Ddoc T 2021 0045 Larue

Développement de nouvelles plateformes pour
l’amélioration du traitement du glioblastome par

thérapie photodynamique
Ludivine Larue
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Ludivine Larue. Développement de nouvelles plateformes pour l’amélioration du traitement du
glioblastome par thérapie photodynamique. Génie des procédés. Université de Lorraine, 2021.
Français. �NNT : 2021LORR0045�. �tel-03338347�
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Université de Lorraine
Ecole doctorale SIMPPE (Sciences et Ingénierie des Molécules, des Produits, des
Procédés et de l’Energie)
Thèse
Pour l’obtention du titre de
Docteur de l’Université de Lorraine

Mention : « Génie des Procédés et des Produits et des Molécules »
Développement de nouvelles plateformes pour

l’amélioration du traitement du glioblastome par
thérapie photodynamique
Par Ludivine LARUE

Présentée et soutenue publiquement le 4 février 2021
Membres du Jury :
Rapporteurs : Muriel AMBLARD DR CNRS, IBMM, Université de Montpellier
Valérie HEITZ Professeur, LSAMM, Université de Strasbourg
Examinateurs : Cédric BOURA MdC, CRAN, Université de Lorraine
Serge MORDON DR INSERM, OncoThAI, Université de Lille
Céline FROCHOT DR CNRS, LRGP, Université de Lorraine (Directrice de

thèse)
Samir ACHERAR MdC, LCPM, Université de Lorraine (Co–directeur de

thèse)
Invités : Sylvain MARQUE Professeur, ICR, Université Aix Marseille
Bertrand VILENO CR CNRS, Laboratoire POMAM, Université de

Strasbourg
Laboratoire Réactions et Génie des Procédés – Université de Lorraine–CNRS (UMR 7274)

1 rue Grandville – BP 24051 – F–54001 Nancy Cedex
II
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier Laurent Falk, directeur du Laboratoire Réactions et
Génie des Procédés (LRGP), et Alain Durand, directeur du Laboratoire de Chimie
Physique Macromoléculaire (LCPM), de m’avoir accueillie au sein de leur laboratoire.
Je remercie le Pr Valérie Heitz et le Dr Muriel Amblard pour avoir accepté d’évaluer

mon travail de thèse et également le Pr Serge Mordon, le Dr Cédric Boura, le Pr Sylvain
Marque et le Dr Bertrand Vileno pour avoir accepté de faire partie de mon jury.
Je tiens ensuite à remercier ma directrice de thèse, Céline Frochot et mon co-directeur

de thèse, Samir Acherar. Merci pour votre confiance et toutes les connaissances et
expériences que vous avez partagées. Céline, merci pour ta bienveillance et ta gentillesse
et surtout d’avoir cru en moi, de m’avoir aidé à surmonter les aléas de ces trois années et
de m’avoir appris à canaliser mes idées. Samir, merci pour ta disponibilité, ta gentillesse
et tes conseils.
Mes remerciements s’adressent ensuite aux membres de la PDTeam, anciens et

nouveaux, sans qui ces trois années n’auraient pas été les mêmes : Albert, Amina,
Bauyrzhan, Bibigul, Laurène, Ludo, Mathilde, Magali, Maxat, Philippe, Régis, Yasmin,
Zahraa... Merci pour votre soutien, vos conseils et tous les bons moments passés avec vous.
Philippe, un grand merci pour ta gentillesse, pour avoir toujours été disponible pour
répondre à mes « nombreuses » questions, réparer les appareils non coopératifs ou tout
simplement pour discuter. Régis, nous n’avons eu que peu l’occasion de travailler ensemble
mais j’ai apprécié toutes nos discussions et je suis reconnaissante pour l’aide que tu m’as
apportée. Merci également à Valérie Jouan Hureaux pour tes conseils et ton aide.
Je souhaite ensuite remercier les membres du LCPM avec qui j’ai pu échanger, pour
les discussions et conseils, Djallal, Loïc, Olivier, Tristan.
Un grand merci aux membres de mon « couloir » au LRGP, pour les pauses café, les
repas, les parties de UNO ou simplement les discussions au détour d’un couloir :
Frédérique, Olivier, Pierre-Alexandre, Valérie, Yann, Yves… et les doctorants et post-
doctorants, anciens et actuels, Aleix, Batukhan, Bilel, Duy, Hatem, Isma, Jonathan, Juan
Carlos, Lucia, Maroua, Matieyendou, Nicolas, Perizat, Selima, Susu, Sylvain, Thomas,
Zaki...
Je souhaite remercier également les membres du BJC, anciens et nouveaux, pour tous
les moments passés au laboratoire mais aussi pour les soirées autour d’un verre ou d’un
billard.
III
Merci mon antillais de l’ile Saint-Laurent et ma Mama italienne pour votre aide,
d’avoir toujours su me remonter le moral lorsque mes expériences étaient capricieuses,
pour toutes nos discussions et tout simplement pour votre bonne humeur au quotidien.
Merci ma tartif pour ton aide et ton soutien précieux pour cette fin de thèse et tous les
moments passés ensemble.
Un grand merci également à Clément, Laetitia, Louise, Lubin, Ophélia, Sylvain et

Yohann pour toutes les repas ou soirées passés ensemble, indispensables durant ces 3 ans.
Laetitia merci pour ta gentillesse, ton soutien et toute l’aide précieuse que tu as su
m’apporter. Louise, tu n’étais pas ma stagiaire mais tu as toujours su m’apporter ton
soutien.
Merci à mes parents et mon frère, d’avoir toujours cru en moi et pour votre soutien.
Maman et Papa, merci de m’avoir toujours encouragée à atteindre mes objectifs et appris
à toujours persévérer. Merci de m’avoir permis d’en être là.
IV
Sommaire
REMERCIEMENTS .................................................................................................................................... III
SOMMAIRE .............................................................................................................................................. V
ABREVIATIONS ....................................................................................................................................... XI
LISTE DES FIGURES ................................................................................................................................XV
LISTE DES TABLEAUX .......................................................................................................................... XXI
INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................................... 1
CHAPITRE I : LA THERAPIE PHOTODYNAMIQUE POUR TRAITER LE CANCER ................... 7
I. CANCER ................................................................................................................................................ 9
I.1. Epidémiologie ........................................................................................................................... 9
I.2. Qu’est–ce que le cancer ? .......................................................................................................... 9
I.3. Diagnostic ............................................................................................................................... 12
I.4. Traitements.............................................................................................................................. 14
I.4.1. La chirurgie .............................................................................................................................................14
I.4.2. La radiothérapie ......................................................................................................................................15
I.4.3. La chimiothérapie ...................................................................................................................................15
I.4.4. L’immunothérapie ...................................................................................................................................15
I.4.5. L’hormonothérapie..................................................................................................................................16
I.5. Cas des tumeurs cérébrales ..................................................................................................... 16
I.5.1. Anatomie du cerveau ..............................................................................................................................16
I.5.2. Epidémiologie .........................................................................................................................................17
I.5.3. Classification des tumeurs cérébrales primitives ...................................................................................18
I.6. Cas du glioblastome multiforme .............................................................................................. 18
I.6.1. Causes et symptômes ..............................................................................................................................18
I.6.2. Diagnostic et traitements ........................................................................................................................19
I.6.2.1. Diagnostic ...........................................................................................................................................19
I.6.2.2. Modalités de traitement classiques ....................................................................................................19
I.6.2.3. Traitement par PDT ............................................................................................................................20
II. LA THERAPIE PHOTODYNAMIQUE (PDT) ............................................................................................. 21
II.1. Découverte de l’effet photodynamique et application pour le traitement du cancer .............. 21
II.2. La PDT pour le traitement du cancer .................................................................................. 23
II.3. Mécanismes photophysiques ................................................................................................ 23
II.3.1. Photoréactions de type I ..........................................................................................................................25
II.3.2. Photoréactions de type II ........................................................................................................................26
II.3.3. Paramètres ...............................................................................................................................................26
II.4. Lumière ............................................................................................................................... 27
II.4.1. Paramètres utilisés dans le choix de la source lumineuse......................................................................27
II.4.2. Sources lumineuses utilisées en PDT .....................................................................................................29
II.4.2.1. Le soleil..............................................................................................................................................30
II.4.2.2. Lasers .................................................................................................................................................30
V
II.4.2.3. Lampes ...............................................................................................................................................30
II.4.2.4. Diodes électroluminescentes (DELs)................................................................................................31
II.5. Photosensibilisateurs (PSs) utilisés en PDT......................................................................... 31
II.5.1. Caractéristiques d’un bon photosensibilisateur (PS) .............................................................................31
II.5.2. Première génération ................................................................................................................................31
II.5.3. Seconde génération .................................................................................................................................32
II.5.3.1. Foscan® .............................................................................................................................................33
II.5.3.2. Acide 5–aminolévulinique (ALA) et ses dérivés .............................................................................34
II.5.3.3. Visudyne® .........................................................................................................................................35
II.5.3.4. Tookad ® ...........................................................................................................................................36
II.5.3.5. Autres PSs de seconde génération ....................................................................................................36
II.5.4. Troisième génération ..............................................................................................................................37
II.5.5. Quatrième génération ..............................................................................................................................37
III. LIMITES DE LA PDT .......................................................................................................................... 38
III.1. Pénétration de la lumière .................................................................................................... 38
III.1.1. Excitation biphotonique dans le proche infrarouge ...............................................................................38
III.1.2. Utilisation des rayons X ..........................................................................................................................40
III.2. Ciblage................................................................................................................................ 40
III.2.1. Ciblage passif ..........................................................................................................................................41
III.2.2. Ciblage actif ............................................................................................................................................43
III.2.2.1. Ciblage actif direct ...........................................................................................................................44
III.2.2.1.i. Récepteur du facteur de croissance de l’épiderme (EGF) ........................................................44
III.2.2.1.ii. Récepteur de l’œstrogène .........................................................................................................44
III.2.2.1.iii. Récepteur à l’acide folique ......................................................................................................45
III.2.2.2. Ciblage actif indirect ........................................................................................................................45
III.2.2.2.i. Intégrine αvβ3 .............................................................................................................................45
III.2.2.2.ii. Récepteur du VEGF (Vascular endothelial growth factor) ....................................................46
III.2.2.2.iii. Le récepteur NRP–1 ................................................................................................................47
Structure et fonction de NRP–1 ................................................................................................................47
Rôle de NRP–1 dans le développement de tumeurs ................................................................................48
Ciblage de NRP–1.....................................................................................................................................49
III.3. Nécessité en oxygène ........................................................................................................... 49
III.3.1. Stratégies pour combattre l’hypoxie.......................................................................................................49
III.3.2. Utilisation d’alcoxyamines photoactivables en PDT .............................................................................50
IV. OBJECTIFS DE LA THESE .................................................................................................................... 52
V. REVUE ............................................................................................................................................... 54
CHAPITRE II : LA PDT CIBLEE ET INDEPENDANTE DE L’OXYGENE : UNE PREUVE DE

CONCEPT..................................................................................................................................................... 171
I. CIBLAGE DU RECEPTEUR NRP–1 PAR DES PEPTIDES............................................................................ 173

II. LES ALCOXYAMINES PHOTOACTIVABLES .......................................................................................... 174
III. CONTEXTE ET OBJECTIFS ................................................................................................................. 175
IV. SYNTHESE ET PURIFICATION DES COMPOSES .................................................................................... 176
IV.1. Synthèse peptidique en phase solide (SPPS) ...................................................................... 176
VI
IV.1.1. Principe..................................................................................................................................................176
IV.1.2. Stratégies de synthèse et résines utilisées ............................................................................................178
IV.1.3. Suivi de la SPPS ....................................................................................................................................182
IV.1.3.1. Dosage du groupement Fmoc ........................................................................................................182
IV.1.3.2. Tests colorimétriques .....................................................................................................................183
IV.1.3.3. Micro–clivage.................................................................................................................................183
IV.1.3.4. Capping ...........................................................................................................................................184
IV.1.4. Agents de couplage ...............................................................................................................................184
IV.1.4.1. Les carbodiimides ..........................................................................................................................184
IV.1.4.2. Sels de phosphonium......................................................................................................................186
IV.1.4.3. Sels d’uronium ...............................................................................................................................187
IV.1.5. Clivage...................................................................................................................................................189
IV.2. Synthèse des composés ...................................................................................................... 189
IV.2.1. Synthèse du composé K(Pyro–a)DKPPR (7).......................................................................................189
IV.2.2. Synthèse de la plateforme trimodale Alc1’–K(Pyro–a)DKPPR (14)..................................................191
IV.2.2.1. Couplage par chimie click .............................................................................................................191
IV.2.2.2. Couplage par SPPS ........................................................................................................................195
IV.2.3. Synthèse du composé Alc1’–KDKPPR (16)........................................................................................196
IV.3. Purification par HPLC préparative ................................................................................... 197
IV.3.1. Principe..................................................................................................................................................197
IV.3.2. Purification des composés ....................................................................................................................198
V. DETERMINATION DES PROPRIETES PHOTOPHYSIQUES ........................................................................ 201
V.1. Absorption......................................................................................................................... 201
V.2. Fluorescence et production d’1O2 ...................................................................................... 203
V.3. Etudes de photoblanchiment .............................................................................................. 204
VI. HOMOLYSE DE L’ALCOXYAMINE..................................................................................................... 205
VI.1. Suivi par HPLC ................................................................................................................. 205
VI.1.1. Illumination par rayons X .....................................................................................................................205
VI.1.2. Illumination par la lumière UV ............................................................................................................206
VI.2. Suivi par spectroscopie par Résonance Paramagnétique électronique (RPE) .................... 209
VI.2.1. Principe..................................................................................................................................................209
VI.2.1.1. Moment magnétique de l’électron .................................................................................................209
VI.2.1.2. L’effet Zeeman ...............................................................................................................................209
VI.2.2. RPE des radicaux nitroxydes en régime isotrope.................................................................................211
VI.2.2.1. Les interactions hyperfines ............................................................................................................212
VI.2.3. Conditions d’illumination .....................................................................................................................214
VI.2.4. Homolyse des composés .......................................................................................................................214
VI.2.4.1. Influence de la concentration .........................................................................................................215
VI.2.4.2. Influence de l’oxygénation ............................................................................................................217
VI.2.4.3. Influence de l’intensité lumineuse .................................................................................................218
VI.2.4.4. Utilisation d’un piégeur radicalaire ...............................................................................................219
VII. TESTS D’AFFINITE .......................................................................................................................... 221
VIII. ARTICLE ...................................................................................................................................... 222
IX. CONCLUSION .................................................................................................................................. 240
VII
CHAPITRE III : AMELIORATION DES PLATEFORMES POUR LE TRAITEMENT DU
GLIOBLASTOME ....................................................................................................................................... 241
I. CONTEXTE ET OBJECTIFS ................................................................................................................... 243

II. AMELIORATION DU CIBLAGE ............................................................................................................ 244
II.1. Tumor–homing peptides .................................................................................................... 244
II.1.1. Les peptides Lyp–1 et tLyp–1 ..............................................................................................................246
II.1.2. Applications diagnostics et thérapeutique ............................................................................................247
II.1.3. Applications en PDT .............................................................................................................................248
II.2. Purification de peptides hydrophiles.................................................................................. 249
II.2.1. La chromatographie d’interactions hydrophiles (HILIC) ....................................................................249
II.2.2. Comparaison entre la chromatographie en phase inverse et l’HILIC sur les peptides KDKPPR et
tLyp–1 250
II.3. Alascan ............................................................................................................................. 251
II.3.1. Introduction ...........................................................................................................................................253
II.3.2. Materials and methods ..........................................................................................................................254
II.3.2.1. Molecular docking simulation.........................................................................................................254
II.3.2.2. Chemicals and materials..................................................................................................................255
II.3.2.3. Instruments.......................................................................................................................................256
II.3.2.4. Synthesis ..........................................................................................................................................256
II.3.2.5. Biological test–binding study of the peptides on recombinant NRP–1 receptor ..........................261
II.3.3. Results and Discussion .........................................................................................................................262
II.3.3.1. Validation of docking calculations .................................................................................................262
II.3.3.2. Molecular docking ...........................................................................................................................262
II.3.3.3. Synthesis and characterization of the peptides ...............................................................................266
II.3.3.4. Affinity for NRP–1 ..........................................................................................................................266
II.3.4. Conclusion .............................................................................................................................................267
III. AMELIORATION DE LA SOLUBILITE .................................................................................................. 269
III.1. Utilisation des cyclodextrines ............................................................................................ 269
III.2. Couplage de la β–CD au peptide et PS .............................................................................. 271
III.2.1. Synthèse du composé β–CD–KK(Pyro–a)DKPPR (28) ......................................................................271
III.2.2. Amélioration de la solubilité ................................................................................................................273
III.2.3. Propriétés photophysiques ....................................................................................................................273
IV. AMELIORATION DE L’ALCOXYAMINE............................................................................................... 275
IV.1. Choix de la structure ......................................................................................................... 275
IV.2. Couplage d’Alc2 aux différents peptides ............................................................................ 276
IV.2.1. Synthèse du composé Fmoc–K(Alc2) (30) ..........................................................................................276
IV.2.2. Essais de couplage de Alc2 au peptide.................................................................................................277
IV.3. Homolyse .......................................................................................................................... 280
V. CONCLUSION ................................................................................................................................... 283
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ................................................................................................ 285
PARTIE EXPERIMENTALE ............................................................................................................... 291
VIII
I. SYNTHESE ET CARACTERISATIONS DES COMPOSES .............................................................................. 293
I.1. Produits chimiques ................................................................................................................ 293
I.2. Instruments ............................................................................................................................ 293
I.3. Procédures générales ............................................................................................................ 294
I.3.1. SPPS ......................................................................................................................................................294
I.3.2. Purification par HPLC préparative .......................................................................................................295
I.4. Synthèse du composé ester Pyro–a–NHS (1) .......................................................................... 295
I.5. Synthèse du composé Fmoc–K(Pyro–a) (2) ............................................................................ 296
I.6. Caractérisation du composé K(Pyro–a)DKPPR (7) ............................................................... 297
I.7. Synthèse de la plateforme trimodale Alc1’–K(Pyro–a)DKPPR (14) ....................................... 299
I.7.1. Essai de synthèse par chimie click .......................................................................................................299
I.7.1.1. Synthèse du composé ester Alc1’–NHS (8) ....................................................................................299
I.7.1.2. Synthèse du composé Alc1’–alcyne (9)...........................................................................................299
I.7.1.3. Synthèse du composé azido–K(Pyro–a)DKPPR (11) .....................................................................300
I.7.1.4. Synthèse du composé azido–K(Zn–Pyro–a)DKPPR (12)...............................................................300
I.7.1.5. Tentative de synthèse du composé Alc1’–click–K(Pyro–a)DKPPR (13) ......................................301
I.7.2. Caractérisation de la plateforme 14 synthétisée par SPPS ..................................................................301
I.8. Caractérisation du composé Alc1’–KDKPPR (16) ................................................................. 303
I.9. Synthèse du peptide t–Lyp1 et des peptides de l’Alascan ........................................................ 304
I.10. Synthèse du composé Mal–KK(Pyro–a)–DKPPR (27) ....................................................... 304
I.11. Synthèse du composé β–CD–KK(Pyro–a)–DKPPR (28) .................................................... 306
I.12. Synthèse du composé ester Alc2–NHS (29) ........................................................................ 307
I.13. Synthèse du composé Fmoc–K(Alc2) (30) .......................................................................... 307
I.14. Essais de synthèse du composé Fmoc–K(Alc2)KDKPPR (31) ............................................ 308
II. DETERMINATION DES PROPRIETES PHOTOPHYSIQUES ........................................................................ 309
II.1. Absorption......................................................................................................................... 309
II.2. Emission de fluorescence et de luminescence de l’1O2 ....................................................... 309
II.3. Photoblanchiment ............................................................................................................. 310
III. PHOTOLABILITE DES ALCOXYAMINES .............................................................................................. 311
III.1. Dispositifs d’illumination .................................................................................................. 311
III.1.1. Illumination de Alc1 .............................................................................................................................311
III.1.1.1. Suivi par HPLC – Irradiateur .........................................................................................................311
III.1.1.2. Suivi par HPLC – Lampe à vapeur de mercure .............................................................................311
III.1.1.3. Suivi par RPE – Lampe UV ...........................................................................................................311
III.1.2. Illumination de Alc2 – Lampe AURA light .........................................................................................311
III.2. Préparations des échantillons............................................................................................ 312
III.2.1. Suivi par HPLC .....................................................................................................................................312
III.2.2. Suivi par RPE ........................................................................................................................................312
III.3. Spectroscopie RPE ............................................................................................................ 312
IV. TESTS D’AFFINITE LBA................................................................................................................... 312
V. MODELISATION MOLECULAIRE ......................................................................................................... 312
VI. DETERMINATION DES LOG P ........................................................................................................... 312
IX
REFERENCES ........................................................................................................................................ 315
ANNEXE : LISTE DES PUBLICATIONS ........................................................................................... 327
ANNEXE : LISTE DES COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES .................................................... 331
X
Abréviations
18FDG : [18F]–2–Fluoro–Déoxy–Glucose
1Δg et1Σg+ : Etats singulet excités de l’oxygène moléculaire
ALA : Acide 5–aminolévulinique
A : Absorbance
AA : Acide Aminé
ACN : Acétonitrile
AcOEt : Acétate d’éthyle
ACS : American Chemical Society
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
AF : Acide Folique
Alloc : Allyloxycarbonyle
AMM : Autorisation de Mise sur le Marché
Arg, R : Arginine
Asn, N : Asparigine
Asp, D : Acide aspartique
B0 : Champ magnétique externe
BDE : Bond Dissociation Energy
Boc : tert–Butoxycarbonyle
BOP : Hexafluorophosphate de 1–H–benzotriazol–1–yloxy–tris(diméthylamino) phosphonium
Bzl : Benzyle
C : Concentration molaire
c : Vitesse de la lumière
CCM : Chromatographie sur Couche Mince
CD : Cyclodextrine
CE50 : Concentration efficace médiane
CendR : C–end rule
CI : Conversion Interne
CI50 : Concentration inhibitrice médiane
CIS : Conversion InterSystème
CNRS : Centre National de la Recherche Scientifique
COSY : COrrelation SpectroscopY
CRAB : Chimie Radicalaire Appliquée à la Biologie
CRAN : Centre de Recherche en Automatique de Nancy
CuAAC : Cycloaddition Azoture Alcyne catalysée par le Cuivre (I)
Cys, C : Cystéine
DCC : N,N′–Dicyclohexylcarbodiimide
DCM : Dichlorométhane
Dde : 1–(4,4–diméthyl–2,6–dioxocyclohex–1–ylidène)éthyl
DELs : Diodes électroluminescentes
DEPMPO : 5–(diéthoxyphosphoryl)–5–méthyl–1–pyrroline–N–oxyde
DIC : N,N′–Diisopropylcarbodiimide
DIPEA : N,N–Diisopropyléthylamine
DMF : Diméthylformamide
DMLA : Dégénérescence maculaire liée à l’âge
DMSO : Diméthylsulfoxide
DNPH : 2,4–Dinitrophénylhydrazine
DO : Densité optique
XI
EDCI : N–Ethyl–N′–(3–diméthylaminopropyl)carbodiimide
EDCI•HCl : Hydrochlorate de N–éthyl–N′–(3–diméthylaminopropyl)carbodiimide
EDT : Ethanedithiol
EGF : Epidermal Growth Factor
EPR : Enhanced Permeability Effect
EtOH : Ethanol
FITC : Fluorescéine isothiocyanate
Fmoc : Fluorénylméthoxycarbonyl
FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRα : Récepteur à l’acide folique
g : Facteur de Landé
Gln, Q : Glutamine
Glu, E : Acide glutamique
GP : Groupement protecteur
h : Constante de Planck
HAP : Hydrocarbure Aromatique Polycyclique
HATU : Hexafluorophosphate de 1–[bis(diméthylamino)méthylène]–1H–1,2,3–triazolo[4,5–
b]pyridinium 3–oxyde
HBTU : Hexafluorophosphate d’O–(benzotriazol–1–yl)–N,N,N’,N’–tétraméthyluronium
HILIC : Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography
His, H : Histidine
HMPA : Hexaméthylphosphoramide
HMPB : Acide 4–(4–Hydroxyméthyl–3–méthoxyphénoxy)butyrique
HOBt : 1–Hydroxybenzotriazole
HOMO : Highest Occupied Molecular Orbital
HP : Hématoporphyrine
HpD : Dérivés de l’hématoporphyrine
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
HRMS : High Resolution Mass Spectrometry
ICR : Institut de Chimie Radicalaire
IEC : Ion–exchange Chromatography
INSERM : Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
iPDT : Thérapie photodynamique interstitielle
IR : Infrarouge
IRM : Imagerie par Résonance Magnétique
kd : Constante de dissociation
LBA : Ligand Binding Affinity
LC–MS : Liquid Chromatography–Mass Spectrometry
LCPM : Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire
LRGP : Laboratoire Réactions et Génie des Procédés
LUMO : Lowest Unoccupied Molecular Orbital
Lys, K : Lysine
MBHA : 4–Méthylbenzhydrylamine
MeOH : Méthanol
Ms : Multiplicité de spin
MS : Mass Spectrometry
MSNs : Mesoporous Silica Nanoparticles
mTHPC : Chlorine 5,10,15,20–tétra(m–hydroxyphényl)
mTHPP : Porphyrine 5,10,15,20–Tétrakis(méso–hydroxyphényl)
Mtt : 4–méthyltrityl
XII
NHS : N–hydroxysuccinimide
NIR : Near InfraRed
NMP : N–Méthyl–2–pyrrolidone
NPLC : Normal Phase Liquid Chromatography
NPs : Nanoparticules
NRP : Neuropiline
NRP–1 : Récepteur de la Neuropiline–1
NRP–2 : Récepteur de la Neuropiline–2
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
OMRI : Overhauser–enhanced Magnetic Resonance Imaging
P1–COOH : Porphyrine 4–carboxyphényl
Pbf : Pentaméthyl–2,3–dihydrobenzofuran–5–sulfonyl
PBS : Phosphate Buffered Saline
PDT : Thérapie photodynamique
PEG : Polyéthylène glycol
Pmc : 2,2,5,7,8–pentaméthylchroman–6–sulfonyl
PpIX : Protoporphyrine IX
PS : Photosensibilisateur
PSA : Antigène prostatique spécifique
PyAOP : Hexafluorophosphate de (7–azabenzotriazol–1–yloxy)tripyrrolidinophosphonium
PyBOP : Hexafluorophosphate de (benzotriazol–1–yloxy)tripyrrolidinophosphonium
PyCloP : Hexafluorophosphate de chlorotripyrrolidinophosphonium
Pyro–a : Pyrophéophorbide a
RBA : Receptor Binding Affinity
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire
ROS : Espèces réactives de l’oxygène
RP : Reverse Phase
RPE : Résonance Paramagnétique Electronique
RPLC : Reverse Phase Liquid Chromatography
RV : Relaxation Vibrationnelle
RX : Rayons X
S : Nombre quantique de spin
S0 : Etat singulet fondamental
S1 : Premier état singulet excité
Sx : Etat singulet excité x
Ser, S : Sérine
SNC : Système Nerveux Central
SPPS : Synthèse Peptidique en Phase Solide
T1 : Etat triplet
tBu : tert–butyl
TEM : Microscopie électronique en transmission
TEMP : Tomographie par Emission MonoPhotonique
TEMPO : (2,2,6,6–tétraméthylpipéridin–1–yl)oxyle
TEMPOL : 4–hydroxy–2,2,6,6–tétraméthylpipéridin–1–oxyle
TEP : Tomographie par Emission de Positrons
TFA : Acide trifluoroacétique
TGPS–PLA : D–α–tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate–poly(lactic acid)
THF : Tétrahydrofurane
Thr, T : Thréonine
TIPS : Triisopropylsilane
XIII
TNBS : Acide 2,4,6–trinitrobenzènesulfonique
TOCSY : TOtal Correlation SpectroscopY
TPC : Chlorine 5–(4–carboxyphényl)–10,15,20–triphényl
Trp, W : Tryptophane
Trt : Triphénylméthyl
Tyr, Y : Tyrosine
UCNPs : Up–conversion nanoparticles
UMR : Unité Mixte de Recherche
USPIONs : Ultra–small superparamagnetic iron oxide nanoparticles
UV : Ultraviolet
VEGF : Vascular endothelial growth factor
VEGF165 : Isoforme 165 du VEGF
VEGF–A, VEGF–B, VEGF–C : Familles de ligands du VEGF
VEGFR–1 et VEGFR–2 : Récepteurs du VEGF
VTP : Vascular Targeted Photodynamic therapy
βe : Magnéton de Bohr
ε : Coefficient d’extinction molaire
λ : Longueur d’onde
ν : Fréquence
τf : Durée de vie de fluorescence
τΔ : Durée de vie de l’oxygène singulet
Φf : Rendement quantique de fluorescence
ΦΔ : Rendement quantique de production d’oxygène singulet
XIV
Liste des Figures
FIGURE 1 : ETAPES DU DIAGNOSTIC D'UN CANCER CONDUISANT A L'ETABLISSEMENT DU BILAN D'EXTENSION. ..... 12
FIGURE 2 : ANATOMIE DU SNC. EXTRAITE DE 14................................................................................................. 17
FIGURE 3 : PHOTOGRAPHIES PEROPERATOIRES DE LA CAVITE OPERATOIRE SOUS LUMIERE VISIBLE (A GAUCHE) ET
SOUS LUMIERE BLEUE (A DROITE). EXTRAITE DE STUMMER ET AL.23 ........................................................... 20
FIGURE 4. PHOTOGRAPHIES DE MEYER–BETZ : TROIS (GAUCHE) ET CINQ JOURS (DROITE) APRES INJECTION D'HP.35
................................................................................................................................................................. 22
FIGURE 5. PRINCIPE DU TRAITEMENT PAR PDT ................................................................................................... 23
FIGURE 6. DIAGRAMME DE PERRIN–JABLONSKI MODIFIE. CIS, CONVERSION INTERSYSTEME ; E–, ELECTRONS RV,
RELAXATION VIBRATIONNELLE. ................................................................................................................. 24
FIGURE 7 : SPECTRE ELECTROMAGNETIQUE. ....................................................................................................... 28

FIGURE 8 : PENETRATION DE LA LUMIERE DANS LES TISSUS BIOLOGIQUES EN FONCTION DE LA LONGUEUR D'ONDE.
EXTRAITE DE 58. ........................................................................................................................................ 29
FIGURE 9 : SPECTRE D'ABSORPTION DES PRINCIPAUX CONSTITUANTS DES TISSUS BIOLOGIQUES. EXTRAITE DE 59.. 29
FIGURE 10 : STRUCTURES CHIMIQUES DE LA PORPHYRINE ET DE SES DERIVES...................................................... 32
FIGURE 11 : SPECTRE D'ABSORPTION STANDARD UV–VISIBLE D’UNE PORPHYRINE. ............................................. 32
FIGURE 12 : STRUCTURE CHIMIQUE DU FOSCAN®............................................................................................... 33
FIGURE 13 : BIOSYNTHESE DE L'HEME. PBG, PORPHOBILINOGENE ; UROLL, UROPORPHYRINOGENE ; COPROLL,
COPROPORPHYRINOGENE ; PROTO IX, PROTOPORPHYRINOGENE IX. ADAPTEE DE HAMBLIN ET AL.34 .......... 34
FIGURE 14 : STRUCTURE CHIMIQUE DE LA VISUDYNE® ...................................................................................... 35
FIGURE 15 : STRUCTURE CHIMIQUE DU TOOKAD®. ............................................................................................. 36
FIGURE 16 : PRINCIPE DE L'EXCITATION BIPHOTON ............................................................................................. 39
FIGURE 17 : ILLUSTRATION DU TRANSFERT D’ENERGIE DES UCNPS A UN PS. ADAPTEE DE MALLIDI ET AL.86 ...... 40
FIGURE 18 : ILLUSTRATION DE L'EFFET EPR. ADAPTEE DE BUGAJ.93 ................................................................... 41
FIGURE 19 : DIFFERENTS TYPES DE NPS. ADAPTEE DE WILCZEWSKA ET AL ET GRIES ET AL.94,98 .......................... 43
FIGURE 20 : ILLUSTRATION DES DEUX TYPES DE CIBLAGE ACTIF. ........................................................................ 43
FIGURE 21 : STRUCTURE DU RECEPTEUR NRP–1. ADAPTEE DE DUMOND ET AL.116 .............................................. 48
FIGURE 22 : OXYGENATION DES TISSUS AU COURS D'UN TRAITEMENT PDT UTILISANT L'ALA SUR LE COLON DE RAT.
FIGURE EXTRAITE DE CURNOW ET AL.117.................................................................................................... 49
FIGURE 23 : STRUCTURE GENERALE DES ALCOXYAMINES ET LEUR HOMOLYSE. ................................................... 51
FIGURE 24 : OBJECTIFS DE LA THESE. ................................................................................................................. 52
FIGURE 25 : EXEMPLES D'ALCOXYAMINES PORTANT UN CHROMOPHORE, INDIQUE EN ROUGE, (A) DIRECTEMENT LIE
AU GROUPEMENT AMINOXYL ET (B) SEPARE DU GROUPEMENT AMINOXYL PAR UNE DISTANCE DEUX LIAISONS
INDIQUEE PAR UNE DOUBLE FLECHE.133 .................................................................................................... 175
FIGURE 26 : STRUCTURE CHIMIQUE DE LA PLATEFORME SYNTHETISEE (NOTEE ALC1’–K(PYRO–A)DKPPR)...... 175

FIGURE 27 : PRINCIPE DE L'ELONGATION PEPTIDIQUE EN SPPS. AAN = ACIDE AMINE AVEC N LE NOMBRE D’ACIDE
AMINE, X = O OU NH, ♦ = GROUPEMENT PROTECTEUR PERMANENT , ● = RESINE.138 .................................. 177
FIGURE 28 : MECANISME DE DEPROTECTION DU GROUPEMENT FMOC................................................................ 182
XV
FIGURE 29 : MECANISME DE LA REACTION D'ACTIVATION PAR LES CARBODIMIDES SUIVI DU COUPLAGE DU FMOC–
ACIDE AMINE AU PEPTIDE EN ELONGATION. .............................................................................................. 184
FIGURE 30 : MECANISMES DES REACTIONS POUVANT SE PRODUIRE LORS DE L'ACTIVATION D'UN FMOC–ACIDE AMINE
PAR UN CARBODIIMIDE. (A) FORMATION DE LA N–ACYLISOUREE ET (B) RACEMISATION PAR LA FORMATION
D’UNE OXAZOLONE. 153
............................................................................................................................. 185
FIGURE 31 : MECANISME DE LA REACTION D'ACTIVATION PAR LES CARBODIMIDES ET L’HOBT SUIVI DU COUPLAGE
DU FMOC–ACIDE AMINE AU PEPTIDE EN ELONGATION.150 .......................................................................... 186
FIGURE 32 : MECANISME DE LA REACTION D'ACTIVATION PAR LE BOP SUIVI DU COUPLAGE DU FMOC–ACIDE AMINE
AU PEPTIDE EN ELONGATION.155 ............................................................................................................... 186
FIGURE 33 : MECANISME DE LA REACTION D'ACTIVATION PAR L’HBTU SUIVI DU COUPLAGE DU FMOC–ACIDE AMINE
AU PEPTIDE EN ELONGATION (VOIE A) ET LA REACTION SECONDAIRE CONDUISANT A LA GUANIDINYLATION DE
LA FONCTION AMINE N–TERMINALE DU PEPTIDE EN EXPANSION (VOIE B).155 ............................................. 188
FIGURE 34 : SYNTHESE DU COMPOSE 2. (I) NHS, EDCI, THF/DMF, 12 H, 40°C ; (II) FMOC–LYS–OH, ET3N,
CHCL3/DMF, 12 H, TAMB. ......................................................................................................................... 190
FIGURE 35 : SYNTHESE DU COMPOSE 7. (I) DEPROTECTION : 20% PIPERIDINE DANS LE DMF, 4 MIN PUIS 7 MIN
(SYNTHETISEUR) OU 4 X 15 MIN (MANUELLE), TAMB, (II) COUPLAGE : FMOC–AA(GP)–OH, HBTU, NMM, NMP,
DMF, 2 X 18 MIN, TAMB, (III) COUPLAGE : 2, HBTU, NMM, NMP, DMF, 12 H, TAMB ET (IV) CLIVAGE :
TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5 ; V/V/V), 2 H, TAMB. A PARTIR DU PEPTIDE 6 AINSI SYNTHETISE, LE COMPOSE 2 A
ENSUITE ETE COUPLEE A CE DERNIER, APRES DEPROTECTION PREALABLE DU GROUPEMENT FMOC, DANS DES
CONDITIONS DE COUPLAGE SIMILAIRE A CELLES UTILISEES POUR LA SYNTHESE DU PEPTIDE. APRES LA
DEPROTECTION DE L’EXTREMITE N–TERMINALE, LE COMPOSE A FINALEMENT ETE CLIVE DU SUPPORT ET
DEPROTEGE SUR SES CHAINES LATERALES EN MILIEU ACIDE POUR OBTENIR LE COMPOSE 7 AVEC UN
RENDEMENT GLOBAL DE 25% APRES PURIFICATION PAR HPLC PREPARATIVE........................................... 190
FIGURE 36 : SYNTHESE DE 1,2,3–TRIAZOLES PAR CYCLOADDITION 1,3–DIPOLAIRE D'AZOTURE ET D'ALCYNE. .... 192
FIGURE 37 : SYNTHESE DE L'ALC1’ FONCTIONNALISEE PAR UN BRAS ALCYNE, 9. (I) NHS, EDCI, ACOET/DMF, 24
H, 35°C ET (II) PROPARGYLAMINE, ET3N, CHCL3/DMF, 30 H, TAMB. .......................................................... 192
FIGURE 38 : SYNTHESE DU COMPOSE 12 POSSEDANT UN BRAS AZOTURE. (I) COUPLAGE : ACIDE AZIDOHEXANOÏQUE,
HBTU, NMM, NMP, DMF, 2 H, TAMB, (II) CLIVAGE : TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5 ; V/V/V), 2 H, TAMB ET (III)
ZN(OAC)2, DMF, 2,5 H, 40°C.................................................................................................................. 193
FIGURE 39 : SPECTRE D'ABSORPTION UV–VISIBLE NORMALISE DE LA PYRO–A ET DU COMPOSE 12 DANS LE DMF.
............................................................................................................................................................... 194
FIGURE 40 : TENTATIVE DE SYNTHESE DE LA PLATEFORME TRIMODALE 13. (I) CUSO4, ASCORBATE DE SODIUM,
DMF/H2O, 24 H, TAMB ET (II) TFA, 5 MIN, 0°C. ......................................................................................... 194

FIGURE 41 : TENTATIVE DE COUPLAGE DE L' ALC1’ AU COMPOSE 10 PAR SPPS. (I) COUPLAGE : HBTU, NMM, NMP,
DMF OU PYBOP, DIPEA, DMF, 12 H, TAMB ET (II) CLIVAGE : TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5 ; V/V/V), 2 H, TAMB.
............................................................................................................................................................... 195
FIGURE 42 : CHROMATOGRAMME HPLC DU COMPOSE 14 A L'ISSU DES PREMIER ET SECOND COUPLAGES ENTRE
L’ALC1’ ET 10 SUIVI D’UN CLIVAGE DE LA RESINE. GRADIENT DE 10 A 100% ACETONITRILE (ACN) DANS
L’EAU + 0,1% TFA EN 15 MIN SUIVI D’UN ISOCRATIQUE A 100% ACN + 0,1% TFA PENDANT 10 MIN
(DETECTION UV : 415 NM). ..................................................................................................................... 196
XVI
FIGURE 43 : SYNTHESE DU COMPOSE 16. (I) DEPROTECTION : 20% PIPERIDINE DANS LE DMF, 7 MIN PUIS 14 MIN
(SYNTHETISEUR) OU 4 X 15 MIN (MANUELLE), TAMB, (II) COUPLAGE : FMOC–AA(GP)–OH, HBTU, NMM, NMP,
DMF, 2 X 18 MIN, TAMB, (III) COUPLAGE : ALC1’, PYBOP, DIPEA, DMF, 12 H, TAMB ET (IV) CLIVAGE :
TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5 ; V/V/V), 2 H, TAMB.......................................................................................... 196
FIGURE 44 : CHROMATOGRAMME HPLC A 260 NM DU COMPOSE 16 A L’ISSU DU COUPLAGE DE L’ALC1’. GRADIENT
DE 10 A 100% ACN DANS L’EAU + 0,1% TFA EN 15 MIN SUIVI D’UN ISOCRATIQUE A 100% ACN + 0,1% TFA
PENDANT 10 MIN (DETECTION UV : 260 NM). ........................................................................................... 197

FIGURE 45 : CHROMATOGRAMMES HPLC OBTENUS POUR LES COMPOSES 7, 16 ET 14 PURIFIES. GRADIENT DE 10 A
100% ACN DANS L’EAU + 0,1% TFA EN 15 MIN SUIVI D’UN ISOCRATIQUE A 100% ACN + 0,1% TFA PENDANT
10 MIN (DETECTION UV : 260 NM POUR 16 ET 415 NM POUR 7 ET 14. ........................................................ 198
FIGURE 46 : CHROMATOGRAMME HPLC DE PLUSIEURS ESSAIS DE PURIFICATION DU COMPOSE 14. A, 7 ET B, 14
(DETECTION UV : 415 NM). ..................................................................................................................... 200
FIGURE 47 : SPECTRES D'ABSORPTION UV–VISIBLE NORMALISEES ET COEFFICIENT D'EXTINCTION MOLAIRE Ε DES
COMPOSES PYRO–A, 7 ET 14 DANS DIFFERENTS SOLVANTS. ...................................................................... 202
FIGURE 48 : EVOLUTION DU ΦF AU COURS DU TEMPS POUR LES COMPOSES PYRO–A, 7 ET 14 ILLUMINES A 668 NM (10
MW.CM–2) DANS LE MEOH. ..................................................................................................................... 204
FIGURE 49 : HOMOLYSE DE L'ALCOXYAMINE BENZOPHENONE–SG1’ SOUS EXCITATION LUMINEUSE. ................. 205

FIGURE 50 : CHROMATOGRAMMES HPLC DE L’ALC1’ SOUS EXCITATION PAR RAYONS X A DES DOSES DE 0 ET 20 GY.
GRADIENT 10 A 100% ACN DANS L’EAU + 0,1% TFA EN 15 MIN SUIVI D’UN ISOCRATIQUE A 100% ACN +
0,1% TFA (DETECTION UV : 260 NM)...................................................................................................... 206
FIGURE 51 : CHROMATOGRAMMES HPLC DE ALC1’ AVANT ET APRES 10 MIN D'ILLUMINATION UV. GRADIENT DE
10 A 100% ACN DANS L’EAU + 0,1% TFA EN 15 MIN SUIVI D’UN ISOCRATIQUE A 100% ACN + 0,1% TFA
PENDANT 10 MIN (DETECTION UV : 260 NM). 1, TEMPO, 2, ALC1’ ET 3, PRODUIT D'HOMOLYSE D’ALC1’. 207
FIGURE 52 : CHROMATOGRAMMES HPLC DES COMPOSES (A) 16 AVANT ET APRES 5 MIN D'ILLUMINATION UV ET (B)
14 AVANT ET APRES 25 MIN D'ILLUMINATION UV. GRADIENT DE 10 A 100% ACN DANS L’EAU + 0,1% TFA EN
15 MIN SUIVI D’UN ISOCRATIQUE A 100% ACN + 0,1% TFA PENDANT 10 MIN (DETECTION UV : 260 NM POUR
16 ET 415 NM POUR LE COMPOSE 14. 1, TEMPO ; 2, COMPOSE 16 ; 3, PRODUIT D'HOMOLYSE DU COMPOSE 16 ;
4, COMPOSE 14 ET 5, PRODUIT D'HOMOLYSE DU COMPOSE 14. ................................................................... 208
FIGURE 53 : LEVEE DE DEGENERESCENCE DES NIVEAUX D'ENERGIE DE SPIN ELECTRONIQUE S = ½ SOUS L’ACTION
D’UN CHAMP MAGNETIQUE B ET ILLUSTRATION DE LA CONDITION DE RESONANCE. ADAPTEE DE SAHLI.173 210
FIGURE 54 : FORMES MESOMERES DU NITROXYDE. ........................................................................................... 211

FIGURE 55 : NIVEAUX D'ENERGIE POUR UN NITROXYDE EN REGIME ISOTROPE AINSI QUE LE SPECTRE RPE RESULTANT
EN FONCTION DU CHAMP MAGNETIQUE. LES FLECHES REPRESENTENT LES TRANSITIONS AUTORISEES EN RPE.
174
ADAPTEE DE LE BRETON. .................................................................................................................... 213
FIGURE 56 : DISPOSITIF D'ILLUMINATION UV ADAPTEE A LA GEOMETRIE CYLINDRIQUE DES TUBES ET CAPILLAIRES.
............................................................................................................................................................... 214
FIGURE 57 : HOMOLYSE DE L’ALC1 SOUS EXCITATION LUMINEUSE. .................................................................. 215
FIGURE 58 : INTENSITE RPE DU RADICAL GENERE AU COURS DE L’ILLUMINATION A TEMPERATURE AMBIANTE POUR
LES COMPOSES (A) ALC1, (B) 16 ET (C) 14 A DIFFERENTES CONCENTRATIONS DANS LE MEOH. ENCADRE :
SPECTRES RPE, NORMALISES PAR LEUR INTENSITE DE PIC A PIC, DU RADICAL SG1 DANS LA SOLUTION A 75 µM
XVII
AU DEBUT DU PLATEAU (BLEU) ET A LA FIN DU PLATEAU (ROUGE). (▲) 300 µM, (●) 150 µM ET (▼) 75 µM. (D)
TAUX DE PRODUCTION INITIAL (K) DU RADICAL ET TEMPS D'EXPOSITION A LA LUMIERE UV JUSQU'A ATTEINDRE
LE TURNOVER (TTURNOVER) POUR LES COMPOSES ALC1, 16 ET 14 A DIFFERENTES CONCENTRATIONS DANS LE
MEOH. ................................................................................................................................................... 216

FIGURE 59 : INTENSITE RPE DU RADICAL GENERE AU COURS DE L’ILLUMINATION POUR LES COMPOSES (A) ALC1,
(B) 16 ET (C) 14 A 300 µM DANS DU MEOH AVEC (♦) OU SANS (▲) OXYGENE.......................................... 218
FIGURE 60 : INTENSITE RPE DU RADICAL GENERE AU COURS DE L’ILLUMINATION POUR LES COMPOSES (A) ALC1,
(B) 16 ET (C) 14 A 300 µM DANS DU MEOH AVEC (♦) INTENSITE LUMINEUSE DE REFERENCE OU (▲) INTENSITE
LUMINEUSE DIMINUE D’UN FACTEUR 2. .................................................................................................... 219
FIGURE 61 : SCHEMA DE PRINCIPE DU PIEGEAGE DE SPIN ENTRE LE DEPMPO ET UN RADICAL R●. ..................... 220
FIGURE 62 : (A) GAUCHE : SPECTRES RPE DE SIMULATION (ROUGE) ET EXPERIMENTAL (NOIR) D'ALC1 EN PRESENCE
DE 10 MM DE DEPMPO APRES 960 S D'IRRADIATION. A DROITE : SIMULATION DES SPECTRES RPE DE SG1,
RAD1, RAD2 ET RAD3. (B) ET (C) EVOLUTION DE LA GENERATION DE RADICAUX AU COURS DE
L’ILLUMINATION DES COMPOSES ALC1, 16 ET 14 DANS LE TEMPS EN SOLUTION DANS DU MEOH A 300 µM EN
PRESENCE DE 10 MM DE DEPMPO DANS LA SOLUTION OXYGENEE (B) ET LA SOLUTION DEGAZEE (C).
RADICAUX FORMES PAR L'ILLUMINATION DES COMPOSES : (♦) ALC1, (●) 16 ET (▲) 14. ............................ 221
FIGURE 63 : NOUVELLES PLATEFORMES QUADRIMODALES ENVISAGEES. ........................................................... 244
FIGURE 64 : REPRESENTATION SCHEMATIQUE DE LA VOIE D'INTERNALISATION DU CENDR. LA PENETRATION D’UN
PEPTIDE, POSSEDANT UN MOTIF CENDR, DANS LES CELLULES TUMORALES SE PRODUIT EN 3 ETAPES, (I) LA
LIAISON DU PEPTIDE A UN RECEPTEUR PRIMAIRE SUR L’ENDOTHELIUM DE LA TUMEUR, (II) LE CLIVAGE DU
PEPTIDE PAR DES PROTEASES EXPOSANT AINSI LE MOTIF CENDR A L’EXTREMITE C–TERMINALE ET (III) LA
LIAISON A NRP–1 MEDIEE PAR LE MOTIF CENDR, CONDUISANT A LA PERMEABILITE VASCULAIRE ET
TISSULAIRE. X, DES ACIDES AMINES ALEATOIRES . LES RONDS NOIRS CORRESPONDENT AUX MOLECULES
POUVANT ETRE TRANSPORTES PAR L’INTERMEDIAIRE DU MOTIF CENDR. EXTRAITE DE RUOSLAHTI.183..... 245
FIGURE 65 : FIXATION DU PEPTIDE LYP–1 A LA PROTEINE P32 SUIVI DE SON INTERNALISATION A TRAVERS NRP–1.
EXTRAITE DE SONG ET AL.184 ................................................................................................................... 246
FIGURE 66 : COMPARAISON DE LA CHROMATOGRAPHIE HILIC AVEC LES AUTRES METHODES HPLC. ADAPTÉEE DE
196
. .......................................................................................................................................................... 250
FIGURE 67: LIGAND–PROTEIN COMPLEX OF PEPTIDE CGNKATR. LIGANDS ARE SHOWN IN YELLOW WHILE
HYDROGEN BONDS ARE SHOWN IN GREEN. ............................................................................................... 263

FIGURE 68: 2D DIAGRAM OF LIGAND–PROTEIN COMPLEX OF PEPTIDE CGNKRTR (TLYP–1), 17. ....................... 264
FIGURE 69: 2D DIAGRAM OF LIGAND–PROTEIN COMPLEX OF PEPTIDE CGNKATR, 20. ...................................... 265
FIGURE 70 : NRP–1 BINDING OF PEPTIDES OBTAINED USING A COMPETITIVE BINDING ASSAY. ........................... 267
FIGURE 71 : STRUCTURES CHIMIQUES DES CDS NATURELLES. ........................................................................... 269
FIGURE 72 : VIABILITE CELLULAIRE DE CELLULES U87 TRAITEE AVEC LES COMPLEXES D'INCLUSION FORME AVEC
M–THPP (A) ET LA P1–COOH (B) ET LE CONJUGUE (C). EXTRAITE DE BEN MIHOUB ET AL.208 ................ 271
FIGURE 73 : SYNTHESE DU COMPOSE 28. (I) COUPLAGE : FMOC–LYS(BOC)–OH, HBTU, NMM, NMP, DMF, 12 H,
TA (II) DEPROTECTION : 20% PIPERIDINE DANS LE DMF, 4 X 15 MIN, TAMB, (III) COUPLAGE : ACIDE 6–
MALEIMIDOHEXANOÏQUE, HBTU, NMM, NMP, DMF, 12 H, TAMB, (IV) TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5), 2 H, TAMB
ET (V) Β–CD–SH, PBS, DMF, 24 H, 40°C. ............................................................................................... 272
XVIII
FIGURE 74 : SPECTRES D’ABSORPTION UV–VISIBLE NORMALISEES DES COMPOSES PYRO–A ET 28 DANS LE D2O.
............................................................................................................................................................... 274
FIGURE 75 : STRUCTURE CHIMIQUE DE ALC2. ................................................................................................... 276
FIGURE 76 : SPECTRE D'ABSORPTION UV–VISIBLE NORMALISEE DE ALC2 DANS LE DCM. ................................. 276
FIGURE 77 : COUPLAGE DE ALC2 A LA LYSINE. (I) NHS, EDCI, DCM/DMF, 12 H, 40°C ET (II) FMOC–LYS–OH,
ET3N, CHCL3/DMF, 12 H, TAMB. ............................................................................................................... 277
FIGURE 78 : COUPLAGE DU COMPOSE 30 AU PEPTIDE 17. (I) PYBOP, DIPEA, DMF, 12 H, TAMB ET (II) HBTU, NMM,
NMP, DMF, 12 H, TAMB. ........................................................................................................................... 278
FIGURE 79 : CHROMATOGRAMME HPLC OBTENU, SELON UN GRADIENT DE 10 A 100% DE ACN DANS L’EAU + 0,1%
HCOOH EN 15 MIN SUIVI D’UN ISOCRATIQUE A 100% ACN + 0,1% HCOOH PENDANT 10 MIN A UN DEBIT DE
0,8 ML.MIN–1, A L’ISSU DES ESSAIS DE COUPLAGE DU COMPOSE 30 AU PEPTIDE KDKPPR EN PRESENCE DE (A)
PYBOP, DIPEA, DMF OU (B) HBTU, NMM, NMP, DMF. 1, [M+H]+ = 1420 DA ; 2, [M+H]+ = 1518 DA ; 3,
[M+H]+ = 1601 DA (PRODUIT ATTENDU) ET 4, PRODUIT NON IONISE EN MASSE. ........................................ 278
FIGURE 80 : MECANISME DE L'HYDROLYSE DU COMPOSE 31, DEPROTEGE SUR SES CHAINES LATERALES ET CLIVE DE
LA RESINE, DURANT LE CLIVAGE. ADAPTEE DE KALIA ET AL.211................................................................ 280
FIGURE 81 : HOMOLYSE DE ALC2 SOUS EXCITATION LUMINEUSE. ..................................................................... 281

FIGURE 82 : SIGNAL RPE OBTENUE APRES 1H45 D'ILLUMINATION A 475 NM (22 MW.CM–2) D'ALC2 EN SOLUTION
DANS LE MEOH A 480 µM. ...................................................................................................................... 281
FIGURE 83 : (A) EVOLUTION DE L’INTENSITE RPE DU 4–CARBOXY–TEMPO AU COURS DE L’ILLUMINATION A 475

NM DANS LE DMSO A 3 MM ET (B) SIGNAL RPE DU NITROXYDE GENERE APRES UNE HEURE D’ILLUMINATION.
............................................................................................................................................................... 282
FIGURE 84 : (A) EVOLUTION DE L’INTENSITE RPE DU 4–CARBOXY–TEMPO AU COURS DE L’ILLUMINATION A 360
NM DANS LE DMSO A 3 MM ET (B) SIGNAL RPE DU NITROXYDE GENERE APRES UNE HEURE D’ILLUMINATION.
............................................................................................................................................................... 283
FIGURE 85 : NOUVELLE STRATEGIE DE SYNTHESE ENVISAGEE. .......................................................................... 290
XIX
XX
Liste des tableaux
TABLEAU 1 : CARACTERISTIQUES DE QUELQUES TECHNIQUES D'IMAGERIE UTILISEES CLINIQUEMENT.10 .............. 14
TABLEAU 2 : PRINCIPALES PHOTOREACTIONS DE TYPE I. 52,54 .............................................................................. 25
TABLEAU 3 : LISTE NON EXHAUSTIVE DES PSS DE SECONDE GENERATION AYANT REÇU L’AMM OU EN PHASE
76,77
CLINIQUE. ............................................................................................................................................ 37
TABLEAU 4 : RENDEMENTS QUANTIQUES DE FLUORESCENCE (ΦF) ET D'OXYGENE SINGULET (Φ∆) DE LA PYRO–A
136
DANS DIFFERENTS SOLVANTS. ............................................................................................................. 176
TABLEAU 5 : COMPARAISON ENTRE LES DEUX PRINCIPALES STRATEGIES UTILISEES EN SPPS. ADAPTE DE138. .... 179
TABLEAU 6 : TYPES DE RESINES POLYSTYRENE UTILISEES EN SPPS. ADAPTE DE PALOMO ET AL.139 ................... 180
TABLEAU 7 : LISTE DES ACIDES AMINES PROTEINOGENES NECESSITANT UNE PROTECTION « PERMANENTE » SUR
LEUR CHAINE LATERALE ET DES GROUPEMENTS PROTECTEURS ACIDO –LABILE ASSOCIES. ADAPTE D’AMBLARD
ET AL.143.................................................................................................................................................. 180
TABLEAU 8 : EXEMPLES DE CARBODIIMIDES UTILISES EN SPPS. ....................................................................... 185

TABLEAU 9 : LISTE DE SELS DE PHOSPHONIUM UTILISES EN SPPS. .................................................................... 187
TABLEAU 10 : EXEMPLE DE SELS D'URONIUM UTILISES EN SPPS. ...................................................................... 188
TABLEAU 11 : ESSAIS DE PURIFICATION HPLC DU COMPOSE 14 SUR COLONNE C18. ......................................... 199
TABLEAU 12 : RECAPITULATIF DES RENDEMENTS ET PURETES OBTENUS POUR LES DIFFERENTS COMPOSES
SYNTHETISES........................................................................................................................................... 200
TABLEAU 13 : RENDEMENTS QUANTIQUES DE FLUORESCENCE (ΦF) ET D'1O2 (ΦΔ) MESURES APRES EXCITATION A 410
NM ET DUREE DE VIE DE FLUORESCENCE (ΤF), APRES EXCITATION A 407 NM ET D' 1O2 (ΤΔ) ,APRES EXCITATION
A 415 NM DES COMPOSES PYRO–A, 7 ET 14 DANS DIFFERENTS SOLVANTS. ................................................ 203
TABLEAU 14 : AFFINITE ENVERS NRP–1 DES COMPOSES ESTIMEES A PARTIR DES COURBES D'AFFINITE. ............ 222
TABLEAU 15 : COMPARAISON DES TEMPS DE RETENTION OBTENUS POUR LES PEPTIDES KDKPPR ET TLYP–1 SUR
UNE COLONNE C18 EN RPLC UTILISANT UN GRADIENT DE 5% A 100% ACN DANS L’EAU + 0,1 % TFA EN 25
MIN ET SUR UNE COLONNE TSK GEL–AMIDE 80 EN HILIC UTILISANT UN GRADIENT DE 95% A 55% ACN DANS
L’EAU + 0,1 % TFA EN 15 MIN SUIVI D’UN ISOCRATIQUE A 55% ACN DANS L’EAU + 0,1 % TFA PENDANT 10
MIN. ........................................................................................................................................................ 251
TABLEAU 16 : FEB, PREDICTED KI AND NUMBER OF HYDROGEN BONDS OF ALL LIGANDS TESTED...................... 262
TABLEAU 17 : RECAPITULATIF DES PROPRIETES DE SOLUBILITE DANS L’EAU DES COMPOSES PYRO–A ET Β–CD–
KK(PYRO–A)DKPPR.............................................................................................................................. 273
TABLEAU 18 : COEFFICIENTS D’EXTINCTION MOLAIRE Ε, RENDEMENTS QUANTIQUES DE FLUORESCENCE (ΦF) ET
D' 1
O2 (ΦΔ) DES COMPOSES PYRO–A ET 28, MESURES APRES EXCITATION A 388 NM ET DUREE DE VIE DE
FLUORESCENCE (ΤF) MESUREE A 407 NM ET D’ 1

O2 (ΤΔ) MESUREE A 415 NM MESURES DANS LE D2O. .......... 274
XXI
XXII
INTRODUCTION
GENERALE
1
2
INTRODUCTION GENERALE
La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement pour lutter contre
de nombreux cancers. Elle repose sur la combinaison de trois entités à savoir l’oxygène, la
lumière et une molécule photoactivable appelée photosensibilisateur (PS). Ce traitement
consiste en l’administration du PS puis, après un certain délai appelé « intervalle drogue–
lumière », à l’illumination de la zone à traiter par la lumière visible conduisant à la
destruction des cellules cancéreuses. Le principe de la PDT est basé sur la photoexcitation
du PS à une longueur d’onde appropriée lui permettant d’atteindre un état excité. A partir
de cet état, le PS va transférer son énergie à l’oxygène environnant et ainsi entraîner la
production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) telles que l’oxygène singulet (1O2) ou le
radical hydroxyle (HO•), induisant ainsi un stress oxydant et par conséquent la destruction
des cellules cancéreuses.
La PDT présente de nombreux avantages à savoir, être une technique 1) peu invasive
reposant sur l’utilisation d’une source lumineuse et d’un PS qui n'ont pas d'action toxique
lorsqu’ils sont pris séparément et 2) sélective du fait d’une action des ROS limitée au site
de génération. Cette sélectivité peut être apportée par une illumination localisée ou bien
par une accumulation sélective du PS au niveau de la zone à traiter. En revanche, deux
inconvénients peuvent limiter son efficacité tels que la nécessité en oxygène pour être
efficace et le manque de sélectivité de la majorité des PSs commerciaux.
De nombreuses stratégies ont été décrites pour combattre l’hypoxie des tumeurs et
notamment l’utilisation de molécules photoactivables. Dans ce contexte, nous nous
sommes focalisés sur des composés dont le potentiel en tant qu’agents thérapeutiques a
déjà été prouvé, les alcoxyamines. Ces composés sont capables, notamment sous l’effet de
la température, de s’homolyser et générer des radicaux alkyles cytotoxiques. Un nouveau
concept d’alcoxyamines homolysables par la lumière a été développé plus récemment mais
leur utilisation dans le traitement antitumoral n’a jamais été étudié. Ces composés
photoactivables représentent, par conséquent, une piste innovante pour des applications
PDT.
Le ciblage tumoral consiste en l’adressage de PSs par conjugaison avec des vecteurs
ayant une affinité pour des récepteurs membranaires surexprimés au niveau des cellules
ou des néovaisseaux. Il existe plusieurs stratégies de ciblage dont l’une, appelée ciblage
actif indirect, qui consiste en l’adressage du PS vers des récepteurs surexprimés au niveau
des néovaisseaux tumoraux. Parmi eux, le récepteur neuropiline–1 (NRP–1), co–récepteur
du récepteur au VEGF (Vascular endothélial growth factor) est étudié depuis plusieurs
3
années par les équipes impliquées dans cette thèse. Plusieurs peptides ciblant NRP–1 ont
déjà été identifiés dont KDKPPR.
Cette thèse consiste au design de nouvelles plateformes PDT spécifiques des

néovaisseaux tumoraux et efficaces à la fois en milieux hypoxique et normoxique. Pour
cela, il a été choisi de combiner trois entités à savoir 1) un PS pour une PDT dépendante
de l’oxygène, 2) une alcoxyamine pour une activité indépendante de l’oxygène et 3) un
peptide pour un ciblage des néovaisseaux tumoraux.
Cette thèse repose sur une approche pluridisciplinaire et a été réalisée en collaboration
avec plusieurs laboratoires :
- Le Laboratoire Réactions et Génie des Procédés (LRGP), UMR 7274, CNRS,

Université de Lorraine, sous la supervision du Dr Céline Frochot. La
fonctionnalisation des PSs ainsi que les purifications des composés et les mesures
photophysiques ont été effectuées au sein de ce laboratoire.
- Le Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire (LCPM), UMR 7375, CNRS,
Université de Lorraine, sous la supervision du Dr Samir Acherar. La synthèse
peptidique sur support solide ainsi que les caractérisations des composés ont été
effectuées au sein de ce laboratoire.
- Le Centre de Recherche en Automatique (CRAN), UMR 7039, CNRS, Université de
Lorraine, sous la supervision du Dr Cédric Boura. Les études biologiques ont été
effectuées au sein de ce laboratoire.
- L’équipe Chimie Radicalaire Appliquée à la Biologie (CRAB) du Pr Gérard Audran
et du Pr Sylvain Marque de l’Institut de Chimie Radicalaire (ICR), UMR 7273, à
Marseille. Le développement et la synthèse des alcoxyamines photoactivables ainsi
que les premières analyses par RPE ont été effectués au sein de cette équipe.
- L’Institut de Chimie, UMR 7177, à Strasbourg, sous l’encadrement des Dr Bertrand
Vileno et Dr Nolwenn Le Breton. Les illuminations ainsi que le suivi par
spectroscopie RPE des alcoxyamines ont été réalisés au sein de ce laboratoire.
- La « School of Pharmaceutical Sciences » de l’Universiti Sains Malaysia en
Malaisie, sous la supervision du Dr Amirah Mohd–Gazzali. Les études de docking
moléculaire ont été effectuées au sein de cette équipe.
Le premier chapitre de cette thèse, divisé en trois parties, présente le contexte

bibliographique. Dans une première partie, les mécanismes du cancer ainsi que les
principaux outils diagnostic et thérapeutique utilisés sont présentés. La seconde partie
consiste en la description du principe de la PDT ainsi que de ses constituants essentiels à
4
savoir 1) l’oxygène, en présentant les mécanismes photophysiques impliquées lors du

processus photodynamique, 2) la lumière par description des paramètres pris en compte
dans le choix des sources lumineuses utilisées et 3) les PSs. La dernière partie décrit les
principales limites de la PDT et les techniques utilisées pour les contourner, à savoir la
faible pénétration de la lumière dans les tissus, la faible sélectivité des PSs commerciaux
et le besoin en oxygène pour un effet photodynamique efficace. Les objectifs de la thèse
sont présentés à la fin de ce chapitre.
Le second chapitre de cette thèse décrit une preuve de concept avec la synthèse d’une
plateforme trimodale combinant la pyrophéophorbide a (Pyro–a), une alcoxyamine de type
benzophénone–SG1 et le peptide KDKPPR. Les possibles interactions des différentes
unités les unes avec les autres sont déterminées par étude des propriétés photophysiques
de la Pyro–a, de la photolabilité de l’alcoxyamine et de l’affinité du peptide envers NRP–
1.
Le troisième chapitre présente l’amélioration de la plateforme synthétisée pour

permettre des études in vitro. La stratégie d’amélioration s’est focalisée sur trois aspects :
1) l’amélioration du ciblage par comparaison du peptide KDKPPR avec un tumor–homing
peptide, le tLyp–1 qui se fixe aussi sur le récepteur NRP–1 et qui est ensuite internalisé,
2) l’amélioration de la solubilité par utilisation de β–cyclodextrine et 3) le développement
d’une l’alcoxyamine homolysable à une longueur d’onde UV–visible compatible avec des
applications PDT.
5
6
CHAPITRE I : LA
THERAPIE
PHOTODYNAMIQUE
POUR TRAITER LE
CANCER
7
8
CHAPITRE I : La thérapie photodynamique pour traiter le cancer
I. Cancer
I.1. Epidémiologie
Le cancer représente la deuxième cause de mortalité dans le monde.1 Selon

l’Organisation Mondiale pour la Santé (OMS), en 2018, plus de 9 millions de décès liés aux
cancers ont été recensés avec une incidence de plus de 18 millions de nouveaux cas dans
le monde avec une prévalence à 5 ans de 574,4/100 000 cas.2 Les principaux types de cancer
recensés chez l’homme étaient ceux du poumon (1 386 524 cas), de la prostate (1 276 106
cas), colorectal (1 026 215 cas), de l’estomac (683 754 cas) et du foie (596 574 cas) alors que
chez la femme, les plus représentés étaient ceux du sein (2 088 849 cas), colorectal
(823 303 cas), du poumon (725 352 cas), du col de l’utérus (569 847 cas) et de la thyroïde
(436 344 cas).
I.2. Qu’est–ce que le cancer ?
Le cancer se traduit par la multiplication incontrôlée et rapide de cellules anormales

envahissant certaines parties de l’organisme se trouvant à proximité. Plusieurs facteurs
ont été identifiés comme causes du cancer tels que les prédispositions génétiques ou des
facteurs extérieurs (tabac, rayonnement UV, radiations, alcool…). Ces facteurs peuvent
être à l’origine d’altérations de l’ADN déclenchant l’apoptose de la cellule.3
En effet, le corps humain est composé de milliards de cellules ayant chacune une
fonction et une mort programmée. Deux mécanismes contrôlent la vie cellulaire : le cycle
cellulaire (création de nouvelles cellules) et l’apoptose (mort cellulaire). Ce cycle de
division cellulaire est composé de cinq phases : la phase de repos (G0), la première phase
de croissance (G1), la phase de synthèse de l’ADN (S), la seconde phase de croissance (G2)
et la mitose (M). Les cellules dans la phase G0 reçoivent un signal de reproduction qui va
les faire passer dans la phase G1 où elles vont fabriquer des protéines et de l’ARN en vue
de leur future division. Pendant la phase S, la synthèse d’ADN a lieu (reproduction à
l’identique) et la phase G2 est, quant à elle, similaire à la phase G1. Ce n’est qu’au moment
de la phase M que la division cellulaire se produit et donne lieu à la création de deux
cellules filles identiques à partir de la cellule mère. A l’issu de cette phase, deux
phénomènes peuvent se produire : soit la cellule reste dans le cycle cellulaire et passe à la
phase G0, soit elle le quitte pour se développer jusqu’à sa maturation puis sa mort.3
Il existe des points de contrôle entre ces phases afin de vérifier que le cycle cellulaire
se déroule normalement. En cas d’anomalies (mutations génétiques), l’organisme peut
9
déclencher une action de corrections ou l’autodestruction de la cellule (apoptose). Lorsque

ces anomalies ne sont pas réparées, il se produit une accumulation de celles–ci au cours
des cycles cellulaires étant à l’origine du cancer. 3 Ces mutations ont lieu lors de la
réplication de l’ADN et peuvent être de plusieurs types dont les principales sont4,5 :
- Les mutations ponctuelles, les plus fréquentes et correspondant à des substitutions

nucléotidiques, c’est–à–dire au remplacement d’une base (nucléotide) de l’ADN par
une autre ;
- Les insertions ou délétions de nucléotides qui sont des mutations de petites tailles ;
- Les modifications structurales du gène entraînant un réarrangement du gène, par
exemple, par délétion de la totalité ou d’une partie du gène.
En ce qui concerne les gènes pouvant être mutés, il en existe trois catégories3,6 :
- Les gènes proto–oncogènes, régulateurs positifs de la prolifération cellulaire qui,

une fois mutés, deviennent oncogènes entraînant une hyperactivation de la
croissance cellulaire et par conséquent une prolifération cellulaire désordonnée et
anormale ;
- Les gènes suppresseurs de tumeurs, régulateurs négatifs dont le rôle est contrôleur
de la prolifération cellulaire qui, une fois mutés, perdent leur activité conduisant
ainsi à une prolifération cellulaire incontrôlée ;
- Les gènes de réparation de l’ADN, réparateurs des erreurs pouvant se produire lors
de la réplication de l’ADN qui, une fois mutés, deviennent incapables de réparer
l’ADN endommagé et jouent ainsi un rôle important dans le développement du
cancer.
Une fois l’ADN d’une cellule lésé, celle–ci va se transformer, se développer puis
proliférer pour former un groupe de cellules identiques et finalement acquérir les
propriétés d’une cellule cancéreuse. Il s’écoule généralement plusieurs années avant que
ce processus soit finalisé. Les cellules cancéreuses sont caractérisées par leur :
- Immortalité, bien que dérivées d’une cellule normale, elles n’assurent pas la
fonction de ces cellules ;
- Capacité à se nourrir en développant leur propre réseau de vaisseaux sanguins ;
- Capacité à bloquer l’attaque des défenses immunitaires de l’organisme. 7
Les cellules cancéreuses, alors développées, sont capables de former leur propre réseau
vasculaire afin d’alimenter la tumeur en oxygène et nutriments par un phénomène appelé
angiogenèse. Elles possèdent également la capacité d’envahir les tissus environnants et
10
de former des métastases par migration au sein de l’organisme. D’autre part, elles peuvent
se servir des cellules environnantes en altérant leurs propriétés, entraînant la formation
de tumeurs composées à la fois de cellules saines et cancéreuses. Deux types de cellules
cancéreuses peuvent être distinguées en fonction de leur appartenance :
- « Différenciées », qui présentent peu de différence avec les cellules dont elles sont
issues ;
- « Indifférenciées », qui ont perdu leurs caractéristiques d’origine rendant
impossible l’identification de leur origine.
Sans traitement, le cancer va évoluer spontanément dans l’organisme sur plusieurs

années et de façon propre à chaque type de cancer. L’apparition de lésions pré–
cancéreuses, contenant des cellules malades, traduit le début de la maladie. Celles–ci vont
évoluer en cellules cancéreuses qui vont se multiplier pour former localement (tissu
d’origine) une tumeur de petite taille (stade 1) qui va ensuite grossir et occuper un volume
plus important (stade 2) pour ensuite envahir les tissus environnants (stade 3),
notamment les ganglions lymphatiques pour finalement s’étendre plus largement et
former des métastases dans l’ensemble de l’organisme (stade 4).3
Il existe différents types de tumeurs en fonction du tissu dont elles sont issues7 :
- Les carcinomes issus de l’épithélium (tissu recouvrant les surfaces internes et

externes de l’organisme) ;
- Les adénocarcinomes issus des glandes ou des muqueuses ;
- Les sarcomes issus majoritairement des os et des muscles (tissu de soutien) ;
- Les lymphomes issus des ganglions et vaisseaux lymphatiques ;
- Les leucémies issues des cellules de la moelle osseuse.
Pour ralentir et/ou stopper l’évolution du cancer, il est nécessaire de le dépister le plus
tôt possible et de vérifier l’étendu de celui–ci par des méthodes de diagnostic.
11
I.3. Diagnostic
Le diagnostic d’un cancer se fait en plusieurs étapes récapitulées dans la Figure 1.
Figure 1 : Etapes du diagnostic d'un cancer conduisant à l'établissement du bilan d'extension.
La première étape du diagnostic consiste en un examen clinique réalisé par le médecin,

à savoir un entretien et un examen spécifique de la zone potentiellement atteinte. Il est
ensuite suivi par des examens biologiques (bilan sanguin et/ou urinaire) pour doser des
marqueurs (molécules) présents en faible quantité dans les cellules saines et plus
fortement produites par les cellules tumorales (exemple : l’antigène prostatique spécifique
(PSA), marqueur dans le cas du cancer de la prostate). Ces anomalies peuvent également
être dues à d’autres maladies que le cancer, il est donc nécessaire de compléter ce
diagnostic par d’autres examens.6,8
La biopsie constitue une étape indispensable dans le diagnostic d’un cancer. En effet,
elle permet de définir la nature de la lésion cancéreuse par prélèvement d’un échantillon
analysé par un examen anatomopathologique au microscope. Elle peut être réalisée par
ponction ou par endoscopie mais également lors d’une intervention chirurgicale.
Des examens d’imagerie médicale sont également effectués pour confirmer la présence
d’une tumeur et la caractériser (taille, localisation, forme, activité métabolique). Il est
possible de regrouper ces examens d’imagerie en deux catégories8,9 :
- « Structurale » qui permettent de renseigner sur la localisation, la forme et la taille

de la tumeur et regroupent :
o La radiographie qui permet d’obtenir des images de certains organes ou
structures du corps par l’utilisation de rayons X ;
o L’échographie qui utilise les ultrasons qui sont envoyés au niveau de
l’organe analysé puis réfléchis par les tissus pour revenir à la source
d’émission et convertis en signaux électrique permettant d’obtenir une
image de la zone examinée. Cette technique présente une bonne résolution
12
et une excellente sensibilité mais est limitée par la pénétration des

ultrasons dans les tissus ;
o Le scanner qui repose sur l’utilisation de rayons X et permet d’obtenir une
image anatomique en trois dimensions. La source de rayons X tourne autour
du patient afin d’obtenir des images en coupe. Un agent de contraste iodé
peut être utilisé afin d’améliorer la résolution spatiale. Elle présente une
haute résolution spatiale ainsi qu’une pénétration des rayons X dans les
tissus, non limitée mais elle a une faible sensibilité et utilise des radiations
ionisantes.
o L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) qui est une technique
d’imagerie utilisant les ondes radiofréquences utilisées pour la visualisation
de la structure interne et la différenciation des tissus selon leur
morphologie. Elle repose sur l’utilisation d’un champ magnétique et sur un
principe similaire à la Résonance Paramagnétique Nucléaire (RMN). Elle
présente plusieurs avantages : une pénétration des ondes radiofréquences
dans les tissus non limitée, l’utilisation d’une radiation non ionisante et une
très bonne résolution spatiale. En revanche, elle présente une faible
sensibilité qui peut être améliorée par l’utilisation d’agents de contraste
(chélates de gadolinium par exemple).
- « Fonctionnelle » qui permettent d’étudier l’activité métabolique de la zone
examinée et regroupent notamment :
o L’IRM fonctionnelle qui permet d’obtenir des informations supplémentaires
par rapport à l’IRM classique telles que les caractéristiques physiologiques
de la vascularisation ou l’oxygénation des tissus.
o La tomographie par émission monophotonique (TEMP) et la tomographie
par émission de positons (TEP) qui sont des techniques d’imagerie nucléaire
reposant sur l’administration d’un composé radiomarqué et permettant
d’étudier les évolutions biologiques des tumeurs et d’étudier le
fonctionnement des organes. La TEMP repose sur l’utilisation de
radionucléides émetteurs de rayonnements γ (99mTc ou 123I) alors que la TEP
repose sur l’utilisation de radionucléides émetteurs de positrons
(rayonnement β+, 18F). Les agents radiomarqués utilisés permettent
d’étudier une activité précise des cellules, telle que l’accumulation du
glucose (18FDG, [18F]–2–fluoro–déoxy–glucose), plus élevée dans les cellules
cancéreuses. Ces techniques présentent une excellente sensibilité et
13
permettent une quantification mais reposent sur l’utilisation de

rayonnements ionisants et ont une résolution spatiale limitée.
Le Tableau 1 récapitule les principales caractéristiques des techniques d’imagerie les plus
utilisées en clinique.
Tableau 1 : Caractéristiques de quelques techniques d'imagerie utilisées cliniquement.10
Technique Temps Résolution spatiale Pénétration Sensibilité Coût

d’imagerie d’acquisition des tissus
Scanner Minutes 50–200 µm (préclinique) Sans limite $$
0,5–1 mm (clinique)
IRM Minutes à 25–100 µm (préclinique) Sans limite 10–3 à 10–5 M $$$
heures ~1 mm (clinique)
Echographie Secondes à 0,01–0,1 mm pour des mm–cm Excellente $
minutes applications superficielles utilisée avec
1–2 mm pour des microbulles (10–12
applications plus profondes M)
TEP Secondes à 1–2 mm (préclinique) Sans limite 10–11 à 10–12 M $$$
minutes 5–7 mm (clinique)
TEMP Minutes 1–2 mm (préclinique) Sans limite 10–10 à 10–11 M $$
8–10 mm (clinique)
Ce sont l’ensemble de ces examens qui conduire à l’établissement du bilan d’extension.

