères nous amènent à pré-identifier ces
bactéries au genre Lactococcus spp.

- 3 isolats se développent à 45°C, en présence de NaCl à 4% mais pas

à 6,5%, hétérofermentaires, ADH négatif. Ces résultats nous amènent à
pré-identifier ces bactéries au genre Leuconostoc spp.

- L’isolat LVS23, sous forme de cocci disposé en chaînettes,

homofermentaire, ADH négatif, pousse à 45 °C mais pas en présence de
6,5% NaCl est incapable de réduire le bleu de méthylène à 0,1% et à 0,3%.
Ces résultats nous conduisent à pré-identifier cette bactérie à l'espèce
Streptococcus thermophilus.

Parmi les bacilles :

Les 4 isolats bacilles sont homofermentaires ; 11 isolats sont

hétérofermentaires ne poussent ni en présence de 6,5 % NaCl ni à 45 °C et
un isolat (LVS22) résiste à la température de 45 °C. Comme nous l'avons
signalé précédemment, pour ces lactobacilles, contrairement aux
lactocoques, les tests utilisés ne nous permettent pas une pré-identification
aussi précise, Leur identification repose essentiellement sur la fermentation
des sucres.

Les isolats provenant de lait collecté de la wilaya de Bechar se

répartit en 7 coques.

- 4 isolats sont ADH négatifs, homofermentaire, ne poussent ni à

45°C ni en présence de 6,5% en NaCl, poussent en présence de 0,1 et 0,3%
de bleu de méthylène. Ces bactéries sont pré-identifiées au genre
Lactococcus spp.

- Un isolat (LVB2) sous forme de cocci, homofermentaire pousse à

pH 9,6, à 45 °C, en présence de 6,5% NaCl, en présence de 0,1% de bleu de
65 | P a g e
 Résultats et discussion

méthylène. Ceci conduit à pré-identifier cette bactérie au genre

Enterococcus spp.

- Un autre isolat (LVB4) sous forme de cocci pousse à 45 °C, en

présence de 4% NaCl mais pas à 6,5%, hétérofermentaire, ADH négatif.
Ces résultats nous conduisent à pré-identifier cette bactérie au genre
Leuconostoc spp.

Les isolats provenant de lait collecté de la wilaya de Chlef se

répartissent en 18 coques et 8 bacilles.

Parmi les coques :

- 8 isolats sont ADH négatifs, homofermentaires, ne poussent ni à 45

°C ni en présence de 6,5 % NaCl, poussent en présence de 0,1 et 0,3% de
bleu de méthylène. Ces bactéries sont pré-identifiées au genre Lactococcus
spp.

- 5 isolats sous forme de cocci, homofermentaires, poussent en

présence de 6,5%, NaCl et à pH 9,6, à 45 °C et en présence de 0,1% de
bleu de méthylène. Ces isolats sont pré-identifiés au genre Enterococcus
spp.

- 3 isolats sous forme de cocci disposés en chaînettes,

homofermentaires, ADH négatif, poussent à 45 °C mais pas en présence de
6,5% NaCl, de plus, ils sont incapables de réduire le bleu de méthylène à
0,1% et à 0,3%. Ces résultats nous conduisent à pré-identifier ces bactéries
à l’espèce Streptococcus thermophilus.

- 3 isolats sous forme de cocci poussent à 45 °C, en présence de 4%

NaCl mais pas à 6,5%, hétérofermentaire, ADH négatif. Ces résultats nous
conduisent à pré-identifier ces bactéries au genre Leuconostoc spp.

Parmi les 7 bacilles :

- 5 isolats bacilles sont hétérofermentaire, ne poussent ni en présence

de 6,5 % NaCl ni à 45 °C, un isolat (LVC22) hétérofermentaire pousse en

66 | P a g e
 Résultats et discussion

présence de 6,5% de NaCl et un autre (LVC25) résiste à la température de

45 °C. Ces isolats ont été pré-identifiés au genre Lactobacillus ssp.

Isolats provenant du lait de chamelles

Sur un total de 43 isolats, 11 étaient isolés à de l’échantillon collecté

d’El Bayad (codés MCE) et 24 étaient isolés de 2 échantillons de Naama
(codés MCN) et 13 étaient isolés à de l’échantillon collecté de Bechar
(codés MCB).

Parmi les 11 isolats obtenus du lait de chamelles de la région d'El

Bayad, 8 se présentent sous forme de coques et 3 sous forme de bâtonnets.

Parmi les coques :

- 5 sont pré-identifiés à Lactococcus spp.

- 2 sont pré-identifiés à Enterococcus spp.

- 1 est pré-identifié à Leuconostoc spp.

Parmi les bâtonnets :

- 2 isolats sont hétérofermentaires et 1 homofermentaires. Ils sont

pré-identifiés au genre Lactobacillus ssp.

Parmi les 13 isolats obtenus du lait de chamelles de la wilaya de

Bechar, 9 se présentent sous la forme de coques et 4 sous la forme de
bâtonnets.

Parmi les 9 isolats en forme de coques (MCB) obtenus du lait de

chamelles de Bechar nous avons distingué :

- 5 isolats sont pré-identifiés à Lactococcus spp.

- 3 sont pré-identifiés à Enterococcus spp.

- 2 pré-identifiés à Streptococcus spp.

Parmi les bâtonnets :

- Les 4 isolats bacilles sont homofermentaires, ADH positifs, ne

poussent ni à 6,5 de NaCl ni à 45 °C. Ils sont pré-identifiés au genre
Lactobacillus spp.

67 | P a g e
 Résultats et discussion

A partir de 2 échantillons de laits de chamelles de Naama nous avons

obtenu 12 isolats sous forme de coques disposés en pairs ou en chaînettes
plus ou moins longues et 6 isolats sous forme de bâtonnets.

Parmi les 12 isolats de forme cocci :

7 isolats sont pré-identifiés à Lactococcus spp car ils sont

homofermentaires et ADH positifs ou négatifs. Tous les isolats ne poussent
pas en présence de 6,5% NaCl. Deux isolats sont atypiques (MCN2,
MCN8) parce qu'ils ne réduisent pas le bleu de méthylène à 0,3%.

3 isolats sont homofermentaires, ADH négatifs, poussent à 45°C, à

pH 9,6 et à 6,5% de NaCl. Ces microorganismes sont pré-identifiés à
Enterococcus spp.

2 isolats sont hétérofermentaires, poussent à 45°C, en présence de 4%

NaCl mais pas à 6,5%, ADH négatif. Ces résultats nous conduisent à pré-
identifier ces bactéries au genre Leuconostoc spp.

Les 6 isolats de forme bâtonnets sont pré-identifiés au genre Lactobacillus

spp.

Isolats provenant des échantillons de fromages (I)

Nous avons isolé au total 56 isolats à partir de fromages algériens, le

premier est un camembert fabriqué industriellement à partir de lait cru de
vaches et le second est un Jben fabriqué traditionnellement à partir de lait
de chèvre. Les tableaux 37, 38 (annexe 4) montrent les résultats de la
caractérisation physiologique et biochimique des différents isolats.

Isolats provenant du camembert

Un total de 35 isolats codés CB ont été isolés et purifiés à partir de 2

échantillons de camembert. 28 étaient sous forme cocci et 7 sous forme
bâtonnets.

Parmi les coques :

68 | P a g e
 Résultats et discussion

- 13 sont pré-identifiés à Lactococcus spp. Parmi eux, 5 sont

atypiques (CB7, CB15, CB19, CB20 et CB35) car ils poussent à 6,5 %
NaCl.

- 7 sont pré-identifiés à Enterococcus spp ; 4 sont pré-identifiés à

Leuconostoc spp ;

- 4 sont pré-identifiés à Streptococcus spp.

Les 7 isolats de forme bâtonnets sont pré-identifiés au genre

Lactobacillus spp.

Isolats provenant du Jben

Un nombre 19 isolats dont 10 cocci et 9 bâtonnets ont été isolés à

partir du fromage traditionnel Jben. Ces isolats ont été codés par les
lettres JB.

Parmi les coques nous avons recensé :

- 6 isolats cocci disposés en paires (diplocoques) ou en chaines

(streptodiplocoques) qui présentent les caractéristiques du genre
Lactococcus spp (homofermentaires, ne poussent ni à 45 °C ni en présence
de 6,5 % NaCl, réduisent le bleu de méthylène à 0,1 et 0,3%).

- 4 isolats qui présentent les caractéristiques du genre Enterococcus

spp (homofermentaires, thermorésistants, ADH positifs, poussent à 45 °C,
à pH 9,6 et à 6,5% de NaCl et réduisent le bleu de méthylène à 0,1).

Toutes les bactéries de forme bâtonnets (9 isolats) se disposent en

chaînes plus ou moins longues. Elles sont homofermentaires mésophiles à
ADH variable ce qui caractérise le genre Lactobacillus.

Isolats du jéjunum de poules (II)

Au cours de la purification des bactéries isolées à partir de 3

échantillons de jéjunum de poules, 38 isolats étaient retenus comme étant
des BL. Ces derniers sont codés JP.

69 | P a g e
 Résultats et discussion

Les résultats obtenus pour les caractéristiques physiologiques et

biochimiques des différents isolats sont représentés dans les tableaux 39,
40 (annexe 4).

Sur les 38 isolats nous avons dénombré 22 coques et 16 bacilles.

Parmi les coques :

- 14 isolats présentent les caractéristiques du genre Enterococcus spp

(homofermentaires, thermorésistants, ADH négatifs, poussent à 45 °C, à
pH 9,6 et à 6,5% de NaCl et réduisent le bleu de méthylène à 0,1).

- 07 isolats présentent les caractéristiques du genre Streptococcus

spp, ils sont sous forme de cocci disposé en chaînettes, homofermentaire,
ADH négatif, ne poussent pas en présence de 6,5% NaCl, de plus, ils sont
incapables de réduire le bleu de méthylène à 0,1% et à 0,3%.

- 01 isolat est pré-identifié à Lactococcus spp car il est

homofermentaire, ADH négatifs, ne pousse pas en présence de 6,5% NaCl
et capable de réduire le bleu de méthylène à 0,1% et 0,3%.

Les 16 isolats de forme bâtonnets sont pré-identifiés au genre

Lactobacillus spp.

Isolats de fèces de rat (III)

Au total, 47 isolats codés FA ont été isolés et purifiés à partir de 16

échantillons de fèces de rats traités à l'ampicilline. Tous les isolats
sélectionnés appartiennent au genre Enterococcus spp (homofermentaires,
thermorésistants, ADH positifs, poussent à 45 °C, à pH 9,6 et à 6,5% de
NaCl et réduisent le bleu de méthylène à 0,1).

Les autres genres ont été systématiquement exclus dans cette partie
d’étude.

Rappelons, qu'au cours de la présente étude nous essayons de

déterminer l’antibiorésistance des souches de BL. Pour vérifier une telle
incidence nous avons voulu préciser la caractérisation des souches en les

70 | P a g e
 Résultats et discussion

soumettant à un test d’antibiogramme et de CMI envers les antibiotiques

intrinsèquement sensibles.

Nous avons identifié de souches présentant un profil de résistance à

plusieurs antibiotiques dont au moins l'ampicilline, l'imipenème, la
tétracycline et/ou la bacitracine, en utilisant des galeries physiologiques et
biochimiques API 50CH ou API 20STREP.

Pour les souches présentant une forte résistance à l’ampicilline

(CMI≥128 µg/mL), l’identification était faite par séquençage de l’ADNr
16S ou par Maldi-Tof.

Identification phénotypique des bactéries

La pré-identification des souches peut être affinée en utilisant des

micro-méthodes adaptées aux microorganismes étudiés. Celles que nous
avons choisies font intervenir deux kits miniaturisés (galeries biochimiques
API 20STREP et API 50CH), commercialisés par Biomerieux, (France),
élaborés pour identifier des BL en cours de croissance. L'identification est
faite en comparant les profils obtenus avec ceux des souches de références
du fournisseur (à l'aide du logiciel d’identification Probabilistic
Identification of Bacteria For Windows, PIBwin ou utilisant le site web
https://lab.upbm.org).

Par ces méthodes nous avons établi les profils fermentaires de 39

souches lactiques (annexe 4) incluant : E. faecalis (n=10), E.
faecium (n=12), E. hirae (n=1), Lc. lactis ssp lactis (n=3), Lc. lactis ssp
cremoris (n=1), L. plantarum (n=4), L. brevis (n=4), L.
acidophilus (n=2), L. casei (n=2) et L. helveticus (n=1).

Identification à l’aide de galeries API 20STREP

La figure 12 montre un exemple de résultats pour une souche

Enterococcus spp (FA13).

71 | P a g e
 Résultats et discussion

Figure 13: Aspect de la galerie API 20 Strep inoculée par la souche FA12 après
24 h d’incubation à 30°C.

Les résultats biochimiques obtenus à partir de l’inoculation des

galeries API 20 STREP ont été remplis dans la grille des résultats du
PIBWin (figure 14).

Figure 14: Capture d’écran de l’affichage de grille d’identification de la

souche FA12 par le PIBWin
Une fois la grille d’identification remplie, en cliquant sur l’onglet
Identification, le programme va faire la comparaison des résultats obtenus
pour la souche FA12 avec les résultats de l’étude statistique contenus dans
la matrice API 20 STREP (figure 15), par la suite s’affiche les résultats de
l’interprétation heuristique du profil biochimique de la galerie. Le
programme suggère que la souche FA12 est une souche d’Enterococcus
faecium avec un score d’identification de 99,99% (figure 15). Les tests
ESC négatif dans 99% des cas, α GAL positif dans 42% des cas et βGUR
positif dans 1 % des cas sont considérés comme des résultats inattendus
pour cette souche.

72 | P a g e
 Résultats et discussion

Figure 15: Capture d’écran de l’affichage de l’onglet d’identification de la

souche FA12 par PIBWin.
Identification à l’aide de galeries API 50CH

Nous avons identifié les bactéries au niveau de l'espèce et parfois de

la sous-espèce en établissant leur profil de fermentation à l'aide de galeries
biochimiques API 50CH. La fermentation des hydrates de carbone
entraîne une acidification qui se traduit par un changement de couleur de
l'indicateur. Les résultats obtenus permettent l'identification des souches
testées.

Un exemple de profils fermentaires est donné dans la figure 16 pour

Lactobacillus spp (LVC15).

Une fois la grille d’identification remplie, le site d’identification va

faire la comparaison des résultats obtenus pour la souche LVC15 avec les
résultats de l’étude statistique contenus dans la matrice API 50CH, par la
suite s’affichent les résultats de l’interprétation heuristique du profile
biochimique de la galerie.

Le programme indique que la souche LVC15 est une souche de

Lactobacillus brevis avec un score d’identification de 100% (figure 17).

73 | P a g e
 Résultats et discussion

Figure 16: Aspect de la galerie API Figure 17: Captures d'écran de l'affichage
50CH inoculée par la souche LVC15 de la grille d'identification de la souche
après 24 h d’incubation à 30°C. LVC15 sur site d’identification UBPM

Identification moléculaire des bactéries

L’identification des bactéries a été approfondie en utilisant des

méthodes moléculaires adaptées aux microorganismes étudiés. Celles que
nous avons choisies fait intervenir deux méthodes d’identification par
séquençage de l’ADNr 16S ou par Maldi-TOF.

Identification par séquençage de l’ADNr 16S

Une comparaison des séquences du gène de l'ARNr 16S des deux

isolats FA4, FA8 identifiées par rapport à la base de données (nr/nt) a été
effectuée à l'aide de la méthode BLAST (Zoetendal et al., 2008). Les
isolats étaient plus proches aux espèces E. faecium avec un pourcentage de
similitude des séquences des gènes de 99%. L'alignement de séquences
multiples des séquences homologues et le gène ARNr 16S des souches
d'essai a été réalisé à l'aide de ClustalW (Thompson et al., 1994). L’arbre

74 | P a g e
 Résultats et discussion

phylogénétique (figure 17) était reconstruit en utilisant la matrice de

distance (neighbor-joining) dans la version du logiciel MEGA 7 (Kumar et
al., 2016) (figure 18) (numéros d'accession MH384833, MH388025,
respectivement).

Enterococcus faecium DSM 20477 CLG 10001872

Enterococcus lactis BT159 GU983697
Enterococcus faecium TR5LBMB MH388025 (FA8)
Enterococcus faecium TR1LBMB MH384833 (FA4)
Enterococcus canis NBRC 100695 BCQJ01000024
Enterococcus durans NBRC 100479 BCQB01000108
Enterococcus hirae ATCC 9790 CP003504
Enterococcus ratti DSM 15687 JXLB01000051
Enterococcus villorum ATCC 700913 AJAN01000023
Enterococcus thailandicus DSM 21767 JXLE01000039
Enterococcus sanguinicola SS-1729 AY321376
Enterococcus phoeniculicola ATCC BAA-412 AJAT01000017
Enterococcus pseudoavium NCFB 2138 Y18356
Enterococcus avium ATCC 14025 KE136366
Enterococcus gilvus ATCC BAA-350 AJDQ01000009

0.002
Figure 16: Cladogramme, utilisant une la matrice de distance (neighbor-joining) de
séquences de gènes d'ADNr 16S sélectionnés du genre Enterococcus, obtenus à partir
de BLAST hits, montrant les relations entre les souches FA4, FA8 et certains
membres représentatifs étroitement liés.

Identification par Maldi-TOF

Une analyse des protéines a été réalisée à l'aide d'un spectromètre

Microflex (Bruker Daltonics, Leipzig, Allemagne) Laser-désorption /
ionisation à temps de vol (MALDI-TOF) MS assistée par une matrice
comme décrit avant. Trois dépôts distincts ont été réalisés pour les isolats
FA3, FA4 et JP3. Les spectres ont été importés dans le logiciel du MALDI
Biotyper (version 2.0, Bruker) et analysés par le modèle standard

75 | P a g e
 Résultats et discussion

correspondant (avec les paramètres par défaut) contre les spectres de la

base de données de références Biotyper.

L’interprétation des scores établis par Bruker Daltonics est la suivante :

• pour l’isolat FA3, les scores obtenus est de 2, 177 avec E. avium
DSM 20063 DSM., suggérant que notre isolat est membre de cette
espèce.
• Pour l’isolat FA4, les scores obtenus est de 2, 340 avec E. faecium
DSM 17050 DSM., suggérant que notre isolat est membre de cette
espèce.
• Pour l’isolat JP3, les scores obtenus est de 2, 319 avec E. hirae
DSM 20160T DSM., suggérant que notre isolat est membre de cette
espèce. Le spectre de masse de l’isolat JP3 est présenté dans la
figure 19.
Intens. [a.u.]

4427.104

8000

6000

7974.457

5354.035

4000

3985.640

6845.016

6325.483
6052.481
2000

10071.537

2671.691
3508.841 9550.765

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000

m/z

Figure 17: Spectre de masse obtenu par MALDI-TOF/MS pour l’isolat JP3.

76 | P a g e
 Résultats et discussion

Profils de sensibilité de BL aux antibiotiques (I-II)

Après pré-identification des isolats, nous avons étudié la résistance

aux antibiotiques des souches en déterminant leurs profils de
sensibilité/résistance par des méthodes phénotypiques utilisant la méthode
de diffusion des disques en milieu solide (Antibiogramme) et par la
méthode de dilution en bouillon et en milieu gélosé (CMI).

Ces tests de sensibilités sont réalisés selon les recommandations du

CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI, 2012).

Antibiogramme

L’antibiogramme a été réalisé pour les souches de BL vis-à-vis de

plusieurs antibiotiques appartenant à différentes familles. La mesure du
diamètre des zones d’inhibition de chaque souche pour chacun des
antibiotiques testés permet de caractériser les souches comme étant
sensibles ou résistantes. Un exemple d’antibiogramme est montré dans la
figure 20.

CN

AZM

DA

Figure 18: Antibiogramme de la souche Lactococcus spp (LVS15).

C N : Gentamycine ; C : Chloramphénicol ; A ZM : Azithromycine ; D A : Clindamycine ;

E : Erythromycine.

77 | P a g e
 Résultats et discussion

Selon les résultats de l'antibiogramme de 241 souches de BL isolées

dans les études I et II, nous avons calculé les taux de résistance aux
différents antibiotiques (figure 21). Sur la base de ce résultat, nous avons
constaté que les souches de BL testées dans cette étude présentaient une
résistance considérable à la famille des β-lactamines, en particulier aux
céphalosporines dont la céfalexine, la céftazidime avec un taux de
résistance qui dépasse 96%. La résistance intrinsèque de BL aux
céphalosporines a été signalée dans plusieurs études (Katla et al., 2001;
Temmerman et al., 2003; Ammor et al., 2007; Gueimonde et al., 2013;
Sharma et al., 2017), à titre d’exemple la résistance chez Lactobacillus et
certaines espèces de Lactococcus peut s'expliquer par la présence des
pompes à efflux (Sharma et al., 2017) ou associée à l'imperméabilité de la
paroi cellulaire (Delgado et al., 2005).

98,34
100 96,68

90

80
71,78 70,95
70
Taux de résistance

61,41
58,51
60
54,77

48,55
50
42,74

40 36,1
34,02

30
24,07 24,07
22,41

20 17,43

10,37 11,62
7,88
10

0
CL CAZ IPM AX P AMP K GN T B SP RA FOS DA AZM E C L

Antibiotiques

Figure 19: Taux de résistances de BL aux différents antibiotiques.

CL (Céfalexine) ; CAZ (Céftazidime) ; IPM (Imipenème) ;AX (amoxicilline) ; P (Pénicilline) ;
AMP (ampicilline) ; K (kanamycine) ; GN (gentamycine) ; T (tétracycline) ; B (bacitracine) ; SP
(spiramycine) ; RA (rifampicine) ; FOS (fosfomycine) ; DA (clindamycine) ; AZM (azithromycine) ;
E (érythromycine) ; C (chloramphénicol) ; L (lincomycine).

78 | P a g e
 Résultats et discussion

La résistance de BL aux autres antibiotiques de la famille des β-

lactamines est à la fosfomycine était variable en fonction de l'antibiotique
testé, les taux de résistance étaient les suivants : ampicilline (54,77%),
amoxicilline (58,51%), pénicilline (61,41%), (42,74%) imipenème et 48,55%
pour la fosfomycine. Selon la littérature, Lactobacillus, Lactococcus et
Leuconostoc sont généralement faiblement résistants à ces antibiotiques
(Herrero et al., 1996; Rahmeh et al., 2019), bien que la résistance soit
variable pour le genre Streptococcus (Katla et al., 2001; Aslim & Beyatli,
2004). Chez Enterococcus, plusieurs études ont montré que la résistance
aux antibiotiques β-lactamines est due à la présence d'un PBP particulier
(pbp5) ayant une faible affinité pour les antibiotiques β-lactamines
(Cattoir & Leclercq, 2012; Lozano & Torres, 2017), cependant la résistance
à la fosfomycine a été signalée comme étant répandue parmi les souches de
E. faecium (Ou & Nadeau, 2017).

Pour les aminoglycosides, les BL isolées ont montré une résistance à

un niveau supérieur à 70% à la gentamycine et à la kanamycine. La
résistance naturelle des BL à ces antibiotiques a également été signalée
dans plusieurs études (Charteris et al., 1998; Coppola et al., 2005; Zhou et
al., 2005; Yerlikaya, 2019). Cette résistance peut être attribuée au manque
d'absorption et de pénétration de l'antibiotique dans la bactérie. Une
association avec un antibiotique qui inhibe la synthèse de la paroi
bactérienne (β-lactamine) rétablit leur efficacité et permet un effet
synergique (Ammor et al., 2007).

La résistance aux autres classes d'antibiotiques était plus ou moins

prononcée. Les taux enregistrés étaient les suivants : tétracycline 34,02% ;
spiramycine 24,07% ; rifampicine 10,37% ; bacitracine 36,10 ; clindamycine
11,62% ; azithromycine 22,41% ; érythromycine 24,07 ; chloramphénicol
7,88% et lincomycine 17,43%. Ces résultats sont cohérents avec plusieurs
études qui ont montré la faible résistance des BL à la rifampicines,
bacitracine et aussi aux inhibiteurs de la synthèse des protéines tels que
chloramphénicol, érythromycine, azithromycine, clindamycine,

79 | P a g e
 Résultats et discussion

lincomycine, spiramycine et tétracycline (Katla et al., 2001; Temmerman

et al., 2003; Devirgiliis et al., 2013; Erginkaya et al., 2018).

Analyse statistique multivariée : Analyse en

composantes principales et regroupement hiérarchique des
résistances aux antibiotiques

Comme analyse statistique des résultats obtenus nous avons mis en

œuvre l'analyse en composantes principales (ACP) et le regroupement
hiérarchique pour identifier les genres de BL les plus résistants aux
antibiotiques ainsi que les origines de l'isolement qui semblent être les
sources les plus riches de bactéries résistantes aux antibiotiques.

Pour ce faire, la résistance aux antibiotiques de 241 souches de BL

isolées de différents produits dans les études I et II a été examinée par
rapport au genre de BL (tableau 5) et par rapport à l’origine d’isolement
(tableau 6). Comme on peut le voir dans le tableau 5, les BL sont
regroupées en cinq groupes selon le genre bactérien : Lactobacillus (n=95),
Lactococcus (n=62), Enterococcus (n=54), Streptococcus (n=17) et
Leuconostoc (n=13). D'autre part, dans le tableau 6, les résultats ont été
organisé en fonction de l’origine d’isolement: lait de vache (n=70), lait de
chamelle (n=68), jben (n=19), camembert (n=35), jéjunum (n=35) et un
dernier groupe (n=10) comprend des souches isolées de l’o live (n=1), du
beurre (n=1), du Ghers (n=2) et du Hamoum (n=1).

Identification des genres de BL les plus résistants

aux antibiotiques

Les principaux antibiotiques auxquels les différents genres de BL

résistent ont été identifiés à partir de l'ACP et du regroupement
hiérarchique. À titre d'exemple, la figure 22 montre les résultats de
l'analyse des données en fonction du genre bactérien. La figure 22 BL
projette les antibiotiques sur l'espace F1-F2, et la figure 23 montre les
résultats de leur classification hiérarchique.

80 | P a g e
 Résultats et discussion

Tableau 5: Profil de résistance aux antibiotiques de BL selon les genres

Nb CL CAZ IP M AX P AM P K GN T B SP RA FOS DA A ZM E C L

Lactobacillus 95 98.95 98.95 40.00 62.11 60.00 57.89 71.58 70.53 26.32 37.89 20.00 9.47 46.32 0.00 13.68 13.68 1.05 12.63
Lactococcus 62 95.16 98.39 16.13 54.84 48.39 41.94 51.61 51.61 19.35 27.42 11.29 16.13 30.65 3.23 6.45 4.84 0.00 4.84
Enterococcus 54 100 100 100 64.81 75.93 59.26 100 100 62.96 46.30 18.52 9.26 59.25 48.15 33.33 37.04 33.33 40.74
Streptococcus 17 100 100 5.88 64.71 64.71 58.82 100 100 29.41 23.53 0.00 5.88 100 0.00 0.00 0.00 0.00 5.88
Leuconostoc 13 84.62 84.62 0.00 30.77 38.46 30.77 15.38 7.69 0.00 38.46 0.00 0.00 30.77 0.00 0.00 0.00 0.00 7.69

Total 241 96.68 98.34 42.74 58.51 61.41 54.77 71.78 70.95 34.02 36.10 24.07 10.37 48.55 11.62 22.41 24.07 7.88 17.43

Tableau 6: Profil de résistance aux antibiotiques de BL en fonction de l’origine d’isolement

Nb CL CAZ IP M AX P AM P K GN T B SP RA FOS DA A ZM E C L

Lait de vache 70 92.86 97.14 38.57 84.29 71.43 78.57 68.57 67.14 37.14 80.00 31.43 15.71 78.57 5.71 30.00 34.29 8.57 21.43
Lait de
68 98.53 98.53 30.88 23.53 22.06 20.59 60.29 60.29 16.18 20.59 14.71 8.82 17.65 11.76 0.00 2.94 2.94 16.18
chamelle
Jben 19 100.00 100.00 31.58 47.37 100.00 36.84 89.47 84.21 10.53 5.26 10.53 10.53 21.05 21.05 0.00 0.00 0.00 0.00
Camembert 35 100.00 100.00 40.00 62.86 74.29 62.86 51.43 51.43 40.00 17.14 8.57 5.71 25.71 2.86 17.14 14.29 8.57 11.43

Jéjunum 39 94.87 97.44 84.62 76.92 87.18 74.36 100.00 100.00 58.97 23.08 48.72 0.00 84.62 23.08 64.10 64.10 17.95 25.64

Autres 10 100 100 20 50 40 50 100 100 60 10 20 40 40 20 20 20 10 20

Total 241 96.68 98.34 42.74 58.51 61.41 54.77 71.78 70.95 34.02 36.10 24.07 10.37 48.55 11.62 22.41 24.07 7.88 17.43

N b : nombre de souches ; C L : Céfalexine ; C A Z : Céftazidime ; IP M : Imipenème ; A X : Amoxicilline; P : Pénicilline ; A M P :

Ampicilline; K : Kanamycine ; G N : Gentamycine ; T : Tétracycline ; B : Bacitracine ; SP : Spiramycine ; R A : Rifampicine ; FOS :
Fosfomycine ; D A : Clindamycine ; A ZM : Azithromycine ; E: Erythromycine ; C : Chloramphénicol ; L: Lincomycine.

81 | P a g e
 Résultats et discussion

Biplot (axes F1 and F2: 93.75 %)

6
Enterococcus

2 IPM GN
K Streptococcus
F2 (10.17 %)

AZM
Lactobacillus
0 DA
C L SP E FOS P
RA AMP AX CAZ
B CL

-2 Lactococcus

-4

Leuconostoc

-6
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

F1 (83.58 %)

Figure 20: Projections des antibiotiques sur l'espace F1-F2 sur la base de la
résistance des genres à ces antibiotiques.

Figure 21: Regroupement hiérarchique des antibiotiques sur la base de leurs

projections en figure 22.
Comme le montre la figure 22, la céfalexine (CL), la céftazidime
(CAZ), La kanamycine (K) et la gentamycine (GN) se distinguent des

82 | P a g e
 Résultats et discussion

autres antibiotiques par le fait que tous les genres ont montré une forte
résistance à ces antibiotiques. Alors que d'autres antibiotiques sont
regroupés dans la figure 22 en raison de leur similitude en matière de
résistance par les genres bactérien, ils peuvent être identifiés dans la figure
23 grâce à une illustration hiérarchique détaillée de la similitude des
antibiotiques présentant une résistance aux différents genres. Les lignes du
dendrogramme de la figure 23 indiquent les groupes d'antibiotiques
regroupés dans la figure 22. En particulier, l’amoxicilline (AX), la
pénicilline (P), l’ampicilline (AMP) et la fosfomycine (FOS) sont
regroupés dans la figure 22. Ils se trouvent dans la même branche de
l'arbre hiérarchique de la figure 23. De même, la céfalexine (CL) et la
céftazidime (CAZ), ainsi que la kanamycine (K) et la gentamycine (GN)
sont regroupés dans la figure 22. Les genres qui ressortent comme les plus
résistants de l'analyse de l'ACP et du regroupement hiérarchique pour les
dix-huit antibiotiques sont aussi présentés par le degré de corrélation dans
la figure 22.

On peut constater que:

• Lactobacillus, Lactococcus et Streptococcus ont résisté de la même

manière aux antibiotiques, y compris la céfalexine (CL) la
céftazidime (CAZ) où il existe une forte corrélation entre ces trois
genres, comme le montre l'ongle réduit formé entre les vecteurs des
trois genres ;
• Leuconostoc est le seul genre qui ne présente pas de forte résistance
à la clindamycine (DA), la rifampicine (RA) et le chloramphénicol
(C), il a une faible corrélation aux autres genres ; il est à part des
autres dans le plan négatif de l'axe F2 (figure 22) ;
• Enterococcus est le seul genre ayant une résistance élevée à
l’imipenème (IPM), la kanamycine (K) et la gentamycine (GN) ; il
présente une faible corrélation aux autres genres et se trouve dans le
sens positif des deux axes.

83 | P a g e
 Résultats et discussion

Selon ces résultats, on constate que le genre Enterococcus est le plus

résistant aux différents antibiotiques par rapport aux autres genres de
bactéries lactiques.

Identification des sources d'isolement présentant

les BL les plus résistantes aux antibiotiques

La résistance des BL aux antibiotiques examinée selon l’origine de la

source d’isolement a également été précisée à partir de l'ACP et du
regroupement hiérarchique. La projection des antibiotiques sur l'espace
F1-F2 et le degré de corrélation entre les origines sont illustrés dans la
figure 24, tandis que le regroupement hiérarchique des antibiotiques est
montré dans la figure 25. Les antibiotiques : céfalexine (CL), céftazidime
(CAZ), kanamycine (K) et gentamycine (GN) se distinguent des autres
antibiotiques par le fait que toutes les bactéries isolées de différentes
origines ont montré une forte résistance. Ces antibiotiques sont localisés
séparément dans une seule branche dans la figure 25. Alors que d'autres
antibiotiques sont regroupés en raison de leur similitude en terme de
résistance par rapport à l’origine d’isolement des BL, comme par exemple
l’amoxicilline (AX), la pénicilline (P), l’ampicilline (AMP) et la
fosfomycine (FOS) qui sont regroupés dans la figure 24 et se trouvent dans
la même branche de l'arbre hiérarchique dans la figure 25. Les sources qui
semblent les plus riches en BL résistantes aux antibiotiques sont
déterminées par l'analyse ACP, le regroupement hiérarchique des
antibiotiques et aussi par le degré de corrélation entre les origines (figure
25).

On peut constater que :

• Les BL issues de camembert et de jben ont résisté de la même

manière aux antibiotiques, y compris la céfalexine (CL) la
céftazidime (CAZ) et cela est présenté dans la figure 24, où l'on peut
voir qu’il y a une corrélation positif entre ces deux origines ;

84 | P a g e
 Résultats et discussion

• Les BL issues de lait de chamelle et les BL issues du groupe

« Autres » ne montrent pas de forte résistance aux différents
antibiotiques dont la fosfomycine (FOS), l’amoxicilline (AX),
l’ampicilline (AMP) et la pénicilline (P). Elles ont une forte
corrélation mais elles sont disposés séparément des autres origines
dans le plan négatif de l'axe F2 (figure 24) ;

• Les BL issues de lait de vache et jéjunum sont les seules présentant

une résistance élevée aux antibiotiques dont la fosfomycine (FOS),
l’amoxicilline (AX), l’ampicilline (AMP) et la pénicilline (P), elles
sont corrélées positivement dans le sens positif des deux axes.

Biplot (axes F1 and F2: 88.30 %)

5
Lait de vache
4
Jéjunum
3

2
FOS
Camembert
1 B AX
F2 (8.18 %)

E
AZM IPM AMP P

0
L SP
C T CAZ
DA K GN
-1 RA
CL

Jben
-2

-3
Lait de chamelle
-4 Autres

-5
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
F1 (80.12 %)

Figure 22: Projections des antibiotiques sur l'espace F1-F2 basées sur la
résistance des BL en fonction de leur origine d'isolement.

85 | P a g e
 Résultats et discussion

Figure 23: Regroupement hiérarchique des antibiotiques sur la base

de leurs projections en figure 24.

À la lumière de ces résultats, il est clair que le lait de vache et le

jéjunum de poulets représentent les biotopes les plus riches en BL
résistantes aux antibiotiques et cela pourrait être associé à l'utilisation
intensive et extensive de ces antibiotiques en médecine vétérinaire. À titre
d'exemple, dans l'élevage des animaux, une gamme très variée
d’antibiotiques est utilisée par les éleveurs pour lutter contre diverses
maladies et améliorer le rendement de leurs productions (Thomson et al.,
2008; Regula et al., 2009; Pardon et al., 2012). Les antibiotiques les plus
utilisés en élevage des bovins et de poulets de chair sont les tétracyclines,
les pénicillines et les céphalosporines administrés par voie parentérale aux
bovins et par voie orale aux poulets de chair (Reybroeck, 2010).
L'utilisation abusive de ces antibiotiques par les éleveurs et les vétérinaires
ainsi que le non-respect des délais d’attente après le traitement des
animaux conduisent à la présence de résidus d’antibiotiques dans le lait et
les autres denrées d’origine animale (Aning et al., 2007), ce qui favorise
sans doute la sélection et la croissance de bactéries résistantes, y compris
les BL.

86 | P a g e
 Résultats et discussion

Mesures de la concentration minimale inhibitrice

(CMI)

La CMI est la plus faible concentration d’antibiotique qui inhibe la

croissance bactérienne. La résistance ou la sensibilité des bactéries est
définie en fonction des valeurs de CMI fixées par le CLSI (CLSI, 2012;
CLSI, 2016) et FEEDAP (EFSA, 2012) (annexe 5).

Dans notre travail, l'étude de la CMI est réalisée selon deux

méthodes, la première sur un milieu solide, et la seconde sur un milieu
liquide. Un exemple des résultats obtenus de chaque méthode est présenté
dans les figures 25 et 26.

0.125µg/mL 0.250µg/mL

Figure 24: Détermination de la CMI des souches de BL vis-à-vis de

l’oxytétracycline par la méthode de dilution en milieu solide.
La CMI de l'oxytétracycline pour CB12, CB13, CB14 et CB24 est de 0,250µ/mL.

0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16

Figure 25: Détermination de la CMI de la vancomycine (µg/mL) pour la

souche FA4 par la méthode de dilution en bouillon.

87 | P a g e
 Résultats et discussion

La CMI de 5 antibiotiques a été estimée pour 241 souches de BL

isolées à partir de différents biotopes dans l’étude I et II. Les tableaux 7 à
11 montrent la distribution des CMI des genres de BL et les taux de
résistance (résistance et résistance intermédiaire) calculés sur la base du
nombre de souches résistantes déterminé par les valeurs fixées par le CLSI
et la FEEDAP par rapport au nombre total.

Tableau 7: Distribution des CMI pour le genre Lactobacillus (n=95).

Nombre de Lactobacillus ayant les CMI suivantes (μg/mL) CMI (CLSI)

%R
Antibiotique 0.25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥265 (μg/mL)

Ampicilline 4 7 10 14 18 17 13 9 3 63.16 ≤8
Pénicilline 4 5 13 19 17 14 11 7 5 56.84 ≤8
Gentamicine 6 2 14 16 57 93.68 ≤ 4 - 8 - ≥ 16

Oxytétracycline 10 11 15 19 10 2 14 10 4 42.11 ≤8
Vancomycine 2 12 15 4 1 10 7 12 13 19 65.26 ≤ 2 4-8 ≥ 16

Tableau 8: Distribution des CMI pour le genre Lactococcus (n=62).

Nombre de Lactococcus ayant les CMI suivantes (μg/mL) CMI

%R (FEEDAP)
Antibiotique 0.25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥265
(μg/mL)

Ampicilline 13 5 14 8 4 8 9 1 48.39 2

Pénicilline 9 10 9 7 10 11 5 1 43.55 4
Gentamicine 5 20 6 7 8 16 59.68 32
Oxytétracycline 13 16 2 13 8 1 4 5 29.03 4

Vancomycine 15 12 16 9 1 4 2 3 16.12 4

Tableau 9: Distribution des CMI pour le genre Enterococcus (n=54).