Ce dernier permet de déterminer le stade de la tumeur à savoir 1) l’extension locale de la
tumeur (classée de T1 à T4), 2) son éventuel envahissement des ganglions lymphatiques
proches (classé de N0 à N3) et 3) la présence (m0) ou non (m1) de métastases. Ces
paramètres ainsi déterminés conduisent à l’élaboration de la stratégie thérapeutique la
plus appropriée.
I.4. Traitements
Une stratégie thérapeutique adaptée et une prise en charge précoce du cancer

permettent d’augmenter les chances de guérison du patient. Il n’est pas possible de guérir
tous les cancers, mais les traitements peuvent ralentir leur évolution tout en améliorant
la qualité de vie du patient. Il existe ainsi plusieurs modalités de traitements, qui peuvent
être combinées ou utilisées seules.11,12 Les principales sont décrites ci–dessous.
I.4.1. La chirurgie
La chirurgie représente l’une des modalités majeures pour le traitement des tumeurs
solides puisque son utilisation est préconisée dans plus de 80% des cas.12 Elle consiste en
un traitement local par la résection la plus totale possible de la tumeur. La chirurgie peut
également avoir différentes finalités dont les principales sont11,12 :
- Une visée diagnostique, plus communément appelée biopsie (§ I.3) ;
14
- Une visée curative, qui consiste à retirer la totalité de la tumeur par résection d’une
marge périphérique entourant la tumeur, supposée saine afin d’être certain du
succès de la résection. L’analyse de cette marge permet de vérifier l’éventuelle
extension de la tumeur. Suivant sa localisation et son extension, une ablation totale
ou partielle de l’organe ou la zone touchée peut être effectuée.
La radiothérapie et la chimiothérapie sont le plus souvent utilisées en complément de

la chirurgie, avant (traitements néo–adjuvants) la chirurgie pour réduire la tumeur ou
après la chirurgie (traitements adjuvants).
I.4.2. La radiothérapie
La radiothérapie repose sur l’utilisation de radiations ionisantes pour détruire les

cellules cancéreuses et concerne plus de 60% des patients atteints d’un cancer. Elle
entraîne des lésions létales pour les cellules par des cassures au niveau des doubles brins
d’ADN.13 Il existe deux types de radiothérapie, i) la radiothérapie externe pour laquelle
une source externe d’irradiation (rayons X) est utilisée et ii) la curiethérapie pour laquelle
une source radioactive (rayons γ) est injectée au sein du patient. L’inconvénient majeur de
la radiothérapie est la destruction des cellules en contact avec les rayonnements sans
distinction entre les cellules saines et cancéreuses.11
I.4.3. La chimiothérapie
La chimiothérapie repose sur l’administration au patient de molécules cytotoxiques

qui vont entraîner la destruction des cellules cancéreuses et empêcher leur multiplication.
Lors d’un traitement par chimiothérapie, plusieurs médicaments sont généralement
associés et administrés (par injection ou voie orale) en plusieurs cures d’un ou plusieurs
jours. En revanche, cette technique présente de nombreux effets secondaires (chute de
cheveux, vomissements…) dus au fait que les molécules utilisées détruisent les cellules en
forte prolifération donc pas seulement les cellules cancéreuses.
I.4.4. L’immunothérapie
L’immunothérapie consiste à renforcer le système immunitaire du patient, soit par une

modulation de son activité globale, soit par « vaccination thérapeutique » consistant à faire
reconnaître les cellules cancéreuses par le système immunitaire et ainsi entraîner leur
destruction.
15
I.4.5. L’hormonothérapie
L’hormonothérapie est utilisée dans le cas de cancers hormonodépendants (croissance

dépendante d’hormones sexuelles, telles que l’œstrogène ou la progestérone par exemple)
Cette technique consiste à empêcher la synthèse de ces hormones.
Il existe également d’autres modalités reposant sur le ciblage spécifique des cellules
cancéreuses appelées thérapies ciblées permettant notamment d’éviter certains effets
secondaires dus à d’autres traitements (destruction des cellules saines en prolifération par
la chimiothérapie, chirurgie parfois invasive…). Une modalité appelée thérapie
photodynamique (PDT) est aussi utilisée et sera décrite dans le § II.
I.5. Cas des tumeurs cérébrales
I.5.1. Anatomie du cerveau
Le système nerveux constitue un des plus importants systèmes de communication de

l’organisme et joue plusieurs rôles essentiels dans son fonctionnement normal tels que la
gestion des informations sensorielles, le contrôle des mouvements et du fonctionnement
des organes.14,15 Deux parties distinctes constituent ce système :
- Le système nerveux central (SNC) composé de la moelle épinière et de l’encéphale

(cerveau, tronc cérébral et cervelet) ;
- Le système nerveux périphérique composé des nerfs essentiels pour la
transmission de signaux entre la moelle épinière, le cerveau et les parties
périphériques du corps (organes, jambes, bras…).
Les nerfs permettent soit d’envoyer des informations au SNC, soit d’envoyer des ordres
transmis par ce dernier aux parties périphériques.
Le cerveau est enveloppé par la boîte crânienne et les méninges, qui constituent une
barrière de protection (Figure 2). Le cerveau est divisé en deux parties distinctes, les
hémisphères droit et gauche, reliées par le corps calleux. Chaque hémisphère est
responsable des fonctionnements sensitifs et moteurs de la partie du corps opposé.
16
Figure 2 : Anatomie du SNC. Extraite de 14.
Le système nerveux est constitué de milliards de cellules. Nous pouvons distinguer14,15 :
- Les neurones qui reçoivent, intègrent et transmettent les informations. Ils sont
constitués d’un corps cellulaire et de fibres nerveuses : les axones (prolongement
des neurones qui envoient des messages par impulsions électriques) et les dendrites
(extensions recevant les impulsions) ;
- Les cellules gliales qui entourent les neurones sont différenciées en plusieurs
types : les astrocytes qui sont impliqués dans la nutrition des neurones, les
épendymocytes qui constituent une paroi délimitant les cavités du SNC, les
oligodendrocytes responsables de la formation de la myéline entourant les axones
et la microglie qui est composée de macrophages jouant un rôle dans le système
immunitaire.
I.5.2. Epidémiologie
Les tumeurs cérébrales sont plutôt rares puisqu’elles ne représentent qu’1% des
cancers dans le monde avec 296 851 nouveaux cas en 2018 et une incidence de 3,5/100 000
cas. Ces tumeurs sont, en revanche, très agressives puisqu’elles sont responsables de plus
de 241 037 décès par an et une survie à 5 ans de 10,1/100 000 cas.16
Il existe différents types de tumeurs cérébrales qui sont caractérisées par leur
localisation, leur taille et leur degré d’agressivité. Deux types peuvent être distingués
selon leur origine14,17 :
- Les tumeurs primitives qui se développent à l’intérieur du crâne et peuvent être

bégnines ou malignes. Elles représentent 6 000 nouveaux cas chez l’adulte par an
17
en France. Les tumeurs cérébrales représentent le deuxième type de cancer le plus

répandu chez l’enfant (20%) ;
- Les métastases cérébrales, également appelées tumeurs secondaires, sont
développées à partir d’un cancer déjà existant dans une autre partie du corps et
représentent plus de 50% des tumeurs cérébrales.
I.5.3. Classification des tumeurs cérébrales primitives
En 2016, l’OMS a établi un nouveau classement des tumeurs cérébrales primitives en

fonction de leur cellule d’origine, la présence d’anomalies au niveau des cellules tumorales
et leur grade.18 Les différents types de tumeurs cérébrales primitives sont les suivants14 :
- Les gliomes, les plus fréquents (80% des tumeurs cérébrales primitives malignes) 19,
développés à partir des cellules gliales du cerveau. Ils peuvent être de plusieurs
grades : le grade I correspond aux formes bégnines, le grade II concerne les tumeurs
qui se développent lentement pour conduire à une forme maligne, le grade III
également appelé gliome anaplasique et le grade IV aussi appelé glioblastome
multiforme. Ce dernier grade représente 60% des tumeurs cérébrales chez
l’adulte19 ;
- Les méningiomes, issus des cellules des méninges et se développant par conséquent
à la superficie du cerveau. Ils sont le plus souvent bénins ;
- Les médulloblastomes se développant dans le cervelet.
I.6. Cas du glioblastome multiforme
Le glioblastome multiforme représente la forme la plus agressive et la plus fréquente

de tumeurs cérébrales chez l’adulte. La survie moyenne après le diagnostic est de 14–15
mois.19
I.6.1. Causes et symptômes
L’origine du développement d’une tumeur cérébrale est difficile à déterminer et peu de

facteurs de risques ont été identifiés. Le seul facteur de risque identifié et confirmé est
l’exposition à des radiations ionisantes lors de traitements par radiothérapie par
exemple.19
Suivant la vitesse à laquelle se développe la tumeur, l’apparition des symptômes peut

se faire différemment (rapide ou progressif). Les symptômes les plus fréquents sont les
céphalées traduisant une augmentation de la pression intracrânienne, les crises
18
d’épilepsie et des troubles fonctionnels dépendant de la localisation de la tumeur (troubles

de l’élocution ou de la vision).19
I.6.2. Diagnostic et traitements
I.6.2.1. Diagnostic
Le premier outil pour diagnostiquer une tumeur cérébrale est l’imagerie par une IRM
avec ou sans agent de contraste permettant d’obtenir sa localisation exacte et son
envahissement éventuel dans d’autres parties du système nerveux. Le scanner peut
également être utilisé, mais en raison de sa moins bonne résolution spatiale et de
l’utilisation de rayons X, son utilisation est surtout préconisée chez les patients pour
lesquels la réalisation d’une IRM n’est pas possible (pacemakers). Les techniques
d’imagerie nucléaire telles que la TEP ou la TEMP peuvent également être envisagées.20
Une biopsie est également effectuée pour réaliser un examen anatomopathologique de

la tumeur.17
I.6.2.2. Modalités de traitement classiques
Le traitement standard du glioblastome consiste en la résection chirurgicale de la

tumeur la plus complète possible, sans engendrer de dommages neurologiques, en
combinaison avec la radiothérapie et la chimiothérapie. La résection chirurgicale consiste
en l’ablation de la tumeur et le succès de celle–ci dépend des caractéristiques de la tumeur
telles que sa localisation et son éventuelle infiltration des tissus environnants. En effet,
une résection supérieure à 90% permet d’augmenter la survie des patients à 1 an. 21 Le
gain de survie associée à ce traitement est en moyenne de 6 à 10 mois.22
Afin d’améliorer le succès de la chirurgie, des techniques ont été développées telles que
la chirurgie guidée par fluorescence. Celle–ci consiste en l’administration d’un agent
fluorescent spécifique de la tumeur, administré au patient avant la chirurgie. Au cours de
l’opération du patient, la zone est illuminée à une longueur d’onde appropriée et la
résection des zones émettant de la fluorescence peut alors être effectuée. 21 Un des premiers
agents utilisées pour démontrer l’intérêt de cette approche en chirurgie est le précurseur
ALA (acide 5–Aminolévulinique) conduisant à la formation de la PpIX (protoporphyrine
IX) fluorescente (Figure 3).23
19
Figure 3 : Photographies peropératoires de la cavité opératoire sous lumière visible (à gauche) et sous lumière bleue (à
droite). Extraite de Stummer et al.23
La radiothérapie du glioblastome consiste, classiquement, en l’administration au

patient d’une dose de rayons X de 50–60 Gy répartie en plusieurs sessions sur 6 semaines.
Son utilisation après la chirurgie conduit à une survie de 12 mois en moyenne. La
chimiothérapie est effectuée en parallèle de la radiothérapie avec l’administration de
témozolomide. Son association à la chirurgie et à la radiothérapie conduit à une
augmentation de la survie moyenne à 14,6 mois.22
En revanche, ces traitements restent insuffisants compte tenu de la survie médiane après
diagnostic de la tumeur et il apparaît souvent une récidive de la tumeur.
I.6.2.3. Traitement par PDT
De nombreuses études cliniques reposant sur l’utilisation de la PDT pour le traitement

de tumeurs cérébrales ont été effectuées.24–28 Par exemple, en 2013, Johansson et al.26 ont
réalisé une étude clinique sur 5 patients reposant sur l’utilisation de la PpIX exogène pour
le traitement de glioblastomes récurrents non résécables. Ils ont étudié l’accumulation du
PS dans la tumeur par fluorescence ainsi que son photoblanchiment après traitement par
PDT interstitielle (iPDT). Après administration du PS et avant traitement par iPDT, des
biopsies ont été effectuées afin d’évaluer l’accumulation du PS. Des concentrations
importantes (entre 1,4 et 3 µM) ont été relevées dans les biopsies de 3 patients. Ces
concentrations corrèlent avec les meilleures réponses au traitement, par rapport aux
biopsies où une faible concentration de PS a été détectée, avec aucune progression de la
tumeur après 29, 30 et 36 mois.
Un essai clinique (projet INDYGO)28 est actuellement en cours à Lille pour le

traitement du glioblastome nouvellement diagnostiqué. Il repose sur l’inclusion du
traitement iPDT, utilisant le ALA, dans le protocole thérapeutique classique. Pour cela,
20
après une résection chirurgicale la plus complète possible, une chirurgie guidée par
fluorescence émise par le PS sous lumière bleue est effectuée afin d’éliminer les zones
cancéreuses non observables sans fluorescence. Le traitement par iPDT est administré à
la fin de la résection par illumination, grâce à un ballonnet, spécifique de la cavité
opératoire sous lumière rouge. Le traitement est ensuite complété par la radiothérapie et
la chimiothérapie.
L’ensemble de ces études démontrent l’intérêt d’utiliser la PDT pour le traitement du

glioblastome.
II. La thérapie photodynamique (PDT)
II.1. Découverte de l’effet photodynamique et application

pour le traitement du cancer
La PDT repose sur le phénomène « d’effet photodynamique » issu de la combinaison de

la lumière, d’une molécule photosensible (PS) et de l’oxygène moléculaire pour induire des
photoréactions. Ce phénomène fut défini pour la première fois par von Tappeiner et
Jesionek en 1904.29
En 1900,30 Oscar Raab fut le premier à observer un effet cytotoxique sur une espèce de
paramécie (organisme unicellulaire) après traitement avec l’acridine en combinaison avec
la lumière du jour. En l’absence de lumière, une survie des paramécies fut observée. Ceci
fut suivi, en 1903,31 par diverses applications dermatologiques (traitement de carcinomes
basocellulaires) avec des PSs, telle que l’éosine, effectuées par von Tappeiner et Jesionek
qui mirent alors en évidence l’implication de l’oxygène dans ce phénomène. Le terme
« thérapie photodynamique » est né en 1912,32 un important effet photodynamique fut
démontré sur des souris avec l’utilisation de l’hématoporphyrine (HP) par le laboratoire
de recherche d’Hans Fischer. En 1913,33 Meyer–Betz s’administra 200 mg d’HP et
n’observa aucun effet durant les deux premiers jours. Lors du troisième jour plus
ensoleillé, les parties de son corps exposées au soleil développèrent des érythèmes et
œdèmes, signes d’une photoréaction, plus importants sur le côté droit de son visage plus
exposé. Cinq jours après l’injection, une réduction du gonflement fut observée même si une
photosensibilité (due à la présence de l’HP) persista pendant plusieurs semaines jusqu’à
l’élimination complète du PS de l’organisme (Figure 4). Cette expérience démontra avec
succès l’effet photodynamique chez l’homme.29,34
21
Figure 4. Photographies de Meyer–Betz : trois (gauche) et cinq jours (droite) après injection d'HP.35
De nombreuses études ont démontré la pertinence d’utiliser l’HP en tant qu’agent

diagnostic et thérapeutique pour le traitement de certains cancers.36–41 L’HP a été obtenue
pour la première fois par Scherer en 1841 42 à partir de l’hémoglobine traitée dans un
premier temps avec un acide minéral (acide sulfurique ou solution d’acide bromhydrique
dans l’acide acétique) suivi d’une hydrolyse pour éliminer le fer et les protéines pour
obtenir l’HP le plus souvent sous forme de dichlorure. Schwartz et al. démontrèrent, en
1955, que la préparation d’HP utilisée dans les précédentes études était un mélange de
différentes porphyrines.43 Après des essais de purification, il observa que l’HP pure
obtenue présentait une très faible sélectivité pour les tumeurs. Ce n’est que dans les
années 60 que Lipson et al.44 développèrent, en recherchant un composé plus hydrosoluble,
un mélange de différents produits, appelée dérivée d’HP (HpD), obtenue par traitement
du dichlorure d’HP avec de l’acide sulfurique dans l’acide acétique puis neutralisation en
milieu alcalin pour obtenir un pH de 7,4, et présentant l’avantage d’être deux fois plus
cytotoxique que l’HP.
La première application de l’HpD pour la détection de tumeurs par fluorescence sur
des patients fut décrite par Lipson et al. en 1967.45 Quelques années plus tard, la
phototoxicité de l’HP46 (1972) et l’HpD47,48 (1975) furent évaluées, pour le traitement par
PDT de gliomes46, de carcinosarcomes et de tumeurs mammaires47 sur des souris et rats
démontrant alors une importante suppression de la croissance tumorale. En revanche, une
réapparition des tumeurs fut observée après plusieurs jours.
En 1976, la première étude clinique utilisant l’HpD pour un traitement par PDT fut
effectuée par Kelly et Snell sur cinq patients présentant des cancers de la vessie et après
traitement, la nécrose des tumeurs fut observée sans lésions au niveau des zones non
illuminées.49 En 1978, un essai clinique à plus grande échelle fut réalisé par Dougherty et
al. sur 25 patients présentant de nombreuses tumeurs de la peau et pour lesquelles les
traitements classiques avaient échoués.50 L’efficacité de la PDT fut alors démontrée avec
succès. Ils ont plus tard identifié les fractions actives de l’HpD responsables de l’effet
photodynamique généré : l’ester et l’éther de dihématoporphyrine.
22
En 1985, le Photofrin®, une fraction enrichie des composés les plus actifs de l’HpD,
développé par Dougherty à la fin des années 70,50 fut alors commercialisée. L’HpD et le
Photofrin® ont conduit à de nombreux essais cliniques durant les années 80 pour le
traitement de nombreux cancers (vessie, poumon, peau…) conduisant généralement à des
résultats encourageants. Le Photofrin® a été le premier composé à obtenir l’autorisation
de mise sur le marché (AMM) pour un traitement par PDT du cancer de la vessie en 1993
au Canada.29,34,51
II.2. La PDT pour le traitement du cancer
La PDT est une approche relativement simple et efficace nécessitant trois entités : la
lumière, l’oxygène et un PS. Pris séparément, ces trois éléments ne présentent pas de
toxicité, c’est leur combinaison qui va induire des réactions de photooxydation. Lors d’un
traitement par PDT, le PS est administré au patient par injection intraveineuse la plupart
du temps (ou sous forme de crème ou de suspension buvable). Après un certain temps,
appelé intervalle drogue–lumière, dépendant de la nature du PS et du type de cancer
traité, le PS est illuminé. Il va réagir avec l’oxygène présent dans les cellules et leurs
microenvironnements, par réaction de photooxydation pour produire des espèces réactives
de l’oxygène (ROS) telles que le radical hydroxyle (HO•) (photoréactions de type I) ou
l’oxygène singulet (1O2) (photoréactions de type II). Ces ROS vont finalement induire un
stress oxydant entraînant l’éradication de la tumeur (Figure 5).
Figure 5. Principe du traitement par PDT
II.3. Mécanismes photophysiques
Pour générer l’effet photodynamique, le PS utilisé doit avant tout absorber les photons
à la longueur d’onde d’illumination sélectionnée.34 Les mécanismes photophysiques et
photochimiques impliqués lors de l’illumination d’un PS sont illustrés par le diagramme
de Perrin–Jablonski (Figure 6). Dans son état fondamental, le PS présente une
23
configuration pour laquelle les électrons sont appariés avec des spins opposés (spin total
S = 0) et une multiplicité de spin (Ms), donnée par l’équation (1) :
Ms = 2S + 1 (1)
Où Ms est la multiplicité de spin et S le spin total.
Dans le cas d’un PS à l’état fondamental, Ms est égale à 1 ce qui correspond à un état
singulet. L’état fondamental S0 représente un état où le PS se trouve à son plus faible
niveau d’énergie.
Figure 6. Diagramme de Perrin–Jablonski modifié. CIS, conversion intersystème ; e–, électrons RV, relaxation
vibrationnelle.
Lors de son illumination, le PS absorbe un photon conduisant à la migration rapide (≈

10–15–10–12 s) d’un électron de son état S0 à un état d’énergie plus élevée, c’est–à–dire un
état singulet excité (Sx avec x = 1, 2, 3… augmentant avec l’état énergétique) dépendant
de l’énergie transférée.52
Lorsque l’électron se trouve à un état singulet excité dans un haut niveau vibrationnel,
il redescend rapidement au niveau le plus faible de ce même état par un processus appelé
relaxation vibrationnelle (RV) associé à une dissipation de l’énergie sous forme de chaleur.
Si cet électron se trouve à un état singulet supérieur (S 2 par exemple), ce dernier va
retomber au premier état singulet excité (S 1), relaxation vibrationnelle par conversion
interne (CI). Le retour à l’état fondamental peut alors se produire de différentes manières :
i) l’émission d’un photon (fluorescence, ≈ 10–11–10–8 s), ii) la dissipation de chaleur
(relaxation non radiative) ou iii) la conversion intersystème (CIS), c’est–à–dire le passage
à un niveau isoénergétique d’un état triplet (T 1). A ce dernier état, les électrons sont
24
appariés et possèdent le même spin. Cette transition est favorisée pour la plupart des PSs.
En revanche, cette transition de spin est interdite selon la règle de changement de spin,
mais a une certaine probabilité de se produire du fait du couplage spin–orbite. Le passage
à l’état T1 est suivi par divers mécanismes : i) une RV, ii) une relaxation radiative à l’état
S0 appelée phosphorescence (≈ 10–6 s) correspondant à l’émission d’un photon et iii)
réactions avec les molécules environnantes dont l’oxygène soit par transfert d’un électron
permettant de générer notamment le radical anion superoxyde (O2●–) et le radical
hydroxyle OH● correspondant aux photoréactions de type I, soit par transfert d’énergie
permettant de générer de 1O2 à partir de l’oxygène et correspondant aux photoréactions de
type II.
II.3.1. Photoréactions de type I
Les photoréactions de type I sont caractérisées par un transfert d’électrons ou de

protons aux molécules environnantes telles que l’oxygène entraînant la formation de
radicaux anion ou cation, eux–mêmes capables de réagir avec l’oxygène pour générer des
ROS (équations (2) et (3) Tableau 2). Le plus souvent, cela conduit à la formation, par
transfert d’un électron du PS à l’oxygène, d’anions superoxyde (O2–●) peu réactifs en milieu
biologique.52 En revanche, ces derniers peuvent réagir de différentes manières :
- Dismutation spontanée en peroxyde d’hydrogène (H2O2) ayant la capacité de

traverser facilement les membranes biologiques (équation (4) Tableau 2) ;
- Réaction d’Haber–Weiss, avec H2O2, si ce dernier est présent en forte
concentration, pour former des radicaux hydroxyles (équation (5) Tableau 2) ;
- Réaction de Fenton, catalysée par un métal (fer ou cuivre) qui permet la
production de radicaux hydroxyles. Par exemple, l’interaction des O2–● avec le
Fe (III) conduit à sa réduction en Fe (II) qui peut lui–même réagir avec H2O2
pour former les radicaux hydroxyles (équations (6) et (7) Tableau 2).52,53
Tableau 2 : Principales photoréactions de type I. 52,54
Photoréactions
3
PS∗ (T1 ) + Substrat → Substrat +▪ + PS−▪ (2)
PS −▪ + O2 ( 3Σg− ) → PS + O−▪
2 (3)
O−▪ −▪ +
SOD (4)
2 + O2 + 2H → H2 O2 + O2
O−▪ 3 − −
2 + H2 O2 → O2 ( Σg ) + OH + OH
▪ (5)
O−▪
2 + Fe
3+ → O ( 3Σ − ) + Fe2+
2 g (6)
Fe2+ + H2 O2 → Fe3+ + OH− + OH▪ (7)

SOD, superoxide dismutase.
25
Les radicaux hydroxyles OH● sont les ROS les plus agressifs, hautement réactifs, et
capables d’endommager la plupart des macromolécules biologiques.
II.3.2. Photoréactions de type II
Les photoréactions de type II sont caractérisées par un transfert d’énergie du PS à

l’état triplet (3PS*) à l’oxygène. Ce transfert d’énergie ne peut se produire que lorsque les
deux espèces (3PS* et oxygène) rentrent en collision. Pour cela, deux conditions sont
requises : d’une part la durée de vie de l’état triplet du PS doit être suffisamment longue
et d’autre part un niveau minimal d’oxygène dans le milieu est requis.55 Lors de son retour
à l’état fondamental, le 3PS*, transfère son énergie (110–130 kJ.mol–1) à l’oxygène, se
trouvant à l’état triplet fondamental.52 Ce transfert d’énergie conduit à l’excitation de l’état
triplet à un état singulet pour lequel les électrons sont appariés avec des spins opposés.
On recense l’existence de deux états singulet excités d’énergie différents pour l’oxygène.
Le premier, noté 1Δg, présente un niveau d’énergie de 94 kJ.mol–1 alors que le second, noté
1Σ +, possède une énergie de 156,7 kJ.mol–1. Seul le premier (1Δg) est considéré comme
g
intervenant lors de l’effet photodynamique, le second, présentant une durée de vie trop
courte, est rapidement quenché pour conduire au premier niveau d’énergie singulet
excité.55 L’1O2 formé est une espèce très réactive qui peut réagir très facilement (oxydation)
avec les substrats biologiques environnants tels que les acides aminés, les bases
pyrimidine et purine ainsi que les phospholipides. Du fait de sa durée de vie courte et sa
grande réactivité, l’1O2 agit très localement là où il est formé, dans un rayon d’action de
l’ordre de la dizaine de nanomètres.
Les deux types de photoréactions (type I ou II) peuvent se produire simultanément, la

proportion de l’une par rapport à l’autre varie en fonction de certains paramètres telles
que la concentration en oxygène ou la nature du PS.52
II.3.3. Paramètres
Les capacités d’absorption, de fluorescence et de production d’1O2 d’un PS peuvent alors

être déterminés par quatre paramètres : le coefficient d’extinction molaire ε, les
rendements quantiques de fluorescence et de production d’1O2 (Φf et ΦΔ) et la durée de vie
de fluorescence (τf).
La quantité de lumière absorbée par le PS est directement proportionnelle à la

concentration de la solution illuminée. L’absorption de la lumière est ainsi définie par la
loi de Beer–Lambert :
26
A = ε. C. l (8)
Avec A, l’absorbance une constante sans unité ; ε, exprimé en L.mol–1.cm–1 spécifique d’une
molécule ; C, la concentration exprimée en mol.L–1 et l, la longueur du trajet parcouru par
la lumière exprimée en cm.29
Le rendement quantique de fluorescence, notée Φf, correspond au ratio du nombre de

photons émis par fluorescence sur le nombre de photons absorbés pendant le même temps.
La durée de vie de fluorescence, notée τ f correspond, quant à elle, au temps moyen pour
qu’une molécule passe de l’état excité S1 à l’état fondamental S0.29
Le rendement quantique de production de 1O2, notée ΦΔ, correspond au ratio du nombre

de photons émis par luminescence de 1O2 sur le nombre de photons absorbés par le PS
pendant le même temps.56
II.4. Lumière
II.4.1. Paramètres utilisés dans le choix de la source lumineuse
Afin de générer l’effet photodynamique le plus efficace, il est nécessaire de prendre

plusieurs paramètres en considération lors du choix de la source lumineuse. La lumière
peut être décrite sous la forme d’ondes et de photons. Il est donc possible de caractériser
son déplacement dans l’espace de différentes manières : utiliser ses caractéristiques
d’onde pour décrire son comportement ou utiliser la nature des particules et des quantums
de lumière pour décrire les interactions et transferts d’énergie entre les molécules.57
L’énergie d’un seul photon, exprimée en Joules (J), est donnée par l’équation (9) :
hc (9)
Ephoton =
λ
Où h est la constante de Planck (6,626 x 10–34 J.s), c la vitesse de la lumière (3 x 1010 cm.s–
1) et λ la longueur d’onde (cm).
Il est également possible d’exprimer la longueur d’onde λ (cm) de la lumière en fonction de

sa fréquence ν (ondes par seconde) et de sa vitesse c, suivant l’équation (10) :
c (10)
ν=
λ
Dans le cadre d’applications photochimique et médicinale, deux paramètres

importants doivent être considérés : la quantité totale d’énergie utilisée pour un procédé
photochimique donné et la vitesse d’application au système considéré. Nous pouvons
considérer le taux de lumière absorbé et la quantité de lumière atteignant la surface
27
d’intérêt (dose de lumière reçue). Deux paramètres vont permettre de régler les conditions
d’illumination optimales en fonction de la zone à traiter : 1) la puissance rapportée à l’unité
de surface est appelée « éclairement énergétique » ou irradiance et est exprimée en W.cm–
2 et 2) l’énergie rapportée à l’unité de surface est appelée « exposition énergétique » ou
fluence (J.cm–2). 29
Un des avantages de la PDT est l’utilisation de radiations non ionisantes, la lumière

visible. La source lumineuse utilisée doit être choisie selon deux critères importants : 1)
être suffisamment énergétique pour activer l’état triplet du PS et par conséquent l’état
singulet de l’oxygène et 2) pénétrer suffisamment les tissus biologiques pour atteindre la
cible visée. Au regard du spectre électromagnétique donné en Figure 7, nous pouvons
observer que la lumière visible représente une très faible partie de ce spectre, la zone
d’intérêt pour une application en PDT est par conséquent d’autant plus réduite.
Figure 7 : Spectre électromagnétique.
En se référant à l’équation de l’énergie (8), plus la longueur d’onde est faible, plus elle est
énergétique et susceptible d’activer la production d’ 1O2 mais par conséquent destructive
des tissus à l’image des rayons ultraviolets (UV) qui peuvent générer des photo–dégâts
importants. Au contraire, au–delà de 1200 nm, il devient difficile de générer un effet
photodynamique permettant de produire de l’1O2 en raison de l’énergie insuffisante
générée.
En ce qui concerne la pénétration de la lumière dans les tissus, plusieurs phénomènes

peuvent se produire lorsqu’un faisceau lumineux traverse des tissus biologiques : il peut
être réfléchi, diffusé ou absorbé (Figure 8). De plus, la pénétration de la lumière dans les
tissus est très faible (de l’ordre de quelque millimètres) et est différente en fonction de la
longueur d’onde (pénétration plus profonde de la lumière rouge et proche infrarouge).
28
Figure 8 : Pénétration de la lumière dans les tissus biologiques en fonction de la longueur d'onde. Extraite de 58.
Il faut également prendre en considération l’absorption de la lumière par les différents

composants des tissus biologiques qui peuvent entrer en compétition avec les PSs. En
lumière UV, ce sont principalement les protéines qui absorbent et en lumière rouge, ce
sont principalement l’hémoglobine et la mélanine qui absorbent (Figure 9).
Figure 9 : Spectre d'absorption des principaux constituants des tissus biologiques. Extraite de 59.
L’ensemble de ces considérations a permis de définir une fenêtre thérapeutique pour

la source lumineuse utilisée en PDT comprise entre 700 et 1000 nm.
II.4.2. Sources lumineuses utilisées en PDT
De nombreuses sources lumineuses existent pour la PDT telles que le soleil, les lasers,
les lampes et les diodes électroluminescentes (DELs).
29
II.4.2.1. Le soleil
La lumière du jour peut être utilisée comme source lumineuse en PDT. Ce traitement
est connu sous le nom de Daylight PDT et a reçu l’AMM pour le traitement des kératoses
actiniques en 2016 en France. Il consiste en l’exposition du patient à la lumière du jour
pendant deux heures, 30 min après application du PS (ALA). L’utilisation de la lumière
du jour est limitée par les conditions météorologiques (ciel dégagé, température comprise
entre 10 et 30°C), la localisation de la lésion à traiter et ne peut être réalisée que d’avril à
octobre.60
II.4.2.2. Lasers
Les lasers sont très utilisés en PDT. En effet, le faisceau émis par un laser présente
des caractéristiques intéressantes qui sont 1) homogène, 2) monochromatique, 3)
possibilité d’émission par courtes pulsations et 4) couplage à une fibre optique avec une
faible perte d’intensité. Il existe de nombreux types de lasers tels que les lasers à état
solide, les lasers à gaz et les lasers à colorant. En revanche, ce type d’équipement peut
présenter un coût élevé et nécessite une expertise technique en terme d’utilisation et de
maintenance.29 Les récents progrès font diminuer les coûts.
Les lasers à diode ont été plus récemment développés et présentent un potentiel pour
des applications PDT. Ils sont composés d’un semi–conducteur qui les rend compacts tout
en conservant une puissance élevée. De plus, ils peuvent être utilisés en mode continue ou
pulsé, sont facilement transportables et faciles d’utilisation. Ils sont souvent couplés à des
fibres optiques et utilisés pour de nombreuses applications PDT notamment endoscopique
ou interstitiel.61 Par exemple, afin de pallier la faible pénétration de la lumière dans les
tissus, la iPDT, consistant en l’insertion de ces fibres optiques dans les tissus à traiter,
peut être utilisée.62
II.4.2.3. Lampes
Les lampes sont moins coûteuses et leur entretien ainsi que leur portabilité sont plus
aisés. Elles ne présentent pas une émission monochromatique mais un spectre beaucoup
plus large nécessitant l’utilisation d’une combinaison de filtres permettant 1) de
sélectionner une longueur d’onde avec une bande passante de 10 nm (filtre à bande
étroite), 2) une réduction du rayonnement UV (filtre passe–haut) et 3) une réduction de
l’émission infrarouge pouvant induire un réchauffement de la zone traitée (filtre passe–
bas). L’utilisation des lampes est, de préférence, conseillée pour le traitement de lésions
30
superficielles larges (lésions de la peau) puisqu’elles peuvent être difficilement couplées à

des fibres optiques.61
II.4.2.4. Diodes électroluminescentes (DELs)
Depuis quelques années, un intérêt pour les DELs en PDT a été démontré. Les DELs
sont caractérisées par une émission non homogène (largeur de bande comprise entre 5 et
10 nm) et une faible puissance (maximum 150 mW.cm–2) réduisant par conséquent la
chaleur produite. Elles sont composées d’un semi–conducteur dont le choix permet
d’ajuster la longueur d’onde utilisée pouvant aller de 350 nm à 1100 nm. Elles présentent
plusieurs avantages comme leur faible coût, leur versatilité et leur facilité de transport.29,61
Le choix de la source lumineuse va dépendre de la zone à traiter et de la longueur

d’onde d’illumination souhaitée. Afin d’homogénéiser l’illumination de la zone à traiter,
les sources lumineuses peuvent être couplées à une fibre optique (pour une tumeur située
en profondeur), à un ballonnet (illumination d’une cavité) ou à des tissus lumineux
(illumination superficielle).62
II.5. Photosensibilisateurs (PSs) utilisés en PDT
II.5.1. Caractéristiques d’un bon photosensibilisateur (PS)
Un PS idéal doit présenter plusieurs caractéristiques52 :
- Être synthétisé facilement ;

- Avoir une forte absorption à la longueur d’onde d’excitation (un haut coefficient
d’extinction molaire ε) ;
- Posséder un état triplet suffisamment long (typiquement, ≥ 500 ns)54 et un
rendement quantique d’oxygène singulet élevé ;
- Agir localement pour ne détruire que les cellules cancéreuses ;
- Être photostable durant le traitement PDT (faible photodégradation)
- Être soluble dans les milieux biologiques ;
- Être faiblement cytotoxique et rapidement excrété de l’organisme.
Depuis la découverte de la PDT, de nombreux PSs ont été développés et synthétisés

conduisant à plusieurs générations de PS.
II.5.2. Première génération
Le Photofrin® et l’HpD décrit dans le § II.1 constituent la première génération de PSs

autorisés dans le cas de traitement par PDT.
31
Bien que présentant des avantages certains (partiellement sélectifs des cellules
cancéreuses, bon rendement quantique de génération d’1O2,), des inconvénients (mélange
complexe, faible coefficient d’extinction molaire à 630 nm, activité PDT modérée,
photosensibilité rémanente) ont conduit à la recherche de nouveaux PSs correspondant
aux cahiers des charges décrits dans le paragraphe II.5.1.
II.5.3. Seconde génération
La majorité des PSs de seconde génération sont dérivés de l’HpD et par conséquent du
squelette tétrapyrroliques des porphyrines. Les porphyrines sont des composés
macrocycliques constitués de quatre unités pyrrole possédant 22 électrons π dont 18
électrons π sont responsables de l’aromaticité de la molécule (Figure 10).29,34,57
Figure 10 : Structures chimiques de la porphyrine et de ses dérivés.
Les porphyrines et leurs dérivés présentent de nombreux avantages : elles sont

fluorescentes, ont une faible toxicité en l’absence de lumière et une durée de vie de l’état
triplet relativement long. Du fait de leur importante aromaticité, les porphyrines
présentent un spectre d’absorption caractéristique avec une bande très intense autour de
400 nm appelée bande de Soret et quatre bandes entre 500 et 650 nm, appelées bandes Q,
dans la région de la lumière visible (Figure 11).
Figure 11 : Spectre d'absorption standard UV–visible d’une porphyrine.
32
Dans la structure de la porphyrine, deux doubles liaisons périphériques de deux motifs

pyrroles opposés sont conjugués entre elles et ne participent pas à l’aromaticité de la
molécule. La réduction d’une ou deux de ces liaisons conduit à l’obtention de dérivés de la
porphyrine : les chlorines et les bactériochlorines (Figure 10). Ces modifications
entraînent une modification du spectre d’absorption avec un décalage de la bande Q I vers
les grandes longueurs d’onde ainsi qu’une modification du coefficient d’extinction molaire
ε à la longueur d’onde correspondante. En effet, ces modifications de la structure de la
porphyrine entraînent une diminution de l’écart entre les orbitales moléculaires HOMO
(highest occupied molecular orbital) et LUMO (lowest unoccupied molecular orbital). Plus
précisément, concernant les porphyrines, elles possèdent une absorption importante
correspondant à la bande QI entre 630 et 650 nm, décalés entre 660 et 710 nm et plus
intense pour les chlorines et entre 740 et 800 nm pour les bactériochlorines qui dépend
également de la nature des substituants périphériques. Ces modifications sont très
intéressantes dans le cas de la PDT puisqu’elles permettent l’illumination des PSs à des
longueurs d’onde plus grandes résultant en une meilleure pénétration de la lumière dans
les tissus biologiques. En revanche, les bactériochlorines présentent l’inconvénient d’être
beaucoup plus sensibles à l’oxydation.
II.5.3.1. Foscan®
Le Foscan®, dont le nom générique est la Temoporfine, est une chlorine synthétique
qui a été commercialisé en Europe en 2001 et a obtenu l’AMM européenne centralisée en
2008.63,64 Il est utilisé cliniquement pour le traitement de plusieurs cancers : tête et cou,
poumon, peau, cerveau, œsophage. La structure chimique de la molécule, dont le nom
complet est la chlorine 5,10,15,20–tétra(m–hydroxyphényl) (mTHPC), est présentée en
Figure 12.65,66
Figure 12 : Structure chimique du Foscan®.
En comparaison avec le Photofrin ®, ce composé, développé par Bonnet et al. dans les
années 80,67 présente l’avantage d’être chimiquement pur et possède une bande
33
d’absorption QI à 652 nm ainsi qu’un ε de 30 000 M–1cm–1 à cette longueur d’onde dans le
méthanol (MeOH). Par conséquent, de faibles quantités de ce composé sont nécessaires
pour générer un effet photodynamique ainsi que de faibles doses de lumière. Dans le cas
d’un cancer colorectal, l’intervalle drogue–lumière est de 2 jours pour avoir une
accumulation préférentielle dans les cellules cancéreuses. Dans ce même cas, sa demie–
vie d’élimination est de 10 à 12 jours.68,69
II.5.3.2. Acide 5–aminolévulinique (ALA) et ses dérivés
Un autre PS très utilisé est la PpIX endogène obtenue à partir de l’ALA. L’ALA est une
prodrogue précurseur de la PpIX elle–même précurseur dans la biosynthèse de l’hème
(Figure 13).34
Figure 13 : Biosynthèse de l'hème. PBG, Porphobilinogène ; Uroll, Uroporphyrinogène ; Coproll,

Coproporphyrinogène ; Proto IX, protoporphyrinogène IX. Adaptée de Hamblin et al.34
L’ALA, tout comme l’hème, ne présente pas d’effet photodynamique à la différence de

la PpIX. L’apport en excès d’ALA exogène conduit à une accumulation de la PpIX.34 Ceci
rend cette approche très sélective des tissus cancéreux en raison d’une faible activité de la
ferrochélatase dans ces derniers en comparaison avec les tissus sains. L’ALA a été formulé
sous plusieurs formes : orale, intraveineuse et topique dépendante de son application et
plusieurs formulations chimiques dérivées. Cliniquement, suivant l’application, la PpIX
peut être illuminée à 410 nm, 510 nm ou 635 nm.68 Les longueurs d’onde les plus courtes
permettent une plus grande production d’1O2 et par conséquent un traitement plus court.
Pour des lésions superficielles, l’ALA est appliqué topiquement et illuminé aux plus basses
longueurs d’onde alors que pour les lésions plus profondes, les formes orales et
intraveineuse sont privilégiées avec une illumination à 635 nm.34
34
L’ALA a été autorisé sous le nom de Levulan® en 1999 aux Etats–Unis pour le
traitement de lésions superficielles de la peau, les kératoses actiniques en administration
topique. La PpIX présente une clairance rapide ainsi qu’une faible intervalle drogue–
lumière. Bien que très efficace dans le traitement de ce type de lésion, la destruction des
tumeurs est limitée à une faible pénétration (1 mm) et le traitement entraîne une douleur
importante pour le patient.70 Grâce aux tissus lumineux composés de fibres optiques
développés par le laboratoire INSERM OncoThAI à Lille, permettant une diffusion
homogène de la lumière à une irradiance basse, la douleur est dorénavant complètement
supprimée.60
D’autres molécules dérivées de l’ALA ont été développées, des esters de l’ALA,
permettant une pénétration dans la peau plus importante notamment le Metvix® (acide
méthylaminolévunilique), également autorisé en Europe, qui présente une meilleure
lipophilie que le Levulan® avec des propriétés photophysiques similaires, une plus grande
sélectivité pour les cancers cutanés et une douleur associée au traitement réduite.
A travers le monde, l’ALA et ses dérivés sont grandement utilisés en dermatologie

notamment pour le traitement des kératoses actiniques, de la maladie de Bowen, des
carcinomes basocellulaires mais également pour les cancers tête et cou, de la vessie, de la
prostate et de l’œsophage de Barret.65,68
II.5.3.3. Visudyne®
La Visudyne® dont le nom générique est la Vertéporfine a reçu l’AMM européenne en

2000 pour des traitements ophtalmologiques notamment pour le traitement de la
dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA).71 La Vertéporfine est un dérivé de la
benzoporphyrine dont la structure chimique est donnée en Figure 14.72
Figure 14 : Structure chimique de la Visudyne®
C’est un composé hydrophobe capable de générer efficacement de l’ 1O2 lorsqu’il est

illuminé à 689 nm. De plus, il présente une photosensibilité de la peau, dépendante de la
dose administrée, maximale seulement quelques heures après traitement.73
35
II.5.3.4. Tookad ®
Le Tookad® dont le nom générique est la padéloporfine, est une bactériochlorine dont
la structure chimique est donnée en Figure 15.
Figure 15 : Structure chimique du Tookad®.
Le Tookad® est un composé hydrophile, ainsi facile à administrer et agissant au niveau

vasculaire. Son illumination à 763 nm permet une pénétration profonde de la lumière et
il est rapidement excrété avec une disparition de la photosensibilité 3 heures après
administration.68 Lors d’essais cliniques, il a été montré que ce traitement été sûr et
efficace avec une disparition du cancer dans 50% des cas après un suivi de 3,5 ans. 74 12
essais cliniques utilisant ce composé sont recensés sur le site clinicaltrials.gov. Il a reçu
l’AMM en France en 2017 pour le traitement du cancer de la prostate localisé à faibles
risques par PDT vasculaire (VTP) mais son impact a été jugé insuffisant par la commission
Nationale d’évaluation des dispositifs médicaux et des technologies de santé et la
commission de transparence, en comparaison avec les modalités de traitement déjà
utilisées. De ce fait, il n’est pas remboursé et pas utilisé. 75
En février 2020, la FDA (Food and Drug Administration) n’a pas non plus approuvé
l’utilisation du Tookad®, préférant, pour les patients à faible risque, une surveillance
active.
II.5.3.5. Autres PSs de seconde génération
Le Tableau 3 récapitule les principaux PSs ayant reçu une AMM ou étant en phase
clinique dans le monde. En fonction du PS et du type d’illumination, la concentration
administrée varie de 0,1 à 5 mg/kg par patient, avec une dose de lumière de 10 à 300 J.cm–
2.
36
Tableau 3 : Liste non exhaustive des PSs de seconde génération ayant reçu l’AMM ou en phase clinique.76,77
Nom du PS Longueur Applications Approuvé Essai

médicament d’onde clinique
d’absorption
Foscan® Temoporfin, m– 652 nm Cancer tête et cou Europe64
THPC
Levulan® ALA 635 nm Kératoses actiniques Europe,
Etats–
Unis78
Lutrin® Lu–Tex, Lutétium 732 nm Cancer du sein Etats–
(III)–texaphyrine Unis79
Metvix® Methyl–ALA 635 nm Kératoses actiniques Europe,
Australie78
Pc–4 Silicon phtalocyanine 675 nm Lésions Etats–
cutanées/subcutanées de Unis80
tumeurs solides diverses
Photochlor 2–(1– 665 nm Cancer de l’œsophage, Etats–
Hexyloxyethyl)–2– des poumons, tête et cou Unis81
devinylpyropheo– et larynx
phorbide, HPPH
Tookad® Bacteriochlorine 762 nm Cancer de la prostate Europe82 Mexique83
Visudyn ® Verteporfine 689 nm Ophtalmique (DMLA) Monde84
Bien que présentant une activité photodynamique importante, les PSs de seconde
génération présentent deux inconvénients majeurs, à savoir une solubilité limitée ainsi
qu’une faible sélectivité pour les cellules cancéreuses.
II.5.4. Troisième génération
Une troisième génération de PSs suscite depuis plusieurs années un intérêt croissant
afin d’améliorer la sélectivité et l’accumulation des PSs actuels pour les tissus tumoraux.
Afin de mener à bien ces objectifs, la stratégie de recherche repose sur l’association des
PSs de seconde génération à des vecteurs par encapsulation ou conjugaison. Les PSs
peuvent être couplés à des nanoparticules (NPs) ou des ligands de récepteurs
membranaires surexprimés sur ces cellules.
Cette section sera détaillée plus précisément dans la partie suivante III.2.
II.5.5. Quatrième génération
La quatrième génération de PSs est basée sur le développement de composés

remplissant à la fois le rôle d’agents de diagnostic et thérapeutique pour une application
dite théranostique. En effet, la majorité des PSs sont des fluorophores pouvant être utilisés
comme outil de diagnostic en parallèle d’un traitement PDT. Ceci présente plusieurs
37
intérêts pour guider ou améliorer le traitement tels que la confirmation de la localisation

du PS ou la différenciation des cellules malignes des cellules saines.85
Cette partie ne faisant pas l’objet de cette thèse, elle ne sera pas détaillée davantage.
III. Limites de la PDT
III.1. Pénétration de la lumière
Comme décrit dans le § II.4, le choix de la source d’illumination dépend de la

localisation et du type de tumeur. Pour traiter des tumeurs profondes sans utiliser de
fibres, il est nécessaire d’utiliser des longueurs d’onde d’excitation dans le rouge voire le
proche infrarouge.
III.1.1. Excitation biphotonique dans le proche infrarouge
L’utilisation d’une illumination proche infrarouge (NIR) en PDT apparaît comme une
stratégie prometteuse pour une meilleure pénétration de la lumière dans les tissus. En
effet, la fenêtre spectrale, pour laquelle la plus grande transparence des milieux
biologiques est observée, est comprise entre 700 et 1100 nm.86
L’application d’une excitation biphotonique en PDT est une approche développée ces
dernières années qui permet l’excitation dans le proche infrarouge d’une molécule. Cette
technique repose sur l’absorption simultanée de deux photons, par combinaison de leur
énergie. Pour augmenter la probabilité d’une molécule à rentrer en contact avec deux
photons simultanément, ceux–ci doivent être émis en grande quantité spatiale et
temporelle ce qui est favorisé par l’utilisation d’un laser pulsé.87 Le mécanisme de
l’excitation biphotonique peut être visualisé comme un processus se déroulant en « deux
étapes ». La première étape consiste au transfert de la molécule de son état fondamental
à un état excité intermédiaire consécutivement à l’absorption d’un premier photon. Durant
la seconde étape, la molécule termine sa transition de son état intermédiaire à un état
excité final suite à l’absorption d’un second photon (Figure 16). En réalité, ces deux étapes
ont lieu simultanément.88
38
Figure 16 : Principe de l'excitation biphoton
Avec cette technique, l’énergie combinée des deux photons est équivalente à l’énergie
d’un seul photon lors d’une excitation classique de la molécule. Pour utiliser cette
technique, la molécule utilisée doit être capable d’absorber en bi–photon. En plus de
présenter une meilleure pénétration de la lumière dans les tissus, une sélectivité spatiale
importante est observée en raison d’une relation quadratique entre l’intensité du laser et
l’excitation biphotonique. Cette sélectivité permet de concentrer le faisceau laser sur la
zone cible en limitant le risque d’atteindre les tissus sains.87
Ces dernières années, une autre approche reposant sur l’utilisation d’un nouveau type
de NPs, appelé UCNPs (upconversion NPs), a été développée pour une excitation dans le
proche infrarouge. Les UCNPs sont principalement constituées de matériaux en
céramique dans lesquels sont introduits des atomes de terres rares. Ces NPs ont la
capacité d’absorber séquentiellement deux photons à travers un état d’énergie métastable.
Cet état d’énergie métastable possède une durée de vie de l’ordre de la microseconde
beaucoup plus long que l’état intermédiaire (de l’ordre de la femtoseconde) impliqué dans
le procédé d’excitation biphotonique. La durée de vie plus longue de cet état intermédiaire
permet l’utilisation de laser en mode continue et de puissance plus faible de l’ordre de 1–
103 W.cm–2 (106–109 W.cm–2 en excitation biphotonique). Après absorption de deux photons
de faible énergie, un photon de haute énergie est émis dans le spectre du visible et
transfert une partie de cette énergie au PS (Figure 17).86,89,90
39
Figure 17 : Illustration du transfert d’énergie des UCNPs à un PS. Adaptée de Mallidi et al.86
III.1.2. Utilisation des rayons X
Une autre stratégie pour augmenter l’activation du PS en profondeur est l’utilisation

des rayons X (RX). Elle a été largement étudiée depuis les années 90 avec un intérêt
croissant depuis le début des années 2000 avec le développement de NPs spécifiques.
Cette partie a fait l’objet d’une revue intitulée « Using X–ray in photodynamic therapy: an
overview » publiée en 2018 dans le journal Photochemical and Photobiological Sciences.91
Deux approches principales ont été rapportées dans cette revue ; d’une part,
l’utilisation des RX avec le PS seul et d’autre part l’utilisation de NPs excitables par RX.
La première partie décrit l’utilisation de PSs comme radiosensibilisateurs tels que l’HpD,
le Photofrin®, la PpIX et l’acridine orange. La seconde partie s’est intéressée à décrire les
différents types de NPs excitables par les RX, couplés ou non à des PSs. Dans le cas où un
PS est associé aux NPs, ces dernières sont activées dans un premier temps par les RX puis
sont capables de transférer leur énergie par FRET ( Fluorescence Resonance Energy
Transfer) au PS et ainsi générer la production de ROS. Certaines NPs peuvent également
générer des ROS directement par excitation aux RX.
III.2. Ciblage
La PDT présente un inconvénient majeur qui est le manque de sélectivité de la

majorité des PSs commerciaux pour les cellules cancéreuses. Même s’ils présentent une
certaine sélectivité pour ces cellules par rapport aux cellules saines, ceci peut être
amélioré. La recherche de nouveaux PSs ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses a
40
connu un intérêt croissant ces dernières années. Il existe deux approches majeures : le
ciblage passif et le ciblage actif.
III.2.1. Ciblage passif
Le ciblage passif repose sur la diffusion de molécules actives dans les cellules
cancéreuses par l’intermédiaire de nano–véhicules en exploitant le microenvironnement
tumoral notamment l’effet EPR (Enhanced Permeability Effect). Cette stratégie vise à
exploiter les différences physiologiques et morphologiques existantes entre les tissus sains
et cancéreux afin de cibler spécifiquement ces derniers. En effet, l’effet EPR repose sur
une différence de vascularisation entre les cellules saines et cancéreuses. Comme évoqué
dans le § I.2, les cellules cancéreuses développent leur propre réseau vasculaire pour
s’alimenter et se développer. Ce processus, appelé angiogenèse tumorale, correspond à la
création de nouveaux vaisseaux sanguins par les tumeurs à partir de ceux préexistants
des cellules saines. Les parois des vaisseaux sanguins sont composées de cellules
endothéliales. Ils ont la capacité de se renouveler et de proliférer rapidement mais ceci est
généralement régulé par des facteurs pro– et anti– angiogéniques. Dans le cas de
nombreux cancers, les facteurs proangiogéniques sont surexprimés et entraînent un
développement rapide de la néovascularisation des tumeurs. Il apparaît une différence
majeure dans l’agencement des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins des tumeurs
et des tissus sains.92 Dans le cas des tumeurs, les cellules endothéliales présentent un
espacement important qui peut permettre la diffusion de nano–véhicules par effet EPR
(Figure 18). De plus, suite à un drainage lymphatique moins important dans les cellules
tumorales que dans les cellules saines, les nano–véhicules sont retenus dans les cellules
cancéreuses. 93
Figure 18 : Illustration de l'effet EPR. Adaptée de Bugaj.93
41
Les nano–systèmes utilisés doivent répondre à deux critères : être biocompatibles et

non toxiques. La taille hydrodynamique, la forme, la composition et les propriétés de
surface de ces NPs doivent être maîtrisées. Tout objet possédant une taille inférieure à
100 nm peut être qualifié de NPs et le nom de NPs est souvent généralisé aux objets
possédant une taille de quelques centaines de nanomètres. Le diamètre hydrodynamique
idéal pour optimiser les critères de biocompatibilité et de toxicité est fixé entre 10 et 100
nm. Dans le cas du ciblage des tumeurs, les NPs présentent certains avantages comme
une accumulation facilitée dans la tumeur ainsi d’une demi–vie d’élimination et une
distribution dans l’organisme meilleure que pour les médicaments libres. 93,94
Quelques exemples de NPs sont donnés en Figure 19. Les NPs peuvent être
différenciées en plusieurs catégories en fonction de leurs propriétés et leurs
structures dont quelques exemples sont explicités ci–après :
- Les Liposomes sont des vésicules sphériques caractérisées par une taille
comprise entre 80 et 300 nm et composées notamment de phospholipides et de
stéroïdes. Ils permettent d’améliorer les propriétés pharmacocinétiques
(métabolisation rapide, accumulation tumorale) des molécules qu’ils
transportent (hydrophiles et hydrophobes). Leur dégradation par le milieu
biologique permet la libération de la molécule encapsulée dans les cellules
cancéreuses. Cette dégradation dépend généralement de la composition du
liposome et du milieu environnant.94 De nombreuses études ont montré une
accumulation rapide de PSs transportés par des liposomes dans les tumeurs en
comparaison avec le PS administré seul.95–97 Elles présentent cependant une
durée de vie limitée dans le plasma en raison de leur biodégradation.
- Les Dendrimères sont des polymères avec une structure et une taille qui leur
est propre. Ils sont généralement composés de trois éléments : un cœur, des
dendrons (bras dendrimériques) et des groupes en surface actifs. Les dendrons
sont des monomères attachés au cœur (un atome ou une molécule) formant
plusieurs couches polymériques et liés à des groupes fonctionnels en surface. Ce
sont ces derniers qui sont responsables de leur biocompatibilité ainsi que leurs
propriétés physicochimiques.94 En plus d’être biocompatibles, ils présentent une
faible toxicité ainsi qu’un coût de manufacture modéré.93
- Les NPs de silice existent sous différentes formes : les xérogels (structure
amorphe possédant une grande aire de surface et porosité) et les NPs de silice
mésoporeuse (MSNs, structure homogène et faible polydispersité ainsi qu’une
42
adsorption de molécule facilitée par l’aire de surface disponible). Ils peuvent

être utilisées pour des applications à la fois thérapeutique et diagnostique.94
Figure 19 : Différents types de NPs. Adaptée de Wilczewska et al et Gries et al.94,98
Bien que très utilisé et prometteur, ce type de ciblage n’est pas adapté à tous les types
de tumeur. Si les NPs sont de trop petite taille, elles peuvent rapidement être excrétées
par le système rénal mais également perdurer dans le système vasculaire. De plus, dans
le cas de petites tumeurs, l’angiogenèse tumorale ne s’est pas mise en place et la diffusion
des NPs par effet EPR n’est alors pas possible.93
III.2.2. Ciblage actif
Le ciblage actif repose sur l’adressage spécifique de PSs par conjugaison de ces derniers
à des molécules, agissant comme vecteurs, présentant une affinité importante pour des
récepteurs surexprimés à la surface des cellules cancéreuses (direct) ou des néovaisseaux
(indirect) (Figure 20).
Figure 20 : Illustration des deux types de ciblage actif.
43
III.2.2.1. Ciblage actif direct
Le ciblage actif direct consiste en l’introduction du PS au sein des tissus tumoraux.

Dans ce cas, des biomolécules (sucres, peptides, acide folique, stéroïdes…) sont utilisés
comme agents de ciblage de la tumeur et sont liés de façon covalente au PS soit
directement, soit par l’intermédiaire d’espaceurs. Cette stratégie présente deux avantages,
d’une part un contrôle de l’amphiphilie limitant le phénomène d’agrégation et d’autre part
l’augmentation de l’accumulation intracellulaire du PS.57 Quelques exemples de
récepteurs ciblés dans le cas de cette stratégie sont donnés ci–dessous.
III.2.2.1.i. Récepteur du facteur de croissance de l’épiderme (EGF)

L’EGF (Epidermal Growth Factor) est un facteur de croissance impliqué dans la
croissance des cellules épithéliales. Le récepteur de l’EGF présente une activité tyrosine
kinase. Les récepteurs de l’EGF sont surexprimés dans de nombreuses lignées cellulaires.
L’activité de ce récepteur est également connue comme impliquée dans la prolifération et
la croissance cellulaire, l’EGF étant un facteur stimulant l’angiogenèse.93,99 Il a également
été montré que l’ajout d’EGF après un traitement PDT avec l’HpD, sur des lignées
cellulaires de gliomes, réduisait la phototoxicité alors que son ajout avant traitement
n’avait aucun effet.100
Lutsenko et al. ont étudié l’effet de l’utilisation de l’EGF comme vecteur pour des
phtalocyanines disulfonées d’aluminium et de cobalt in vitro sur des lignées cellulaires du
cancer du sein (MCF–7) et in vivo sur des lignées du mélanome (B16).101 Le conjugué
d’aluminium a montré une photoactivité sept fois plus importante que le PS non vectorisé
in vitro et in vivo.
III.2.2.1.ii. Récepteur de l’œstrogène

Dans l’organisme, l’œstrogène constitue la principale hormone stéroïde sexuelle
féminine et se lie naturellement à son récepteur, le récepteur de l’œstrogène qui est une
protéine. Ce récepteur est surexprimé dans plusieurs types de cancer : le cerveau, les
ovaires et le sein.102
James et al. ont synthétisé une tétraphénylporphyrine C11 conjugué au β–oestradiol

pour cibler spécifiquement le récepteur de l’œstrogène.103 Ce conjugué présente une
affinité (CE50 = 274 nM), de l’ordre du nanomolaire, pour ce récepteur mais cependant
moins importante que l’œstrogène (CE50 = 1 nM). Des études in vitro sur des lignées
cellulaires du cancer du sein ont montré une accumulation importante du conjugué dans
des cellules MCF–7, beaucoup plus importante que pour le PS non vectorisé. En revanche,
44
l’activité photodynamique du PS n’a pas connu d’amélioration. 104 Khan et al. ont, quant à
eux, couplé l’œstradiol à diverses phtalocyanines et évaluer l’affinité des conjugués ainsi
que leur phototoxicité pour un modèle cellulaire de cancer du sein.105 Les conjugués les
moins lipophiles ont montré de très bonnes affinités pour le récepteur à l’œstrogène (RBA
(Receptor Binding Affinity) < 2) et certains conjugués ont montré une photoactivité
similaire à celle observée pour le PS non conjugué.
III.2.2.1.iii. Récepteur à l’acide folique

L’acide folique (AF) est une petite molécule connue également sous le nom de vitamine
B9 et présentant une forte affinité pour son récepteur « folate receptor » (FRα). De plus, il
est facilement disponible, à des moindres coûts.93
La fixation de l’AF à FRα conduit à son internalisation dans les cellules par endocytose
dans des vésicules. FRα est de plus absent de la plupart des tissus sains et surexprimés
dans de nombreux cancers (ovaire, reins, sein…). 106
Le ciblage de FRα apparaît donc comme une cible prometteuse en PDT, sa conjugaison
à des PSs étant relativement simple. Le couplage de l’AF à des PSs pour la PDT a été
largement étudiée.106
Notre équipe a étudié le couplage de l’AF à la porphyrine 4–carboxyphényl (P1–COOH)

et a montré que l’accumulation cellulaire du conjugué était sept fois supérieure à celle
observée pour le PS seul. Ce conjugué a de plus montré une phototoxicité importante avec
une survie cellulaire de 30% sur des cellules surexprimant le FRα (KB).107 Une nouvelle
molécule conjuguée à l’AF développée par notre équipe a fait l’objet d’un brevet et son
efficacité a été prouvée sur des carcinoses péritonéales d’origine ovarienne.108,109
III.2.2.2. Ciblage actif indirect
Comme décrit dans le § III.2.1, les tumeurs ont la capacité de développer leur propre
réseau vasculaire par le phénomène d’angiogenèse tumoral. Cette vasculature est
indispensable à la tumeur pour s’alimenter en oxygène et nutriments et par conséquent
pour se développer. Le ciblage de ces néovaisseaux et un traitement PDT asphyxient la
tumeur et peut indirectement entraîner son éradication. Ce procédé est appelé ciblage actif
indirect. Pour mener à bien cette stratégie, la recherche s’est intéressée au ciblage des
récepteurs impliqués dans le développement angiogénique des tumeurs.
III.2.2.2.i. Intégrine α v β 3
L’intégrine αvβ3 est un récepteur des cellules endothéliales néovasculaires surexprimé
dans beaucoup de cellules cancéreuses et dans les cellules endothéliales en prolifération.
45
Il a été montré que ce récepteur jouait un rôle important dans l’angiogenèse.57,110 La

tripeptide RGD a été identifié comme ligand ayant une forte affinité pour ce récepteur. Ce
peptide, sous sa forme linéaire ou cyclique, couplé à un PS (chlorine 5–(4–carboxyphényl)–
10,15,20–triphényl) a été étudiée par notre équipe. Il a été montré in vitro dans des cellules
endothéliales humaines (HUVEC) surexprimant l’intégrine αvβ3 une augmentation 80
(RGD cyclique) et 98 fois supérieure (RGD linéaire) de l’accumulation du PS conjugué en
comparaison au PS seul.111
III.2.2.2.ii. Récepteur du VEGF ( Vascular endothelial growth factor )

Le VEGF est considéré comme un des facteurs angiogéniques les plus importants. Il
appartient à une famille de glycoprotéines homodimériques jouant un rôle clé dans le
développement embryonnaire du système vasculaire sanguin, du système lymphatique
ainsi que dans l’angiogénèse.112 Il est synthétisé notamment par les cellules tumorales et
endothéliales et sa régulation est influencée par différents facteurs notamment l’hypoxie.
Il existe plusieurs isoformes du VEGF qui sont classées en fonction du nombre d’acides
aminés les composant, la forme la plus exprimée dans les tissus est le VEGF165 composé
de 165 acides aminés.
Le VEGF joue un rôle majeur dans le développement des tumeurs et des métastases.
Il est responsable de l’induction de la prolifération des cellules endothéliales ainsi que de
la stimulation de leur migration et favorisent la survie de ces dernières par inhibition de
l’apoptose. Ces phénomènes se produisent par fixation de ce ligand à ses récepteurs
fortement exprimés à la surface des cellules endothéliales.56
Les récepteurs du VEGF sont des récepteurs à activité tyrosine kinase, dont deux de
ces récepteurs sont les VEGFR–1 et VEGFR–2. Une autre famille de récepteur, les
neuropilines (NRP), présentent également une interaction avec le VEGF. Ce sont des
protéines transmembranaires ne présentant pas d’activité tyrosine kinase et jouant le rôle
de co–récepteur des récepteurs de la famille du VEGF. 112 Il existe deux formes de ces
récepteurs NRP–1 et NRP–2 qui ne sont pas exprimés de la même manière. NRP–1 est
majoritairement localisé dans les cellules endothéliales artérielles alors que NRP–2 est
exprimé dans l’endothélium lymphatique et veineux. NRP–1 est fortement surexprimée
dans les lignées cancéreuses et joue un rôle dans la prolifération tumorale. 113
46
III.2.2.2.iii. Le récepteur NRP–1
STRUCTURE ET FONCTION DE NRP–1

Il a été identifié que le récepteur NRP–1 interagissait avec le récepteur VEGFR–2.
Cette interaction est responsable d’une augmentation de la signalisation associée à la voie
du VEGFR–2 et favorise l’angiogenèse.114,115
Le récepteur NRP–1 est un récepteur non–tyrosine kinase existant sous plusieurs

isoformes avec une structure basique composée de plusieurs domaines (Figure 21)116 :
- Un domaine extracellulaire N–terminal, lui–même constitué de 5 domaines : a1, a2,

b1, b2 et c ou domaine MAM. Les quatre premiers domaines permettent la liaison
de ligands tels que les sémaphorines et les VEGFs alors que le dernier est impliqué
dans l’homo– ou l’hétéro–dimérisation de récepteurs ;
- Un domaine transmembranaire ;
- Un court domaine cytoplasmique impliqué dans la dimérisation de récepteurs et
possédant un motif de liaison PDZ (SEA).
Après la fixation d’un ligand au récepteur NRP–1, celui forme un hétéro–dimère avec
le récepteur spécifique du ligand (récepteur primaire). Plusieurs ligands sont connus pour
se lier à NRP–1, notamment ceux appartenant aux familles des sémaphorines et des
VEGF. Les sémaphorines sont des protéines jouant un rôle dans le développement
neuronal. Il existe sept classes de sémaphorines dont la classe 3 se lie préférentiellement
à NRP–1. Les récepteurs spécifiques sont les plexines. La signalisation associée à la
fixation de sémaphorines sur NRP–1 aurait des propriétés antitumorales.114
47
Figure 21 : Structure du récepteur NRP–1. Adaptée de Dumond et al.116
En ce qui concerne les VEGFs, parmi les six membres de cette famille, seulement trois
se lient à NRP–1 (VEGF–A, VEGF–B et VEGF–C). Le VEGF–A représente la classe la
plus étudiée avec des propriétés proangiogéniques établies, en faisant une cible d’intérêt
dans le ciblage tumoral.114 Dans cette thèse, nous nous intéresserons essentiellement à ce
ligand.
ROLE DE NRP–1 DANS LE DEVELOPPEMENT DE TUMEURS