Nombre d’Enterococcus ayant les CMI suivantes (μg/mL) CMI (CLSI)

%R
Antibiotique 0.25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥265 (μg/mL)

Ampicilline 5 9 4 12 16 8 66.67 ≤8 - ≥16

Pénicilline 3 6 11 2 5 2 14 11 46.30 ≤8 - ≥16

Gentamicine 2 2 10 27 13 96.30 32
Oxytétracycline 6 9 8 1 9 12 1 4 4 55.56 ≤4 8 ≥16
Vancomycine 7 12 8 10 1 3 6 7 31.48 ≤4 8-16 ≥32

88 | P a g e
 Résultats et discussion

Tableau 10: Distribution des CMI pour le genre Streptococcus (n=17).

Nombre de Streptococcus ayant les CMI suivantes (μg/mL) CMI (CLSI)

%R
Antibiotique 0.12 0.25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥265 (μg/mL)
Ampicilline 7 4 6 58.82 ≤0,25
Pénicilline 7 4 1 2 1 2 58.82 ≤0,12
Gentamicine 15 2 100 32
Oxytétracycline 5 2 2 3 4 1 47.06 ≤2
Vancomycine 7 4 3 2 1 17.65 ≤1

Tableau 11: Distribution des CMI pour le genre Leuconostoc (n=13).

Nombre de Leuconostoc ayant les CMI suivantes (μg/mL) CMI (CLSI)
%R
Antibiotique 0.12 0.25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥265 (μg/mL)

Ampicilline 2 2 1 3 3 2 38.46 ≤8
Pénicilline 4 2 3 3 1 30.77 ≤8

Gentamicine 3 6 2 2 30.77 ≤ 0,5

Oxytétracycline 2 4 1 4 2 0.00 8

Vancomycine 3 10 100

Selon ces résultats, les profils de résistance aux antibiotiques de

Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus et Leuconostoc
sont légèrement différents. En effet, la plupart des genres ont exprimé une
résistance aux antibiotiques β-lactamines et aux aminoglycosides, à
l’exception de Leuconostoc qui semble être le moins résistant. Les CMI les
plus élevées pour l’ampicilline, la pénicilline et la gentamycine ont été
exprimées par les genres Lactobacillus Lactococcus et Enterococcus (≥ 64
μg/mL). L'imperméabilité de la paroi cellulaire semble être le principal
mécanisme de résistance, étant donné que les bactéries lactiques ne
disposent pas d'un transport d'électrons à médiation cytochrome (Condon,
1983). Il convient de noter que les valeurs de CMI pour l'ampicilline et la
pénicilline semblent être élevées par rapport à ce qui a été rapporté dans
la littérature, par exemple, les valeurs de CMI pour Lactococcus se situent
généralement entre 2 et 8 µg/mL, tandis que pour Lactobacillus, les
valeurs de CMI se situent entre 0,5 et 8 µg/mL. (Danielsen & Wind, 2003;
Florez et al., 2005; Rojo-Bezares et al., 2006; Gad et al., 2014).

89 | P a g e
 Résultats et discussion

Leuconostoc, Lactobacillus et Enterococcus étaient résistants à de

fortes concentrations de vancomycine (CMI ≥ 256 mg/mL), tandis que
Lactococcus et Streptococcus étaient faiblement résistants (CMI ≤ 32
mg/mL). La résistance de Lactobacillus et de Leuconostoc à la
vancomycine peut être due à la présence de D-Ala-D-Lac en tant que
dipeptide normal de leur peptidoglycane auquel la vancomycine ne se lie
pas (Handwerger et al., 1994; Klein et al., 2000). Cependant la résistance à
la vancomycine chez Enterococcus est due à la synthèse de précurseurs
modifiés de la paroi cellulaire (codés par les gènes van) ayant une faible
affinité pour les glycopeptides (Lozano & Torres, 2017).

À l'exception de la vancomycine, les CMI des antibiotiques affectant

la synthèse des protéines comme l’oxytétracycline ont montré la plus
grande variation entre les différents genres, la plupart des souches étaient
clairement sensibles, bien que quelques souches modérément à fortement
résistantes aient été observées. Katla et al., (2001), Temmerman et al.,
(2003), Ammor et al., (2007) et plusieurs chercheurs ont montré la
sensibilité des bactéries lactiques aux antibiotiques qui inhibent la
synthèse des protéines tels que l’oxytétracycline. La résistance à la famille
des tétracyclines peut être attribuée à l'acquisition de gènes de résistance
tet par la médiation de plasmides conjugatifs (Hummel et al., 2007;
Thumu & Halami, 2012).

Nos résultats montrent que presque toutes les souches lactiques

testées dans le cadre de cette étude présentent une forte résistance à la
plupart des antibiotiques, la cause étant vraisemblablement liée à la sur-
utilisation d'antibiotiques dans l'élevage en Algérie, ce qui a exercé une
pression de sélection sur les bactéries résistantes, y compris les bactéries
lactiques. Une étude approfondie de Titouche, et al (2013) a montré une
forte présence de résidus d'antibiotiques dans le lait cru produit dans la
région de Freha (Tizi-Ouzou), avec 80 échantillons positifs (46,78%). La
plupart d'entre eux contenaient la pénicilline et/ou la tétracycline

90 | P a g e
 Résultats et discussion

(88,75%), suivis par les macrolides et/ou l'aminoglycoside (12,5%). En

revanche, les sulfamides n'étaient présents que dans 5% des cas positifs.

Détection phénotypique des mécanismes de résistance

aux β-lactamines

Durant la recherche de β-lactamases nous n’avons trouvé aucun

résultat montrant une image de synergie entre le C3G et l'acide
clavulanique, ce qui reflète l'absence de production d'une β-lactamase à
spectre étendu (BLSE). La même remarque est faite pour le test de Hodge
où toutes les souches testées étaient négatives et ne possèdent pas de
carbapénémases conférant une résistance à l'imipéneme. Un tel résultat a
été rapporté dans les travaux de Fontana et al. (1996) et Ono et al.
(2005), qui ont montré que la résistance aux β-lactamines est le résultat
d'une surproduction de PBP plutôt que de la production de β-lactamases.

Effet de l'ampicilline sur l'équilibre écologique du

microbiote intestinal du rat (III)

Il est reconnu que l'utilisation d'antibiotiques dans la production

animale exerce une pression de sélection qui favorise l'émergence et la
propagation de bactéries résistantes, dont les entérocoques. Cette pression
de sélection s’exerce au niveau du microbiote intestinal des animaux.
L’administration d'antibiotiques aux animaux a pour conséquence la
présence de résidus dans les tissus et les aliments produits par ces animaux
(Wassenaar, 2005). Le non-respect des conditions d'utilisation des
antibiotiques (dosage et délais d'attente) ou à des erreurs d'élevage peut
avoir de graves conséquences sur la santé des consommateurs, en
favorisant la sélection de bactéries commensales résistantes et constituent
à leur tour un réservoir de gènes de résistance potentiellement
transférables à des bactéries pathogènes (Idowu et al., 2010; Hsieh et al.,
2011).

L'étude de l'impact des antibiotiques sur le microbiote intestinal de

l'hôte est importante pour améliorer le traitement contre les maladies

91 | P a g e
 Résultats et discussion

infectieuses, mais pour des raisons éthiques, les interactions « antibiotiques

– microbes » sont très complexes à étudier chez l'homme et les recherches
ont donc été basées sur des analyses du microbiote fécal (Karimaei et al.,
2016). Il est donc aussi important de développer une meilleure
compréhension du microbiote intestinal chez des animaux de laboratoire,
afin de pouvoir étudier l'interaction microbienne de l'hôte avec un niveau
de contrôle expérimental qui n'est pas réalisable dans les études humaines
(Kostic et al., 2013; Flemer et al., 2017). Les rats sont les meilleurs
modèles utilisés pour les études du microbiote intestinal humain, en raison
de leurs nombreuses similitudes avec le tube digestif humain,
principalement la ressemblance dans la composition du microbiote gastro-
intestinal (Nguyen et al., 2015; Flemer et al., 2017).

Nous avons étudié l'impact de l'administration orale d'ampicilline sur

le microbiote entérocoque chez les rats pendant et après le traitement en
explorant les relations entre le niveau des entérocoques résistants à
l’ampicilline, la distribution des espèces d'entérocoques, la détermination
des CMI d'ampicilline des isolats d'entérocoques et la mesure par RP-
HPLC de l'ampicilline non absorbée dans les fèces de rats.

Evaluation de la résistance des entérocoques à

l’ampicilline

Les entérocoques présumés dans les échantillons de matières fécales

ont été dénombrés par numération sur gélose Slanetz et Burtely. Les
pourcentages moyens d’Enterococcus spp résistants à l'ampicilline pour
chaque groupe de traitement sont indiqués à la figure 27. Le pourcentage
moyen des entérocoques résistants variait de 0,9% à 18% avant
l'administration d'ampicilline. Au premier jour de traitement, il est passé à
35%. Aux jours 3 et 7, le niveau de résistance dépassait 64% dans tous les
groupes traités. Par contre, le niveau de résistance dans le groupe témoin
est demeuré inférieur à 19% en tout temps. Les animaux traités ont
excrété des pourcentages significativement plus élevés d'entérocoques

92 | P a g e
 Résultats et discussion

résistants que le groupe témoin (P ≤ 0,05) pendant le traitement et après

le traitement.

80

70

60

50
%

40

30

20

10

0
0 1 3 5 7 11 15
Temps (jour)

Figure 26: Pourcentages d’Enterococcus spp résistant à l'ampicilline

pour chaque groupe.

Les pourcentages ont été calculés à partir des numérations totales d’Enterococcus spp en
l'absence ou en présence d'ampicilline (16µg/mL). (■) Pourcentages d’Enterococcus spp
résistants à l'ampicilline dans le groupe des rats traités, (▲) Pourcentages
d’Enterococcus spp résistants à l'ampicilline dans le groupe témoin.

Distribution des espèces d'entérocoques

La répartition des espèces d'entérocoques est montrée dans la figure

28. Au total, 47 isolats d'entérocoques ont été obtenus à partir de fèces de
rats traités. Les isolats d’entérocoques étaient E. faecium (53,19%), suivi
de E. faecalis (23,40%), E. hirae (14,89%) et E. avium (8,51%).

E.faecalis
23,40%

E.faecium
E.avium
53,19%
8,51%

E.hirae
14,89%

Figure 27: Répartition des espèces d’Enterococcus isolées de fèces de rats traités
par ampicilline

93 | P a g e
 Résultats et discussion

Le nombre et le taux d'isolats d'entérocoques avant et après

l'administration d'ampicilline sont indiqués dans le tableau 12. Avant le
traitement, une grande variété d'espèces d'entérocoques a été identifiée
parmi les isolats sélectionnés au hasard. Les espèces prédominantes étaient
E. faecium (36,36%), E. faecalis (27,27%), E. hirae et E. avium (18,18%).
Après le début du traitement, le taux d’E. faecium a augmenté
régulièrement, de 50%, 58,33% et 66,66% au jour 3, 5 et 7 respectivement.
En revanche, les taux des autres espèces de Enterococcus (E. faecalis, E.
hirae et E. avium) étaient variables et restaient inférieurs à 35% pour la
plupart des espèces.

Tableau 12: Taux d'entérocoques isolés avant et après 3, 5 et 7 jours de

traitement par l'ampicilline à 20 mg/kg.

Nombre d'isolats d'entérocoques à une CMI (μg/mL) %

d’isolats
Jour 0.25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥265
résistants

0 1 4 2 2 2 36,36

3 1 3 2 2 4 50

5 1 2 2 2 4 1 58,33

7 2 1 1 2 5 1 66,66

Détermination de la concentration minimale

inhibitrice d’ampicilline

Le taux d'entérocoques résistants était de 36,36% avant

l'administration d'ampicilline (tableau 13). Dès le début du traitement, le
niveau de résistance atteignait 50% au jour 3, puis 58,33% et 66,66%,
respectivement aux jours 5 et 7 du traitement. Seuls les isolats d’E.
faecium étaient très résistants à l'ampicilline (CMI≥32 µg/mL), tandis que
E. faecalis, E. hirae et E. avium étaient sensibles avec une CMI≤8 μg/ mL
(figure 30).

Les CMI de l'ampicilline pour tous les isolats d’E. faecium étaient de
32 à 64 μg/mL, à l'exception de deux souches. Elles se sont révélées très

94 | P a g e
 Résultats et discussion

résistantes (CMI≥128 μg/mL), par rapport aux autres membres d'E.

faecium (CMI≤64 μg/ mL).

Tableau 13: Distribution des CMI d'ampicilline (μg/mL) et niveau de résistance

chez les Enterococcus spp aux jours 0, 3, 5 et 7 du traitement.

Jour E. faecium E. hirae E. avium E. faecalis Total

0 4 (36,36) 2 (18,18) 2 (18,18) 3 (27,27) n=11

3 6 (50) 2 (16,66) 0 (0) 4 (33,33) n=12

5 7 (58,33) 2 (16,66) 1 (8,33) 2 (16,66) n=12

7 8 (66,66) 1 (8,33) 1 (8,33) 2 (16,66) n=12

Day 0 Day 3
2,5 4,5
4
2 3,5
Strains number

Strains number

3
1,5
2,5
2
1
1,5
0,5 1
0,5
0 0
0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥265 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥265
Ampicillin (µg/mL) Ampicillin (µg/mL)

E. faecium E. hirae E. faecalis E. avium E. faecium E. hirae E. faecalis E. avium

Day 5 Day 7
4,5 6
4
5
3,5
Strains number

Strains number

3 4
2,5
3
2
1,5 2
1
1
0,5
0 0
0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥265 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 ≥265
Ampicillin (µg/mL) Ampicillin (µg/mL)

E. faecium E. hirae E. faecalis E. avium E. faecium E. hirae E. faecalis E. avium

Figure 28: Distribution des CMI d'ampicilline (μg/mL) parmi E. faecium,

E. hirae, E. faecalis et E. avium isolés aux jours 0, 3, 5 et 7 du traitement.

95 | P a g e
 Résultats et discussion

Mesure des résidus d'ampicilline dans les

échantillons fécaux par analyse RP-HPLC

L’analyse chromatographique a montré que le temps de rétention de

l'ampicilline était de 8,5 min (figure 31). La courbe d'étalonnage a été
construite en traçant la concentration en fonction du rapport de l'aire du
pic. La courbe d'étalonnage est linéaire et est illustrée à la figure 32. La
quantité d'ampicilline présente dans l'échantillon a été calculée par la
courbe d'étalonnage standard.

Les rapports de pic de surface du médicament par rapport à la

concentration sont linéaires. Les résultats sont exprimés en analyse de
régression linéaire selon la méthode des moindres carrés. Les rapports de
des pics des surfaces de l'ampicilline par rapport à la concentration sont
linéaires et les résultats sont exprimés dans le tableau 14.

100

9
Absorbance at 280nm (mAU)

8
0
Ampicilline
7
0

6
0

5
0

4
0

3
0

2
0

1
0

0,0 2,5 5,0 7,5 10, 12, 15, 17, 20, 22, Time (min)
0 5 0 5 0 5

Figure 29: Chromatogrammes RP-HPLC de fèces de rats.

96 | P a g e
 Résultats et discussion

Tableau 14: Données d'étalonnage de la méthode.

Concentration Surface de pic

(μg/mL)
1,56 58926
3,12 146844
6,25 686106
12,5 917607
25 1535809
50 2579425

L'équation de régression de la concentration d'ampicilline par

rapport à son rapport de surface de pic s'est avérée être Y = 50347X +
161439 (r = 0,9676) où Y est le rapport de pic de surface et X est la
concentration d'ampicilline (figure 32).

3000000
y = 50347x + 161439
R² = 0,9676
2500000

2000000

1500000

1000000

500000

0
0 10 20 30 40 50 60

Figure 30: Concentration d'ampicilline.

Y = 50347X + 161439 (r=0,9676) où Y est le rapport de pic de surface et X est la concentration
d'ampicilline.

Au jour 1 du traitement, la quantification de l'ampicilline dans les

selles était de 5,15 μg/g. Cette valeur a été progressivement augmentée
jusqu'à être maximale au jour 5 du traitement avec une valeur de 40,44
μg/g. Après le jour 6 (arrêt du traitement) ces valeurs ont chuté à
respectivement 5,56 μg/g et 0,73 μg/g (figure 33) au 11ème et 15ème jour.

97 | P a g e
 Résultats et discussion

45 40,44
40
33,01
35
Concentration µg/g

30

25

20

15

10 5,54
5,15 5,56

5 0,73
0
0
0 1 3 5 7 11 15
Temps (jour)

Figure 31: Mesures moyennes de l'ampicilline par RP-HPLC dans les fèces des
rats traités par l'ampicilline 16 µg/mL

Les données présentées dans cette partie de l'étude permettent de

mieux comprendre l'effet de l'administration orale d'ampicilline qui
favorise une augmentation importante du niveau de résistance à
l'ampicilline dans le microbiote fécal pendant le traitement et après le
traitement.

Nos résultats montrent que l'administration orale d'ampicilline sur la

population d'entérocoques dans l'intestin conduit à l'accumulation
progressive des niveaux élevés d'ampicilline non absorbée dans les fèces.
Ces résultats concordent avec ceux d'études antérieures montrant que
l'absorption de β-lactamines après administration orale est largement
incomplète (Agerso & Friis, 1998; Jensen et al., 2004; Kung et al., 1995;
Welling, 1989). De plus, en raison de la recirculation entérohépatique,
l'ampicilline peut être éliminée sur de longues périodes. C'est à la suite de
ces conditions que la pression sélective peut être exercée directement sur le
microbiote, ce qui entraîne une augmentation significative et beaucoup
plus facile du nombre de souches d’Enterococcus résistantes à l'ampicilline
déjà présentes en tant que clones minoritaires chez les rats. Nous avons
également montré que le traitement de 7 jours à l'ampicilline est associé à
une excrétion élevée de E. faecium intrinsèquement relativement résistante

98 | P a g e
 Résultats et discussion

à l'ampicilline par rapport aux autres streptocoques (Fontana et al., 1994;

Murray, 1998; Shah et al., 2018). Cela suggère que l'antibiothérapie a aidé
E. faecium à s'établir plus efficacement dans le tractus gastro-intestinal, ce
qui a permis à des concentrations plus élevées de persister après le
traitement. Des résultats similaires ont été rapportés par Rice et al,
(2001), qui montrent clairement la relation entre l'exposition aux β-
lactamines et la colonisation gastro-intestinale élevée par E. faecium
résistant à l'ampicilline (Rice et al., 2004). En outre, on a signalé que
l'émergence d'entérocoques résistants à la vancomycine (ERV) a
également été associée entre les déterminants de la résistance à la
vancomycine (chez E. faecium) et la surproduction d'une protéine de
liaison à la pénicilline (PBP) à faible affinité qui diminue l'affinité des
PBP (Fontana et al., 1994; Murray, 1998). Il confère non seulement une
résistance élevée à l'ampicilline, mais aussi à d'autres β-lactames (Rice et
al., 2001). On craint que le traitement par des β-lactamines ne favorise la
colonisation du tractus gastro-intestinal par les ERV, qui agissent souvent
comme réservoirs de gènes de résistance à la vancomycine transmissible
aux bactéries potentiellement pathogènes comme Staphylococcus aureus et
Clostridium difficile, compliquant le traitement des maladies (Ramos et
al., 2012; Walters et al., 2015; Semedo-Lemsaddek et al., 2018).

Nous avons procédé au séquençage du génome entier de la souche E.

faecium FA4 en vue de préciser les déterminants moléculaires impliqués
dans sa résistance aux antibiotiques.

Séquençage haut débit illumina (IV)

Contrôle de qualité de l’ADN génomique

Comme indiqué dans la section "Matériel et méthodes", l'ADN

génomique total de la souche FA4 a été extrait à l'aide du kit bactérien
DNAMITE DNA (Microzone Ltd, UK). La concentration d'ADN
génomique purifié a été mesurée sur Qubit et NanoDrop, les résultats sont
présentés dans le tableau 15.

99 | P a g e
 Résultats et discussion

Tableau 15: Résultats du contrôle de qualité de l'ADN génomique

Echantillon Contrôle qualité entrée de l’échantillon

Kit NanoDrop
Qubit
Nom Date extraction Concentration
(ng/μl) A260/230 A260/280
gDNA (ng/μl)
DNAMITE
Souche
07/07/2017 DNA bacterial 19,6 207,4 2,15 1,62
FA4
de Microzone

Sur Qubit la mesure de la concentration de l’ADN était de 19,6

ng/µL, une valeur soit 11 fois plus moins concentrée que celle donnée par
le NanoDrop (207,46 ng/µL). L’avantage du Qubit par rapport au
NanoDrop est sa spécificité. Les réactifs nécessaires permettent une liaison
spécifique à l'acide nucléique d'intérêt, ce qui signifie que les
concentrations ne sont pas affectées par la présence d'autres contaminants,
contrairement au NanoDrop qui est vulnérable à ce sujet (Koetsier &
Cantor, 2019). Par exemple, l'ADN et l'ARN absorbent tous les deux à
260 nm, donc avoir les deux dans le même échantillon peut surestimer les
lectures de concentration. En plus l'utilisation du NanoDrop nécessite un
nettoyage. Cela peut également avoir un impact sur les résultats si la
machine n'a pas été nettoyée correctement, ce qui peut expliquer pour
notre cas la valeur trop élevée affichée par le NanoDrop.

La mesure de la pureté de l’échantillon par NanoDrop a affiché une

valeur de 2,15 pour le rapport 260/230, ce qui indique l’absence de
contaminations par phénol, EDTA ou sels etc. Cependant le rapport
260/280 a affiché une valeur de 1,62 soit inférieure à la valeur typique de
1,8, ce qui peut donner l’indication d’une contamination probable par des
protéines.

L'utilisation des deux systèmes présente des avantages et des

inconvénients : le Qubit pour des mesures de concentration précises et le
Nanodrop pour des mesures de pureté.

100 | P a g e
 Résultats et discussion

Analyses des données de séquençage

Évaluer la qualité des données brutes issues d'un séquençage haut-

débit est la première étape que nous avons effectuée avant de se lancer
dans des analyses bioinformatiques. Il est important de déterminer, entre
autres (annexe 6):

• le nombre de « reads » (lectures),

• la qualité des reads,
• la longueur des reads,
• une éventuelle contamination
• la présence suspecte d'adaptateurs.

Evaluation de la qualité des données brutes

Les fichiers récupérés sont des séquences brutes issues du séquençage

par la méthode Illumina. Le contrôle de la qualité des reads était réalisé
par le « software » FastQC (Andrews, 2010), les résultats sont résumés
dans le tableau 16 et la figure 34.

Tableau 16: Résultat de la qualité des données brutes.

Mesure Valeur
Nom de fichier FA4.fastq
Encodage Sanger / Illumina 1.9
Total des séquences 2855150
Séquences marquées comme étant 0
de mauvaise qualité
Longueur de séquence 35-301
% GC 39

Le tableau 16 résume les résultats de la qualité des données brutes, il

montre le type de séquençage (illumina) le nombre total des séquences
(2855150), le nombre de séquences de mauvaise qualité (0), la longueur des
séquences (35 et 301) ainsi que le pourcentage de GC (39%).

Le graphique de la figure 34 représente la qualité (score Phred, en

ordonnée) de chaque base (en abscisse) pour tous les reads. À chaque

101 | P a g e
 Résultats et discussion

position du read, la qualité de tous les reads est représentée sous la forme
d'un « boxplot ». La médiane est en rouge. Le code couleur indique les
scores de très bonne qualité en vert, bonne qualité en orange et mauvaise
qualité en rouge. Généralement, la qualité baisse en fin de reads.

Pour notre cas, le « software » a indiqué une bonne qualité des

séquences, mais un nettoyage est nécessaire pour éliminer les bases de
mauvaises qualités situées sur la fin des séquences, ainsi que les séquences
contaminantes comme les « trimmers » des adaptateurs.

Figure 32: Scores de qualité des bases (Sanger/Encodage Illumina 1.9) avant
nettoyage.

Nettoyage des données bruites

Le nettoyage des données brutes de séquençage était réalisé par

Trimmomatic (Bolger et al., 2014) et Fastx-Toolkit (Hannon, 2010). Les
résultats sont présentés dans le tableau 17 et la figure 35.

102 | P a g e
 Résultats et discussion

Tableau 17: Résultat de la qualité des données brutes après nettoyage.

Mesure Valeur
Nom de fichier qual_trim_FA4.fastq
Encodage Sanger / Illumina 1.9
Total des séquences 2398830
Séquences marquées comme étant 0
de mauvaise qualité
Longueur de séquence 34-300
% GC 39

Figure 33: Scores de qualité des bases (Sanger/Encodage Illumina 1.9) après
nettoyage.
Le nettoyage a permis d'éliminer les séquences contaminantes et de
conserver que les séquences de bonnes qualités (2398830). La dernière base
située sur la fin des séquences a été aussi enlevée ce qui a réduit la taille
des séquences d’une base (34-300). La qualité de chaque base est ainsi
augmentée et le « software » a indiqué une très bonne qualité (figure 35).

103 | P a g e
 Résultats et discussion

Le nettoyage des données brutes avant l'assemblage peut conduire à

de bien meilleurs assemblages, car la contamination et les reads sujets aux
erreurs de faible qualité auront été supprimées. Il donne également un
meilleur guide pour le réglage des paramètres d'entrée appropriés pour le
logiciel d'assemblage. Il est important d'effectuer ces étapes sur tous les
fichiers lus car ils peuvent avoir des qualités très différentes.

Résultats de l’assemblage de novo du génome

Dans la plupart des cas, nous avons essayé un ensemble de

paramètres pour chaque software pour optimiser l’assemblage et pour
diminuer les erreurs.

Après l’assemblage nous avons procédé à la construction de scaffolds

(gabarits) qui consiste à ordonner et à orienter les séquences assemblées «
contigs ». L’outil utilisé dans ce travail est le Scaffolder_Builder et qui
permet de construire des scaffolds génomiques de large taille.

Le software Quast 5.0.2 (Gurevich et al., 2013) était utilisé pour

examiner les contigs et les scaffolds et pour évaluer statistiquement la
qualité de l'assemblage. Le fichier journal de Quast 5.0.2 contient des
informations sur tous les assemblages exécutés. A la fin de ce fichier, il y a
beaucoup d'informations concernant l'assemblage final. Cela comprend
certaines données métriques sur les drafts contigs et scaffolds (N50,
longueur maximale de contigs, nombre de contig, etc.) ainsi que les
estimations des longueurs d'insertion pour chaque ensemble de données
final apparié. Les résultats de l’assemblage sont résumés dans le tableau
18.

Le nombre de contigs obtenus par l'assembleur MIRA est de 209, ce

qui est inférieur au nombre de contigs créés par les autres assembleurs. En
plus, pour les contigs ayant une taille supérieure à 1 kb, qui est le seuil
arbitraire de sélection d’un contig de grande taille, MIRA produit plus de
contigs (166) que les autres assembleurs. Le N50 obtenu pour l'assemblage

104 | P a g e
 Résultats et discussion

MIRA est de 94.857 pb, signifiant que la moitié de l'assemblage final de

MIRA se trouve dans des contigs ayant une taille supérieure à 94857 pb.

D'après ces résultats, les contigs et par MIRA sont globalement de

plus grande taille. La taille du plus grand contig est de 320095 pb et celle
du génome total est de 3.071.485 pb avec un contenu de 3585 CDS et un
%GC de 37,97. De plus, après scaffolding des contigs générés par les
différents assembleurs, nous avons trouvé que les contigs de MIRA ont
construit 8 scaffolds seulement, le N50 obtenu pour les scaffolds et de
890.381 pb dont le plus large à une taille de 1180302 bp. En comparant avec

les autres assembleurs, MIRA semble le meilleur assembleur pour cette

analyse. En revanche, l’exécution de MIRA nécessite un temps énorme soit
24 h et 46 mn (1246 mn), un espace libre de 200 GB et une mémoire vive
de 46 Go, ce qui est un peu énorme en se comparant aux autres
assembleurs, ce même problème a été signalé dans plusieurs études
d’assemblage des génomes (Deng et al., 2015) mais la fiabilité de cet
assembleur était toujours remarquable.

Assemblage des reads utilisant un génome de

référence

L’assemblage utilisant un génome de référence consiste en

l'alignement des reads en fonction d'une séquence de génome référence,
construisant une séquence qui est similaire mais pas nécessairement
identique à la séquence du génome de référence. Mais en termes de
complexité et de temps, les assemblages de novo sont plus lents et plus
gourmands en mémoire que les assemblages de mapping. Ceci est
principalement dû au fait que l'algorithme d'assemblage doit comparer
chaque read avec tous les autres reads.

Dans notre étude nous avons utilisé les mappeurs MIRA (Chevreux
et al., 2004) et Geneious (Geneious, 2017) pour un assemblage des reads à
un génome de référence E. faecium DO (accession n° CP003583.1)
disponible et bien annoté dans GenBank.

105 | P a g e
 Résultats et discussion

Tableau 18: Résultats de l'assemblage du génome entier de E. faecium FA4

Contigs Large Longueur GC Nb Temps Large

Assembleur Contigs N50 2 1 Scaffolds N50
>1 Kb contig totale (%) CDS mn Scaffold

MIRA 4.9.6 209 166 320095 3071485 37,97 94857 3585 1 246 8 1180302 890381

Spades 3.11.1 344 116 172295 2768588 37,88 55579 2624 30 11 679031 316635

Velvet 1.2.09 572 255 81071 2690347 37,89 15599 2730 2 12 693.928 282162

Velvet
572 255 81071 2690347 37,89 15599 2730 22,31 12 693928 282162
optimizer 2.2.6

Abyss 4.1 460 232 81733 2825464 37,97 21681 2683 12 13 709133 281352

Megahit 1.1.3 620 164 139376 2753541 37,86 29392 2640 4 13 630031 325049

Ray 2.2.1 895 229 82483 2629985 37,87 15845 2517 146 16 486170 277333

1 : Temps d’exécution de software.

2 : Nombre de CDS estimé utilisant le software Prokka.

106 | P a g e
 Résultats et discussion

Les résultats après évaluation statistique par Quast 5.0.2 (Gurevich

et al., 2013) sont montrés dans le tableau 19.

Tableau 19: Résultats de l’assemblage des reads utilisant un génome référence

Génome Chromosome Plasmide1 Plasmide2 Plasmide3

Longueur 3057227 2701215 66483 253027 4
Couverture
303,46 302,58 103.85 121,17 686,24
moyenne
MIRA %GC 38,2 38,15 34,38 35,89 36,25
Mismatch
8050 5120 533 1927 470
(Ns)
1
HQ (%) 99,73 99,81 99,19 99,23 98,71
Longueur 3052740 2698245 66250 251965 36280
Couverture
93 - - - -
moyenne
Geneious %GC 38,4 38,3 36 35,2 36,28
Mismatch
325228 157321 35510 126738 5659
(Ns)
1
HQ (%) 89,34 94,6 46,4 49,7 84,4

1. HQ : Pourcentage de la séquence référence couverte.

Le mapping à une référence a permis l'assemblage du génome entier

de la souche E. faecium FA4. Sur l'ensemble du génome, le nombre de pb
correspondants trouvés et la qualité de mappage dépendait de l'assembleur
utilisé (tableau 19). L'assembleur le plus performant était MIRA qui a
produit 3057227 pb de très bonne qualité. Le pourcentage de la couverture
HQ était de 99,73% avec un minimum de mismatch soit un pourcentage
de 0,27% (8050 Ns). En revanche le software Geneious a produit un
génome de 3052740 pb mais avec un HQ qui ne dépasse pas 89,34% de
couverture et un nombre de mismatch élevé (325228 Ns) soit 10,66% du
génome entier.

Le software MIRA a généré 4 séquences correspondant à un

chromosome (2701215 pb) et trois plasmides (66483 pb, 253027 pb, 36502
pb). L'évaluation manuelle des résultats de l’assemblage de tous les reads
a révélé que la couverture la plus complète a été obtenue avec MIRA soit
une couverture moyenne estimée de 303,46 X, c’est-à-dire que chaque base
est statistiquement séquencée environ 303 fois, à noter que certaines
107 | P a g e
 Résultats et discussion

régions étaient couvertes par quelques extrémités de reads de qualité

inférieure ou par un seul read de haute qualité ce qui représente la cause
principale de l’apparition des mismatchs pour l’assembleur MIRA. Le
software Geneious a aussi révélé une bonne couverture, la moyenne a été
estimée de 93 X mais nous avons pu identifier plusieurs régions non
couvertes par les reads avec des écarts allant jusqu’à 19637 pb. La qualité
globale de l’assemblage MIRA était considérablement meilleure que celle
produite par Geneious, ce qui a été aussi montré dans l’étude de (Kisand
& Lettieri, 2013).

L’annotation des génomes dans cette étude a été effectuée par deux
annotateurs, le premier est le pipeline automatisé RASTtk (Rapid
Annotation using Subsystem Technology) (Brettin et al., 2015) et le
second est Prokka (Seemann, 2014).

L'annotation originale du génome de référence d’E. faecium DO a été

utilisé pour évaluer l’exactitude des deux annotateurs (tableau 20).

Tableau 20: Comparaison de l'annotation de E. faecium DO accession

CP003583.1

Caractéristiques Référence Rast Prokka

CDS total 3114 3123 2953

Protéine hypothétique 692 748 1198

ARNt 64 64 64

ARNr 18 18 18

En outre le génome de E. faecium FA4 issu du mappeur MIRA a été

aussi réannoté avec ces deux annotateurs (tableau 21).

RAST, comme nous l'avons déjà signalé, est un pipeline entièrement

automatisé d'annotation des génomes bactériens et archéobactéries. Le
pipeline a identifié les gènes qui codent pour les protéines, les ARNr et les
ARNt, il a également attribué des fonctions aux gènes, et a prédit quels
sous-systèmes sont représentés dans le génome comme montré dans la
figure 37. Le génome annoté par RASTtk peut être consulté dans un

108 | P a g e
 Résultats et discussion

environnement qui permet une analyse comparative avec les génomes

annotés conservés dans l'environnement SEED (Aziz et al., 2008). Le
pipeline a mis le génome annoté à disposition dans les 24 heures suivant sa
soumission, de manière générale RASTtk a prédit à partir du génome de
E. faecium DO un ensemble de 3162 CDS dont 748 CDS sont des
protéines hypothétiques, 64 ARNt et 18 ARNr ce qui est très proche à
l’annotation originale.

Prokka par contre est un outil de commande en ligne fonctionnant

sous Linux, il a été conçu pour être à la fois précis et rapide. Prokka a
permet l’annotation complète d’un projet de génome bactérien en environ
3 minutes. Il produit des fichiers de sortie conformes aux normes pour
analyse plus approfondie ou pour une visualisation dans les navigateurs
génomiques (tableau 22). Dans la présente étude Prokka a pu prédire 2988
CDS dont 1198 CDS sont des protéines hypothétiques, 64 ARNt et 18
ARNr à partir du génome d’E. faecium DO.

Tableau 21: Résultats de l'annotation du génome de E. faecium FA4

Génome Chromosome Plasmide 1 Plasmide 2 Plasmide 3

Caractéristiques 3057227 2701215 66483 253027 36502

CDS 3161 2740 92 282 47

RAST Gènes 3244 2821 94 282 47

Protéine 743 616 25 90 12

hypothétique

CDS 2988 2594 81 270 43

Prokka Gènes 3051 2655 83 270 43

Protéine
1238 1031 45 134 28
hypothétique

109 | P a g e
 Résultats et discussion

Figure 34: Capture d’écran de résultats du pipeline RASTtk montrant les gènes
chromosomique liés aux sous-systèmes et leur distribution dans différentes catégories
(chromosome). Les catégories sont extensibles jusqu'au gène spécifique.

Tableau 22: Description des fichiers de sortie Prokka

Suffixe Description du contenu des fichiers

.fna Ficher FASTA des contigs d'entrée originaux (nucléotide)
.faa Fichier FASTA des gènes codants traduits (protéine)
.fsa Séquences Contig pour soumission (nucléotide)
Fichier FASTA de toutes les caractéristiques génomiques
.ffn
(nucléotides)
.tbl Tableau des caractéristiques pour la soumission
.sqn Fichier Sequin éditable pour soumission
.gbk Fichier Genbank contenant des séquences et des annotations
.gff Fichier GFF v3 contenant des séquences et des annotations
.log Fichier journal de la sortie du traitement Prokka
.txt Statistiques de résumé des annotations

Selon ces résultats, le nombre de séquences codantes (CDS) a

clairement diminué lors de l'utilisation de l'annotateur Prokka ; en outre,
l'annotateur Prokka ne pouvait pas identifier la fonction de plus d'un tiers

110 | P a g e
 Résultats et discussion

des CDS puisque le nombre de CDS codant pour des protéines

hypothétiques est élevé par rapport au pipeline RASTtk qui, lui, prévoyait
un nombre considérablement plus élevé de séquences codantes (CDS) que
Prokka avec un nombre minimum de CDS codant pour des protéines
hypothétiques. Cela a été clairement observé en analysant également les
résultats de l'annotation du génome E. faecium FA4 (tableau 21).

Gènes et mécanismes de résistance aux antibiotiques

L'acquisition de mécanismes spécifiques de résistance à différents

antibiotiques, en particulier pour l'espèce E. faecium, a rendu les
infections par ces microorganismes difficiles à traiter (Kristich et al., 2014;
Shiadeh et al., 2019) ; en 10 ans seulement, la résistance aux antibiotiques
s'est répandue rapidement parmi les entérocoques et est devenue une
préoccupation importante pour la santé publique (AARN, 2018; Shiadeh et
al., 2019).

E. faecium FA4 a exprimé une résistance accrue à divers

antibiotiques testés par antibiogramme, notamment l'Imipénem,
l'ampicilline, la pénicilline, la kanamycine, la gentamycine, la doxycycline,
la tétracycline, l'azithromycine, l'érythromycine, le chloramphénicol, la
lincomycine, la fosfomycine. D'autre part, la bactérie a exprimé une
grande sensibilité à la rifampicine. La mesure de la CMI a révélé que E.
faecium FA4 exprimait une forte résistance à l'ampicilline, la pénicilline, la
gentamycine et à l'oxytétracycline (CMI≥256µg/mL), alors que pour la
vancomycine, la CMI ne dépassait pas 2µg/mL.

La recherche de gènes de résistance aux antibiotiques chez E.

faecium FA4 a montré l'existence de plusieurs gènes exprimant la
résistance à différents antibiotiques (tableau 23). Les gènes pris en
considération étaient ceux ayant un pourcentage d'identification supérieur
à 90% et une longueur de gène supérieure à 80%.

Nous avons pu identifier :

111 | P a g e
 Résultats et discussion

- 10 gènes de résistance portés par le chromosome bactérien, dont

AAC(6')-Ii, aph(3')-IIIa, msrC, msrA, efmA, ponA, fosX, dfrF,
tetA et vanZ.
- 5 gènes portés par le plasmide 1 : SAT4, aph(3’)-IIa, ant(6)-Ia, cat
et erm(B).
- 3 gènes portés par le plasmide 3, tetS, tetM et tetL,
- 2 gènes supplémentaires lnu(B) et dfrG trouvés dans le scaffold 1.
- Un ensemble de 20 mutations chromosomiques ponctuelles
identifiées dans le gène pbp 5 conférant une résistance à
l'ampicilline.