Les premières études sur ce récepteur ont établi que la signalisation intracellulaire
associée à NRP–1 ne pouvait être induite par le récepteur seul mais que la formation de
complexes avec un co–récepteur était nécessaire.
NRP–1 joue un rôle dans la médiation de la signalisation du VEGF–A par le biais de

complexes avec un co–récepteur qui peuvent être formés avec VEGFR–1 ou VEGFR–2. La
plupart des études concernent son association avec ce second récepteur et sa liaison avec
un isoforme du VEGF–A en particulier, le VEGF–165. Ce dernier peut se lier à la fois au
récepteur NRP–1 et au récepteur VEGFR–2 formant un ainsi un complexe ternaire.
L’association avec NRP–1 a pour effet d’augmenter la liaison du VEGF–165 au récepteur
VEGFR–2 et ainsi renforcer la signalisation associée à ce récepteur et son activité
proangiogénique.114
D’autres études ont également montré que NRP–1 pouvait également induire une
signalisation cellulaire, après liaison du VEGF, en l’absence de co–récepteurs (VEGFR–1
48
et VEGFR–2). De plus, l’expression de ce récepteur a été observé dans de nombreux types

de cellules tumorales (sein, pancréas, neuroblastome) en l’absence de ces mêmes co–
récepteurs.
C IBLAGE DE NRP–1
NRP–1 est fortement exprimé sur les cellules musculaires lisses vasculaires et sur les
cellules endothéliales. Il est également exprimé sur de nombreux types de cellules
cancéreuses et son expression corrèle généralement avec une hausse de la progression
tumorale.
L’expression de ce récepteur dans les cellules tumorales, son implication dans

l’angiogenèse et la progression tumorale en font un récepteur cible d’intérêt pour une
thérapie ciblée.
III.3. Nécessité en oxygène
III.3.1. Stratégies pour combattre l’hypoxie
Un autre inconvénient majeur de la PDT est le besoin d’oxygène pour être efficace. En
effet, un niveau minimum d’oxygène est requis dans le milieu pour que l’effet
photodynamique puisse se produire. De plus, l’oxygénation au sein des tumeurs n’est pas
uniforme et des zones hypoxiques sont souvent rencontrées. L’hypoxie peut également se
manifester au cours du traitement, la PDT consommant de l’oxygène. Dans la Figure 22,
la désoxygénation des tissus après illumination est clairement observée.
Figure 22 : Oxygénation des tissus au cours d'un traitement PDT utilisant l'ALA sur le colon de rat. Figure extraite de
Curnow et al.117
49
Récemment, nous avons reporté dans une revue, située à la fin de ce chapitre § V.,
intitulée « Fighting hypoxia to improve PDT » et publiée dans le journal Pharmaceuticals,
les différentes stratégies, mises en œuvre dans la littérature pour contourner ce
problème.118 Six grandes stratégies ont été identifiées :
1) L’utilisation de véhicules d’oxygène afin d’augmenter l’apport en oxygène

directement dans le milieu, par exemple en utilisant des perfluorocarbones ;
2) La modification du microenvironnement tumoral en utilisant les particularités de
celui–ci, par exemple par décomposition de H2O2, présent fortement dans les
tumeurs, pour générer de l’oxygène ;
3) Le recours à des thérapies combinées pour amplifier l’effet de la PDT en la
combinant notamment à la chimiothérapie ou la thérapie photothermique ;
4) La PDT fractionnée, c’est–à–dire qu’au lieu d’illuminer la zone à traiter en une
seule fois, cette dernière est illuminée plusieurs fois successivement afin de
permettre la réoxygénation des tissus ;
5) L’utilisation de l’hypoxie des tumeurs en ayant recours à des composés
spécifiquement activés par l’environnement hypoxique, par exemple des
azobenzènes réduits spécifiquement en zone hypoxique ;
6) Une PDT indépendante de l’oxygène en utilisant des composés qui ne nécessitent
pas d’oxygène pour avoir un effet toxique sur les cellules cancéreuses, par exemple
en utilisant des donneurs d’1O2 tels que les endoperoxydes ou, dans le cadre de cette
thèse, des composés photoactivables.
III.3.2. Utilisation d’alcoxyamines photoactivables en PDT
Depuis de nombreuses années, les alcoxyamines ont été largement étudiées et c’est
leur application en polymérisation radicalaire contrôlée plus précisément la
polymérisation contrôlée par des nitroxydes qui a fait grandir l’intérêt pour ce type de
composés.119,120 Ce sont des composés très stables à température ambiante, capables de
libérer d’une part un nitroxyde stable et d’autre part un radical alkyle hautement réactif
par homolyse thermique de la liaison C–ON (Figure 23). La dissociation de cette liaison
est, de plus, réversible. En effet, cette dernière liaison présente une faible énergie de
dissociation de liaison (BDE) favorisant son homolyse.121,122 La réaction de combinaison
entre les deux espèces radicalaires libérées est aussi possible, la réaction est réversible
sans présence de pièges radicalaires.
50
Figure 23 : Structure générale des alcoxyamines et leur homolyse.
Leur utilisation la plus connue est comme amorceurs de radicaux et contrôleurs pour
la polymérisation médiée par des nitroxydes. Cette dernière repose sur l’utilisation de
l’homolyse réversible de la liaison C–ON des alcoxyamines induite par l’augmentation de
la température pour la préparation de polymères avec des structures bien définies.123
Récemment, Audran et al.124 ont proposé le concept de l’utilisation d’alcoxyamines

pour des applications théranostiques. Pour cela, les alcoxyamines utilisées doivent être
suffisamment stables pour être stockées et engendrer une homolyse de la liaison C–ON
suffisamment rapide dans les conditions du milieu (température physiologique). Ils ont
alors établi que la BDE idéale se trouvait entre 100 et 140 kJ.mol–1. Pour une application
théranostique, les radicaux nitroxydes générés sont utilisés pour le diagnostic par OMRI
(Overhauser–enhanced Magnetic Resonance Imaging ) alors que les radicaux alkyles sont
utilisés en thérapie par induction d’un stress oxydant dans les cellules cancéreuses.
L’homolyse des alcoxyamines peut être déclenchée par différents procédés : physique
(température ou lumière), chimique (oxydation) ou biologique (protéases) et entraînant la
libération de l’alcoxyamine dans le milieu suivi de son homolyse induite par la
température physiologique.
La même équipe a montré l’efficacité de ce type de composé pour induire la mort

cellulaire in vitro sur une lignée cellulaire du glioblastome par induction d’un stress
oxydant dû à la libération in situ de radicaux alkyles.125
L’utilisation d’alcoxyamines homolysables non pas par la température mais par la

lumière fut reportée pour la première fois par Scaiano et al. en 1997, en tant qu’agent pour
la photopolymérisation contrôlée par des nitroxydes.126 Les alcoxyamines photoactivables
n’ont jamais été utilisées dans le cas de traitement de cancers.
L’utilisation de ce type de composé en PDT s’avère prometteuse puisqu’ils permettent

de générer des radicaux hautement réactifs et toxiques pour les cellules cancéreuses. De
plus, leur génération ne nécessite pas la présence d’oxygène.
51
IV. Objectifs de la thèse

Dans la partie précédente III., nous avons décrit plusieurs limites de la PDT. Le but
de cette thèse est de développer de nouvelles plateformes innovantes de ciblage qui
puissent produire des ROS en milieux hypoxique ou normoxique pour améliorer le
traitement du cancer, en particulier du glioblastome, par PDT.
Pour atteindre ces objectifs, nous avons choisi de combiner plusieurs entités (Figure
24) :
- Un peptide d’adressage présentant une forte affinité pour le récepteur NRP–1 ;

- Une alcoxyamine photolabile utilisée comme composé indépendant de l’oxygène
pour produire des radicaux alkyles ;
- Un PS comme composé dépendant de l’oxygène pour générer de l’ 1O2.
Figure 24 : Objectifs de la thèse.
Le choix des différentes unités a été fait en prenant tout d’abord en considération la
longueur d’onde utilisée pour exciter le PS et l’alcoxyamine. Pour cela, deux approches ont
été envisagées :
- L’excitation des deux unités à deux longueurs d'onde différentes (double

excitation) ;
- L’excitation à la même longueur d'onde (excitation unique).
L’utilisation d’alcoxyamines photoactivables combinées à un PS et un peptide pour une

application PDT n’ayant jamais été décrite, la première étape de cette thèse a été d’établir
une preuve de concept. Celle–ci a consisté à prouver que le couplage de ces trois unités
était possible et que chacune des unités n’avait pas d’interférence sur les propriétés des
deux autres. Pour cela, les plateformes ont été synthétisées et les propriétés
photophysiques du PS ont été vérifiées, ainsi que la photolabilité de l’alcoxyamine et
52
l’affinité du peptide pour le récepteur NRP–1. Cette preuve de concept a reposé sur
l’utilisation d’une alcoxyamine et d’un PS excitable à deux longueurs d’ondes différentes.
La synthèse de l’alcoxyamine photoactivable a été faite par nos collaborateurs, l’équipe du
Pr Gérard Audran et du Pr Sylvain Marque de l’Institut de Chimie Radicalaire à Marseille.
Cette alcoxyamine était excitable par lumière UV, ce qui ne rend pas possible la réalisation
de tests PDT in vitro.
La seconde partie de cette thèse a donc été consacrée en l’amélioration de cette

plateforme. Nous nous sommes focalisés sur trois pistes : 1) le développement d’un
nouveau peptide ciblant toujours NRP–1 et pouvant être internalisé dans les cellules
cancéreuses après fixation sur le récepteur, 2) l’amélioration de leur solubilité par
l’utilisation de cyclodextrines et 3) le design d’une nouvelle alcoxyamine absorbant à de
plus hautes longueurs d’onde compatibles avec une application in vitro voire in vivo.
53
V. Revue
Review
Fighting Hypoxia to Improve PDT

Ludivine Larue 1, Bauyrzhan Myrzakhmetov 2, Amina Ben-Mihoub 3, Albert Moussaron 1, Noémie
Thomas 4, Philippe Arnoux 1, Francis Baros 1, Régis Vanderesse 3, Samir Acherar 3 and Céline
Frochot 1,*
1 Laboratoire Réactions et Génie des Procédés (LRGP), UMR 7274, CNRS, Université de Lorraine, Nancy 54000,
France; [email protected]
2 M.Kh. Dulaty Taraz State University, Taraz 080012, Kazakhstan
3 Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire (LCPM), UMR 7375, CNRS, Université de Lorraine, Nancy
54000, France
4 Biologie, Signaux et Systèmes en Cancérologie et Neurosciences, CRAN, UMR 7039, Université de Lorraine,
CNRS, Nancy 54000, France

* Correspondence: [email protected]; Tel.: +33-3-72-74-37-80
Received: 24 October 2019; Accepted: 26 October 2019; Published: date
Abstract: Photodynamic therapy (PDT) has drawn great interest in recent years mainly due to its low
side effects and few drug resistances. Nevertheless, one of the issues of PDT is the need for oxygen to
induce a photodynamic effect. Tumours often have low oxygen concentrations, related to the abnormal
structure of the microvessels leading to an ineffective blood distribution. Moreover, PDT consumes
O2. In order to improve the oxygenation of tumour or decrease hypoxia, different strategies are
developed and are described in this review: 1) The use of O2 vehicle; 2) the modification of the tumour
microenvironment (TME); 3) combining other therapies with PDT; 4) hypoxia-independent PDT; 5)
hypoxia-dependent PDT and 6) fractional PDT.
Keywords: PDT; oxygen; hypoxia.
1. Introduction
In the case of cancer, tissue hypoxia is a key feature of virtually all solid tumours [1]. The hypoxic
adaptation, which is recognized as a source of therapeutic failure in clinical oncology [2] is critical for
tumour expansion, invasion and metastasis, and some studies aim to target hypoxia for enhanced cancer
therapy [3,4]. In vivo, reduced oxygenation induces a lack of nutrients and growth factors, increased
acidosis and production of products coming from the close necrotic area. This leads to alteration of cells
and cell-matrix interaction and even sometimes to cell death. Nevertheless, some tumor cells survive
and these “hypoxic” cells become very aggressive and induce a local tumor relapse [5]. It is necessary
for a treatment to be efficient to detect and control oxygenation in the tissue. Photodynamic therapy
(PDT) has been applied to cure many diseases such as AMD, psoriasis, Barrett’s esophagus, and various
malignant cancers for over a decade [6]. PDT is a simple and efficient approach relying on irradiation
to move a photosensitizer (PS) from the ground state to a singlet excited state and then to a triplet excited
state. This excited PS can react with the surrounding medium to produce Reactive Oxygen Species
(ROS) such as superoxide anion (O2-•) and hydroxyl radical (HO•) or transfer its energy to triplet oxygen
to generate singlet oxygen (1O2). Success of PDT requires that the PS incorporate preferentially into the
tumor cell, that the number of photons be correctly evaluated in order to excite a majority of the PS
molecules, and that there be enough O2 to induce the photo-oxidation process [7]. Indeed, PDT, like
54
radiotherapy, suffers from a severe drawback: the need for O2 to be efficient. Therefore, PDT displays a
low efficiency in hypoxia or when hypoxia occurs due to the consumption of molecular O 2 by the PS,
leading to PDT resistance. When the oxygen concentration in the medium is not high enough, the
photodamage is reduced or even no photodynamic reaction occurs at all [8]. These spare hypoxic cells
can induce the regrowth of the tumor. Hypoxia occurring during PDT has been studied by several teams
last years [9–11]. Bush et al. for example used in 2000 oxygen-sensitive electrodes during PDT treatment
in vivo [10]. The same team also showed that the spatial distribution of hypoxia during PDT treatment
can influence the balance between destruction of the tumor and damage of the neovessels [12]. Several
approaches have been described during the last decades to overcome hypoxia in PDT. In this review,
we chose to divide them onto six strategies developed in the literature to fight hypoxia for an
enhancement of PDT: 1) The use of O2 vehicles; 2) the modification of the tumour microenvironment
(TME); 3) combining other therapies with PDT; 4) hypoxia-independent PDT, 5) hypoxia-dependent
PDT and 6) fractional PDT.
2. O2 vehicles
Various clinical applications (i.e. radio-, chemo- and phototherapies) involve the presence of O2 in
the neighbourhood of the tumours to be treated, but hypoxia can lead to a poor treatment efficiency
with enhanced malignant cell survival, increased angiogenesis and metastasis. The supply of O 2 is
therefore a major asset and a new modality for many disease interventions [13,14]. In fact, the increase
of the arterial and capillary O2 pressure (pO2) improves the transport of dissolved O2 into the tissue.
2.1. Hyper-oxygenation/Hyperbaric Oxygenation (HBO)

Hyperoxic vasodilatation in healthy tissue makes way to vasoconstriction in hypoxic tissues, so one
idea is to perform hyper-oxygenation during PDT of pre-existing hypoxic cells and to compensate the
O2 depletion. This so-called hyperbaric oxygenation (HBO) can be realized in several ways, which will
be developed in this section. One way is to provide additional O 2 in the areas to be treated by the
addition of 1O2 itself, H2O2, or other molecules. Another way is to favour the formation of ROS at the
expense of 1O2 by switching the photochemistry of PSs from a type II to a type I mechanism [15,16].
Some other interesting reviews on this topic can help in understanding the history, the notion of hypoxia
and the broad scope of HBO [17–19].
Hjelde et al. in 2005 [20] compared the in vitro PDT efficiency under normoxic or hyperoxic exposure
on AY27 tumour cells, human colon adenocarcinoma WiDr and SW840 cells. The cultured cancer cells
were incubated with 5-ALA and irradiated (435 nm, 0.5 and 30 min, 12.9 mW∙cm−2), which matched a
total light dose of 0.387 and 23.22 J∙cm−2 respectively. After PDT treatment under normoxia (21 kPa O2)
and hyperoxia (100, 200, 300, or 400 kPa), the cells’ survival was evaluated and surprisingly, showed no
significant difference between normoxia and HBO. However, the three cell lines exhibited very different
sensitivities to PDT in normoxic conditions: At 21 kPa, and within 5 min illumination, about 90% of
WiDr and SW840 cells were killed, while only 20–25% of AY27 cells were destroyed and an illumination
for up to 30 min was necessary to attain a similar result.
Mei et al. in 2019 [21] used 5-ALA with or without HBO for PDT treatment of human squamous
carcinoma (A431 cell line) in vitro. For HBO assays, the cells were flushed by a mixture 98% O 2 plus 2%
CO2 (0.25 MPa) for 1 h daily before addition of 5-ALA. Both treatments, after irradiation (530 nm, 5
J∙cm−2, 8 days) indicated: a) a decrease of cell proliferation as a function of a concentration gradient (0,
0.1, 0.3, 1, and 3 mM ALA), b) a synergistic effect of the combination ALA-HBO, especially at 1 and 3
mM ALA with 30–35% cell viability. Western blot analysis allowed the detection of apoptosis-related
protein Bax, Bcl-2 and caspase 3. The data suggested synergistically increased levels of the proteins Bax
and caspase, but a decrease for Bcl-2 in A431 cells, evidencing a mitochondria-intrinsic pathway cell
apoptosis. Furthermore, it has been shown that the dual ALA-HBO treatment reduced ROS production
in A431 cells and favoured autophagy. It can be considered that ALA-HBO could be used i for the
treatment of human squamous carcinomas.
55
Chen et al. [22,23] used hyper-oxygenation in vivo in mammary carcinoma tumours implanted into
C3H mice (6-8 mm). Tumours were treated by Photofrin and illuminated at 630 nm (200 J∙cm−2, 150
mW∙cm−2). Hyperbaric conditions were attained when the mice were under a 3-atmosphere pressure.
Under normal conditions (1 atm and normoxia) about 20% of the tumour disappeared after 60 days. In
normobaric conditions (NBO, 100% O2), this percentage increase to 80 %. In hyperbaric conditions
(HBO, 100% O2), it was only 60 %. Reduction of light fluence to 75 mW∙cm−2 combined with NBO
treatment led to a 70% tumour cure. The relative negative effect of HBO wasperhaps due to a reduced
cardiac outcome. The same team used also an atmospheric composition of 95% O2 and 5% carbon
dioxide (carbogen) [24]. They did not observe any effects after decreasing the fluence. In all cases (HBO,
NBO or carbogen) the rate of cellular death was doubled, compared to normal atmospheric conditions.
In 2003, they [25] used the same protocol as previously, but measured the O2 concentration in tumour
in vivo with the Oxylite system. First, only room air (RA) and NBO conditions were used. Table 1 shows
the important effect of NBO on the survival rate of tumours after different times (as a tumour fraction).
Table 1. % Mammary carcinoma tumour implanted into C3H mice after PDT treatment (630 nm, total light
irradiation of 150 mW∙cm−2).
0h 4h 18 h 24 h
RA 0.495 0.381 0.043 0.0045
NBO 0.185 0.120 0.006 0.00035
Similar results as previously were obtained using carbogen and HBO conditions. Li et al. [26] used
also hyperbaric conditions with upconversion nanoparticles (UCNPs). They synthesized a core@shell
NPs NaGdF4:Yb,Er,Ca@NaYbF4:Ca, with an upconversion core which can transfer its energy to Rose
Bengal, and produce ROS under 808 nm laser excitation (Figure 1). It was demonstrated that PDT
assisted by HBO led to strong depletion of collagen fibre in the extracellular matrix, with a reduction of
hypoxia and a simultaneous enhancement of NP levels in the tumour blood vessels.
Figure 1. Schematic illustration for the synthesis of NaGdF4:Yb,Er,Ca@NaYbF4:Ca@NaNdF4:Gd,Ca @mSiO2 NPs.

Reprinted from [26] with permission from the American Chemical Society, Copyright 2018.
In vivo experiments were performed on xenograft 4T1 cells (murine breast tumour cell line) tumour-
transplanted mice mouse model. Fluorescence in tumour was observed 6 h after NP administration, up
to 48 h and disappeared progressively from the tumour. Consequently, a second treatment (16 min of
irradiation with an 808 nm laser, 0.75 W∙cm−2) was administered 48 h after the first one. In vitro, 4T1 cell
viability was measured to about 75% under hypoxia, about 35% in normoxia and 20% in HBO
conditions. In vivo, the tumour weight, initially 0.5 g, decreased to about 0.1 g with UCNP in HBO
conditions.
Maier et al. [27] conducted a clinical pilot study to treat patients with advanced oesophageal
carcinoma in 2000. They used HpD and illumination (630 nm, 300 J∙cm−2), 14 patients were treated by
PDT and 17 with PDT under HBO (2 absolute atm pressures). A difference was observed between the
two groups, with a median overall survival for the PDT group of 7.0 months (12-months survival rate
was 28.6%) and 12 months for the PDT/HBO group (the 12-months survival rate was 41.2% for the
PDT/HBO group). The same team published in 2000 another study for the treatment of advanced
carcinoma of the cardia and oesophagus [28]. In the same conditions (vide supra), 23 patients were
treated by PDT and 29 with PDT/HBO. The mean survival time for the PDT group was 8.7 months and
56
for the PDT/HBO group 13.8 months. This experience was re-conducted the same year on 31 patients
for PDT alone and 44 patients for PDT/HBO for the treatment of tumour at the oesophago-gastric
junction [29]. A median overall survival of 7 and 12 months was observed, respectively. In order to
avoid the prolonged photosensitivity of the skin of HpD, the authors evaluated the efficacy of Photosan ®
and ALA on patients with oesophageal cancer [30,31]. As expected, polyhematoporphyrin seemed to
be more effective than ALA in terms of reduction of dysphagia, tumour stenosis and Karnovsky
performance status. A questionnaire of the patients indicated a best comfort for oral administration of
ALA than intravenous injection of Photosan ® and no complication or sunburn occurred for either
treatment. Such a comparison has been made on lung cancer and more particularly in the treatment of
advanced malignant bronchogenic stenosis [32,33] and no definitive conclusions have been drawn. At
the best of our knowledge, no further investigations in the field of HBO have been undertaken by this
team.
In 2001, Schouwink et al. [34] conducted preclinical studies for optimization of PDT by m-THPC in
female BALB/c mice bearing human mesothelioma (H-MESO1) tumour. To overcome the PDT-induced
O2 deficit, they proposed a preliminary treatment by nicotinamide (300 mg∙kg −1) and/or carbogen (i.e. a
mixture 5% CO2 and 95% O2) 30 min and/or 5 min before illumination, respectively. In a first series, they
studied the influence of nicotinamide injection and/or carbogen breathing on the mean time of regrowth
of tumour from 2 to 5 mm diameter. The mean time was found to be about 42 days in hypoxic conditions
and 17 days in hyperbaric conditions. They analysed also the mean median pO 2 and they observed no
significant increase of oxygenation with nicotinamide alone (17.6 mm Hg to be compared to a control
value of 12.6 mm Hg), but a pO2 of 24.8 mm Hg for nicotinamide plus carbogen. The efficiency of PDT
by m-THPC (0.15 mg∙kg−1, 100 mW∙cm−2) was then discussed and mice survival (after 24 h post PS-
injection and illumination) reached 11% for PDT alone and 58% for PDT and carbogen, the nicotinamide
bringing almost no improvement.
(Table 2)
Table 2. Summary of publications about HBO as O2 vehicle.
Ref Application O2 source PS Energy of Type of In vitro In vivo

excitation ROS
[20] PDT Hyperbaric 5-ALA 435 nm, 12.9 1O2 AY27, No
chamber with mW∙cm−2, 0.5 WiDr
100% O2 min and 30 and
(21, 100, 200, min SW840
300, or 400 cell line
kPa)
[21] PDT HBO (0.25 5-ALA 630 nm, 5 ROS A431 No
MPa; 98% O2 + J∙cm−2, 8 h per cancer
2% CO2) days cell line
[22–25] PDT HBO or NBO Photofrin 630 nm, 1 O2 No MCa tumour-
100% O2 “Fractional bearing mice
(hyperbaric light“ group:
chamber: 3 atp) 150 mW∙cm−2,
200 J∙cm−2, 30 s
light and dark
intervals
“Reduced
light dose
rate” group:
75 mW∙cm−2,
200 J∙cm−2
57
Table 2. Cont.
[26] PDT HBO RB 808 nm ROS 4T1 cell 4T1 tumour

(hyperbaric 16 min, 0.75 line bearing mice
chamber: 2.5 W∙cm−2
atm)
[27–33] PDT HBO HpD 630 nm, 300 nd No Clinical study on
(hyperbaric (Photosan) J∙cm−2 patients with
chamber: 2 atm or 5-ALA oesophageal
O2) carcinoma
[34] PDT Nicotinamide m-THPC 652 nm, 20, nd No H-MESO1
and carbogen 100 and 200 tumour-bearing
(95% mW∙cm−2, 5 mice
oxygen with min
5%
carbodioxide)
nd: not determined; HBO: hyperbaric oxygen; 5-ALA: 5-aminolevulinic acid; RB: Rose Bengal; HpD:
haematoporphyrin derivatives; m-THPC: meta-tetra(hydroxyphenyl)chlorin.
2.2. Red Blood Cells (RBC) or Hemoglobin (Hb)

A new optical method based on in vivo laser-induced photodissociation of blood oxyhemoglobin
have been proposed by Asimov et al. [35] to solve the hypoxia problem in malignant tissue and to
stimulate the aerobic metabolism of cells. The kinetics of laser-induced oxygenation of cutaneous tissue
dependence on the laser-irradiation time was investigated. It was found that upon He-Ne laser
irradiation (632 nm, 225 W∙m−2) of the cutaneous blood vessels, a local increase in the O2 concentration
in the irradiated region was observed. Based on the obtained results, the proposed optical method for
local hypoxia elimination in malignant tissues may be a good key to increase the efficiency of the
different therapeutic procedure in oncology.
Luo et al. [36] developed stable nanosize artificial red cells denoted as I-ARCs by loading complexes
of indocyanine green (ICG) and O2 carrier (hemoglobin, Hb) to incorporate an O2 supply and monitor
the PDT process. The in vitro studies of I-ARCs compared to deoxy-I-ARCs and ICG NPs (INPs) were
performed on MCF-7 human breast cancer cell line under NIR laser irradiation (100 mW∙cm−2, 808 nm,
5 min). I-ARCs showed massive generation of ROS (9.5 times stronger than INPs) and 10.7-times higher
formation of ferryl-Hb than deoxy-I-ARCs. I-ARCs presented the best phototoxic effects against MCF-
7, with a cell viability of 8.9%. The authors explained the remarkable phototoxicity in I-ARCs by the
enhanced both ROS production and ferryl-Hb generation. Similarly, the result of PDT-treated mice
bearing MCF-7 tumours obtained with I-ARCs was the best compared to the other systems (Figure 2).
Figure 2. MCF-7 tumour growth curves of different groups after treatments. *P < 0.05, **P < 0.01. All injectants
were oxygenated before experiments. Adapted from Luo et al. [36].
58
Two years later, the same team [37] designed a protein hybridization approach by developing a
bioinspired hybrid protein O2 nanocarrier with encapsulated chlorin e6 (Ce6) (C@HPOC) via
intermolecular disulfide conjugations for O2-augmented immunogenic PDT against tumour growth and
metastasis. In vitro 1O2 production ability of C@HPOC was investigated in 4T1 tumour cells and
compared to that of Ce6 and C@HSA. It was found that under laser irradiation (600 nm, 0.1 W∙cm −2, 2
min) C@HPOC significantly enhanced the 1O2 levels compared to the other systems. The PDT treatment
revealed that at 1 µg∙mL−1 of Ce6, C@HPOC showed the highest PDT effect (80% apoptosis ratio of 4T1
cells) compared to Ce6 and C@HSA under the same conditions, indicating that C@HPOC boosted the
PDT effect to kill tumour cells. In addition, according to the in vivo results, O2-boosted PDT of C@HPOC
provoked immunogenic cell death with enhanced release of danger-associated molecular patterns from
4T1 tumour cells and then promoted the maturation of dendritic cells. Finally, the well-defined
C@HPOC evoked O2-enhanced immunogenic PDT, which not only destroyed the primary tumours but
also effectively suppressed distant tumours and lung metastasis in metastatic triple-negative breast
cancer model by evoking systemic anti-tumour immunity.
Tang et al. [38] developed a novel red blood cells (RBC)-facilitated PDT methodology. They first
loaded the phthalocyanine ZnF16-Pc into ferritin NPs and then coupled the ZnF16-Pc-loaded ferritins (P-
FRT) onto RBC membranes to afford P-FRT-RBC-NPs. According to the in vitro and hypoxic tumour
models, using RBCs as ZnF16-Pc carriers could enhance the PDT efficiency. It was shown that RBCs
could provide O2 to enable sustained 1O2 production even when P-FRT-RBC NPs were under hypoxic
conditions (Figure 3).
Figure 3. P-FRT-RBCs showed enhanced PDT effect under hypoxic environments. Comparison of 1O2 generation
among P-FRT-RBCs, a mixture of RBCs and free P-FRTs, and free P-FRTs, conducted in an Ar-filled cuvette. The
cuvette was irradiated by a 671 nm laser (0.1 W∙cm −2) for up to 60 min. SOSG was used as an indicator of 1O2
production. Adapted from Tang et al. [38].
P-FRT-RBCs were injected onto U87MG human glioma tumour bearing mice (671 nm, 100 mW∙cm−2,
30 min). Significant improvement in the PDT efficiency was observed with P-FRT-RBC or O2-treated P-
FRT-RBC groups compared to that of the P-RBC and CO-treated P-FRT-RBC groups (76.7% of tumour
suppression). Such results validated the contribution of O2 released from RBCs in the enhanced
treatment.
Wang et al. [39] reported a novel strategy for overcoming biological barriers and site specific hypoxia
cancer therapy under NIR control. The latter consisted of preparing orthogonal excitation-emission
UCNPs functionalized with a novel ultrasensitive specific hypoxia probe (HP) and RB, conjugated to
the surface of RBC to finally obtain RBC microcarriers. According to the in vitro PDT results under
hypoxic conditions, the inactive HP present in RBC microcarriers could be transformed into an active
state specifically to trigger the O2 release from oxygenated Hb under 980 nm excitation. PDT efficiency
enhanced greatly under 808 nm excitation because of the increasing of O2 amount from RBC
microcarriers. Consequently, the highest cell mortality (60%) was achieved with RBC microcarriers after
59
alternately irradiating by 980 nm and 808 nm laser, indicating a highest PDT efficacy which was due to
the large amount of released O2. PDT for hypoxia tumours studies was investigated onto U87MG solid
tumour-bearing mice. Much higher anti-tumour efficacy by remarkably regressing the solid tumour
volumes was observed with RBC microcarriers in the presence of the alternate 980 nm and 808 nm laser
irradiation, compared to that with Si microcarriers and RBC alone (Figures 4a and b).
Figure 4. PDT for hypoxia tumours. a) Digital photos of U87MG tumour-bearing mice after 14 days of
O2 release and PDT treatments under NIR irradiation. From up to down mice were treated with RBC
microcarriers + 980-nm +808-nm laser; Si microcarriers + 980-nm +808-nm laser; RBC + 980-nm +808-nm
laser. b) Tumour growth profiles of the mice bearing U87MG tumour with different treatments.
Reprinted from [39] with permission from Elsevier, Ltd, Copyright 2017.
Cao et al. [40] designed a multi-functional nanocomplexe (BP@RB-Hb) by simple molecular assembly
of bis(pyrene) (BP), RB, Hb and nanoliposomes (Figure 5) to improve both the depth and the
effectiveness of antitumour PDT treatment. In brief, upon two-photon laser irradiation, RB was excited
indirectly through intra-particle FRET mechanism for improving treatment depth. At meantime, Hb
could supply extra O2 into tumour through targeting effect for enhanced PDT efficiency.
Figure 5. The BP@RB-Hb structure and the process of one-/two photon. Reprinted from [40] with permission from
John Wiley and Sons, Copyright 2018.
In vitro studies were performed on MCF-7 cells lines at different concentrations of deoxy-BP@RB-
Hb or BP@RB-Hb (0-1.25 mg∙mL−1). Upon mono-photon laser irradiation (150 W, 480 nm cutoff filter),
BP@RB-Hb showed the best photocytotoxicity, which was explained by more ROS production by
BP@RB-Hb via intra-particle FRET between RB and BP species.
60
Figure 6. Tumour volume under hyperoxia and hypoxia. Adapted from Cao et al. [40]
Finally, in vivo photodynamic studies were also done in a mouse cancer model (BALB/c nude mice).
BP@RB-Hb or BP@RB was injected to the mouse followed by two-photon laser (800 nm, 390 mW∙cm−2, 8
min). A significant anti-tumour effect was observed in the case of group injected with BP@RB-Hb.
Furthermore, in vivo BP@RB-Hb showed a higher anti-tumour efficiency to the hyperoxic tumour than
the hypoxic tumour after two-photon laser irradiation (Figure 6).
Guo et al. [41] designed an O2-delivering photosensitive liposome (LIH) by loading complexes of Hb
and ICG. LIH showed out-standing ability as an O2 carrier and could generate massive 1O2 under NIR
laser irradiation (808 nm, 1 W∙cm−2, 1 min), even in hypoxia conditions. In vitro O2 carrying was
investigated on CT-26 cancer colon cells. It was found LIH could not only get inside CT-26 cells and
deliver O2 into cells in hypoxia conditions, but also down-regulated hypoxia-associated protein to cells.
Thus, the sufficient 1O2 produced by LIH under NIR laser treatment (808 nm, 1 W∙cm−2, 1 min) enhanced
dramatically the PDT phototoxicity in hypoxic CT-26 cells. According to the in vivo studies on mice
bearing tumours, LIH accumulated preferentially into subcutaneous and orthotopic CT-26 tumours. In
addition, the vascular endothelial growth factor (VEGF) and Hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)
expression level in LIH treated tumours was also down-regulated and this state was maintained for
several days. Consequently, under NIR laser irradiation (808 nm, 1.5 W∙cm −2, 3 min) dramatically
enhanced PDT efficacy against hypoxic tumour in vivo was observed.
Liu and his team [42] synthesized Hb-conjugated biodegradable polypeptides as O2 carrier via click
reaction between polypeptides and Hb BODIPY-Br2 NPs denoted (p-Hb-B-NPs). The O2-carrying ability
of the prepared NPs was confirmed by comparing the dissolved O2 concentration of p-Hb-B-NPs to that
of O2 saturated ultrapure water. PDT efficiency of the NPs was investigated on hepatocellular carcinoma
HepG2 cancer cells (620 nm, 25 mW∙cm−2, 10 min) under normal or N2 atmosphere and compared to
that of p-B-NPs. Even under low light irradiation both NPs showed phototoxic effect under normal
atmosphere, where the best effect was obtained at a 4 µM p-Hb-B-NPs concentration, however a non-
phototoxic effect was observed under N2 atmosphere. Furthermore, p-Hb-B-NPs found to be able to
release O2 even in hypoxic conditions.
Xu et al. [43] prepared a new biocompatible and stable nanocarrier (HbTcMs) with O 2 supply for
enhanced PDT. A well-defined triblock copolymer mPEG-b-PAA-b-PS copolymer could self- assemble
in aqueous solution to form micelles. The micelles and the PS (carboxyphenyl-porphyrin, TCPP) both
covalently conjugated to Hb via amidation reactions formed a nanocarrier (HbTcMs). According to the
O2 binding ability results, HbTcMs was found to be able not only to retain the O 2 binding capacity as
Hb did, but also showed better stability against both oxidation and trypsin digestion. HbTcMs conjugate
showed little dark toxicity and rapid efficiency of cellular uptake by 4T1 cells. More importantly, under
light irradiation (600 nm, 70 mW∙cm−2, 2 min), HbTcMs could generate more 1O2 to exert better
phototoxicity in vitro compared to the carriers without O2 supply.
Liu et al. [44] designed man-made red blood cells (RBCs). A complex between Hb and polydopamine
(PDA, an enzyme-mimicking) was constructed and methylene blue (MB) was encapsulated inside the
61
biovesicle (Hb-PDA-MB, 500 nm in transverse length and 2000 nm in longitudinal length). To evaluate
the influence of Hb, other complexes were synthesized in which Hb was substituted with albumin
bovine serum (BSA) (called BSA-PDA@RBCM and BSA-PDA-MB@RBCM, respectively). Hb was
unchanged in the vesicle and the capability of Hb to carry O2 was the same for free Hb and Hb into the
vesicle. 1O2 formation was higher for MB inside the vesicle than in solution due to the extra O2 supply.
In 4T1 cell line upon light illumination (660 nm, 30 mW∙cm−2, 1 min) DCFH-DA revealed the formation
of 1O2. In hypoxic media, the vesicles were still able to produce 1O2, whereas almost no more 1O2 was
produced by MB alone. The phototoxicity of Hb-PDA-MB decreased by 10% in hypoxic media
compared to normoxic one whereas a decrease of 50% was obtained with free MB (660 nm, 220 mW∙cm −2,
5 min). In vivo in 4T1 tumour bearing mice, they used the same vesicle labelling with both Ce6 and DiR
(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindotricarbocyanine) and could observe that the tumour stopped
growing. Some tumours even completely disappeared.
(Table 3)
62
Table 3. Summary of publications about RBC as O2 vehicle.
Ref Application O2 source PS Energy of excitation Type In vitro In vivo

of ROS
[36] PDT Artificial red cells IGC In vitro: 808 nm, 100 mW∙cm−2, 5 min ROS MCF-7 cell line MCF-7 tumour-bearing
(ARCs) containing Hb In vivo: 808 nm, 100 mW∙cm−2, 30 min mice
[37] PDT Hb Ce6 In vitro: 660 nm, 0.1 W∙cm−2, 2 min 1 O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
In vivo: 660 nm, 0.1 W∙cm−2, 30 min mice
[38] PDT RBCs ZnF16Pc In vitro: 671 nm, 100 mW∙cm−2, 0-60 min 1 O2 U87MG cell line U87MG tumour bearing
In vivo: 671 nm, 100 mW∙cm−2, 30 min mice
[39] PDT RBCs RB 980 nm + 808 nm, 1.5 W∙cm−2, 15 min 1 O2 U87MG cell line U87MG tumour-bearing
mice
[40] PDT Hb RB In vitro: two-photon 808 nm, 390 1 O2 MCF-7 cell line MCF-7 tumour-bearing
mW∙cm−2, 20 min mice
In vivo: two-photon 808 nm, 390 or 250
mW∙cm−2, 8 or 15 min
[41] PDT Hb ICG 808 nm, 1 W∙cm−2, 1min 1 O2 CT-26 cell line S180 and CT26 tumour-
bearing mice
[42] PDT Hb BODIPY-Br2 635 nm, 25 mW∙cm−2, 10 min 1O2 HepG2 cell line No
[43] PDT Hb TCPP 600 nm, 70 mW∙cm−2, 2min 1O2 4T1 cell line No
[44] PDT RBC membranes MB In vitro: 660 nm, 30 mW∙cm−2, 5 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
encapsulating Hb In vivo: 660 nm, 220 mW∙cm−2, 5 min mice
[45] PDT Hb-RBC ICG 808 nm, 60 mW∙cm−2, 5 min 1 O2 Macrophages MCF-7 tumour-bearing
(RAW264.7 cell line) + mice
multicellular tumour
spheroids
Hb: Hemoglobin; ICG: Indocyanine green; Ce6: Chlorin e6; RBC: Red Blood cells; ZnF16Pc: zinc 1,2,3,4,8,9,10,11,15,16,17,18,22,23,24,25-hexadecafluoro-29H,31H-
phthalocyanine; RB: Rose Bengal; BODIPY-Br2: 4,4-difluoro-4-bora-3a,a-diaza-s-indacene brominated; TCPP: carboxyphenyl-porphyrin; MB: methylene blue.
63
Zirconium (IV)-based MOF (UiO-66) NPs (diameter 55 nm) coated with ICG were loaded with O 2
and coextruded with Hb-RBC membranes by Gao et al. [45]. They presented high O2 storage capacities.
The production of 1O2 was observed by DPBF after irradiation at 808 nm during 2 min (Figure 7). A
photothermal effect was measured with a temperature of 43 °C after 5 min irradiation. The NPs were
encapsulated in RBC membrane from male ICR mice and the circulation half-lives increased. The uptake
of the NPs in macrophages (RAW264.7 cell line) was confirmed. The 1O2 production in multicellular
tumour spheroids (MCTSs) was observed by DCFH-DA. The PDT efficiency was assessed showing a
high cell mortality after NIR irradiation (808 nm, 0.06 W∙cm−2, 5 min). Intravenous injection of the NP in
MCF-7 and light irradiation (808 nm, 0.06 W∙cm−2, 1 min) tumour-bearing mice showed a notably
tumour growth inhibition.
Figure 7. a) The absorbance changes of DPBF treated with UiO-66@ICG in DMF after 808 nm laser irradiation for
different times. b) Infrared thermal images of pure H2O and UiO-66@ICG aqueous dispersion (1 mg∙mL −1) after
irradiation for 5 min by 808 nm laser (0.06 W∙cm −2). c) O2 concentration in 20 mL deoxygenated water before and
after adding 5 mg of O2@UiO-66@ICG. d) O2 concentration changes in solutions of O2@UiO-66@ICG under
irradiation by 808 nm laser. DO2: Enhanced O2 concentration. The O2 loading capacity per 1 g of ICG@UiO-66 was
calculated as follows: the loading capacity of ICG@UiO-66 ¼ (DO2: Enhanced O2 concentration)/ (ICG@UiO-66
concentration). The O2 loading capacity of ICG@UiO-66 was determined to be ~140 mmol∙g −1 or 4.48 mg∙g−1.
Reprinted from [45] with permission from Elsevier Ltd, Copyright 2018.
2.3. Perfluorocarbon
Perfluorocarbons (PFCs) are organofluorine compounds with the formula CxFy. PFCs are capable of
dissolving relatively high volumes of gases due to the weak intermolecular interactions in these PFCs.
They can maintain a higher O2 content than the tumour matrix at a given O2 partial pressure thanks to
their high O2 capacity. In this context, since 2016 19 publications have described the use of PFC to relieve
tumour hypoxia and improve PDT efficiency. It can be used as the contrast enhancement agent of
ultrasonography in the clinic [46], different formulations of liquid PFC have been explored to serve as
an artificial blood substitute. PFCs could be excreted by exhalation from lungs or skin pores. Oxypherol
(Fluosol-43) has obtained FDA approval in improving myocardial oxygenation and preventing
abnormalities in ventricular function [47]. Oxygent™ is a concentrated PFC emulsion being developed
for use as a temporary O2 carrier. It has been approved in Russia to increase O2 delivery during acute
blood loss.
Cheng et al. [48] developed nanodroplets of perfluorohexane (PFH) coated with a lipid shell
incorporating IR780 as a PS (diameter 200 nm). The irradiation of NPs in water with an 808 nm laser for
5 s intervals during 60 s (2 W∙cm−2) showed a higher 1O2 production than irradiation of PFH or IR780
64
alone. MCF-7 cells or CT26 murine colon adenocarcinoma cells irradiated with 808 nm laser (20 s, 2
W∙cm−2) led to an increase of 1O2 production with the NPs compared to PFH or IR780 alone.
Phototoxicity of the nanodroplets on the two cell lines was observed. Photothermal effect did not play
any role. The effects of the NPs in hypoxia were studied in CT26 cells in hypoxic conditions. After
irradiation, NPs still maintained superior cytotoxicity to traditional PDT. In vivo evaluation of 1O2
production on CT26 tumour-bearing mice with SOSG indicated higher 1O2 generation with the
conjugate than with PFH or IR780 alone. The tumour growth of the mice was inhibited after
intratumoural injection. The tumour volume of mice receiving NPs and irradiation (808 nm, 10+10 s, 2
W∙cm−2) was four folds lower than the volume of mice receiving IR780 alone.
PFC nanoemulsions (diameter 175 nm) containing a fluorous porphyrin were synthetized by Day et
al. [49]. They could encapsulate O2 with high concentration and produced 1O2 after light illumination
(420 nm, 8.5 mW∙cm−2, 30 min). A minimal leaching of fluorous porphyrin to the hydrophilic medium
was detected. The uptake of the emulsions in human malignant melanoma cells (A375) was successfully
observed with confocal microscopy. Cell death was observed after irradiation (420 nm, 8.5 mW∙cm−2, 30
min), whereas minimal death occurred with an emulsion containing a fluorous rhodamine. In summary,
fluorous porphyrins sequestered in PFC nanoemulsions were able to deliver 1O and to perform efficient
PDT.
Liu et al. [50] synthesized a core shell NP (Au core, SiO2 and CuO2 shell) incorporated into PFH
droplets to form a liposome (diameter 190 nm). The plasmon-induced resonance energy transfer
(PIRET) from Au to Cu2O, Au@SiO2@Cu2O (670 nm, 0.48 mW∙cm−2, 10 min) produced 1O2 with a
quantum yield evaluated at 0.71. NPs successfully incorporated into MCF-7 cells. 1O2 production in
these cells was greatly enhanced by the O2 supply of PFH. A strong phototoxicity appeared after light
illumination (670 nm, 0.48 mW∙cm−2, 10 min) (Figure 8a). The caspase 3 protein activity, an apoptosis
indicator, showed a 3.6 higher amount than without irradiation (Figure 8b). The NPs induced significant
phototoxicity to MCF-7 cells under both normoxic and hypoxic conditions. The O2 self-enriched effect
of the NPs could guarantee PDT efficacy in MCF-7 cells. Irradiation of multicellular tumour spheroids
(MCTS) of MCF-7 cells showed a high mortality. Tumour growth measurements on MCF-7 cancer-
bearing female Balb/c mice conducted to a complete inhibition during 14 days after injection of the NPs
and irradiation (670 nm, 0.48 mW∙cm-2, 10 min).
Figure 8. PDT in vitro on MCF-7 cells. a) Cytotoxicity of different samples in the presence or absence of irradiation
(670 nm, 0.48 W∙cm−2). b) Relative activity multiple of caspase-3 protein in MCF-7 cells activated by Lip(ASC) and
Lip(ASC/PFH) (20 µg∙mL−1) with or without 670 nm irradiation for 10 min. Adapted from Liu et al. [50].
Que et al. [51] elaborated fluorine-containing NPs (a core of pentafluorophenyl and 5,10,15,20-
tetrakis(4-aminophenyl) porphyrin) coated with PEG as spherical micelles (diameter 30 nm). 1O2
production, measured with ABDA was highly dependent of the concentration of PFC in the core, as O 2
supplier (655 nm, 1.52 mW∙cm−2, 15 min). The porphyrin in copolymers was then loaded with Pd. The
heavy atom effect played a role in the enhanced PDT efficacy. No dark cytotoxicity was observed on
65
SMMC-7721 cells (human hepatoma cell line). The phototoxicity of the micelles after irradiation (655
nm, 1.52 mW∙cm−2, 60 min) showed a cell viability less than 30% and correlated with the PFC amount.
A nanoliposome was prepared by Sheng et al. [52] by incorporating perfluorooctyl bromide (PFOB)
and ICG into a core coated by a bilipidic shell (diameter 200 nm). The release of O 2 from the NPs was
assured by diffusion during at least 24 hours. The photothermal effect of the NPs was evaluated after
laser irradiation (808 nm, 1 W∙cm−2, 5 min) with a temperature increase from 43 to 50 °C. 1O2 measured
by SOSG under hypoxia was highly increased with the conjugate compared to ICG or liposome-ICG
alone. The ROS production measured in vitro on human triple-negative breast cancer MDA-MB-231
cells led to the same results. Under irradiation (808 nm, 1 W∙cm−2, 3 min) the cell viability decreased to
10% both in normoxia and hypoxia by a combination of PDT and PTT effects. Mice bearing MDA-MB-
231 tumours treated with the conjugate and irradiated (808 nm, 1 W∙cm−2, 10 min) achieved almost
complete tumour destruction without tumour recurrence.
Song et al. [53] synthesized nanodroplets of PFC (diameter 160 nm) loaded with O2 and stabilized
by albumin. Ce6 was modified (three hexylamine were added to increase the hydrophobicity) and
loaded into the lipid bilayers of PEG-modified liposomes. The release of O2 was triggered by an external
ultrasound activation (Figure 9). This activation enhanced PDT and radiotherapy efficiency. 4T1
tumour-bearing mice placed under hyperoxic inhalation were treated with ultrasound (US).
Oxygenation levels showed an increase of 50% for the mice treated with the conjugate. 4T1 tumour-
bearing mice were treated with US and irradiated (671 nm, 1.2 W∙cm−2, 5 min). Mice tumour growth was
significantly inhibited compared to the control group. Similar results were obtained on mice bearing
CT-26 colon cancer tumours.
Figure 9. Time-dependent changes of dissolved O2 concentrations in deoxygenated pure water without or with
addition of O2-loaded PFC nanoemulsion (PFC@O2). An US treatment was applied on these solutions within the
indicated period. Reprinted from [53] with permission from the American Chemical Society, Copyright 2016.
Tang et al. [54] designed PFC nanodroplets coated with IR Dye 800CW (for in vivo imaging) and
incorporating ZnF16Pc as a PS and perylene diimide (PDI) as photoacoustic agent (PA) imaging agent
(diameter 110 nm). The high O2 solubility in PFC enhanced PDT. The PDI agent converted light energy
into heat for contrast-enhanced ultrasound imaging and for a photothermal effect. The PA intensity was
registered proportionally to the PDI concentration. Under irradiation at 671 nm at different irradiance
(until 1.2 W∙cm−2, 5 min) the temperature of the solutions increased until 89 °C showing the
photothermal effect for an irradiance of 1.2 W∙cm−2. Phototoxicity was observed after light irradiation
(671 nm, 100 mW∙cm−2, 200 s) on U87MG cells with a viability less than 34% without photothermal effect.
1O2 was produced in normoxic and hypoxic media due to O 2 supply by PFC. Same conclusions were
observed on U87MG cells. Mice irradiated at 500 mW∙cm−2 during 10 min (671 nm) presented a complete
tumour eradication (Figure 10).
66
Figure 10. Tumour growth curves. Complete tumour eradication was found in the combinational PTT/Oxy-PDT
treatment group with i.v. injection of PS-PDI-PAnDs plus a 0.5 W∙cm−2 laser irradiation. Significant tumour growth
inhibition was also observed with animals treated with PTT only (i.v. injection of PS-PDI-PAnPs plus a 0.5 W∙cm−2
laser irradiation) and Oxy-PDT only (i.v. injection of PS-PDI-PAnDs plus a 0.2 W∙cm−2 laser irradiation), indicating
tumour growth inhibition rates of 82.3% and 67.5%, respectively, on day 18. Adapted from Tang et al. [54].
Tang et al. [55] designed a nanodroplet of PFH as core and a lipid shell containing IR780 as the PS.
The high concentration of O2 on PFH is playing as a sponge for O2 and was able to overcome hypoxia
in tumours. After irradiation (808 nm, 2 W∙cm−2, 20 s) 1O2 production measured by the SOSG probe was
higher with the conjugate than the lipidic NPs without PFH even when the conjugate was in hypoxic
conditions. CT26 murine colon adenocarcinoma cells incubated and irradiated (808 nm, 2 W∙cm −2, 20 s)
showed a higher level of 1O2 with the conjugates than with the lipidic NPs alone. The phototoxicity of
the conjugate in hypoxia presented a high mortality in the CT26 cells, while almost no cells were killed
with the lipidic NPs. The NPs were injected intravenously in mice bearing CT26 subcutaneous tumours
kept in hypoxia (7% O2) during 30 min. After light illumination (808 nm, 2 W∙cm−2, 10+10 s) the tumour
growth was inhibited whereas no efficacy was observed for the lipidic NPs.
Tao et al. [56] prepared fluorinated covalent organic polymers (COPs) by linking covalently a
porphyrin (THPP) with perfluorosebacic acid (PFSEA) and PEG (diameter ~60 nm). PFCE, a type of
PFC, was loaded into the porous structure of the NPs. The dissolved O 2 concentration was enhanced
compared to the control. 1O2 level measured by SOSG showed a significant increased production after
irradiation (660 nm, 10 mW∙cm−2, 30 min).
Figure 11. Tumour growth curves of four groups of mice after treatments as indicated. V 0 and V stand for the
tumour volumes before and after the treatments, respectively. Adapted from Tao et al. [56].
Cellular uptake of the conjugates was successfully achieved on 4T1 cells. Phototoxicity of 80% was
evaluated after irradiation (660 nm, 10 mW∙cm−2, 60 min). The tumour growth of 4T1 tumour-bearing
67
mice after intravenous injection and irradiation (660 nm, 50 mW∙cm−2, 30 min) was fully inhibited after
14 days (Figure 11).
Wang et al. [57] synthesized hollow MoSx NPs (HMoSx) by incorporating PFH in the core and loaded
with albumin (HSA) and aluminum phthalocyanine (AlPc) (diameter 140 nm). The NPs were then
loaded with O2. A photothermal effect was observed after irradiation (670 nm, 1 W∙cm −2, 5 min), the
temperature reached 68 °C. 1O2 production measured by DPBF showed a significant enhancement for
the conjugate after irradiation. Phototoxicity assays realized on 4T1 cell lines led to an efficient activity
of the conjugate on normoxia and hypoxia, when it was loaded with O 2. Intracellular ROS generation
on 4T1 cells was also confirmed by measurement with the ROS-ID probe. Tumour growth
measurements on 4T1 tumour mice conducted to a complete inhibition during 16 days after injection of
the conjugate and irradiation (670 nm, 1 W∙cm−2, 5 min) confirming the dual PTT/PDT effect.
Wang et al. [58] prepared a polymeric micelle constituted of perfluorooctanoic acid and branched
polyethyleneimine and incorporating Ce6 (diameter 120 nm). A non-fluorinated micelle was prepared
as control. The two NPs were loaded with O2 and the O2 released concentration was significantly higher
for the fluorinated NP (Figure 12). ROS production measured by DCFH-DA on C6 cells showed high
concentration for the conjugate after irradiation (630 nm, 30 mW∙cm −2, 3 min). Hypoxia was greatly
overcome by the conjugate in C6 cells compared to the control. Tumour growth measurements on
BALB/c nude mice bearing C6 tumours conducted to a significant inhibition during 12 days after
intravenous injection of the NPs and irradiation (660 nm, 500 mW∙cm−2, 20 min).
Figure 12. O2 concentration changed after the addition of O2 saturated Ce6-PFOC-PEI-M, Ce6-OC-PEI-M and PBS
into deoxygenated water. Adapted from Wang et al. [58].
Yu et al. [59] designed PFH nanoliposomes incorporating O2 and Ce6 (diameter 100 nm). PFH was
able to encapsulate and then release O2. The dissolved O2 concentration was greatly enhanced during
ultrasonic activation. The ROS generation using DPBF showed a time-dependent production for the
conjugate in contrary to the control without PFH. Phototoxicity of the conjugate was clearly established
in contrary to the control without PFH. In vivo tumour growth volume measurements on mice bearing
subcutaneous 4T1 tumour showed that the conjugate induced the best tumour inhibition (670 nm, 1
W∙cm−2, 1 min).
Yuan et al. [60] synthesized fluorinated polypeptide micelles incorporating a NIR PS BODIPY
(diameter 150 nm). The NPs was water dispersible and the PFC concentration allowed a high O2 loading.
Higher levels of dissolved O2 were measured with the conjugate compared to the non fluorined one.
The same tendency was observed for the photosensitized 1O2 generation after irradiation at 635 nm (0.5
mW∙cm−2, 360 s). Phototoxicity (635 nm, 34 mW∙cm−2, 10 min) measured on HepG2 cells at the same
irradiance showed a better efficacy of the conjugate compared to the non fluorined one, confirming the
role of PFC in O2 supply. Tumour growth measurements on 4T1 tumour-bearing mice conducted to a
complete inhibition during 19 days after injection of the NPs and irradiation (635 nm, 100 mW∙cm −2, 10
min).
68
Zhang et al. [61] synthesized perfluorooctyl bromide nanoliposomes incorporation IR780 NIR PS
(diameter 270 nm). The photothermal effect of the NPs was evaluated after laser irradiation (808 nm, 1
W∙cm−2, 5 min) with a temperature increase from 25 °C to 70 °C. 1O2 generation was measured by SOSG
under the same fluence with a high amount for the conjugate in contrary to the non-fluorinated NPs.
Intracellular 1O2 generation was observed after light irradiation (808 nm, 1 W∙cm−2, 5 min). PTT and PDT
treatments on 4T1 cancer cells showed less viability for the fluorinated conjugate and better efficacy
with combined PTT/PDT. Tumour growth measurements on 4T1 cancer-bearing mice conducted to a
complete inhibition during 18 days after injection of the NPs and PTT/PDT treatment (808 nm laser (on
30 s, off to room temperature, 20 cycles), 1.0 W∙cm−2) (Figures 13a and b).
Figure 13. a) Tumour growth curves of six groups after various treatments. b) Weight of tumours 18 d post various
treatments. (Values are means±s.d., n = 5, *P < 0.05.). Adapted from Zhang et al. [61].
Zhao et al. [62] elaborated a NP made of a core of perfluorooctyl bromide and a shell with the PS
IR780 and a tumour penetrating peptide CRGDK (diameter 210 nm). Hypoxia measurements made on
MDA-MB-231 tumour-bearing mice showed a significant attenuation in the tumour where the conjugate
was injected, confirming the role of PFC in the O2 delivery. Tumour growth measurements on MDA-
MB-231 tumour-bearing mice conducted to a complete inhibition during 13 days after injection of the
NPs and irradiation (808 nm, 2 W∙cm−2, 20 s).
NPs with a PFH core and a hyaluronic acid (HA) and Ce6 shell were synthetized (diameter 220 nm)
by Hu D. et al. [63]. These “on-off” NPs were redox-activatable and could release Ce6 and O2 in hypoxic
tumours. The 1O2 of the conjugate increased significantly in reducing conditions after light irradiation
(660 nm, 100 mW∙cm−2, 5 min). The cellular uptake of the NP was studied on MDA-MB-231 cells. The
ROS production in vitro was significantly higher with that conjugate than with NPs with incomplete
composition. NPs were intravenously injected in MDA-MB-231 breast tumour xenograft mouse model.
NPs retention in the organs was stronger after 24 h than for free Ce6, especially in the tumour (5.8 fold)
(Figure 14).
Figure 14. In vivo biodistribution of NPs. Semiquantitative fluorescence analysis of the radiant efficiency of organs
and tumours isolated at 24 h post-injection. Adapted from Hu et al. [63]
69
Table 4. Summary of publications about PFC as O2 vehicle.
Ref Application O2 source PS Energy of excitation Type of In vitro In vivo

ROS
[48] PDT PFH IR780 808 nm, 2 W∙cm−2, 20 s 1O2 MCF-7 and CT26 CT26 tumour-
adenocarcinoma bearing mice
cell lines
[49] PDT PFC Fluorous 420 nm, 8.5 mW∙cm−2, 30 min 1 O2 A375 cell line No
porphyrin
[50] PDT PFH Plasmon resonance 670 nm, 0.48 mW∙cm−2, 10 min 1 O2 MCF-7 cell line MCF-7 tumour-
bearing mice
[51] PDT Pentafluorophenyl 5,10,15,20- In vitro: 655 nm, 1.52 mW∙cm−2, 15 min 1 O2 SMMC-7721 cell No
tetrakis(4- In vivo: 655 nm, 1.52 mW∙cm−2, 60 min line
aminophenyl)
porphyrin
[52] PDT PFOB ICG In vitro: 808 nm, 1 W∙cm−2, 3 min 1O2 + ROS MDA-MB-231 MDA-MB-231
In vivo: 808 nm, 1 W∙cm−2, 10 min cell line tumour-bearing
mice
[53] Ultrasound PFC Ce6 671 nm, 1.2 W∙cm−2, 5 min 1 O2 4T1 and CT26 cell 4T1 and CT26
triggered lines tumour-bearing
PDT and RT mice
[54] PDT PFC ZnF16Pc In vitro: 671 nm, 100 mW∙cm−2, 200 s 1 O2 U87MG cell line U87MG
In vivo: 671 nm, 500 mW∙cm−2, 10 min tumour-bearing
mice
[55] PDT PFH IR780 808 nm, 2 W∙cm−2, 20 s 1 O2 CT26 cell line CT26 tumour-
bearing mice
[56] PDT PFSEA THPP In vitro: 660 nm, 10 mW∙cm−2, 30 min 1 O2 4T1 cell line 4T1-tumour-
In vivo: 660 nm, 50 mW∙cm−2, 60 min bearing mice
[57] PDT + PTT PFH AlPc 670 nm, 1 W∙cm−2, 5 min 1 O2 4T1 cell line 4T1-tumour-
bearing mice
[58] PDT Perfluorooctanoic Ce6 In vitro: 630 nm, 30 mW∙cm−2, 3 min 1 O2 C6, HepG2 and C6 glioma tumour-
acid In vivo: 630 nm, 500 mW∙cm−2, 20 min HeLa cell lines bearing mice
[59] PDT PFH Ce6 670 nm, 1 W∙cm−2, 1 min 1 O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
bearing mice
[60] PDT Fluorinated BODIPY-Br2 In vitro: 635 nm, 34 mW∙cm−2, 10 min 1 O2 HepG2 cell line 4T1 tumour-
polypeptide NPs In vivo: 635 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min bearing mice
70
Table 4. Cont.
Ref Application O2 source PS Energy of excitation Type of In vitro In vivo

ROS
[61] PDT + PTT Perfluorooctyl IR780 In vitro: 808 nm, 1 W∙cm−2, 5 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
bromide In vivo: 808 nm, 1 W∙cm−2, on 30 s, off bearing mice
to room temperature, 20 cycles
[62] PDT Perfluorooctyl IR780 808 nm, 2 W∙cm−2, 20 s 1 O2 MDA-MB-231 and MDA-MB-231
bromide MCF-7 cell lines tumour-bearing
mice
[63] PDT PFH Ce6 In vitro: 660 nm, 100 mW∙cm−2, 5 min 1O2 + ROS MDA-MB-231 cell MDA-MB-231
In vivo: 660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min line tumour-bearing
mice
[64] PDT PFC Hypocrellin B 630 nm, 20 mW∙cm−2, 300 s ,6 J per well 1O2 H1299 cell line No
[65] PDT NPs with IR780 In vitro: 808 nm, 2 W∙cm−2, 20 s 1O2 4T1 tumour 4T1 tumour-
fluorocarbon In vivo: 808 nm, 2 W∙cm−2, 5 min spheroids bearing mice
chains
PFH: perfluorohexane; PFC: perfluorocarbon; PFOBRB: perfluorooctyl bromide; ICG: Indocyanine green; Ce6: Chlorin e6; ZnF 16Pc: zinc
1,2,3,4,8,9,10,11,15,16,17,18,22,23,24,25-hexadecafluoro-29H,31H-phthalocyanine; PFSEA: perfluorosebacic acid; THPP: meso-5, 10, 15, 20-tetra (4-hydroxylphenyl)
porphyrin; AlPc: aluminium phthalocyanine; BODIPY-Br2: 4,4-difluoro-4-bora-3a,a-diaza-s-indacene brominated.
71
The in vivo hypoxia intensity declined with the NPs compared to the NPs without PFH. The NPs
showed effective tumour growth inhibition compared to NPs with incomplete composition even if the
tumour did not disappear completely (660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min).
Hu et al. [64] synthesized different amphiphilic fluorous random copolymers with different amount
of PFC, that embed Hypocrellin B (HB) as PS, assembled themself into micelles in water (diameter 200
nm). The O2 carrying ability of the conjugate was related to the PFC content. 1O2 production of HB after
light irradiation (630 nm, 6 J/well) of the conjugate measured with SOSG was equivalent as for HB in
water. The phototoxicity (630 nm, 20 mW∙cm−2, 300 s) of the conjugate in human lung carcinoma H1299
cells depended on the amount of PFC. The highest amount led to the best efficiency.
Ma et al. [65] prepared NPs with fluorocarbon chains and IR780 PS in the core and iRGD peptides
on the shell (diameter 80 nm). 1O2 concentration was measured in vitro and in vivo with SOSG showing
increased values for the conjugate (808 nm, 2 W∙cm−2, 20 s). ROS generation measured on 4T1 tumour
spheroids showed an enhanced concentration even inside the spheroid showing efficacy of the tumour-
penetrating iRGD peptide. High phototoxicity was observed at 7.5 µg∙mL−1 with a cell viability less than
20% (808 nm, 2 W∙cm−2, 20 s). O2 concentration in 4T1 solid tumours measured by photoacoustic system
showed an enhanced amount after injection of the NPs and irradiation. Tumour growth measurements
on 4T1 cancer-bearing mice conducted to a complete inhibition during 12 days after injection of the NPs
and irradiation (808 nm, 2 W∙cm−2, 5 min). (Table 4)
2.4. O2 Microbubbles
Free O2 gas bubbles are not recommended to be directly injected into blood flow for hemolysis
reason. A new approach of O2 delivery, well documented in a review of Khan et al. [66] consists in the
use of O2 loaded micro-/nanobubbles to bring O2 to the hypoxic tumour without side effects. In such
particles, the shell is generally a monolayer biomaterial (lipids, proteins, polymers…) that encapsulates
the core gas.
Huang et al. [67] have developed a new strategy for externally triggered PDT of tumour hypoxia
using bone marrow-derived monocytes/macrophages as cellular vehicles for co-transport of O2 and Ce6.
Superparamagnetic iron oxide NPs (SPIONs) were co-entrapped within the polymer to afford
functional bubbles denoted (SCOPBs). According to the in vitro studies, these functional bubbles were
found harmless to cellular hosts without external trigger. However, significant apoptosis of cancer cells
co-incubated with therapeutic monocytes was observed when treated with high frequency magnetic
field (HFMF) and red light laser irradiation due to the combined effect of PDT and magnetic
hyperthermia was observed. Furthermore, upon tumour treatment with HFHM (9 min) and red laser
irradiation (660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min), the therapeutic monocytes exhibited a superior performance
in inhibiting tumour growth on tramp-C1 tumour-bearing mice. Moreover, immunohistochemistry
(IHC) staining of tumour sections confirmed the successful cellular transport of the therapeutic
payloads to tumour hypoxia and the pronounced antitumour effect elicited by combined
hyperthermia/PDT along with the additional O2 supply.
In 2018, Song et al. [68] developed nanocapsules composed of a decane core and a polymer shell
linked to Ce6, surrounded by lipid molecules conjugated to a hydrophilic polymer PEG (263.2±10.3 nm
with a thickness of about 20 nm for the shell). The O2 nanobubbles (NBs-O2) were finally obtained by O2
infusion in the nanocapsules. Fluorinated caps on the PCL polymer avoided the liberation of O 2 at an
undesired place. The authors had then compared their ability to release O2 in comparison with well-
known O2 carrier, lipid-coated O2 microbubbles (LOMs). They followed the level of O2 dissolved in a
hypoxic solution over time. LOMs showed a higher and faster increase of O 2 concentration, at the
beginning (first minute) than NBs-O2 but they decreased rapidly to a lower level than NBs-O2. This
indicated a better robustness of these nanobubbles due to their thicker shell. They also compared the
effect of O2 release on the 1O2 production of Ce6 and observed a level 3 times higher for NBs-O2 in
comparison with Ce6 alone. In vitro studies on C6 glioma showed that they were strongly accumulated
in cytoplasm after endocytosis in comparison with Ce6 alone. In vivo studies were performed on
72
glioma-bearing nude mice. They evaluated their ability to improve the PDT treatment and showed a
significant decrease of tumour growth for mice treated with these nanobubbles and laser irradiation
(670 nm, 300 mW∙cm−2, 30 min) in comparison with the control group.
(Table 5)
Table 5. Summary of publications about O2 microbubbles as O2 vehicle.
Ref Application O2 source PS Energy of Type of In In vivo

excitation ROS vitro
[67] Hyperthermia/PDT O2-loaded Ce6 660 nm, 100 1O2 RAW Tramp-C1
polymer mW∙cm−2, 10 264.7 tumour-bearing
bubbles min cell line C57BL/6JNarl
mice
[68] PDT O2 Ce6 670 nm, 300 1O2 C6 C6 glioma
nanobubbles mW∙cm−2, 30 glioma tumour-bearing
min cell line mice
Ce6: Chlorin e6.
2.5. Other
Niu et al. [69] designed β-NaGdF4:Yb3+/Er3+ upconverting NPs (diameter 50 nm) associated with gold
oxide (Au2O3), porous silica, Ce6, cyclo-RGD and PEG. Upon a NIR irradiation, Au2O3 is able to produce
O2 assisted by UCNPs via (FRET). When FRET occurred between UCNPs and Au/Au2O3 under NIR
light, Au2O3 underwent a decomposition into Au and O2. The O2 production under NIR irradiation (980
nm, 30 min, 0.5 mW∙cm−2) was demonstrated using a Ru probe. FRET was observed between the NPs
and Au2O3 for O2 production and between the NPs and Ce6 for a PDT effect. The phototoxicity of the
NPs on human cervical cancer cells (HeLa) was demonstrated. The NPs were intravenous injected in
nude mice inoculated with HeLa tumour cells. After NIR irradiation (980 nm, 30 min, 0.5 mW∙cm−2), the
relative tumour volume of the treated group stayed constant whereas it increased in the control group.
The NPs presented also a photothermal effect that could be used for PA.
3. Modification of Tumour Microenvironment (TME)

The "normal" microenvironment is complex and dynamic. Its cellular component encompasses all
neighbouring cells (adjacent cells belonging to the same tissue) and cells residing in their direct
environment (fibroblasts, vascular cells, dendritic cells, immune system cells, etc.). The TME or stroma
is defined as the cellular components, molecular components and mechanical stresses surrounding and
interacting with tumour cells. It differs from the "normal" microenvironment by the biochemical
composition of the extra cellular matrix and especially by the fact that the stromal cell populations,
although not transformed, are subverted and controlled by the tumour cells to meet their own needs. It
has been widely demonstrated that TME plays a major role in bone marrow clearance and tumour
invasion, as well as resistance to chemotherapy [70]. By modifying the TME, it seems possible through
specific response pathways, such as that of the proteins of the Hypoxia Inducible Factor (HIF) family,
to induce the activation of several signalling pathways that regulate many cellular processes such as
angiogenesis, metabolism, cell proliferation and apoptosis.
3.1. H2O2 Decomposition