Résistance aux β-lactamines

La fréquence des entérocoques résistants aux β-lactamines a

augmenté ces dernières années, en particulier chez E. faecium. En effet,
dans certains hôpitaux européens, plus de 90% des souches d’E. faecium
sont résistantes à l'ampicilline (Autriche, Danemark, Grèce et Royaume-
Uni, entre autres) (ECDC, 2014), et le pourcentage détecté en Algérie est
de 83,08% (AARN, 2018).

Selon la littérature, tous les entérocoques produisent au moins cinq

PBP, l'analyse génomique de E. faecium et E. faecalis dans plusieurs
études a révélé six gènes pbp putatifs, dont trois sont de classe A comme
ponA et trois de classe B comme les pbp5 (Arbeloa et al., 2004; Duez et
al., 2004; Rice et al., 2009). Les mécanismes de résistance consistent en
une surproduction de PBP (comme le pbp4 chez E. faecalis ou le pbp5
chez E. faecium) ou en des mutations qui entraînent des changements
d'acides aminés dans leur site actif, les plus courants étant les
modifications du pbp5. Les changements de pbp5 sont surtout détectés
dans les souches d’E. faecium et confèrent un niveau élevé de résistance à
l'ampicilline (Cattoir & Leclercq, 2012).

112 | P a g e
 Résultats et discussion

Tableau 23: Liste des gènes de résistance présents dans E.faecium FA4

Origine Gène Longueur Position Classe d’antibiotique Mécanisme de résistance

AAC(6')-Ii 549 pb 2219956-2219408 Aminoglycoside Inactivation antibiotiques
aph(3')-IIIa 780 pb 2409938-2409717 Aminoglycoside Inactivation antibiotiques
msrC 1479 pb 2599641-2601119 Efflux d’antibiotiques
Macrolide, streptogramine, lincosamide
msrA 792 pb 284771-285562
Chromosome EfmA 974 pb 552160-551187 Macrolide, fluoroquinolone Efflux d’antibiotiques
ponA 2346 pb 1957564-1959909 Céphalosporine, céphamycine, pénème Altération de la cible antibiotique
FosX 243 pb 1158297-1158539 Fosfomycine Inactivation d’antibiotique
dfrF 528 pb 1030906-1031433 Diaminopyrimidine Remplacement de la cible antibiotique
MFS 1185 1306393-1305209 Divers classes d’antibiotiques Efflux d’antibiotique
VanZ 1164 pb 1322172-1323335 Glycopeptide Altération de la cible antibiotique
SAT4 553 pb 168-66069 Aminoglycosides et streptothricine Inactivation d’antibiotique
aph(3’)-IIa 795 pb 41744-40950 Aminoglycosides Inactivation d’antibiotique
Plasmide1 ant(6)-Ia 912 pb 42376-43287 Aminoglycosides Inactivation d’antibiotique
CAT 648 pb 50959-51606 Chloramphénicol Inactivation d’antibiotique
erm(B) 738 pb 47315-46578 Macrolide, streptogramine, lincosamide Altération de la cible antibiotique
Plasmide3 tetS 493 pb 1462-1954 Protection des cibles antibiotiques
tetM 960 pb 1981-2940 Tétracycline
tetL 1379 pb 2144-3522 Efflux d’antibiotique
Scaffold 1 lnu(B) 804 pb 39824-40627 Lincosamide Inactivation d’antibiotique
dfrG 498 pb 69793-70290 Diaminopyrimidine Remplacement de la cible antibiotique

113 | P a g e
 Résultats et discussion

Certaines souches produisent des β-lactamases similaires au type A

produit par les staphylocoques (codé pour le gène blaZ) mais il s'agit d'un
mécanisme très rare et plus typique de E. faecalis que de E. faecium
(Cercenado, 2011; Crank & O’Driscoll, 2015).

Conformément à ces résultats, nous avons identifié le gène ponA qui

fait partie des pbp de la classe A et qui confère une résistance non
seulement aux céphalosporines mais aussi aux antibiotiques de la famille
céphamycine et péname (Arbeloa et al., 2004; Rice et al., 2009). La
recherche des mutations ponctuelles au niveau du gène pbp 5 a révélé
l’existence de plusieurs mutations ponctuelles qui confèrent toutes une
résistance à l’ampicilline (tableau 24 et figure 38). Cette souche résistante,
présentait plusieurs variations dans pbp5 (V24A ; S27G ; R34Q ; G66E ;
A68T ; E85D ; E100Q ; K144Q ; T172A ; L177I ; D204G ; A216S ;
T324A ; M485A ; N496K ; A499T ; E525D ; V586L ; E629V ; P667S), qui
ont été associées à une forte augmentation des CMI de l’ampicilline
(Pietta et al., 2014). Cependant, la souche étudiée ne possédait pas de β-
lactamases connues telles que la blaZ.

Pour rappel, la souche E. faecium FA4 a été isolée des fèces de rats
traités uniquement à l'ampicilline, cette souche a montré une forte
résistance aux β-lactamines spécialement à l’ampicilline. Comme montré
précédemment, cette résistance était principalement due à des mutations
génétiques trop ciblées conférant toutes à une forte résistance à
l’ampicilline, cela devrait changer notre point de vue sur les mutations
génétiques, que nous avons toujours tendance à définir comme des
mutations aléatoires.

114 | P a g e
 Résultats et discussion

Tableau 24 : Modifications des acides aminés dans la séquence pbp5

de la souche de E. faecium FA4.
La mutation V24A comme exemple est une substitution de type transition du nucléotide
T par le nucléotide C, cette substitution se reflète également dans la chaîne
polypeptidique qui a entraîné la substitution de l'acide aminé valine en position 24 par
une alanine.

Changement de l’acide
Mutation Changement de nucléotide
aminé

pbp5 p.V24A GTA -> GCA Val -> Ala

pbp5 p.S27G AGT -> GGT Ser -> Gly

pbp5 p.R34Q CGG -> CAG Arg -> Gln

pbp5 p.G66E GGA -> GAA Gly -> Glu

pbp5 p.A68T GCA -> ACA Ala -> Thr

pbp5 p.E85D GAA -> GAT Glu -> Asp

pbp5 p.E100Q GAG -> CAG Glu -> Gln

pbp5 p.K144Q AAA -> CAA Lys -> Gln

pbp5 p.T172A ACA -> GCA Thr -> Ala

pbp5 p.L177I TTA -> ATA Leu -> Ile

pbp5 p.D204G GAC -> GGC Asp -> Gly

pbp5 p.A216S GCA -> TCC Ala -> Ser

pbp5 p.T324A ACA -> GCA Thr -> Ala

pbp5 p.M485A ATG -> GCG Met -> Ala

pbp5 p.N496K AAT -> AAA Asn -> Lys

pbp5 p.A499T GCA -> ACA Ala -> Thr

pbp5 p.E525D GAG -> GAT Glu -> Asp

pbp5 p.V586L GTA -> TTA Val -> Leu

pbp5 p.E629V GAA -> GTA Glu -> Val

pbp5 p.P667S CCC -> TCG Pro -> Ser

115 | P a g e
 Résultats et discussion

Figure 35: Séquence protéique du gène pbp5 et les différentes

variations en acides aminés (surlignées en gris) dans pbp5 de la souche E.
faecium FA4.
Résistance aux macrolides, lincosamide,
streptogramine (MLS) et quinolone

Les antibiotiques macrolides, lincosamide, streptogramine (MLS)

constituent une thérapie alternative pour le traitement des infections
insidieuses à entérocoques. En Algérie, nous avons pu estimer que 86,85%
E. faecium sont résistants à l'érythromycine (AARN, 2018). Trois
mécanismes différents expliquent la résistance acquise aux antibiotiques
MLS chez les bactéries à Gram-positif : la modification de la cible,
l'inactivation de l’antibiotique et l'efflux actif de l'antibiotique. Dans le
premier cas, une seule altération de l'ARNr 23S confère une large
résistance croisée aux antibiotiques macrolide-lincosamide-streptogramine
B (MLSB), alors que le mécanisme d'inactivation ne confère une résistance
qu'aux antibiotiques MLS structurellement apparentés (Miller et al.,
2014).

Dans cette étude, la résistance au macrolide-lincosamide-

streptogramine a été conférée par les gènes msrA, msrC et erm(B). Les
gènes msrA et msrC ont été associés aux pompes impliqués dans l'efflux
actif des antibiotiques à l’extérieur de la cellule (Ross et al., 1990; Miller et
al., 2014; Mišić et al., 2017). Cependant le gène ermB code une méthylase
conférant à une modification de la cible ARNr 23S (Weisblum, 1995;

116 | P a g e
 Résultats et discussion

Portillo et al., 2000; Miller et al., 2014; Mišić et al., 2017). Le gène lnu(B)
confère aussi à une résistance au lincosamide, cette résistance spécifique
aux lincosamides (phénotype L) est le résultat de la modification et de
l'inactivation par les enzymes lincosamides par nucléotidyltransférase
codées par les membres de la famille des gènes lnu dont la plupart sont
situés sur les plasmides ou transposons, selon Montilla et al., (2014) et Zhu
et al., (2017).

Un autre gène, le gène efmA, code également pour une pompe à

efflux conférant une résistance au macrolide et au quinolone (Nishioka et
al., 2009) a également été détecté chez E. faecium FA4.

Résistance aux aminoglycosides

Les entérocoques présentent une tolérance intrinsèque (qui se

manifeste par l'absence d'activité bactéricide) aux aminoglycosides. Ce
phénomène semble être médié par deux facteurs principaux : une mauvaise
absorption de l'antibiotique nécessitant des concentrations plus élevées
pour favoriser l'entrée dans l'espace intracellulaire et une inactivation par
modification covalente des groupes hydroxyle ou amino de la molécule
d'aminoglycoside effectuée par des enzymes entérocoques naturelles, créant
un obstacle stérique et diminuant la liaison à la cible ribosomique (Miller
et al., 2014). Dans la présente étude, la résistance aux aminoglycosides a
été conférée par les gènes aac(6')-Ii, aph(3')-IIIa, aph(3’)-IIa, ainsi que par
le gène ant(6)-Ia et sat4. En effet, E. faecium possède une enzyme 6′-
acétyltransférase (AAC(6′)-Ii) codée par un gène chromosomique, capable
de modifier la tobramycine, la sisomicine, la kanamycine et la nétilmicine
(Costa et al., 1993; Perera et al., 2020). Cependant le gène aph(3′)-IIIa
code une enzyme (APH(3′)-IIIa) qui entraîne une résistance élevé à la
kanamycine et à l'amikacine grâce à sa capacité de phosphotransférase
(Gray & Fitch, 1983; Trieu-Cuot & Courvalin, 1983; Elghaieb et al.,
2020). L'enzyme APH(3′)-IIa exprimé par le gène aph(3’)-IIa inactive la

117 | P a g e
 Résultats et discussion

néomycine et la kanamycine ainsi que la paromomycine, la butirosine, la

gentamicine B et la ribostamycine (Woegerbauer et al., 2015).

Le gène ant(6)-Ia, qui code pour une autre enzyme l'aminoglycoside

nucléotidyltransférase, confère une résistance de haut niveau à la
streptomycine (Carlier & Courvalin, 1990; Bender et al., 2019). Le gène
sat4 confère la résistance de la streptothricine médiée par la N-
acétyltransférase qui inactive l’antibiotique par acétylation du groupe
amino de la β-lysine (Werner et al., 2001).

Résistance aux tétracyclines

Les tétracyclines exercent leur effet antibactérien en se liant au

ribosome et en interférant avec l'arrimage de l'aminoacyl-ARNt. Cela se
produit par association avec plusieurs boucles de l'ARNr 16S et de la
protéine ribosomale S7, mais il s'agit d'un processus réversible et ces
agents sont bactériostatiques (Schnappinger & Hillen, 1996). La résistance
est médiée par de multiples gènes, mais suit deux stratégies générales,
l'efflux de l'antibiotique et la protection ribosomique.

Dans notre cas, les pompes d'efflux codées par tetL sont des
déterminants plasmidiques ; selon la littérature ce gène code des protéines
avec 14 hélices α qui constituent les domaines transmembranaires et
confèrent une résistance à la tétracycline mais pas à la minocycline
(Chopra & Roberts, 2001). Cependant les gènes tetM et tetS trouvés chez
E. faecium FA4 confèrent selon plusieurs études à une résistance à la
doxycycline et à la minocycline ainsi qu'à la tétracycline, oxytétracycline
et sont souvent associés à la famille des transposons conjugatifs Tn916 et
Tn1545 (Pepper et al., 1987; Bentorcha et al., 1991; Clewell et al., 1995;
Chajęcka‐Wierzchowska et al., 2019). Selon Chopra & Roberts (2001) les
gènes tetM et tetS codent pour une protéine ayant une homologie
significative avec les facteurs d'élongation bactériens (EF) et, comme ces
derniers, ils sont capables d'hydrolyser le GTP en présence du ribosome,
ce qui modifie la conformation ribosomique et déplace la tétracycline liée.

118 | P a g e
 Résultats et discussion

Résistance aux glycopeptides

Les glycopeptides (vancomycine et téicoplanine) se lient à la partie

terminale D-alanine-D-alanine (D-Ala-D-Ala) des précurseurs de
peptidoglycanes, empêchant ainsi la réticulation des chaînes de
peptidoglycanes et inhibant la synthèse de la paroi cellulaire (Faron et al.,
2016). La résistance aux glycopeptides est due à la production de
précurseurs de la paroi modifiés (terminés par D-alanyl-D-lactate ou D-
alanyl-D-sérine) et à l’élimination des précurseurs naturels de haute
affinité (terminés par D-Ala-D-Ala) (Cattoir & Leclercq, 2010). Dans notre
étude nous avons identifié le gène vanZ qui code pour la résistance à la
téicoplanine mais à des niveaux très faibles de vancomycine.

Résistance aux phénicolés

Les phénicolés (chloramphénicol et thiamphénicol) sont des

antibiotiques bactériostatiques qui se fixent sur la sous-unité 50S du
ribosome, inhibant donc la synthèse protéique des bactéries. Ils se lient en
effet sur le site de fixation de l’acide ribonucléique de transfert (tARN),
stoppant l’élongation de la chaîne protéique en cours de synthèse
(Epaulard & Brion, 2009). La résistance par diminution de la perméabilité
de la paroi est décrite mais le principal mécanisme de résistance aux
phénicolés est de nature enzymatique et son support génétique est de type
transposon. Le gène cat présent dans E. faecium FA4 contribue
efficacement à la résistance au chloramphénicol. En effet, les
chloramphénicol-acétyltransférases codées par ce gène peuvent transformer
la molécule d'origine en un dérivé diacétylé inactif, selon Freitas et al,
(2017).

Résistance aux diaminopyrimidines

La triméthoprime est une diaminopyrimidine utilisée pour le

traitement des infections des entérocoques, respiratoires, cutanées et
urinaires (Bergmann et al., 2014). Il agit de manière bactériostatique par
inhibition de la dihydrofolate réductase (DHFR), une enzyme de la voie de

119 | P a g e
 Résultats et discussion

synthèse du tétrahydrofolate et de la vitamine B9 nécessaire à la synthèse

des bases puriques, pyrimidiques et des acides aminés. L'interférence avec
cette voie inhibe la synthèse de l'ADN bactérien (Miovic & Pizer, 1971).
Le mécanisme le plus fréquent de résistance à la triméthoprime chez
Enterococcus est la production d'une dihydrofolate réductase (DHFR),
souvent trouvée sur des éléments génétiques mobiles (plasmides,
transposons, cassettes) (Amyes & Towner, 1990; Huovinen et al., 1995).
Pour la souche E. faecium FA4, nous avons pu détecter la présence de
deux gènes de résistance à la triméthoprime, dfrG et dfrF, dont le mode de
résistance selon la littérature est une production de DHFR par le gène
dfrG (Nurjadi et al., 2014) et le gène drfF (Kerschner et al., 2019).

Résistance aux fosfomycines

La fosfomycine inhibe l'enzyme UDP-N-acétylglucosamine 3

énolpyruvyltransférase (MurA), qui catalyse la première étape de la
biosynthèse de la paroi cellulaire bactérienne. D’autres études ont
déterminé que la fosfomycine inactive de manière irréversible MurA en
alkylant un résidu de cystéine sur le site actif (Kahan et al., 1974;
Skarzynski et al., 1996). La résistance à la fosfomycine résulte soit de
mutation(s) chromosomique(s), soit, plus rarement, d'une médiation
génique. Dans notre cas, nous avons identifié le gène fosX qui code pour
l’enzyme qui modifie la fosfomycine par addition nucléophile sur le carbone
1 (C1) de la fosfomycine, ouvrant ainsi le cycle époxyde de l’antibiotique
et l’inactivant (Fillgrove et al., 2003; Pourbaix & Guérin, 2016).

Mécanisme de résistance par système d’efflux actif

bactérien MFS

Les entérocoques sont capables de surmonter l'accumulation des

antibiotiques en les transportant vers la membrane extérieure par un
mécanisme d'efflux comme le système de pompe à efflux actif Major
Facilitator Superfamily (MFS) trouvé chez la souche E. faecium FA4. Le
MFS est capable d’expulser des antibiotiques appartenant à des classes

120 | P a g e
 Résultats et discussion

très différentes mais également des métaux lourds, des sels biliaires, des
solvants organiques, certains antiseptiques comme les ammoniums
quaternaires et des colorants (Li & Nikaido, 2004; Liz & Nikaido, 2009).

Annotation des facteurs de virulences

Les facteurs de virulence, ainsi que la résistance aux antibiotiques,

ont été considérés comme des déterminants importants de la colonisation
bactérienne, de l'établissement et de la persistance des entérocoques
résistants en milieu hospitalier (Rathnayake et al., 2012). La présence de
ces facteurs donne aux bactéries la possibilité de s'adapter aux
écosystèmes et d'acquérir des gènes de résistance aux antibiotiques. E.
faecium est porteur de multiples facteurs de virulence, tels que l’antigène
spécifique de l'endocardite A (efaAfm), l'hyaluronidase (hyl) et l'adhésine
liant au collagène (acm) (Werner et al., 2010), dont l'expression est
associée à la colonisation, à la formation de biofilms et à la pathogénicité
(Yang et al., 2015).

La souche étudiée E. faecium FA4 possède trois gènes de virulence,

deux à médiation chromosomique (efaAfm et acm) et un porté par le
plasmide 2 (hylEfm) (tableau 25).

Il a été montré, que le premier gène efaAfm est impliqué dans

l'adhésion de la bactérie aux surfaces biotiques et abiotiques favorisant la
formation de biofilms (Pérez-Pulido et al., 2006; Montironi et al., 2019).
De plus, il a été décrit que ce gène est impliqué dans l'évitement de la
réponse immunitaire (Pérez-Pulido et al., 2006) et qu'il joue un rôle
crucial dans l'endocardite infectieuse causée par Enterococcus (Mohamed
et al., 2004; Strateva et al., 2016). En revanche, le second gène acm intact
peut coder pour une adhésine de collagène de type I et de type IV, qui
s'est révélé important aussi dans la pathogenèse de l'endocardite
(Nallapareddy et al., 2003; Arshadi et al., 2018).

Le troisième gène hylEfm (codant pour une hyaluronidase

hypothétique) a été trouvé presque exclusivement dans des isolats

121 | P a g e
 Résultats et discussion

cliniques de E. faecium, et ces dernières années, il a été montré qu'il se

trouvait sur un plasmide qui augmentait la capacité des souches de E.
faecium à coloniser le tractus gastro-intestinal, comme le montre l'étude
III (Arias et al., 2009; Panesso et al., 2011). Il a été rapporté que
l'acquisition du plasmide porteur du gène hylEfm par E. faecium
D344SRF à partir d'un isolat clinique américain (C68) a augmenté la
colonisation du tractus gastro-intestinal des souris, un effet qui était
indépendant de la présence de déterminants de la résistance aux
antibiotiques (Rice et al., 2009).