It is known that cancer cells have higher levels of H2O2 than normal cells [71] because of the aberrant
metabolism of cancer cell. The concentrations range from 10−4 to 10−3 M. One of the strategies to improve
O2 levels in hypoxic areas is to design compounds that could degrade endogenous H 2O2 to produce O2
inside the tumour. It is interesting to note that catalase is able to convert around 5 million H 2O2
molecules per minute and catalase is explored nowadays to overcome tumour relief [72]. Moreover,
73
another advantage of this strategy is that the decrease of H 2O2 in the cells leads to a decrease of cancer
cell proliferation [73–75].
3.1.1. MnO2
One advantage of MnO2 is that it can adsorb different kinds of small molecules via physisorption or
Mn-N coordination links. MnO2 produces O2 by catalytic H2O2 decomposition under neutral conditions,
but also under acidic conditions by reaction with H+. This strategy is very new. The first publication has
been written in 2015, and then we can find three publications in 2016, seven in 2017, 14 in 2018 and three
already in 2019 (before March). Moreover, the efficacy of PDT is not only limited by tumour hypoxia
but also over-expressed glutathione (GSH) in cancer cells that consumes ROS.
Xu et al. [76] synthesized a photoactive Mn(II) complex of BODIPY derivatives ([(BDA)MnCl2], Mn1)
as a O2 generator under irradiation (green LED, 500-600 nm, 10 W) in water. Mn1 was loaded on
graphene oxide (Mn1@GO) and an in vitro biological evaluation for Mn1 and Mn1@GO on HepG-2 cells
in normal and hypoxic conditions was performed. In normal conditions, both Mn1 and Mn1@GO after
light illumination (green LED, 500-600 nm, 15 min) were active against HepG-2 cells. It was also found
that both compounds could be used as photoactivated anticancer materials since Mn1 and Mn 1@GO
were able to exhibit inhibition on the proliferation of HepG-2 cells when light irradiation. In particular,
Mn1@GO reacted with H2O2 resulting in the formation of active species, and worked as H 2O2 and light-
activated anticancer NPs. Moreover, Mn1@GO could be an efficient anticancer material in hypoxic
environments and Mn1 could target mitochondria and had some effects on the expression of HIF-1α in
HepG-2 cells.
Multifunctional MnO2 NPs loaded with Ce6 and coated with PEG were designed (Ce6 @ MnO2-PEG)
by Zhu et al. [77]. In vitro studies in an O2-deficient atmosphere have shown that Ce6 @ MnO2-PEG NPs
can effectively increase the efficiency of light-induced PDT (661 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min) due to the
increased intracellular level of O2. In vitro in 4T1 cells, it was found that Ce6@MnO2-PEG NPs were very
effective, even under conditions of O2 deficiency. With systemic administration to mice bearing
subcutaneous 4T1 tumours, Ce6@MnO2-PEG NPs showed effective accumulation inside the tumour, in
which the MnO2 NPs gradually decomposed into Mn2+ ions. Meanwhile, as expected, the level of
oxygenation of the tumour was significantly increased. Due to enhanced Ce6 uptake in the tumour and
reversed tumour hypoxia, highly effective PDT treatment (661 nm, 5 mW∙cm−2, 1 h) of cancer was
implemented using Ce6@MnO2-PEG NPs. Given the gradual decomposition of MnO2 NPs, easy
filtration of Mn2+ in the kidneys, and the lack of obvious short-term in vivo toxicity observed in this
study, MnO2 nanostructures could be a unique type of safe nanoplatform promising for cancer.
Figure 15. Schematic illustration showing a molecular model of the Mn2+ ion linking porphyrin ring and
two carboxylate radicals of DVDMS molecules (a), the fabrication process of Mn/DVDMS (b), and
photothermal/PDT (PTT/PDT) (c). Reprinted from Chu et al. [78] with permission from John Wiley and
Sons, Copyright 2018.
74
Chu et al. [78] developed an engineering nanoplatform that combined many functions, including
imaging (fluorescence imaging, MRI and PA imaging), as well as a synergistic combination of
phototherapy (PTT and PDT). The MnO2 nanosheets served as a highly efficient carrier for a
sinoporphyrin sodium (DVDMS) PS and an in situ O2 and nano-DVD (Mn/DVDMS) generator,
enhanced theranostic capability of Mn2+-assisted assembly of DVDMS (MnO2/DVDMS) (Figure 15).
MnO2 nanosheets served as a highly effective DVDMS carrier and in situ O2 and nanoDVD generator.
In a tumour environment, MnO2/DVDMS could be reduced by GSH and H2O2, which resulted in the
release of Mn2+, DVDMS and O2. In addition, GSH consumption, O2 production, and nanoDVD
formation demonstrated an overall improved efficacy of phototherapy in vitro (630 nm, 75 mW∙cm−2, 5
min) and in vivo (630 nm, 300 mW∙cm−2, 8 min) in MCF-7 tumour.
Gao et al. [79] developed an O2-generating PDT nanocomplex (IHM) by encapsulating MnO2 NP in
HA NPs coupled to ICG. The O2 content in the tumour increased by 2.25±0.07 times with IHM compared
without IHM treatment. After laser irradiation in the IHM group, there was a significant inhibition of
tumour growth compared to the group treated with NPs. Immunofluorescent staining confirmed a
decrease in both HIF1-a and pimonidazole in the IHM group, implying that generating O2 in the tumour
not only improved the efficiency of PDT, but also weakened tumour hypoxia. In vitro studies in murine
squamous SCC-7 cells showed a high suppression of cell proliferation under PDT (808 nm, 0.5 W∙cm −2,
10 min) treatment with IHM. In vivo in SCC-7 tumour-bearing mice highlighted a high inhibition of
tumour growth with PDT treatment (808 nm, 0.8 W∙cm−2, 10 min) with IHM.
Hao et al. [80] designed poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) NPs loaded with hematoporphyrin
monomethyl ether (HMME) and coated with multifunctional MnO2 shells, (PLGA/HMME@MnO2 NPs).
As expected, inside the tumour they could observe the generation of O2 and degradation of MnO2 into
Mn2+ ions by glutathione. In vitro in MCF-7 cells, under illumination (532 nm, 1.5 W∙cm−2, 2 min), the
released HMME produced ROS that destroyed tumour cells. Furthermore, the decreased of GSH level
further inhibited the consumption of the produced ROS, which greatly enhanced the PDT efficacy.
These results were confirmed by in vivo studies in S180 tumour model after PDT treatment (532 nm, 1.5
W∙cm−2, 1.5 min) with PLGA/HMME@MnO2 NPs with a significant decrease of tumour volume.
Kim et al. [81] developed biocompatible mesoporous silica NPs with MnFe2O4 NPs (MFMSN) and
Ce6 (MFMSN-Ce6). These results demonstrated the continuous generation of O2 by the Fenton catalyst
under physiological conditions, improving the generation of ROS under hypoxic conditions. In vitro
PDT efficiency in human glioblastoma cancer (U-87 MG) cells in both normoxic and hypoxic conditions
was investigated. A significant cell death was observed in both conditions after incubation of cells with
MFMSN-Ce6 and irradiated at 670 nm (0.5 W∙cm−2, 30 s), contrary to cells incubated with Ce6 alone and
irradiated, which highlighted a low cell death in hypoxic conditions. In vivo in U87 MG-bearing mouse
xenograft model, PDT treatment (670 nm, 0.88 W∙cm−2, 5 min) with MFMSN-Ce6 showed the best
efficiency.
Liu et al. [82] developed a bovine serum albumin (BSA) stabilized MnO2 NPs on which TCC (HPPH)
was physisorbed (hydrodynamic size 60.52±25.61 nm). In vitro studies in U87MG cells after 630 nm laser
irradiation showed that the cells incubated with the NPs exhibited more reduced viability than those
incubated with the PS alone (10 mW∙cm−2, 1 min). In vivo (630 nm, 10 mW∙cm−2, 10 min) in U87MG
tumour bearing mice, a complete eradication of the tumour was observed after treatment with the NPs
whereas no diminution was observed with the NPs without HPPH and only a low decrease with HPPH.
Thanks to pimonidazole hypoxyprobe kit, they proved the decrease of tumour hypoxia.
Ma Z. et al. [83] in 2017 developed a H2O2-activatable nanostructure (SiO2-MB@MnO2) composed by
a SiO2-MB core coated to a MnO2 shell. Under acidic hypoxic conditions, these NPs could release MB
and generate O2 by decomposition of H2O2 of the TME. SiO2-MB@MnO2 exhibited a significant PDT
efficiency (650 nm, 100 mW∙cm−2,15 min) in vitro in HeLa cells with 92% of cell death (42% for MB alone
and 64% for SiO2-MB). Moreover, in TME conditions (pH = 5.5), an efficient release of MB by SiO 2-
MB@MnO2 was observed after 5h of incubation (87%). The dramatic increase of PDT effect was also
proven in vivo in U14 tumour-bearing mice with an important decrease of tumour volume in
75
comparison with irradiation of MB alone or SiO2-MB and a decrease of HIF-1α showing an improvement
of hypoxia.
Ai et al. [84] developed upconversion nanoconjugate (UCN) loaded with Ce6 and integrating MnO2
NPs and HA biopolymer (UCNs-MnO2-Ce6-HA). Under NIR 808 nm light irradiation (0.4 W∙cm−2, 60
min), UCNs-MnO2-Ce6-HA produced high level of O2 by reaction of MnO2 with H2O2 of the
microenvironment and thus led to an increase of the production of 1O2 in hypoxic conditions. In vitro
studies in murine melanoma cells (B16F10) confirmed this with an increase of cell death (49%) by
treatment with UCNs-MnO2-Ce6-HA under NIR irradiation (0.4 W∙cm−2, 60 min) in hypoxic conditions.
Gu et al. [85] synthesized nanocomposites (CaF2:Yb,Er@silica/MnO2-Ce6 = C@MSN-Ce6)
constituted of CaF2:Yb,Er crystals incorporated in mesoporous silica nanospheres (MSNs) coated with
a thin layer of MnO2 and loaded with Ce6. The MnO2 coating modulated a hypoxic TME by generating
in situ O2 through a reaction with an endogenous H2O2 tumour. In vitro tests in 4T1 cells highlighted
that C@MSN-Ce6 presented under light irradiation (980 nm, 0.5 W∙cm−2, 10 min) an improvement of
PDT efficiency, in comparison with NPs without MnO2, in both normoxic and hypoxic conditions
confirmed by an elevation of intracellular ROS level. In 4T1 tumours on Balb/c mice, in vivo studies
showed a decrease of hypoxia in tumour after injection of C@MSN-Ce6 by using pimonidazole probe.
The highest efficiency of PDT treatment (980 nm, 0.5 W∙cm−2, 30 min) was observed for C@MSN-Ce6
with a significant decrease of tumour growth.
Chen et al. [86] prepared successfully pH/H2O2-responsive carbon dots CDs/MnO2-PEG presenting
interesting characteristics such as a low cytotoxicity and a complete clearance from the body and an
increase of fluorescence and 1O2 production in TME conditons. In vitro, in HeLa cells, and in vivo, in
4T1 tumour-bearing nude mice, analyses revealed that the low-toxic CDs/MnO2-PEG nanohybrids
could be applied as pH/H2O2-driven, turn-on nanotheranostics for the concurrent bimodal MR/FL
imaging and O2-elevated PDT of solid tumours. In vitro PDT (635 nm, 100 mW∙cm−2, 30 min) effect was
investigated in HeLa cells under hypoxic and acidic conditions and CDs/MnO2-PEG exhibited high
efficiency to kill cancer cells. In vivo studies, under PDT treatment (635 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min) with
CDs/MnO2-PEG, conduction a significant inhibition of tumour growth.
He et al. [87] synthesized large pore silica nanocomposites (LPMSNs) coupled to Ce6, AS1411
aptamer for the selectivity and MnO2, denoted as AS1411/Ce6-LPMSNs-MnO2. Due to the high
reactivity of MnO2 with endogenous acidic H2O2, massive O2 molecules were formed, improving PDT
efficiency (660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min).
Kapri and Bhattacharyya [88] developed a p-n heterojunction nanofilm containing p-type MoS2
nanoplates and nitrogen-doped reduced graphene oxide (n-rGO) with a thickness of ~ 5 nm.
Illumination at 980 nm led to an effective electron-hole separation through the heterojunction. The
nanoplates were modified with functionalized lipoic acid poly(ethylene glycol) to ensure better
biocompatibility and colloidal stability and surface-decorated 3–5 nm MnO2 NPs to finally obtain
pMoS2/n-rGO-MnO2-PEG nanosheets. MnO2 increased intracellular O2 by reacting with endogenous
H2O2. In vitro studies in HeLa and HEK 293 (human embryonic kidney 293 cells) cells were performed
highlighted an efficient PDT (980 nm, 0.4 W∙cm−2, 5 min) effect of the nanosheets. Compared to p-
MoS2/n-rGO-PEG and MoS2/rGO-PEG, p-MoS2/n-rGO-MnO2-PEG nanoplates exhibit enhanced DCF
fluorescence and they detected an increase of hypoxia due to increased apoptosis under the influence
of NIR light.
Liang et al. [89] synthesized gold-coated NPs coupled to MnO2 NPs (AuNC@MnO2, AM). Sufficient
oxygenation in the tumour site reduced local hypoxia. In addition, the O2-enhanced effect of PDT AM
not only effectively destroyed the primary tumour in vivo, but also caused the death of immunogenic
cells (ICD) with the release of damage-related molecular patterns (DAMP), which subsequently caused
maturation of DC and activation of effector cells, thereby causing a systematic inducing antitumour
immune responses against mTNBC. In vitro analyses in 4T1 cells showed a high increase of ROS
production and cell apoptosis after treatment with AM under NIR irradiation (808 nm, 0.8 W∙cm −2, 3
min). In vivo studies in 4T1 tumour-bearing mice showed a high inhibition of tumour growth after AM-
PDT treatment. Moreover, they observed that AM could also destroy tumour metastasis.
76
To enhance cancer PDT, a mitochondrial-directed multifunctional MnO2 NP with a dye (IR808) was
developed (IR808 @ MnO NP) by Zhou et al. [90] (Figure 16).
Figure 16. Synthetic route of MnO@OA, MnO@NH 2, and IR808@MnO. Reprinted from [90] with permission from
John Wiley and Sons, Copyright 2018.
In this nanoplatform, IR808 acted as targeting ligand, eventually moving into mitochondria. Large
amounts of ROS were formed during the reaction between H 2O2 and MnO2 NPs. The results, in MCF-7
cancer cells, showed that IR808@MnO NPs improved the hypoxia environment of the tumour,
generating a large amount of ROS. Moreover, a high in vitro PTT/PDT efficiency (808 nm, 0.5 W∙cm−2, 5
min) was observed by treatment with IR808@MnO NPs with a significant decrease of cell viability (6%)
under acidic conditions. In vivo in MCF-7 tumour-bearing mice, IR808@MnO NPs highlighted a
significant phototoxicity with no tumour recurrence for all treated-mice and an improvement of hypoxia
in tumour.
HSA-MnO2-Ce6 woofers were prepared by Lin et al. [91]. HSA-MnO2-Ce6 NPs generated O2 when
reacting with H2O2 at endogenous levels. In addition, 1O2 generation was doubled due to the use of
HSA-MnO2-Ce6 NPs instead of HSA-Ce6 NPs in the presence of H2O2 with 660 nm laser illumination.
In vitro mouse bladder cancer cells (MB-49) viability tests showed that HSA-MnO2-Ce6 NPs themselves
were non-toxic, but significantly enhanced the effects of PDT on bladder cancer cells (MB-49) during
laser irradiation (660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min). O2 content in orthotopic bladder cancer increased by 3.5
times after the introduction of HSA-MnO2-Ce6 NPs compared with the previous introduction of HSA-
Ce6 NPs without MnO2. Given the superior tumour targeting and low toxicity, HSA-MnO2-Ce6 NPs
were then used for the PDT treatment of orthotopic bladder cancer (660 nm, 200 mW∙cm−2, 15 min). PDA
with HS of HSA-MnO2-Ce6 NPs showed significantly improved therapeutic efficacy and significantly
increased the lifespan of mice compared with the control group.
Wang et al. [92] developed pH/H2O2 responsive nanocomplexes composed of Si QDs linked by
electrostatic interaction to BSA-Ce6 to form BSA-Ce6-Si QDs (BCS) coated with MnO2 on the surface of
BSA to obtain blocked-cell shared-memory (BCSM NPs). In the same conditions as TME (H 2O2, pH =
6.5), BCSM NPs showed a high production of O2 and thus of 1O2 which was higher than Ce6 alone. PDT
treatment (638 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min) with BCSM NPs in vitro in HeLa cells conducted to a significant
decrease of cell viability (20 %) and a high production of 1O2 was observed. In vivo PDT experiments in
HeLa tumour-bearing mice showed that the growth of tumours was effectively inhibited under light
exposure (638 nm, 5 mW∙cm−2, 5 min).
Zhu et al. [93] synthesized hybrid semiconductor NPs (SPN-Ms) composed of semiconducting
polymer NPs (SPN) as a core and MnO2 nanosheets as a shell. The SPN core served as the NIR agent for
fluorescence imaging and PDT, while the MnO2 nanoribbons as O2 formation agent. SPNs were coated
with different amounts of MnO2 and the SPN-M1 (1 w/w% of MnO2) generated 2.68 times more 1O2 than
uncoated SPN (SPN-0) under hypoxic conditions under NIR laser irradiation (0.44 W∙cm−2). In vitro and
in vivo in 4T1 cells model, SPN-M1 exhibited a high PDT (808 nm, 5 min, in vitro: 0.44 W∙cm −2 and in
vivo: 0.3 W∙cm−2) efficiency.
77
Zhu et al. [94] designed a multifunctional theranostic NP (NMOFs@BSA/SDs@MnO2) with nanoscale

metal organic frameworks (NMOFs, composed of TCPP as ligand and Fe 3+), bovine serum albumin
(BSA) and sulfadiazines (SDs), to provide actively targeting for the over-expressed carbonic anhydrase
IX (CA IX) in tumour cells, and MnO2. NPs presented an average hydrodynamic diameter of 122 nm
and its ability to produce O2 was also proved. In vitro in 4T1 cells, NMOFs@BSA/SDs@MnO2 under laser
irradiation (660 nm, 50 mW∙cm−2, 15 min) induced a high decrease of cell viability with a production of
ROS due to H2O2 decomposition. In vivo in 4T1 bearing mice highlighted a significant inhibition of
tumour growth by PDT treatment (660 nm, 50 mW∙cm−2, 15 min) with NMOFs@BSA/SDs@MnO2.
Liu et al. [95] developed NPs based on black phosphorus nanocomposite as PS. The NPs (R-MnO2-
FBP) were composed by assembly of MnO2 encapsulating in Rhodamine B (RhB) (R-MnO2) for O2
generator and fluorescein isothiocyanate (FITC)-labelled peptide-functionalized black phosphorus
(FBP) as PS. It was shown that the O2 release was proportional to the liberation of Mn2+ and RhB in the
R-MnO2-FBP system. Under irradiation (660 nm), R-MnO2-FBP presented ϕΔ of 9.9% which remained
stable in hypoxic conditions. After delivery of R-MnO2-FBP into cancer cells in acidic and H 2O2-rich
environment, the generation of O2 was observed and PDT treatment in hypoxic cells conducted to 51.6%
of cell (HeLa cells) apoptosis under laser irradiation (660 nm, 150 mW∙cm−2, 3 min). In vivo experiments
in HeLa-bearing mice with R-MnO2-FBP highlighted the ability of R-MnO2-FBP to enhance PDT
treatment (660 nm, 150 mW∙cm−2, 10 min).
Several teams have studied the use of MnO2 NPs to improve combined therapies by designing self-
oxygenated systems. We report three teams who described the interest of MnO 2 to improve PTT/PDT
synergistic therapy.
Cao et al. [96] developed intelligent NPs to overcome limitations of dual PDT and PTT treatment.
The NPs were constituted by a MnO2 nanosheet decorating at the surface with Cu2-xS (MnO2/Cu2-xS) and
then loaded with siRNA (siRNA-small interfering RNA) to finally formed MnO2/Cu2-xS-siRNA. In an
acidic microenvironment, the MnO2 tumour was reduced to the Mn2+ ion and triggered the
decomposition of H2O2 to O2 to facilitate tumour hypoxia. Reduced Mn2+ ions significantly enhanced
the contrast of MRI, and Cu2-xS acted as a powerful PA and PT imaging agent, which led to accurate
trimodal tumour-specific imaging and detection. In vitro studies in MCF-7 and A549 cells were
performed. Under NIR irradiation (980 nm, 0.72 W∙cm−2, 5 min), MnO2/Cu2-xS NPs showed a high
phototoxicity with a cell viability of only 29.68% due an effective synergistic PTT/PDT effect. In vivo
studies in B16 tumour-bearing mice highlighted a high inhibition of tumour growth for mice treated
with MnO2/Cu2-xS-siRNA and NIR irradiation ((980 nm, 0.72 W∙cm−2, 5 min) proving an enhancement
of PTT/PDT treatment with a high increase of 1O2 due to H2O2 decomposition by MnO2.
Yin et al. [97] coated uniformly carbon nanotubes (CNTs), as PTT agent with cross-linked MnO2
flakes, as O2 generator, MnO2/CNTs (MCs) and incubated with Ce6 to give Ce6-MnO2/CNTs (CMCs)
for PTT/PDT therapy. This system could, in the TME, release Ce6 and CNTs while generating O 2 by
reaction of MnO2 with endogenous H2O2 and H+. In TME-mimetic conditions, the photothermal effect
of CMCs and 1O2 generation under laser irradiation (PTT: 808 nm, 1.0 W∙cm−2 and PDT: 660 nm, 0.5
mW∙cm−2) was observed. In vitro in HeLa cells, CMCs showed a high phototoxicity and a strong
production of 1O2 under irradiation (660 nm, 1.0 W∙cm−2, 5 min). The synergistic PTT/PDT effect of CMCs
was highlighted in vivo in HeLa tumour-bearing mice irradiated with 808 + 660 nm (1.0 W∙cm−2, 10 min)
with eradication of tumours.
In 2019 Liu et al. proposed [98] new MnO2-based nanotherapeutic agents (honeycomb
MnO2/IR780/BSA NPs, HMIB NPs) for NIR-activatable and self-oxygenated PTT/PDT. HMIB NPs
exhibited efficient 1O2 production under NIR irradiation (785 nm, 20 mW∙cm−2) and PT effect (785 nm,
0.3 and 1.0 W∙cm−2, 6 min). In vitro in HepG2 and 3T3 cells, the authors showed that the irradiation of
cells with a higher power (785 nm, 1 W∙cm−2) after incubation with HMIB NPs led to more cell death
than irradiation at 785 nm and 50 mW∙cm−2 due to the PT effect. In vivo, HepG2 tumours could be
completely eliminated when increasing the laser power density from 0.3 to 1 W∙cm −2, which could be
attributed to the synergy of PDT and PTT.
78
We report two studies about the use of MnO2 to improve chemo-PDT synergistic therapy. Chen et
al. [99] synthesized HSA-MnO2-Ce6 & Pt NPs (HMCP) constituted by MnO2 nanoclusters coated to HSA
modified with Ce6 or with a prodrug of cis-Pt (c,t,c-[Pt(NH3)2 -(O2CCH2CH2COOH)(OH)Cl2] (cis-
Pt(IV)SA)). These NPs were sensitive to pH/H 2O2 using a simple one-step albumin-based
biomineralization method for effective combination therapy. Once inside the tumour, MnO 2
nanoclusters in HMCP NPs decreased hypoxia. Meanwhile, the reaction of MnO2 with H+ and H2O2 in
TME led to the gradual decomposition of these albumin-MnO2 NPs into separate therapeutic albumin
complexes with sizes less than 10 nm in order to achieve significantly improved intra-tumour interstitial
diffusion for optimized treatment of tumours. As a result of these effects, large in vitro antitumour
therapeutic results in 4T1 cells were achieved after combined PDT (660 nm, 5 mW∙cm −2, 30 min) and
chemotherapy using HMCP NPs by a single treatment at a rather low dose. In vivo studies were
performed in 4T1 tumours-bearing mice and a significant decrease of hypoxia was also observed in
presence HMCP NPs by using pimonidazole. In vivo studies of the efficiency of HMCP combined to
light irradiation (660 nm, 5 mW∙cm−2, 1 h) highlighted an increase of tumour growth inhibition.
Zhang et al. [100] developed an O2-generating and pH-sensitive nanoplatform, loading MnO2 for O2
generation, g-C3N4 for PDT, ZIF-8 (zeolitic imidazolate frameworks) for drug encapsulation and
doxorubicin hydrochloride for chemotherapy (Figure 17).
Figure 17. a) Schematic illustration of the fabrication of FMZ/DC nanocomposites. The diagram is not drawn to
scale. b) Schematic illustration of FMZ/DC with O2 generation enhancing the chemo-PDT under 660 nm light
irradiation. Reprinted from [100] with permission from John Wiley and Sons, Copyright 2018.
In vitro experiments in 4T1 cells showed a higher therapeutic effect using the NPs compared to
therapy without MnO2 nanodot in hypoxic conditions or only with chemical and PDT (660 nm, 5
mW∙cm−2, 30 min) with the presence of MnO2 nanodot. In vivo experiments also showed that NPs could
reduce tumour hypoxia and improve the effect of photodynamic and chemotherapeutic treatment. 4T1
tumours could be very effectively eliminated using the developed NPs when irradiated with light (660
nm, 5 mW∙cm−2, 30 min).
Two others studies about the use of MnO2 to improve combined therapies have been described.
Fan et al. [101] were the first to propose intelligent MnO2 nanosheets, anchored with UCNPs, to
simultaneously visualize and treat solid tumours after X-ray/light excitation. After NIR illumination of
the quenched UCNP, luminescence of the UCNPs was enhanced after the decomposition of MnO 2 into
Mn2+ by acidic H2O2 in the tumours (Figure 18).
79
Figure 18. Schematic illustration of the decomposition of MnO2 nanosheets arising from the redox reaction between
UCSMs and acidic H2O2, which led to the enhanced UCL imaging for diagnosis/monitoring as well as the massive
O2 generation for improving the synergetic PDT/RT effects. Reprinted from [101] with permission from John Wiley
and Sons, Copyright 2015.
Hypoxic murine breast cancer, hc-4T1 cells, were used. No killing could be observed after X-ray (5
Gy, 5 min) or light irradiation (NIR, 1.5 W∙cm−2, 5 min). After addition of the compound, cell death could
be observed after PDT (UCSMs + NIR) and RT (UCSMs + RT) due to the O 2 generation. Moreover, after
NIR and X-ray, the lowest cell viability would be detected showing the synergetic PDT/RT effects. The
same effect was detected in vivo in 4T1 solid tumour (PDT: NIR, 2 W∙cm−2, 10 min and RT: 8 Gy, 5 min).
In vivo PA imaging was performed to evaluate the vascular saturated O2 by evaluating oxygenated and
deoxygenated Hb. Injection of UCSMs increased the signal intensity of oxygenated/deoxygenated Hb
but also enhanced O2 by about 7%. Moreover, addition of UCSMs induced a down-expression of HIF-
1α, due to the decreased hypoxia and increased oxygenation.
He et al. [102] proposed a glutathione-activatable and O2/Mn2+-Evolving NPs for both PDT and gene-
silencing therapy (GAOME N). This system consisted of the MnO2 cellular nanocarrier (hMnO2) loaded
with catalase, Ce6, and foliar-tag DNAzyme. After endocytosis, hMnO2 carriers were reduced by
overexpressed GSH to Mn2 + ions, which led to a decrease of GSH level and the breakdown of GAOME
NC. Then, the released catalases triggered the cleavage of endogenous H 2O2 with the formation of O2.
The formation of O2 and the consumption of GSH effectively increased the efficiency of PDT. In
addition, the DNAzyme was released to silence the genes in the presence of self-generated Mn2 + ions as
cofactors. Rational synergy of enhanced PDT and gene therapy led to a significant increase in the
effectiveness of cancer treatment in vitro (MCF-7 cell line, 635 nm, 30 mW∙cm−2, 5 min) and in vivo
(MCF-7 tumour-bearing mice, 635 nm, 100 mW∙cm−2, 5 min).
Another type of NPs was able to catalyse H 2O2 to produce O2 as well as being a contrast agent for
both MRI and fluorescence imaging: carbon dot [103]. Jia et al. synthesized Mn-carbon dots (CDs) by a
solvothermal approach with Mn(II) phthalocyanines (Mn-Pc) and cooperative self-assembly with DSPE-
PEG. The hydrodynamic diameter of this Mn-CD assembly was around 162 nm. Mn(II) could be
oxidized to MnO2 that led to the catalytic decomposition of H2O2. Formation of O2 was observed when
Mn-CD was in acidic H2O2 solution whereas no O2 was produced in the absence of H2O2 or Mn-CD. In
acidic media, the O2 bubbles were even more abundant. Mn-CD assembly totally disassembled in acidic
H2O2 solution forming free Mn-CD. By ESR technique in solution and using SOSG probe in vitro in
HeLa cells, they proved the formation of 1O2 even in hypoxic conditions. For PDT experiments (635 nm,
50 mW∙cm−2, 10 min) the cells were cultured in an acid medium (pH = 6.5) with addition of H 2O2. 99%
mortality rate could be observed whereas with CD without Mn, no PDT effect could be observed (no
PS). In vivo PDT efficiency was evaluated in subcutaneous 4T1 tumour-bearing female nude mice (635
nm, 50 mW∙cm−2, 10 min). With Mn-CD the tumour was completely inhibited and no recurrence could
be observed. All the mice survived over 60 days.
(Table 6)
80
Table 6. Summary of publication about the decomposition of H2O2 by MnO2.
Ref Application Catalyst O2 PS Energy of excitation Type of In vitro In vivo

source ROS
[76] PDT Mn (II) H2O2 BODIPY derivatives 500-600 nm, 15 min 1O2, •OH HepG-2 cell
complex and others line
ROS
[77] PDT MnO2 H2O2 Ce6 In vitro: 661 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
In vivo: 661 nm, 5 mW∙cm−2, 1 h bearing mice
[78] PDT MnO2 H2O2 DVDMS In vitro: 630 nm, 75 mW∙cm−2, 5 min 1O2 MCF-7 cell MCF-7
In vivo: 630 nm, 300 mW∙cm−2, 8 min line tumour-
bearing mice
[79] PDT MnO2 H2O2 ICG In vitro: 808 nm, 0.5 W∙cm−2, 10 min 1O2 SCC-7 cell SCC7
In vivo: 808 nm, 0.8 W∙cm−2, 10 min line tumour-
bearing mice
[80] PDT MnO2 H2O2 HMME In vitro: 532 nm, 1.5 W∙cm−2, 2 min 1O2 MCF-7 cell S180 tumour
In vivo: 808 nm, 1.5 W∙cm−2, 1.5 min line model
[81] PDT manganese H2O2 Ce6 In vitro: 670 nm, 0.5 W∙cm−2, 30 s 1O2 U87 MG U87 tumour-
ferrite NPs In vivo: 670 nm, 0.8 W∙cm−2, 5 min cell line bearing mice
[82] PDT MnO2 H2O2 HPPH In vitro: 10 mW∙cm−2, 1 min U87MG cell U87MG
In vivo: 630 nm, 10 mW∙cm−2, 10 min line tumour-
bearing mice
[83] PDT MnO2 H2O2 MB 650 nm, 100 mW∙cm−2, 15 min 1O2 HeLa cell U14 tumour-
and H+ line bearing
mice
[84] PDT MnO2 H2O2 Ce6 808 nm, 0.4 W∙cm−2, 60 min 1O2 B16F10 cell No
nanosheets line
[85] PDT MnO2 H2O2 Ce6 In vitro: 980 nm, 0.5 W∙cm−2, 10 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
In vivo: 660 nm, 0.5 W∙cm−2, 30 min bearing mice
[86] PDT MnO2 H2O2 CD In vitro: 635 nm, 100 mW∙cm−2, 30 min 1O2 HeLa cell 4T1-tumour-
In vivo: 635 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min line bearing mice
81
Table 6. Cont.

source ROS
[87] PDT MnO2 H2O2 Ce6 660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min 1O2 HeLa cell No
line
[88] PDT MnO2 H2O2 PEGylated p–n 980 nm, 0.4 W∙cm−2, 5 min 1O2 HeLa cells
heterojunction nanosheets and HEK
293 cell
lines
[89] PDT MnO2 H2O2 Gold nano-cage (AuNC) 808 nm, 0.8 W∙cm−2, 3 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
bearing mice
[90] PDT MnO NP H2O2 IR808 808 nm, 0.5 W∙cm−2, 5 min 1O2 MCF-7 cell MCF-7
line tumour-
bearing mice
[91] PDT MnO2 H2O2 Ce6 In vitro: 660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min 1O2 MB-49 Mice with
In vivo: 660 nm, 200 mW∙cm−2, 15 min orthotopic
bladder cells
[92] PDT MnO2 H2O2 Ce6 In vitro: 638 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min 1O2 HeLa and HeLa
In vivo: 638 nm, 5 mW∙cm−2, 5 min HepG-2 cell tumour-
lines bearing mice
[93] PDT MnO2 H2O2 Poly(cyclopentadithiophene In vitro: 808 nm, 0.44 W∙cm−2, 5 min 1O2 4T1 cells 4T1 tumour-
and H+ -alt-benzothiadiazole) In vivo: 808 nm, 0.30 W∙cm−2, 5 min bearing mice
(PCPDTBT)
[94] PDT MnO2 H2O2 NMOFs composed by TCPP 660 nm, 50 mW∙cm−2, 15 min .OH 4T1 cells 4T1 tumour-
and Fe3+ bearing mice
[95] PDT MnO2 H2O2 FBP In vitro: 660 nm, 150 mW∙cm−2, 3 min 1O2 HeLa cell HeLa tumour-
and H+ In vivo: 660 nm, 150 mW∙cm−2, 10 min line bearing mice
[96] PTT/PDT MnO2 H2O2 Cu2-xS 980 nm, 0.72 W∙cm−2, 5 min 1O2 MCF-7 and B16
A549 cell tumour-
lines bearing mice
[97] PTT/PDT MnO2 H2O2 Ce6 808 + 660 nm, 1.0 W∙cm−2, 10 min 1O2 HeLa cell HeLa tumour-
and H+ line bearing mice
82
Table 6. Cont.

source ROS
[98] PTT/PDT MnO2 H2O2 IR780 785 nm 1O2 HepG2 and HepG2
and H+ PDT: 50 mW∙cm−2 3T3 cell tumour-
PTT/PDT: 0.3 to 1.0 W∙cm−2 lines bearing mice
[99] Chemo-PDT MnO2 H2O2 Ce6 In vitro: 660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
In vivo: 660 nm, 5 mW∙cm−2, 1 h bearing mice
[100] Chemo-PDT MnO2 H2O2 g-C3N4 660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
and H+ bearing mice
[101] PDT MnO2 H2O2, Silicon phthalocyanine In vitro: NIR, 1.5 W∙cm−2, 5 min 1O2 hc-4T1 cell 4T1 tumour-
nanosheets H+ dihydroxide (SPCD) In vivo: NIR, 2 W∙cm−2, 10 min line bearing mice
[102] PDT and O2/Mn2+- H2O2 Ce6 In vitro: 635 nm, 30 mW∙cm−2, 5 min 1O2 MCF-7 cell MCF-7
gene-silencing evolving In vivo: 635 nm, 100 W∙cm−2, 5 min line tumour-
therapy nanocomposite bearing mice
[103] PDT Mn-Carbon H2O2 Mn-Pc 635 nm, 50 mW∙cm−2, 10 min 1O2 HeLa cell 4T1 tumour-
dot line bearing mice
BODIPY: 4,4-difluoro-4-bora-3a,a-diaza-s-indacene; Ce6: Chlorin e6; DVDMS: sinoporphyrin sodium; ICG: Indocyanine green; HMME: hematoporphyrin monomethyl
ether; HPPH: 2-devinyl-2-(1-hexyloxiethyl)pyropheophorbide; MB: methylene blue; CD: carbon dot; NMOFs: nanoscale metal organic frameworks; TCPP:
carboxyphenyl-porphyrin; FBP: fluorescein isothiocyanate (FITC)-labelled peptide-functionalized black phosphorus; g-C3N4: Graphitic carbon nitrides; Mn-Pc: Mn(II)
phthalocyanines.
83
3.1.2. Catalase
Catalase is a natural enzyme. Catalase has a specific catalytic behaviour and is able to decompose
endogenous H2O2 to produce O2 bubbles in the tumour tissue. It can then be used to regulate tumour
hypoxia. However, it is not very stable in the presence of proteases in the blood circulation and systemic
administration is compromised. In order to protect catalase, one solution can be its encapsulation or
coupling to inorganic or organic NPs. That will be the aim of the next paragraph.
As far as we know, the first paper developing this strategy was written by Chen et al. [104]. They
synthesized multifunctional NPs composed of catalase (encapsulation efficiency 13.1%) into a PLGA
(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) NP with MB as a PS (encapsulation efficiency 19.51%), a black hole
quencher-3 (BHQ-3) as an energy quencher of excited PS and a targeting unit (RGDfK) for α vβ3 integrin
targeting. The average hydrodynamic diameter of the HAOP NP was 205 nm measured by DLS. In the
presence of H2O2, formation of O2 bubbles induced the destruction of the HAOP NPs shell and the
release of MB. Using SOSG, they also demonstrated the formation of 1O2 in the presence of H2O2 after
635 nm excitation (100 mW∙cm−2, 5 min) of the HAOP NPs, which was negligible for HAOP NPs without
H2O2 and NPs without catalase. PDT efficacy was performed with light of 635 nm (100 mW∙cm−2, 5 min)
on U87-MG cell line. After illumination, the apoptotic cells were 98.2% for cells treated with HAOP NPs
and only 15.8 % for cells treated with HAOP NPs without catalase. A lysosome-associated pathway
could be concluded using acridine orange as a marker of lysosome integrity. A commercially available
O2 probe ([Ru(dpp)3]Cl2) allowed to detect intracellular O2 which increased after incubation with HAOP
NPs. The group treated with HAOP NPs without catalase showed high level of HIF-1α whereas the
group treated by HAOP NPs showed very week level expression due to generated O2 that overcame the
hypoxia. In vivo PDT was realized on BALB/c mice bearing U87-MG tumour. As expected after HAOP
NPs injection, the tumour growth was totally inhibited which was not the case for all the control groups.
After release from the NPs, catalase could generate high level of O2.
Zhang et al. in 2016 [105] designed core-shell gold nanorod (APMECR@MB NC) (diameter of 75 nm)
covered with phenyl mesoporous silica loaded with [Eu(THA) 3(phen)] to trigger MB via luminescence
resonance transfer, a catalase was covalently coupled to the surface via its amino group and conjugated
to a targeting peptide (cRGD). Thanks to the overlap between emission spectrum of Eu(THA) 3(phen)
and absorption spectrum of MB, high energy transfer could happen upon 808 nm excitation between
Eu(THA)3(phen) and MB estimated to be 96.1%. With DPBF, it was possible to conclude to the formation
of 1O2. APMECR@MB NC produced O2 bubbles in the presence of H2O2. Prostatic cancer cell lines (PC-
3) were cultured in hypoxic incubator. Using DCFH-DA, 1O2 could be detected after incubation with
APMECR@MB NC whereas little or no 1O2 could be detected after incubation with free MB or
APME@MB without catalase. Pork tissues of various thickness were used and placed between the
excitation source (808 nm, 1000 mW∙cm−2 for 5 min) and the PC-3 cells. The authors proved that there
was a synergistic PTT/PDT of PC-3 cells with the use of APMECR@MB.
Hu et al. [106] used a zeolite with mesoporous structure (531 nm) as a nanocarrier to immobilize
catalase and MB (ZCM NPs). The catalase loaded in the zeolite was still efficient and kept 90% of
enzymatic activity compared to free catalase. As expected, in closed tubes, it was possible to detect O 2
formation in the presence of ZCM NPs and H2O2. In vitro detection of 1O2 with SOSG revealed that the
1O2 formation was 3.7 higher for the ZCM treated group than the group’s zeolite or zeolite-MB.
Formation of O2 upon decomposition of in situ H2O2 thanks to the presence of the NPs was 4.8-fold
higher than without NPs and allowed the release of MB. The PDT experiments were performed on
athymic nude mice with SW1990 with laser at 635 nm, 50 mW∙cm−2 for 10 min. They could observe a
total inhibition of tumour growth at 18 days, which was not possible under other conditions (control,
light only, ZCM only) (Figure 19).
84
Figure 19. In vivo PDT in xenograft mice models with SW1990 PC. Survival rates of mice bearing SW1990 tumours
after different treatments. (*) p < 0.05, (**) p < 0.01. Group 1-PBS, Group 2-laser, Group 3-ZCM nanocapsule, Group
4-free MBlaser, Group 5-zeolite-MB-laser, and Group 6-ZCM nanocapsule-laser (n = 5 per group). Adapted from
Hu et al. [106].
Cheng et al. [107] described catalase incorporated into a nanoscale metal-organic framework
(NMOF) composed of a cancer cell membrane and a cytoskeleton-like porous zeolitic imidazole
framework with AlPcS4 (Al(III) phthalocyanine chloride tetrasulfonic acid) (10.6 %). The core-shell
structure had size of about 110 nm and an outer lipid bilayer shell of 7.2 nm. After irradiation at 660 nm
(30 mW∙cm−2, 1 min) of HeLa cells in presence of CAT-PS-ZIF@Mem, 75.6 % of the cells died whereas
only 12.28% died when exposed to PS-ZIF@Mem without catalase. BALB/c-nu mice with HeLa cells
were used as tumour model. HIF-1α staining assay was used to evaluate the tumour hypoxic conditions.
As expected the group treated with CAT-PS-ZIF@Mem presented low signal (low hypoxia) whereas the
group treated with PS-ZIF@Mem without catalase presented high signal. For PDT experiments (660 nm,
220 mW∙cm−2, 5 min) the tumour growth was significantly inhibited showing that the CAT-PS-
ZIF@Mem NPs have a high phototoxicity and that the formation of O2 thanks to decomposition of H2O2
improved PDT efficiency.
Combination therapy is also possible. Chen et al. [108] described self-assembly of HSA in which they
covalently coupled Ce6 (2.6 %) and encapsulated catalase and a chemotherapeutic drug the paclitaxel
(PTX) (6.5 %). The NPs HSA-Ce6-Cat-PTX showed spherical structure of around 100 nm of diameter.
They proved that HSA-Ce6-Cat-PTX NP produced more O2 in the presence of H2O2 than HSA-Ce6-Cat
may be due to some loss of activity of the catalase in HSA-Ce6-Cat. In HSA-Ce6-Cat-PTX NPs, the
entrapped catalase maintained around 70% of its initial enzymatic activity. Moreover, the generation of
1O2 by HSA-Ce6-Cat-PTX detected with SOSG was higher in the presence of H 2O2 due to the additional
O2 supply. In vitro experiments were performed in 4T1 cells with 660 nm light (5 mW∙cm−2, 30 min).
Compared with PDT alone, chemotherapy alone or both, the combination treatment under light
irradiation proved to be the best. After light illumination, the release of PTX into the cytoplasm
improved the PDT effect. Under nitrogen atmosphere and addition of HSA-Ce-cat was not able to
induce PDT effect whereas HSA-Ce6-Cat-PTX had a very good cancer cell killing efficiency. Female
nude mice bearing 4T1 tumours were used for in vivo tests. To check the hypoxia into the tumour, (HIF)-
1α and pimonidazole were used. Both HSA-Ce6-Cat-PTX and HSA-Ce6-Cat showed significant
decreased hypoxia signals compared to the control. After PDT (660 nm, 5 mW∙cm −2, 60 min) the most
effective tumour growth inhibition was observed for mice treated with HSA-Ce6-Cat-PTX compared to
PDT alone or chemotherapy alone. To sum up, HSA-Ce6-Cat-PTX NPs accumulated into the tumour
then decomposed, PTX was released, catalase decomposed endogenous H 2O2 to produce O2, PDT
induced the disruption of lysosomes and the PTX distributed into cytoplasm.
Yang et al. [109] also designed a very smart multifunctional NPs in which they encapsulated catalase
in hollow silica NPs, with covalently coupled Ce6, covalently coupled CTPP (3-
85
carboxypropyl)triphenylphosphonium bromide) to target mitochondria and modified with an acidic

pH responsive charge-convertible DPEG polymer (in acidic conditions, the DPEG polymer had
positives charges that enhance tumour cell internalization) and programmed death-ligand 1 (PD-L1)
antibody to promote the infiltration of T lymphocytes in metastasis. The obtained CAT@S/Ce6-
CTPP/DPEG had a size of around 100 nm with a shell thickness of 12 nm. Comparing O2 formation in
solution in the presence of H2O2, they could observe a rapid O2 formation for CAT@S/Ce6-CTPP/DPEG
compared to the control BSA@S/Ce6-CTPP/DPEG. CAT@S/ Ce6-CTPP/DPEG kept 70% of its initial
activity compared to free catalase in the presence of protease. Thanks to SOSG, they also observed the
increase in 1O2 formation in solution with CAT@S/Ce6-CTPP/DPEG excited at 660 nm in the presence of
H2O2 compared to the absence of H2O2. 4T1 cells were used for in vitro tests (660 nm, 5 mW∙cm−2, 60
min). The cell killing efficiency was higher after incubation with CAT@S/Ce6-CTPP/DPEG compared to
BSA@S/Ce6-CTPP/DPEG. Confocal microscopy imaging revealed a specific intracellular targeting of
mitochondria. Oxygenation level was increased with CAT@S/Ce6-CTPP/DPEG compared to the control
and the use of pimonidazole proved the decrease of hypoxia. PDT efficiency was also the best for
CAT@S/Ce6-CTPP/DPEG (660 nm, 5 mW. cm−2, 60 min). Very interestingly, thanks to the programmed
death-ligand 1 (PD-L1) antibody, they showed that PDT plus anti-PD-L1 treatment was able to stop the
progression of tumours that were not irradiated (1-2 cm away).
Shen et al. [110] synthesized pH-responsive aerobic NPs made of interaction of negatively charged
catalase with positively charged chitosan. The resulting micelles (C&C) were used to encapsulate Ce6
and the size of the C&C-Ce6 was 68.5 nm. In acidic environment, the disassembly of the NPs led to the
release of Ce6 (75% after 80 h) as well as the release of catalase. They showed that the formation of 1O2
after addition of H2O2 was higher in acidic media due to the release of both Ce6 and catalase in contact
of H2O2. In vitro phototoxicity was evaluated in squamous cell carcinoma CAL-27 (650 nm, 100
mW∙cm−2, 10 min). IC50 was found to be 15.33 mg·mL−1 for free Ce6 and 12.02 mg∙mL−1 for catalase + Ce6
mixture and only 4.03 mg∙mL−1 for C&C-Ce6. The percentage of apoptotic cell after PDT treatment for
PBS, Ce6, chitosan + Ce6, catalase + Ce6 and C&C-Ce6 NPs were respectively 9.38%, 78.57%, 76.7%,
86.09% and 94.31% showing the important role of catalase that induced higher formation of 1O2. Female
BALB/c mice bearing CAL-27 tumour (650 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min) were chosen for in vivo
experiments. After 14 days after the treatment, the tumour volumes for PBS, Ce6, chitosan + Ce6,
catalase + Ce6 and C&C-Ce6 NPs were respectively 1.87±0.14 cm3, 1.04±0.09 cm3, 0.99±0.15 cm3, 0.96±0.12
cm3 and 0.52±0.11 cm3, in good agreement with in vitro results. The lowest amount of hypoxia-inducible
factor HIF-1α was found as expected for the C&C-Ce6 NPs treated mice.
Zhao et al. [111] described graphitic-phase mesoporous carbon nitride nanosheet (mpg-C3N4, MCNs)
in which hematoporphyrin monomethyl ether (HMME) and catalase were wrapped into the 5 nm pores.
HA was covalently coupled to the nanosheet. They checked that catalase still kept its activity when it
was encapsulated. The best HMME loading was obtained with a feed rate HMME/MCNs of 3/1. A
strong incorporation of HA@mgp-C3N4-HMME/CAT into murine melanoma B16-F10 cell line could be
observed by confocal microscopy and the apoptosis rate was higher than all the others conditions
((HA@mgp-C3N4 + LED, HMME, HA@mgp-C3N4-HMME, HA@mgp-C3N4-HMME/CAT) after light
illumination (LED, 3000 mW∙cm−2 for 2 min). In female C57 mice, the in vivo results were in good
agreement with the in vitro ones, the authors could detect enhanced inhibition of tumour growth after
injection (i.v.) of HA@mgp-C3N4-HMME/CAT, and light illumination compared to all the others groups.
Using pimonidazole, reduced hypoxia could be detected in tumours from mice injected with HA@mgp-
C3N4-HMME/CAT thanks to the formation of O2 through the decomposition of H2O2 compared to mice
injected with HA@mgp-C3N4-HMME and irradiated.
Another idea is to target proinflammatory-activated macrophages that are involved in chronic
inflammation and also known to generate H2O2 to destroy undesirable invaders [112]. Lu et al. [113]
developed selenium NPs (SeNPs) coated with a first layer of chitosan(CS)-RB-GSH, a thiolate catalase
(CAT) covalently coupled to this first layer and a second layer of HA-ethylene diamine(EDA)-folic
acid(FA). HA and FA were respectively CD44 and FR-b targeting agent over-expressed on cell surfaces
of activated macrophages. The size of the NPs was 148.4±7.2 nm. 1O2 detection was performed by
86
electronic paramagnetic resonance (EPR) and using 9,10-diphenylanthracene (DPA) and was more
important in the presence of H2O2. The NPs presented high specificity for activated macrophages
compared to normal macrophage. In RAW 264.7 (mouse macrophages) and under light illumination
(green LED array, 40 mW∙cm−2, 10 min) a decrease of cell viability could be observed (43.3% cell
viability) with SeNPs and 32.8% with CAT/SeNPs. Using CAT/SeNPs led to H 2O2 depletion and
inhibition of activation and proliferation of macrophages.
Ouyang et al. [114] proposed the use of thylakoid membrane which was able to catalycally
decompose H2O2 to produce O2 thanks to its membrane-related catalase [115]. With mechanical
grinding, chloroplasts were extracted from spinach leaves. They underwent hypotonic lysis to release
thylakoids. After extrusion, nanovesicle biomimetic nanothylakoids (NT) were obtained with a
membrane thickness of around 9 nm and a size of around 50 nm. In hypoxic conditions and in the
presence of H2O2 the dissolved O2 concentration increased in solution and H2O2 was catalytically
decomposed. Using SOSG, after 660 nm light excitation (1 W∙cm−2, 5 min), 7.8 more 1O2 was produced
within 5 min. NPs without catalase (LP) was synthesized as a control. In hypoxic environment, NPs
produced larger amount of 1O2 than LP. In 4T1 cancer cells, [Ru(dpp)3]Cl2 quenched fluorescence in
hypoxic environment proved the formation of O2 and SOSG the formation of 1O2. In vivo studies on
tumour-bearing mice injected with NT or LP were performed. The expression of HIF1-a decreased after
NT treatment which was not the case with LP injection, suggesting that tumour hypoxia disappeared
after NT treatment. After PDT (660 nm, 1 W∙cm−2, 10 min) the tumour growth was totally inhibited after
injection of NT whereas with LPs, the tumour growth was only delayed within the first 4 days and even
recurred later.
An original strategy was developed by Wang et al. [116]. Catalase could lose a part of its activity
when encapsulated into NPs. In this paper, they used the acrylate onto the surface of the protein to
enable free radical polymerization of a small PEG as the drafting moiety and Meso-tetra(p-
hydroxyphenyl)porphine (THPP) as a cross linker. The CAT-THPP-PEG nanocapsules showed
spherical morphology with a size of around 25 nm and 30 nm by DLS (Figure 20).
Figure 20. Schematic illustration of the preparation and structure of CAT-THPP-PEG. (b) Hydrodynamic diameters
of catalase, BSA-THPP-PEG and CAT-THPP-PEG in water, PBS and FBS. Reprinted [116] with permission from
Elsevier Ltd, Copyright 2018.
Using SOSG, after light illumination (660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min) they could detect in solution a
high production of 1O2 in the presence of H2O2 both in normoxic and hypoxic media due to the formation
of extra O2. In vitro experiments in 4T1 cells were performed (660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min). As expected,
cell killing increased under hypoxic conditions in presence of CAT-THPP-PEG and not in presence of
the control BAS-THPP-PEG. Antipimonidazole antibody was used to detect hypoxia zones on tumour
slices and revealed a large decrease of tumour hypoxia after CAT-THPP-PEG treatment compared to
BSA-THPP-PEG treatment. In vivo studies in BALB/c mice bearing 4T1 tumours (660 nm, 5 mW∙cm −2,
87
60 min) confirmed the in vitro studies with a large inhibitory effect of the tumour growth after CAT-
THPP-PEG injection.
Another strategy is not to use natural enzyme but nanomaterial-based artificial enzyme. They are
called nanozyms. The advantage is that the requirement of enzyme encapsulation is not needed neither
the controllable release.
In 2017 Liu et al. [117] developed peroxidase amine-terminated PAPAM dendrimer-encapsulated
gold NP with catalase like activity (AuNCs-NH2) and coupled to Protoporphyrin IX (PpIX). They
proved that the AuNCs-NH2 NPs possessed catalase-like activity at pH 4.8-7.4 that could allow H2O2
consumption to form O2 in cytoplasm (pH = 7.4), endosomes (pH = 5.5) or lysosomes (pH = 4) Evidence
of O2 formation was obtained in lung cancer H 460 cells. PDT efficiency (532 nm, 200 mW∙cm−2, 5 J per
well) in hypoxic and normoxic conditions with AuNCs-NH2 and PPIX showed that AuNCs-NH2
overcome cancer cell hypoxia and induced a better PDT efficacy.
Yang et al. [118] in 2018 described a new kind of catalase-mimeting DNAzyme function NP with
AN1411 DNA G-quadruplex/hemin (iron-containing porphyrin)-Ce6 coordinated to calcium ions and
surrounding by poly(L-histidine)polyethylene glycol. AS1411/Ce6 (AC) and AS1411/hemin (AH)
complexes had a size of 10 nm. Thanks to Ca2+ coordination, and poly(L-histidine)- polyethylene glycol
(pHis-PEG) as stabilizing agent, the CACH-PEG NP was elaborated with a size of 70 nm. CACH and
CACH-PEG NP were more efficient in producing 1O2 in the presence of H2O2 under 660 nm light
irradiation than free Ce6. At acidic pH (5.5), the hydrodynamic size of CACH-PEG NP decreased to 12
nm showing the formation of smaller G-quadruplex. In 4T1 cells, the CACH-PEG NP internalized via
endocytosis and Ce6 localized in the nuclei. PDT treatment (660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min) with or without
H2O2 was conducted and as expected, the level of 1O2 produced was higher in the presence of H2O2. In
BALB/c mice bearing 4T1 tumours, 99mTc CACH-PEG NPs showed tumour retention (5.4% of injected
dose per gram of tissue (%ID/g)). Using pimonidazole proved that hypoxia was reduced in the mice
that have been injected with PEG CACH-PEG NPs. After PDT (660 nm, 5 mW∙cm−2, 60 min) the best
inhibition of tumour growth was observed for mice treated with CACH-PEG NP.
Ruan et al. [119] synthesized manganese-iron layered double oxide (MnFe-LDH) that possessed
catalase-like activity and was loaded with MB. The particle size was about 200 nm and thickness of 2.8
nm with 2-3 layers. Under 808 nm laser with high irradiance (1000 mW∙cm−2) for 10 min, the temperature
increased rapidly. In HeLa cells incubated with MnFe-LDH, they detected the formation of O2 by
checking the quenched fluorescence of [Ru(dpp)3]Cl2. In solution using DPBF, 1O2 formation after 650
nm light excitation of MnFe-LDH/MB could be detected and addition of H2O2 in the solutions increased
1O2 formation. With SOSG in HeLa cells, the same results were obtained. The irradiation of HeLa cells
(650 nm, 100 mW∙cm−2 for 10 min) with free MB and MnFe-LDH/MB led to respectively 15% and 40% of
cell death. After irradiation at 808 nm, 51 % cell death was observed. After 650 nm and 808 nm
irradiation, cells treated with MnFe-LDH/MB all died showing the synergistic effect of PTT and PDT.
In female Kunming mice with murine cervical cancer cells (U14) (650 nm, 100 mW∙cm −2 for 15 min and
808 nm 1000 mW∙cm−2 10 min) tumour growth inhibition was moderate after PTT or PDT, whereas the
dual treatment induced an almost total destruction of the tumour. HIF-1α was very low.
Two papers utilized Prussian Blue (PB) NPs that are known for their catalase-like activity and were
FDA approved for clinical application [120,121]. In the first one, Yang et al. [121] described periodic
mesoporous organosilica coated with PB NPs and loaded with Ce6. TESPTS (1,4-
bis(triethoxysily)propane tetrasulfide) was used as organosilica molecule to coat PB NPs. The
hydrodynamic diameter of PB@PMO-Ce6 NPs was about 170 nm. In solution, the mixing of PB@PMO-
Ce6 and H2O2 resulted in the formation of O2 bubbles showing the catalase-like activity of PB@PMO-
Ce6 NPs. In U87MG cells, after irradiation at 660 nm (1000 mW∙cm−2, 5 min), total amount of formed 1O2
was higher for PB@PMO-Ce6 in the presence of H2O2 than with PB@PMO-Ce6 alone PDT in vivo was
investigated in U87MG tumour-bearing mice by intratumoural injection of PB@PMO-Ce6 or Ce6 alone
and 660 nm light (1000 mW∙cm−2, 2 min). Higher formation of 1O2 and apoptotic cells were observed
after PB@PMO-Ce6 treatment than Ce6 treatment. Tumour growth presented a slower rate after Ce6
treatment and was totally broken after PB@PMO-Ce6 treatment.
88
The second paper concerns Wang’s work [120] who used mesoporous silica to coat PB, coated by
PEG and loaded by Zinc phthalocyanine (ZnPc) (Figure 21). The NPs with a PB core and SiO2 shell
surrounding by PEG had a hydrodynamic diameter of around 140 nm (PSP NCs). More than 50% H 2O2
was degraded in the presence of PSP NCs within 1 hour at 25 °C with the apparition of O 2 bubble and
increased at 43 °C. The concentration of O2 formed was 1.95 time higher at 43 °C than at 25 °C.
Figure 21. Schematic of the synthetic procedure and photo-enhanced therapy of the PSPZP NCs. Reprinted from
[120] with permission from Elsevier Ltd, Copyright 2018.
For each PSP particle, it was possible to load 18,800 ZnPc (PSPZP). Using DPBF in hypoxic condition
a significant increase of 1O2 formation was observed after addition of H 2O2. 4T1 cells were incubated
under hypoxia conditions with ([Ru(dpp)3]Cl2. After being treated with PSP NCs, the decrease of the
fluorescence of ([Ru(dpp)3]Cl2 proved the formation of O2. HeLa, A549 (Human lung cancer cells) and
4T1 cells were selected for PDT experiments (671 nm, 400 mW∙cm−2 for 5 min). After incubation with
PSPZP, the cytotoxicity was higher in normoxic than hypoxic conditions. Addition of H2O2 in hydroxic
condition increased cytotoxicity that was even enhanced at 43 °C. In vivo experiments were performed
in 4T1 tumour-bearing mice (671 nm, 400 mW∙cm−2, 5 min) after intravenous injection of PSPZP. The
growth of the tumour stopped which was not the case for PSPZP without light, light, ZnPc + light, PSP
+ light. The reduced pimonidazole fluorescence in tumour slices extracted from mice treated with
PSPZP showed that the tumour hypoxia disappeared. The drawbacks were the low accumulation and
the lack of targeting unit.
Two papers have described the use of Fe(III) for its catalase like-activity. Ma et al. showed that Fe(III)
could have catalase-like activity and could decompose H2O2 to create O2 [122]. They elaborated Fe(III)
doped Graphitic-phase C3N4 nanosheet covalently coupled to a mitochondria- targeting moiety—(4-
carboxybutyl)triphenylphosphonium bromide (TPP)—and loaded with MB on the surface. The C3N4-
Fe-TPP NF/MB NPs in water had a size of 110 nm that moved to 116 nm after 5 days. Fluorescence of
[Ru(dpp)3]Cl2 after addition of H2O2 to C3N4-Fe-TPP NF/MB NPs solution suggested an increase of local
O2 concentration. With DPBF, formation of 1O2 was proven under 650 nm light illumination (100
mW∙cm−2) and in vivo in HeLa cells (650 nm, 100 mW∙cm−2, 15 min) with DCHF-DA. PDT experiments
in vitro in HeLa cells showed a slight decrease of cell viability with free MB and C 3N4-NS/MB NPs
without Fe(III) whereas a strong decrease of cell viability was observed after incubation with C3N4-Fe
NF/MB NPs and C3N4-Fe-TPP NF/MB NPs. The in vivo efficiency was determined in U14 cervical cancer
in Kunming mice (650 nm, 100 mW∙cm−2, 15 min each day, 2 days interval). C3N4-Fe-TPP NF/MB NPs
proved to be very efficient and led to almost complete elimination of the tumour with no regrowth
during the 15 days of the experiment. HIF-1α indicated a higher O2 concentration in the group treated
with C3N4-Fe NF/MB and C3N4-Fe-TPP NF/MB NPs.
89
Few months later, Zhen et al. [123] also used the catalase-like activity of Fe(III) and developed BSA
that coordinated with Fe3+ through different active groups such as carboxyl, thiol amino. MB was then
added and loaded in BSA through amide bond and/or hydrophobic interaction. The monodispersed
MB-BSA-Fe(III)NP had a hydrodynamic size of 28.21 nm. In solution, the production of O2 was
measured in the presence of MB-BSA-Fe(III)NP and H2O2 suggesting that MB-BSA-Fe(III) possessed
catalase-like activity. In solution under light illumination (650 nm, 100 mW∙cm−2 10 min) the absorbance
of DPBF (proportional to 1O2 formation) decreased to 79% with H2O2 and only 60% without H2O2. In
HeLa cells, the fluorescence of Ru(dpp)3]Cl2 disappeared after 24 h in cells treated with MB-BSA-
Fe(III)NP suggesting that NPs could overcome the hypoxia. After PDT (650 nm, 100 mW∙cm −2, 15 min)
viability was 83.3% after MB incorporation whereas a high decrease of 33.7% was observed with MB-
BSA-Fe(III)NP.
Metal-organic frameworks (MOFs) are self-assembled molecules that have nanometric size and
present excellent properties such as high surface-to-volume ratio, large pore size and pore windows.
Two papers in 2018 used MOFs. Hu et al. [124] used iron(III) carboxylate MOF (MIL-100 (Fe); MIL
stands for Materials Institutes Lavoisier) as a carrier for three kinds of PS: Ce6, 2-((4’-(2,2-bis(4-methoxy-
phenyl)-1-phenylvinyl)-1,1’-biphenyl-4-yl)(phenyl)methylene)malonitrile (TPEDC) and (E)-2-(4-(4-(2,2-
bis(4-methoxyphenyl)-1-phenylvinyl)styryl)-3-cyano-5,5-dimethylfuran- 2(5H)-ylidene)malonitrile
(TPETCF). To improve the water dispersibility, they coated the NPs with a nonionic amphiphilic block
copolymer F127. The average hydrodynamic size was 140 nm (size distribution 90-400 nm). In solution
and in the presence of H2O2, a catalytic reaction occurred thanks to Fe(III) leading to the release of free
Fe(III) that will decomposed rapidly H2O2 to produce O2. 9,10-Diphenylanthracenediyl-bis(methylene)
dimalonic acid (ABDA) was used to prove that PSs did not produce 1O2 when trapped into the MOF,
but were still able to produce 1O2 when they escaped. F127-TPETCF@MIL-100 was chosen to study the
activatable PDT effect in vitro on 4T1 cells. By confocal microscopy with DCHF-DA in the presence of
H2O2 the photosensitization capability of F127-TPETCF@MIL-100 was demonstrated. After light
excitation (white light excitation, 50 mW∙cm−2, 5 min) in the presence of H2O2 cell death was observed,
which was not the case without H2O2. If TPETCF could induce nonspecifically apoptosis in both normal
and tumour cells, F127-TPETCF@MIL-100 specifically induced cell death in the tumour. In vivo
experiments in subcutaneous 4T1 tumour-bearing mice both TPETCF and F127-TPETCF@MIL-100
injected into the tumour could inhibit tumour growth after light illumination (50 mW∙cm−2, 10 min) but
the tumour treated with F127-TPETCF@MIL-100 had a slower growing rate. The hydroxyprobe-1 kit
was used to show that the hypoxia was weaker in the tumour treated with F127-TPETCF@MIL-100.
After intravenous injection, F127-TPETCF@MIL-100 localized mainly in liver and tumour and could still
inhibit the tumour growth.
The same year, Lan et al. [125] proposed also a nanoscale MOF elaborated from Fe3O clusters and
5,10,15,20-tetra(p-benzoato)porphyrin (TBP). The Fe-TBP had a length of 100 nm and was able to
catalyze the decomposition of H2O2 to produce O2. Incubation in CT26 cells under low O2 conditions led
to the accumulation of HIF-1α, but when heated with Fe-TBP, the signal decreased significantly
showing the decrease of hypoxia thanks to the production of O2. After irradiation (650 nm, 20 mW∙cm−2,
15 min) under hypoxic conditions and using SOSG in solution, they proved that after addition of H 2O2
Fe-TBP was able to produce 1O2 similar than the production in normoxic conditions whereas the control
H4TBP or Hf-TBP without Fe(III) generated only traces of 1O2. IC50 in normoxic conditions were
2.60±1.59, 11.33±6.75, 25.13±6.83 mM for Fe-TBP, Hf-TBP and H4TBP. In hypoxic conditions, Fe-TBP
presented an IC50 of 3.10±1.66 whereas H4TBP or Hf-TBP were totally ineffective (IC50 superior to 50
mM). In vivo experiments were performed in mouse model of CT26 colorectal adenocarcinoma (650
nm, 100 mW∙cm−2, 7.5 min) and PDT was effective in both normoxic and hypoxic conditions.
Interestingly, they studied the effect of PDT in immunotherapy. A bilateral model of CT26 tumours was
built.
One of the tumours was treated with Fe-TBP and illuminated and the other tumour did not receive
any treatment. Then an α-PD-L1 treatment was performed. Both tumours decreased (more than 90%)
90
with a very low dose of Fe-TBP (0.2 mM and 45 J∙cm−2). They also demonstrated that PDT together with
α-PD-L1 treatment induced formation of cytotoxic T cells that could infiltrate in distant tumour.
A very sophisticated system has been developed by Liu et al. [126]. They designed black phosphorus
nanosheeta (BPNSa) on which they coupled FA by non-covalent interaction to target FA receptor as
well as a DNA duplex made of Cy5-aptamer-heme (H1) and 3’-heme-labelled oligo-nucleotide (H2)
(Cy5-dHeme-BPNS-FA). The idea was that after endocytosis the strong affinity between intracellular
ATP and the aptamer would induce the release of H1 and H2 that would be able to concert H2O2 to O2.
In solution in presence of Cy5-dHeme-BPNS-FA and ATP, the fluorescence of Cy5 increased proving
the release of Cy5 labelled H1. When H2O2 was added, the formation of O2 was detected. Using DPBF,
Cy5-dHeme-BPNS-FA produced 1O2 mainly due to BPNS. In normal air atmosphere, 1O2 formation of
Cy5-dHeme-BPNS-Fa in presence of ATP was 44.6 % higher than without ATP. Under hypoxic
conditions, after 20 min irradiation (660 nm, 150 mW∙cm−2) in vitro, 1O2 formation was even 16.0- and
6.8-fold higher with and without ATP. In HeLa cells, [Ru(dpp) 3]Cl2 was used to show that activated
heme was essential in O2 formation in hydroxic and normoxic HeLa cells. Thanks to SOSG, it was also
possible to demonstrate in vitro production of 1O2. Cell death after PDT (660 nm, 150 mW∙cm−2, 3 min)
in normoxic conditions treated with Cy5-BPNS-FA was 35.8 % whereas it was 79.1 % for cells treated
with Cy5-dHeme-BPNS-FA due to higher concentration of O2 after decomposition of H2O2. In vivo in
subcutaneous 4T1 tumour-bearing female nude mice (660 nm, 150 mW∙cm−2, 10 min), the tumour
volume decreased to 6% for the group treatment with Cy5-BPNS-FA and 45% for the group treatment
with Cy5-dHeme-BPNS-FA in good agreement with in vitro experiments (Table 7).
91
Table 7. Summary of publications about the decomposition of H2O2 by catalase.
Ref Application Catalyst O2 PS Energy of excitation Type In vitro In vivo

source of ROS
[104] PDT Catalase H2O2 MB 635 nm, 100 mW∙cm−2, 5 min 1O2 HaCaT, U87-MG, U87-MG tumour
MCF-7 and SKOV-3 bearing mice
cell lines
[105] PDT Catalase H2O2 MB 808 nm, 1 W∙cm−2, 5 min 1O2 PC-3 and bMSCs No
cell lines
[106] PDT Catalase H2O2 MB In vivo: 635 nm, 50 mW∙cm−2, 10 min 1O2 SW1990 and 293 T SW1990 tumour-
cell lines bearing mice
[107] PDT Catalase H2O2 AlPcS4 In vitro: 660 nm, 30 mW∙cm−2, 1 min 1O2 HeLa, COS7, SCC-7 HeLa tumour-
In vivo: 660 nm, 220 mW∙cm−2, 5 min and 4T1 cell lines bearing mice
[108] PDT Catalase H2O2 Ce6 In vitro: 660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
[109] PDT Catalase H2O2 Ce6 660 nm, 5 mW∙cm−2, 60 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
mice
[110] PDT Catalase H2O2 Ce6 In vitro: 650 nm, 100 mW∙cm−2, 10 1O2 CAL-27, HeLa, L929 CAL-27 tumour-
min, 25 J∙cm−2 cell lines bearing mice
In vivo: 650 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min
[111] PDT Catalase H2O2 HMME LED, 3000 mW∙cm−2 for 2 min 1O2 B16-F10 cell line Female C57 mice
[113] PDT Thiolate catalase (CAT) H2O2 RB Green LED array, 40 mW∙cm−2, 10 min 1O2 RAW 264.7 cell line No
[114] PDT Biomimetic H2O2 chlorophyll 660 nm 1 W∙cm−2, 10 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
nanothylakoid mice
[116] PDT Catalase H2O2 THPP In vitro: 660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
[117] PDT/lung AuNCs-NH2 H2O2 PpIX 532 nm, 200 mW∙cm−2, 5 J per well 1O2 H 460 cell line No
cancer
[118] PDT G-quadruplex-hemin H2O2 Ce6 In vitro: 660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
DNAzyme In vivo: 660 nm, 5 mW∙cm−2, 60 min mice
[119] PDT MnFe-LDH H2O2 MB In vitro: 650 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min 1O2 HeLa cell line U14 tumour-bearing
92
Table 7. Cont.
Ref Application Catalyst O2 PS Energy of excitation Type In vitro In vivo

source of ROS
[120] PDT PB NPs H2O2 ZnPc 671 nm, 400 mW∙cm−2, 5 min 1O2 HeLa, A549 and 4T1 4T1 tumour-bearing
cell lines mice
[121] PDT PB NPs H2O2 Ce6 In vitro: 660 nm, 1.0 W∙cm−2, 5 min 1O2 U87MG and U87MG tumour-
In vivo: 660 nm, 1.0 W∙cm−2, 2 min HUVEC cell lines bearing mice
[122] PDT Fe(III) H2O2 MB 650 nm, 100 mW∙cm−2, 15 min 1O2 HeLa cell line U14 tumour-bearing
mice
[123] PDT Fe(III) H2O2 MB In vitro: 650 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min 1O2 HeLa cell line -
[124] PDT Fe(III) H2O2 Ce6, In vitro: white light excitation, 50 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
TPEDC, mW∙cm−2 5 min mice
TPETCF In vivo: white light excitation, 50
mW∙cm−2, 10 min
[125] Immuno- Fe (III) H2O2 TBP In vitro: 650 nm, 20 mW∙cm−2, 15 min 1O2 CT26 cell line CT26 tumour-
PDT In vivo: 650 nm, 100 mW∙cm−2, 7.5 min bearing mice
[126] PDT Cy5- aptamer-heme H2O2 BPNS In vitro: 660 nm, 150 mW∙cm−2, 3 min 1O2 HeLa cell line 4T1 tumour-bearing
(H1) and 3’-heme In vivo: 660 nm, 150 mW∙cm−2, 10 min mice
labelled oligonucleotide
(H2)
MB: Methylene Blue; AlPcS4: Al(III) phthalocyanine chloride tetrasulfonic acid; Ce6: Chlorin e6; HMME: Hematoporphyrin monomethyl ether; RB: Rose Bengal; THPP:
meso-5, 10, 15, 20-tetra(4-hydroxyphenyl) porphyrin; AuNCs-NH2: peroxidase amine-terminated PAPAM dendrimer-encapsulated gold NP; PPIX: Protoporphyrin IX;
MnFe-LDH: Manganese-iron layered double oxide; PB NPs: Prussian Blue nanoparticles; ZnPc: Zinc phthalocyanine; TPEDC: 2-((4’-(2,2-bis(4-methoxyphenyl)-1-
phenylvinyl)-1,1’-biphenyl-4-yl)(phenyl)methylene)malonitrile; TPETCF: (E)-2-(4-(4-(2,2-bis(4-methoxyphenyl)-1-phenylvinyl) styryl)-3-cyano-5,5-dimethylfuran-
2(5H)-ylidene)malonitrile; TBP: 5,10,15,20-tetra(p-benzoato)porphyrin. BPNS: black phosphorus nanosheet.
93
3.1.3. Platinum (Pt) NPs

Pt NPs are other types of artificial catalases. They can also be used as catalysts and are well-known
to possess good peroxidase-like properties. They can indeed catalyze in situ the intracellular H 2O2 to
produce large amounts of O2 thanks to the decomposition of H2O2. In the literature, we found five
publications describing the use of Pt NPs all in 2018 and four of them reported in vivo experiments. In
all of them, Pt NPs are associated with others NPs. Pt NP converts H 2O2 into O2.
Zhang et al. [127] developed Pt NPs (approximately 2 nm) in a metal-organic framework (average
diameter of about 90 nm) coated with PEG. The dynamic diameter of the NPs was 160.1 nm. They chose
the TCPP as the PS. Thanks to dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) and DPBF they proved
that the NPs could efficiently produce 1O2 in hypoxic conditions in the presence of H 2O2. After
intravenous injection in hepatoma 22 (H22) tumour-bearing mice after light illumination (638 nm, 1
W∙cm−2, 10 min), the tumour growth of the group treated with the NPs and light was significantly
different from the groups with only light and only NPs (around six times less).
Wei et al. [128] decided to develop 2D Pd-based nanoplates as a carrier. They coupled SH-PEG-
COOH to improve the stability and coupled Ce6 onto the carboxylic acid group (10 wt%). The resulting
Pd@Pt-PEG-Ce6 nanoplates have a hydrodynamic size of about 80 nm. Using DPBF, they proved that
Pd@Pt-PEG-Ce6 and Ce6 produced the same amount of 1O2. Adding H2O2, only Pd@Pt-PEG-Ce6 was
able to increase the production of 1O2. In vitro experiments in A4T1 cell lines, in N2 atmosphere addition
of exogenous H2O2 under 660 nm laser irradiation (5 min, 150 mW∙cm−2) produced a diminution of PDT
effect with Ce6 but not with Pd@Pt-PEG-Ce6 compared that in air atmosphere, proving the production
of O2. Under 808 nm irradiation (0.5 W∙cm−2, 5 min), Pd@Pt-PEG-Ce6 exhibited a moderate photothermal
effect, which could lead to an enhancement of PDT treatment. In vivo studies in Balb/v mice with 4T1
tumour showed that Pd@Pt-PEG-Ce6 under both 660 nm and 808 nm illumination led to the best tumour
growth inhibition compared to the others groups (Ce6 alone, light alone, only Pd@Pt-PEG-Ce6).
Wang et al. [129] synthesized hybrid core-shell NPs composed of a polydopamine (pda) core, Pt NP
interlayer, zirconium-TCPP (PCN) porphyrin shell and a coordination between Zr 6 and the carboxyl
group of folic acid. The size of Pda-Pt@PCN was 250 nm with a thickness of the shell of about 30 nm.
With ADPA and Pda-Pt@PCN, in solution saturated with N2, formation of 1O2 was higher after addition
of H2O2 revealing the formation of O2 via the decomposition of H2O2. The incorporation of Pda-Pt@PCN-
FA into FAR over-expressed CT26 cells was higher than that into FAR-negative COS7 cell line
demonstrating the FA targeting effect. PDT efficacy was investigated under both normoxia and hypoxia
conditions. In normoxic conditions, no difference could be observed between Pda-Pt@PCN-FA and
Pda@PCN-FA whereas in hypoxia conditions, Pda@PCN-FA presented higher phototoxicity (nearly
80%). Using a wound-healing test, they also proved that cells treated with Pda-Pt@PCN-FA were less
capable of moving compared with cells without treatment demonstrating the advantage of these NPs
for the metastatic process. In a CT26-cell-bearing mice modeltumour hypoxia had been improved
(hypoxia-inducible factors staining assay), 660 nm illumination (220 mW∙cm−2, 5 min) induced a
significant tumour suppression effect as well as an inhibition of tumour metastasis.
Cai et al. [130] designed 3D-dendritic mesoporous silica NP (3D-dentritic MSNs DMSNs) in which
were incorporated Pt NPs. They coupled NH2-PEG-NH2 to improve the biocompatibility,
triphenylphosphine (TPP) to target mitochondria and loaded Ce6 as a PS (13% (w/w)). Pt-DMSNs-
TPP/Ce6 had an average diameter of around 113.5 nm. An important increase of 1O2 production by Pt-
DMSNs-TPP/Ce6 was noticed with addition of H 2O2 using ADBA. A549 cells treated with free Ce6,
DMSNs/Ce6, Pt-DMSNs/Ce6 and Pt-DMSNs-TPP/Ce6. As expecting, mitochondria-triggered apoptosis
and therapeutic PDT (660 nm, 50 mW∙cm−2, 5 min) in vivo efficacy was higher in the cells treated with
Pt-DMSNs-TPP/Ce6 than the others conditions.
Ouyang et al. [131] used 2D semiconductor NPs namely BPNS with an average diameter of 200 nm
on which Pt NP of 4.2 nm were uniformly placed. BP nanosheet did not induce decomposition of H 2O2
whereas Pt@BP nanohydrids did. Formation of 1O2 was observed thanks to DPBF whose absorption
decreased less than 10% under NIR illumination for Pt@BP but by 35% after adding H2O2. In vitro
94
antitumour studies were performed on 4T1 cells; after incorporation and light illumination (660 nm, 1
W∙cm−2, 10 min), the cell viability decreased of 26% with BP and 65 % with Pt@BP, with a dysfunction
of mitochondria. In vivo in mice bearing subcutaneous 4T1 tumours, PDT treatment led to total
regression of the tumour (Table 8).
3.1.4. Others
In order to produce O2 inside the hypoxic zones of the tumours, three others strategies have been
developed. Three studies focused on the decomposition of H2O2 but not endogenous H2O2 of tumour
cells. In these strategies, the authors encapsulated H2O2 in nanostructures.
Li et al. [132] designed light-triggered polymeric vesicle coupled to Ce6 and encapsulating H 2O2.
Briefly, PAMAM dendrimer coupled to Ce6/cypate and H2O2 were co-assembled with a block
copolymer that could be cleaved upon ROS production into polymeric vesicles (HC@P1-vesicle)
(155.2±21.5 nm). Upon 808 nm excitation, H2O2 was decomposed in O2. Upon 660 nm illumination,
excitation of Ce6 induced the formation of 1O2 that disrupted the copolymer and destabilized the vesicle
leading to the release of Ce6/cypate into the tumour. One cycle of 660/805 nm illumination induced the
fast release of H2O2 due to cleavage of the copolymer and disruption of the vesicle. 808 nm excitation of
HC@P1-vesicle did not lead to high formation of 1O2 but 660 nm excitation did. One cycle of 660/805 nm
illumination induced an increased amount of 1O2. In human pancreatic BxPC-3 cancer cells, the cellular
uptake of CC-PAPAM was five times higher with light irradiation of HC@P1-vesicle than without light.
A higher PDT effect (805 nm, 1000 mW∙cm−2, 3 min - 660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min) was observed for
HC@P1-vesicle than for the same vesicles without H2O2. In vivo experiments in BxPC-3 tumour-bearing
mice (805 nm, 1000 mW∙cm−2, 3 min - 660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min) showed that HC@P1-vesicle
preferably accumulated into the tumour compared to CC-PAMAM. After one cycle of 660/805 nm
illumination, CC-PAPAM released from the vesicle deeply distributed into the tumour.
95
Table 8. Summary of publications about H2O2 decomposition by Pt NPs.

source ROS
[127] PDT Pt NP H2O2 TCPP In vitro: 638 nm, 1.0 W∙cm−2, 10 min 1O2 HeLa and 4T1 cell H22 tumour-bearing
In vivo: 638 nm, 1.0 W∙cm−2, 8 min lines mice
[128] PDT Pt NP H2O2 Ce6 660 nm, 150 mW∙cm−2, 5 min + 808 nm, 500 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
mW∙cm−2, 5 min mice
[129] PDT Pt NP H2O2 zirconium- In vitro: 660 nm, 30 mW∙cm−2, 3 min 1O2 CT26 cell line CT26 tumour-bearing
TCPP In vivo: 660 nm, 200 mW∙cm−2, 5 min mice
[130] PDT Pt NP H2O2 Ce6 660 nm, 50 mW∙cm−2; 5 min 1O2 A549 cell line No
[131] PDT Pt NP H2O2 BPNS 660 nm, 1.0 W∙cm−2, 10 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
mice
TCPP: carboxyphenylporphyrin; BPNS: black phosphorus nanosheet.
96
Thanks to pimonidazole, after treatment with HC@P1-vesicle and one cycle of 660/805 nm
illumination it was proved that the hypoxia decreased in the tumour. Multiple cycles of 660/805 nm
illumination were then performed. After five cycles, in vivo, tumour treated with HC@P1-vesicle had
less than 20% hypoxic areas compared to more than 70% for tumour treated with only 660 nm light. A
total ablation of hypoxic hypopermeable pancreatic tumour was observed.
Wang et al. [133] developed NPs (PLGA–FA/IR780–H2O2 NPs) composed of a core-shell (poly(lactic-
co-glycolic acid) (PLGA) and H2O2/poly(vinylpyrrolidone) complex (O2 source)) convalently
conjugating folic acid (targeting) and entrapping in the shell IR780 diodide (PTT/PDT agent) (Figure
22). The authors proved the photothermal effect of these NPs as well as their ability to produce ROS to
kill cancer cells in vitro in HepG2 cell line after laser irradiation (808 nm, 0.5 W∙cm−2, 60 s) with a decrease
of cell viability of 80%. The phothermal effect conducted to an efficient release of H2O2 to increase the
O2 concentration. These observations were confirmed in vivo in Hep-G2 tumour-bearing mice with a
significant inhibition of tumour growth.
Figure 22. Illustrations of O2 self-enriched PLGA–FA/IR780–H2O2 NPs and their application for PTT and enhanced
PDT against tumours. Republished from [133] with permission of the Royal Society of Chemistry, Copyright 2018.
In 2011, Manifold et al. [134] described a preliminary study on the influence of topical application of
H2O2 cream on the potential photodynamic reaction (PDR) by 5-ALA methyl ester (MAL) on skin
diseases. In this study, the aim was to investigate the possible side effects of H 2O2 cream (Crystacide®),
of MAL cream under different pO2. Forty healthy volunteers participated in the protocol and each of
them wore a patch on the right forearm. The patch was constituted of four sites:, i.e. a) normal skin
without any treatment, b) a positive control with MAL cream and further illumination after removal of
excess of PS, c) same as b) in hypoxic condition, and d) same of b) with H2O2 cream. Another patch on
the left forearm was devoted to control the different factors taken alone (light, MAL cream, Crystacide ®).
An evaluation by the naked eye was carried out to highlight the presence of erythema or oedema on the
cutaneous sites. Laser Doppler perfusion imaging quantified the change in cutaneous blood flow in
vivo. The first results indicated a great variability in terms of appearance of erythema as a function of
time and 25% of volunteers showed strong response. Regarding oedema, this side effect was much less
problematic. In summary, further investigation should be necessary before topical administration of
Crystacide® for cutaneous PDR applications.
Two others studies have described two other systems to decompose endogenous H2O2. Zhen et al.
synthesized a BiOI/BiOIO3 nanocomposite (BB NCs) (108 nm) [135]. The photogenerated electrons (e-)
under 650 nm light irradiation reacted with H2O2 to produce ●OH and slit H2O to produce O2 then 1O2
both in hypoxic and normoxic conditions. ●OH was detected thanks to hydroxyphenyl fluorescein probe
(HPF) after 650 nm illumination and its concentration was even higher after addition of H2O2. 1O2 was
detected thanks to SOSG probe even in hypoxic conditions. In HeLa cells, the use of SOSG probe also
proved the formation of 1O2 even in hypoxic cells. DCHF-DA presented the same fluorescence in
97
normoxic or hypoxic cells showing the equal amount of ROS production. Fluorescence of ([Ru(dpp)3]Cl2
was quenched even in hypoxic conditions in the presence of irradiated BB NCs. In vivo (650 nm, 500
mW∙cm−2, 15 min), the tumour in the BB NCs/laser group was totally destroyed and a low level of HIF-
1α was detected.
Wu et al. [136] synthesized an UCNP containing Ce6 and Ferric Hydroxide Fe(OH) 3, biocompatible
and acting as a synergetic agent between PDT and chemotherapy. When irradiated at 808 nm in
presence of H2O2, these UCNPs (176 nm diameter) excited Ce6 which generated 1O2, using O2 produced
by the Fenton-like reaction of Fe(OH)3 with H2O2. In vitro, 4T1 and 293T human embryonic kidney cells
viability was tested in normoxia or hypoxia, in presence or in absence of H 2O2 with or without
irradiation (808 nm, 1 W∙cm−2, 10 min). They clearly showed the amplified effect of using these UCNPs
in presence of H2O2 and irradiation (Figure 23).
Figure 23. a) and b) CCK-8 assay of 4T1 cells after incubating in a normoxia/hypoxia environment and treated by
different methods. Adapted from Wu et al. [136]
In vivo, the 4T1 mouse tumour model was irradiated at 808 nm (1 W∙cm−2, 30 min) and 14 days after
treatment with UCPs, not only the growth of tumour dramatically decreased, but also the tumour nearly
disappeared (Table 9).
3.2. Water Splitting

Until 2010, water splitting was essentially studied for H2 production as it appears a potentiate
solution to the energy and environmental issues. Numerous active photocatalysts such as metaloxides,
sulfides, nitrides, nanocomposites, and doped materials have been proposed for the generation of H2
(and concomitant O2 generation) [137]. However, it is well known that nature (and especially plants) is
able to use light to catalyse the synthesis of O2 from H2O in chloroplasts with high yields. Inspired by
this and, as water is the most abundant element in the human body, scientists have thought of using
light-driven water splitting for in situ O2 formation at the tumour site and thus decrease hypoxia. For
this, some teams have developed various O2 generators based on oxides (CaO, ZnO, Bi2WO6 ...), carbon
nitride NPs and other materials such as nanorods or nanosheets.
CaO2 is an O2-generating material that can be used to suppress hypoxia. It has many advantages
such as highly compatible, efficient O2 generator and rapidly metabolized in cells. When it reacts with
water or weak acid, it can release O2 and can alleviate tumour hypoxia:
2CaO2 + 4H2O → 2Ca(OH)2 + 2 H2O2 → 2Ca(OH)2 + 2H2O + O2 (1)
Hu et al. [138] developed an « optical battery » based on UCNP associated with RB by electrostatic
interactions in biocompatible PDMS (polydimethylsiloxane) which was able to produce 1O2 after NIR
irradiation (980 nm, 2 W∙cm−2, 5 s). The persistent luminescence of the battery allowed to irradiate during
a short time (5 s) and to induce a PDT effect without continuous irradiation. This avoided photothermal
effects.
98
Table 9. Summary of publications about H2O2 decomposition by other ways.

source ROS
[132] PDT Light-triggered polymeric vesicle coupled H2O2 Ce6 805 nm, 1000 mW∙cm−2, 3 1O2 BxPC-3 cell BxPC-3 tumour-
to Ce6 and encapsulating H2O2. min - 660 nm, 100 line bearing mice
mW∙cm−2, 10 min
[133] PTT/PDT Hydrophilic H2O2/poly(vinylpyrrolidone) H2O2 IR780 808 nm, 0.5 W∙cm−2, 3 min ROS HepG2 cell HepG2 tumour-
complex line bearing mice
[134] PDT Cream H2O2 5-ALA methyl ester 570-670 nm, 105 nd Erithema 40 healthy
(MAL, Metvix®) mW∙cm−2, 16 min, in vvo cell line volunteers
[135] PDT BiOI/BiOIO3 nanocomposite H2O2 BiOI/BiOIO3 650 nm, 500 mW∙cm−2, 15 1O2 and HeLa cell 4T1 tumour-
min ●OH line bearing mice
[136] Chemo- Fe(OH)-modified UCNP H2O2 Ce6 In vitro: 808 nm, 1 1O2, 4T1 cell 4T1 tumour-
PDT W∙cm−2, 10 min ●OOH line bearing mice
In vivo: 808 nm, 1 and ●OH
W∙cm−2, 30 min
nd: not determined; Ce6: chlorin e6; 5-ALA: 5-sminolevulinic acid; UCNP: Up-conversion nanoparticles.
99
The battery was implemented under different thicknesses of pork tissue. The NIR irradiation (980
nm) induced 1O2 production at a thickness of 4 mm, whereas UV light (365 nm) was efficient at only 1
mm. The battery was biocompatible in a human colon adenocarcinoma cell line HT29 and presented
phototoxicity under light illumination. CaO2 was encapsulated in the battery and a higher molecular O2
concentration and hypoxia inhibition was observed. Finally, the device was implanted subcutaneously
onto a HT29 solid tumour. The PDT effect of the battery after NIR irradiation (660 nm, 30 mW∙cm−2, 30
+ 60 s) during 15 days (two times each day) led to a better oxygenation and a tumour volume decrease
(Figure 24).
Figure 24. Tumour volumes evolution in different treatments groups. PDT-OB = O2 generating optical battery;
GPM: Green luminescent material Adapted from Hu et al. [138].
A liposome-based NP containing MB and the O2 supplier CaO2 were synthetized by Liu et al. [139].
After a short irradiation time (30 s), photobleaching of the NPs occurred inducing the formation of O2
by release of CaO2 in water. After a long irradiation time (60 s), hypoxia in the tumour environment was
regulated and a PDT effect was observed. The NPs were tested on 4T1 cells. The regulation of hypoxia
was demonstrated using a ROS detection kit. Dual-stage irradiation (660 nm, 30 mW∙cm−2, 1 min and 5
min) led to improved phototoxicity compared to single irradiation. The NPs were tested on
subcutaneously 4T1 solid tumour bearing mouse. Tumour inhibition was observed after light
illumination (658 nm, 280 mW∙cm−2, 2+8 min) whereas negligible effect appeared in the dark group
(Figure 25).
Figure 25. Relative tumour volume after different treatments. Adapted from Liu et al. [139].
Sheng et al. [140] synthesized a core shell NP with a CaO2 core coated with a pH sensitive
methacrylate based copolymer that could undergo a dissolution at pH lower than 7.4, leading to the
exposure of the CaCO2 to aqueous medium. The authors prepared a de-oxygenated PBS solution
containing SOSG and RB and added CaO2 NPs and irradiated (white light, 5 min). The results revealed
100
a significant increase (324.8%, p < 0.001) of SOSG fluorescence compared to the control experiments,
indicating the ability of the NPs to provide O2 during PDT, to enhance the formation of 1O2. The injection
of NPs in a BxPC-3 human pancreatic cancer cell line demonstrated an enhancement of the PDT effect.
In vivo experiments were performed in Mia-PaCa 2 xenograft mice, (3*3 min Fenix LD01 LED50 mW,
205 J∙cm−2) which is a model known to form hypoxic tumours. No significant difference in tumour
volume for mice treated with PDT alone or CaO2 NPs alone 5 days after treatment was observed whereas
a significant reduction of 70.5% was observed for animals treated with the CaO 2 NPs and PDT.
C3N4 is known as a water splitting material biocompatible but presents limit efficiency in the red
light region. Carbon-dot (CD)-doped carbon nitride (C3N4) NPs were designed by Zheng et al. [141] to
enhance red light absorption and allow O2 production via water splitting. To overcome the limit
efficiency in red light region, carbon dots have been added. PpIX-PEG-RGD was grafted on the NP. The
association showed an enhanced O2 production compared to C3N4 alone, allowing the decrease of
hypoxia. ROS production after light illumination (630 nm, 80 mW∙cm −2, 10 min) was measured in a 4T1
cell line. An enhancement could be observed with the NP, and not for PpIX or C3N4 without CDs. After
laser irradiation at 630 nm, NPs displayed the same phototoxicity in hypoxic and normoxic medium,
contrary to PpIX. The NPs were tested in subcutaneously 4T1 solid tumour bearing mouse. NP injection
and irradiation showed remarkable tumour growth inhibition contrary to PpIX or C3N4 without CDs.
Li et al. [142] associated Fe-C3N4 NPs with tris(bipyridyl)cationic Ru complexes (Ru(bpy) 32+) which
could enhance photocatalytic activity and act as PS. Ru complex absorption of near infrared light
enhanced the charge transfer to C3N4 and photocatalytic water splitting. The NPs irradiated at 800 nm
(2.7 W, 5 min) allowed more O2 generation than C3N4 or (Ru(bpy)32+) alone. The ROS production was
also confirmed by using DCFH-DA and ESR. The NP biocompatibility, cellular uptake and
phototoxicity (800 nm, 2.7 W, 3 min) were demonstrated on a 4T1 cell line. Experiments on 4T1 tumour
bearing mice after intravenous injection of NPs and light irradiation (800 nm, 2.7 W, 5 min) showed
significant tumour inhibition.
Yang et al. [143] developed a theranostic platform that associated UCNPs (NaGdF4:Yb,Tm@NaGdF4)
graphic-C3N4 nanosheets (one PS) and carbon dots (another PS) incorporated in a ZIF-8 metal−organic
framework (MOF) shell. The combination of g-C3N4 and CDs could induce stepwise water splitting: (1)
2H2O → H2O2+H2; (2) 2H2O2 → 2H2O + O2. The phototoxicity was observed on HeLa cells after NIR
irradiation (980 nm, 500 mW∙cm-2, 5 min) (Figure 26). The NPs injected in U14 tumour-bearing mice
irradiated at 980 nm (0.5 W∙cm−2, 10 min) induced a delayed tumour growth.
Figure 26. (A) In vitro cell viabilities of HeLa cells incubated with cell culture (control), 980 nm light, UCNPs-g-
C3N4 with 980 nm laser irradiation, and UCNPs-g-C3N4−CDs@ZIF-8 at varied concentrations with and without
980 nm laser irradiation. Adapted from Yang et al. [143] (B) CLSM images of HeLa cells incubated with different
conditions corresponding to the toxicity test in vitro, and all the cells are marked with calcein AM and PI. Reprinted
from [143] with permission from the American Chemical Society, Copyright 2017.
101
Zheng et al. [144] designed a platform assembling an O2-generated thylakoid membrane from plants
(spinach, lettuce, carbage) fused with synthetic NP (Ag, SiO2, ZnO). This idea come from the fact that in
nature, plants possess a very oxygenic photosynthesis system that allow the photocatalyzed formation
of O2. These platforms exhibited good O2 generation that could reverse the tumour hypoxia. This O2
production proved to be higher compared to CaO2 or MnO2. The in vivo generation of O2 was proven
in CT26 tumour bearing Balb/C mice. The authors observed enhanced PDT when they added the
platform to MB (660 nm, 155 mW∙cm−2, 2 min).
In 2015, Zhou et al. [145] synthesized a monolayer of Bi2WO6 with highly active surface that could
generate photocatalytic oxidation reactions, leading to the oxidation of H2O (or OH− ) to •OH upon laser
irradiation. Indeed, Bi2WO6 could produce ROS without the need of O2. Zhang et al. [146] demonstrated
that small Bi2WO6 NPs (5 nm) grafted with carboxylic acid groups could efficiently generate ●OH after
irradiation in the NIR grange (808 nm, 1 W∙cm−2, 5 to 20 min). The in vivo injection of the NPs in HeLa
tumour bearing nude mice showed a photothermal effect until 47°C after 8 min irradiation (808 nm, 1
W∙cm−2) because of their strong Plasmon resonance. The ROS production was evaluated both by the
SOSG for 1O2 and by EPR for ●OH radicals. Formation of ●OH played a dominant role. The in vivo PDT
(HeLa tumour bearing mouse model, 808 nm, 1 W∙cm−2, 8 min) showed that Bi2WO6 NPs induced
photodynamic killing in a hypoxia-free manner resulting in tumour continuous decrease of the tumour
volume (Figure 27). It was not the case for ICG and W18O49 NPs, which could react, with O2 absorbed
onto the NPs to generate ROS in an O2 independent manner.
Figure 27. a) Tumour volumes of HeLa-tumour-bearing mice that received different treatments as displayed. b)
Number of tumour-free mice after treatment during the observation. c) Survival curves of HeLa-tumour bearing
mice that received different treatments as displayed. d) Body weight of HeLa-tumour-bearing mice that received
different treatments as indicated. Adapted from Zhang et al. [146].
Fan et al. in 2017 [147] developed semiconductor materials with broadband light response in UV and
visible region. Usually photocatalytic reaction produce O2 by splitting water, in vivo, but not enough to
produce ROS in sufficient quantity by PDT. To improve the efficiency, such nanorods (CdSe-
seeded/Cds) were doped with deposited Au, forming a hybrid nanocomposite (HNC) (Figure 28). RGD
peptide was coupled to target αvβ3 receptors. Under visible excitation, the nanorods induced charge
separation and delocalized electrons, which were transferred to Au, increasing the ROS generation by
water splitting.
102
Figure 28. (A) Structure of HNCs: (I) anisotropic growth of NRs; (II) gold deposition on top of NRs; (III) RGD
modification of HNCs; (B) schematic diagram of visible light driven water splitting to generate ROS for PDT
treatment. Republished from [147] with permission from the Royal Society of Chemistry, Copyright 2017.
In vitro, excitation was performed with a blue LED (450 nm, 500 mW∙cm−2, 10 min). A significant
increase of intracellular ROS was observed in COS-7 and HeLa cells with HNC in normoxic conditions.
Moreover, cytotoxicity assays have been performed on 4T1 cells, with irradiation by blue LED during
1, 2 and 3 minutes. 20% viability of cells was observed in normoxic and hypoxic conditions, to be
compared to the 80% obtained with non-modified nanorods (CdSe-seeded/Cds). In vivo model was the
murine 4T1 breast-adenocarcinoma mouse on female balb/c mice. Obvious tumour growth inhibition
was observed when NCNs-RGD were used under blue light irradiation (30 min), indicating the excellent
accumulation of these nanorods in the tumour and improvement of the PDT effect in hypoxic media
(Table 10).
3.3. Destruction of Tumour Extracellular Matrix (ECM)

Proteins such as collagen, glycoproteins, elastin, and proteoglycans are constituents of normal
connective tissues. The tumour-associated proteases are likely to destroy some of these proteins
inducing, by the way, the invasive process and thus metastasis. However, destruction of the
extracellular matrix may be useful if it is cleverly applied. Indeed, it can lead to better vascularization
and therefore to an excess supply of O2, thus reducing hypoxia.
In 2016, Gong et al. [148] investigated the effect of the administration of hyaluronidase (HAase)
before PDT with nanomicelles containing Ce6 (NM-Ce6). The HAase treatment could degrade ECM by
breaking down hyaluronan leading to an increase of the blood vessel density and the perfusion of the
tumour. The accumulation of NM-Ce6, with an average size of 33 nm, in tumours was studied after
administration of different doses of HAase (0, 375, 750, 1500 and 3000 U) and a significant increase in
the tumour uptake of NM-Ce6 (~ 2-fold) was observed with the HAase treatment with an optimal dose
at 1500 U. The significant decrease of HIF-1 α after this HAase administration proved an improvement
of hypoxia conditions in the tumour. In vivo PDT studies were performed in balb/c mice bearing 4T1
tumours. No effect on the tumour growth was observed with the administration of HAase alone but in
combination with PDT treatment with NM-Ce6 under light irradiation at 660 nm (2 mW∙cm−2, 1 h), there
was an almost total inhibition of the tumour growth. The authors also investigated the effect of HAase
administration on PDT efficiency against lymphatic metastasis since HAase presented the ability to
move in drainage lymph nodes and thus increased the EPR effect of NM-Ce6 and relieved the hypoxia
in both the tumour and the metastases sites. To reduce invasiveness of local injection of HAase, this last
one was PEGylated to form HAase-PEG for systemic local injection and the same EPR and hypoxia
effects were observed.
103
Table 10. Summary of publication about water splitting.
Ref Application Catalyst O2 source PS Energy of excitation Type of In vitro In vivo

ROS
[138] PDT CaO2 Water RB 980 nm, 2 W∙cm−2, 5 s 1O2 HT29 cell HT29 tumour-bearing
splitting line mice
[139] PDT CaO2 Water MB In vitro: 660 nm, 30 mW∙cm−2, 30 + 60 s 1 O2 4T1 cell 4T1 tumour-bearing
splitting In vivo: 658 nm, 280 mW∙cm−2, 2 + 8 line mice
min
[140] PDT CaO2 Water RB White light, 205 J∙cm−2, 5 min 1 O2 BxPC-3 cell MIAPaCa-2 tumour-
splitting line bearing mice
[141] PDT C3N4 NPs Water PpIX 630 nm, 80 mW∙cm−2, 10 min nd 4T1 cell 4T1 tumour-bearing
splitting line mice
[142] PDT Fe-C3N4 NPs Water Ru(bpy)32+ In vitro: 800 nm - 2 photons, 2.7 W, 3 1 O2 4T1 cell 4T1 tumour bearing
splitting or 5 min line mice
In vivo: 800 nm - 2 photons, 2.7 W, 5
min
[143] PDT C3N4 nanosheets Water CD In vitro: 980 nm, 500 mW∙cm−2, 5 min ●OH HeLa cell U14 tumour-bearing
splitting In vivo: 980 nm, 500 mW∙cm−2, 10 min O2-● line mice
[144] PDT Thylakoid membrane Water Ag, SiO2 or 660 nm, 155 mW∙cm−2, 2 min ROS CT26 cell CT26 tumour-bearing
from plants splitting ZnO NPs line mice
[146] PTT/PDT Bi2WO6 NPs Water Bi2WO6 NPs 808 nm, 1 W∙cm−2, 5 to 20 min ● OH HeLa cell HeLa tumour-bearing
splitting line mice
[147] PDT Au-semiconductor Water In vitro: 450 nm, 500 mW∙cm−2, 10 min nd 4T1 cell 4T1 tumour-bearing
nanocomposite splitting In vivo: 450 nm, 500 mW∙cm−2, 30 min line mice
nd: not determined; RB: Rose Bengal; MB: Methylene Blue; C 3N4: Carbon nitride; PPIX: Protoporphyrin IX; Ru(bpy)32+: tris(bipyridyl)cationic Ru complexes; CD:
Carbon dot.
104
Liu et al. [149] described another strategy, based on two steps to enhance PDT treatment: a first
injection of NPs containing collagenase (CLG) to destroy tumour ECM by degradation of collagen and
a second injection of liposomes containing Ce6 for PDT treatment. The pH-sensitive NPs were
composed of Mn2+ coordinated with benzoic-imine (BI)-linker to form nanoscale coordination polymers
(NCPs) encapsulating CLG (CLG@NCP). CLG@NCP NPs were surrounded by a lipid PEG shell to
finally formed CLG@NCP-PEG NPs possessing a hydrodynamic size of 106 nm. The pH-sensitive
relapse of CLG by CLG@NCP-PEG NPs was investigated by changing the pH of a solution containing
CLG@NCP-PEG NPs, from 7.4 to 6.5 and after 24 h of incubation a release of ~90% was observed.
Moreover, a recovery of ~80% of CLG enzyme activity was highlighted for a pH 6.5. In vivo in 4T1
tumour bearing mice, a high tumour uptake was observed 24 h after injection of CLG@NCP-PEG NPs
as well as a significant decrease of the collagen level in the tumours leading to an ECM degradation and
thus an enhancement of blood flow perfusion. As a consequence of these effects of the level of tumour
oxygenation, a significant increase over time was observed after treatment with CLG@NCP-PEG NPs
(Figure 29) as well as a high decrease of hypoxia signals.
Figure 29. Quantification of the oxyhemoglobin saturation in the tumour from different groups over time. Adapted
from Liu et al. [149].
The effect of a pretreatment with CLG@NCP-PEG NPs before PDT treatment with liposomes
containing Ce6 (liposome@Ce6) was finally studied. The therapeutic PDT effect was dramatically
improved with an effective tumour growth inhibition when mice where pretreated with CLG@NCP-
PEG NPs 24 h before injection of liposome@Ce6 and irradiated (660 nm, 5mW∙cm −2, 60 min) after again
24 h. Moreover, CLG@NCP-PEG NPs showed no cytotoxicity over time (14 days) (Table 11).
3.4. Decrease of Tumour O2 Consumption

A recent strategy consists to decrease the tumour cells’ demand for O2 by inhibiting mitochondrial
respiration ((via NADH dehydrogenase). Several mitochondrial receptors can be targeted such as
papaverine’s or metformin’s complexes and others. The expected reduced O2 consumption induces an
increased oxygenation concentration. Since 2015, some drugs with potential ability to decrease the
hypoxic fraction have been developed in the field of PDT and/or PTT. Nevertheless, some requirements
must be taken into account to obtain a significant improvement in the treatment of cancer. Normally
oxygenated tissues should not be affected, uptake by tumour cells should be rapid, minimal side effects
and optimal clearance should be observed. Two teams have reported the use of metformin (Met) which
is known to reduce tumour O2 consumption and thus increase tumour oxygenation.
105
Table 11. Summary of publications about the destruction of ECM to modify TME.
Ref Application Target Additional compound PS Energy of excitation Type of ROS In vitro In vivo
[148] PDT Hyaluronan of ECM Hyaluronidase Ce6 660 nm, 2 mW∙cm−2 1 O2 and others ROS No 4T1 tumour-bearing mice
60 min
[149] PDT Collagen of ECM Collagenase Ce6 660 nm, 5 mW∙cm−2, 60 min nd No 4T1 tumour-bearing mice
nd: not determined; Ce6: Chlorin e6.
106
In 2017, Song et al. [150] incorporated in PEG liposomes, HCe6 (hydrophobic Ce6) and a
hypoglycemic agent, Met. The resulting NPs exhibited a 1O2 generation under 660 nm light excitation.
In vitro studies were performed in 4T1 cells to evaluate the PDT efficiency of Met-HCe6-liposomes in
comparison with HCe6-liposomes and Met or Ce6 alone. After a 660 nm light irradiation for 10 min, all
Ce6 formulations showed almost the same PDT effect in normoxic conditions. In vivo tests were
performed in mice bearing 4T1 tumours injected with Met-HCe6-liposomes. The authors used PA to
evaluate the tumour oxygenation in presence of Met alone or Met-liposomes by following the level of
oxygenated Hb (oxyhemoglobin) in tissues. A high increase was observed for both after 2 h with a
decrease over time, after 2 h, for Met alone. However, for Met-liposomes, the increase of oxyhemoglobin
subsist over time due to a continuous release of Met. After injection of Met-HCe6-liposomes, a
significant reduction of hypoxia was observed 2h and 24h after injection (57% to 27% and 15%
respectively), by using pimonidazole hydrochloride. The improvement of tumour oxygenation with this
compound was also proved in two other tumour models (CT26 colon cancer and SCC-7). Finally, the
improvement of PDT efficiencywas confirmed by in vivo studies in a 4T1 tumour model. After injection
of Met-HCe6-liposomes or HCe6-liposomes 24h before a 660 nm light irradiation (0.035 W∙cm−2, 30 min),
the tumour growth was highly decreased for both in comparison with PDT treatment with Ce6 alone.
Moreover, the most significant inhibition of tumour growth was observed for group treated with Met-
HCe6-liposomes-mediated PDT.
Zuo et al. [151] designed NPs (PM-W18O49-Met NPs) composed by W18O49 NPs (PDT and PTT
application) and Met encapsulated in platelet membranes (PM) for a better biocompatibility. They first
evaluated the properties of W18O49 NPs and PM-W18O49 NPs without Met and found respective mean
diameter of 5 nm and 115 nm. Under an 808 nm laser irradiation (1 W∙cm −2, 10 min), a solution of PM-
W18O49 NPs showed an increase of temperature from 24.2 to 61.6°C over time. Moreover, they observed
a conservation, over time, of 1O2 production and of the ability to transform laser energy to heat for PM-
W18O49 NPs contrary to W18O49 NPs alone indicating a protecting effect of PM. The introduction of Met
in PM-W18O49 NPs did not affect its characteristics (size, morphologic, optical) and PM-W18O49-Met NPs
allowed an effective release of Met in the tumour. The efficiency of PM-W18O49-Met NPs to reduce
tumour O2 consumption was evaluated in Raji cells and compared to that of Met alone. For both
compounds, a significant decrease (70%) of O2 consumption rate was observed after 24h incubation. An
induction of hypoxia simultaneously to increase of ROS production was observed for PM-W18O49 NPs
whereas a higher level of ROS production was observed for PM-W18O49-Met NPs with a decrease of
hypoxia. In vitro PTT/PDT studies were performed in Raji cells incubated with PM-W18O49-Met NPs,
PM-W18O49 NPs or W18O49 NPs and irradiated at 808 nm (1 W∙cm−2, 10 min). A highly decrease of cell
viability was observed for all these compounds but PM-W18O49-Met NPs presented the highest
cytotoxicity with a level of viability inferior at 20%. The antitumour efficacy was confirmed by in vivo
tests in mice bearing Raji-lymphoma xenografts injected with the same compounds and irradiated at
808 nm (10 min).
Two others systems based on two different compounds (tamoxifen, TAM, and atovaquone, Ato) able
to reduce O2 consumption have been described. In 2018, Yang et al. [152] developed a system based on
the use of TAM. They combined in solution Ce6-modified HSA (HSA-Ce6) with TAM to induce a self-
assembly of NPs which could be dissociated under acidic pH. They also synthesized as a control
covalently cross-linked HSA-Ce6 NPs (C-HSA-Ce6 NPs). The NPs formed: HSA-Ce6/TAM NPs and C-
HSA-Ce6 NPs presented a hydrodynamic size of 130 nm and 80 nm respectively. When the environment
became acidic, the TAM molecules were protonated, which could induce NPs dissociation. They found
that the presence of TAM and HSA did not affect the 1O2 generation induce by Ce6. In vitro PDT
efficiency was evaluated in 4T1 cells incubated with HSA-Ce6/TAM NPs 6 h before 660 nm light
irradiation (5 mW∙cm−2, 30 min). The HSA-Ce6/TAM NPs showed a photocytotoxicity similar as that
observed for C-HSA-Ce6 NPs or Ce6 alone. By performing in vivo studies, in mice bearing 4T1 tumours,
the authors observed a tumour uptake of HSA-Ce6/TAM NPs significantly higher than C-HSA-Ce6 NPs
or Ce6 alone due to the pH-induced dissociation of HSA-Ce6/TAM NPs in HSA-Ce6 allowing an
intratumoural penetration more efficient. Moreover, they investigated the evolution of tumour
107
oxygenation after injection of HSA-Ce6/TAM NPs by using PA imaging and observed an increase of
tumour oxygenation from 0.91% to 10.9%. By using pimonidazole they found a reduction of hypoxia
from 21.6% to 2.04% for mice treated with HSA-Ce6/TAM NPs. The in vivo PDT efficiency was
evaluated by injection in mice of HSA-Ce6/TAM NPs and C-HSA-Ce6 NPs following by 660 nm light
irradiation. A high phototoxic effect was highlighted for mice treated HSA-Ce6/TAM NPs and light
with some complete eradication of the tumour whereas for the control groups (C-HSA-Ce6 + Light or
HSA-Ce6/TAM NPs alone), any inhibition of tumour growth was observed.
Xia et al. [153] described another vehicle with a reducible size based on gelatin for a better tumour
uptake encapsulating a PS (ICG-BSA nanocomplex) and Ato. The gelatin NPs thus formed were denoted
Ato-ICG-GNPs (437±52 nm). These NPs could be reduced in the tumour by enzymes (matrix
metallopeptidase, MMP-2) and thus highly release in the tumour site Ato and ICG-BSA after only 2
hours (Figure 30).
Figure 30. MMP-2-triggered shape remodelling and cell uptake behaviour of Ato-ICG-GNPs. a) Fluorescence
intensity of ICG-BSA (795 nm) in the supernatant. b) Absorbance of Ato (490 nm) in the supernatant. Adapted from
Xia et al. [153].
The ability of Ato-ICG-GNPs to reduce tumour O2 consumption was investigated in HeLa cells and
compare to Ato alone. The O2 consumption rate was significantly reduced by 50%, after incubation of
cells with 2µM of Ato or Ato-ICG-GNPs and no difference was observed between the two compounds.
The evaluation of OCR was done in both normoxic (21% of O2) and hypoxic (2% of O2) conditions and
any influence of O2 on Ato efficiency was highlighted. It was also observed that in presence of Ato-ICG-
GNPs, the cell proliferation slowed down. (Table 12)
Figure 31. In vivo therapeutic outcome. a) Relative tumour growth curves of mice received different treatments
within a total of 28 days. Control (0.1 mL per mouse, PBS); Ato (0.1 mL per mouse, containing 330.15 µg∙mL −1 Ato);
ICG-BSA (0.1 mL per mouse, containing 37.44 µg∙mL −1 ICG); Ato-ICG-GNPs (0.1 mL per mouse, containing 330.15
µg∙mL−1 Ato and 37.44 µg∙mL−1 ICG). The tumour region was irradiated by a 808 nm laser with a power density of
1 W∙cm−2 for a duration of 5 min at 4 h post injection. (n = 18 in each group). b) Survival profiles as represented by
the calculated rate of survival. Adapted from Xia et al. [153].
108
Table 12. Summary of publications about the reduction of tumour O2 consumption to modify TME.
Ref Application Additional PS Energy of Excitation Type of In vitro In vivo

Compound ROS
[150] PDT Met HCe6 In vitro: 660 nm, 10 min nd 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing mice
In vivo: 660 nm, 30 min, 0.035
W∙cm−2
[151] PDT Met W18O49 808 nm, 1 W∙cm−2, 10 min 1 O2 Raji cell line Raji lymphoma-bearing
mice
[152] PDT TAM Ce6 660 nm, 5 mW∙cm−2, 30 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing mice
[153] PDT Ato ICG-BSA 808 nm, 1 W∙cm−2, 5 min ROS HeLa cell HeLa tumour-bearing mice
nanocomplex line
nd: not determined; Met: Metformin; HCe6: Hydrophobic Chlorin e6; TAM: Tamoxifen; Ato: Atovaquone; ICG-BSA: Indocyanine Green-Bovine Serum Albumin.
109
The PDT efficiency of Ato-ICG-GNPs in comparison with ICG-BSA was investigated in vitro in HeLa
cells incubated with Ato-ICG-GNPs or ICG-BSA and irradiated with an 808 nm laser (1.0 W∙cm−2, 5 min).
A high decrease of cell viability was observed for both with a significantly better phototoxicity for Ato-
ICG-GNPs. In vivo studies in mice bearing HeLa-xenograft confirmed the results observed in vitro with
a high decrease of tumour growth for mice treated with Ato-ICG-GNPs and laser irradiation (treatment
repeated four times) (Figure 31a) and a survival rate of 90% after 3 weeks of treatment (Figure 31b).
3.5. Others
Two others ways to modify the TME have been reported. Gui et al. [154] explored a new strategy
consisting in finding a way to deplete ATP in hypoxic cells. They synthesized a metal-organic
framework NP with Cu2+ and ZnPc-(COOH)8 leading to a 3D architecture ((Cu8(ZnPc-(COOH)8)n,
ZPCN). ZnPc-(COOH)8 was aggregated into the NPs and ROS production was not efficient. The authors
showed that addition of ATP led to the formation of ATP-Cu complex and free ZnPc-(COOH)8 could
then produce again 1O2. In A549 cells after PDT (665 nm) incubation with Cu2+ only did not decrease the
survival, whereas with the PS survival was 55.4 % and with ZPCN 23.7 %. They showed also that cells
treated with ZPCN caused an important decrease in ATP concentration, arrested in the S phase,
suggesting that DNS replication was stopped in the cells, a decrease in GSH level and high production
of ROS and induced mitochondrial transmembrane potential depolarization of 68.72%. In vivo in A549
tumour xenografts in nude mice, PDT (665 nm) induced the suppression of tumour growth.
In 2016, Lv et al. [155] designed two PS based on iridium (III) complexes: Ir(P(ph) 3 and Ir-alkyl
(Figure 32) for the specific targeting of mitochondria and lysosomes, respectively, to enhance the PDT
effect.
Figure 32. Chemical structures of a) Ir-P(ph)3 and b) Ir-alkyl. Adapted from Lv et al. [155].
The authors treated HeLa cells with both complexes at different O2 levels and found that even under
hypoxic conditions, the intracellular O2 concentration remains high for Ir(P(ph)3. They attributed this
finding to an inhibition of respiration in mitochondria due to the PS. The PSs exhibited ϕΔ of 0.17 for
Ir(P(ph)3 and 0.21 for Ir-alkyl. After incubation with Ir(P(ph)3 or Ir-alkyl, under hypoxic conditions, a
high intracellular O2 concentration was observed with Ir(P(ph)3 (11% against 3% for Ir-alkyl). Under a
475 nm irradiation (22 mW∙cm−2, 30 min), for both compounds, cell death occurred in 4 h whereas in
hypoxic conditions, Ir(P(ph)3 was more efficient to kill cells. Moreover, the irradiation of Ir(P(ph) 3
induced more ROS generation than Ir-alkyl under both normoxic and hypoxic conditions.
4. Combined therapies
In many diseases, a single treatment is often not effective or selective enough. One solution is to add
a second therapy to the usual treatment. As a result, there are many opportunities for clinicians to
improve the healing and comfort of patients. The combination of two or more simultaneous or
consecutive modes of action may result in additive or synergistic effects, i.e. creative cooperation. For
example, one often speaks of "cocktail effect" in the case of complex mixtures of chemicals. In the field
of cancer, various modalities can be applied [156,157] and combining several interventions can
minimize drug resistance, or fight against expected resistance.
110
In this section, recent advancements of PDT associated with various other modalities (chemo-,
antiangiogenic-, immuno-, or photothermal therapies) will be addressed.
4.1. Chemo-PDT
Chemotherapy is still the major treatment for many cancers. However, cancer cells can develop drug
resistance, decreasing the effectiveness of the protocol, or even generating recurrence of cancer. The
combination of chemotherapy and PDT as an adjuvant therapy can bring a synergistic effect that can
lead to a decrease in drug doses and reduced systemic toxicity.
4.1.1. Tirapazamine (TPZ)

TPZ belongs to the class of benzotiazine-di-N-oxides of hypoxic cytotoxin. Thanks to a one-electron
reduction of the molecule, free radical species are formed and induce single and double-strand breaks.
Hypoxic microenvironment triggers TPZ. It was the first molecule not based on nitro or quinone
functionalities to induce ROS in hypoxic conditions.
Liu et al. [158] designed double silica-shelled UCNP able of co-delivering silicon phthalocyanine
dihydroxide (SPCD) and TPZ to afford TPZ-UC/SPCD for the NIR-induced synergetic therapy of
tumours, by combining PDT and hypoxia-activated chemotherapy. Under 980 nm laser irradiation (1.4
W∙cm−2, 5 min), TPZ-UC/SPCD generated a large amount of ROS, and therefore high PDT efficacy
against HeLa cells was achieved, resulting in a severe hypoxia which would further facilitate the
activation of TPZ. Furthermore, according to the in vivo studies performed on tumour-bearing nude
mice under 980 nm laser light (1.4 W∙cm−2, 15 min), TPZ-UC/SPCD showed remarkably suppressed
tumour growth compared to UC-PDT alone, which confirmed that the combined TPZ-PDT treatment
could lead to marked cell apoptosis, further demonstrating the synergistic effects.
Guo et al. [159] designed an angiogenesis vessel-targeting NPs (AVT-NPs) that consisted of a PS (5-
(4-carboxyphenyl)-10, 15, 20- tris(3-hydroxyphenyl)chlorin, TPC), angiogenic vessel-targeting peptide
(GX1 cyclopeptides), and TPZ (Figure 33).
Figure 33. Schematic illustration and characterizations of AVT-NPs. (A) The formation of AVT-NP, generation of
cytotoxic TPZ radical under hypoxic conditions in cancer cells, and illustration of AVT-NP/TPZ based PDT that
induces a local hypoxic environment and promoted angiogenesis for targeted drug delivery and synergistic chemo-
photo therapy. Reprinted from [159] with permission from Elsevier Ltd, Copyright 2017.
The designed AVT-NPs showed high accumulation efficiency at the tumour site, resulting in a large
production of ROS under laser (650 nm, 1.2 W∙cm−2, 10 min) irradiation, and therefore high PDT efficacy
111
was achieved which resulted in a severe hypoxia and increased angiogenesis. In the meantime, the
exaggerated hypoxia further activated the bioreductive prodrug TPZ to also release highly cytotoxic
radicals, leading to an enhanced antitumour efficacy both in vitro and in vivo (MCF-7 cells, 650 nm, 1.2
W∙cm−2, 10 min) compared to free drug or non-targeted nanodrugs.
Li et al. [160] demonstrated a novel biomimetic nanoplatform (TPZ@PCN@Mem) for tumour-
targeted combination therapy. TPZ@PCN@Mem was elaborated by loading the hypoxia-activated
prodrug TPZ in a PCN-224 porphyrinic metal organic framework and then coating with the homotypic
cancer cell membranes. The authors found that PCN-224 present in the nanoplatform generated large
amounts of cytotoxic ROS once exposed to laser irradiation (660 nm, 30 mW∙cm−2, 30 s) and the resulting
hypoxia in the tumour aggravated by the photochemical O2 depletion further facilitated the activation
of TPZ for successive bioreductive chemotherapy. Thus, according to the both in vitro (660 nm, 30
mW∙cm−2, 5 min) and in vivo (660 nm, 220 mW∙cm−2, 10 min) investigations, TPZ@PCN@Mem exhibited
highly efficient therapeutic effect against a 4T1 tumour model with negligible side effects.
Wang et al. [161] reported the development of hybrid PLGA/lipid NPs able of codelivering ICG and
TPZ to solid tumours by combining PDT and hypoxia-activated chemotherapy against metastatic breast
cancer. Further conjugation of the NPs to iRGD (CRGDKGPDC) peptide provided NPs (iNP/IT) studied
in both 3D tumour spheroids in vitro and orthotopic breast tumours in vivo. Upon near-IR laser (808
nm, 2 W∙cm−2, 3 min), the NPs showed a high ROS production and therefore an important antitumour
efficacy against metastatic 4T1 tumour model under normal O2 conditions. Meanwhile, the hypoxic
microenvironment in tumours triggered TPZ for synergistic cell-killing effect. Furthermore, according
to the in vivo results (4T1 tumour-bearing mice, 808 nm, 2 W∙cm−2, 5 min), iNP/IT could inhibit both
primary tumour growth and metastasis with minimal side effects contrary to a mixture of NPs
containing individual drugs.
Chen et al. [162] have successfully developed photolabile HSA-based NPs modified with diazirine
(DA) and loaded with ICG and TPZ (ICG/TPZ@HSA dNMs). Such photoresponsive ICG/TPZ@HSA
dNMs were able to form aggregates via crosslinking of surface DA groups upon 405 nm (1.0 W∙cm −2)
laser irradiation, thus causing enhanced tumour site accumulation and prolonged retention time. A
successive laser exposure (808 nm, 1.0 W∙cm−2, 7 min) of the ICG/TPZ@HSA dNMs at the tumour area
enabled to trigger a cascade of synergistic therapeutic events by generation of ROS, hyperthermia, and
consequent hypoxia microenvironment, which activated the initially nontoxic TPZ. Following systemic
administration to mice bearing 4T1 tumours, ICG/TPZ@HSA dNMs eradicated efficiently the tumours
by sequential irradiation of lasers (405 nm, 0.75 W∙cm−2, 5 min and 808 nm, 1.0 W∙cm−2, 10 min).
Liu et al. [163] designed a multifunctional (Hf/TCPP) NMOF platform, denoted Hf/TCPP loaded
with TPZ. Thanks to their porous surface nature, the Hf/TCPP NMOFs possessed a high TPZ loading
capacity (80 %). In addition, further surface PEGylation with DOPA-PIMA-mPEG enhanced their
dispersibility and stability in physiological media and, significantly controlled the release rate of TPZ
within TPZ/Hf/TCPP/PEG. Exposure of TPZ/Hf/TCPP/PEG NMOFs to laser irradiation (635 nm, 12
mW∙cm−2, 9 min) provoked an efficient ROS production, triggered the activation of TPZ and as
consequently a great cytotoxic effect against both HeLa and 4T1 cells. Finally, the in vivo studies (635
nm, 0.1 W∙cm−2, 30 min) confirmed the prominent antitumour efficacy against 4T1 tumours.
Yang et al. [164] developed another drug delivery system for synergistic breast cancer treatment. The
lipid carrier denoted Lip(IR780&TPZ) was successfully prepared by encapsulating the lipophilic IR780
in the phospholipid bilayer of liposome while TPZ was loaded in the hydrophilic core. According to
both in vitro and in vivo results, (Figure 34), the lipidic carrier Lip(IR780&TPZ) could exert PDT by
generating 1O2 once exposed to laser irradiation (808 nm, 1.0 W∙cm−2, 3 min) in 4T1 tumour, leading to
the formation of a hypoxic microenvironment which activated TPZ.
112
Figure 34. a): Survival of 4T1 cells after photo-thermal treatment: Viability of cells treated with different
formulations under an 808 nm laser for 3 min with a sequence of 10 s irradiation and 10 s break. b): Toxicity of
Lip(IR780&TPZ) in 4T1 tumour-bearing mice: Tumour weights in the different groups of mice after the indicated
treatments. Adapted from Yang et al. [164].
Zhang et al. [165] reported the synthesis of an innovative hypoxia-responsive 2-nitroimidazole (NI)
derivative conjugated with PEG amphoteric polymer-based liposomes (PEG-NI) co-encapsulating Ce6,
TPZ and a gene probe (PmiRNA) for synergistic PDT-chemotherapy. Exposition of the multifunctional
liposomes (Lip/Ce6/TPZ-PmiRNA) to laser irradiation (670 nm, 0.48 W∙cm−2, 10 min) caused Ce6-mediated
PDT and severe hypoxia, leading to the disassembly of the liposome and activation of the TPZ. A greatly
improved anti-cancer activity compared to conventional PDT was achieved upon laser irradiation (670
nm, 0.48 W∙cm−2, 10 min) for both in vitro and in vivo studies in MCF-7 cell lines, indicating the benefit
of the hypoxia-activated chemotherapy combined PDT of the as prepared multifunctional liposomes for
synergistic treatment.
Wang et al. [166] elaborated a multifunctional supramolecular vesicles based on the recognition of
water-soluble pillar [5]arene (WP5) and NIR-absorbing diketopyrrolopyrrole (DPP)-based guest (G) for
combined photothermal/photodynamic/hypoxia-activated chemotherapy. These supramolecular
vesicles were able to highly encapsulate TPZ. The photothermal conversion efficiency and ROS
generation ability of the vesicles were investigated (660 nm, 1.5 W∙cm−2, 7 min). The results revealed that
such vesicles could efficiently convert O2 to 1O2 for PDT. Meanwhile, the continuous O2 consumption
during the PDT process resulted in hypoxic microenvironment, which triggered antitumour activity of
the TPZ-loaded vesicles for synergistic enhancement of anticancer efficacy in vitro against MCF-7 cancer
cells (Figure 35). (Table 13)
Figure 35. In vitro cytotoxicity of MCF-7 cancer cells incubated for 24 h with free TPZ, unloaded vesicles, and TPZ-
loaded vesicles in the dark (a) and in light (b). Adapted from Wang et al. [166].
113
Table 13. Summary of publications about the use of TPZ for Chemo-PDT.
Ref Application Supplementary Chemo- PS Energy of Excitation Type of In vitro In vivo

Therapy used Drug ROS
[158] Chemo- Chemotherapy TPZ SPCD In vitro: 980 nm, 0.7 W∙cm−2, 5 min 1O2 and HeLa cell line HeLa tumour-
PDT In vivo: 980 nm, 1.4 W∙cm−2, 15 min others ROS bearing mice
[159] Chemo- Chemotherapy TPZ TPC 650 nm, 1.2 W∙cm−2,10 min 1O2 MCF-7 cell MCF-7 tumour-
PDT line bearing mice
[160] Chemo- Chemotherapy TPZ PCN-224 In vitro: 660 nm, 30 mW∙cm −2, 5 min 1 O2 4T1 and 4T1 tumour-
PDT In vivo: 660 nm, 220 mW∙cm −2, 10 COS7 cell bearing mice
min lines
[161] Chemo- Chemotherapy TPZ ICG In vitro: 808 nm, 2 W∙cm−2, 3 min 1 O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
PDT In vivo: 808 nm, 2 W∙cm−2, 5 min bearing mice
[162] Chemo- Chemotherapy TPZ ICG 405 nm, 0.75 W∙cm−2, 5 min and 808 1 O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
PDT nm, 1.0 W∙cm−2 , 10 min bearing mice
[163] Chemo- Chemotherapy TPZ TCPP In vitro: 635 nm, 12 mW∙cm−2, 9 min 1 O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
PDT In vivo: 635 nm, 0.1 W∙cm−2, 30 min bearing mice
[164] Chemo- Chemotherapy TPZ IR780 808 nm, 1 W∙cm−2, 3 min 1 O2 4T1 cell line 4T1 tumour-
PDT bearing mice
[165] Chemo- Chemotherapy TPZ Ce6 670 nm, 0.48 W∙cm−2, 10 min 1 O2 MCF-7 cell MCF-7 tumour-
PDT line bearing mice
[166] Chemo- Chemotherapy TPZ Diketopyrrolopyrrole 660 nm, 1.5 W∙cm2, 10 min 1 O2 MCF-7 cell No
PDT (DPP)-based compound line
TPZ: Tirapazamine; SPCD: silicon phthalocyanine dihydroxide; TPC: 5-(4-carboxyphenyl)-10, 15, 20-tris(3-hydroxyphenyl) chlorin; PCN-224: porphyrinic metal
organic framework; ICG: Indocyanine green; TCPP: Carboxyphenyl-porphyrin; Ce6: Chlorin e6.
114
4.1.2. Doxorubicin (Dox)

DOX is an anthracycline that slows or stops the growth of cancer cells by poisoning TOP-2. Qian et
al. [167] reported the synthesis of light-activated hypoxia-responsive NPs by combining the PDT and
hypoxia responsive chemotherapy. Such a conjugated polymer-based delivery system denoted as
DOX/CP-NI NPs were designed based on three components, i.e., 2-nitroimidazole-grafted conjugated
polymer (CP-NI), polyvinyl alcohol (PVA) and DOX (Figure 36).
Figure 36. Schematic of the light-activated hypoxia-responsive drug-delivery system. Formation and mechanism
of DOX/CP-NI NPs. Reprinted from [167] with permission from John Wiley and Sons, Copyright 2016.
According to both in vitro and in vivo studies on HeLa cells, DOX/CP-NI NPs could efficiently
generate ROS when exposed to light irradiation (532 nm, 0.1 W∙cm−2, 20 min). Meanwhile, the
continuous O2 consumption for PDT facilitate generation of hypoxic conditions which promoted the
disassembly of DOX/CP-NI, and thus an efficient DOX release which resulted in enhanced anticancer
effect.
Hu et al. [168] synthesized multifunctional polymeric Ce6-DOX-MnO2 NPs (CDM NPs) for
combined chemo and PDT enhanced by O2 generation. The CDM NPs were fabricated by hierarchically
assembling DOX, Ce6 and colloidal MnO2 with poly (ε-caprolactone-co-lactide)-β-
poly(ethyleneglycol)-β-poly(ε-caprolactone colactide). Once administrated through systemic injection,
the CDM NPs passively accumulated in the tumour, induced decomposition of endogenous tumour
H2O2 under laser irradiation (660 nm, 100 mW∙cm−2, 5 min) to generate O2 and Mn2+ for T1-weighted
MRI. More importantly, CDM NPs dramatically improved antitumour efficiency against MCF-7
tumour-bearing mouse mode. Luo et al. [169] elaborated tumour-targeted hybrid protein O2 carriers
loaded with DOX and Ce6 (ODC-HPOCs) (Figure 37).
Figure 37. Schematic illustration of the fabrication of the ODC-HPOCs [169].
Laser irradiation (660 nm, 100 mW∙cm−2, 2 min) of tumour-targeted ODC-HPOCs allowed
outstanding performance in tumour accumulation of O2, DOX and Ce6. The high O2 affinity of ODC-
HPOCs guaranteed sufficient tumour oxygenation, which was able to break hypoxia-induced
115
chemoresistance through inhibiting the expressions of HIF-1α, multidrug resistance 1 (MDR1) and P-
glycoprotein (P-gp). Meanwhile, the abundant O2 enhanced the ROS generation in PDT, and the
enhanced chemo-PDT (660 nm, 100 mW∙cm−2, 2 min) managed to offer a single-dose treatment with
minimized concentration of DOX and Ce6.
Xu et al. [170] designed mesoporous MnO2 (mMnO2)-coated UCNPs for TME-enhanced chemo-PDT
and multiple imaging under NIR light excitation. The mesoporous silica shell covalently loaded with
Ce6 were coated on the core–shell structured UCNPs (NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4:Yb). Subsequently,
mMnO2 was coated on silica shell and then modified with PEG and loaded with DOX to obtain
UCNPs@Ce6@mSiO2@mMnO2-PEG-DOX (UCSM-PEG-DOX). Upon 980 nm irradiation (0.5 W∙cm−2, 5
min), the fast degradation of mMnO2 shell in TME resulted in markedly enhanced T1-contrast MRI
signals, an efficient DOX release, and greatly relieved tumour hypoxia by in situ generation of O 2.
Xie et al. [171] developed a novel O2-loaded pH-responsive multifunctional nanodrug carrier
UC@mSiO2-RB@ZIF-O2-DOX-PEGFA (URODF) for an improved chemo-PDT efficiency.
NaYF4:Yb/Er@NaYbF4:Nd@NaGdF4 NPs (UC) were employed for dual-modal upconversion/MR
imaging. Meanwhile, the core−shell structure allowed UC NPs to activate RB in the mesoporous silica
shell (mSiO2) for PDT in 808 nm laser irradiation. Thus, under acidic conditions, the outmost O 2
reservoir ZIF-90 shell would decompose, allowing quick release of O2 and DOX at low pH TME, and
therefore achieving improved synergetic therapy and alleviating tumour hypoxia. Finally, according to
the in vitro (808 nm, 0.5 W∙cm−2, 10 min) cytotoxicity against 4T1 and HeLa cells and in vivo (808 nm,
0.5 W∙cm−2, 5 min) tumour inhibition studies against H22 cancer cells, the URODF NPs demonstrated
remarkably enhanced tumour inhibition effect.
He et al. [172] reported a cancer-targeting vehicle characterized by cascaded reactivity to external
(light) and internal (hypoxia) triggers for selective release of the cancer drug. The hypoxia- responsive
drug delivery was prepared from self-assembled polyethylenimine-nitroimidazole (PEI-NI) micelles
loaded with DOX that were further co-assembled with HA-conjugated Ce6 (HC) to form NPs. Upon
internalization into mouse Lewis lung carcinoma (LLC) cells via CD44-mediated endocytosis, the
hypoxia-responsive HC/PN/DOX NPs generated high levels of ROS under light irradiation (660 nm, 10
mW∙cm−2, 30 min) The continuous O2 consumption provoked the disassembly of the DOX-loaded PEI-
NI micelles which maximized the DOX release.
Yang et al. [173] developed a multifunctional NP composed of an iron oxide (Fe 3O4) core coated to a
combined shell of MnO2 and polypyrrole (PPy), which was both the photothermal agent and PS, to
formed Fe3O4@MnO2@PPy. Magnetic Fe3O4 was used to increase the intracellular O2 concentration. DOX
was loaded on the Fe3O4@MnO2@PPy nanocomposite to finally obtain Fe3O4@ MnO2@PPy-DOX NPs.
The increase of O2 concentration was proven in presence of H2O2 with these NPs. In vitro experiments
were performed on HepG2 and Chinese hamster ovary (CHO) cells to study the chemotherapeutic effect
of the Fe3O4@ MnO2@PPy-DOX NPs for cancer and normal cells. An acidic environment-dependent of
DOX release was highlighted for the NPs as well as synergistic effects of chemotherapy and PTT/PDT
improved by the increase of O2 tumour level. An enhancement of cellular uptake and an increase of cell
death was observed with the combined chemo-PTT/PDT (638 nm, 1 mW∙cm−2, 10 min) treatment using
Fe3O4@ MnO2@PPy-DOX NPs.
Deng et al. [174] reported the synthesis of multifunctional nitroimidazole (NI)-bearing polymeric
micelles to co-deliver DOX and Ce6 for dually hypoxia- and 1O2-responsive integration of chemotherapy
and PDT. As proof of concept, in vitro and in vivo studies were investigated on 4T1 cells and 4T1
tumour-bearing mouse model, respectively. It was found, that upon 660 nm laser irradiation (100
mW∙cm−2, 10 min), the NCs/Dox + Ce6 produced large amount of 1O2, which caused oxidation of NI,
provoking micelle collapse, triggered payload release, and the production of aldehyde which results in
high PDT effect. Meanwhile, the continuous consumption of 1O2 resulted in a hypoxic environment,
which triggered the micelle disassembly, DOX release, and thus caused glutathione GSH depletion that
provided a supplementary anti-tumour efficacy. (Table 14)
116
Table 14. Summary of publications about the use of DOX for chemo-PDT.
Ref Application Supplementary therapy Drug PS Energy of excitation Type of In vitro In vivo
used ROS
[167] Chemo- Chemotherapy DOX 2-nitroimidazole In vitro: light, 0.1 W∙cm−2 , 5 or 20 min 1O2 HeLa cell HeLa tumour-
PDT (NI) In vivo: 532 nm, 0.1 W∙cm−2, 5 min or 635 line bearing mice
nm, 0.1 W∙cm−2, 5 min
[168] Chemo- Chemotherapy DOX Ce6 In vitro: 660 nm, 100 mW∙cm−2, 5 min 1 O2 MCF-7 cell MCF-7 tumour-
PDT In vivo: 660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min line bearing mice
[169] Chemo- Chemotherapy DOX Ce6 In vitro: 660 nm, 100 mW∙cm−2, 2 min 1 O2 MCF-7 cell Female BALB/c
PDT In vivo: 660 nm, 100 mW∙cm−2, 20 min line nude mice
[170] Chemo- Chemotherapy DOX Ce6 980 nm, 0.5 W∙cm−2, 5 min ROS HeLa cell U14 tumour-bearing
PDT line mice
[171] Chemo- Chemotherapy DOX RB In vitro: 808 nm, 0.5 W∙cm−2, 10 min 1 O2 L929 cell H22 tumour bearing
PDT In vivo: 808 nm, 0.5 W∙cm−2, 5 min line mice
[172] Chemo- Chemotherapy DOX Ce6 In vitro: 660 nm, 2 mW∙cm−2, 30 min 1 O2 LLC cell LLC tumour bearing
PDT In vivo: 660 nm, 10 mW∙cm−2, 30 min line mice
[173] Chemo- Chemotherapy DOX PPy 638 nm, 1 W∙cm−2, 10 min 1 O2 HepG2 cell No
PDT line
[174] Chemo- Chemotherapy DOX Ce6 660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min 1 O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
PDT mice
DOX: Doxorubicin; Ce6: Chlorin e6; RB: Rose Bengal; PPy: Polypyrrole.
117
4.1.3. AQ4N
AQ4N is a banoxantrone (Figure 38) and a hypoxia-activated prodrug (HAP) which can be reduced
by endogenous isozymes (inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cytochrome P450 (CYP) in
hypoxia conditions.
Figure 38. Structure of AQ4N.
Feng et al. [175] prepared a liposome (AQ4N-64Cu-hCe6-liposome) encapsulating hydrophilic AQ4N

and hydrophobic hexadecylamine conjugated hCe6 cHeLated with a 64Cu isotope for in vivo positron
emission tomography (PET) and a combined hypoxia-activated chemo-PDT. In vitro fluorescence
imaging showed an efficient accumulation of these liposomes after intravenous injection in 4T1 cells.
Moreover, an effective cell killing ability was observed after illumination (660 nm, 30 min) of cells
treated with AQ4N-64Cu-hCe6-liposome. In vivo PDT experiments (660 nm, 2 mW∙cm−2, 1 h) were
performed in 4T1 tumour-bearing mice injected with AQ4N-64Cu- hCe6-liposome and a severe tumour
hypoxia was observed triggering the activation of AQ4N and thus improved the inhibition of tumour
growth.
A graphene oxide (GO)-based NP was designed by Luan et al. [176] for a trimodal cancer therapy.
This NP was composed of verteporfin (VP) and the peptide c(RGDfK) for vascular-targeted PDT, AQ4N
as hypoxia-activated prodrug (HAP), and HIF-1α siRNA (siHIF-1α) to suppress the HIF-1α expression
upon hypoxia and thus increase the AQ4N activation. These NPs significantly hindered the growth of
tumours in PC-3 models in vivo after illumination (690 nm, 30 mW∙cm−2, 10 min) compared to the
control groups.
He et al. [177] engineered NPs for hypoxia-activated chemo-PDT composed of pegylated UiO-66
NMOFs co-anchoring a PS photochlor (HPPH) and an azide group and encapsulating AQ4N (Figure
39).
Figure 39. Schematic illustration showing the synthetic procedure of A@UiO-66-H-P NPs and the mechanism of
PDT and hypoxia-activated cascade chemotherapy. Reprinted from [177] with permission from John Wiley and
Sons, Copyright 2018.
118
Table 15. Summary of publications about the use of AQ4N for chemo-PDT.
Ref Application Supplementary therapy Drug PS Energy of Excitation Type of In vitro In vivo
used ROS
[175] Chemo- Chemotherapy AQ4N Ce6 In vitro: 660 nm, 2 mW∙cm−2, 30 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
PDT min mice
In vivo: 660 nm, 2 mW∙cm−2, 1 h
[176] Chemo- Chemotherapy AQ4N Verteporfin In vitro: 690 nm, 30 mW∙cm−2, 1O2 PC-3 cell line PC-3 tumour-bearing
PDT 10 min mice
In vivo: 690 nm, 50 mW∙cm−2,
20 min
[177] Chemo- Chemotherapy AQ4N Photochlor In vitro: 671 nm, 100 mW∙cm−2, ROS U87MG cell U87MG tumour-bearing
PDT (HPPH) 6 min line mice
In vivo: 671 nm, 100 mW∙cm−2,
10 min
Ce6: Chlorin e6.
119
In both in vitro and in vivo studies (U87MG cells and tumour, 671 nm, 100 mW∙cm −2, 6 min) the
authors observed that the O2-depleting PDT with these NPs conducted to an intracellular/tumour
hypoxia leading to the activation of AQ4N and thus an efficient synergistic chemo-PDT therapy. (Table
15)
4.1.4. Platinium drugs

Platinium (IV) complexes are prodrugs which can be reduced in toxic Pt (II), by UV light irradiation
or reducing agents. These species act as drugs for chemotherapy. Guo et al. [178] reported a Pt(IV)
complex-based photoactivatable polyprodrug able to simultaneously generate highly toxic Pt(II) species
for chemotherapy and a high level of ROS. This chemo-PDT concept did not rely on the use of a PS and
the consumption of O2. The polyprodrug was obtained by co-polymerizing Pt(IV) complex-based
prodrug monomer (PPM) with 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC), nanosized hydrogel-
like polyprodrug. Under light exposure, a reduction of Pt(IV) moieties contained in this
photoactivatable polyprodrug was observed leading to the generation of Pt(II) species. In vitro
experiments were performed in A549 cancer cells and in vivo in nude mice bearing A 549 cells and IC50
values for polyPPM of 2.6 mM and 2.9 mM against A549 and cisplatin-resistant A549R cells respectively
were observed under irradiation (396 nm, 5 mW∙cm−2, 5 min). In vivo A549 tumour- bearing mice were
treated with polyPPM and light irradiation (0.4 W∙cm−2, 10 min) and resulted in the decrease in tumour
growth.
The same strategy was described by Xu et al. [179]. They developed a NP containing Pt(IV) and Ce6,
loading with UCNPs for the conversion of 980 nm near-infrared light into 365 nm and 660 nm emissions.
After tumour accumulation, the NPs were triggered by a 980 nm laser to generate O2 and could also
release active Pt(II). Results suggested that NPs generated O2 inside HeLa and L929 cells (980 nm, 0.85
W∙cm−2, 5 min). In vivo in HeLa, B16 (Murine tumour cell line skin cancer), HCT116 (Human colon
cancer cell line) and MDA-MB-231 tumour model, the capability of NPs to improve tumour hypoxia
was demonstrated (980 nm, 0.80 W∙cm−2, 10 min).
A new kind of compounds (covalent-organic polymers, COPs) which are able to cross-linked
differents organic molecules by covalent bond to form organic network structures have been used in
various fields. Wang et al. [180] cross-linked a PS, mesotetra(p-hydroxyphenyl) porphine (THPP), to a
chemotherapeutic pro-drug, cis-Pt (IV) and conjugated to PEG to obtain THPP-Pt-PEG COPs. Cis-Pt(IV)
was also used as a reduction-responsive linker. The ability of THPP-Pt-PEG COPs to kill cancer cells
after PDT (660 nm, 5 mW·cm−2, 20 min) was observed in 4T1 cells and a reduction-responsive
degradation/drug release was highlighted. After injection of THPP-Pt-PEG COPs in 4T1 tumour-
bearing mice, the combined chemo-PDT (660 nm, 5 mW·cm−2, 45 min) of the COPs showed a n
improvement of therapeutic outcome in comparison with PDT and chemotherapy taken separately
(Table 16).
4.2. Antiangiogenic-PDT
PDT also induces expression of angiogenic and survival molecules including VEGF, cyclooxygenase-
2 (COX-2), and MMPs. The founding member of the hypoxia-inducible factor (HIF) family, HIF-1α,
regulates a broad array of genes in response to O2 deprivation.
4.2.1. HIF-1α inhibitors

The expression of HIF-1α is increased after PDT treatment of cancer cells, which induces PDT
resistance. The inhibition of HIF-1α combined to PDT can lead to an improvement of the PDT efficiency.
Chen et al. [181] developed anisamide-targeted lipid–calcium–phosphate (LCP) NPs encapsulating HIF-
1α siRNA to reduce the expression of HIF-1α prior to PDT treatment with Photosan®. In vitro in SCC4
and SAS cells, targeted LCP with anisamide showed an efficient release of HIF-1α siRNA 2.5 or 3.5 fold
higher than observed for LCP without anisamide.
120
Table 16. Summary of publications about the use of Pt (IV) drugs for chemo-PDT.
Ref Application Supplementary Drug PS Energy of Excitation Type of In vitro In vivo

Therapy used ROS
[178] Chemo- Chemotherapy Pt (IV) No In vitro: 396 nm, 5 mW·cm−2, 5min ●OH and A549 cell line A549 tumour- bearing
PDT complex In vivo: 396 nm, 0.4 W·cm−2, 10 min 1O2 mice
[179] Chemo- Chemotherapy Pt (IV) Ce6 980 nm near-infrared light convert into 1O2 L929 cell line HeLa, B16, HCT116 or
PDT Up conversion 365 nm and 660 nm emissions MDA-MB-231
NP In vitro: 0.85 W∙cm−2, 5 min tumour-bearing mice
In vivo: 0.80 W∙cm−2, 10 min
[180] Chemo- Chemotherapy cis-Pt (IV) THPP In vitro: 660 nm, 5 mW·cm−2, 20 min 1O2 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
PDT In vivo: 660 nm, 5 mW·cm−2, 45 min mice
Ce6: Chlorin e6; THPP: mesotetra(p-hydroxyphenyl)porphine.
121
Treatment with these NPs prior to photosan-PDT (640 nm, 320 mW∙cm−2, 100 J∙cm−2) led to a
significant decrease of cell viability in comparison with PDT alone. In vivo in SCC4 and SAS tumour-
bearing mice, the combination of HIF-1α siRNA and PDT led to a significant decrease of tumour volume
(40 %) after 10 days.
Sun et al. [182] designed a multifunctional compound (siHIF@CpMB) constituted by cationic
porphyrin lipip microbubbles (CpMBs), elaborated from cationic porphyrin lipip NPs, and loading HIF-
1α siRNA (siHIF) on the surface by electronic adsorption. In vitro in MDA-MB-231 cells, the authors
observed an efficient release of siHIF after ultrasound exposure (1.03 MHz, 50 % duty, 1 W∙cm−2, 1 min)
and production of 1O2 after irradiation (650 nm, 200 mW∙cm−2, 10 min). Moreover, the combinaison of
siHIF treatment and PDT led to significant effect to kill cancer cells in both in vitro and in vivo models.
Broekgaarden et al. [183,184] elaborated a strategy relying on the use of acriflavine (ACF) to inhibit
the expression of HIF-1α in combinaison with PDT treatment with ZnPC-ETLs (Zinc Phthalocyanine in
endothelium-targeting liposomes). An increase of HIF-1α expression has been observed with PDT
alone. The authors observed an increase of PDT effect (500 mW, 15 J∙cm −2) with the addition of ACF
before PDT in both normoxic and hypoxic conditions in vitro in human perihilar cholangiocarcinoma
models (SK-ChA-1 cells). They reproduced the experience in A431 cells and observed an increase of cell
death in hypoxic conditions after combination of ACF and PDT (671 nm, 500 mW∙cm −2, 15 J∙cm−2)
whereas no adjuvant effect of ACF was highlighted in normoxic conditions. (Table 17).
4.2.2. VEGF Inhibitors

Vascular endothelial growth-factor (VEGF) is overexpressed in tumour after PDT treatment and is
involved in the neovascularisation of tumours which can induce PDT resistance. The inhibition of VEGF
during PDT can lead to an enhancement of its efficiency.
Ferrario et al. [185] studied the overexpression of HIF-1α and VEGF after PDT treatment (570-650
nm, 0.35 mW∙cm−2) with Photofrin of BA tumours (mouse mammary carcinoma). To reduce this
overexpression and thus improving the efficiency of PDT, they combined antiangiogenic therapy with
PDT by treating mice with an angiogenic synthetic dipeptide (IM862) or an endothelial-activating
polypeptide (EMAP-II) to inhibit VEGF production. The authors observed a decrease of VEGF level
after combined antiangiogenic-PDT therapy (630 nm, 75 mW∙cm−2, 200 J∙cm−2) with IM862 or EMAP-II
and Photofrin as well as an increase of the tumoricidal action of PDT.
Zhou et al. [186] examined the influence of antiangiogenic coumpounds (VEGF inhibitors: SU5416
and SU6668) in combination with PDT with hypericin. In vivo studies in CNE2 tumour-bearing mice
(poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma) showed a significant inhibition of tumour growth for
mice treated with SU5416 or SU6668 in combination with PDT (halogen light source, 47.7 J∙cm −2, 60
mW∙cm−2) with a better enhancement of the tumour response to PDT with SU6668.
Weiss et al. [187] compared the used of two types of compounds: an anti-VEGF antibody
(bevatizumab) and angiostatic tyrosine kinase inhibitors (TKIs, sunitinib, sorafenib and axitinib) to
inhibit VEGF receptor for an antiangiogenic treatment in combinaison with PDT using visudyne. They
chose two tumour models (A278 human ovarian carcinoma cells and HCT-116 human colorectal
carcinoma cells) implanted in chorioallantoic membrane of the chicken embryo. They observed the best
improvement of PDT (35 mW∙cm−2, 5 J∙cm−2) by combination with TKIs especially sorafenib and axitinib,
the last one leading to a complete suppression of VEGFR-2 receptors expression in the vasculature of
the tumour. The use of bevacizumab did not lead to any improvement of PDT.
122
Table 17. Summary of publications about the use of HIF-1α inhibitors for antiangiogenic-PDT.