Tableau 25: Liste des gènes de virulence présents dans E. faecium FA4

Origine Gène Longueur Position

acm 2166 pb 2.230.876-2.233.041
Chromosome
efaAfm 861 pb 498.184-499.044
Plasmide 2 hylEfm 1662 pb 147.796-146.135

La présence des gènes de virulence efaAfm, acm et du gène

plasmidique hylEfm dans la souche d’E. faecium FA4 pourrait améliorer la
capacité de colonisation, et sa résistance élevée à différents antibiotiques
pourrait entraîner une augmentation de la virulence. Il a été montré que la
capacité de E. faecium à se disséminer dans le milieu hospitalier est due
non seulement à la présence de gènes de résistance aux antibiotiques, mais
aussi à l'acquisition de déterminants qui peuvent augmenter la capacité de
l'organisme à survivre chez les patients, à les coloniser et/ou à les infecter
dans le milieu clinique (Arias et al., 2009).

Annotation des prophages d’E. faecium FA4

Les bactériophages, virus qui infectent et se répliquent à l'intérieur

des bactéries, ont été signalés comme ayant des effets à la fois bénéfiques
et néfastes en ce qui concerne la gestion des maladies. Les bactériophages
ont des impacts écologiques et évolutifs importants sur leurs hôtes
bactériens. Ils ont été associés à l'utilisation thérapeutique pour tuer les
pathogènes bactériens, mais peuvent conduire à la transmission de la
résistance aux antibiotiques (Torres-Barceló, 2018), conséquence de

122 | P a g e
 Résultats et discussion

l'excision ou de l'encapsidation imprécise du génome du phage qui permet

l'incorporation de gènes de l'hôte par erreur. Ce mécanisme, appelé
transduction, a été décrit en 1951 pour de nombreuses espèces
bactériennes et est rapidement devenu un outil de biologie moléculaire
utilisé pour étudier la génomique bactérienne (Zinder & Lederberg, 1952).

Dans la présente étude, la recherche et l’annotation des phages a été

réalisée par le programme PHASTER, (Zhou et al., 2011; Arndt et al.,
2016). L'analyse des résultats montre la présence d'un groupe de gènes
présentant des homologies avec des gènes codant pour des protéines
phagiques, et notamment des protéines structurant la capside virale et la
gaine, comme les intégrase, transposase et autres (figure 39 et tableau 26).

Les résultats indiquent la présence de huit prophages tempérés dans

le génome de E. faecium FA4 et correspondant à une région phagique
intacte, six régions contestables et une région incomplète. Parmi ces
régions, deux (4, 5) sont similaires aux phages trouvés chez Staphylococcus
(phage SPbeta-like) (Kornyenko et al., 2016), trois autres (1, 6 et 7)
similaires aux bactériophages de Lactobacillus (phage Lactob_phiAT3 et
Lactob_jlb1) (Baugher et al., 2014), une région similaire au phage d’E.
coli (Stx2_c_1717) (Zhang et al., 2008), une région correspond au phage
Entero_EF62phi d’Enterococcus (Brede et al., 2011) et une dernière
région intacte correspond au phage complet de Listeria (Lister_2389)
(Zimmer et al., 2003).

123 | P a g e
 Résultats et discussion

Figure 36: Disposition des prophages sur le chromosome de E. faecium FA4.

124 | P a g e
 Résultats et discussion

Tableau 26: Liste et position des prophages de E. faecium FA4

Région Origine Taille Complétude Score CDS Position Phage le plus courant %GC

1 Chromosome 28 Kb Incomplète 30 10 580047-608084 Lactob_jlb1 (NC_024206) 32,58

2 Chromosome 60,2 Kb Intacte 150 65 810617-870858 Lister_2389 (NC_003291) 36,34

3 Chromosome 10,6 Kb Contestables 80 12 897754-908413 Stx2_c_1717 (NC_011357) 34,83

4 Plasmide 1 23,8 Kb Contestables 90 20 9623-33442 Staphy_SPbeta_like (NC_029119) 35,19

5 Plasmide 1 30,3 Kb Contestables 90 33 33442-63830 Staphy_SPbeta_like (NC_029119) 33,61

6 Plasmide 2 10,2Kb Contestables 80 13 99002-109266 Lactob_phiAT3 (NC_005893) 34,52

7 Plasmide 2 24,2 Kb Contestables 70 7 175470-199723 Lactob_phiAT3 (NC_005893) 33,35

8 Plasmide 3 11,7 Kb Contestables 90 16 2146-13899 Entero_EF62phi (NC_017732) 34,89

Intacte (score > 90)

Contestables (score 70-90)
Incomplète (score < 70)

125 | P a g e
 Résultats et discussion

Selon ces résultats, le transfert horizontal de gènes par des

transducteurs de différentes espèces bactériennes à E. faecium est possible,
ces mêmes observations avaient déjà été rapportées dans les travaux de
Zighelboim-Daum (1988) où il a montré que le transfert de gènes de
résistance de Staphylococcus à Enterococcus peut être fait par
transduction. Il faut rappeler que les antibiotiques jouent un rôle
important dans l'induction des phages (Matsushiro et al., 1999; Kimmitt
& Harwood, 1999). De nombreux antibiotiques peuvent induire
l'expression de produits de gènes phagiques ou conduire à l'excision et à la
propagation inter-espèces des phages tempérés. Dans notre étude
l’ampicilline était l’unique antibiotique administré par voie orale aux rats
traités, donc il a pu déclencher le cycle lytique des phages menant à la
propagation des phages dans l'écosystème.

Pour mieux comprendre le mécanisme de l'induction des phages, il a

été bien décrit pour les phages modèles que des facteurs environnementaux
indésirables endommagent l'ADN des bactéries et activent la "réponse
SOS" bactérienne (Baharoglu & Mazel, 2014). Les protéines bactériennes
qui sont activées pendant la réponse SOS en cascade dégradent la protéine
de répresseur CI du phage tempéré lambda d’E. coli RB791 activant ainsi
le cycle lytique du bactériophage (Ptashne, 1986). Cette réponse explique
pourquoi les facteurs de stress, tels que la lumière UV, la mitomycine et
les antibiotiques comme les fluoro-quinolones et les β-lactamines, ont pour
conséquence non voulue d'activer et de propager les prophages (Torres-
Barceló, 2018).

Le transfert horizontal de gènes d’Enterococcus à d'autres espèces

bactériennes par l'intermédiaire de phages avait déjà été signalé, mais ces
transferts sont moins préoccupants en raison de leur fréquence de
transduction généralisée extrêmement faible. Dans des expériences
distinctes, il a été déterminé que la transduction de la résistance à la
tétracycline ou au chloramphénicol se produit à un taux compris entre 10 -8

126 | P a g e
 Résultats et discussion

et 10-9 transductants/UFC. La seule cause d'inquiétude dans ces études est

que pour les entérocoques, les phages transducteurs ont pu transférer la
résistance aux antibiotiques entre différentes espèces bactériennes
(Mazaheri Nezhad Fard et al., 2011), Par conséquent, Enterococcus peut
agir comme un réservoir de gènes de résistance transférables par
transduction à d'autres espèces bactériennes partageant le même
écosystème.

Les phages comme nous l’avons déjà mentionné, peuvent jouer un

autre rôle très bénéfique car ils sont de parfaits chasseurs de bactéries, ils
sont précis, efficaces et capables de s'adapter aux stratégies de leurs proies.
Les protocoles d'isolement et de purification des phages à des fins
thérapeutiques sont simples et facilement disponibles (Merabishvili et al.,
2009; Pirnay et al., 2015). Il existe de nombreuses raisons pour lesquelles
la "thérapie par les phages" est de plus en plus utilisée, et cette méthode
pourrait être davantage exploitée. La situation de ce type de thérapie est
opposée à celle des antibiotiques, dont l'efficacité a été radicalement
diminuée alors que les nouveaux types d'antibiotiques sont peu nombreux
ou en début de développement (Ling et al., 2015).

Annotation des éléments génétiques mobiles d’E.

faecium FA4

Les éléments génétiques mobiles bactériens (EGM), tels que les

éléments intégratifs et conjugatifs (ICEs) et les plasmides conjugatifs, ont
été mis en évidence comme étant d'importants vecteurs de diffusion de la
pathogénèse et des déterminants de la résistance aux antimicrobiens. Les
régions conjugatives des EGM auto transmissibles se composent
généralement de quatre modules : origine du site de transfert (oriT), gène
de la relaxase, gène codant pour la protéine de couplage de type IV
(T4CP) et groupe de gènes pour le système de sécrétion bactérien de type
IV (T4SS). La région oriT, généralement longue de dizaines voire de
centaines de paires de bases, contient une région de coupure (nic) et des

127 | P a g e
 Résultats et discussion

paires de répétitions inversées (IR) qui sont impliquées dans la localisation

vers un site nic précis.

Ici, les résultats ont montré l'existence de deux EGM chez E.

faecium FA4, le premier est dans le plasmide 1 et ne contient qu’une
séquence oriT et une séquence relaxase. La séquence oriT a une taille de
108 pb avec une similarité de 70% avec la séquence oriT du plasmide
pIP1630 de S. aureus (Varella Coelho et al., 2009), tandis que la protéine
relaxase a une longueur de 121aa avec une similarité de 96,70% avec la
relaxase du plasmide pC223_p4 de S. aureus (Smith & Thomas, 2004)
(tableau 27). Ce type de EGM est transférable mais non auto
transmissible, portant un nombre limité de gènes mob pour leur propre
conjugaison. Il est intéressant de noter que les EGMs non conjugatifs
portant des séquences oriT et relaxase fonctionnelles peuvent être
mobilisés par autres éléments conjugatifs (Ramsay & Firth, 2017) comme
c’est le cas pour le transposon conjugatif Tn916 que nous avons identifié
dans le plasmide 3 et qui peut aussi participer dans la transmission du
premier EGM. Le transposon conjugatif identifié est un ICE contenant
une séquence oriT de 133 pb avec deux séquences inversées (6 pb et 7 pb)
et une autre région nic de 10 pb (figure 40). La séquence oriT correspond
à 100% du Tn916 d’E. faecalis décrit par (Flannagan et al., 1994) (tableau
28). Il contient aussi une relaxase de 401aa (Ren et al., 2010), T4CP de
329aa (Flannagan et al., 1994) et un groupe de 11 gènes T4SS (figure 41).

Tableau 27: Composants EGM du plasmide 1 de E. faecium FA4

Taille Position Score Homologie Référence

S. aureus plasmide (Varella Coelho et

OriT 108pb 51768-51871 70%
pIP1630 al., 2009)

S. aureus plasmide (Smith & Thomas,

Relaxase 121aa 52301-52666 96.70%
pC223_p4 2004)

128 | P a g e
 Résultats et discussion

Tableau 28: Composants du Tn916 du plasmide 3 de E. faecium FA4

Taille Position Score Homologie Référence

E. faecalis
OriT 133bp 24086-24218 100% (Flannagan et al., 1994)
Tn916

Relaxase 401aa 24229-25434 99.25% E. faecalis (Ren et al., 2010)

T4CP 329aa 22641-23630 97.83% E. faecalis (Flannagan et al., 1994)

24086

24156 24165

24218

Figure 37: Structure prévue de la séquence oriT du Tn916 de E. faecium FA4.

1 2 3 4 56 7 8 9 10 11

Figure 38: Structure prévue de 11 gènes T4SS du Tn916 de E. faecium

FA4
1. Tra_Tn, 2. Tra_Tn [666], 3, 4 et 5. Tra_Tn [644], 6. Tra_Tn [650], 7. Tra_Tn [659], 8. Tra_Tn [652], 9.
Tra_Tn [668], 10. Tra_Tn [652], 11. Tra_Tn [649]

D’après ces résultats ont peut constater que la souche E. faecium

FA4 a une grande capacité à acquérir des éléments génétiques mobiles des
autres espèces comme S. aureus ou E. faecalis. Plusieurs études ont
montré ces capacités de transfert génétique par la médiation des EGMs
entre E. faecium et S. aureus (Périchon & Courvalin, 2009) et également
entre E. faecium et E. faecalis (Garnier et al., 2000). Pour rappel, les deux
plasmides porteurs de ces EGMs ont également été caractérisés comme
porteurs de plusieurs gènes de résistance dont: SAT4, aph(3')-IIa, ant(6)-

129 | P a g e
 Résultats et discussion

Ia, cat, erm(B) (plasmide1) ; tetS, tetM et tetL (plasmide2). Alors E.

faecium peut en effet agir comme un réservoir de gènes de résistance
transmissibles à d'autres bactéries pathogènes par la médiation des EGMs
comme montré par plusieurs travaux (Garnier et al. (2000), Périchon &
Courvalin, (2009), Walters et al. (2015) et Semedo-Lemsaddek et al.
(2018).

130 | P a g e
Conclusion et perspectives

131 | P a g e
 Conclusion et perspectives

Les antibiotiques ont une valeur importante pour combattre les

maladies infectieuses, mais leur efficacité est menacée par la résistance
bactérienne. À l'heure actuelle, la multirésistance semble être peu courante
parmi les BL, mais un nombre croissant de souches présentant des niveaux
de résistance atypiques à certains antibiotiques sont isolées dans plusieurs
études, dont celle-ci.

Notre étude indique que certaines souches présentent des résistances

inhabituelle aux classes d'antibiotiques les plus utilisées en médecine
vétérinaire et en élevage, en particulier aux antibiotiques β-lactamines,
tétracyclines et macrolides. L’analyse des profils de résistances des souches
par ACP montre que les biotopes d'origine animale, le lait de vache et le
jéjunum de poulet représentent les biotopes présentant les niveaux les plus
élevés de BL résistantes aux antibiotiques, le genre Enterococcus étant le
plus résistant par rapport aux autres genres de BL. Cela nous amène à
constater que la résistance bactérienne aux antibiotiques est fortement
associée à l'utilisation inappropriée des antibiotiques dans l'élevage, ce qui a
sans aucun doute favorisé la sélection et la croissance de bactéries
résistantes, y compris les BL. L’éleveur et le vétérinaire doivent être
conscients que l’utilisation des antibiotiques à des fins prophylactiques ou
comme facteurs de croissance pour améliorer le rendement de leur production
peut apporter de graves conséquences en termes de santé publique. Une
bonne réactivité de la part de ces deux professionnels est indispensable.

Dans cette thèse, nous avons également cherché à comprendre l’effet de

l’ampicilline sur l’écosystème microbien intestinal par expérimentation
animale, la méthode que nous avons développée nous a permis de quantifier
efficacement la résistance au sein d’un microbiote intestinal en utilisant les
entérocoques comme des indicateurs pour surveiller le taux de résistance. De
plus, nous avons montré que l’administration orale d’ampicilline entraîne
l'accumulation progressive de niveaux élevés d'ampicilline non absorbée dans
les fèces, ce qui conduit à l'excrétion de pourcentages significativement plus
élevés (P ≤ 0,05) d'entérocoques résistants, y compris l’espèce E. faecium,

132 | P a g e
 Conclusion et perspectives

pendant le traitement et le post-traitement. L'analyse génomique d'une de

ces espèces multi-résistantes isolées de cet écosystème a montré le grand effet
de l’ampicilline sur la modification génomique de la bactérie en question en
induisant non seulement des mutations génétiques conférant une résistance à
l'ampicilline mais aussi en déclenchant l'excision et la propagation inter-
espèces des phages tempérés et des EGMs, favorisant ainsi le transfert
horizontal de gènes y compris les gènes de résistances aux antibiotiques et de
gènes de virulence par transduction et par conjugaison. Beaucoup de ces
gènes sont fortement acquis par transmission horizontale. Les souches
résistantes du tractus gastro-intestinal humain et animal sont assez
courantes, ce qui confirme la propagation des gènes entre les bactéries
commensales dans cet écosystème complexe.

Les souches de BL destinées à être utilisées dans les systèmes

d'alimentation humaine et animale devraient faire l'objet d'une surveillance
systématique des résistances afin d'éviter leur inclusion dans les starters et
les probiotiques. Il est tout aussi important d'étudier les mécanismes par
lesquels les bactéries acquièrent et maintiennent des gènes de résistance aux
antibiotiques, ce qui pourrait contribuer à empêcher ces bactéries de devenir
un réservoir de gènes indésirables et à justifier l'utilisation d'antibiotiques à
des fins thérapeutiques. En même temps, l'utilisation d'espèces de BL comme
probiotiques peut contribuer à réduire l'utilisation des antibiotiques à des
fins thérapeutiques, prophylactiques et de stimulation de la croissance dans
l'élevage.

133 | P a g e
Références bibliographiques

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167 | P a g e
 Annexes

168 | P a g e
 Annexes

Annexe 1 : Méthodes de caractérisation phénotypique des isolats.

A. Critères morphologiques

Les bactéries isolées ont été observées au microscope après avoir subi
une coloration de Gram. Celle-ci permet, de plus, de mettre en évidence la
morphologie et du mode de groupement des bactéries.

B. Critères physiologiques

B.1. Croissance à différentes températures

Ce test était important, car il permettait de distinguer les BL

mésophiles des BL thermophiles. Après inoculation du bouillon MRS par les
cultures pures, les tubes étaient incubés aux températures 10 °C pendant
sept à dix jours et à 45 °C pendant 24 heures ; au bout de ces délais, la
croissance a été appréciée par examen des milieux. Les bactéries mésophiles
se développent à 10 °C alors que les bactéries thermophiles ne le peuvent
pas.

B.2. Croissance dans des conditions hostiles

La croissance en présence de différentes concentrations de chlorure de

sodium (NaCl) et différents valeurs de pH fournit des informations précieuses
pour l’identification. Les pré-cultures à tester ont été ensemencées sur des
bouillons MRS hypersalés à 4 % et à 6.5 % de NaCl, et à un pH de 9,6.
Après une incubation à la température optimale pendant 24 h, l’aptitude à
croître sur ces milieux se traduit par l’apparition d’un trouble (Facklam &
Moody, 1970).

B.3. Test de thermorésistance

Le test de thermorésistance avait permis de sélectionner des espèces

thermorésistantes. Les isolats à tester avaient été préalablement réparties
dans des tubes stériles contenant du bouillon MRS. ont ensuite été exposés à
une température de 60 °C pendant 30 min, puis rapidement refroidis sous un
jet d'eau du robinet, l'incubation s'est faite à 30°C pendant 48 h. Un résultat
positif se traduit par un trouble (Ayers et al., 1918).

169 | P a g e
 Annexes

B.4. Recherche de type fermentaire

Ce test a permis de différencier les BL homofermentaires de celles

hétérofermentaires. Il consistait à mettre en évidence la production de gaz
(CO2) à partir du glucose. Pour ce faire, le bouillon MRS avec une cloche de
Durham a été ensemencé par les pré-cultures bactériennes. Après incubation,
la présence ou l’absence du gaz dans la cloche indique le type fermentaire
(Hariri et al., 2009).

Les isolats homofermentaires vont produire 90% d‘acide lactique et

seulement 10% de CO2, par contre les souches hétérofermentaires vont
produire l‘acide lactique et le CO2 à proportions égales (Carr et al., 2002).

B.5. Test de lait de SHERMAN

Ce test a indiqué l’aptitude des bactéries se développer en présence de

bleu de méthylène à différentes concentrations. Chaque culture à tester a été
ensemencée dans le lait écrémé avec 0,1% et 0,3% de bleu de méthylène.
Après une incubation à 30 °C pendant 24h à 48h, des observations de
réduction du bleu de méthylène et de coagulation du lait ont été notées. Les
lactocoques réduisent le bleu de méthylène à 0.3% avec coagulation et les
Entérocoques à 0.1%, en revanche les streptocoques thermophiles sont
sensibles à ce colorant. La réaction positive entraîne la réduction du bleu de
méthylène du bleu (forme oxydée) au transparent (forme réduite) (Leveau et
al., 1991; Sherman, 1938; Ayers et al., 1918).