Therapy used ROS
[181] Antiangiogenic- Antiangiogenic HIF-1α Photosan 640 nm, 320 mW∙cm−2, 100 nd SCC4 and SCC4 and SAS tumour
PDT siRNA J∙cm−2 SAS cell lines bearing nude mice.
[182] Antiangiogenic- Antiangiogenic HIF-1α Cationic porphyrin- 650 nm, 200 mW, 10 min 1 O2 MDA-MB-231 MDA-MB-231 tumour-
PDT siRNA grafed lipid cell line bearing mice
[183] Antiangiogenic- Antiangiogenic Acriflavine ZnPc 671 nm, 500 mW, 15 J∙cm−2 nd A431 cell line No
PDT
[184] Antiangiogenic- Antiangiogenic Acriflavine ZnPc 671 nm, 500 mW, 15 J∙cm−2 ROS SK-ChA-1 cell No
PDT line
nd: not determined; HIF-1α siRNA: hypoxia-inducible factor-1α small interfering RNA; ZnPc: zinc phthalocyanine.
123
Lecaros et al. [188] combined PDT using Photosan® with lipid-calcium–phosphate NPs (LCP NPs)
delivering VEGF-A small interfering RNA (siVEGF-A) in cells to enhance the PDT effect by decreasing
VEGF-A expression. In vivo studies in human oral squamous cancer cell (HOSCC), SCC4 and SAS
models were performed and the combinaison of siVEGF-A and PDT (640 nm, 320 mW∙cm−2, 100 J∙cm−2,
11 min) induced a significant reduction of tumour volume in both models.
Liang et al. [189] synthesized pH-responsive direct-acting-antiviral (DAA) NPs with an average
diameter of 55 ± 2 nm and composed of dimethylxanthenone-4-acetic acid (DMXAA) as active-targeting
VEGF receptor and diketopyrrolopyrrole (DPP-4) as PTT/PDT agent to improve combined PTT/PDT
treatment by the destruction of the vascular region of tumours (Figure 40). Under acidic conditions of
the TME, there was an effective release of DMXAA and an increase of 1O2 generation as well as a good
photothermal effect in comparison with pH of 7.4. In vitro and in vivo studies in HeLa tumour model
highlighted an efficient synergitic effect of antivascular activity of DMXAA and PTT/PDT (660 nm, 0.8
W∙cm−2, 4 min) to kill cancer cells with a complete ablation of tumour (Table 18).
Figure 40. Antivascular and pH-Responsive Cancer PTT/PDT of DAA NPs at the tumour site. Reprinted from [189]
with permission from the American Chemical Society, Copyright 2018.
4.2.3. Others
Cyclooxygenase 2 (COX-2) expression is induced by PDT treatment and it is involved in the
progression of cancer. In 2005, Ferrario et al. [190] evaluated the effect of COX-2 inhibitors (celecoxib, a
COX-2 selective nonsteroidal anti-inflammatory drug or NS-398, a COX-2 inhibitor) combined to PDT
with Photofrin on cancer cell death in comparison with PDT alone. In vitro in BA cells, they observed a
light dose-dependent increase of apoptosis of cancer cells after combined PDT (570-650 nm, 0.35
mW∙cm−2, 0 to 525 J∙cm−2, 0 to 150 s) with COX-2 inhibitors. In vivo (630 nm, 75 mW∙cm−2, 0 to 200 J∙cm−2)
injection of COX-2 inhibitors decreased angiogenesis and inflammation and increased PDT efficiency.
Tuncel et al. [191] synthesized a phthalocyanine−chalcone conjugate composed of chalcones holding
properties of vascular disrupting agents (VDA) and a phthalocyanine as the PS. They observed a
moderate inhibition of HUVEC (human umbilical vein endothelial cell) proliferation after treatment
with the conjugate lower than those observed with chalcone alone as well as a lower 1O2 for the
conjugate in comparison with the PS alone (55% against 83%). However, PDT treatment (red light, 3.6
J∙cm−2) with the conjugate in vitro in human colon adenocarcinoma cells (HT-29) led to the best
efficiency, which could be explained by a better cellular uptake thanks to its amphiphilic character.
124
Table 18. Summary of publications about the use of VEGF inhibitors for antiangiogenic-PDT.
Ref Application Therapy Used Drug PS Energy of Excitation Type In vitro In vivo
of ROS
[185] Antiangiogenic- Antiangiogenic EMAP-II or IM862 Photofrin In vitro: 570-650 nm, 0.35 mW∙cm−2 nd BA cell line BA tumour-bearing
PDT In vivo: 630 nm, 75 mW∙cm−2, 200 J∙cm−2 mice
[186] Antiangiogenic- Antiangiogenic SU5416 and SU6668 hypericin Halogen light with red acetate filter, nd No CNE2 tumour-
PDT 47.7 J∙cm−2, 60 mW∙cm−2 bearing mice
[187] Antiangiogenic- Antiangiogenic sunitinib, sorafenib and Visudyne 420 nm, 5 J∙cm−2, 35 mW∙cm−2 nd No A2780 tumour-
PDT axitinib/bevacizumab bearing mice
[188] Antiangiogenic- Antiangiogenic VEGF-A siRNA Photosan 640 nm nd SCC4 and SCC4 and SAS
PDT In vitro: 10 J∙cm−2, 159 s SAS cell tumour bearing
In vivo: 320 mW∙cm−2, 100 J∙cm−2, 11 min lines nude mice
[189] Antiangiogenic- Antiangiogenic 5,6-dimethylxanthenone- DPP-4 660 nm, 0.8 W∙cm−2, 4 min 1 O2 and HeLa and HeLa tumour-
PDT 4-acetic acid others HUVEC cell bearing mice
ROS lines
nd: not determined; DPP-4: diketopyrrolopyrrole.
125
The activation of the nuclear factor-kappa B (NF-κB) is induced by PDT treatment and has a negative
role for this last one. Li et al. [192,193] studied the combination of dihydroartemisinin (DHA), which
could inactivate NF-κB and displayed an anticancer activity, with PDT using 5-ALA in comparison with
PDT alone. In vitro and in vivo in human oesophageal cancer models (Eca109 and Ec9706), they showed
a better tumour inhibition with a reduction of NF-κB expression for the combined treatement with DHA
and PDT (630 nm, 20-25 J∙cm−2) as compared to each treatment alone.
Carbonic anhydrase IX (CAIX) is overexpressed in tumour and is involved in the tumour survival
and invasion. Jung et al. [194] synthesized an acetazolamide-functionalized boron dipyrromethene PS
(AZ-BPS) (Figure 41) to combine antiangiogenic therapy by inhibiting CAIX with PDT.
Figure 41. Structure of AZBPS. Adapted from Jung et al. [194].
In vitro in aggressive cancer MDA-MB-231 cells, they evaluated the phototoxicity (660 nm, 2 W∙cm−2,
30 min) of AZ-BPS in comparison with BPS alone and observed an enhancement of phototoxicity. The
same observation was done in vivo in MDA-MB-231 tumour-bearing mice, which may be due to the
inhibition of tumour angiogenesis combined to PDT (Table 19).
4.3. PTT/PDT
Photothermic therapy is a technique to destroy cancer cells by burning them selectively. This
technology uses a low-power laser beam that is directed to the tumour containing small amount of
molecules capable of absorbing near-infrared rays (between 800 and 1300 nm), and which efficiently
convert this energy into heat. Since this technique uses irradiation, some teams considered associating
PTT with PDT and proposed targeted hybrid nano-objects capable of being excited to produce both heat
and ROS. This dual PTT/PDT modality offers the advantage of using only one NP for a double effect by
involving only light. In contrary to PDT, PTT does not require O2 to be efficient.
Figure 42. Schematic illustration of the study rationale and design. Reprinted from [195] with permission from the
American Chemical Society, Copyright 2013.
126
Table 19. Summary of publications about the use of others inhibitors for Antiangiogenic-PDT.

Therapy Used ROS
[190] Antiangiogenic- Antiangiogenic celecoxib or Photofrin 570-650 nm, 0.35 mW∙cm−2, 0 to nd BA cell line BA tumour-bearing
PDT NS-398 525 J∙cm−2, 0 to 150 s mice
[191] Antiangiogenic- Antiangiogenic Chalcone phthalocyanine red light (>600 nm), 3.6 J∙cm−2 1O2 HT29 cell line No
PDT
[192] Antiangiogenic- Antiangiogenic DHA 5-ALA 630 nm, 25 W∙cm−2 nd Eca109 cell line Eca109 tumour-
PDT bearing mice
[193] Antiangiogenic- Antiangiogenic DHA 5-ALA 630 nm, 20 or 25 W∙cm−2 nd Eca109 and No
PDT Ec9706 cell lines
[194] Antiangiogenic- Antiangiogenic acetazolamide AZBPS 660 nm, 2 W∙cm−2, 30 min 1O2 MDA-MB-231 MDA-MB-231
PDT and MCF7 cell tumour-bearing
lines nude mice
nd: not determined; AZBPS: acetazolamide conjugated BODIPY; 5-ALA: 5-aminolevulinic acid;.
127
Nanostructured self-quenched porphysome NPs (Figure 42) have been developed by Jin et al. [195].
PDT with Photofrin (633 nm, 200 mW with a spot size of 9 mm diameter for 318 s) in treating mice
bearing KB xenograft under hyperoxic conditions induced 100% reduction of tumour volume 2 days
after treatment and 100% survival over 50 days. When molecules of Photofrin were assembled in the
bilayer of self-quenched porphysome NPs, no PDT effect could be observed (671 nm, 200 mW, 5 min 18
s). Porphysomes proved in fact to be photothermal enhancers that induced rapid and significant tumour
temperature increase (T final > 60 °C in 85 s) upon PTT irradiation (PTT: 671 nm, 750 mW, 100 J∙cm −2, 85
s) for a complete KB tumour elimination regardless of cellular O2 amount in both hyperoxic and hypoxic
conditions.
Zhu et al. [196] designed a NP (BSA/SAs–NMOF NPs) based on NMOFs (TCPP as organic ligands
and iron ions as metal center) as PTT/PDT agent, covalently conjugated to BSA/SA complexes (bovine
serum albumin/sulfonamides) for biocompatibility. In vitro in 4T1 cell line, the authors observed a
photothermal conversion efficiency of 40.53% (660 nm, 50 mW∙cm−2, 10 min) and a efficient ROS
generation (660 nm, 50 mW∙cm−2, 10 min then 1.0 W∙cm−2, 5 min) in both normoxic and hypoxic
conditions under laser irradiation. The synergistic effect of PTT/PDT (660 nm, 50 mW∙cm−2, 10 min then
1.0 W∙cm−2, 5 min) to kill cancer cells was desmontrated in both in vitro and in vivo 4T1 tumour models
and appeared to be significantly better than PTT or PDT alone.
In 2016, Hu et al. [197] developed an original strategy based on the increase of temperature to
improve circulation of the blood, blood O2 concentration in tumour tissue. This strategy is different from
PTT since it does not based on a conversion of energy into heat but on an external change of the
temperature of mice. They synthesized a human serum albumin loaded with Ce6 cHeLated with Mn2+
(HSA-Ce6 NAs) with an average hydrodynamic diameter of 100±2.4 nm. Reduced GSH could induce
the cleavage of intermolecular disulfide bonds of HSA-Ce6 NAs and the release of Ce6. In vitro in 4T1
cells, they showed that PDT (660 nm, 50 mW∙cm−2, 5 min) led to cell viability of 25.7 % at 37°C and 5.8
% at 43°C. In vivo in 4T1 tumour-bearing mice, PDT was also performed (660 nm, 200 mW∙cm−2, 20 min).
The designed a warm water bath to simulate « hot spring » bath. By changing the temperature from
37°C to 43°C, blood flow velocity increased from 17.3 cm∙s−1 to 32.4 cm∙s−1, O2 saturation in tumour tissue
also increased from 52% to 79%. After PDT, mice treated with Ce6 at 37 °C showed a tumour growth
delay, with HSA-Ce6 NAs at 37°C a partly inhibition of tumour growth whereas with HSA-Ce6 NAs at
43°C they could observe significant tumour regression with no tumour recurrence.
In 2017, Feng et al. [198] described liposomes activatable by NIR light to relieve tumour hypoxia and
to be an efficient PDT-agent while protecting skin. The liposomes (DiR-hCe6-liposomes) were composed
by a PEG shell and encapsulated hexylamine conjugated Ce6 (hCe6) and 1,1'-dioctadecyl-3,3,30,3'-
tetramethylindotricarbocyanine iodide (DiR) as a NIR dye quenching the photophysical properties of
hCe6. In the absence of NIR light, hCe6 contained in DiR-hCe6-liposome presented a quenching of its
photophysical properties and under a 785 nm NIR irradiation, a photobleaching of DiR induced a
recovery of hCe6 properties but also a photothermal heating leading to a reduction of tumour hypoxia.
A quenching of 97% of hCe6 fluorescence in DiR-hCe6-liposomes was observed and a recovery of
fluorescence was observed after NIR irradiation (785 nm, 1 W∙cm−2, 10 min). The 1O2 generation was also
evaluated under light excitation (660 nm, 2 mW∙cm−2, 30 min) and the production by DiR-hCe6-
liposomes was significantly lower than Ce6 alone and hCe6-liposomes but under NIR irradiation
followed by 660 nm irradiation, DiR-hCe6-liposomes recovered this ability. In vitro PDT efficiency was
investigated in 4T1 cells. Under light irradiation (660 nm, 2 mW∙cm −2, 30 min), DiR-hCe6-liposomes
showed a slight phototoxicity but a succession of NIR and 660 nm irradiation, a high phototoxic effect
was observed similar to that observed for hCe6-liposomes. In vivo studies in balb/c mice bearing 4T1
tumours under NIR irradiation, an increase of temperature over time was observed corresponding to a
photothermal heating. A significant reduction of tumour hypoxia from 38% to 12% was also observed
after NIR irradiation (Figure 43).
128
Figure 43. In vivo activation of DiR-hCe6-liposome by NIR laser irradiation and the followed tumour Oxygenation.
Semi-quantitative analysis of the percentage of positive hypoxia region before and after laser irradiation. Adapted
from Feng et al. [198].
Finally, the in vivo PDT effect of DiR-hCe6-liposomes after successive irradiations (785 nm, 0.7
W∙cm−2 for 20 min followed by 660 nm, 2 mW∙cm−2 for 1h) was studied and a high inhibition of tumour
growth was observed whereas for mice injected with hCe6 and irradiated at 660 nm, only a moderate
effect was observed (Figure 44) (Table 20).
Figure 44. In vivo NIR light activated synergistic cancer phototherapy. (a) Relative tumour volume (V/V 0) changing
curves of mice after various different treatments at indicated for 14 days. V and V 0 stood for the tumour volumes
after and before the treatment, respectively. Adapted from Feng et al. [198].
4.4. Imuno-PDT
Cancer cells undergo profound genetic rearrangements that allow them to acquire their malignant
properties. Thus, they begin to express on their surface specific molecules (tumoural antigens) that
distinguish them from healthy cells and are able to induce immune reactions. Immunotherapy is a
therapeutic approach that acts on the immune system of a patient to fight against his disease. This
technique relies on the injection of specific proteins to the targeted tumour, the goal being to teach the
patient's immune cells to identify tumour and eliminate it. PDT may be a synergistic adjunct to this type
of treatment as shown by the following example.
129
Table 20. Summary of publications about PTT/PDT.
Ref Application Supplementary PS Energy of Excitation Type of In vitro In vivo

Therapy Used ROS
[195] PTT/PDT PTT Photofrin and Photofrin: 635 nm, 200 mW, 318 s nd No KB tumour-bearing
Porphysome Porphysome: 671 nm, 200 mW, 18 s; PTT: 671 nm, 750 mice
mW, 85 s
[196] PTT/PDT PTT Iron porphyrin 600 nm, ROS 4T1 cell 4T1 tumour-bearing
PDT: 50 mW∙cm−2, 10 min line mice
PTT: 1.0 W∙cm−2 for 5 min,
[197] PDT External heating Ce6 In vitro: 660 nm, 50 mW∙cm−2, 5 min 1 O2 4T1 cell 4T1 tumour-bearing
In vivo: 660 nm, 200 mW∙cm−2, 20 min line mice
[198] PTT/PDT PTT hCe6 NIR irradiation: 785 nm, 1 W∙cm−2, 10 min nd 4T1 cell 4T1 tumour-bearing
Light irradiation: 660 nm, 2 mW∙cm−2, 30 min line mice
nd: not determined; Ce6: Chlorin e6; hCe6: hexylamine conjugated chlorin e6.
130
Im et al. [199] developed hypoxia-responsive Ce6-doped-azobenzene-glycol chitosan(GC)-PEG

mesoporous silica NPs (CAGE) to enhance cancer immunotherapy (CIT) with PDT by modulation of
dendritic cells and destruction of cancer cells (Figure 45). The effective generation of ROS by CAGE
under laser irradiation was confirmed using SOSG. Biocompatibility and photoinduced cytotoxicity
(660 nm, 150 mW∙cm−2, 15 min) of carriers was validated in vitro in a murine melanoma cell line (B16.F1).
In vivo studies in B16.F1 tumour bearing mice showed an efficient inhibition of tumour growth for mice
treated with CAGE and irradiated at 660 nm (200 mW∙cm−2, 15 min).
Figure 45. Schematic representation of Immuno-PDT concept of the study. Reprinted from [199] with permission
from the American Chemical Society, Copyright 2019.
5. Hypoxia-Independent PDT
Intratumoural hypoxia is one of the major limitations in clinical use of PDT owing to insufficient
generation of 1O2. This hypoxic environment is further aggravated by consumption of oxygen during
PDT limiting the therapeutic outcome [195,200]. To overcome that problem, various oxygen-sufficient
materials or oxygen-independent PSs to produce ROS are developed and presented in this section.
5.1. PDT Type I

The principle of PDT is based on a PS excitation at a specific wavelength enabling PS to move to its
triplet excited state and leading to the formation of cytotoxic ROS. These ROS can be produced by Type
I (i.e. free radicals such as ●OH) or Type II (i.e. 1O2) photochemical reactions simultaneously. Most of the
clinical applications relating to PDT are based on Type II PDT and suffering badly from the insufficient
O2 supply in TME. One of the approaches being explored to circumvent this problem is the use of Type
I PDT for more cytotoxic free radicals’ generation to reduce dependence on intracellular oxygen content.
Ding et al. (2011) [201] designed micelles with 5,10,15,20-tetrakis-(meso-hydroxyphenyl)porphyrin)
(mTHPP) effective under both normoxic (50 mm Hg O2) and hypoxic (less than 20 mm Hg O2) conditions
by modulation of photoactivation mechanism. Diameter of such micelles were 57 nm (electron rich: β-
poly(2-(diisopropylamino)ethyl methacrylate (mTHPP-PDPA) micelles), 49 nm (electron deficient:
poly(D,L-lactide)) micelles (mTHPP-(PEG-b)PLA) (Figure 46).
In vivo experiments were performed with various cancer cells (H2009, A549 and PC-3) in hypoxic
conditions, irradiated at 532 nm (20 mW∙cm−2, 10 min) and cell survivals was observed 2 days after
treatment. PDPA micelles generate less 1O2 (relative quantum yield of 0.46) than PLA micelles in air
saturated solution but about three time more others ROS. As example, survival of H2009 cells were two
folds lower with PDPA micelles than with PLA micelles and three folds lower than with free mTHPP.
131
Figure 46. Modulation of photoactivation mechanism of a model PS, mTHPP, by the micelle microenvironment.
Electron-rich PDPA micelles led to increased type I reactions producing superoxide radical anions, while electron-
deficient PLA micelles generated 1O2 as predominant species by type II reactions. Adapted from Ding et al. [201].
In 2014, Usacheva et al. [16] designed MB-loaded alginate NPs (275±30 nm) to study the PDT
efficiency under normoxic and hypoxic conditions. The authors compared the ROS and 1O2 production
with free MB and MB NPs after irradiation under different concentration of O2. The 1O2 production and
fluorescence were systematically higher for MB NPs than free MB even at low O2 concentration. More
interesting was a higher production of ROS with the NPs than free MB. Nitroblue tetrazolium (NBT)
assay clearly indicated a high level of O2-●. Cytotoxicity of MB and MB NP-mediated PDT was studied
in various breast cancer cells (MDAMB231, 4T1, SKBR3, and MCF7 cells) under ambient conditions and
NPs showed a better efficacy for the MB. A similar study in normoxia and hypoxia led to the same
result. The authors investigated the MB-mediated PDT (660 nm, 6 mW∙cm−2) on mammospheres
induced by MCF-7 cancer stem cells (CSCs) and showed that MB NPs effectively disrupted the
formation of mammospheres as well colonies of cells under hypoxic conditions.
Li et al. (2018) [202] developed a molecular superoxide radical generator (ENBS-B) (Figure 47) that
excited by near infrared light produced O2-● through type I reaction. A significant part of this O2-● was
transformed in ●OH after formation of H2O2 (Figure 48).
Figure 47. Structure of ENBS-B. Adapted from Li et al. [202].
132
Figure 48. Schematic Illustration of Photo-Induced Radical Generation Mechanism of ENBS-B. Reprinted from [202]
In vitro cytotoxicity of HepG2 cells under normoxic and hypoxic conditions was increased at equal
time up to 94 % at low concentration of ENBS-B. In vivo studies were performed on tumour bearing
BALB/c mice with light irradiation (660 nm, 15 min, 14.4 J∙cm −2) after injection of ENBS-B A They could
observed the suppression of tumour growth. This was probably due to a better targeting on biotin
receptors and also to the overcoming of traditional PDT involving O2 consumption.
Liu et al. (2018) [203] irradiated copper ferrite nanosphere (CFNs) (Figure 49) with 650 nm laser, in
synergy with PTT. PDT and Fenton reaction together allowed the theranostic nanoplatform to generate
cytotoxic ●OH and O2-● by electron/hole pairs of CFN. This platform was synthesized using BSA as
biocompatible surfactant and had a diameter of 70 nm.
Figure 49. Schematic illustration of synthetic process and therapeutic mechanism of CFNs. Reprinted from [203]
In vitro in HeLa cells treated with CFNs and light illumination (650 nm, 15 min, 0.469 W∙cm−2) of
CFNs induced ROS formation, with higher concentration than with light alone or CFNs alone. The CFNs
were proven to regulate the TME via the catalysis of H 2O2 producing O2 and consuming GSH. The
authors observed the decrease of tumour hypoxia using ([Ru(dpp) 3]Cl2 .Cell viability decreased nearly
to zero when concentration of CFNs increased after two different illuminations (650 nm, 15 min, 0.469
W∙cm−2 and 808 nm, 10 min, 1.3 W∙cm−2). In vivo experiments were performed on U14 tumour bearing
mice, leading to a complete ablation of tumour when both PDT and PTT were in synergy.
Lv et al. [204] synthetized type I PSs based on ruthenium (II) complexes with different cyclometaled
ligands, one with 2,4-difluorophenylpyridine (Ru1) and the other with a coumarin (Ru2). In both
133
normoxic and hypoxic conditions, experiments showed a strong effect attributed to charge transfer
followed by type I reaction, leading to ROS production. It was found that ROS production (475 nm, 10
mW∙cm−2) by Ru2 was 6.7 time larger than by Ru1. In vitro PDT effect was evaluated in HeLa cells
irradiated in the visible region (400-800 nm, 30 mW∙cm−2) during 10 min. Ru2 was clearly more
aggressive than Ru1 even at low concentration (Figure 50). Moreover, under hypoxia, the quantity of
apoptotic cells after treatment was 2.83 % for Ru1 and 54 % for Ru2.
Figure 50. Dose–dependent curves for cell viability of HeLa cells treated with Ru1 and Ru2 using a typical MTT
assay under light irradiation (L) or in the dark (D). Cells were irradiated with white light (400–800 nm, 30 mW∙cm−2,
10 min). Adapted from Lv et al. [204].
In vivo PDT treatment (Xe lamp) on HeLa tumour bearing mice using Ru2 as PS indicated a tumour
weight going from about 2 g to less than 0.1 g after 14 days.
Wang et al. (2018) [205] designed another nanoplatform Fe3O4@MIL-100(Fe)-UCNP (FMU) (MIL,
Material of Institute Lavoisier) which generate ●OH species in large amount due to a photo Fenton
reaction. PEGylated FMU were also synthesized (FMUP) (Figure 51). In vitro cytotoxicity was measured
on HeLa cells excited by 980 nm laser (0.9 W∙cm−2, 10 min) and the cell viability was about 10 %.
Figure 51. Schematic illustration of the synthesis process of FMUP, and the intracellular photon-Fenton reaction of
FMUP with intracellular H2O2 under the irradiation of 980 nm. Reprinted from [205] with permission from Elsevier
Ltd, Copyright 2018.
134
In vivo experiments were performed on mice transplanted with carcinoma cells U14. Starting from
a tumour of about 6 mm of diameter, illumination during 15 min at 980 nm (0.9 W∙cm−2) was followed
after 14 days of treatment by a significant inhibition of growth and even a small decrease of the initial
tumour diameter. Synergy between PDT and Fenton photoreaction was clearly the reason of such a
result.
Tian et al. (2018) [206] integrated chloromethyl group into a Ru(II)-bipyridine complex leading to
three chemical structures showed in Figure 52. Known to accumulate easily into mitochondria these
complexes generate radicals in presence of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) abundant in
such organelles. These radicals induced strong damages on DNA even in hypoxic conditions, leading
to apoptosis. In vitro, the cytotoxicity toward SKOV-3 was evaluated, after incubation at different
concentrations and irradiation at 470 nm (LED) during 30 min. Complex 3 induced the highest
cytotoxicity (between 50 and 10 % of viability). Under hypoxic condition (3% O2), this complex induced
21.1 % of apoptotic cells after 30 min of irradiation (470 nm, 22.5 mW∙cm−2). A disadvantage of this
method is clearly that complexes were consumed during the PDT treatment, which could be solved by
integration of Ru complexes into a drug delivery platform.
Figure 52. Chemical structures of complexes Ru (II) complexes. Adapted from Tian et al. [206].
Lazic et al. [207] developed three panchromatic PSs (TLD1822, TLD1829 and TLD1824) based on
osmium complexes containing different 2,2’-biquinoline (biq) ligands (Figure 53) for PDT applications
in both normoxic and hypoxic environment. These compounds presented the particularity to be
activatable from 200 to 900 nm and the evaluation of 1O2 generation by these compounds showed very
low ϕΔ (~ 4%) for TLD1822 and TLD1829 and no production of 1O2 was observed for TLD1824 indicating
PDT effect with these molecules was not mediated by 1O2 but by other ROS.
Figure 53. Molecular structures of the osmium-based PSs. Adapted from Lazic et al. [207].
In vitro PDT efficiency was evaluated in both HT1376 (human bladder cells) and U87 (human
glioblastoma cells) under NIR (808 nm, 900 mW∙cm−2 for 667 s) or red (625 nm, 450 mW∙cm−2 for 200 s)
light irradiation. The workers first evaluated PDT efficiency in normoxic conditions and observed that
all PSs under both irradiations, TLD1829 displayed the highest cytotoxicity in U87 cells whereas for
TLD1822 highest cytotoxicity was found in HT1376 cells. Moreover, no significant influence of the type
135
of irradiation was highlighted. In hypoxic conditions, the cytoxicity of TLD1822 under irradiation was
similar to that observed in normoxic conditions contrary to a PS of reference (PPIX) and TLD1829, which
losted all their cytotoxicity in hypoxic media. In vivo studies were performed in a subcutaneously colon
carcinoma tumour model and the PDT efficiency was evaluated for TLD1829 only under both red (192
or 266 J∙cm−2) and NIR irradiation (600 J∙cm−2). Under red light illumination (266 J∙cm−2), a significant
tumour regression was observed with a majority of complete regression. Under NIR light, similar
observations could be done. (Table 21)
136
Table 21. Summary of publications about the use of PDT type I strategy for a PDT Hypoxia-independent.
Ref Application Hypoxia-independent PS Energy of Excitation Type of ROS In vitro In vivo

Strategy
[201] PDT Modulation of the mTHPP 532 nm, 20 mW∙cm−2, 10 min 1 O2 and others H2009, A549 and No
mechanism of ROS PC-3 cell lines
photoactivation by
micelles
[16] PDT Alginate formulation to MB 600 nm, 6 mW∙cm−2 O2-● and others MDAMB231, 4T1,
switch photochemistry of ROS SKBR3, and MCF7
PS from type II to type I cell lines
[202] PDT Superoxide radical ENBS-B 660 nm, 14.4 J∙cm−2, 15 min O2-●, ●OH HepG2 cell line HepG2
generator tumour-
bearing mice
[203] PTT/PDT Fenton reaction CFNs 650 nm, 0.49 W∙cm−2, 15 min and 808 ● OH, O2-● HeLa cell line U14 tumour-
nm 1.3 W∙cm−2, 10 min bearing mice
[204] PDT Type I PSs Ru (II) complexes In vitro: white light (400-800 nm) 1 O2 and others HeLa cell line HeLa tumour-
30 mWcm−2, 10 min ROS bearing mice
In vivo: xenon lamp, 250 mW∙cm−2, 15
min
[205] PDT Fenton reaction Fe3O4@MIL-100(Fe)- In vitro: 980 nm laser, 0.9 Wcm−2, 10 ● OH HeLa cell line U14 tumour-
UCNP min bearing mice
In vivo: 980 nm laser, 0.9 Wcm−2, 15
min
[206] PDT Carbon radical generator Ru(III) complexes 470 nl LED Carbon SKOV-3 cell line No
radicals
[207] PDT Type I reaction Os(biq)2(phen)](PF6)2, 625 nm (90 J∙cm−2 = 450 mW∙cm−2, 200 1O2 and HT1376 and U87 CT26.CL25
Os(biq)2(IP)](PF6)2 and s) or 808 nm light (600 J∙cm−2 = 900 oxygen- cell lines tumour-
Os(biq)2(dppn)](PF6)2 mW∙cm−2, 667 s) independent bearing mice
pathways
mTHPP: 5,10,15,20-Tetrakis(meso-hudroxyphenyl)porphyrin; MB: Methylene Blue; CFNs: copper ferrite nanosphere.
137
5.2. O2 independent Cytotoxic Compounds

Some other teams have developed compounds which could be photoactivated and do not need O 2
to be cytotoxic. Babii et al. (2016) [208] used a light sensitive diarylethene-derived peptidomimetic
(Figure 54), which did not need O2 to be cytotoxic since it was itself a toxic molecule in its isomeric form,
appearing after irradiation by UV or visible light. A new photoswitchable block of peptidomimetics was
designed with diarethylene connected to the peptide by a keto group. Absorption of this new compound
was shifted to the red for about 50 nm.
Figure 54. Reversible photoisomerization of the diarylethene core with UV and visible light. Adapted from Babii et
al. [208].
Cytotoxicity on HeLa cells and COLO-205 cells showed that the closed ring had always less toxicity
(5.5 to 8-fold lower) than the open one (Figure 55). Excitation with 664 nm light led to about 50%
transformation from closed-ring form to open-ring form.
Figure 55. In vitro cytotoxic activities of the two GS-DPRoSw photoforms as measured in the MTT test. Adapted from
Babii et al. [208].
In vivo, the authors used LLC model in C57B1/6 mice and PDT with visible light (100 mW∙cm −2, 20
min), inducing above 60 % more viability of mice after 20 days of therapy.
Fadhel et al. (2016) [209,210] developed in the same work PEG-functionalized and hydrophilic silica
NPs-enriched photacid generator (PAG) (Figure 56). These NPs were used to kill HCT-116 cells via an
O2 independent mechanism, involving one or two NIR photon excitation. Under illumination, PAG
incorporated in the silica NP functionalized with amines, induced the decrease of the pH inside the
cells, leading to their destruction.
138
Figure 56. Structure of SiNP-PAG9 and PEG-PAG9. Adapted from Fadhel et al. [209].
Intrinsic toxicity in cells was evaluated after exposure with light at 377 nm (5.4 mW∙cm−2, 10 min). A
viability of 64% for PEG-PAG9 and 42 % for SiNP-PAG9 was found. (Table 22)
139
Table 22. Summary of publications about the use of O2 independent cytotoxic compounds for PDT hypoxia-independent.
Ref Application Hypoxia-independent Strategy PS Energy of Excitation Type of In vitro In vivo

ROS
[208] PDT Photocontrollable cytotoxic Diaryletene- Visible light, 100 mW∙cm−2, 20 min No HeLa and LLC tumour-
peptidomimetic derived COLO-205 cell bearing mice
(photoisomerization) peptodomimetics lines
[209,210] PDT Photoacid generators to induce an PAG In vitro: 377 nm, 5.4 mW∙cm−2 No HCT-116 cell No
imbalance of the pH of tumour cells In vivo: two-photon (710 nm), 2.0 line
mW∙cm−2
PAG: photacid generator.
140
5.3. NO Donors
Several strategies relying on the use of NO donors have been developed to overcome the problem of
hypoxia for PDT treatment. Since NO is known to inhibit cell respiration by competition with O 2 by
binding on mitochondrion, O2 consumption in cancer cells is inhibited and the spared O2 can be used
for PDT. Some teams proposed an alternative to the O2-supply strategy i.e. an O2-economizer for the
PDT treatment of hypoxic tumour.
Recently, Yu et al. [211], synthesized poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanovesicles (PV) in which either
sodium nitroprusside (SNP), tetraphenylporphyrin as PS or both were loaded. SNP was a precursor of
nitric oxide NO in the presence of thiol compounds such as glutathione or cysteine. The thiols
concentration in tumour cells being much higher than in normal cells, NO production was then higher.
At the same time, the higher O2 contain was also evidenced by the use of HIF-1α and
immunofluorescence assay. Thus, NO could be considered as O2-economizer in hypoxic tumours. This
effect was verified in vitro by pO2 measures and NO release in normal or hypoxic conditions and in the
dark or under irradiation (660 nm, 20 mW∙cm−2). As expected, hypoxic conditions led to lower cell
viability than in normoxic ones after 3 min irradiation. However, prolonged irradiation time from 3 min
to 10 min induced the death of about 90 % cells. The nature of oxidizing agent(s) was not clearly explicit.
In vivo experiments were conducted on 4T1 tumour bearing female BALB/c mice and the first results
exhibited a very low tumour growth in the group of PV-TS illuminated by NIR (660 nm, 150 mW∙cm−2,
5 min) and a progressive shrinkage of tumour until eradication.
Heinrich et al. (2013) [212] studied the synergy between ROS and NO. A Ru complex
(Ru(phthalocyanine)(pyrazine)2-(Ru(bpy)2(NO))2)(PF6)6 (Figure 57) was synthetized and produced both
NO and 1O2 under 660 nm irradiation. NO production depended on excitation wavelength and pH, and
reached a maximum value for 377 nm and pH3.0. In vitro, viability of B16F10 cells was found to be
minimal at about 22 %, 4 hours after irradiation by 660 nm laser (5 J∙cm −2). A proposed mechanism was
the inhibition of mitochondrial respiration due to NO allowing an increased sparing of O2.
Figure 57. Molecular structure of [Ru(phthalocyanine)(pz)2{Ru(bpy)2NO}2]6+. Adapted from Heinrich et al. [212].
Wan et al. (2018) [213] also designed a NP taking benefit from the synergy between PDT and NO
production. Starting from a porous coordination network (porphyrinic metal-organic framework),
containing L-arginine (a NO donor), they coated it with a cancer cell membrane (4T1 cells) and obtained
the so-called (L-Arg@PCN@Mem) NPs. Under NIR (640 nm and 720 nm) irradiation, L-Arg reacted with
ROS to produce great amount of NO. In vitro, 4T1 cells were incubated under normoxic and hypoxic
conditions. The cell death reached up to 71 % in normoxia and 18 % in hypoxia after PDT treatment (660
nm, 30 mW∙cm−2, 8 min), due in part to the long lifetime of NO and its large diffusion coefficient. In vivo
experiments on 4T1 tumour bearing mice showed a nearly complete ablation of tumour 14 days after
the treatment (660 nm, 200 mW∙cm−2, 10 min).
Deng (2018) et al. [214] synthetized a NO nanogenerator, a glutathione (GSH)-sensitive NO carrier
by conjugating S-nitrosothiol to alpha-cyclodextrin, integrated in a supramolecular nanocarrier alpha-
CD-Ce6-NO (Figure 58). This compound presented many advantages: 1) acted as GSH scavenger, 2)
SMC (smooth muscle cells) relaxation to increase blood flow and 3) NO generation which could react
with ROS to produce radical nitrogen species (RNS).
141
Figure 58. Multiple synergistic effects between NO and PDT generated from the supramolecular NPs α-CD-Ce6-
NO NPs to improve therapeutic efficacy. Reprinted from [214] with permission from Elsevier Ltd, Copyright 2018.
After NPs internalization in MCF-7 cells great amount of ROS was produced when cells were
exposed to 660 nm laser irradiation without GSH, slightly less when GSH was added, but nevertheless
four times larger than NPs without NO. Cell viability (Figure 59) decreased up to 12.6 % when synergy
between PDT (660 nm, 0.2 W∙cm−2, 2 min) and NO production was taken into account.
Figure 59. Cytotoxicity of MCF-7 cells incubated with α-CDCe6 NPs, α-CD-Ce6-NO NPs, α-CD-Ce6 NPs with laser,
and α-CD-Ce6-NO NPs with laser (660 nm, 0.200 W, 2 min). Adapted from Deng et al. [214].
In vivo, tumour growth (nude mice bearing MCF-7 xenograft) was clearly inhibited with this
treatment, going up to a complete ablation 21 days after treatment (660 nm, 0.5 W∙cm −2, 5 min).
(Table 23)
142
Table 23. Summary of publications about the use of NO donor for PDT hypoxia-independent.
Ref Application Hypoxia-independent PS Energy of Excitation Type Others In vitro In vivo

Strategy of Radicals
ROS
[211] PDT SNP: NO donor to Tetraphenylporphyrin 660 nm, 20 mW. cm−2, 3 or 10 min 1O2 NO 4T1 cells 4T1 tumour-
reduce O2 consumption + others ROS bearing mice
[212] PDT Compound able to Ru complex 660 nm, 5 J∙cm−2 1 O2 NO B16F10 No
produce both NO and cell line
1O2 under irradiation
[213] PDT NO-generation induced Porphyrinic metal- In vitro: 660 nm, 30 mW∙cm−2, 8 min 1 O2 NO 4T1 cell 4T1 tumour-
by ROS production organic framework In vivo: 660 nm, 200 mW∙cm−2, 10 line bearing mice
(NO donor: L-arginine) min
[214] PDT Glutathione-sensitive Ce6 In vitro: 660 nm laser, 0.2 W, 2 min NO + MCF-7 cell MCF-7 tumour-
supramolecular NO In vivo: 660 nm laser, 0.5 W, 5 min Peroxynitrite line bearing mice
nanogenerator anions
NO: Nitric oxide; Ce6: Chlorin e6.
143
5.4. 1O2 Donor

We report two teams who have described the use of compounds with endoperoxide able to directly
generate 1O2 under photothermal conditions. Yuan et al. [215] used substituted diphenyl anthracene
(DPA) as 1O2 donor. The endoperoxide of DPA is known to be stable and biocompatible, with a great
1O2 formation yield. Substituents in various positions affect the cycloreversion. A nanomicelle of 60 nm
diameter was synthesized with an amphiphilic block copolymer in which were introduced both ortho-
substituted DPA and tetraphenyl porphyrin. IR780 iodide was then encapsulated in the core of the NPs
to form PMT NPs. These PMT NPs could produce heat and ROS under illumination at 808 nm, heat
conduced to the release of 1O2 from endoperoxide of DPA. In vitro, PDT was performed onto to HepG2
cells (human liver carcinoma) and led to more than 95 % of dead cells, compared to about 20 % when
no substituted DPA was used. In vivo experiments on HepG2 tumour bearing mice, with a light density
around 1.0 W∙cm−2 were performed. Large tumour with a volume of 500 mm3 was treated both with PT
NPs (block copolymer different) and PMT NPs. In the first case, growth was inhibited during treatment
but accelerated after. In the second case, a decrease of the tumour volume was observed after three days
of treatment (808 nm, 1 W∙cm−2, 2-4 min), leading to such a weak value of the volume that cannot be
measured.
Han et al. [216] designed pH-responsive micelles (C/O@N-Micelle) with an average size of 43 nm
and obtained by self-assembly of the triblock copolymer poly(ethyleneglycol)-β-poly (ε-caprolactone)-
β-poly(2-(piperidin-1-yl)ethyl methacrylate) (PEG-b-PCLb-PPEMA) co-encapsulating cypate (a
photothermal agent) and a 1O2 donor (diphenylanthracene endoperoxide, DPAE). Under NIR
irradiation (808 nm, 1.5 W∙cm−2, 5 min), an increase of temperature of 7°C was highlighted confirming
the photothermal effect of cypate and an efficient 1O2 generation due to this effect. In vitro in 4T1 cells,
a better cellular uptake of C/O@N-Micelle was observed when the pH was decreased from 7.4 to 6.8 and
a high cytotoxic effect was observed under a combined PTT/PDT treatment (808 nm, 1.5 W∙cm −2, 5 min)
with C/O@N-Micelle. In vivo in 4T1 tumour-bearing mice, they confirmed in vitro results with high
tumour accumulation, significant hyperthermia and ROS production and an efficient tumour growth
inhibition after PTT/PDT treatment with C/O@N-Micelle. (Table 24)
Figure 60. Chemical structures of Pt-1, Pt-2, and Pt-3. Adapted from Lv et al. [217].
144
Table 24. Summary of publications about 1O2 donor for a PDT Hypoxia-independent.
Ref Application Hypoxia-independent PS Energy of Excitation Type of In vitro In vivo

Strategy ROS
[215] PTT/PDT Use of 1O2 donor: tetraphenylporphyrin In vitro: 808 nm, 0.5 W∙cm−2, 1 min 1O2 and HepG2 cell HepG2 tumour-
endoperoxide of DPA In vivo: 808 nm, 1.0 W∙cm−2, 0-5 min others ROS line bearing mice
[216] PTT/PDT Use of 1O2 donor: DPAE 808 nm, 1.5 W∙cm−2, 5 min ROS 4T1 cell line 4T1 tumour-bearing
DPAE mice
DPA: diphenylanthracene; DPAE: diphenylanthracene endoperoxide.
145
5.5. Active Compounds in both Normoxic and Hypoxic Conditions

Lv et al. [217] elaborated bifunctional agents, based on Pt (II) porphyrins, for tumour hypoxia
imaging and PDT treatment efficient under hypoxia. A Pt (II) porphyrins core and four cationic fluorine
oligomers arms with different lengths composed the three agents synthesized (Pt-1, Pt-2 and Pt-3)
(Figure 60).
These compounds presented emission in the red with an increase of phosphorescence emission with
decreasing level of O2 and high ϕΔ of 0.80, 0.86 and 0.92 respectively. Pt-3 showed the lowest aggregation
and the highest O2 sensitivity due to its 3D architecture and was tested in vitro and in vivo. In vitro
studies were performed in HeLa cells incubated with Pt-3 and irradiated by light at 520 nm (10 mW∙cm−2,
10 min). The molecule showed high efficiency in normoxic media to kill cancer cells and under hypoxic
atmosphere, its efficiency was significantly better than hematoporphyrin used for comparison, with an
apparition of apoptosis of cells 1 h after PDT for Pt-3 against 2h for HP. A HeLa xenograft tumour-
bearing mice model was used for in vivo studies. Under 520 nm irradiation (160 mW∙cm −2, 10 min), a
high decrease of tumour volume was observed for Pt-3 and HP with a more significant decrease for Pt-
3.
Pinto et al. [218] investigated a benzophenazine compound (OR141) as a PS for PDT applications
under normoxic and hypoxic conditions (Figure 61). They chose this compound after a phenotypic
screening.
Figure 61. Molecular structure of OR141. Adapted from Pinto et al. [218].
Generation of 1O2 was identified as the main photoinduced mechanism by light excitation of OR141.
The authors showed that the production of 1O2 was independent of the level of O2 (1 or 21 %) since
almost no change was observed between the two conditions contrary to others PS such as verteporfin
and MB. They studied in endothelial cells the pathways inhibited under hypoxia by OR141 under light
irradiation and found that OR141 inhibited the HIF-2α expression and the mTOR (mammalian target of
rapamycin) pathway. Finally, they investigated OR141 efficiency in vivo in a human colon carcinoma
xenograft model. The PS accumulated during 4 h after injection and the mice were irradiated with white
light (optic fiber, 15 min) after this time. This protocol was repeated each four days and a significant
decrease of tumour growth was observed.
Sun et al. [219] developed a novel PS based on a donor-acceptor-donor (DAD) model for targeting
mitochondria and be an effective PDT agent. This molecule (Mito-DAD) was composed of an electron-
donor (benzodithiophene), a median electron acceptor (benzotriazole), an oligoethylene glycol for a
better water solubility, and a mitochondrial targeting unit (four triphenylphosphonium units) (Figure
62).
This compound presented a high ϕΔ of 0.64 in methanol. Under low O2 concentrations (5%), the ϕΔ
remained high with a value of 0.52. No ROS generation was observed in the dark but under LED light
irradiation an elevation of intracellular ROS was showed. Moreover, the cell death was induced very
quickly after 2 min of visible light irradiation (470 nm, 16 mW∙cm−2). After light irradiation (LED lamp,
3 min), the HeLa cells viability have been shown to be Mito-DAD concentration-dependent with a
decrease of viability of 96% to 4.6% with concentration from 0 to 5 µM whereas under the dark, the cell
viability remained superior at 90%.
146
Figure 62. Illustration of enhanced cytotoxicity through photogeneration of 1O2 by a mitochondria-targeting DAD
molecule. Republished from [219] with permission of the Royal Society of Chemistry, Copyright 2018.
Under 5% O2 concentration, an efficient PDT effect was also observed, after treatment of cells with
Mito-DAD and irradiated (LED lamp 470 nm, 16 mW∙cm−2) during 5 min, with a percentage of cells
viability of only 6.6%.
Wieczorek et al. [220] designed novels porphyrazines incorporated in liposomes for PDT application
in both normoxia and hypoxia media. They synthesized three compounds derived from porphyrazines,
one of them the tribenzoporphyrazine (Figure 63) presented a ϕΔ of 0.069 and 0.180 in DMF and DMSO,
respectively.
Figure 63. Structure of tribenzoporphyrazine. Adapted from Wieczorek et al. [220].
Two types of liposomes formulations were chosen to incorporate the porphyrazines, the first one,
composed of 1-α-phosphatidyl-D,L-glycerol (PG) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn- glycero-3-
phosphocholine (POPC), negatively charged and the second one, composed of 1,2-dioleoyl-3-
trimethylammonium-propane (chloride salt, DOTAP) and POPC, positively charged. Porphyrazines
alone and their liposomes formulations were tested in vitro in human prostate carcinoma cells (LNCaP).
Under normoxic conditions, the tribenzoporphyrazine, as for the DOTAP-POPC and PG-POPC
formulations, showed a significant cytotoxicity under light irradiation (690 nm, 2 J∙cm −2). IC50 was
significantly lower for the both liposome formulations in comparison with tribenzoporphyrazine alone.
The same results were observed in hypoxic conditions (1% of O2). (Table 25)
6. Hypoxia-Dependent PDT
The cell survival and propagation of the tumour are greatly facilitated by a hypoxic TME which is a
common factor in tumours. Hypoxia induces a number of complex intracellular signaling pathways, a
major one being the HIF pathway. The overexpression of HIF-1α and HIF-2α subunits lead to key
cellular responses, which cause, among other things, the increase of blood vessel formation,
aggressiveness and metastasis.
147
Table 25. Summary of publications about the use of active compounds in both normoxic and hypoxic conditions for PDT hypoxia-independent.
Ref Application PS Energy of Excitation Type of In vitro In vivo

ROS
[217] PDT Pt (II) porphyrins linked In vitro: 520 nm, 10.0 mW∙cm−2, 10 min 1O2 HeLa cell line HeLa tumour-bearing mice
to cationic oligofluorenes In vivo: 520 nm, 160 mW∙cm−2, 10 min
arms
[218] PDT OR141 White light, 15 min 1O2 Endothelial Human colon carcinoma
cells xenograft model
[219] PDT Mito-DAD 470 nm, 16 mW∙cm−2, 3 min in normoxia and 5 min in 1O2 HeLa cell line No
hypoxia
[220] PDT Porphyrazines 690 nm, 2 J∙cm−2 1O2 LNCaP cell No
derivatives line
DAD: donor-acceptor-donor.
148
The use of hypoxia-responsive drug delivery system for PDT seems to be a rising approach for an
improvement of its efficiency, which could be alterated by hypoxia. Therefore, several strategies are
designed to overcome hypoxia in the treatment of solid cancers such as the development of anti-hypoxia
agents, hypoxia-active nanoparticles, and hypoxia-targeting agents for anticancer PDT. The aim of these
strategies is to produce O2 and activate the nanoparticles or agents in the TME, but also to target
biomarkers of tumour hypoxia to improve the PSs' effectiveness that are administered.
6.1. Hypoxia-Reducible Compounds
6.1.1. Azobenzene (AZO)

The AZO group (−N=N−) can be reduced and cleaved by azoreductase (a typical biomarker of
hypoxia) under the hypoxic environment of tumour cells, acts as the hypoxia responsive linker
component.
Zhang et al. [221] reported a NP (CPs-CPT-Ce6 NPs) composed of a conjugated polymer containing
AZO bridges (CPs), which was hypoxia-responsive, adsorbing Ce6 and camptothecin as chemodrug
and coating to PVP. Under irradiation (670 nm, 50 mW∙cm−2, 10 min), an efficient ROS production by
CPs-CPT-Ce6 NPs was observed which induced an enhancement of tumour hypoxia and thus induced
the dissociation of NPs by the reductive cleavage of AZO bridges and finally release CPT for an efficient
chemo-PDT treatment. Both in vitro in HeLa and NIH3T3 cells and in vivo chemo-PDT (670 nm, 50
mW∙cm−2, 10 min) studies in HeLa tumour-bearing mice proved the better efficiency of this synergistic
treatment in comparison with PDT and chemotherapy alone.
Huang et al. [222] also developed a drug delivery system (DDS) based on the use of hypoxia-induced
cleaved AZO bridges composed of gold NPs (AuNPs) functionalized with β-cyclodextrins conjugating
on the surface DRHC (double-stranded DNA/RNA hybridization complex) containing HIF-1α-against
antisense oligonucleotide (ASO). A PS (5,10,15,20-tetrakis-(1-methyl-4-pyridyl)-21H,23H-porphine,
TMPyP4,) was finally loaded on DDS to obtain DDS@TMPyP4. In HepG2 cells and in hypoxic
conditions, an effective cleavage of AZO bridges was observed conducting to the release of ASO and a
decrease of HIF-1α expression. In vitro in HepG2 and L02 cells incubated with DDS@TMPyP4, an
efficient synergistic effect of hypoxia-triggered ASO release and PDT was observed (660 nm, 1 W∙cm−2,
30 min).
Piao et al. [223] developed azoSeR based on a seleno-rosamine-based dye (SeR) linked to an AZO.
The ϕΔ was very weak for azoSeR (0.03) in comparison with SeR (0.56) due to the presence of the azo
moiety which interfere with the intersystem crossing. In vitro studies were performed in rat liver
microsomes to evaluate the ability of NADPH to reduce the AZO in normoxic and hypoxic conditions.
Under normoxia, no change on the absorption spectra of azoSeR was observed after addition of NADPH
while under hypoxia a new absorbance peak was observed. Its ability to induce cell death under light
irradiation (535 nm, 28 mW∙cm−2, 3 min) was evaluated in human lung cancer-derived A549 cells
incubated with the PS under normoxia or hypoxia conditions. The cell death was mainly induced for
cells treated under hypoxia. Moreover, azoSeR was able to selectively kill hypoxic cells without ablating
normoxic cells. The evaluation of sensitivity of azoSeR to different O 2 concentrations, under light
irradiation, showed a significant toxicity even for O2 concentration of 5% and the authors also observed
an increase of cell death in mild hypoxia conditions (~ 8% of O2).
Li et al. [224] developed polymeric micelles which presented the ability to be responsive to both
hypoxia and 1O2 to improve the tumour uptake and the cargo release of the PS in the tumour site. The
micelles (mPEG-Azo-PAsp-IM Micelles) were composed by AZO covalently bind to both hydrophilic
(mPEG) and hydrophobic (PAsp-IM) polymers, the last one containing the 1O2-responsive moiety
(imidazole, IM). The micelles were formed by self-assembly of mPEG-Azo-PAsp-IM and could
encapsulated Ce6 with a content of 4.1±0.5%. The 1O2 production could induce a rapid drug release
whereas the hypoxia conditions could induce a dissection of AZO to enhance the PS uptake in tumour.
The micelles without AZO (SR micelles) were synthesized as a comparative to mPEG-Azo-PAsp-IM
149
micelles (DR micelles) for investigation of Ce6 release. The authors showed similar 1O2 production for
both SR and DR micelles under a 660 nm irradiation (100 mW∙cm −2, 10 min) and observed a good Ce6
release due to the dissociation of micelles by oxidation of imidazole moiety by 1O2. In Lewis lung
carcinoma (LLC) cells, the intracellular level of Ce6 was significantly higher after laser irradiation of DR
micelles in hypoxic conditions in comparison with SR micelles. In vitro PDT studies in Lewis lung
carcinoma (LLC) cells were performed to investigate the efficiency of DR micelles in comparison with
Ce6 alone and SR micelles. High similar phototoxicity (irradiation at 660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 min) was
observed in hypoxic conditions for Ce6 alone and DR micelles, which 2 folds more than that for SR
micelles. Under normoxic conditions, Ce6 alone showed the highest photocytotoxicity and for DR
micelles, it was lower than that in hypoxia. The in vivo PDT tests in LLC tumour-bearing mice
highlighted a better efficiency of DR micelles in comparison with SR micelles confirming the in vitro
studies.
Li et al. [225] designed a light-enhanced hypoxia responsive NP denoted (PAP-FC NPs) for synergic
treatment of solid tumours. The PAP molecules were obtained by covalent combination of poly(ethylene
oxide)-block-poly(propylene oxide)-block-poly(ethylene oxide) triblock copolymer Pluronic (P123),
polyethyleneimine (PEI600), hypoxia-responsive AZO and polyethylene glycol (PEG2000), while FC
molecules were obtained by covalent conjugation of Ce6 to triblock copolymer Pluronic F127. At critical
micellar concentration, PAP and FC polymers self-assembled into PAP-FC NPs, which ensure the
encapsulation of DOX and thus afford PAP-FC/DOX for combined chemo-PDT treatment (Figure 64).
Figure 64. The structure and mechanism of PAP-FC for combined chemo-PDT. Republished from [225] with
permission of the Royal Society of Chemistry, Copyright 2018.
According to both the in vitro and in vivo studies against MCF-7 cells, PAP-FC/DOX found to be
able to generate high level of 1O2 upon laser irradiation (660 nm, 8 mW∙cm−2, 6 min). In addition,
followed by consumption of the tissue O2, the AZO bond broke quickly in the hypoxia condition,
leading to an efficient release of DOX, and therefore triggering apoptosis of the internal tumour cells,
which resulted in enhanced antitumour efficacy.
Wang et al. [226] designed a kind of “one stone two birds” living drug delivery system by combining
the PDT and hypoxia responsive chemotherapy, denoted as Ce6-PEG-Azo-PCL for cervical cancer
treatment. This living drug delivery system was fabricated with three essentials constituents, i.e., AZO,
biodegradable hydrophobic poly(ε-caprolactone) (PCL), and hydrophilic poly(ethylene glycol) (PEG)-
conjugated Ce6. Subsequently, the functional NP Ce6-PEG-Azo-PCL was further loaded with DOX to
afford Ce6-PEG-Azo-PCL@DOX (DOX@NP). Irradiation of DOX@NP with 671 nm laser (10 mW, 5 min)
resulted in high ROS generation. The continuous consumption of O2 facilitated intracellular hypoxia
microenvironment, and triggered the disassembly of hypoxia responsive AZO at tumour site to release
loaded DOX resulting in enhanced anticancer effect.
6.1.2. Other
150
Chen et al. [227] designed pH-sensitive nanoliposomes constituted by a PS activatable under hypoxia
conditions (DiBDP), substituted by a nitro group, and a Cy7-marked anti-HIF-1α antibody (Ab-DiBDP)
for theranostic applications. DiBDP was not able to release 1O2 due to the nitro group but could be
reduced by an enzyme, the nitroreductase (NTR), and thus, was “switched on” and could release 1O2
(Figure 65). The nanoliposomes showed an average size of 86±17 nm and were able to release quickly
86 % of DiBDP at pH 5.0 within 24 h.
Figure 65. Schematic illustration of Ab-DiBDP NPs for dual hypoxia marker imaging and activatable PDT against
tumours. Republished from [227] with permission of the Royal Society of Chemistry, Copyright 2018.
They first evaluated the NTR-activatable generation of 1O2 induced by the irradiation of DiBDP by
using DPBF and showed a high increase of ϕΔ of the PS, from 0.05 to 0.46 when it was incubated with
NTR. They performed the same evaluation for Ab-DIBDP NPs, by using the SOSG and showed a
significant increase of SOSG fluorescence with NTR. The combination of Ab-DiDBP NPs and laser in
vitro in HeLa cells in hypoxic conditions showed a high cytotoxicity (more than 56 % of cell death). In
vivo studies in HeLa tumour-bearing mice were also performed to evaluate the efficiency of Ab-DiBDP
NP-mediated PDT. The tumour growth was severely reduced for mice treated with Ab-DiBDP NPs and
laser in comparison with other treatments (Ab-NPs + laser and DiBDP + laser). (Table 26)
6.2. Environment-Accumulated Hypoxia Compounds

Evans et al. [228] described the use of a MB like molecule (EtNBS) capable of destroying hypoxic
region in the core of 3D models of OVCAR-5 human OvCa cells of metastatic ovarian cancer. EtNBS
was capable to incorporate into the core of the nodule. After PDT (652 nm, 15 J∙cm−2, 25 to 300 mW∙cm−2)
even at low light fluence (5 J∙cm−2) EtNBS could destroy the nodule core cells. At higher fluence, the
entire nodule could be destructed. In hypoxic conditions, PDT (670 nm, 100 mW∙cm −2, 5 to 20 J∙cm−2)
with EtNBS was still very efficient and the authors could observe significant cell killing at 20 J∙cm −2. In
vivo experiments will be performed.
151
Table 26. Summary of publications about the use of Hypoxia-reducible compounds for PDT hypoxia-dependent.
Ref Application Hypoxia- PS Energy of Excitation Type of In vitro In vivo

dependent ROS
Strategy
[221] Chemo- Hypoxia-cleaved Ce6 In vitro: 670 nm, 50 mW∙cm−2, 6 min 1 O2 HeLa and NIH3T3 cell HeLa tumour-bearing
PDT Azobenzene In vivo: 670 nm, 50 mW∙cm−2, 10 min lines mice
[222] Chemo- Hypoxia-cleaved TMPyP4 660 nm, 1 W∙cm−2, 30 min ROS HepG2 and No
PDT Azobenzene L02 cell lines
[224] PDT Hypoxia-cleaved Ce6 In vitro: 660 nm, 100 mW∙cm−2, 10 and 1 O2 LLC cell line LLC tumour-bearing
Azobenzene 5 min mice
[223] PDT Hypoxia-cleaved azoSeR 535 nm, 28 mW∙cm−2, 3 min 1 O2 A549 cell line No
Azobenzene
[225] Chemo- Hypoxia-cleaved Ce6 In vitro: 660 nm, 8 mW∙cm−2 , 6 min 1 O2 MCF-7 cell line MCF-7 tumour-bearing
PDT Azobenzene In vivo: 660nm, 8 mW∙cm−2, 30 min mice
[226] Chemo- Hypoxia-cleaved Ce6 In vitro: 671 nm, 10 mW∙cm−2, 5 min 1 O2 HeLa cell line HeLa tumour-bearing
PDT Azobenzene In vivo: 671 nm, 150 mW∙cm−2, 10 min mice
[227] PDT Hypoxia-reducible DiBDP 520 nm, 100 mW∙cm−2, 5 min 1 O2 HeLa cell line HeLa tumour-bearing
compound by NTR substituted with mice
a nitro group
Ce6: Chlorin e6; TMPyP4: 5,10,15,20-tetrakis-(1-methyl-4-pyridyl)-21H,23H-porphine; azoSeR: azobenzene seleno-rosamine-based dye; NTR: Nitroreductases; DiBDP:
dimeric BODIPY.
152
Guan et al. [229] synthesized a novel theranostic nanosheet, composed of a metal complex (Ru(C-
bpy)2) loaded to single layered layered double hydroxide (LDH), denoted as Ru(C-bpy)2/mLDH) for
theranostic applications. The nanosheets Ru(C-bpy)2/mLDH showed an average diameter of 35±5 nm
and a stronger fluorescence under an excitation at 488 nm for hypoxia media in comparison with
normoxic media. Under light excitation (520 nm, 100 mW∙cm−2 for 8 min), a significant decrease of cell
viability was observed for Ru(C-bpy)2/mLDH which appeared to be more phototoxic than Ru(C-bpy)2
alone. They observed that ϕΔ was depended of the excitation wavelength and the combination of single
layered LDH with the ruthenium complex significantly enhanced the generation of 1O2 with a ϕΔ of 0.28
for Ru(C-bpy)2/mLDH against 0.19 for Ru(C-bpy)2 alone. An in vivo model of nude mice bearing
subcutaneous HeLa tumour was used to evaluate the PDT efficiency of the nanosheets. The animals
treated with Ru(C-bpy)2/mLDH and irradiation at 520 nm (100 mW∙cm−2) for 8 min, showed a significant
suppression of tumour volume in comparison with the control and Ru(C-bpy)2 groups. (Table 27)
6.3. Other
Guan M. et al. [230] developed a biocompatible, water soluble and photostable PS, the
trismethylpyridylporphyrin-C70 (PC70) constituted by C70 linked to 5-(4-formyl- phenyl)-10,15,20-
tris(4-pyridyl)-porphine (D-TMPyP), which could be used in hypoxic media. PC70 could be assembled
in a structure similar to liposome with a diameter of 30 nm. In vitro studies in A549 cells were performed
to evaluate PDT efficiency of this compound in normoxic and hypoxic conditions. Under normoxic
conditions, it was shown that PC70 phototoxicity was both concentration and illumination time-
dependent. For cells incubated with 1 µM of PC70 and illuminated with white light (17 mW∙cm−2) during
10 min, the percentage of cell death reached 98 % (Figure 66).
Figure 66: a) Cell viability of A549 cells incubated with PC70 at gradient concentrations for 3 h and exposed to light
irradiation for 10 min at a power density of 17 mW∙cm−2 and b) dose- and time-dependent PDT effects of PC70 on
the A549 cell viability. Adapted from Guan et al. [230].
Under hypoxic conditions, in the same conditions of irradiation as previously, the photodamage of
A459 cells was significantly higher with PC70 (80%) in comparison with D-TMPyP (22 %) demonstrating
the high potential of PC70 under white light illumination, to kill hypoxic cells.
7. Fractional PDT
The strategy is to intermittently irradiate the tumour in order to regulate the consumption of 3O2 and
the formation of 1O2. This discontinuous irradiation technique proved positive in most cases studied.
This phenomenon seems due to the fact that the pulsed irradiation allows an optimal replenishment of
cellular O2.
153
Table 27. Summary of publications about the use of compounds hypoxia environment-accumulated for PDT hypoxia-dependent.
Ref Application PS Energy of Excitation Type of In vitro In vivo

ROS
[228] PDT EtNBS EtNBS-PDT: 652 nm, 15 J∙cm−2, 25 to 300 nd 3D adherent OVCAR-5 human OvCa No
mW∙cm−2 model
Hypoxia EtNBS-PDT: 670 nm, 100 mW∙cm−2, 5 to
20 J∙cm−2
[229] PDT Ru(C- 520 nm, 100 mW∙cm−2, 8 min 1O2 HeLa cell line HeLa tumour-bearing
bpy)2/mLDH mice
nd: not determined.
154
In 1996, Van Geel et al. [231] investigated the influence of different ways of illumination (single or
fractionated) or different fluence rates for a discontinuous illumination, on the PDT efficiency of two PS
(Photofrin and meta-tetrahydroxyphenylchlorin, mTHPC) in female C3H/Km mice inoculated with RIF1
cells. They first studied the difference between interstitial and superficial illumination and showed that
to have the same fluence rate of interstitial illumination they have to increase the time of superficial
illumination, by a factor of 2.7. However, they did not observe a significant difference of tumour
response with PDT treatment Photofrin for both illuminations whereas they highlighted an increased
response with mTHPC under superficial illumination. The fractionated illumination studies were
performed only with mTHPC and no marked difference on tumour regrowth was observed between
continuous or fractionated illumination. They also tested a single dose application of mTHPC in
comparison with two doses (each 24h before the illumination) and observed no difference in the tumour
response. However, for a single dose of mTHPC and by varying the time interval between each
illumination, even if no change was observed on the delay for tumour regrowth, an increase of cure
mice was observed for a time interval of 1h. Moreover, the number of cure mice was better with the
injection of two doses of mTHPC. They finally determined that the fluence rate, for a discontinuous
illumination had no influence on the tumour response.
In two studies, Klimenko et al. [232,233] studied the influence of the type of irradiation (pulse or
continuous) on the O2 consumption and 1O2 generation. A first theoretical model showed a high
decrease of O2 generation and the cumulative 1O2 production at high fluence rates under continuous
wave (CW) mode whereas, for pulse irradiation mode, a high level of 3O2 was maintained as the
cumulative 1O2 concentration, which increased in comparison with CW mode.
Both modes of irradiation were tested in vitro in k562 cell line by using radachlorin and the authors
observed that there was less cell surviving while CW mode in comparison with pulse mode at fluence
of 1.25 and 2.5 J∙cm−2. Moreover, they observed different mechanisms of cell death with the two modes
with an apoptotic mechanism for pulse mode and a necrotic mechanism for CW.
Kawauchi et al. [234] in 2004 studied the difference in mouse renal carcinoma cells (Renca) viability
and total O2 consumption and O2 consumption rate after pulsed laser irradiation (670 nm nanosecond
pulsed Nd:YAG laser, peak fluence rate 1 mW∙cm−2, 30 Hz) or continuous laser irradiation (CW, 670 nm,
40 J∙cm−2) by using (13,17-bis[1-carboxypropionyl]carbamoyl- ethyl-3-ethenyl-8-
ethoxyiminoethylidene-7-hydroxy-2,7,12,18-tetramethylporphyrin sodium (PAD-S31). Concerning the
cytotoxicity at two different irradiances (180 mW∙cm−2 and 270 mW∙cm−2), continuous excitation induced
more cell viability than pulsed irradiation. The cytotoxic effect was independent of the fluence rate for
both excitation modes. The O2 consumption rate decreased of half after pulsed light compared to CW.
The total O2 consumption was also less important with pulsed light compared to CW. Fluence rates for
both excitation modes influenced the O2 consumption (less O2 consumption for 270 mW∙cm−2 than for
180 mW∙cm−2) but did not have any influence on the total O2 consumed.
In 2016, Turan et al. [235] developed a PS for fractional PDT able to produce 1O2 under light
irradiation and in the dark. This PS was based on a pyridone (PYR) which could be converted in 2-
pyridone endoperoxide (EPO) after light irradiation (650 nm) by reaction with 1O2 generated. In the
dark EPO was able to release 1O2 by thermal conversion and thus returned to the PYR form (Figure 67).
Under alternation of dark and light (650 nm, 15 min) cycles on this PS, a continuous production of
1O2 was observed. The PDT efficiency of PYR and EPO was evaluated in vitro in HeLa cells and for a
better solubility, the compound was incorporated into micelles. After administration of the compounds
and 655 nm LED array irradiation (324 µmol∙m−2∙s−1 photon flux) during 10 min repeated every one
hour, a significant decrease of cell viability was observed for both compounds.
155
Figure 67. 1O2 generation achieved first by irradiation of bifunctional compound PYR at λ = 650 nm, and
subsequently by thermal cycloreversion in the dark. The cycles can be repeated indefinitely. Adapted from Turan
et al. [235].
Moreover, EPO seemed to present a better phototoxic effect with a CC50 (50% cytotoxic
concentration) of 8.6 nM against 49.0 nM for PYR. (Table 28)
Table 28. Summary of publications about fractional PDT.
Ref Application PS Excitation Wavelength Type In vitro In vivo

de
ROS
[231] Continuous vs. Photofrin and Interstitial: 628±3 nm for nd No RIF1
fractional PDT mTHPC Photofrin and 652±3 nm for tumour-
mTHPC bearing
Superficial: 100 mW∙cm−2 mice
[232,233] Continuous vs. Radachlorin 20 mW∙cm−2 1 O2 k562 No
fractional PDT Pulse mode: 200 ms – pulse cell line
duration, 700 ms - period
[234] Continuous vs. PAD-S31 Pulsed: 670 nm nanosecond nd Renca No
fractional PDT pulsed Nd:YAG laser, peak cell line
fluence rate 1 MW∙cm−2, 30
Hz
CW: 670 nm, 40 J∙cm−2, 180
mW∙cm−2 or 270 mW∙cm−2
[235] Fractional PDT Pyridone 655 nm, 324 µmol∙m−2∙s−1 1 O2 HeLa No
photon flux for 10 min cell line
every 1h
nd: not determined; mTHPC: meta-tetrahydroxyphenylchlorin.
156
8. Conclusions
The first clinical trial in PDT were performed in 1978 by Dougherty in Roswell Park (Buffalo, NY,
USA) and the first approval of PDT using Photofrin for the treatment of bladder cancer was 25 years
ago in 1993. Since then, many efforts have been done to improve the chemistry of the PS, the light
illumination and also the oxygenation of the tissue. In this review, we collected all the data till March
2019 concerning the improvement of oxygenation for PDT applications. We showed that different
strategies can be used to decrease hypoxia, leading to highly efficient treatment, and even metastasis
inhibition of aggressive hypoxic malignant cancers. In all the studies, two main approaches have been
described concerning hypoxia. In one side, the authors tried to relieved tumor hypoxia by carrying O2
in tumour or decreasing tumour O2 comsumption and in another side, they used hypoxia to activate
their designed platforms and thus improved PDT efficiency. To summarize, five different ways can be
followed: 1) playing with the light and realizing fractionated illumination to allow the re-oxygenation
of the tissues between two illuminations; 2) designing molecules or NPs that are able to produce ROS
even in hypoxic media; 3) adding O2 into the hypoxic media by transporting O2 with hemoglobin or
perfluorocarbon systems, improving the blood flow by increasing the temperature or with combination
of anti-angiogenic compounds, producing O2 by the decomposition oh H2O2 in the hypoxic medium; 4)
using combined strategies, in particular hypoxic-activated chemotherapy, PTT that does not require O2
or antiangiogenic therapy and 5) development of hypoxia-activated compounds. These strategies
present a significant interest to enhanced cancer-PDT effect by fighting hypoxia. Many in vitro and in
vivo experiments in all kind of cancer proved that the decrease of hypoxia really improved PDT
efficiency. At this time, no clinical trial is registered using one of this strategy, it should be the next step.
Overcoming hypoxia to improve PDT is a relatively new subject whose interest has been steadily
increased since the 1990s. In 1991, Freitas and Baronzio [5] reported a few strategies to fight hypoxia by
improving the oxygenation of tumours which rely essentially on the increase of tumour O 2
concentration. In our review, we reported an enhancement of the attention for hypoxia these last years
with an increase of publications about hypoxia and PDT year after year. In our point of view, fighting
hypoxia could become essential for an efficient PDT treatment of cancer and could lead to significant
improvements for the treatment of patients.
Author Contributions: writing-review and editing: L. Larue , B. Myrzakhmetov , A. Ben-Mihoub , A. Moussaron,
N. Thomas , P. Arnoux, F. Baros , R. Vanderesse , S. Acherar , C. Frochot
Funding: This research received no external funding
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.
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169
170
CHAPITRE II : LA
PDT CIBLEE ET
INDEPENDANTE DE
L’OXYGENE : UNE
PREUVE DE CONCEPT
171
172
CHAPITRE II : La PDT ciblée et indépendante de l’oxygène : une preuve de
concept
I. Ciblage du récepteur NRP–1 par des peptides

Notre équipe s’est intéressé depuis plus de 15 ans au ciblage de NRP–1. Dans un
premier temps, nous avons utilisé un heptapeptide (ATWLPPR). Dans cette étude, le
peptide a été couplé à un PS (TPC, (chlorine 5–(4–carboxyphényl)–10,15,20–triphényl) par
l’intermédiaire d’un bras espaceur (Ahx, acide aminohexanoïque). In vitro, le conjugué
TPC–Ahx–ATWLPPR synthétisé a été mis en contact avec des cellules endothéliales de la
veine ombilicale humaine (HUVEC), exprimant le récepteur NRP–1, en comparaison avec
la TPC seule. Il a été montré que l’accumulation du conjugué était 25 fois supérieure à
celle de la TPC seule et une incorporation du conjugué médiée par la fixation du peptide à
NRP–1. De plus, le conjugué a montré une phototoxicité environ 10 fois supérieure à celle
de la TPC seule.127 L’augmentation de l’accumulation cellulaire de la TPC par association
avec ce peptide dans le conjugué TPC–Ahx–ATWLPPR a été confirmé par des études sur
des cellules de cancer du sein (MDA–MB–231) surexprimant fortement le récepteur NRP–
1. Des études in vivo, sur des souris greffées avec des cellules de gliome malin humain, ont
montré une accumulation du conjugué au niveau des cellules endothéliales tapissant les
vaisseaux tumoraux ainsi qu’une réduction de la vascularisation de la tumeur au cours du
traitement par PDT.128 En revanche, d’autres études in vivo ont ensuite montré une
dégradation du peptide.129
L’étude de nouveaux peptides pouvant cibler NRP–1 a alors été effectuée par docking
moléculaire et tests d’affinité. Les peptides étudiés ont été déterminés à partir des ligands
de NRP–1 décrits dans la littérature et l’affinité d’un nouveau peptide (DKPPR) pour
celui–ci a pu alors être mise en évidence. De plus, il a été montré que l’extrémité C–
terminale était importante pour l’affinité du peptide pour NRP–1.130 L’ajout d’une lysine
sur l’extrémité N–terminale pour le greffage d’un PS a été effectuée par la suite et il a été
prouvé que cet ajout ne diminuait pas l’affinité pour NRP–1 mais au contraire l’améliorait
(CE50 = 46 µM pour DKPPR et CE50 = 2 µM pour KDKPPR).131
Ce dernier peptide (KDKPPR) étant bien connu par notre équipe, nous avons choisi de
l’utiliser afin d’établir la preuve de concept de cette thèse.
173
concept
II. Les alcoxyamines photoactivables