C. Critères biochimiques

C.1. Hydrolyse de l’Arginine (ADH)

La mise en évidence de cette enzyme est intéressante pour la

caractérisation des BL. Le rôle de cette enzyme est de libérer l‘ammoniac à
partir de l‘arginine. Pour réaliser ce test, une gélose M16 BCP a été utilisée.
Après ensemencement par stries, les cultures ont été incubées à 30 °C
pendant 24 h (Reddy et al., 1969).

170 | P a g e
 Annexes

Ce milieu contient un indicateur de pH, le pourpre de bromocrésol, un

résultat positif se traduit par une couleur mauve à jaune pâle-violet, tandis
qu’un résultat négatif se traduit par un virage au jaune vif, le tube témoin
vire au jaune et garde la couleur, cela veut dire que la bactérie est ADH
négative (Reddy et al., 1969).

C.2. Recherche de la catalase

Cette enzyme a été démontrée en mettant en contact la culture à

étudier avec une goutte de peroxyde d'hydrogène (10 %) sur une lame. La
présence de l’enzyme se manifestait par l’apparition de bulles gazeuses
(d’oxygène). Pendant leur respiration aérobie certaines bactéries produisent
du peroxyde d’hydrogène (H2O2), qui est très toxique et certaines bactéries
sont capable de le dégrader grâce aux enzymes qu’elles synthétisent,
notamment la catalase. Les BL ne possèdent généralement pas cette enzyme.

D. Identification par galeries biochimiques

Dans ces études, deux types de galeries biochimiques ont été utilisées
pour identifier les bactéries.

D.1. Les galeries API 20 STREP (Biomerieux)

Le système API 20 STREP (Biomerieux, France) est une méthode

d'identification rapide fréquemment utilisée, basée sur la dégradation de
substrats biochimiques. Cette méthode permet d'identifier les coques à Gram
positif au niveau de l'espèce en évaluant le profil de 20 réactions
biochimiques différentes. La galerie API 20 STREP est constituée de 20
microtubes contenant des substrats déshydratés pour la détection des
activités enzymatiques ou de fermentation du sucre..

Les tests enzymatiques ont été effectués conformément aux

recommandations du fabricant Biomerieux, France. Les réactions produites
pendant la période d'incubation ont entraîné des changements de couleur
spontanés ou ont été révélées par l'ajout de réactifs. Les tests de
fermentation ont été inoculés avec un milieu enrichi (contenant un indicateur
de pH) qui réhydrate les sucres. La fermentation des hydrates de carbone a

171 | P a g e
 Annexes

conduit à une acidification qui a entraîné un changement de couleur

spontané. La lecture de ces réactions a été faite à l'aide du catalogue
analytique ou du logiciel d'identification PIBWin (Probabilistic Identification
of Bacteria For Windows) (Tenover, 2006) ou utilisant le site web
https://lab.upbm.org.

D.2. Les galerie API 50 CHL (Biomerieux)

La galerie API 50 CHL est un système standardisé associant 50 tests

biochimiques permettant l’identification du genre Lactobacillus et germes
apparentés.

La galerie se compose de 50 microtubes pour la fermentation des

hydrates de carbone et de leurs dérivés. Le profil biochimique est spécifique à
chaque espèce au sein de ce groupe de bactéries. Les tests enzymatiques ont
été réalisés selon les recommandations du fabricant Biomerieux, France. La
fermentation a entraîné un changement de couleur dans le microtube en
raison de la production d'acide en anaérobiose révélée par l’indicateur du pH
du milieu choisi.

La lecture de ces réactions a été faite à l'aide du catalogue analytique

ou du logiciel d'identification PIBWin (Probabilistic Identification of
Bacteria For Windows) (Tenover, 2006) ou utilisant le site web
https://lab.upbm.org.

172 | P a g e
 Annexes

Annexe 2: Procédures de détermination des profils de

sensibilité/résistance aux antibiotiques.

Nous avons étudié le comportement des souches de BL par rapport à

plusieurs antibiotiques en effectuant des antibiogrammes en milieu solide
MRS, M17 ou MH à l'aide de disques imprégnés d'antibiotiques
commercialisés par l'Institut Pasteur d'Algérie (tableau 29).

Tableau 29: Agents antimicrobiens pour la détermination de la sensibilité

phénotypique utilisés dans les études I à III.

Antibiotique Famille d’antibiotique Etude I Etude II Etude IV

Céfalexine C1G ✓ ✓
Céftazidime C3G ✓ ✓
Imipenème Carbapénèmes ✓ ✓ ✓
β-lactamines
Amoxicilline Aminopénicillines ✓ ✓
Ampicilline Aminopénicillines ✓ ✓ ✓
Pénicilline Pénicilline ✓ ✓ ✓
Kanamycine ✓ ✓ ✓
Aminosides
Gentamycine ✓ ✓ ✓
Doxycycline ✓
Tétracycline
Tétracycline ✓ ✓ ✓
Bacitracine Polypeptides ✓ ✓
Spiramycine Macrolides ✓ ✓
Azithromycine Macrolides ✓ ✓ ✓
Erythromycine Macrolides ✓ ✓ ✓
Chloramphénicol Phénicolés ✓ ✓ ✓
Rifampicine Rifamycines ✓ ✓ ✓
Lincomycine Lincosamides ✓ ✓ ✓
Fosfomycine Fosfomycines ✓ ✓ ✓

E. Procédure pour effectuer le test de diffusion de disque

E.1. Préparation d'inoculum

E.1.1. Préparation de l’étalon 0,5 MacFarland

Pour standardiser la charge d'inoculum dans un test de sensibilité, il est

conseillé d'utiliser un standard de turbidité de Sulfate de baryum (BaSO4),
équivalent au standard 0,5 McFarland, pour ce faire une portion aliquote de
1 ml de BaCl2 à 0,048 mol/L (1,175% poids/volume) est ajoutée à 99 ml de
H2SO4 à 0,18 mol/L (1% v/v) sous agitation. La densité de l'étalon de

173 | P a g e
 Annexes

turbidité a été vérifiée en utilisant un spectrophotomètre à 625 nm,

l’absorbance devrait être de 0,008 à 0,10.

La suspension de sulfate de baryum a été transférée en aliquotes de 4 à

6 mL dans des tubes à essai de la même taille que ceux utilisés pour la
croissance ou la dilution de l'inoculum bactérien. Les tubes ont été
soigneusement scellés et conservés à l'obscurité.

a. Méthode de croissance

La méthode de croissance a été réalisée comme suit : Trois à cinq

colonies bien isolées de même aspect macroscopique ont été sélectionnées à
partir d'une culture de 16 heures sur milieu gélosé, ces colonies ont été
utilisées pour inoculer un tube de 4 à 5 ml d'un bouillon approprié. La
culture du bouillon a été incubée à 30°C ou 37°C jusqu'à ce qu'elle atteigne
ou dépasse la turbidité du standard 1 McFarland (généralement 2 à 4
heures).

La charge du bouillon de culture a été ajustée avec de l'eau

physiologique ou du bouillon de culture pour obtenir une turbidité
optiquement comparable à celle du standard 1 de McFarland. Il en est
résulté une suspension contenant environ 2 à 3 108 UFC/mL pour E. coli
ATCC 25922. Pour effectuer cette étape correctement, un spectrophotomètre
a été utilisé ou, si nous le faisions visuellement, un éclairage adéquat est
nécessaire pour une bonne comparaison visuelle de l'inoculum et du standard
1 McFarland.

b. Méthode de suspension directe

Comme l’alternative pratique à la méthode de croissance, l’inoculum

peut être préparé en un bouillon direct ou en suspension physiologique de
colonies isolées choisies parmi une culture sur boite Petri de 16 à 24 h. La
suspension a été ajustée pour correspondre au standard de turbidité de 1
McFarland, en utilisant de l’eau physiologique et du vortex.

174 | P a g e
 Annexes

E.2. Inoculation de boites de test

L’inoculation des boites a été réalisée à l’aide d’un écouvillon stérile, la

procédure a consisté de plonger l’écouvillon dans la suspension ajusté 15
minutes suivant l’étalonnage de la turbidité de l’inoculum. L'écouvillon
devait être tourné et pressé fortement contre la paroi interne du tube au-
dessus du niveau de liquide, pour éliminer l'excès de l'inoculum.

La surface séchée d'une boite de gélose MRS, M17 ou MH a été

inoculée en étalant l’écouvillon sur toute la surface de la gélose stérile. Cette
procédure a été répétée en stries deux fois, en faisant tourner la boite
d'environ 60° à chaque fois pour assurer une distribution uniforme de
l'inoculum.

Le couvercle peut être laissé entrouvert pendant 3 à 5 minutes, mais

pas plus de 15 minutes, afin de permettre l'absorption de l'excès d'humidité
superficielle avant l'application des disques imprégnés d’antibiotiques.

E.3. Application de disques sur des boites d'agar inoculées

Les disques d’antibiotiques ont ensuite été distribués à la surface de la

boite inoculée. Chaque disque a été enfoncé pour assurer un contact complet
avec la surface de la gélose. Que les disques aient été placés individuellement
ou avec un dispositif de distribution, ils ont été répartis uniformément de
manière à ce qu'ils ne soient pas inférieurs à 24 mm de centre à centre.
Normalement, il ne faut pas placer plus de 5 à 6 disques sur une boîte de 100
mm.

Les boîtes ont été inversées (couvercle vers le bas) et placées dans un
incubateur réglé à 35°C dans les 15 minutes suivant l'application des disques.

E.4. Lecture de boites et interprétation des résultats

Après 16 à 18 heures d'incubation, les zones d’inhibitions ont été

mesurées au millimètre près, à l’aide de pied à coulisse ou d’une règle.

175 | P a g e
 Annexes

Pour les BL hormis le genre Enterococcus et Streptococcus les résultats

interprétés comme étant sensibles, S (≥ 21 mm) ; Intermédiaire, I (16-20
mm) et résistant, R (≤ 15 mm) respectivement selon (Vlková et al., 2006).

Pour le genre Enterococcus et Streptococcus, les diamètres des zones

d'inhibition ont été interprétés en se référant aux diamètres discriminants
fixés par CLSI M100-S (Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI,
2012).

F. Méthodes de dilution pour déterminer la concentration

minimale inhibitrice (CMI) (I-IV)

Les méthodes de test de sensibilité à la dilution ont été utilisées pour

déterminer la concentration minimale d'antibiotique nécessaire pour inhiber
ou tuer les bactéries. Cela peut être réalisé par dilution de l'antibiotique dans
un milieu en gélose ou en bouillon. La CMI a été mesurée pour cinq
antibiotiques : ampicilline, pénicilline, gentamicine, oxytétracycline et
vancomycine.

F.1. Préparation des solutions mère d’antibiotiques

Pour mettre une série de dilution logarithmique d’antibiotique, la

méthode consiste à préparer une solution initiale (A) à 5120 µg/ml, de cette
concentration deux autres solutions ont été préparées : une solution (B) à
320 µg/ml et une autre solution (C) à 20 µg/ml.

Les solutions A, B et C ont subi par la suite des dilutions 1/2, 1/4, 1/8,
et 1/16 utilisant l’eau distillée stérile pour avoir une série de concentration
allant de 0,62 µg /mL à 5120 µg/mL comme a été montré dans le tableau 30.

Les solutions d’antibiotiques préparés ont ensuite été conservées dans

l’obscurité à 4 °C, à utiliser dans une durée qui ne dépasse pas 7 jours pour
éviter toute perte d'activité antibiotique.

F.2. Méthode de dilution en gélose (I-III)

Des colonies isolées pures ont été mises en suspension dans une solution
saline stérile à 0,9%. La densité a été ajustée par spectrophotométrie à 0,16

176 | P a g e
 Annexes

ou 0,20, qui correspond au standard de 1 McFarland ou 3 × 108 UFC/mL.

Un inoculateur multipoint a ensuite été utilisé pour ensemencer les surfaces
des géloses MRS antibiotiques préparées extemporanément en effectuant une
dilution décimale des solutions mères dans la gélose MRS, M17 ou MH, en
raison de 2 mL de la solution d’antibiotique dans 18 mL de milieu gélosé
liquéfié.

Les spots sont mis à sécher à température ambiante durant 15 à 30

min, ensuite les boites sont incubées à 37 °C pendant 24 à 48 heures. La CMI
est définie à partir de la première boîte de la série dépourvue de croissance
microbienne.

La souche de référence Enterococcus faecalis ATCC 29212 a été utilisée

comme souche témoin.

Tableau 30: Procédé de dilution des antibiotiques (Ericsson & Sherris, 1971).

Concentration de Concentration
la solution initiale Dilutions Concentration Dilution finale dans le
en antibiotique obtenue µg/mL milieu de culture
(µg/mL) µg/mL
1/2 2560 256
Solution A 1/4 1280 1/10 128
5120 1/8 640 64
1/16 320 32
1/2 160 16
Solution B 1/4 80 1/10 8
320 1/8 40 4
1/16 20 2
1/2 10 1
Solution C 1/4 5 1/10 0,5
20 1/8 2,5 0,25
1/16 1,125 0,125
1/32 0,62 0,062
F.3. Méthode de dilution en bouillon (IV)

La méthode de dilution en bouillon est une procédure simple

permettant de tester un petit nombre d'isolats, même un seul isolat.

177 | P a g e
 Annexes

La technique consistait à préparer une première suspension bactérienne

à 0,5 McFarland, cette suspension a été utilisée pour inoculer les bouillons
MRS, M17 ou MH additionnés d’antibiotique (voir tableau 30, Ericsson et
Sherris 1971) en raison d’avoir vers la fin une charge bactérienne de 5 10 5
UFC/mL. La croissance des bactéries a été observée à l’œil nu après 24 h
d’exposition à l’antibiotique à 30 ou 37 °C.

La concentration minimale inhibitrice, est la plus faible concentration

d'antibiotique où il n’y a pas de croissance bactérienne visible.

178 | P a g e
 Annexes

Annexe 3 : Critères morphologiques et biochimiques de BL.

Tableau 31 : Caractéristiques différenciant les 12 genres de BL

(Sneath, 1986; Williams et al., 1990).

FT TF/ 45°C 6,5% 18% pH 9,6

Genre\Test
Glucose NaCl NaCl
Carnobacterium - - - ND - -
Lactobacillus - ± ± ± - -
Aerococcus + - - + - +
Enterococcus - - + + - +
Lactococcus/
- - - - - -
Vagocuccus
Leuconostoc/
- + - ± - -
Oenococcus
Pediococcus + - ± ± - -
Streptococcus - - - - - -
Tetragenococcus + - - + + +
Weissella - + - ± - -

- : Réaction négative ; + : Réaction positive ; ± : variable selon l’espèce ; FT : Formation de

tétrades ; TF/Glucose : type fermentaire par rapport au glucose ; 45 °C : croissance à 45 °C,
pH 9,6 : croissance à pH 9,6 ; 6,5% NaCl : croissance en présence de 6,5 % NaCl ; 18% NaCl
: croissance en présence de 18% NaCl ; ND : non déterminé.

Tableau 32: Différenciation du lactocoque et des coques similaires à Gram positif

(Frank et al., 2002).

6,5% 0,1%
Genre 10°C 45°C TF pH 9,6 ADH
NaCl BM
Enterococcus + + + - + + +
Lactococcus + - - - - ± ±
Streptococcus - + - - - ± -
Leuconostoc + + - + ND - ND

- : Réaction négative ; + : Réaction positive ; ± : variable selon l’espèce ; 10 °C : croissance

à 10 °C ; 45 °C : croissance à 45 °C ; 6,5% NaCl : croissance en présence de 6,5 % NaCl ; TF
: type fermentaire ; ADH : arginine dihydrolase, 0,1% MB : réduction de bleu de méthylène
à 0,1% ; ND : non déterminé.

179 | P a g e
 Annexes

Annexes 4 : Caractéristiques des isolatsa de différents biotopes (I-II).

Tableau 33: Caractéristiques des isolatsa de lait de vaches.

°C %NaCl Lait au BM pH
Isolats TR TF ADH Pré-identifié à Identifié à
10 45 4 6,5 0,1% 0,3% 9,5
LVS1 - - - - - + + - - + Lactobacillus spp
LVS2 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
LVS3 + + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecalis**

LVS4 - - - + - + - - + - Lactobacillus spp

LVS5 - - - + - + + - - - Lactobacillus spp
LVS6 - - - + - + + + - - Lactobacillus spp
LVS7 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
LVS8 - - - + - + + + - - Lactobacillus spp L. plantarum*

LVS9 + + - + - + - - - - Leuconostoc spp

LVS10 - - - + - + + + - - Lactobacillus spp
LVS11 - - - - - - + + - - Lactococcus spp
LVS12 + - - + - + + + - + Lactobacillus spp
LVS13 - - - + - + + + - + Lactobacillus spp
LVS14 + + - + - + + - - - Leuconostoc spp
LVS15 - - + - - - + + - - Lactococcus spp
LVS16 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecalis**

LVS17 - - - + - + + + + + Lactobacillus spp

LVS18 - - - + - + - - - + Lactobacillus spp
LVS19 - - - + + - + + - - Lactobacillus spp L. casei*

LVS20 + - - + - - + + - - Lactococcus spp

LVS21 - - - + - + - + - + Lactobacillus spp
LVS22 - + - + - + - - - + Lactobacillus spp
LVS23 - + - + - - - - - - Streptococcus spp
LVS24 + - - + + - - - - + Lactobacillus spp L. brevis*

LVS25 + - - + + - - - - + Lactobacillus spp

LVB1 + - - + - - + + - - Lactococcus spp
LVB2 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecium**

LVB3 + - - + - - + + - - Lactococcus spp

LVB4 + + - + - + - - - - Leuconostoc spp
LVB5 - - - + - - + + - - Lactococcus spp
LVB6 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
LVB7 + - - + - - + + - + Lactococcus spp

180 | P a g e
 Annexes

Tableau 34: (Suite) Caractéristiques des isolatsa de lait de vaches.

°C %NaCl Lait au BM pH
Isolats TR TF ADH Pré-identifié à Identifié à
10 45 4 6,5 0,1% 0,3% 9,5
LVC1 + + - + - + - - - - Leuconostoc spp
LVC2 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
LVC3 + + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecium**
LVC4 - - - + - - - - - - Lactobacillus spp L. casei*
LVC5 - - - + - + - - - + Lactobacillus spp
LVC6 - - - + - + + + - - Lactobacillus spp
LVC7 + - - + - - + + - - Lactococcus ssp
LVC8 - + - + - - - - - + Streptococcus spp
LVC9 + + - + - + - - - - Leuconostoc spp
LVC10 - - - - - + + - - + Lactobacillus spp L. acidophilus*
Lc.lactis ssp
LVC11 + - - + - + + + - - Lactococcus spp
lactis*
LVC12 + - - + - - + + - - Lactococcus ssp
LVC13 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecalis**
LVC14 - - - + - + + + - - Lactococcus spp
LVC15 + - - + - - + + - + Lactobacillus spp L. brevis*
LVC16 + - - + - - + + - - Lactococcus ssp
LVC17 + - - + - + + + - - Leuconostoc spp
LVC18 - - + + - + + + - - Lactococcus spp
LVC19 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecalis**
LVC20 - - + + - + + + - - Lactococcus spp
LVC21 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
LVC22 + - - + + + + + - + Lactobacillus spp L. brevis*
LVC23 - - - + - - - - - + Streptococcus spp
LVC24 - - - + - + - + - - Lactobacillus spp L. plantarum*
LVC25 - + - + - - - - - + Lactobacillus spp L. brevis*
LVC26 - - - + - - - - - + Streptococcus spp
a : Gram positif et catalase négative ; - : Réaction négative ; + : Réaction positive ; 10 °C :
croissance à 10 °C ; 45 °C : croissance à 45 °C ; 6,5% NaCl : croissance en présence de 6,5 %
NaCl ; TF : type fermentaire ; TR : thermorésistance (60°C/30min) ; ADH : arginine
dihydrolase, 0,1% MB : réduction de bleu de méthylène à 0,1% ; 0,3% MB : réduction de
bleu de méthylène à 0,3%. * :Identification par API 50CH ; ** : Identification par API 20
STREP.

181 | P a g e
 Annexes

Tableau 35: Caractéristiques des isolatsa de lait de chamelles.

°C %NaCl Lait au BM pH
Isolats TR TF ADH Pré-identifié à Identifié à
10 45 4 6,5 0,1% 0,3% 9,5
MCE1 + - - + - + + + - - Lactococcus spp
MCE2 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
MCE3 + + + + + - + - + + Enterococcus spp
MCE4 + - - + - - + + - + Lactobacillus spp
MCE5 + + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecium**

MCE6 - - - + - + + + - - Lactobacillus spp

MCE7 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
MCE8 - - - + - + + + - + Lactobacillus spp
MCE9 + - - + - + - - - - Leuconostoc spp
MCE10 + - - + - + + + - - Lactococcus spp
MCE 11 - - - + - + + + - - Lactococcus spp
MCB1 - - - + - - + + - + Lactobacillus spp
MCB2 - + + + + + + - + + Enterococcus spp
MCB3 + - + + - + + + - - Lactococcus spp
MCB4 - + + + + + + - + + Enterococcus spp
MCB5 - - - + - - + + - + Lactobacillus spp
MCB6 + - - + - + + + - - Lactococcus spp
MCB7 + - - + - + + + - - Lactococcus spp
MCB8 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
MCB9 - + + + + + + - + + Enterococcus spp E. faecalis**
MCB10 - + - + - - - - - + Lactobacillus spp
MCB11 - + - + - - - - - + Streptococcus spp
MCB12 + - - + + - - - - + Lactobacillus spp
MCB13 - + - + - - - - - + Streptococcus spp
a : Gram positif et catalase négative ; - : Réaction négative ; + : Réaction positive ; 10 °C :
croissance à 10 °C ; 45 °C : croissance à 45 °C ; 6,5% NaCl : croissance en présence de 6,5 %
NaCl ; TF : type fermentaire ; TR : thermorésistance (60°C/30min) ; ADH : arginine
dihydrolase, 0,1% MB : réduction de bleu de méthylène à 0,1% ; 0,3% MB : réduction de
bleu de méthylène à 0,3%. * :Identification par API 50CH ; ** : Identification par API 20
STREP.

182 | P a g e
 Annexes

Tableau 36: (Suite) Caractéristiques des isolatsa de lait de chamelles.

°C %NaCl Lait au BM pH
Isolats TR TF ADH Pré-identifié à Identifié à
10 45 4 6,5 0,1% 0,3% 9,5
MCN1 - + - - - + + - - + Lactobacillus spp
Lc. lactis ssp
MCN2 + - - - - - + - - - Lactococcus spp
cremoris*
MCN3 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
MCN4 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
MCN5 - - - - - + + - - + Lactobacillus spp
MCN6 - - - + - - + + - - Lactococcus spp
MCN7 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecium**
MCN8 + - - + - - + - - + Lactococcus spp
MCN9 + + - + - + - - - - Leuconostoc spp
MCN10 - + - + - + + + - - Lactobacillus spp
MCN11 - - - - - - + + - - Lactococcus spp
MCN12 + - - + - + + + - + Lactobacillus spp L. helveticus*
MCN13 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
MCN14 - - - + - + + + - + Lactobacillus spp
MCN15 + + - + - + + - - - Leuconostoc spp
MCN16 - - + - - - + + - - Lactococcus spp
MCN17 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
MCN18 - - - - - + + - - + Lactobacillus spp
a : Gram positif et catalase négative ; - : Réaction négative ; + : Réaction positive ; 10 °C :
croissance à 10 °C ; 45 °C : croissance à 45 °C ; 6,5% NaCl : croissance en présence de 6,5 %
NaCl ; TF : type fermentaire ; TR : thermorésistance (60°C/30min) ; ADH : arginine
dihydrolase, 0,1% MB : réduction de bleu de méthylène à 0,1% ; 0,3% MB : réduction de
bleu de méthylène à 0,3%. * :Identification par API 50CH ; ** : Identification par API 20
STREP.

183 | P a g e
 Annexes

Tableau 37: Caractéristiques des isolatsa de camemberts.

°C %NaCl Lait au BM pH
Isolats TR TF ADH Pré-identifié à Identifié à
10 45 4 6,5 0,1% 0,3% 9,5
CB1 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
CB2 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
CB3 + + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecium**
CB4 - - + - - - + + - - Lactococcus spp
CB5 + + - + - + - - - - Leuconostoc spp
CB6 - - - + - + + + - - Lactobacillus spp
CB7 + - - + + - + + - + Lactococcus spp
CB8 - + + + + - + - - + Enterococcus spp
CB9 + + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecium**
CB10 - + + + + - + - - + Enterococcus spp
CB11 - - - - - - + + - - Lactococcus spp
Lc. lactis ssp
CB12 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
lactis*
CB13 - + - + - - - - - - Streptococcus spp
CB14 + + - + - + + - - - Leuconostoc spp
CB15 - - + - + - + + - - Lactococcus spp
CB16 - + - + - - - - - - Streptococcus spp
CB17 - - - + - - - - - - Streptococcus spp
CB18 - - - + - + - - - + Lactobacillus spp
CB19 + - - + + - + + - - Lactococcus spp
CB20 + - - + + - + + - - Lactococcus spp
CB21 - - - + - + - + - + Lactobacillus spp L. acidophilus*
CB22 - + - + - + - - - - Lactobacillus spp L. plantarum*
CB23 - + - + - - - - - - Streptococcus spp
CB24 + - - + - - + + - - Lactococcus spp
CB25 + - - + + - - - - + Lactobacillus spp
CB26 - + + + - - + - + + Enterococcus spp E. faecium**
CB27 - + + + - - + - + + Enterococcus spp E. faecium**
CB28 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
CB29 + + - + - + - - - - Leuconostoc spp
CB30 - - - + - - + + - - Lactococcus spp
CB31 + - - + - + - - - - Leuconostoc spp
CB32 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
CB33 + - - + + - + - - - Lactobacillus spp
CB34 - + - + + + - - - + Lactobacillus spp
CB35 + - - + - - + + - - Lactococcus spp
a : Gram positif et catalase négative ; - : Réaction négative ; + : Réaction positive ; 10 °C :
croissance à 10 °C ; 45 °C : croissance à 45 °C ; 6,5% NaCl : croissance en présence de 6,5 %
NaCl ; TF : type fermentaire ; TR : thermorésistance (60°C/30min) ; ADH : arginine
dihydrolase, 0,1% MB : réduction de bleu de méthylène à 0,1% ; 0,3% MB : réduction de
bleu de méthylène à 0,3%. * :Identification par API 50CH ; ** : Identification par API 20
STREP.

184 | P a g e
 Annexes

Tableau 38: Caractéristiques des isolatsa de Jben.

°C %NaCl Lait au BM pH
Isolats TR TF ADH Pré-identifié à Identifié à
10 45 4 6,5 0,1% 0,3% 9,5
JB1 + - - - - - + - - - Lactobacillus spp
JB2 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
JB3 + + + + + - + - + + Enterococcus spp
JB4 - + - + - - - - + - Lactobacillus spp
JB5 - - - + - - + - - - Lactobacillus spp
JB6 - + - - - - + - - + Lactobacillus spp
JB7 + - - + - - + - - - Lactococcus spp
JB8 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
JB9 + - - + - - + + - + Lactococcus spp
JB10 - - - - - - + - - + Lactobacillus spp
JB11 - - - + - - + + - - Lactococcus spp
JB12 + - - + - - + + - - Lactobacillus spp
JB13 - - - + - - + + - - Lactobacillus spp
JB14 - - - + - - + - - - Lactococcus spp
JB15 - - + - - - + + - - Lactococcus spp
JB16 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecalis**
JB17 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
JB18 - - - + - - - - - + Lactobacillus spp
JB19 - - - + + - + + - - Lactobacillus spp
a : Gram positif et catalase négative ; - : Réaction négative ; + : Réaction positive ; 10 °C :
croissance à 10 °C ; 45 °C : croissance à 45 °C ; 6,5% NaCl : croissance en présence de 6,5 %
NaCl ; TF : type fermentaire ; TR : thermorésistance (60°C/30min) ; ADH : arginine
dihydrolase, 0,1% MB : réduction de bleu de méthylène à 0,1% ; 0,3% MB : réduction de
bleu de méthylène à 0,3%. * :Identification par API 50CH ; ** : Identification par API 20
STREP.

185 | P a g e
 Annexes

Tableau 39: Caractéristiques des isolatsa des jéjunums de poules.

°C %NaCl Lait au BM pH
Isolats TR TF ADH Pré-identifié à Identifié à
10 45 4 6,5 0,1% 0,3% 9,5
JP1 - - - - - + + - - + Lactobacillus spp
JP2 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
JP3 + + + + + - + - + + Enterococcus spp E. hirae **
JP4 - + - + - + - - - - Lactobacillus spp
JP5 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecalis**
JP6 + - - + - + + + - - Lactobacillus spp
JP7 - - - + - - - - - + Streptococcus spp
JP8 - - - + - - - - - + Streptococcus spp
JP9 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
JP10 - + - - - + + - - + Lactobacillus spp
JP11 - + - - - + + - - + Lactobacillus spp
JP12 + - - + - + + + - + Lactobacillus spp
JP13 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecalis**
JP14 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecalis**
JP15 + - - + - + + + - + Lactobacillus spp
JP16 - + - - - + + - - + Lactobacillus spp
JP17 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecalis**
JP18 - - - + - - - - - + Streptococcus spp
JP19 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecium**
JP20 - - - + - - - - - + Streptococcus spp
JP21 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
JP22 - - - + + - + + - + Lactobacillus spp
JP23 - - - + - - - - - + Streptococcus spp
JP24 - - - + - + - + - + Lactobacillus spp
JP25 - + - + - - - - - - Lactobacillus spp
JP26 - - - + - - - - - + Streptococcus spp
JP27 + - - + - + + + - + Lactobacillus spp
JP28 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
JP29 - - - + - + - - - - Lactobacillus spp
JP30 - - - - - + + - - + Lactobacillus spp
JP31 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecium**
JP32 - + + + + - + - + + Enterococcus spp E. faecium**
Lc. lactis ssp
JP33 + - - + - + + + - + Lactococcus spp
lactis*
JP34 - - - + - - - - - + Streptococcus spp
JP35 + + - + - + - - - + Lactobacillus spp
JP36 - + + + + - + - + + Enterococcus spp
JP37 + + + + + - + - + + Enterococcus spp
JP38 - - - + - + - - - - Lactobacillus spp L. plantarum*
a : Gram positif et catalase négative ; - : Réaction négative ; + : Réaction positive ; 10 °C :
croissance à 10 °C ; 45 °C : croissance à 45 °C ; 6,5% NaCl : croissance en présence de 6,5 %
NaCl ; TF : type fermentaire ; TR : thermorésistance (60°C/30min) ; ADH : arginine
dihydrolase, 0,1% MB : réduction de bleu de méthylène à 0,1% ; 0,3% MB : réduction de
bleu de méthylène à 0,3%. * :Identification par API 50CH ; ** : Identification par API 20
STREP.

186 | P a g e
 Annexes

Annexe 5 : Valeurs de CMI de BL fixées par CLSI et FEEDAP.

Tableau 40: Valeurs de CMI fixées par CLSI pour le genre Lactobacillus

CMI (µg/mL)
Antibiotique
S I R
Pénicilline ≤8 - -
Ampicilline ≤8 - -
Imipenème ≤ 0,5 1 ≥2
Gentamycine ≤4 8 ≥ 16
Vancomycine ≤2 4-8 ≥ 16
Daptomycine ≤4 - -
Erythromycine ≤ 0,5 1-4 ≥8
Clindamycine ≤ 0,5 1 ≥2
Linezolide ≤4 - -

Tableau 41: Normes d'interprétation du diamètre de la zone et de la CMI fixées par

CLSI pour le genre Enterococcus

Diamètre de zone d’inhibition (mm

CMI (µg/mL)
près)
Antibiotique
Charge
S I R S I R
de disc
Pénicilline 10 unités ≥15 - ≤14 ≤8 - ≥16
Ampicilline 10 µg ≥17 - ≤16 ≤8 - ≥16
Teicoplanin 30 µg ≥14 11-13 ≤10 ≤8 16 ≥32
Rifampin 5 µg ≥20 17-19 ≤16 ≤1 2 ≥4
Fosfomycin 200 µg ≥16 15-18 ≤14 ≤4 8 ≥16
Vancomycine 30 µg ≥17 15-16 ≤14 ≤4 8-16 ≥32
Chloramphenicol 30 µg ≥18 13-17 ≤12 ≤8 16 ≥32
Erythromycine 15 µg ≥23 14-22 ≤13 ≤0,5 1-4 ≥8
Tétracycline 30 µg ≥19 15-18 ≤14 ≤4 8 ≥16
Doxycycline 30 µg ≥16 13-15 ≤12 ≤4 8 ≥16
Linezolid 30 µg ≥23 21-22 ≤20 ≤2 4 ≥8

Tableau 42: Valeurs de CMI fixées par CLSI pour le genre Leuconostoc

CMI (µg/mL)
Antibiotique
S I R
Pénicilline ≤8 - -
Ampicilline ≤8 - -
Gentamycine ≤ 0,5 1 ≥2
Minocycline ≤4 8 ≥ 16
Chloramphénicol ≤2 4-8 ≥ 16

187 | P a g e
 Annexes

Tableau 43: Normes d'interprétation du diamètre de la zone et de la CMI fixées par

CLSI pour le genre Streptococcus

Diamètre de zone d’inhibition (mm

CMI (µg/mL)
près)
Antibiotique
Charge
S I R S I R
de disc
Pénicilline 10 unités ≥24 - - ≤0,12 0,25-2 ≥4
Ampicilline 10 µg ≥24 - - ≤0,25 0,5-4 ≥8
Cefotaxime 30 µg ≥28 26-27 ≤25 ≤1 2 ≥4
Ceftriaxone 30 µg ≥27 25-26 ≤24 ≤1 2 ≥4
Clindamycin 2 µg ≥19 16-18 ≤15 ≤0,25 0,5 ≥1
Vancomycine 30 µg ≥17 - - ≤1 - -
Chloramphenicol 30 µg ≥21 18-20 ≤17 ≤4 8 ≥16
Erythromycine 15 µg ≥21 16-20 ≤15 ≤0,25 0,5 ≥1
Tétracycline 30 µg ≥23 19-22 ≤18 ≤2 4 ≥8
Azithromycin 15 µg ≥18 14-17 ≤13 ≤0,5 1 ≥2
Linezolid 30 µg ≥21 - - ≤2 - -

Tableau 44: Valeurs de CMI fixées par FEEDAP

Chloramphenicol
Erythromycine
Streptomycine
Vancomycine

Gentamycine

Clindamycin
Kanamycine

Tétracycline
Ampicilline

Lactobacillus homofermentaire obligatoirea 1 2b 16 16 16 1 1 4 4

Groupe de Lactobacillus acidophilus 1 2 16 64 16 1 1 4 4
Lactobacillus hétérofermentaire obligatoirec 2 n.r. 16 32 64 1 1 8 4
Lactobacillus reuteri 2 n.r. 8 64 64 1 1 16 4
Lactobacillus hétérofermentaire facultatif 4 n.r. 16 64 64 1 1 8 4
Lactobacillus plantarum/pentosus 2 n.r. 16 64 n.r. 1 2 32 8
Lactobacillus rhamnosus 4 n.r. 16 64 32 1 1 8 4
Lactobacillus casei /paracasei 4 n.r. 32 64 64 1 1 4 4
Lactococcus lactis 2 4 32 64 32 1 1 4 8
Leuconostoc 2 n.r. 16 16 64 1 1 8 4
Streptococcus thermophilus 2 4 32 64 64 2 2 4 4
Enterococcus 4 4 32 512 128 4 4 8 8

188 | P a g e
 Annexes

Annexe 6: Définitions importantes dans l’analyse bioinformatique des

génomes.

Le séquençage complet d'un génome avec les NGS conduit à un nombre

colossal de petits fragments séquencés (un grand nombre de petites séquences
ou reads) que l'on essaye ensuite d'assembler en contigs. La qualité de
couverture du séquençage et donc liée à celle des contigs (leur longueur et
leur continuité) et donc au nombre de gaps.

Reads (Lecture) : une séquence d'un fragment.

La couverture d'une séquence est le nombre moyen de fois qu'une

base du génome est représentée dans la séquence des Reads.

Profondeur de couverture : nombre de reads chevauchante à une

région donnée (en X).

Contigs : séquences continues générées par l'alignement de séquences

de fragments qui se chevauchent.

L'assemblage : La comparaison des séquences permet d'aligner les

parties qui se recouvrent partiellement ou chevauchantes. Les séquences
chevauchantes peuvent être reliées en enchainements plus grands que l'on
appelle contigs. En reliant l'ensemble des contigs, on reconstitue des
séquences de plusieurs millions à plusieurs dizaines de millions de bases. Ces
opérations sont effectuées par des programmes bio-informatiques.

Les trous ou "gap" : parties du génome non séquencées ou dont les

séquences ne chevauchent pas avec d'autres et ne peuvent donc entrer dans
un contig. Comme le séquençage est effectué sur des sous-fragments Plis de
manière aléatoire, même avec un tel niveau de redondance, il reste des
parties non assemblées : des trous ("gap") qui peuvent être "comblés" par un
travail ciblé. Les trous "gaps" sont de longueur connue.

Scaffold : ensemble de contigs orientés et ordonnés.

Mapped scaffold : ensemble de scaffolds localisés le long des

chromosomes (pas forcément ordonnés ou orientés). Pour déterminer les

189 | P a g e
 Annexes

relations de voisinage des contigs, les liens clones sont considérés, c'est-à-dire
les lectures obtenues aux deux extrémités d'un même fragment d'ADN. On
recherche parmi ces paires celles qui s'ancrent dans deux contigs différents.
Cela permet de jeter un pont entre les deux contigs et de les orienter. De
plus, le fragment d'ADN "à cheval" sur le trou entre les deux contigs peut
faire l'objet d'un séquençage supplémentaire, ce qui permet de combler le
trou.

Figure 39: Séquençage "Paire ends reads" selon illumina

La lecture des profils bruts ou "base-calling" : c'est la

détermination de la séquence par appel de bases qui s'effectue en routine par
des programmes informatiques qui déterminent l'identité des bases,
comparent les séquences et fournissent une plate-forme intuitive de
correction.

Régions de faible complexité : parties du génome dont les

séquences sont très peu diversifiées comme les séquences répétées.

Métagénomique étude du génome d'un organisme prélevé

directement dans un environnement complexe (intestin, océan, sols, ...), à
l'inverse d'un organisme de laboratoire. Le but est d'obtenir des informations

190 | P a g e
 Annexes

sur l'incidence de cet environnement. Le préfixe "méta" signifie « après, au-

delà de, avec.. ».

Les assembleurs de novo sont un type de « software » qui assemble

des séquences nucléotidiques courtes en séquences plus longues sans
l'utilisation d'un génome de référence. Ils sont le plus souvent utilisés dans
les études bioinformatiques pour assembler des génomes ou des
transcriptomes.

191 | P a g e

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