La dissociation des alcoxyamines par différents procédés a été largement étudiée. La
méthode la plus reportée et utilisée concerne la décomposition contrôlée par la
température bien que plus récemment, d’autres amorceurs aient été reportés : la
protonation de la partie alkyle et l’illumination par la lumière UV–visible.122 Ce dernier
amorceur est largement étudié depuis le développement d’alcoxyamines photoactivables
par Scaiano et al. en 1997.132
L’influence de différents paramètres sur la photodissociation des alcoxyamines a été

étudié par Gigmes et al.133–135 Ils ont tout d’abord évalué l’influence de l’intensité
lumineuse (illumination UV) sur la photolabilité d’alcoxyamines portant un chromophore
de type benzophénone. La vitesse de dissociation (k d) de la liaison C–ON de l’alcoxyamine
a été déterminée à différentes intensités lumineuses et une corrélation linéaire entre la
vitesse de dissociation et l’intensité lumineuse a été observée. De plus, suivant la structure
de la partie nitroxyde, la quantité de nitroxyde générée maximale baisse avec la
diminution de l’intensité lumineuse, qui peut s’expliquer par une instabilité du nitroxyde
généré.135
Ils ont ensuite étudié l’influence de la position du chromophore sur la photodissociation

des alcoxyamines. Une compétition entre l’homolyse de la liaison C–ON et celle de la
liaison CO–N a été observée. Cette compétition peut être expliquée par la BDE. En effet,
plus la différence entre les BDE des deux liaisons est élevée (≥ 50 kJ.mol –1), plus la
probabilité d’obtenir préférentiellement l’homolyse de la liaison C–ON est importante. De
plus, la BDE de cette liaison doit être faible. Il a été également mis en évidence que la
liaison directe du système π du chromophore au groupement aminoxyl (Figure 25A), c’est–
à–dire en position R1 ou R2, conduisait à une compétition entre les photodissociations CO–
N et C–ON. En revanche, lorsque le chromophore est séparé de la partie contenant la
liaison N–O (Figure 25B) par deux liaisons, une forte sélectivité pour la photodissociation
de la liaison C–ON est observée conduisant à la formation de nitroxyde.133,134
174
concept
Figure 25 : Exemples d'alcoxyamines portant un chromophore, indiqué en rouge, (A) directement lié au groupement
aminoxyl et (B) séparé du groupement aminoxyl par une distance deux liaisons indiquée par une double flèche.133
D’après ces différentes études, il apparaît donc que la structure de l’alcoxyamine ainsi
que la source d’illumination jouent un rôle important dans l’efficacité de la
photodissociation de la liaison C–ON.
III. Contexte et objectifs

Afin de répondre aux objectifs de cette thèse, nous avons développé une plateforme
trimodale, applicable en PDT, sélective pour le récepteur NRP–1 et efficace à la fois en
milieu hypoxique et normoxique. La structure de cette plateforme, notée Alc1’–K(Pyro–
a)DKPPR), est donnée en Figure 26.
Figure 26 : Structure chimique de la plateforme synthétisée (notée Alc1’–K(Pyro–a)DKPPR).
Le choix du PS s’est porté sur la pyrophéophorbide a (Pyro–a), un PS naturel dérivé de

la chlorophylle, présentant une bande Q I d’absorption intense à 670 nm permettant son
excitation dans le rouge et de bons Φf et Φ△ (Tableau 4). De plus, ce PS contient dans sa
structure chimique une fonction acide carboxylique permettant le couplage à un peptide.
175
concept
Tableau 4 : Rendements quantiques de fluorescence (Φf) et d'oxygène singulet (Φ∆) de la Pyro–a dans différents
solvants. 136
Solvant Φf Φ∆
Toluène 0,39 0,49
EtOH 0,39 0,53
MeOH 0,31 0,42
Le peptide KDKPPR, dont l’affinité pour le récepteur NRP–1 a été prouvée par notre
équipe, a été utilisée. Le choix de l’alcoxyamine s’est porté sur une alcoxyamine de type
benzophénone–SG1, notée Alc1, homolysable sous une illumination par lumière UV,
permettant ainsi de générer des radicaux alkyles cytotoxiques. L’alcoxyamine
fonctionnalisée par une fonction acide carboxylique sera notée Alc1’ dans ce chapitre.
Afin de vérifier l’influence du PS et de l’alcoxyamine sur leurs propriétés respectives,

il a également été nécessaire de synthétiser deux composés de référence, le composé
alcoxyamine–peptide (Alc1’–KDKPPR) et le composé PS–peptide (K(Pyro–a)DKPPR).
Dans la suite, nous nous intéresserons à la synthèse des composés, puis à l’étude des
propriétés photophysiques du PS, de la photolabilité de l’alcoxyamine et de l’affinité du
peptide pour le récepteur NRP–1.
IV. Synthèse et purification des composés
IV.1. Synthèse peptidique en phase solide (SPPS)
IV.1.1. Principe
La synthèse peptidique en phase solide (SPPS) est un procédé, développé par

Merrifield en 1963,137 consistant en l’assemblage d’un peptide par l’accrochage de
l’extrémité C–terminale de ce dernier sur un polymère insoluble (résine), suivi d’une
succession d’additions (couplages) d’acides aminés éventuellement protégés constituants
la séquence, de l’extrémité C– à N–terminale (Figure 27).
176
concept
Figure 27 : Principe de l'élongation peptidique en SPPS. AA n = acide aminé avec n le nombre d’acide aminé, X = O ou
NH, ♦ = groupement protecteur permanent, ● = Résine.138
L’addition de chaque acide aminé se fait selon un cycle de quatre étapes :
- Déprotection : clivage du groupement protecteur de l’extrémité Nα–terminale ;

- Etapes de lavage afin d’éliminer la solution de déprotection ;
- Couplage d’un acide aminé C–terminal activé N–terminal protégé et
éventuellement protégé sur sa chaîne latérale et pré–activé par un agent de
couplage ;
- Etapes de lavage pour éliminer les excès de réactifs et les sous–produits.
La chaîne peptidique en élongation étant fixée sur le support solide (résine), les excès de
réactifs et les sous–produits solubles sont éliminés simplement par filtration lors des
étapes de lavage avec des solvants appropriés. Lors des étapes de déprotection et couplage,
seuls des solvants permettant de gonfler la résine (dichlorométhane, DCM ou
diméthylformamide, DMF) sont utilisés alors que lors des lavages, des solvants rétractant
la résine (MeOH ou éthanol, EtOH) peuvent être employés. Le peptide assemblé restant
177
concept
ancré à la résine, cette technique permet de s’affranchir de toutes les étapes d’extraction
et de purification à chaque couplage.139
Cette technique permet de travailler avec des excès de réactifs et par conséquent
d’augmenter la vitesse des réactions afin d’atteindre des rendements proches de 100% à
chaque étape.
IV.1.2. Stratégies de synthèse et résines utilisées
En SPPS, il est essentiel d’utiliser des protections appropriées pour pouvoir contrôler
la réactivité des fonctions susceptibles de réagir. Il existe deux types de groupements
protecteurs, ceux dits temporaires en position N–terminale sur la chaîne principale et ceux
dits permanents portés par les chaînes latérales des différents acides aminés qui doivent
être stables tout au long de la synthèse pour éviter des réactions secondaires. Les
protections « temporaires » sont donc retirées avant chaque couplage alors que les
protections « permanentes » le sont seulement à la fin de la synthèse lors du clivage du
peptide de la résine. Il est nécessaire que ces deux types de protection soient orthogonales
afin qu’il n’y ait pas de déprotection des chaînes latérales lors de la déprotection de
l’extrémité N–terminale.140,141
Le choix des protections est déterminé par la stratégie utilisée. Il existe plusieurs
stratégies en SPPS dont les deux principales sont la stratégie Boc/Bzl et la stratégie
Fmoc/tBu (Tableau 5). La stratégie Boc/Bzl est la plus ancienne et repose sur l’utilisation
d’acide trifluoroacétique (TFA) pour l’élimination des groupements protecteurs
temporaires (Boc) et d’un acide fort (acide hydrofluorique, HF) pour le clivage final. Cette
stratégie n’est pas préconisée en synthèse de routine en raison de l’utilisation de HF,
nécessitant un équipement spécial. La stratégie Fmoc/tBu, plus récente, est moins
contraignante : les groupements protecteurs temporaires basolabile sont éliminés avec de
la pipéridine et le clivage final est effectué à l’aide de TFA.141,142 Cette stratégie a été
retenue dans le cadre de cette thèse.
178
concept
Tableau 5 : Comparaison entre les deux principales stratégies utilisées en SPPS. Adapté de138.
Fmoc/tBu Boc/Bzl
Utilisation Synthèse de routine Equipement spécial nécessaire
Protections de l’extrémité N– Orthogonales En milieu acide

terminale et des chaînes
latérales
Déprotection de l’extrémité N– Milieu basique (Pipéridine) Milieu acide (TFA)

terminale
Déprotection des chaînes Milieu acide (TFA) Milieu acide fort (HF)
latérales et clivage de la résine
Echelle Pas de limitation, y compris pour Limité pour le clivage final avec
le clivage final HF
Étapes de synthèse Déprotection, lavages, couplage, Étape de neutralisation

lavages supplémentaire
Le support solide utilisé en SPPS, aussi nommée résine, est généralement composé
d’une matrice polymère et d’un espaceur. Chaque résine est caractérisée par sa charge («
loading ») qui indique le nombre de sites d’accrochage disponibles et qui est donnée en
mmol.g–1 de résine. Il existe de nombreux types de résines commercialement disponibles
dont les résines à base de polystyrène réticulé qui sont les plus utilisées en synthèse de
routine. Ces dernières sont caractérisées par des billes ayant une taille comprise entre 200
et 400 mesh, soit un diamètre d’environ 50 µm et une charge comprise entre 0,5 et 0,8
mmol.g–1. Elles présentent des propriétés de gonflement importantes dans le DMF et le
DCM. Il existe également d’autres types de résines plus hydrophiles que les résines
polystyrène, les résines à base de polyamide réticulé et les résines composites à base de
polystyrène–polyéthylène glycol (PEG). Ces résines présentent une charge généralement
moins importante mais peuvent être une alternative pour les grandes séquences
peptidiques (plus de 25 acides aminés) ou les séquences difficiles.143
Le type de polymère et l’espaceur vont être déterminés par la stratégie choisie ainsi que
par la nature de l’extrémité C–terminale (acide carboxylique ou amide) souhaitée pour le
peptide à synthétiser. Le Tableau 6 récapitule les principales résines polystyrène utilisées
en SPPS.
179
concept
Tableau 6 : Types de résines polystyrène utilisées en SPPS. Adapté de Palomo et al.139
Résine Structure chimique Conditions de Nature de l’extrémité

polystyrène clivage C–terminale du peptide
final
Wang TFA Acide carboxylique
Rink acide TFA Acide carboxylique
HMPB TFA Acide carboxylique
2–chlorotrityl TFA Acide carboxylique

chloride
Rink amide TFA Amide
MBHA HF Amide
Fmoc, fluorénylméthoxycarbonyl ; HMPB, acide 4–(4–Hydroxyméthyl–3–méthoxyphénoxy)butyrique ; MBHA, 4–

méthylbenzhydrylamine.
Le choix de groupements protecteurs « permanents » est important. Dans le cas de la

stratégie Fmoc/tBu, les groupements protecteurs orthogonaux sont éliminés lors du
clivage final du peptide par le TFA. Le Tableau 7 récapitule les différents groupements
protecteurs acido–labiles utilisés pour l’ensemble des acides aminés protéinogènes.
Tableau 7 : Liste des acides aminés protéinogènes nécessitant une protection « permanente » sur leur chaîne latérale
et des groupements protecteurs acido–labile associés. Adapté d’Amblard et al.143
L– Acide aminé Structure Groupement protecteur acido–labile
Arginine (Arg, R)
180
concept
Asparagine (Asn, N)
Acide aspartique (Asp, D)
Cystéine (Cys, C) Trt, Mtt
Acide Glutamique (Glu, E) tBu
Glutamine (Gln, Q) Trt, Mtt
Histidine (His, H) Trt, Mtt
Lysine (Lys, K)
Sérine (Ser, S) tBu,
Thréonine (Thr, T) tBu,
Tryptophane (Trp, W) Boc
Tyrosine (Tyr, Y) tBu
Boc, tert–butoxycarbonyl; tBu, tert–butyl ; Mtt, 4–méthyltrityl; Pbf, pentaméthyl–2,3–dihydrobenzofuran–5–sulfonyl ;

Pmc, 2,2,5,7,8–pentaméthylchroman–6–sulfonyl ; Trt, triphénylméthyl.
181
concept
Dans le cas de certaines stratégies de synthèse, il est également possible de déprotéger

sélectivement un acide aminé en utilisant des groupements protecteurs appropriés. Par
exemple, pour la lysine, il est possible d’utiliser un groupement allyloxycarbonyl (Alloc)
clivé en présence de Palladium ou un groupement 1–(4,4–diméthyl–2,6–dioxocyclohex–1–
ylidène)éthyl (Dde) clivé en présence de 2% d’hydrazine dans le DMF.141,144
IV.1.3. Suivi de la SPPS
Le suivi des réactions de couplage est plus compliqué que pour les synthèses
classiques en solution. Plusieurs techniques permettent cependant de suivre les étapes
de déprotection et de couplage.
IV.1.3.1. Dosage du groupement Fmoc
La première de ces techniques consiste à déterminer la charge de la résine par un

dosage du groupement Fmoc porté par l’extrémité N–terminale. Elle est souvent
utilisée lors de l’accrochage du premier acide aminé sur la résine afin de vérifier quelle
quantité d’acide aminé a été accrochée. Pour cela, une petite quantité pesée de résine
est mise en présence d’une solution de déprotection contenant de la pipéridine. La
réaction de déprotection du groupement Fmoc est une β–élimination induite en milieu
basique. Lors de cette réaction, le Fmoc est éliminé en dibenzofulvène et dioxyde de
carbone (Figure 28). Le dibenzofulvène formé peut alors réagir avec une seconde
molécule de pipéridine pour former un adduit dont le dosage est effectué à 301 nm par
spectroscopie UV.139,145 Cette seconde réaction permet d’éviter une réaction
irréversible du dibenzofulvène avec l’amine N–terminale libérée. La quantification de
l’adduit formé permet de déterminer indirectement la quantité en acide aminé
accroché à la résine et par conséquent la charge de la résine.
Figure 28 : Mécanisme de déprotection du groupement Fmoc.
182
concept
IV.1.3.2. Tests colorimétriques
De nombreux tests colorimétriques qualitatifs ont été développés pour évaluer le

succès des réactions de couplage et de déprotection. Ces tests permettent d’évaluer
s’ils restent des amines libres en position N–terminale, indiquant un couplage
incomplet. Une fonction amine déprotégée correspondra ainsi à un test positif alors
qu’une fonction amine protégée correspondra à un test négatif. Il existe plusieurs
tests notamment les tests de Kaiser et TNBS (acide 2,4,6–trinitrobenzènesulfonique)
permettant de détecter préférentiellement les amines primaires, et le test chloranil
permettant de détecter les amines secondaires. Lors de ces tests, quelques billes de
résines sont soumises à quelques gouttes de solutions spécifiques et l’observation de
la couleur des billes permet de déterminer la réussite du couplage.146
Le test de Kaiser est basé sur la réaction des amines avec la ninhydrine. Une coloration
bleue de la résine et de la solution correspond à un test négatif alors qu’une coloration
jaunâtre correspond à la présence d’amines déprotégées.147
Le TNBS réagit avec les amines primaires libres pour conduire à la formation d’un
dérivé trinitré qui conduit à une coloration rouge–orange des billes de résine. Dans ce
cas, seule une coloration des billes de résine, et non de la solution, est observée. Un
test positif correspond à des billes rouges–orange et un test négatif correspond à des
billes incolores.148
Dans le test chloranil, comme pour le test TNBS, seule une coloration des billes de
résine est observée. Un test positif correspond à des billes bleues foncé–vertes et un
test négatif correspond à des billes incolores ou jaunâtre.149
Ces tests sont plus adaptés pour des petites séquences peptidiques (< 25 acides
aminés). En effet, lors de la synthèse de long peptides, l’extrémité N–terminale du peptide
devient moins accessible et ces tests peuvent se révéler inefficaces.
IV.1.3.3. Micro–clivage
L’outil qui reste le plus fiable pour visualiser le bon déroulement de la SPPS est le
micro–clivage. Celui–ci consiste à prélever quelques billes de résine et de les soumettre
aux conditions de clivage puis d’analyser le peptide clivé obtenu par LC–MS.145
183
concept
IV.1.3.4. Capping
S’il n’est pas possible de vérifier le bon déroulement de la synthèse ou si malgré

des étapes de couplage répétées, le couplage reste incomplet, des étapes de capping
peuvent être effectuées à l’issue de celui–ci. Cette étape consiste en l’acétylation des
fonctions amines n’ayant pas réagi au cours de la synthèse afin de les neutraliser et
ainsi éviter la formation de peptides de délétion.146
IV.1.4. Agents de couplage
Lors du couplage peptidique, il est nécessaire d’activer la fonction acide carboxylique

en position C–terminale de l’acide aminé à coupler sur la résine. Cette activation rend
cette fonction plus réactive, ce qui permet de réduire les temps de couplage et d’augmenter
les rendements de couplage. Pour cela, des agents de couplage sont utilisés pour activer in
situ l’acide aminé. Il existe deux catégories principales d’agents de couplage : les
carbodiimides et les sels de phosphonium et d’uronium.150
IV.1.4.1. Les carbodiimides
L’utilisation de carbodimides pour la synthèse peptide a été introduite en 1955 par

Sheelan et Hess.151 Ces composés permettent la formation d’une O–acylisourée par
réaction du carbodiimide avec la fonction acide carboxylique de l’acide aminé. L’O–
acylisourée ainsi formée est en principe capable de réagir avec l’amine libre en position
N–terminale sur le peptide en croissance accroché à la résine. Ce couplage peptidique
engendre la libération d’un dérivé urée (Figure 29).
Figure 29 : Mécanisme de la réaction d'activation par les carbodimides suivi du couplage du Fmoc–acide aminé au
peptide en élongation.
Le Tableau 8 récapitule quelques exemples de carbodiimides utilisés en SPPS.
184
concept
Tableau 8 : Exemples de carbodiimides utilisés en SPPS.
Carbodiimide Structure
DCC151
DIC152
EDCI152
DCC, N,N′–Dicyclohexylcarbodiimide ; DIC, N,N′–Diisopropylcarbodiimide ; EDCI, N–Ethyl–N′–(3–

diméthylaminopropyl)carbodiimide.
Cependant, l’utilisation de carbodiimides présente l’inconvénient de générer plusieurs

réactions secondaires. En effet, la réaction de couplage avec ce type de composé est
généralement lente et peut alors se traduire par la migration de l’aminoacyle du O vers le
N de l’O–acylisourée conduisant à un dérivé inactif (Figure 30A) ou par la formation
significative d’une oxazolone entraînant une racémisation (Figure 30B).153
Figure 30 : Mécanismes des réactions pouvant se produire lors de l'activation d'un Fmoc–acide aminé par un
carbodiimide. (A) Formation de la N–acylisourée et (B) Racémisation par la formation d’une oxazolone.153
L’ajout d’un nucléophile auxiliaire plus réactif tel que l’1–hydroxybenzotriazole (HOBt)
peut permettre de réduire la probabilité de ces réactions secondaires. Ce nucléophile
auxiliaire va réagir plus rapidement avec l’O–acylisourée pour former un ester activé plus
réactif (Figure 31).153
185
concept
Figure 31 : Mécanisme de la réaction d'activation par les carbodimides et l’HOBt suivi du couplage du Fmoc–acide
aminé au peptide en élongation.150
IV.1.4.2. Sels de phosphonium
Les sels de phosphonium, tout comme les sels d’uronium, sont des sels d’oniums dérivés
de l’HOBt et sont très largement utilisés en SPPS. L’un des premiers décrits est le BOP
(Hexafluorophosphate de 1–H–benzotriazol–1–yloxy–tris(diméthylamino) phosphonium),
aussi appelé réactif de Castro.154
L’utilisation de sels de phosphonium nécessite également l’utilisation d’une base afin

de former un carboxylate ; c’est cette espèce qui va réagir avec le sel de phosphonium pour
former un sel acyloxyphosphonium longtemps considéré comme l’espèce réactive dans ce
mécanisme. D’autres études ont montré qu’il était plus probable que l’espèce réactive soit
l’ester formée avec l’HOBt libéré lors de la formation de ce sel (Figure 32).155
Figure 32 : Mécanisme de la réaction d'activation par le BOP suivi du couplage du Fmoc–acide aminé au peptide en
élongation.155
186
concept
En revanche, bien que très réactif, l’utilisation du BOP conduit à la libération d’une
espèce très toxique : l’hexaméthylphosphoramide (HMPA). Pour pallier ce problème,
d’autres sels de phosphonium dérivés de la structure du BOP ont été développés : PyBOP,
PyAOP, PyCloP (Tableau 9).
Tableau 9 : Liste de sels de phosphonium utilisés en SPPS.
Sel de phosphonium Structure

BOP154
PyBOP156
PyAOP157
PyCloP158
BOP, Hexafluorophosphate de 1–H–benzotriazol–1–yloxy–tris(diméthylamino) phosphonium ; PyBOP,

Hexafluorophosphate de (benzotriazol–1–yloxy)tripyrrolidinophosphonium; PyAOP, Hexafluorophosphate de (7–
azabenzotriazol–1–yloxy)tripyrrolidinophosphonium ; PyCloP, Hexafluorophosphate de chlorotripyrrolidinophosphonium.
IV.1.4.3. Sels d’uronium
Ces agents de couplages sont également très utilisés en synthèse peptidique. Les sels
d’uronium possèdent une charge positive portée par un atome de carbone. Le mécanisme
de la réaction d’activation par les sels d’uronium est décrit en Figure 33. Comme pour les
sels de phosphonium, cette réaction se fait en présence d’une base conduisant à la
formation d’un ion carboxylate qui va réagir avec le sel d’uronium pour former un sel
carboxyluronium. L’HOBt libéré va alors réagir avec ce sel pour générer un ester activé
qui va pouvoir réagir par couplage peptidique avec l’amine libre en position N–terminale
sur le peptide en expansion accroché à la résine (Figure 33, Voie A).
Un des inconvénients majeurs dans l’utilisation de ces agents de couplage est la

formation d’un dérivé tétraméthylguanidinium bloquant de façon irréversible la fonction
N–terminale du peptide en expansion (Figure 33 Voie B). Pour éviter cette réaction
187
concept
secondaire, il est donc impératif de générer dans un premier temps l’ion carboxylate de
l’acide aminé et d’ajouter ensuite le réactif de couplage et d’ajouter en dernier le peptide
possédant une extrémité N–terminal libre.155
Figure 33 : Mécanisme de la réaction d'activation par l’HBTU suivi du couplage du Fmoc–acide aminé au peptide en
élongation (voie a) et la réaction secondaire conduisant à la guanidinylation de la fonction amine N–terminale du
peptide en expansion (voie b).155
Le Tableau 10 récapitule quelques exemples de sels d’uronium utilisées en SPPS. 155
Tableau 10 : Exemple de sels d'uronium utilisés en SPPS.
Sel d’uronium Structure

HATU159
HBTU160
HATU, Hexafluorophosphate de 1–[bis(diméthylamino)méthylène]–1H–1,2,3–triazolo[4,5–b]pyridinium 3–oxyde ; HBTU,

Hexafluorophosphate d’O–(benzotriazol–1–yl)–N,N,N’,N’–tétraméthyluronium.
188
concept
IV.1.5. Clivage
En stratégie Fmoc/tBu, le clivage du peptide de la résine s’effectue en milieu acide en

présence de TFA, les chaînes latérales sont également déprotégées. En revanche, des
carbocations provenant de groupements protecteurs (tels que le groupement tBu) peuvent
être formés. Ceux–ci peuvent alors réagir avec les chaînes latérales d’autres acides aminés
sur le peptide (par exemple, les chaînes latérales de la méthionine et du tryptophane).
Pour éviter cela, des nucléophiles appelés « scavengers » tels que le Triisopropylsilane
(TIS) ou certains thiols (éthanedithiol (EDT)) sont utilisés. Le peptide ainsi clivé est
ensuite précipité dans l’éther diéthylique à froid.143,155
IV.2. Synthèse des composés
La synthèse des composés a été réalisée entièrement par SPPS.
IV.2.1. Synthèse du composé K(Pyro–a)DKPPR (7)
Afin de coupler la Pyro–a au peptide KDKPPR, deux synthèses en parallèle ont été
effectuées, 1) le couplage en solution de la Pyro–a sur l’ε–NH2 de la lysine d’une part et 2)
la synthèse du peptide DKPPR d’autre part.
La première étape de cette synthèse a donc consisté au couplage de la Pyro–a sur l’ε–
NH2 de la lysine (Figure 34). Pour cela, la fonction acide carboxylique de la Pyro–a a été
préalablement activée par un groupement N–hydroxysuccinimide (NHS) en présence
d’EDCI dans un mélange THF/DMF. La Pyro–a ainsi activée sous forme d’ester NHS (1)
a été couplée sur l’ε–NH2 de la lysine en présence de triéthylamine dans un mélange
CHCl3/DMF. Le composé 2 a été obtenue avec un rendement global de 83% et une pureté
en HPLC de 97% après purification par chromatographie sur colonne de silice.
189
concept
Figure 34 : Synthèse du composé 2. (i) NHS, EDCI, THF/DMF, 12 h, 40°C ; (ii) Fmoc–Lys–OH, Et3N, CHCl3/DMF, 12 h,
tamb.
D’autre part, le peptide 6, protégé sur ses chaînes latérales, a été synthétisé (Figure
35). Le peptide 6 a été obtenu par une succession d’étapes de déprotection, couplage et
capping.
Figure 35 : Synthèse du composé 7. (i) déprotection : 20% pipéridine dans le DMF, 4 min puis 7 min (synthétiseur) ou 4
x 15 min (manuelle), tamb, (ii) couplage : Fmoc–AA(GP)–OH, HBTU, NMM, NMP, DMF, 2 x 18 min, tamb, (iii) couplage : 2,
HBTU, NMM, NMP, DMF, 12 h, tamb et (iv) clivage : TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5 ; v/v/v), 2 h, tamb.
190
concept
A partir du peptide 6 ainsi synthétisé, le composé 2 a ensuite été couplée à ce dernier,

après déprotection préalable du groupement Fmoc, dans des conditions de couplage
similaire à celles utilisées pour la synthèse du peptide. Après la déprotection de l’extrémité
N–terminale, le composé a finalement été clivé du support et déprotégé sur ses chaînes
latérales en milieu acide pour obtenir le composé 7 avec un rendement global de 25% après
purification par HPLC préparative.
IV.2.2. Synthèse de la plateforme trimodale Alc1’–K(Pyro–

a)DKPPR (14)
Concernant le couplage de Alc1’, il a été choisi de la greffer sur l’extrémité N–terminale

libre du peptide et deux stratégies de couplage ont été envisagées, par réaction de chimie
click ou par SPPS.
IV.2.2.1. Couplage par chimie click
La réaction de chimie click choisie est la cycloaddition azoture alcyne catalysée par le
cuivre (I) (CuAAC) ou cycloaddition 1,3–dipolaire de Huisgen catalysée par le cuivre. La
cycloaddition 1,3–dipolaire de Huisgen est une réaction non catalysée permettant la
synthèse de 1,2,3–triazoles à partir d’un azoture et d’un alcyne sous haute
température.161,162 Cette réaction est lente et non sélective, conduisant à la synthèse d’un
mélange de régioisomères 1,4– et 1,5–disubstitués 1,2,3–triazoles (Figure 36). Le terme de
« chimie click » a été introduit en 2001 par Sharpless.163 La cycloaddition 1,3–dipolaire
catalysée par le Cu (I) entre un alcyne et un azoture (CuAAC) a été simultanément
découverte en 2002 par les équipes de Medal et Sharpless. 164,165 L’utilisation de cuivre (I)
comme catalyseur permet d’augmenter la vitesse de la réaction et également d’avoir une
réaction régiosélective conduisant à l’obtention de l’isomère 1,4–disubstitué. L’utilisation
de la CuAAC pour la synthèse de dérivés de PSs tels que les porphyrines, chlorines et
phtalocyanines, a été décrite dans la littérature.166
191
concept
Figure 36 : Synthèse de 1,2,3–triazoles par cycloaddition 1,3–dipolaire d'azoture et d'alcyne.
Pour effectuer le lien triazole entre la Pyro–a et l’Alc1’, nous avons choisi de greffer 1)
un groupement alcyne sur Alc1’ en faisant réagir sa fonction acide carboxylique avec la
propargylamine et 2) un groupement azoture sur l’extrémité N–terminale du composé
K(Pyro–a)DKPPR–Résine Wang avec l’acide azidohexanoïque.
Afin de greffer le bras alcyne sur Alc1’, des conditions similaires à la synthèse du
composé 2 ont été utilisées. La fonction acide carboxylique de Alc1’ a d’abord été activée
sous forme d’ester de NHS en présence de NHS et d’EDCI dans un mélange acétate
d’éthyle (AcOEt)/DMF. La propargylamine a ensuite été couplée à Alc1’ ainsi activée en
présence de triéthylamine dans un mélange CHCl3/DMF (Figure 37). Le composé 9 a alors
été obtenu après plusieurs lavages et extraction avec un rendement quantitatif et utilisé
sans purification dans l’étape suivante.
Figure 37 : Synthèse de l'Alc1’ fonctionnalisée par un bras alcyne, 9. (i) NHS, EDCI, AcOEt/DMF, 24 h, 35°C et (ii)
propargylamine, Et3N, CHCl3/DMF, 30 h, tamb.
Le bras azoture azidohexanoïque a été couplé au peptide en croissance dans les mêmes
conditions de couplage que celles décrites pour la synthèse du peptide. Le composé ainsi
obtenu a ensuite été clivé de la résine et déprotégé sur ses chaînes latérales pour conduire
à l’obtention du composé 11 après centrifugation dans l’éther à froid et utilisé sans
purification pour l’étape suivante. Pour éviter une insertion du cuivre au centre du cycle
192
concept
du motif Pyro–a lors de la réaction de CuAAC suivante, le composé 11 a été zingué à l’aide
d’acétate de zinc dans le DMF pour conduire au composé 12 utilisé sans purification pour
l’étape suivante (Figure 38).167
Figure 38 : Synthèse du composé 12 possédant un bras azoture. (i) couplage : Acide azidohexanoïque, HBTU, NMM,
NMP, DMF, 2 h, tamb, (ii) clivage : TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5 ; v/v/v), 2 h, tamb et (iii) Zn(OAc)2, DMF, 2,5 h, 40°C.
En revanche, après l’ajout du zinc, des problèmes de solubilité dans la majorité des
solvants organiques, à l’exception du DMF, et aqueux ont été rencontrés rendant difficile
la caractérisation du produit par les techniques d’analyse classiques (HPLC, MS, RMN 1H
et 13C). La formation du composé 12 a pu être confirmée par spectroscopie UV visible dans
le DMF (Figure 39). En effet, lors de l’insertion du zinc, il apparaît un décalage des pics
caractéristiques du spectre d’absorption de la Pyro–a.
Plusieurs changements ont pu alors être observés :
- Un déplacement bathochrome de la bande de Soret de 412 nm à 428 nm ;
193
concept
- Une disparition des bandes Q3 et Q4 ;

- Un déplacement hypsochrome de la bande Q2 de 609 nm à 615 nm et de la bande
Q1 de 670 nm à 661 nm.
Figure 39 : Spectre d'absorption UV–visible normalisé de la Pyro–a et du composé 12 dans le DMF.
La réaction de CuAAC entre les composés 9 et 12 a été ensuite effectuée dans un

mélange DMF/H2O (Figure 40) en présence de CuSO4 et d’ascorbate de sodium. Les
problèmes de solubilité ont persisté. Le composé obtenu a été traité en milieu acide afin
d’éliminer le zinc.168 Après analyse par HPLC, l’apparition d’un nouveau pic n’a pas été
détecté et le pic correspond au composé 9 de départ a été observé indiquant que la réaction
de CuAAC n’a pas eu lieu.
Figure 40 : Tentative de synthèse de la plateforme trimodale 13. (i) CuSO4, Ascorbate de sodium, DMF/H2O, 24 h, tamb et
(ii) TFA, 5 min, 0°C.
Il nous a alors fallu opter pour une autre stratégie.
194
concept
IV.2.2.2. Couplage par SPPS
Le couplage de l’Alc1’ au peptide et au PS directement par SPPS a été envisagé (Figure

41). Un premier essai a été effectué en utilisant les conditions classiques de couplage
(HBTU, NMM, NMP) mais malgré la disparition des produits de départ et l’apparition de
deux nouveaux pics en HPLC, le produit attendu n’a pas été observé.
Figure 41 : Tentative de couplage de l' Alc1’ au composé 10 par SPPS. (i) couplage : HBTU, NMM, NMP, DMF ou
PyBOP, DIPEA, DMF, 12 h, tamb et (ii) clivage : TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5 ; v/v/v), 2 h, tamb.
De nouvelles conditions de couplage ont été testées, d’après Trimaille et al.,169 utilisant
cette fois–ci le PyBOP comme agent de couplage et la DIPEA comme base dans le DMF.
Avec ces conditions, le produit souhaité a été obtenu mais le couplage n’a pas été total, un
second couplage a été par conséquent effectué. La répétition de cette dernière étape n’a,
cependant, pas entraîné une amélioration significative du ratio entre le produit de départ
et le produit souhaité (Figure 42).
195
concept
Figure 42 : Chromatogramme HPLC du composé 14 à l'issu des premier et second couplages entre l’Alc1’ et 10 suivi
d’un clivage de la résine. Gradient de 10 à 100% acétonitrile (ACN) dans l’eau + 0,1% TFA en 15 min suivi d’un
isocratique à 100% ACN + 0,1% TFA pendant 10 min (détection UV : 415 nm).
Le peptide a ensuite été clivé de la résine et déprotégé sur ses chaînes latérales pour
conduire, après purification par HPLC préparative, à la plateforme trimodale 14 avec un
rendement global de 19%.
IV.2.3. Synthèse du composé Alc1’–KDKPPR (16)
Le peptide Fmoc–KDKPPR–Résine Wang a été synthétisé selon les mêmes stratégie

et méthode que pour le peptide DKPPR décrites dans la partie IV.2.1. Après déprotection
du groupement Fmoc, l’Alc1’ a été couplée au peptide en présence de PyBOP et DIPEA
dans le DMF (Figure 43). Le couplage s’est révélé total (Figure 44).
Figure 43 : Synthèse du composé 16. (i) déprotection : 20% pipéridine dans le DMF, 7 min puis 14 min (synthétiseur) ou
4 x 15 min (manuelle), tamb, (ii) couplage : Fmoc–AA(GP)–OH, HBTU, NMM, NMP, DMF, 2 x 18 min, tamb, (iii) couplage :
Alc1’, PyBOP, DIPEA, DMF, 12 h, tamb et (iv) clivage : TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5 ; v/v/v), 2 h, tamb.
196
concept
Figure 44 : Chromatogramme HPLC à 260 nm du composé 16 à l’issu du couplage de l’Alc1’. Gradient de 10 à 100%
ACN dans l’eau + 0,1% TFA en 15 min suivi d’un isocratique à 100% ACN + 0,1% TFA pendant 10 min (détection UV :
260 nm).
Le produit 16 a pu être obtenu après clivage de la résine et déprotection des chaînes

latérales et purification par HPLC préparative avec un rendement de 27%.
IV.3. Purification par HPLC préparative
IV.3.1. Principe
Les composés synthétisés par SPPS ont été purifiés par HPLC préparative. Le principe
de cette méthode est de séparer des composés en fonction de leurs interactions avec une
phase solide dite stationnaire. Le composé solubilisé est injecté puis entraîné par une
phase liquide (phase mobile) dans une colonne contenant la phase stationnaire. Un débit
élevé est imposé à la phase mobile augmentant ainsi la pression du système et permettant
une séparation plus rapide des composés. Ce sont les interactions entre les composés et la
phase stationnaire qui vont définir l’ordre de sortie des différentes espèces. La phase
stationnaire est le plus souvent constituée de gel de silice, préparé sous forme de
microsphères et comportant des pores de tailles différentes. Ce gel de silice présente une
forte polarité qui peut être réduite par certaines modifications de ce gel, conduisant à
l’obtention de silice greffée. Ce greffage permet d’obtenir des phases stationnaires peu
polaires et hydrophobes. Parmi ces silices greffées, il existe les phases RP–C8 (Reverse
Phase) et RP–C18 pour lesquelles des chaînes carbonées de 8 et 18 atomes de carbones
sont greffées sur le gel de silice. En opposition à une phase apolaire, une phase mobile
polaire est généralement utilisée. Ce procédé est appelé chromatographie en phase inverse
197
concept
(RPLC). Dans ce cas–là, il est généralement utilisé un mélange d’eau et d’ACN ou MeOH.
Les composés polaires sont élués les premiers et les composés apolaires seront plus
facilement retenus par la colonne et donc élués plus tard.
IV.3.2. Purification des composés
Dans le cas de la purification de nos composés, nous avons utilisé la RPLC et une
colonne RP–C18 avec pour solvants l’eau (A) et l’ACN (B) contenant 0,1% de TFA. Les
composés 7 et 16 ont été purifiés facilement en suivant un gradient de 10% B à 100% B en
15 min suivi d’un isocratique pendant 10 min pour 7 et un gradient de 10% B à 100% B en
25 min pour 16 et utilisant un débit de 12 mL.min–1 (Figure 45).
Figure 45 : Chromatogrammes HPLC obtenus pour les composés 7, 16 et 14 purifiés. Gradient de 10 à 100% ACN dans
l’eau + 0,1% TFA en 15 min suivi d’un isocratique à 100% ACN + 0,1% TFA pendant 10 min (détection UV : 260 nm pour
16 et 415 nm pour 7 et 14.
Concernant la plateforme trimodale 14, de nombreuses difficultés ont été rencontrées

pour sa purification. En effet, une bonne séparation des pics a été observé en HPLC
analytique en utilisant le même gradient que pour le composé 7, mais lors de la
transposition de la méthode en HPLC préparative, le produit était élué à 100% d’ACN avec
une mauvaise résolution (Tableau 11, Essai 1). Pour remédier à ce problème, il a été choisi
de modifier le gradient en commençant à une plus forte quantité d’ACN (50%) suivi d’un
palier isocratique plus ou moins long (Tableau 11, Essais 2–3 et Figure 46). Les mêmes
observations que pour l’essai 1 ont été effectuées avec l’obtention d’une mauvaise
résolution. Nous avons décidé d’augmenter l’acidité de la phase mobile pour réduire la
198
concept
rétention du produit sur la colonne en utilisant les mêmes conditions d’élution que pour
l’essai 1 (Tableau 11, Essai 4). Ceci n’a pas amélioré le profil du chromatogramme HPLC.
Tableau 11 : Essais de purification HPLC du composé 14 sur colonne C18.
Essai Colonne Solvant A Solvant B Gradient Débit

(mL.min–1)
1 21,2*150 mm 5 µm H2O + 0,1%TFA ACN + 0,1%TFA 10%B →

15 min
100%B 12
10 min
→ 100%B
2 21,2*150 mm 5µm H2O + 0,1%TFA ACN + 0,1%TFA 50%B →

10 min
100%B 12
10 min
→ 100%B

10 min
100%B 12
20 min
→ 100%B

15 min
100%B 12
15 min
→ 100%B
5 10*250 mm 5µm H2O + 0,1%TFA ACN + 0,1%TFA 50%B →

10 min
100%B 4
20 min
→ 100%B
6 10*250 mm 5µm H2O + 0,1%TFA ACN + 0,1%TFA 80%B →

5 min
100%B 4
25 min
→ 100%B

15 min
100%B 15
10 min
→ 100%B

15 min
100%B 15
10 min
→ 100%B
Nous avons alors choisi de tester une colonne semi–préparative possédant un diamètre
plus faible (10 mm). Deux essais de gradient ont été effectués, un premier identique à celui
utilisé pour l’essai 3 et un second plus rapide et démarrant à un plus fort pourcentage
d’ACN (80%) (Tableau 11, Essais 5–6 et Figure 46). En plus d’être élué sur un temps très
long, le pic d’intérêt était co–élué avec plusieurs autres pics dans ces deux conditions. Cette
colonne n’a, par conséquent, pas été retenue.
199
concept
Figure 46 : Chromatogramme HPLC de plusieurs essais de purification du composé 14. A, 7 et B, 14 (Détection UV :

415 nm).
Les derniers essais effectués ont été réalisés en utilisant les mêmes conditions que
pour les essais 1 et 4 mais en utilisant cette fois–ci une HPLC permettant d’utiliser un
débit plus élevé (15 mL.min–1) (Tableau 11, Essais 7–8 et Figure 46). En utilisant une
phase mobile acidifié à 0,1% de TFA, un pic beaucoup moins large a été observé mais une
mauvaise reproductibilité entre les injections a été mise en évidence. En revanche,
l’utilisation d’une phase mobile acidifié à 0,4% de TFA a permis d’obtenir un profil
exploitable, permettant à la fois une bonne séparation des composés et une bonne
résolution du pic. De plus, une très bonne reproductibilité a été observée (Tableau 11,
Essai 8). Ce sont, par conséquent, ces dernières conditions qui ont été retenues pour la
purification du composé 14 (Figure 45).
Le Tableau 12 récapitule les rendements et puretés obtenus après purification des

composés dans les conditions décrites précédemment.
Tableau 12 : Récapitulatif des rendements et puretés obtenus pour les différents composés synthétisés.
Composé Rendement Pureté HPLC

7 25% >99%
14 19% 98%
16 27% 95%
200
concept
V. Détermination des propriétés photophysiques

Les propriétés physiques des composés synthétisés contenant la Pyro–a ainsi que le
PS seul ont été évaluées dans plusieurs solvants (diméthylsulfoxide (DMSO), EtOH,
MeOH et eau deutérée (D2O)).
V.1. Absorption
Les spectres d’absorption UV–visible des différents composés ont été déterminés dans
le DMSO, tous les composés présentant la meilleure solubilité.
Le spectre d’absorption UV–visible de l’Alc1’ seule dans le DMSO a été enregistré et a

montré un pic entre 200 et 300 nm avec un maximum à 260 nm.
Les spectres d’absorption de la Pyro–a ainsi que celles des composés 7 et 14 ont été
enregistrés dans différents solvants (Figure 47). Dans l’EtOH et le MeOH, une bande de
Soret légèrement plus large par rapport au spectre dans le DMSO a été observée. En
revanche, dans le D2O un élargissement très important des pics est observé ainsi qu’un
déplacement bathochrome de la bande de Soret et de la bande Q I. Pour la Pyro–a et le
composé 7, un déplacement hypsochrome a été observé pour la bande de Soret de 415 à
381 nm alors que pour le composé 14, au contraire, un déplacement bathochrome de 415 à
438 nm a été observé. Ces changements peuvent s’expliquer par une agrégation des
composés dans le D2O.
Les plus faibles coefficients d’extinction molaire ε observés pour tous les composés dans
le D2O confirment une faible solubilité. Les ε sont similaires pour chaque composé dans
l’EtOH et le DMSO et le MeOH fournit les meilleurs résultats, ce qui peut s’expliquer par
une meilleure solubilité des composés dans ce solvant.
201
concept
Figure 47 : Spectres d'absorption UV–visible normalisées et coefficient d'extinction molaire ε des composés Pyro–a, 7
et 14 dans différents solvants.
Dans tous les solvants, une diminution significative des ε a été mis en évidence lorsque
la Pyro–a est couplée au peptide et à l’alcoxyamine.
202
concept
V.2. Fluorescence et production d’ 1O2
Les spectres d’émission de fluorescence ont été enregistrés après une excitation à 410
nm et ont permis de déterminer les rendements quantiques de fluorescence, Φ f. Les
spectres d’émission de l’1O2 ont été effectués dans les mêmes conditions afin de déterminer
le rendement quantique d’1O2, ΦΔ (Tableau 13).
Tableau 13 : Rendements quantiques de fluorescence (Φf) et d'1O2 (ΦΔ) mesurés après excitation à 410 nm et durée de
vie de fluorescence (τf), après excitation à 407 nm et d' 1O2 (τΔ) ,après excitation à 415 nm des composés Pyro–a, 7 et 14
dans différents solvants.
Solvant Composé Φf (%) ΦΔ (%) τf (ns) τΔ (µs) τΔ litt,

(µs)
DMSO Pyro–a 47 28 7,2 7,8 5,5170
7 43 9 7,5 8,1
14 40 11 6,8 8,4
EtOH Pyro–a 38 61 6,6 15,3 12171
7 38 54 6,8 13,9
14 30 44 6,6 13,9
MeOH Pyro–a 34 54 6,4 8,0 7171
7 28 50 6,5 8,3
14 32 54 6,6 9,0
D2 O Pyro–a <1 – 6,0 – 20171
7 <1 – 5,9 –
14 <1 – 4,9 –
Sous excitation lumineuse, la Pyro–a émet un pic de fluorescence très intense vers 670
nm et un second pic beaucoup moins intense vers 720 nm. Pour tous les composés et dans
tous les solvants, à l’exception du D 2O, des signaux similaires de fluorescence ont été
observés. Pour le D2O, un signal de fluorescence extrêmement faible a été observé
confirmant le manque de solubilité des composés. Globalement, de meilleurs Φf ont été
observés dans le DMSO sans doute dus à une bonne solubilité dans ce solvant. Dans le
MeOH et l’EtOH, des résultats similaires ont pu être observés. Dans l’ensemble des
solvants, une faible diminution des Φf en présence du peptide et de l’alcoxyamine a été
observée.
Concernant le ΦΔ, de biens meilleurs résultats ont été constatés dans l’EtOH et le
MeOH, ce qui est en adéquation avec les résultats inverses des Φf. Cependant, des ΦΔ
similaires pour les trois composés ont été observés uniquement dans le MeOH, indiquant
peu ou pas d’influence du peptide et de l’alcoxyamine. Dans le DMSO et l’EtOH, une
203
concept
diminution des ΦΔ a été observée en présence de l’alcoxyamine et du peptide. A noter

également qu’aucun signal de production d’1O2 n’a pu être observé dans le D2O, en
adéquation avec la faible solubilité des composés.
Les solutions ont ensuite été illuminées à 407 nm afin de déterminer les durées de vie
de fluorescence (τf) et à 415 nm pour évaluer les durées de vie d’1O2 (τΔ). Peu de différences
entre les trois composés ont pu être mises en évidence.
La détermination des propriétés photophysiques de la Pyro–a au sein des différents

composés a pu montrer que le peptide et l’alcoxyamine avait une influence minime sur
celles–ci.
V.3. Etudes de photoblanchiment
Sous illumination, le PS peut subir une photo–dégradation ou un photo–

réarrangement, appelé photoblanchiment. Ceci peut se traduire par une perte
d’absorption et de fluorescence. La stabilité de la Pyro–a et des composés 7 et 14 sous
illumination à 668 nm (10 mW.cm–2) dans le MeOH a été étudiée. Le Φf a été calculé au
cours du temps et une stabilité a été observée pour l’ensemble des composés (Figure 48).
De même, nous avons pu observer que ΦΔ était constant.
Figure 48 : Evolution du Φf au cours du temps pour les composés Pyro–a, 7 et 14 illuminés à 668 nm (10 mW.cm–2)
dans le MeOH.
204
concept
VI. Homolyse de l’Alcoxyamine

L’alcoxyamine choisie pour cette étude est constituée d’un motif benzophénone–SG1’
et est capable, sous activation lumineuse, de s’homolyser pour générer d’une part un
nitroxyde (SG1’) et d’autre part un radical alkyle cytotoxique (Figure 49).
Figure 49 : Homolyse de l'alcoxyamine benzophénone–SG1’ sous excitation lumineuse.
Dans cette partie, nous décrirons le suivi de cette homolyse en utilisant différentes
techniques d’excitation et d’analyse.
VI.1. Suivi par HPLC
La photolabilité des composés a été, dans un premier temps, suivie par HPLC. En effet,
l’Alc1’ présentant une absorption dans l’UV, nous avons pu suivre la disparition du pic
correspondant au cours de l’excitation. Le choix du solvant utilisé s’est porté sur le DMSO
puisque les composés présentaient une bonne solubilité. De plus, ce dernier présente
l’avantage d’être beaucoup moins volatile que l’EtOH ou le MeOH et permet donc de garder
une concentration stable.
La réaction d’homolyse étant une réaction réversible, nous avons utilisé un quencher
(TEMPO) pour réagir avec le radical alkyle généré et ainsi pouvoir suivre la formation de
l’adduit formé. En effet, l’absorption de l’Alc1’ dépendant essentiellement de la partie
alkyle, c’est principalement l’apparition d’un pic correspondant à cet adduit qu’il est
possible de détecter en HPLC.
Deux stratégies d’excitation ont été envisagées pour homolyser l’Alc1’ :
- Les rayons X ;
- La lumière UV.
VI.1.1. Illumination par rayons X
Dans un premier, nous avons envisagé l’utilisation des rayons X comme source
d’illumination pour homolyser l’Alc1’. Sous excitation lumineuse, le chromophore porté par
205
concept
l’Alc1’ transfère son énergie à la liaison C–ON et engendre ainsi l’homolyse de cette liaison.
L’idée associée à l’utilisation des rayons X était la possibilité d’un transfert d’énergie, non
pas seulement à liaison C–ON mais également au PS et ainsi la génération simultanée
d’1O2 et de radicaux alkyles.
Les premiers tests ont été effectués sur l’Alc1’ seule, avec le TEMPO comme quencher
des radicaux alkyles produits. Les solutions ont été irradiées par un irradiateur avec une
puissance de 160 keV à différentes doses (0, 2, 5, 10 et 20 Gy). Des prélèvements de chaque
solution ont été effectués et dilués dans l’ACN avant d’être injectés en HPLC (Figure 50).
Aucune différence au niveau de l’intensité des pics n’a pu être observée en HPLC et par
conséquent aucune homolyse n’a pu être détectée.
Figure 50 : Chromatogrammes HPLC de l’Alc1’ sous excitation par rayons X à des doses de 0 et 20 Gy. Gradient 10 à
100% ACN dans l’eau + 0,1% TFA en 15 min suivi d’un isocratique à 100% ACN + 0,1% TFA (détection UV : 260 nm).
Des seconds tests ont été réalisés en augmentant la puissance de l’irradiateur à 320 keV
et en utilisant des doses de 0, 5, 10, 20 et 30 Gy. Aucune homolyse n’a également été
observée. Il a alors été conclu qu’il n’était pas possible d’homolyser notre alcoxyamine par
les rayons X dans ces conditions d’excitation.
VI.1.2. Illumination par la lumière UV
La première étape a été de confirmer la photolabilité de l’Alc1’ sous illumination UV

(254 nm et 365 nm, 125 mW.cm–2). Après illumination de la solution d’Alc1’ dans le DMSO
pendant 10 min, une disparition presque totale du pic correspondant à l’Alc1’ a été
observée. Cette disparition a été croissante au cours du temps ainsi que l’apparition d’un
produit d’homolyse à 11,7 min confirmant l’homolyse du composé (Figure 51).
206
concept
Figure 51 : Chromatogrammes HPLC de Alc1’ avant et après 10 min d'illumination UV. Gradient de 10 à 100% ACN dans
l’eau + 0,1% TFA en 15 min suivi d’un isocratique à 100% ACN + 0,1% TFA pendant 10 min (détection UV : 260 nm). 1,
TEMPO, 2, Alc1’ et 3, produit d'homolyse d’Alc1’.
Un bullage d’argon a permis une agitation continue et un dégazage de la solution. Dans

ces conditions, une homolyse totale de l’Alc1’ en 12 min a encore été observée.
Ces dernières conditions ont ensuite été utilisées pour déterminer la photolabilité des
composés 16 et 14. Comme pour l’alcoxyamine seule, nous avons pu observer pour chacun
des composés la disparition du pic du composé de départ et l’apparition d’un nouveau pic
à un temps de rétention de 11,7 min pour le composé 16 et de 15,9 min pour le composé 14
(Figure 52). Une homolyse plus rapide que pour l’alcoxyamine seule a été observée pour le
composé 16 avec la disparition du pic correspondant après seulement 5 min d’illumination.
Cette différence peut s’expliquer par une solubilité plus importante du composé due au
peptide. En revanche, un temps d’illumination beaucoup plus long (25 min) a été
nécessaire pour observer une disparition totale du composé 14. Cette différence peut
s’expliquer par une possible compétition entre l’alcoxyamine et le PS, ce dernier absorbant
également la lumière UV.
207
concept
Figure 52 : Chromatogrammes HPLC des composés (A) 16 avant et après 5 min d'illumination UV et (B) 14 avant et
après 25 min d'illumination UV. Gradient de 10 à 100% ACN dans l’eau + 0,1% TFA en 15 min suivi d’un isocratique à
100% ACN + 0,1% TFA pendant 10 min (Détection UV : 260 nm pour 16 et 415 nm pour le composé 14. 1, TEMPO ; 2,
composé 16 ; 3, produit d'homolyse du composé 16 ; 4, composé 14 et 5, produit d'homolyse du composé 14.
Bien qu’un temps plus long soit observé pour l’homolyse totale du composé 14, ceci ne
semble pas problématique pour de potentielles applications en PDT puisque des radicaux
sont formés dès les premières minutes d’illumination et qu’il n’est pas forcément
nécessaire d’avoir une homolyse totale pour générer un effet cytotoxique.
Pour quantifier les radicaux formés par HPLC, nous avons recherché un étalon interne
qui serait introduit dans la solution de départ avant illumination. L’étalon interne devait
réunir plusieurs caractéristiques, (i) un temps de rétention différents des composés
étudiés, (ii) une stabilité sous illumination UV et (iii) une absorption aux longueurs
d’ondes de détection des composés en HPLC. L’étude de plusieurs étalons internes
classiques tels que le toluène, l’acétone ou le nitrobenzène et également les Hydrocarbures
Aromatiques Polycycliques (HAP) a été effectuée et aucune des références étudiées n’a
rempli tous les critères. Il a alors été choisi d’utiliser une autre méthode pour quantifier
les radicaux formés lors de la réaction d’homolyse.
208
concept
VI.2. Suivi par spectroscopie par Résonance Paramagnétique

électronique (RPE)
La Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) est une technique de spectroscopie

utilisée pour la détection d’espèces chimiques possédant un ou plusieurs électrons non
appariés (espèces paramagnétiques).
VI.2.1. Principe
C’est une technique proche de la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) puisque ces
deux techniques reposent sur l’interaction d’un champ électromagnétique avec les
moments magnétiques de spin. La différence entre les deux techniques est que la RMN
concerne les noyaux (spins nucléaires) alors que la RPE concerne les centres
paramagnétiques (spins électroniques) tels que les atomes et molécules possédant des
électrons non appariés. La RPE présente l’avantage d’être plus sensible que la RMN et
permet d’analyser des composés à des concentrations beaucoup plus faibles, de l’ordre du
micromolaire.172
VI.2.1.1. Moment magnétique de l’électron
Chaque électron non apparié est caractérisé par sa masse et sa charge élémentaire
mais également par son moment angulaire intrinsèque également appelé spin de l’électron
ou moment cinétique.172 Le mouvement d’un électron est caractérisé par son spin auquel
est associé un moment magnétique ⃗⃗⃗
µ𝑠 . Le nombre quantique de spin possède une valeur S
= ½ associé à des composantes magnétiques ms = ± ½. Le moment magnétique ⃗⃗⃗
µ𝑠 est donné
par l’équation (11) :
⃗⃗⃗s = −gβe S⃗
µ (11)
Où g est un facteur sans dimension caractérisant le centre paramagnétique appelé facteur

de Landé ou facteur g et dépendant de la structure électronique du composé étudié et βe le
magnéton de Bohr (βe = 9,27401.10–24 A.m2).
VI.2.1.2. L’effet Zeeman
La RPE repose sur l’effet Zeeman, qui consiste en la levée de dégénérescence de

niveaux d’énergie électronique en présence d’un champ magnétique externe (Figure 53).
En effet, en l’absence de champ magnétique, les niveaux électroniques m s = ± ½ sont
dégénérés. Lors de l’action d’un champ magnétique externe B0 parallèle à l’axe z, un
209
concept
alignement des électrons selon deux directions dans l’espace (parallèle ou antiparallèle au
champ B0) se produit. Deux états énergétiques peuvent alors être identifiés et
l’Hamiltonien Zeeman est utilisé pour caractériser la levée de dégénérescence donné par
l’équation (12) :
⃗⃗ Zeeman = −μ
H ⃗ 0 = gβe S⃗. B
⃗ .B ⃗ 0 = gβe Sz (12)
Où Sz correspond à la projection de l’opérateur de spin électronique sur l’axe z.
Figure 53 : Levée de dégénérescence des niveaux d'énergie de spin électronique S = ½ sous l’action d’un champ
magnétique B et illustration de la condition de résonance. Adaptée de Sahli.173
210
concept
L’induction d’une transition de spin entre deux niveaux énergétiques, ms = – ½ vers

un niveau ms = + ½ peut se produire par l’absorption d’une radiation électromagnétique
caractérisée par une énergie ΔE ainsi qu’une fréquence ν perpendiculaire au champ
magnétique B0. Il est nécessaire que l’énergie hν fournie soit égale à l’écart entre les deux
niveaux énergétiques pour que les photons soient absorbés, c’est ce qui constitue la
condition de résonance qui est donnée par l’équation (13) :
∆E = hν = E+ − E− = + 1⁄2 gβe B0 − (− 1⁄2 gβe B0 ) = gβe B0 (13)
Avec h la constante de Planck (h = 6,62607015.10–34 J.s).
Le facteur g peut alors être exprimé selon l’équation (14) :
h ν ν (14)
g= = ~0,714484
βe B0 B0
Où la fréquence ν de l’onde électromagnétique est exprimée en MHz et le champ

magnétique B0 en Gauss (G).
En RPE, une modulation d’un champ magnétique B 0 est effectuée pour des raisons liées à
la sensibilité de détection conduisant à l’observation d’un signal RPE correspondant à la
dérivé première du signal d’absorption.172
VI.2.2. RPE des radicaux nitroxydes en régime isotrope
Les radicaux nitroxydes sont composés d’un groupement fonctionnel où un atome

d’oxygène est lié à un atome d’azote (Figure 54). Ils présentent une très forte stabilité et
sont par conséquent considérés comme des radicaux persistants. Leur stabilité peut
s’expliquer par la délocalisation de l’électron entre les atomes d’azote et d’oxygène qui se
fait avec des proportions similaires. La présence de groupements encombrants en α de
l’atome d’azote leur confère une grande stabilité en raison de l’encombrement stérique
généré.174
Figure 54 : Formes mésomères du nitroxyde.
211
concept
VI.2.2.1. Les interactions hyperfines
Lorsqu’un électron non apparié présente dans son environnement proche des noyaux
caractérisés par un spin nucléaire I ≠ 0, une perturbation du champ magnétique perçu par
le spin de l’électron se produit. Cette interaction est qualifiée d’interaction hyperfine et
dans le cas des radicaux nitroxydes, se traduit par l’interaction de l’électron non apparié
avec un noyau 14N possédant un spin nucléaire I = 1. L’interaction hyperfine est la
résultante de l’interaction entre les moments de spin magnétique S et de spin nucléaire I
non nuls et est donnée par l’équation (15) :
HHyperfin = S⃗A
̃I (15)
Où A
̃ est le tenseur hyperfin ou constante de couplage hyperfine et I l’opérateur de spin
nucléaire.
L’interaction hyperfine dépend de plusieurs paramètres, dont la densité de spin au niveau

du noyau et d’autre part le rapport gyromagnétique de l’électron. Plus ces derniers sont
importants, plus la valeur du tenseur A
̃ est grande.174
L’interaction d’un électron non apparié avec un noyau 14N, possédant une constante
AN d’environ 1,5 mT, conduit à l’observation d’un spectre possédant 2I + 1 = 3 raies. Placés
dans un champ magnétique, les niveaux d’énergie Ems de ce système peuvent être décrits
par l’équation suivante (16) :
Ems = gB0 Ms + AN Ms MI(N) (16)
Les niveaux d’énergie et le spectre RPE résultant dans le cas d’un nitroxyde sont donnés
dans la Figure 55.
212
concept
Figure 55 : Niveaux d'énergie pour un nitroxyde en régime isotrope ainsi que le spectre RPE résultant en fonction du
champ magnétique. Les flèches représentent les transitions autorisées en RPE. Adaptée de Le Breton.174
L’électron non apparié sur le nitroxyde peut être délocalisé le long de la liaison NO
conduisant à deux formes mésomères (Figure 54). Celle où l’électron non apparié est porté
par l’oxygène est une forme neutre tandis qu’une séparation de charge apparaît lorsqu’il
est porté par l’atome d’azote. Cette dernière forme est favorisée lorsque la polarité du
milieu augmente conduisant à une augmentation de la densité de spin sur le noyau de
l’atome d’azote entraînant une augmentation de la constante de couplage hyperfine. Cette
constante hyperfine peut donc subir des variations entre 1,4 et 1,7 mT.
Dans le cas de nos alcoxyamines, le nitroxyde généré SG1 est de type β–phosphorylée
et une interaction supplémentaire entre l’électron non apparié et le noyau du 31P
possédant un spin nucléaire I = ½ a lieu. Celle–ci conduit à l’observation en régime isotrope

d’un spectre à (2I(N) + 1)(2I(P) + 1) = 6 raies. L’interaction entre l’électron non apparié et
le noyau de 31P est caractérisé par une AP d’environ 4,0 mT. La même variation en fonction
de la polarité du milieu est observée pour la constante hyperfine A N entre 1,3 et 1,7 mT.
213
concept
En revanche, l’augmentation de la polarité du solvant conduit à une diminution de la

constante d’interaction AP entre l’électron non apparié et le noyau de 31P.174
VI.2.3. Conditions d’illumination
Les analyses RPE ont été effectuées en utilisant des capillaires en verre (25 L,
Hirschmann). Une chambre d’illumination UV spécialement conçue pour l’illumination
homogène de tubes et capillaires RPE a été utilisée (Figure 56). Les analyses RPE ainsi
que les illuminations dans ces nouvelles conditions ont été effectuées à l’institut de Chimie
de Strasbourg en collaboration avec les Dr Nolwenn Le Breton et Dr Bertrand Vileno.
Figure 56 : Dispositif d'illumination UV Adaptée à la géométrie cylindrique des tubes et capillaires.
La source de lumière UV est émise par des néons à une puissance d’environ
4,5 mW.cm–2.
VI.2.4. Homolyse des composés
L’utilisation des capillaires de 25 µL a conduit à choisir un solvant moins visqueux que

le DMSO utilisé dans le § VI.1.2. Le MeOH a été sélectionné compte tenu des bonnes
propriétés photophysiques observés dans ce solvant et le problème de volatilité du solvant
a pu être résolu en scellant les tubes. Les homolyses ont été effectuées à de faibles
concentrations de l’ordre de 10 –4 M permettant de s’affranchir de l’utilisation du TEMPO
(§ VI.1). Il a été montré que l’oxygène du milieu pouvait être utilisé comme scavenger pour
piéger les radicaux formés et ainsi de suivre la formation du nitroxyde persistant.175
214
concept
Figure 57 : Homolyse de l’Alc1 sous excitation lumineuse.
Pour l’étude de l’alcoxyamine seule, la forme non fonctionnalisée par une fonction acide
carboxylique a été utilisée (Figure 57), le radical SG1’ généré lors de l’illumination étant
beaucoup moins stable que le radical SG1 seul. La première étape de ces études d’homolyse
par suivi RPE à consister à vérifier la stabilité du radical SG1 seul au cours de
l’illumination UV. L’illumination d’une solution de SG1 à 300 µM pendant 1 heure a
conduit à une diminution du signal inférieure à 10% indiquant une bonne stabilité du
radical.
VI.2.4.1. Influence de la concentration
Nous avons évalué l'influence de la concentration de l’alcoxyamine seule (300 µM dans

le MeOH) sur la génération de radicaux au cours de l’illumination UV. La signature RPE
de Alc1 consistant en 6 raies d’amplitudes égales, comme décrit dans le § VI.2.2.1, a pu
être détectée. Dès les premières secondes d’illumination, le signal RPE associé à SG1 a été
observé pour atteindre une intensité RPE maximale à 75 secondes. Après cela, une forte
baisse de l'intensité a été observée (Figure 58A). Ce changement notable au niveau de
l'évolution de l'intensité RPE peut être défini comme un turnover entre les mécanismes de
génération et de réduction des radicaux. L’Alc1 a été illuminée à différentes concentrations
et une dépendance linéaire du taux initial de production du radical SG1 avec la
concentration d'Alc1 a été mise en évidence (Figure 58D). En effet, une cinétique plus
rapide a été observée pour la plus forte concentration en Alc1 (300 µM). Une corrélation
entre la diminution de la concentration en Alc1 et l’augmentation du temps d’illumination
a également été mis en évidence. Celle–ci a été accompagnée d’un déplacement du
turnover quelle que soit la concentration en alcoxyamine.
215
concept
Figure 58 : Intensité RPE du radical généré au cours de l’illumination à température ambiante pour les composés (A)
Alc1, (B) 16 et (C) 14 à différentes concentrations dans le MeOH. Encadré : Spectres RPE, normalisés par leur intensité
de pic à pic, du radical SG1 dans la solution à 75 µM au début du plateau (bleu) et à la fin du plateau (rouge). (▲) 300
µM, (●) 150 µM et (▼) 75 µM. (D) Taux de production initial (k) du radical et temps d'exposition à la lumière UV jusqu'à
atteindre le turnover (tturnover) pour les composés Alc1, 16 et 14 à différentes concentrations dans le MeOH.
Des études, dans les mêmes conditions, ont été réalisées pour les composés 16 et 14.
Bien que présentant des tendances similaires avec l’alcoxyamine seule, les résultats sont
différents. En effet, les 6 raies présentent des amplitudes différentes témoignant d’un
régime de mobilité intermédiaire dû à des molécules plus grosses, qui tournent moins vite ;
il n’est plus possible de moyenner les paramètres RPE. De plus, la dépendance linéaire
de la production de radicaux en fonction de la concentration n’a pas été observée (Figure
58B et C).
Le temps d'illumination nécessaire pour atteindre le turnover est très différent. En

effet, bien que des cinétiques soient similaires, la cinétique est significativement plus
longue pour le composé 14. Compte tenu de l'absorption de la lumière UV par le PS, ce
dernier peut concurrencer l'alcoxyamine, partageant ainsi la quantité de photons reçus et
augmentant le temps pour atteindre la quantité maximale de génération du nitroxyde.
216
concept
Il est intéressant de noter que les spectres RPE de SG1 s'affinent au cours du temps
lors de l'illumination (Figure 58A Encadré) indiquant une diminution de la concentration
en oxygène dans le solvant organique.176 En revanche, cet effet n’a pas été observé pour
les deux autres composés (Figure 58B et C Encadré).
VI.2.4.2. Influence de l’oxygénation
Afin de déterminer l'influence de l’oxygène sur la formation de radicaux, les composés

ont été illuminés après dégazage de la solution de l’Alc1 au moyen d'un barbotage doux à
l'argon (environ 5 mL.min–1). Dans de telles conditions d'hypoxie, une influence capitale
de l’oxygénation a été observée pour l’alcoxyamine seule, puisque presqu’aucun signal
correspondant au radical SG1 n’a pu été détecté (Figure 59A). Cette approche a été
également répétée sur les composés 16 et 14, et de façon étonnante des cinétiques
superposables ont été obtenues quelles que soient les conditions d'oxygénation (Figure 59B
et C).
Cette absence de différence entre ces derniers résultats peut être due à la présence du
peptide et du PS jouant ici le rôle de piégeurs de radicaux alkyles. Dans le cas de
l’alcoxyamine seule, une grande quantité de nitroxyde est observée car les radicaux alkyles
sont piégés par l’oxygène supprimant la rétro–réaction. En revanche, en l'absence
d’oxygène, les radicaux alkyles ne sont pas piégés et la rétro–réaction se produit
empêchant ainsi l’augmentation de la quantité de nitroxyde générée.
217
concept
Figure 59 : Intensité RPE du radical généré au cours de l’illumination pour les composés (A) Alc1, (B) 16 et (C) 14 à 300
µM dans du MeOH avec (♦) ou sans (▲) oxygène.
VI.2.4.3. Influence de l’intensité lumineuse
Nous avons étudié l’influence de la puissance d’illumination sur la génération de

radicaux nitroxydes (Figure 60).
218
concept
Figure 60 : Intensité RPE du radical généré au cours de l’illumination pour les composés (A) Alc1, (B) 16 et (C) 14 à 300
µM dans du MeOH avec (♦) intensité lumineuse de référence ou (▲) intensité lumineuse diminué d’un facteur 2.
Pour les trois composés, une diminution d’un facteur 2 de l’intensité lumineuse conduit
au doublement du temps d’illumination nécessaire pour atteindre le turnover a une
intensité RPE similaire. Bien que ralentissant la cinétique, la réduction de l’intensité
lumineuse ne modifie que très peu la quantité maximale de nitroxyde générée.
VI.2.4.4. Utilisation d’un piégeur radicalaire
L’observation de la dépendance de la génération de SG1 à l’oxygène nous a conduit à

l’hypothèse selon laquelle la réduction du radical SG1 par des intermédiaires radicalaires
et la consommation potentielle d’oxygène favorisaient la formation photoinduite
d'intermédiaires radicalaires. Pour valider cette dernière, une étude de piégeage de spin a
été effectuée en utilisant du 5–(diéthoxyphosphoryl)–5–méthyl–1–pyrroline–N–oxyde
(DEPMPO) afin de piéger des espèces réactives instables dont la durée de vie est trop
219
concept
courte pour être observée dans nos conditions expérimentales. En effet, la réaction entre
le DEPMPO et le radical ciblé R● a conduit à la formation d'un adduit de spin plus stable
qui peut donc être détecté par spectroscopie RPE (Figure 61).177
Figure 61 : Schéma de principe du piégeage de spin entre le DEPMPO et un radical R ●.
Comme pour le radical SG1, les adduits de spin de DEPMPO présentent le couplage
entre l'électron non apparié et les noyaux de 31P, 14N et 1H (I = ½). Par conséquent, les
spectres RPE de DEPMPO peuvent avoir jusqu'à 12 raies (Figure 62A). Il convient de noter
que les constantes de couplage hyperfines liées à l'interaction hyperfine au sein des
adduits sont caractéristiques de la nature du radical piégé permettant potentiellement
leur identification (par exemple, un radical centré sur le carbone ou l'oxygène).178
En présence de DEPMPO, une meilleure stabilité du radical SG1 généré au cours du

temps d'illumination a pu être observée que ce soit dans les conditions normales
d’oxygénation ou dégazées. Un turnover était toujours présent mais à un temps
d'illumination significativement plus long dans ces conditions et la décroissance du signal
correspondant a été significativement ralentie (Figure 62B et C). Ceci s’explique par le fait
que le piégeur de spin joue son rôle en piégeant les radicaux responsables de la disparition
de SG1. Trois espèces radicales distinctes ont été détectées. Sur la base des interactions
hyperfines obtenues, les deux premiers radicaux (ici dénommés rad1 et rad2) ont été
caractérisés comme des radicaux oxygénés tandis que le dernier (dénommé rad3) a été
identifié comme un radical centré sur le carbone.179
Pour le composé 16 (300 µM dans le MeOH), un plateau a été atteint dans les deux
conditions d’oxygénation et aucun turnover n’a été observé, indiquant la grande stabilité
du nitroxyde photo–généré (SG1–peptide). Un plateau a été atteint après environ 500
secondes d’illumination et est resté stable après 1 heure d'illumination et ce, dans les deux
conditions d'oxygénation (Figure 62B et C). Trois adduits de spin distincts ont également
été observés. Cette grande stabilité du nitroxyde généré pourrait s'expliquer par un effet
protecteur du peptide.
220
concept
Figure 62 : (A) Gauche : Spectres RPE de simulation (rouge) et expérimental (noir) d'Alc1 en présence de 10 mM de
DEPMPO après 960 s d'irradiation. A droite : simulation des spectres RPE de SG1, Rad1, Rad2 et Rad3. (B) et (C)
Evolution de la génération de radicaux au cours de l’illumination des composés Alc1, 16 et 14 dans le temps en
solution dans du MeOH à 300 µM en présence de 10 mM de DEPMPO dans la solution oxygénée (B) et la solution
dégazée (C). Radicaux formés par l'illumination des composés : (♦) Alc1, (●) 16 et (▲) 14.
En revanche, pour le composé 14 (Figure 62B et C), la même tendance que pour
l’alcoxyamine seule a été observée avec un ralentissement de la décroissance du signal du
nitroxyde dans les conditions normales d'oxygénation. La génération des mêmes radicaux
que pour le composé 16 a également été observée. Cette différence entre les cinétiques des
composés 16 et 14 pourrait s'expliquer par le fait que l'introduction du PS, un groupe
stériquement encombrant, a modifié la structure 3D du peptide et a modifié ainsi l'effet
protecteur observé en son absence.
La forte réactivité avec le milieu environnant du nitroxyde a été mis en évidence par
la réduction de son signal. Bien qu’une compétition entre l’alcoxyamine et le PS ait été
observée, la génération de radicaux nitroxydes n’a pas été bloquée. Ceci est très
intéressant pour les futures applications PDT.
VII. Tests d’affinité

L'affinité des composés 7, 16 et 14 pour le récepteur NRP–1 a été évaluée par un test
de compétition avec le ligand compétitif VEGF 165 biotinylé (Tableau 14). Les composés 7
et 14 présentent une meilleure affinité pour NRP–1 que le peptide seul ou le composé 16,
221
concept
probablement en raison des interactions hydrophobes renforcées par la Pyro–a et des

interactions stériques stabilisant la conformation 3D du peptide. L'affinité du composé 14
pour NRP–1 (CI50 de 0,46± 1 µM) était encourageante pour envisager une évaluation de
cette nouvelle approche thérapeutique multimodale sur des modèles in vivo de tumeurs
exprimant le NRP–1.
Tableau 14 : Affinité envers NRP–1 des composés estimées à partir des courbes d'affinité.
Composés CI50 (µM)

KDKPPR 11,5 ± 1
16 9,0 ± 1
7 0,12 ± 1
14 0,46 ± 1
VIII. Article
La preuve de concept décrite dans ce chapitre a fait l’objet d’une publication intitulée
« The design of a targeting and Oxygen–independent platform to improve Photodynamic
Therapy: A proof of concept » acceptée dans le journal ACS Applied Biomaterials en
Novembre 2020.
222
concept
The design of a targeting and Oxygen–independent platform

to improve Photodynamic Therapy: A proof of concept
Ludivine Larue,†,‡ Tataye MOUSSOUNDA MOUSSOUNDA KOUMBA, Nolwenn Le Breton,°,∥
Bertrand Vileno,°,∥ Philippe Arnoux,† Valérie Jouan–Hureaux,⊥ Cédric Boura,⊥ Gerard
Audran,,* Raphael Bikanga,§ Sylvain R. A. Marque, Samir Acherar,‡ and Céline Frochot,†,*
† Université de Lorraine, CNRS, LRGP, F–54000 Nancy, France ; ludivine.larue@univ–lorraine.fr,

philippe.arnoux@univ–lorraine.fr, celine.frochot@univ–lorraine.fr
‡ Université de Lorraine, CNRS, LCPM, F–54000 Nancy, France ; samir.acherar@univ–lorraine.fr
 Aix Marseille Univ, CNRS, ICR, UMR 7273, case 551, Avenue Escadrille Normandie–Niemen,
13397 Marseille Cedex 20, France; g.audran@univ–amu.fr, sylvain.marque@univ–amu.fr,
[email protected]
° Institut de Chimie, UMR 7177, CNRS, Université de Strasbourg, 4 rue Blaise Pascal, F–67000
Strasbourg, France; [email protected], [email protected]
∥ French EPR Federation of Research, REseau NAtional de Rpe interDisciplinaire, RENARD,
Fédération IR–RPE CNRS 3443, France
⊥ Université de Lorraine, CNRS, CRAN, F–54000 Nancy, France ; valerie.jouan–hureaux@univ–
lorraine.fr, cedric.boura@univ–lorraine.fr
§ Laboratoire de Substances Naturelles et de Synthèse Organométalliques, Université des Sciences
et Techniques de Masuku, B.P. 943, Franceville, Gabon ; [email protected]
* Correspondence: celine.frochot@univ–lorraine.fr; Tel.: +33–3–72–74–37–80; g.audran@univ–amu.fr;
Tel.: +33–4–91–28–88–62
KEYWORDS: photodynamic therapy, hypoxia, targeting, neuropilin–1, peptide, alkoxyamine,
hemolysis, spin trapping
ABSTRACT:
Photodynamic therapy (PDT) is a promising technique to treat different kinds of disease especially
cancer. PDT requires three elements: molecular oxygen, a photo–activatable molecule called the
photosensitizer (PS) and appropriate light. Under illumination, the PSs generate, in the presence
of oxygen, the formation of reactive oxygen species including singlet oxygen, toxic, which then
destroys the surrounding tissues. Even if PDT is used with success to treat actinic keratosis or
prostate cancer for example, PDT suffers from two major drawbacks: the lack of selectivity of most
of the PSs currently used clinically as well as the need for oxygen to be effective. To remedy the
lack of selectivity, targeting the tumor neovessels is a promising approach to destroy the
vascularization and cause asphyxia of the tumor. KDPPR peptide affinity for the NRP–1 receptor
overexpressed on endothelial cells has already been proven. To compensate for the lack of oxygen,
we focused on photoactivatable alkoxyamines, molecules capable of generating toxic radicals by
light activation. In this paper we describe the synthesis of a multifunctional platform combining
three units: a PS for an oxygen–dependent PDT, a peptide to target tumor neovessels and an
alkoxyamine for an oxygen–independent activity. The synthesis of the compound was successfully
carried out, the study of the photophysical properties showed that the PS retained its capacity to
form singlet oxygen, the affinity tests confirmed the affinity of the compound for NRP–1. Thanks
to the Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy, a technique of choice for radical
investigation, the radicals generated by the illumination of the alkoxyamine could be detected. The
proof of concept was thus successfully established.
223
concept
INTRODUCTION
Photodynamic therapy (PDT) is applied to treat many diseases 1 such as age–related macular
degeneration (AMD), actinic keratoses, Barrett’s esophagus, prostate cancer. PDT is a simple and
efficient approach requiring three components to be effective: the light, the molecular oxygen
(triplet oxygen 3O2) and a photosensitizer (PS). All these components are non–toxic taken apart but
taken together, they are able to destroy cells at a specific location. This modality of treatment
requires the illumination of the PS by light. Thus, the PS moves from the ground state to singlet
excited state (1PS*). After intersystem–crossing a triplet excited state (3PS*) is formed. 3PS* reacts
with surrounding molecular 3O2 to generate radical oxygen species (ROS) by two main types of
reactions: (i) type I which conducts at the generation of superoxide anion (O 2–•) and hydroxyl radical
(HO•) (ii) type II where 3PS* transfers its energy to 3O2 to produce reactive singlet oxygen (1O2).1
Although PDT presents many well–known advantages, we can report, as well as for
radiotherapy, the requirement of 3O2 to be efficient.2 Indeed, the PDT leads to the consumption of
3O2 inside the tumor and thus PDT–induced hypoxia as well as tumor pre–existing hypoxia limit
its efficiency. To fight tumor hypoxia, six strategies from literature have been reported by us in a
recent review3: (1) the use of 3O2 cargo to directly supply additional 3O2 inside the tumor
(oxyhemoglobin, perfluorocarbon…), (2) the modification of tumor microenvironment (H 2O2
decomposition, decrease of tumor 3O2 consumption…), (3) the use of combined therapies to have an
additional effect to PDT (chemo–PDT, PTT–PDT…), (4) the fractional PDT to regulate tumor 3O2
consumption, (5) the hypoxia–dependent PDT by using hypoxia–activated compounds (azobenzene)
and (6) hypoxia–independent PDT by using compounds which do not need 3O2 to be cytotoxic (PDT
type I, NO or 1O2 donor and photoactivatable compounds). The use of photoactivatable compounds
that do not require 3O2 to be effective appeared to be particularly interesting.
Alkoxyamines (Alks), with R1R2NO―R3 (R1, R2 and R3 as alkyl chains) as general structure, are
interesting molecules for therapeutic aspects. Indeed, as depicted in the Scheme 1, alks having
weak energy bond of NO―R3 could release two radical species: a stable nitroxide (R 1R2NO•) and a
transient alkyl radical (R3•). Moreover, both radicals could be coupled together to reform an alk.4
Thus, this radical reactivity of alks has been intensely investigated in NMP (Nitroxide Mediated
Polymerization).5 Several relationships were developed linking the rate constants of homolysis k d
to polarity, bulkiness, and stability parameters of both the nitroxide (R 1R2NO•) and alkyl
fragments(R3•).6 In 2014, we reported a proof of concept for a new application of alks as theranostic
agents against cell tumours.7 Thus, the release radical as therapeutic agent triggered the apoptosis
of cancer cells in vitro and the nitroxide as diagnostic probe in imaging by Overhauser MRI.
Recently, we optimized the efficiency of these reactive species to destroy malignant cells in vitro8
and reported in vivo experiments in mouse.9
Scheme 1. Reversible NO―R3 bond in alks.
Another limit of PDT is the low selectivity of the majority of the commercial PSs. The selectivity
is therefore due to the possibility to confine the PS by restricting the light illumination to a specific
region. However, this strategy is limited in some cases (spread metastases for example) needing a
broader illumination. It is necessary to develop modified PSs able to target effectively the cancer
cells by a specific accumulation into the tumor or the neovessels surrounding the tumor.10 The
224
concept
destruction of the vascular system allows the eradication of the tumor, following the O 2 deprivation
and nutrients essential to life.11 Therefore, the tumor vascular system is a promising target for
creating damage by PDT. Specific receptors of endothelial cells, such as vascular endothelial growth
factor receptors (VEGF) or neuropilin–1 co–receptor (NRP–1) can be used as molecular targets.12
Figure 1. Schematic representation of trimodal platform.

Herein, we design trimodal platform for a targeted–PDT treatment efficient in both normoxic
and hypoxic conditions. The designed platform, named Alk–K(Pyro–a)DKPPR, is based on three
unities: (1) pyropheophorbide–a (Pyro–a) as a PS, which could be illuminated in the red region (Q I
= 668 nm) to have an O2–dependent PDT, (2) KDKPPR, a NRP–1–targeted peptide has already
been proven by our team and (3) a homolyzable alk, under UV illumination, to produce alkyl
radicals in order to have an O2–independent PDT (Figure 1). For the evaluation of the relevance of
these new platforms, the synthesis of the following compounds is necessary: the bimodal platform
without Alk (i.e. K(Pyro–a)DKPPR) on the one hand and the bimodal platform without Pyro–a (i.e.
Alk–KDKPPR) on the other hand. In this study, we aim to establish the proof of concept that the
combination of these three unities is possible without any disruption of their proper properties.
RESULTS AND DISCUSSION
Synthesis
Alk (RS/SR)–6 was prepared in 4 steps in 37% overall yield. First, allylic bromination of 4–
ethylbenzophenone 1 using N–bromosuccinimide (NBS) in CCl4 afforded the bromide derivative
(R/S)–2 in 92 % yield (Scheme 2).13 Then, the alkyl radical was generated in situ by the action of
copper catalysts to the nitroxide (R/S)–314 with the bromide derivative yielded the alk 4 as a 4:1
mixture of diastereoisomers (55%).
Figure 2. X–Ray structure of alk (RS/SR)–4.15

At this stage, the two diastereoisomers in racemic form were separated using column
chromatography to afford 2.95 g of (RS/SR)–4 and 0.80 g of (RR/SS)–4. Thanks to recrystallization
of (RS/SR)–415 in diethyl ether white crystals suitable for X–ray analysis were obtained (Figure 2).
Finally, alk (RS/SR)–6 was obtained through two successive oxidations with Dess−Martin
periodinane (DMP)16 and Pinnick oxidation procedure in 73% yield. 17
225
concept
Scheme 2. Synthesis of alk (RS/SR)–6. (i) NBS, CCl4, reflux, 5h, (ii) Cu/CuBr, rt, 12h, PMDTA, benzene, (iii)
DMP, DCM, 0°C, 5h, and (iv) NaClO2/NaH2PO4, t–BuOH, rt, 1.5h.
The amino acid lysine was chosen to link the three units (peptide, Alk and PS) together in our
trimodal platform. First, the coupling reaction of the Pyro–a with the (ε)–amino group of lysine was
done separately and performed in two steps in liquid phase to afford Fmoc–K(Pyro–a) as described
previously by our team (Figure 3).18
Figure 3. Structure of Fmoc–K(Pyro–a).

All the platforms, Alk–KDKPPR (9), K(Pyro–a)DKPPR (12) and Alk–K(Pyro–a)DKPPR (13)
were prepared using a Fmoc/tBu solid phase peptide synthesis (SPPS) on 4–benzyloxybenzyl
alcohol (Wang) resin (Scheme 3) and characterized by HRMS and 1H NMR (See Supporting
information). First, the peptide Fmoc–KDKPPR–wang resin 8 and Fmoc–DKPPR–wang resin 10
with protected lateral chains was synthesized. From these peptides, the bimodal platforms without
Pyro–a (i.e. Alk–KDKPPR, 9) and without Alk (i.e. K(Pyro–a)DKPPR, 12), and the trimodal
platform Alk–K(Pyro–a)DKPPR 13 were generated. The bimodal platform 9 was obtained after
coupling reaction at the N–terminal extremity of peptide 8 with (RS/SR)–6, followed by both
cleavages under acidic conditions (27% overall yield from 7 with a HPLC purity of 95%) of the
peptide from the resin and of the lateral chains. The other bimodal platform 12 was isolated after
226
concept
a coupling reaction at the N–terminal extremity of peptide 10 with Fmoc–K(Pyro a) to afford 11,
then resin–cleaved and fully deprotected (25% overall yield from 7 with a HPLC purity of 100%).
Finally, the trimodal platform 13 was obtained after similar procedure as 9 from 11 with (RS/SR)–
6, (19% overall yield from 7 with a HPLC purity of 98%) (Figure 4).
Figure 4. Structure of the trimodal platform 13.
Scheme 3. Solid phase peptide synthesis of bimodal (9 and 12) and trimodal (13) platforms: (i) N–
Deprotection: DMF/Pip (80:20, v:v), rt, 4 then 7 min (synthesizer) or 4x15 min (manually) (ii)
Coupling: Fmoc–AA(P)–OH, HBTU, NMM, NMP, DMF, rt, 2 x 18 min, (iii) Coupling: HBTU, NMM, NMP,
DMF, rt, 12 h, (iv) Coupling: PyBOP, DIPEA, DMF, rt, 12 h and (iv) TFA/TIPS/water (92.5:2.5:5.0, v:v:v),
rt, 1h30. Legend: x, number of amino acid.
227
concept
Photophysical properties
The photophysical properties of the synthesized platforms (9, 12 and 13) as well as those of
(RS/SR)–6 and Pyro–a alone were evaluated. These last two were used as references to test the
influence of each moiety on the photophysical properties of Pyro–a. The photophysical studies were
performed in methanol in which all the compounds were soluble. The absorption spectra of each
compound were recorded at several concentrations to determine the ε values (Figure 5A). A slight
decreased of the ε of Pyro–a was observed for the Soret and QI bands after conjugation with the
peptide and alk moieties, but it remained high for PDT applications.
The absorption spectrum showed the typical absorption bands of Pyro–a at 410 (Soret band),
508 (QIV), 539 (QIII), 609 (QII) and 666 (QI) nm. Moreover, the coupling of the peptide and alk led to
the apparition of a band at 214 and 270 nm, respectively (Figure 5B).
Solutions of Pyro–a, (RS/SR)–6, 9, 12 and 13 were prepared at a concentration allowing an
absorbance of about 0.2. The fluorescence spectra were performed at an excitation wavelength at
410 nm for compounds containing Pyro–a (Figure 5C) and at 280 nm for compounds containing
(RS/SR)–6 (data not shown). The fluorescence quantum yields, Φf, could then be calculated (Figure
5A). No fluorescence was observed for compounds that do not contain Pyro–a (i.e. (RS/SR)–6 and
9). The 1O2 emission spectra were carried out under the same conditions in order to determine the
quantum yield of 1O2, ΦΔ (Figure 5A and Figure 5D).
As for the fluorescence, no 1O2 production was highlighted for compounds (RS/SR)–6 and 9. It
could be observed that there was a slight decrease of both quantum yields for 12 in comparison with
Pyro–a. Moreover, for 13, no change was observed. These results indicated that alk and peptide
were not found to affect the photophysical properties of Pyro–a.
Figure 5. Photophysical properties of compounds with Pyro–a in methanol: (A) Absorption coefficient,
Φf and ΦΔ (B) Normalized UV–Visible Absorption spectra, (C) Fluorescence emission spectra (λexc = 410
nm) and (D) 1O2 emission spectra (λexc = 410 nm) of Pyro–a, 12 and 13. Legend: (__) Pyro–a, (__) 12 and
(__) 13.
228
concept
Photobleaching studies
The stability of Pyro–a, 12 and 13 under light illumination (668 nm, 10 mW.cm–2) in methanol
was studied to check the non–photobleaching of the PS over time. The Φ f was evaluated every 5
min and a significant stability was observed for all the compounds (Figure 6). Moreover, we could
observe that ΦΔ was the same at the beginning and at the end of the illumination.
Figure 6. Evolution of Φf and ΦΔ quantum yields of compounds Pyro–a, 12 and 13 under light irradiation
(668 nm, 10 mW.cm–2) over time. Legend: (□) Pyro–a, (△) 12, (×) 13.
Photolability studies
Scheme 4 showed the radicals production from the alk used in our model. To evaluate the
effective homolysis of our compounds, we followed the generation of SG1 radical by Electron
paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. A high stability of this radical was observed after
more than 1 hour of irradiation with a decrease of intensity from 100% to 93% (data not shown).
Scheme 4. Alk homolysis under UV light irradiation.
First, we opted to evaluate the influence of Alk concentration and oxygenation of the solution
on the SG1 generation though spin–trapping investigations upon UVA–light illumination (λ =
365nm) of Alk. We used, as reference conditions, a 300 µM solution of Alk in methanol under normal
conditions of oxygenation and illumination (see Material and Methods section). While doing so,
EPR fingerprint of the Alk was detected. It consisted of 6 lines of equal intensity arising from the
coupling between the single unpaired electron and both 31P and 14N nuclear spin of ½ and 1
respectively (hyperfine coupling values are given in Supporting Information). 19 From the very first
seconds of illumination a fast production of SG1 was observed reaching a maximum EPR intensity
after ca. 75 s of illumination. After this, a sharp decline of the intensity was observed (Figure 7A).
The marked change in the evolution of the EPR intensity is also referred to as turnover between
the radical generation (or spin adduct) and their reduction. The illumination of Alk at different
concentration exhibited a linear dependence of the initial rate of SG1 production (Table 1) together
with the Alk concentration. This trend was accompanied with a shift of the turnover towards higher
illumination time (Figure 7A), yet such turnover was observed whatever was the Alk concentration.
Similar investigations were performed on the compounds 9 and 13 (Figure 7B and 7C, respectively).
Doubling the compounds concentrations were not sufficient here to double the corresponding initial
229
concept
rates while the presence of a well–defined turnover was also detected. The major difference was the
time of illumination necessary to reach the turnover. Indeed, if the kinetics were comparable for
the Alk alone and the compound 9, the kinetic was significantly longer for the compound 13 which
may be due to the presence of the PS. Considering the significant UV light absorption of PS, this
latter may compete with the Alk, sharing the amount of photons received and increasing the time
to reach the maximal quantity of nitroxide. However, some unexpected kinetic effect may account
for these observations (vide infra).
Figure 7. EPR intensity of radical generated after different irradiation time at room temperature for
Alk (A), 9 (B) and 13 (C) at different concentrations in methanol. Inset: EPR spectra, normalized by
their peak to peak intensity, of SG1 of the solution at 75 µM at the beginning of the plateau (blue) and
at the end of the plateau (red). Legend: (▲) 300 µM, (⚫) 150 µM and (▼) 75 µM.
Worthy of note, EPR spectra of Alk sharpen upon irradiation (Figure 7A, inset), pointing to a
decrease in O2 concentration within the organic solvent.20 Interestingly this effect wasn’t observed
neither for 9 nor 13. The utmost importance of 3O2 for the formation of radicals after irradiation of
Alk was even strengthened by degassing the alk solution by mean of soft Argon bubbling ( ca. 5
min/mL) prior to EPR investigations. In such hypoxic conditions, close to no SG1 was observed
(Figure 8A). Identical approach was performed on both 9 and 13 compounds yet stackable kinetics
were obtained regardless of the oxygenation conditions (Figure 8B and 8C). The absence of
230
concept
difference in Figure 8B and 8C is due to the presence of peptide and PS which play the role of alkyl
radical scavengers. Indeed, in Figure 8A, a large amount of nitroxide is observed because alkyl
radicals are scavenged by 3O2 and back reaction is suppressed (S1) whereas in absence of 3O2 back
reaction occurs impeding the growth of nitroxide.
Table 1. Initial production rate (k) of radical and UV exposition time until reaching the turnover
(tturnover) for compound Alk, 9 and 13 at different concentrations in methanol.
The SG1 reduction together with the potential consumption of 3O2 is in favour of the photo–
induced formation of radical intermediates. To validate such hypothesis a spin–trapping
investigation was performed, using 5–(Diethoxyphosphoryl)–5–methyl–1–pyrroline–N–oxide
(DEPMPO) to trap unstable reactive species too short–lived to be observed in our experimental
conditions.21 Indeed, the reaction between DEPMPO and targeted radical led to the formation of a
more stable spin–adduct which could hence be detected by EPR spectroscopy (Scheme 5).
Scheme 5. Reaction between DEPMPO (EPR silent) and a short–lived radical leading to its corresponding
spin adduct (EPR active).
As for SG1, DEPMPO spin–adducts exhibited the coupling between 31P and 14N and the
unpaired electron, yet with an additional 1H having a nuclear spin of ½. Consequently, EPR spectra
of DEPMPO can have up to 12 lines. Noteworthy, the hyperfine coupling constants ( hfccs) related
to the hyperfine interaction within the adducts were characteristic of the nature of the trapped
adduct, potentially allowing their identification ( e.g. carbon– or oxygen–centred radical) (Figure
9A).22
231
concept
Figure 8. EPR intensity of radical generated after different irradiation time for Alk (A), 9 (B) and 13
(C) at 300 µM in methanol with (♦) or without (▲) oxygen.
In presence of DEPMPO, a better stability of the radical SG1 generated over illumination time
was observed in both oxygenated and degassed conditions: a break was still present at significantly
longer illumination time and the corresponding signal decay was significantly slowed down (Figure
9B and 9C). Quite possibly, the spin–trap shielded the SG1 nitroxide site from potential reduction
due to radical intermediates. Indeed, three distinct radical species were detected and identified.
Based on the obtained hyperfine interactions, the first two radicals (herein referred as to rad1 and
rad2) were identified as oxygenated radicals while the latter one (denoted as rad3) pointed towards
carbon centred radical (See Supporting Information).
For the compound 9 (Figure 9B and 9C), a plateau was reached pointing to the high stability of
the photo–generated nitroxide radical (SG1–peptide). For a methanol solution of 9 at 300 μM, a
plateau around 500 seconds was which remained stable after 1 hour of illumination and that in
both conditions of oxygenation. In these conditions, three distinct spin–adducts were also observed
(see Supporting Information). This high stability of the nitroxide radical generated could be
explained by a protecting effect due to the peptide.
Interestingly enough, for the compound 13 (Figure 9B and 9C), the same trend as for Alk alone
was observed with a slower decay of the nitroxide signal in normal conditions of oxygenation. The
generation of the same radicals as for 9 was also observed (see Supporting Information). This
difference between the kinetics of compounds 9 and 13 might be explained by the fact that the
introduction of the PS, a sterically large group, changed the structure of the peptide and changed
the protective effect observed in its absence.
232
concept
Figure 9. (A) Left: Simulation (red) and experimental (black) spectra of alk in presence of 10 mM of DEPMPO
after 960 s of irradiation. Right: simulation of EPR spectra of SG1, Rad1, Rad2 and Rad3. Simulation parameters
are given in Supplementary information. (B) and (C) Evolution of radical generation after illumination of Alk, 9
and 13 over time in solution in MeOH at 300 µM in presence of 10 mM of DEPMPO in (B) oxygenated solution
and (C) degassed solution. Legend: Radicals formed by illumination of: (♦) Alk, (● ) 9 and (▲) 13.
The reduction of the nitroxide radical signal highlighted its strong reactivity with the
surrounding environment and although there was competition between Alk and PS, the generation
of nitroxide radicals was far from being blocked. This is very interesting for future biological
applications for the destruction of cancer cells.
Affinity studies
The affinity of 9, 12 and 13 to neuropilin–1 was evaluated by competitive ligand binding assay
in comparison with the peptide KDKPPR alone. The binding of 12 and 13 to NRP–1 showed a better
specificity than the peptide alone or 9 probably due to hydrophobic interactions enhanced by Pyro–
a and steric interactions stabilizing the 3D conformation of the peptide (Figure 10). The affinity of
13 to NRP–1 (IC50 of 0.46± 1 µM) was relatively encouraging to envisage an evaluation of this new
multimodal therapeutic approach on in vivo models of tumors expressing NRP–1.
233
concept
Figure 10. (A) Affinity of 9, 12 and 13 to NRP–1 evaluated by Binding Ligand Assay. (B) IC50 values of
compounds estimated from affinity fitting curves.
CONCLUSION
Herein, we established the proof of concept that we can combine three entities, with their own
properties, a PS, an alk and a peptide without any perturbations of their properties to overcome
two major barriers of PDT. We report the effective synthesis of this innovative trimodal platform
using SPPS with acceptable yield and high purities. The photophysical properties (quantum yields
of fluorescence and 1O2) of Pyro–a were maintained even coupled with peptide and the alk. The
peptide KDKPPR still targeted NRP–1 after the coupling of Pyro–a and/or alk, even with a better
affinity. The illumination of alk alone or coupled to the peptide or the PS led to the formation of
radicals.
Concerning the photolability property of alks, compounds 9 and 13 presented two different
kinetics. As an explanation, it might be suggested that the introduction of the bulky Pyro–a induced
a change in the conformation of the peptide that lost its protective effect. This could be confirmed
by the affinity studies where we can observe a better affinity for peptides coupling with Pyro–a
than the peptide coupling only with ( RS/SR)–6.
Although established, this proof of concept does not currently allow in vitro and in vivo
applications due to the use of UV light for alk homolysis. We have to confirm our concept in vitro
by developing others models of alk homolysable at higher wavelength.
MATERIALS AND METHODS

Synthesis of compounds
Chemicals
All commercially chemicals were used without further purifications. (3S–trans)–9–ethenyl–14–
ethyl–4,8,13,18–tetramethyl–20–oxo–3–phorbinepropanoic acid (pyropheophorbide a, Pyro–a) was
purchased from BOC Sciences (Shirley, NY, USA). The Benzotriazole–1–yl–oxy–tris–pyrrolidino–
phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) was purchased from Merck (Darmstadt, Germany).
The Fmoc–Arg(Pbf)–Wang resin, 9–fluorenyl–methoxy–carbonyl (Fmoc)–aminoacid–OH and
234
concept
N,N,N′,N′–Tetramethyl–O–(1H–benzotriazol–1–yl)uronium hexafluorophosphate) (HBTU) were

purchased from Iris Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany). The Fmoc–Lys–OH hydrochloride,
N–hydroxysuccinimide (NHS), N–Ethyl–N′–(3–dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride
(EDCI), acetic anhydride and trifluoroacetic acid (TFA) were purchased from Sigma–Aldrich (St
Louis, MO, USA). The N–methylmorpholine (NMM), N–methylpyrrolidinone (NMP), N,N–
Diisopropylethylamine (DIPEA) and triisopropylsilane (TIPS) were purchased from Alfa Aesar
(Haverhill, MA, USA). Piperidine was purchased from Acros Organics. Ultrapure water (Milli–Q, ρ
>18 MΩ⋅cm) was used for the aqueous solution preparation.
Instruments
Analytical thin layer chromatographies (TLC) were performed using Merck Kieselgel 60 F254
plates; spots were detected after UV light illumination and a phosphomolybdic acid solution in
EtOH as a stain revealed by heating. Purifications of 2, (RR/SS)–4, (RS/SR)–4, (RS/SR)–5 and
(RS/SR)–6 were done on a Reveleris® X2 flash chromatography system (BUCHI, Switzerland) on
Merck Kieselgel 60 (230–400 mesh). The synthesis of 2, (RR/SS)–4, (RS/SR)–4, (RS/SR)–5 and
(RS/SR)–6 were realized under anhydrous conditions and an inert atmosphere of argon and, except
where stated, using dried apparatus and employing standard techniques for handling air–sensitive
materials.
The peptides were synthesized with an automated ResPepXL peptide synthesizer (Intavis AG,
Bioanalytical Instruments). The compounds were purified using Shimadzu LC–10ATvp, column
Agilent Pursuit C18, 5 mm column (5 µm, 150 × 21.2 mm) equipped by an UV photodiode array
detector (Varian Prostar 335–190–950 nm) and a spectrofluometric detector (Shimadzu RF–10AXL–
200–650 nm). The UV detection was performed at 415 and 260 nm. Fluorescence detection at 650
nm was realized after an excitation at 415 nm. The analysis by HPLC were performed with the
same equipment but with a column Agilent Pursuit 5 C18 (5 µm, 150 × 4.6 mm).
1H, 13C, and 31P NMR spectra of 2, (RR/SS)–4, (RS/SR)–4, (RS/SR)–5 and (RS/SR)–6 were
recorded in CDCl3 on a 300 or 400 MHz spectrometer at Marseille and 1H, COSY and TOCSY NMR
spectra of 9¸ 12 and 13 were recorded in DMSO–d6 solvent at room temperature (T = 298 K) on a
BRUKER AVANCE spectrometer at 300 MHz at Nancy. Chemical shifts (δ) are given in parts per
million (ppm) and using residual non– deuterated solvents as the internal reference for 1H and 13C–
NMR spectra, and as an internal capillary filled with 85% H 3PO4 for 31P–NMR spectra for 2,
(RR/SS)–4, (RS/SR)–4, (RS/SR)–5 and (RS/SR)–6 and using DMSO residual peak (δ = 2.5 ppm) as
internal reference for 9¸ 12 and 13. Coupling constants (J) are given in hertz (Hz) and multiplicities
are reported as follow: s = singlet, d = doublet, t = triplet, q = quadruplet, m = multiplet and br =
broad.
High–resolution mass spectra (HRMS) of 2, (RR/SS)–4, (RS/SR)–4, (RS/SR)–5 and (RS/SR)–6
were recorded on a SYNAPT G2 HDMS (Waters) spectrometer equipped with a pneumatically
assisted atmospheric pressure ionization source (API). Positive mode electro– spray ionization was
used on samples: electrospray voltage (ISV): 2800 V; opening voltage (OR): 20 V; nebulizer gas
pressure (nitrogen): 800 L.h−1. Electron spray ionization mass spectra (ESI–MS) of compounds 9¸
12 and 13 were recorded on a Brucker MicroTof–Q HR spectrometer in the “Service commun de
Spectrométrie de Masse”, Faculté des Sciences et Technologies (Vandoeuvre–lès–Nancy, France).
Alkoxyamine synthesis
Compound 2 has been synthetized by a reported procedure 23 (see SI) by using 10 mol% of
azobisisobutyronitrile instead of 1 mol % of benzoyl peroxide.
The new compounds 4, 5, 6 have been prepared according to a reported procedure24 (see SI).
235
concept
Solid phase peptide synthesis (SPPS)

The peptides K(Boc)D(OtBu)K(Boc)PPR(Pbf)–Wang resin 8 and D(OtBu)K(Boc)PPR(Pbf)–
Wang resin 10 were first synthesized using the automated ResPepXL peptide synthesizer, with a
Fmoc/tBu methodology. The side chains of arginine, lysine and aspartic acid were respectively
protected by Pbf, OtBu and Boc groups. We used a Fmoc–Arg(Pbf)–Wang resin swelled in CH2Cl2.
To remove the Fmoc group we used piperidine (20% in DMF). This step was performed two times,
a first during 4 min and a second during 7 min. Then the next amino acid was grafted by adding
an excess of Fmoc–aminoacid–OH (6 eq), HBTU (5 eq), NMP (3 eq) and NMM (10 eq) in DMF. This
step was repeated two times for 18 min. A last step of capping, using a solution of acetic anhydride
(5% in DMF), was performed for 5 min, to trap all functions that did not react. Deprotection,
coupling and capping steps were repeated until the end of the synthesis of the peptide.
Alk–KDKPPR, 9.
After Fmoc deprotection, the reaction between (RS/SR)–6 (1.5 eq) and peptide
K(Boc)D(OtBu)K(Boc)PPR(Pbf)–Wang resin 8 was performed in presence of PyBOP (3 eq) and
DIPEA (3 eq) in DMF, and the solution was stirred for 12 h. The resin was dried under vacuum and
then cleaved (with full deprotection of lateral chains) using TFA/TIPS/water (92.5/2.5/5%) for 2 h.
The acidic resin was filtered and washed with CH 2Cl2 and EtOH. The filtrate was dried under
vacuum and the compound was precipitated in ether by centrifugation. The final product was
further purified by preparative HPLC using acetonitrile/water (0.1% TFA; 10/90) to 100%
acetonitrile gradient in 25 min at a flow of 12 mL.min –1. Rt =13.2 min. 9 was isolated as a white
powder with a yield of 27% (8.60 mg) and a HPLC purity of 95%.
K(Pyro)DKPPR, 12.
After Fmoc deprotection, the reaction between Fmoc–K(Pyro–a) (1.5 eq) and peptide
D(OtBu)K(Boc)PPR(Pbf)–Wang resin 10 was performed with HBTU (3 eq), NMP (3 eq) and NMM
(9 eq) in DMF and the mixture was stirred for 12h to conduct to the Fmoc and lateral protected
compound 11. The final Fmoc protection was removed using piperidine. The resin was dried under
vacuum and then cleaved (with full deprotection of lateral chains) using TFA/TIPS/water
(92.5/2.5/5%) for 2 h. The acidic resin was filtered and washed with CH2Cl2 and EtOH. The filtrate
was dried under vacuum and the compound was precipitated in ether by centrifugation. The final
product was purified by preparative HPLC using acetonitrile/water (0.1% TFA; 10/90) to 100%
acetonitrile gradient in 15 min, followed by isocratic acetonitrile for 10 min at a flow of 12 mL.min –
1. Rt =12.9 min. 12 was isolated as a dark green powder with a yield of 25% (15.57 mg) and a HPLC
purity of 100%.
Alk–K(Pyro–a)DKPPR, 13.
Following the synthesis of the product 11 on resin, the coupling reaction with (RS/SR)–6 (1.5
eq) was performed in presence of PyBOP (3 eq) and DIPEA (3 eq) in DMF, and the reaction mixture
was stirred for 12 h. The resin obtained was dried under vacuum and then cleaved (with full
deprotection of lateral chains) using TFA/TIPS/water (92.5/2.5/5%) for 2 h then filtered and washed
with CH2Cl2 and EtOH. The filtrate was dried under vacuum and the compound was precipitated
in ether by centrifugation. The final product was purified using an Armen SPOT Prep system (high
pressure, preparative liquid chromatography) using a column, using acetonitrile/water (0.1% TFA;
10/90) to 100% acetonitrile gradient in 15 min, followed by isocratic acetonitrile for 10 min at a flow
of 15 mL.min–1. Rt =18.3 min. 13 was isolated as a dark green powder with a yield of 19% (8.25 mg)
and a HPLC purity of 98%.
Photophysical properties
236
concept
The set ups and the methods have been already described in a previous study. 25
Photobleaching of Pyro–a
The studies of photobleaching were performed with a red laser (λ = 668 nm and P = 10 mW.cm–
2). The solutions of Pyro–a, 12 and 13 were prepared in order to have an absorbance around 0.2 to
follow the evolution of fluorescence and singlet oxygen emission. The solutions were irradiated and
the photophysical properties of each compound were evaluated at different times of irradiation: 0,
5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 and 60 min with the same instruments as described below.
Homolysis of Alk
EPR spectra were recorded as previously described 26 except the microwave power was at 4.5
mW, modulation amplitude et 2 G, a sweep time of 30 s for a single scan and 25 µL capillaries
(Hirschmann) were used. 5–(Diethoxyphosphoryl)–5–methyl–1–pyrroline–N–oxide (DEPMPO)
was synthesized as reported in the literature.21 DEPMPO was stored in a stock solution at 0.5 M
in acetonitrile. The intensity of the EPR spectra was obtained by calculating the double integral of
the EPR spectra. In case of multiple component spectra, spectra were simulated using Easyspin
toolbox under Matlab (Mathworks) environment.27 The parameters used for simulation are
presented in Supporting information table S2. The double integral of each component of the
simulated spectra was used to get the intensity of each component. Initial rates were calculated by
performing a linear fit on the 4 first points of the kinetics using OriginPro, version 8, fitting tool.
Affinity tests
Competitive binding to recombinant NRP–1 protein
The binding of compounds for NRP–1 protein was evaluated in terms of the half maximal
inhibitory concentration (IC50 values) through a competitive assay as previously described 28. (See
SI)
ASSOCIATED CONTENT
Supporting Information. “This material is available free of charge via the Internet at
http://pubs.acs.org.” S1. Synthesis and analytical characterizations of 2, (RR/SS)–4, (RS/SR)–4,
(RS/SR)–5 and (RS/SR)–6, 9, 12 and 13. S2. Photophysical properties. S3. Homolysis studies. S4.
Competitive binding to recombinant NRP–1 protein.
AUTHOR INFORMATION
Corresponding Author
* celine.frochot@univ–lorraine.fr; Tel.: +33–3–72–74–37–80; g.audran@univ–amu.fr; Tel.: +33–4–
91–28–88–62
Author Contributions
The manuscript was written through contributions of all authors. All authors have given
approval to the final version of the manuscript.
Funding Sources
This research received no external funding.
ACKNOWLEDGMENT
We gratefully acknowledge François Courtier, Marc Basler and Dr. David Martel (Institut
Charles Sadron, Strasbourg, France) for designing & building of the illumination chamber. The
authors thank the French Ministry of Research and the REseauNAtional de Rpeinter–Disciplinaire
237
concept
(RENARD, Fédération IR–RPE CNRS #3443). Dr. Elena Gimenez–Arnau (Dermatochemistry

Laboratory, University of Strasbourg, France) is acknowledged for providing us with DEPMPO. We
also aknowledge André Merlin, LERMAB, CNRS, Université de Lorraine for his help with the RPE
experiments, Olivier Fabre, LCPM, CNRS, Université de Lorraine, for the NMR experiments and
Serge Mordon, ONCOTHAI, INSERM, Université de Lille, CHU for the loan of the lighting
equipment.
ABBREVIATIONS
Alk, alkoxyamine; AMD, age–related macular degeneration; DCM, dichloromethane; DIPEA,
Diisopropylethylamine; DMF, diméthylformamide; DMP, Dess−Martin periodinane; DO, optical
density; EDCI, N–Ethyl–N′–(3–dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride; EPR, Electronic
paramagnetic resonance; HBTU, N,N,N′,N′–Tetramethyl–O–(1H–benzotriazol–1–yl)uronium
hexafluorophosphate); HO•, hydroxyl radical; HPLC, high performance liquid chromatography;
HRMS, high–resolution mass spectrometry; NBS, N–bromosuccinimide; NHS, N–
hydroxysuccinimide; NMM, N–methylmorpholine; NMP, Nitroxide Mediated Polymerization;
NMR, nuclear magnetic resonance; NO, nitric oxide; NRP–1, neuropilin–1; O2, molecular oxygen;
1O2, singlet oxygen; O2–•, superoxide anion; PDT, photodynamic therapy; pip, piperidine; PS,
photosensitizer; PTT, photothermal therapy; PyBOP, Benzotriazole–1–yl–oxy–tris–pyrrolidino–

phosphonium hexafluorophosphate; Pyro–a, pyropheophorbide–a; ROS, reactive oxygen species;
TFA, trifluoroacetic acid; THF, tetrahydrofuran; TIPS, triisopropylethylamine; TLC, thin layer
chromatography; UV, ultra–violet; VEGF, vascular endothelial growth factor.
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239
concept
IX. Conclusion
Nous avons établi une preuve de concept basée sur le développement d’une plateforme
trimodale pour une application PDT anticancéreuse ciblant le récepteur NRP–1 efficace à
la fois en milieu normoxique et hypoxique.
La première étape, effectuée avec succès, a consisté à synthétiser la plateforme

composée d’un peptide (KDKPPR), d’une alcoxyamine (SG1–benzophénone) et d’un PS
(Pyro–a), ainsi que des composés de référence. Une fois ces composés obtenus, leurs
propriétés photophysiques ainsi que leur photolabilité ont été évalués. Une très faible
interaction des différentes unités sur les propriétés photophysiques du PS a été observée.
Concernant les propriétés de photolabilité de l’alcoxyamine sous illumination UV, un effet
protecteur du peptide a pu être observée ainsi qu’une compétition entre le PS et
l’alcoxyamine. Bien que ralentissant la photodissociation de l’alcoxyamine, la présence du
PS ne bloque pas la génération de radicaux et ne présente par conséquent pas
d’interférences majeures sur les propriétés de cette dernière. La plateforme a également
prouvé avoir une très bonne affinité pour le récepteur NRP–1 (CI50 = 0,46 µM) meilleure
que celle du peptide seul (CI50 = 11,5 µM).
Bien que prometteuse, il n’est pas possible d’évaluer l’efficacité de notre plateforme in
vitro ou in vivo en raison de l’utilisation de la lumière UV pour l’homolyse de
l’alcoxyamine. Dans la suite de cette thèse, nous nous sommes tournés vers l’amélioration
de cette plateforme.
240
CHAPITRE III :
AMELIORATION DES
PLATEFORMES POUR
LE TRAITEMENT DU
GLIOBLASTOME
241
242
CHAPITRE III : Amélioration des plateformes pour le traitement du
glioblastome
I. Contexte et objectifs
Dans ce chapitre, nous nous sommes focalisés sur l’amélioration de nos plateformes
selon différents aspects :
i) L’amélioration du ciblage, en utilisant le peptide tLyp–1, forme tronquée du
peptide Lyp–1 connu pour se fixer sur le récepteur NRP–1 et être ensuite
internalisé ;
ii) L’augmentation de la solubilité de la plateforme grâce au greffage d’une β–
cyclodextrine.
iii) L’utilisation d’une nouvelle alcoxyamine homolysable à une longueur d’onde UV–
visible compatible avec une application PDT in vitro.
Dans ce contexte, nous avons envisagé de nouvelles plateformes comprenant cette fois–ci
quatre unités :
o La Pyro–a comme PS ;
o Une nouvelle alcoxyamine, notée Alc2, cette fois–ci liée au peptide par
l’intermédiaire d’une lysine supplémentaire permettant d’avoir une fonction
terminale libre sur le peptide ;
o Une β–cyclodextrine (β–CD) ;
o Le peptide tLyp–1. La plateforme avec le peptide KDKPPR est également
synthétisée afin de pouvoir comparer les deux plateformes (affinité, efficacité).
La structure schématique des plateformes quadrimodales envisagées est donnée en
Figure 63.
243
glioblastome
Figure 63 : Nouvelles plateformes quadrimodales envisagées.
Nous avons également envisagé les structures « témoin » à savoir les plateformes
trimodales sans β–CD, sans Alc2 ou sans PS.
II. Amélioration du ciblage
II.1. Tumor–homing peptides
Les tumor–homing peptides sont des peptides reconnaissant des marqueurs
spécifiques de certains types de tumeurs. Ces peptides sont capables de cibler la
vascularisation tumorale, les vaisseaux lymphatiques, les cellules tumorales. En plus de
leurs propriétés de ciblage, ils sont également capables d’internalisation au sein des
cellules et de transporter des molécules afin de les délivrer au sein des tissus tumoraux.
180 Plusieurs librairies de phage display ont permis d’identifier de nombreux tumor–
homing peptides.181
Teesalu et al.182 ont identifié une séquence d’internalisation commune aux peptides
capable de pénétration vasculaire, cellulaire et dans les tissus, nommée « C–end rule »
(CendR). Cette séquence contient une arginine ou une lysine en C–terminale souvent
précédée par une autre lysine ou arginine correspondant à un motif de type R/KXXR/K
avec X est un acide aminé aléatoire. La voie d’internalisation se produit par fixation du
peptide sur son récepteur spécifique, son extrémité C–terminale est alors exposée et subit
un clivage protéolytique libérant ainsi le motif de reconnaissance CendR. La pénétration
du fragment CendR dans les cellules est ensuite initiée par sa fixation au récepteur NRP–
244
glioblastome
1. Les tumor–homing peptides possédant le motif CendR peuvent se lier à des récepteurs
primaires différents mais l’internalisation se fait via le récepteur NRP–1 (Figure 64).
Figure 64 : Représentation schématique de la voie d'internalisation du CendR. La pénétration d’un peptide, possédant
un motif CendR, dans les cellules tumorales se produit en 3 étapes, (i) la liaison du peptide à un récepteur primaire sur
l’endothélium de la tumeur, (ii) le clivage du peptide par des protéases exposant ainsi le motif CendR à l’extrémité C–
terminale et (iii) la liaison à NRP–1 médiée par le motif CendR, conduisant à la perméabilité vasculaire et tissulaire. X,
des acides aminés aléatoires. Les ronds noirs correspondent aux molécules pouvant être transportés par
l’intermédiaire du motif CendR. Extraite de Ruoslahti.183
Le motif CendR est internalisé par endocytose formant ainsi de larges vésicules
endocytosiques (diamètre de 200 nm) permettant le transport d’autres molécules soit par
conjugaison au motif CendR soit par co–administration avec le peptide sans conjugaison.
Le transport de molécule associée au CendR peut se faire d’une cellule à l’autre selon un
mécanisme qui n’a pas été clairement identifié.183
Les tumor–homing peptides présentent l’avantage de pouvoir augmenter la
concentration de la molécule transportée dans la tumeur mais également sa distribution
au sein de la tumeur.
245
glioblastome
II.1.1. Les peptides Lyp–1 et tLyp–1
Le peptide Lyp–1 est un tumor–homing peptide cyclique constitué de 9 acides aminés
(CGNKRTRGC) capable de cibler les cellules tumorales, les cellules endothéliales
lymphatiques et les macrophages associés aux tumeurs. Le récepteur du Lyp–1 est une
protéine mitochondriale appelée gC1qR/p32 surexprimée à la surface de nombreuses
cellules cancéreuses issues notamment des cancers du sein, du pancréas, du colon, du
corps utérin, du mélanome et du glioblastome.183 Après combinaison du Lyp–1 avec p32,
un clivage protéolytique a alors lieu libérant le motif CendR du peptide (CGNKRTR,
appelé tLyp–1) pouvant alors se fixer au récepteur NRP–1, pour être ensuite internalisé
dans les cellules (Figure 65). C’est cette forme tronquée (tLyp–1) qui permet
l’internalisation de molécules.184
Figure 65 : Fixation du peptide Lyp–1 à la protéine p32 suivi de son internalisation à travers NRP–1. Extraite de Song et
al.184
Laakkonen et al. ont montré que le peptide Lyp–1 ciblait les cellules tumorales ainsi
que les vaisseaux lymphatiques associés à la tumeur sur plusieurs modèles de cancer in
vivo (sein, osteosarcome, prostate). Une accumulation du Lyp–1 dans le noyau de ces
246
glioblastome
cellules a également été observée.185 Ils ont également montré que les zones tumorales
ciblées par Lyp–1 sont des microenvironnements tumoraux hypoxiques.186
Une mort cellulaire a été observée in vitro sur des cellules de cancer du sein liant le
Lyp–1 alors que sur des cellules de mélanome ne liant pas le Lyp–1, aucune apoptose n’a
été observée.186 Ces constations ont également été faites in vivo sur le même modèle de
cancer du sein sur des souris avec une inhibition de la croissance tumorale associée au
Lyp–1 et une réduction du nombre de vaisseaux lymphatiques dans les tumeurs. Le
mécanisme associé à ce phénomène n’est pas clairement défini mais pourrait être associée
à son récepteur p32.184
II.1.2. Applications diagnostics et thérapeutique
Les capacités de ciblage et d’internalisation de ces peptides en font des candidats de
choix pour la détection et le traitement de tumeurs par combinaison à d’autres molécules.
De nombreuses applications diagnostiques et thérapeutiques ont été reportées dans la
littérature.184
En 2018, Abulrob et al.187 ont développé un nouveau agent de contraste (Lyp–1–Fe3O4–
Cy5.5) pour l’IRM conjuguant le peptide Lyp–1 à des NPs d’oxide de fer fluorescentes sur
un modèle in vivo de cancer du sein triple–négatif. Un signal de fluorescence en imagerie
optique dans les glandes mammaires des souris 2,6 fois plus important a été observé pour
les souris traitées avec ce composé, 2 heures après injection, contrairement à celles traitées
avec un peptide contrôle. Une augmentation du contraste au niveau des berges et du cœur
de la tumeur en IRM a également pu être observée pour les souris traitées avec Lyp–1–
Fe3O4–Cy5.5.
En 2020, Wu et al. 188 ont développé une sonde moléculaire pour l’imagerie par IRM de
gliomes. Cette sonde a été conçue pour cibler NRP–1 et a consisté en la combinaison de
NPs USPIONs (ultra–small superparamagnetic iron oxide nanoparticles) avec le peptide
tLyp–1. Des études in vivo sur des souris portant deux types de cellules de gliomes U87
247
glioblastome
(grade IV) ou CHG–5 (grade II) ont été effectuées. Une expression relative de NRP–1
significativement plus importante a été observée pour les cellules U87. La concentration
de NPs chez les souris portant des tumeurs U87, déterminée par IRM et par microscopie
électronique en transmission (TEM) est 2,5 fois plus élevée dans les cellules U87 (+) que
CHG–5 (–) dû à la plus forte expression du récepteur NRP–1 dans les cellules U87.
En 2014, Xu et al.189 ont développé des nano–bâtonnets d'or recouvert de silice
mésoporeuse sur lesquels a été greffé le peptide tLyp–1 marqué avec la fluorescéine
isothiocyanate (FITC) et chargé en camptothécine (CPT–loaded AuNR@SiO2−tLyp–1)
pour une thérapie bimodale chimiothérapie et photothermie. Des études in vitro sur des
cellules de cancer de l’utérus (HeLa) et de cancer du sein (MCF–7) ont confirmé
l’internalisation des NPs dans ces cellules alors qu’aucune internalisation n’a été observée
sur des cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC) et des cellules
d’ostéosarcome (MG63). Après incubation des cellules avec les NPs pendant 24 heures et
illumination sous un laser proche IR, une diminution importante de la viabilité cellulaire
a été mise en évidence sur les deux types de cellules (HeLa, 65% et MCF–7, 75%) en
comparaison avec les cellules non traitées.
II.1.3. Applications en PDT
Peu d’applications des peptides Lyp–1 et tLyp–1 ont été décrites pour le ciblage
tumoral en PDT. Nous avons recensé trois publications en 2016190–192 et une en 2020193.
Ainsi, en 2016, Jiang et al ont développé des NPs TGPS–PLA (D–α–tocopheryl
polyethylene glycol 1000 succinate–poly(lactic acid)) incorporant dans leur cœur un agent
de chimiothérapie (doxorubicine) et dans leur enveloppe un PS (Ce6), décorées en surface
par le peptide tLyp–1 (tLyp–1–NPs) pour une thérapie chimio–photodynamique combinée.
Des études in vitro sur des cellules MCF–7/ADR, résistante à la doxorubicine, et HUVEC
ont montré que l’accumulation cellulaire des tLyp–1–NPs était améliorée (1,57 et 1,62 fois
plus élevée pour les cellules HUVEC et MCF–7/ADR respectivement) sous illumination,
248
glioblastome
due à la production de ROS par la Ce6, qui pourrait favoriser la perméabilité des
membranes par oxydation de celles–ci. En l’absence d’illumination, une CI50 75,6 fois plus
faible pour les tLyp–1–NPs en comparaison avec la doxorubicine seule a été observée sur
les cellules MCF–7 et 31,5 fois plus faible pour les NPs sans le tLyp–1. Sous illumination,
une nouvelle diminution (6,6 fois) de la CI50 des tLyp–1–NPs a été observée. In vivo, les
capacités de ciblage et d’internalisation des tLyp–1–NPs ont été démontrées. L’efficacité
thérapeutique des tLyp–1–NPs a également été montrée in vivo avec une diminution de
la croissance tumorale jusqu’à 14 jours après traitement.
L’ensemble des caractéristiques décrites font des peptides Lyp–1 et tLyp–1 d’excellents
candidats pour le ciblage tumoral. De plus, leur application en PDT a été peu étudiée
faisant d’eux des agents d’intérêt. La forme tronquée (tLyp–1) étant la seule partie
internalisée, nous nous sommes focalisés sur cette séquence.
II.2. Purification de peptides hydrophiles
Un des problèmes majeurs rencontrés lors de la synthèse de peptides polaires tels que
le KDKPPR et le CGNKRTR, est la purification dans les conditions classiques de RPLC.
Aussi d’autres méthodes de purification ont dû être envisagées comme la chromatographie
d’interactions hydrophiles (HILIC).
II.2.1. La chromatographie d’interactions hydrophiles (HILIC)
L’HILIC a été définie dans les années 90 par Alpert dans le cadre de la purification de
composés hydrophiles tels que les peptides et acides nucléiques.194 Contrairement à la
RPLC, l’HILIC repose sur l’utilisation d’une phase stationnaire polaire et d’une phase
mobile riche en solvant organique.
La chromatographie HILIC présente de nombreuses similarités avec les autres
techniques de chromatographie liquide. Elle repose sur l’utilisation d’une phase mobile
similaire à celle utilisée en RPLC, d’une phase stationnaire polaire tout comme la
249
glioblastome
chromatographie en phase normale (NPLC) et permet d’analyser des composés chargés
comme la chromatographie d’échange d’ion (IEC) (Figure 66).195
Figure 66 : Comparaison de la chromatographie HILIC avec les autres méthodes HPLC. Adaptéee de 196.
Les phases stationnaires utilisées en HILIC sont des silices greffées avec des
groupements fonctionnels polaires tels que des groupements amine, diol ou amide. La
phase mobile, quant à elle, se compose d’eau et d’un solvant organique polaire aprotique
miscible avec l’eau (ACN).
Les modes isocratique avec une grande proportion de solvant organique ou gradient
croissant d’eau sont employés. Le temps de rétention du composé va varier selon le
caractère hydrophile du composé élué, la polarité de la phase stationnaire et la
concentration en solvant organique (souvent l’ACN) de la phase mobile.
Une augmentation du temps de rétention sera observée pour les composés les plus
hydrophiles.197
II.2.2. Comparaison entre la chromatographie en phase inverse et

l’HILIC sur les peptides KDKPPR et tLyp–1
Dans ce chapitre, nous avons tout d’abord choisi d’évaluer l’intérêt de l’utilisation de
la chromatographie HILIC sur les peptides KDKPPR et tLyp–1 en comparaison avec la
250
glioblastome
chromatographie RPLC. En RPLC, ces peptides présentent des profils similaires, avec une
élution très rapide dans le volume mort.
L’utilisation d’une colonne HILIC suivant un gradient de 95% ACN dans l’eau + 0,1%
TFA à 55 % ACN dans l’eau + 0,1% TFA en 15 min suivi d’un isocratique pendant 15 min
a permis d’augmenter considérablement le temps de rétention des peptides (Tableau 15).
Tableau 15 : Comparaison des temps de rétention obtenus pour les peptides KDKPPR et tLyp–1 sur une colonne C18
en RPLC utilisant un gradient de 5% à 100% ACN dans l’eau + 0,1 % TFA en 25 min et sur une colonne Tsk Gel–Amide
80 en HILIC utilisant un gradient de 95% à 55% ACN dans l’eau + 0,1 % TFA en 15 min suivi d’un isocratique à 55% ACN
dans l’eau + 0,1 % TFA pendant 10 min.
Temps de rétention
Peptides RPLC HILIC
KDKPPR 2,6 min 20,8 min
CGNKRTR 2,6 min 19,9 min
II.3. Alascan
Afin de déterminer l’importance de chaque acide aminé pour l’affinité avec NRP–1,
nous avons réalisé un « Alascan » consistant au remplacement successif de chaque acide
aminé par une alanine. En parallèle, avec l’équipe du Dr Amirah Mohd Gazzali, School of
Pharmaceutical Sciences, Universiti Sains Malaysia, le docking moléculaire de tous les
peptides de l’Alascan a été entrepris pour définir les interactions entre ces peptides et le
récepteur NRP–1. Tous les résultats sont présentés dans la publication ci–dessous que
nous allons soumettre dans « Bioorganic Chemistry ».
Brièvement, cet article présente le docking moléculaire, la synthèse et les tests
d'affinité de chaque peptide de l'Alascan.
251
glioblastome
tLYP–1: a peptide suitable to target NRP–1 receptor

Ludivine Laruea, Muhammad–Amirul–Asyraf Nohb, Valérie Jouan–Hureauxc, Amirah
Mohd–Gazzalib, Cédric Bourac, Céline Frochota, Samir Acherard*
aLaboratoire Réactions et Génie des Procédés (LRGP), UMR 7274, CNRS, Université de Lorraine,
1 rue Granville, F 54000 Nancy, France;
bSchool of Pharmaceutical Sciences, Universiti Sains Malaysia, 11800 Panang, Malaysia;
cUniversité de Lorraine, CNRS, CRAN, Vandoeuvre–les–Nancy, France;
dLaboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire (LCPM), UMR 7375, CNRS, Université de
Lorraine, 1 rue Granville, F–54000 Nancy, France
Abstract
Targeting Vascular endothelial growth factor receptor (VEFGR) and its co receptor
neuropilin–1 (NRP–1) is an interesting vascular strategy. tLyP–1 is a tumor–homing and
penetrating peptide of 7 amino–acids (CGNKRTR). It is a truncated form of LyP–1
(CGNKRTRGC), which is known to target neuropilin–1 (NRP–1) receptor, a co–receptor
of VEGF receptor, with high affinity and specificity.131 It is mediated by endocytosis via
C–end rule internalization pathway. The aim of this study is to synthesize tLyP–1 and to
determine the importance of each amino acid in the sequence. To do so, ALA–scan has
been realized by synthesizing 7 peptides by replacing in each of them one amino acid by
an alanine. The synthesis was done with success. In parallel, docking study of all the
peptides on domain b1 of NRP–1 has been performed. The results showed that the peptide
CGNKATR has the lowest energy of binding and showed significantly improved binding
affinity as compared to tLyP–1. The molecular affinity study proved that the lysine and
both arginines are essential for the efficient binding of the peptide to NRP–1. However, it
was also observed that the cysteine is not essential for the affinity.
Keywords: peptide; NRP–1; targeting; modeling
List of abbreviations
Boc: tert–Butoxycarbonyl
tBu : Tert–butyl
BSA: Bovine Serum Albumin
DMF: Dimethylformamide
DMSO: Dimethylsulfoxide
FEB: Free energy of binding
Fmoc: Fluorenylmethoxycarbonyl
HBTU: 2–(1H–Benzotriazol–1–yl)–1,1,3,3–tetramethyluronium hexafluorophosphate
252
glioblastome
HPLC: High performance liquid chromatography
HRMS: High Resolution Mass Spectrometry
LBA: Ligand Binding Assay
NMM: N–Methylmorpholine
NMP: N–Methylpyrrolidine
NRP–1: Neuropilin–1
Pbf: Pentamethyl–2,3–dihydrobenzofuran–5–sulfonyl
PBS: Phosphate Buffer Saline
PDB: Protein Data Bank
PDT: Photodynamic therapy
PS: Photosensitizer
RMSD: Root–mean–square deviation
TFA: Trifluoroacetic acid
TIPS: Triisopropylsilane
Trt: Triphenylmethyl
VEGF: Vascular endothelial growth factor
VEGFR: Vascular endothelial growth factor receptor
II.3.1. Introduction
Thanks to the development of new therapies or drugs, a decline of incidence and death
rates can be observed for all cancers.198 Nevertheless, progress can still be done.
Improvement of drug selectivity could induce a better efficacy of the treatment with lower
doses. One strategy consists in targeting the new blood neo–vessels to induce an asphyxia
of the tumor by preventing the tumor cells to be supply in oxygen and nutrients. Since
years, our team focus on the development of targeted photosensitizers (PSs) for
photodynamic therapy (PDT) applications. In particular, we designed PSs coupled to
peptides targeting neuropilin–1 (NRP–1) receptor, a co–receptor of VEGF receptor
overexpressed on tumors and neo–vessels. We used first ATWLPPR 199,200 which proved to
be not so stable in vivo. We developed then KDKPPR.131
In this new study, we are interested in using tLyP–1, a tumor–homing and penetrating
peptide of 7 amino acids (CGNKRTR). It is a truncated form of LyP–1 (CGNKRTRGC), a
cyclic 9–amino acid peptide, which is known to target tumor lymphatics as well as tumor
cells and associated macrophages especially.185,201 It is mediated by endocytosis via C–end
253
glioblastome
rule internalization pathway. A receptor known as gC1qR/p32 is the primary site of
binding for Lyp–1. The gC1qR/p32 mediates many biological events such as infection,
inflammation and immune response. This receptor is abundantly expressed by endothelial
cells localized in tumoral environment. It is supposed that Lyp–1 binds first to gC1qR/p32
and then is cleaved to form tLyp–1 that binds to NRP–1 and/or NRP–2 and can be
internalized.180 In 2015, it has been used with success in glioma for drug delivery
applications. It has been coupled to 5–carboxyfluorescein (FAM) or 18F–fluoride and the
authors showed in U87MG glioblastoma cells xenografted in nude mice that the
distribution of the targeted compounds in the tumor tissue was in relation with the
expression of NRP–1.202
Very recently, a molecular modeling of Lyp–1 in complex with gC1qR/p32 was
performed, by using a structure of gC1qR/p32 available in the Protein Data Bank (PDB
code: 1P32). It was shown that Asn3, Lys4, Arg5 and Ag7 were important amino acids for
the specific binding of gC1qR/p32. The authors also supported their finding with molecular
dynamic study, to further determine the interaction pattern between Lyp–1 and p32.203
As far as we know, no docking simulation study has been done with regards to the tLyp–
1 on NRP–1. Our previous experience with docking on NRP–1 receptor was published in
2016, in which a series of peptides was tested.130
II.3.2. Materials and methods
II.3.2.1. Molecular docking simulation
Autodock 4.2 was used for the docking simulation of tLyp–1 on the b1 domain of NRP–
1 receptor (PDB ID: 5IJR). AutoDockTools (ADT), which is a graphical user interface that
is designed to work with Autodock program, was used to remove any unrelated ions and
ligands from the receptor. Polar hydrogen and Kollman charges were subsequently added
and this file was saved as PDBQT format.204 The amino acid residues in the receptor was
maintained as is in the PDB file, without any special protonation state added. The docking
254
glioblastome
area was refined to a grid box set at 60 Å x 60 Å x 60 Å along the X, Y and Z axis
respectively at 0.375 Å grid point spacing, to cover the active receptor site based on the
location of co–crystallized L–homoarginine ligand (native ligand of the NRP–1 receptor in
5IJR).
The tLyp–1 peptide and the ALA–Scan analogues were prepared by adding Gasteiger’s
charges, specifying the suitable torsion centres and determining the number of allowed
rotation within the molecule. These ligands were then saved as PDBQT files.
Molecular docking simulation was executed by using the Lamarckian genetic
algorithm for 150 runs. The results were ranked according to their lowest free energy of
binding (FEB) and the molecules with RMSD value of within 0.5 Å from each other were
clustered together. The binding conformations were then visualized by using Biovia
Discovery Studio to determine the interactions recorded during the simulation process.
II.3.2.2. Chemicals and materials
Ultrapure water (Milli–Q, ρ >18 MΩ⋅cm) was used in all the experiments.
Dichloromethane (DCM), dimethylformamide (DMF) and ethanol (EtOH) were obtained
from Sigma–Aldrich and were used without further purification.
The synthesis of all peptides required HBTU (Iris Biotech GmbH, Germany), acetic
anhydride and piperidine (Sigma–Aldrich, Germany) and N–methylmorpholine (NMM),
N–methylpyrrolidinone (NMP) (Alfa Aesar, Haverhill, MA, USA) as reagents. Fmoc–L–
Cys (Trt)–OH, Fmoc–L–Lys(Boc)–OH, Fmoc–L–Gly–OH, Fmoc–L–Thr(tBu)–OH and
Fmoc–L–Arg(Pbf)–OH were obtained from Iris Biotech GmbH (Germany). Fmoc–L–
Arg(Pbf)–Wang resin (100–200 mesh) and Fmoc–L–Asn(Trt)–OH were obtained from
Novabiochem (Germany). Trifluoroacetic acid (TFA) was purchased from Sigma Aldrich
(Germany) and triisopropylsilane (TIPS) from Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA).
255
glioblastome
II.3.2.3. Instruments
The peptides were synthesized using an automated ResPepXL peptide synthesizer
(Intavis AG, Bioanalytical Instruments) and operated with a Multiple–Parallel Peptide
Synthesis Program and were purified by HPLC using Shimadzu LC–20AT, column TSK
gel amide–80 (3 µm, 300 x 7.8 mm) equipped by an UV photodiode array detector (SPD–
M20A). The UV detection was performed at 214 nm. The analysis by HPLC were
performed using the same equipment with a column TSK gel amide–80 (3 µm, 150 × 4.6
mm).
1H NMR spectra were recorded on a Brucker Advance III 400 MHz spectrophotometer.
The spectra were recorded in DMSO–d6 at room temperature (T = 298 K) and residual
peak of DMSO (δ = 2.5 ppm) was used as internal reference. The chemical shifts (δ) are
given in parts per million (ppm). High resolution mass spectrometry (HRMS) experiments
were performed on a micrOTOF Bruker (electrospray ionization ESI+, 50–1000 in low and
50–2500 in width).
II.3.2.4. Synthesis
All the peptides were synthesized using the automated ResPepXL peptide synthesizer,
according to a classical Fmoc/tBu solid phase methodology. The side chains of arginine,
asparagine, cysteine, lysine and threonine were protected by Pbf, Trt, tBu or Boc groups
(see III.3.2.2 section). A Fmoc–Arg(Pbf)–Wang resin or Fmoc–Ala–Wang resin was used
as the starting material and swelled in CH 2Cl2. The Fmoc groups were removed by
piperidine (20% in DMF). This step was performed three times, a first during 4 min and
the next two for 7 min. The next amino acid was then grafted with the coupling step by
adding an excess of Fmoc–aminoacid–OH (6 eq), HBTU (5 eq), NMP (3 eq) and NMM (10
eq) in DMF. This step was repeated two times for 18 min and three times for the last
amino acid. A last step of capping, using a solution of acetic anhydride (5% in DMF), was
performed for 5 min, to trap all functions that did not react. The process of deprotection,
256
glioblastome
coupling and capping were repeated until the desired sequences of amino acids were
grafted on the resin. At the end of each step, all soluble reagents on the resin and the
protecting group at the N–terminus of the peptide were removed by filtration and washing
process with CH2Cl2, EtOH and DMF. The final Fmoc protection was removed using
piperidine performed 4 times for 15 min. The resin was dried under vacuum and then
cleaved (with full deprotection of lateral chains) using TFA/TIPS/water (92.5/2.5/5%) for 2
h. The acidic resin was filtered and washed with TFA and CH2Cl2. The filtrate was dried
under vacuum and the compound was precipitated in ether by centrifugation. The crude
product was further purified by semi–preparative HPLC using acetonitrile/water (0.1%
TFA; 95/5) to 55% acetonitrile gradient in 25 min, followed by isocratic acetonitrile for 10
min at a flow of 1.7 mL.min–1.
tLyp–1, CGNKRTR (17).

1H NMR (400 MHz, DMSO–d6, δ):
CGNKRTR (17)
NH α–H β–H δ–H Others
Cys – 4.02 3.01 – –

2.90
Gly 8.84 3.93 – – –
3.78
Asn 8.26 4.59 2.54 7.45 –
2.43 6.96
Lys 8.04 4.21 1.67 1.51 ε–NH= 7.72; ε–CH2= 2.74; γ–CH2= 1.31
Arg1 8.17 4.30 1.74 3.08 γ–CH2= 1.52; ε–NH= 7.75

1.58
Thr 7.71 4.21 3.97 – γ–CH3= 1.05
Arg2 7.99 4.17 1.74 3.09 γ–CH2= 1.36; ε–NH= 7.64

1.50
HRMS (ESI): m/z calcd. for C31H59N15O10S [M + H]+ 834.4363, [M + 2H]2+ 417.7218; found [M + H]+ 834.4315,
[M + 2H]2+ 417.7281.
257
glioblastome
CGNKRTA (18).
CGNKRTA (18)
Cys – 4.06 3.19 – –

2.93
Gly 8.78 3.83 – – –
or 8.62 3.71
Asn 8.17 4.52 2.48 7.37 –
2.37 6.88
Lys 7.94 4.13 1.61 1.46 ε–NH= 7.58; ε–CH2= 2.69; γ–CH2=1.25
Arg1 8.08 4.20 1.67 3.02 γ–CH2= 1.41; ε–NH= 7.54

1.48
Thr 7.57 4.11 3.89 – γ–CH3= 0.97
Ala 7.89 4.13 1.20 – –
[M + 2H]2+ 375.1988.
CGNKRAR (19).
CGNKRAR (19)
Cys – 3.96 2.90 – –

2.84
Gly 8.80 3.84 – – –
or 8.64 3.70
Asn 8.20 4.52 2.49 7.41 –
2.36 6.90
Lys 8.03 4.07 1.60 1.45 ε–NH= 7.63; ε–CH2= 2.67; γ–CH2= 1.23
Arg1 8.01 4.07 1.65 3.02 γ–CH2= 1.44; ε–NH= 7.58
Ala 7.74 4.20 1.14 – –
Arg2 7.99 4.14 1.68 2.99 γ–CH2= 1.49; ε–NH= 7.67
[M + 2H]2+ 402.7213.
258
glioblastome
CGNKATR (20).
CGNKATR (20)
Cys – 4.04 2.99 – –

2.99
Gly 8.87 3.91 – – –
or 8.72 3.79
Asn 8.25 4.57 2.53 7.45 –
2.47 6.96
Lys 8.04 4.18 1.67 1.52 ε–NH= 7.7; ε–CH2= 2.75; γ–CH2= 1.31
Ala 8.12 4.31 1.23 – –
Thr 7.63 4.20 3.95 – γ–CH3= 1.05
Arg2 7.93 4.21 1.75 3.09 γ–CH2= 1.50; ε–NH= 7.68

1.60
[M + 2H]2+ 375.1991.
CGNARTR (21).
CGNARTR (21)
Cys – 3.97 2.92 – –

2.83
Gly 8.87 3.84 – – –
or 8.72 3.71
Asn 8.20 4.51 2.50 7.39 –
2.36 6.88
Ala 8.06 4.19 1.15 – –
Arg1 7.92 4.12 1.67 3.02 γ–CH2= 1.42; ε–NH= 7.58

1.52
Thr 7.50 4.14 3.88 – γ–CH3= 0.97
Arg2 8.05 4.19 1.68 3.01 γ–CH2= 1.39; ε–NH= 7.58

1.49
[M + 2H]2+ 389.2008.
259
glioblastome
CGAKRTR (22).
CGAKRTR (22)
Cys – 4.04 2.98 – –

2.89
Gly 8.84 3.92 – – –
or 8.68 3.77
Ala 8.15 4.34 1.18 – –
Lys 8.08 4.23 1.65 1.51 ε–NH= 7.72; ε–CH2= 2.74; γ–CH2= 1.30
Arg1 8.05 4.33 1.71 3.08 γ–CH2= 1.46; ε–NH= –

1.51
Thr 7.75 4.22 3.95 – γ–CH3= 1.04
Arg2 8.00 4.21 1.73 3.09 γ–CH2= 1.50; ε–NH= –

1.60
[M + 2H]2+ 396.2263.
CANKRTR (23).
CANKRTR (23)
Cys – 4.03 3.13 – –

2.92
Ala 8.09 4.35 1.16 – –
Asn 8.27 4.50 2.47 7.43 –

2.35 6.91
Lys 7.79 4.17 1.59 1.42 ε–NH= 7.60; ε–CH2= 2.65; γ–CH2= 1.21
Arg1 8.10 4.23 1.68 3.01 γ–CH2= 1.42; ε–NH= –

1.48
Thr 7.64 4.14 3.90 – γ–CH3= 0.97
Arg2 7.90 4.10 1.67 3.02 γ–CH2= 1.41; ε–NH= –

1.54
HRMS (ESI): m/z calcd. for C32H61N15O10S [M + 2H]2+ 424.7296; found [M + 2H]2+ 424.7388.
260
glioblastome
AGNKRTR (24).
AGNKRTR (24)
Ala 8.81 4.15 1.49 – –
Gly 8.53 3.81 – – –

3.73
Asn 8.11 4.48 2.47 7.37 –
2.38 6.89
Lys 7.95 4.11 1.61 1.44 ε–NH= 7.55 ; ε–CH2= 2.67 ;γ–CH2= 1.26
Arg1 8.05 4.22 1.67 3.00 γ–CH2= 1.42 ; ε–NH= 7.38

1.49
Thr 7.56 4.13 3.87 – γ–CH3= 0.98
Arg2 8.16 4.35 1.67 3.01 γ–CH2= 1.42 ; ε–NH= 7.45

1.60
HRMS (ESI): m/z calcd. for C31H59N15O10 [M + 2H]2+ 401.7357; found [M + 2H]2+ 401.7397.
II.3.2.5. Biological test–binding study of the peptides on

recombinant NRP–1 receptor
The affinity of peptides for NRP–1 was assessed as previously described. Briefly, the
surface of the high protein–binding capacity polystyrene 96 well ELISA plate (NUNC
MaxiSorp™, Sigma–Aldrich, France) was coated with NRP–1 at a concentration of 2
μg·mL–1 in phosphate buffer saline (PBS) and kept overnight at room temperature. The
plate was then blocked with a solution of PBS containing 0.5 % bovine serum albumin
(BSA) during 1 h at 37 °C, to inhibit non–specific interactions. Binding of the tested
peptides to NRP–1 was evaluated using 5 ng·mL–1 of biotinylated VEGF–A165 in blocking
buffer containing 2 μg·mL–1 of heparin. Biotinylated VEGF–A165 was added to the coated
wells, in competition, or not, with different concentration of peptide. The plates were
further incubated for 2 h at room temperature. After that, the plates were washed 3 times
and the amount of bound biotinylated VEGF–A165 was assayed as it was stained with
streptavidin horseradish peroxidase conjugate and its substrate (tetramethylbenzidine
and H2O2). After 20 min of incubation at room temperature, the reaction was stopped by
the addition of 2N sulfuric acid. The corresponding optical densities were then measured
at a wavelength of 450 nm. The obtained results were expressed as relative absorbance to
261
glioblastome
wells containing only blocking buffer. For this assay, three wells were used per
condition.129,131
II.3.3. Results and Discussion
II.3.3.1. Validation of docking calculations
The validation of docking protocol was conducted by re–docking the co–crystallized L–
homoarginine found in the NRP–1 structure in PDB within its native binding site in the
receptor. This was done by using the same software for docking simulation; the Autodock
4.2. The docked conformation with the lowest FEB was compared to the native ligand
structure in term of the RMSD value. It was found that the RMSD value of the re–docked
L–homoarginine was 1.47 Å and this showed that the docking protocol used in this study
is valid. A RMSD value of less than 2.0 Å is necessary to confirm the validity of a docking
protocol.
II.3.3.2. Molecular docking
The tLyp–1 peptide CGNKRTR (17) and its ALA–scan analogues (CGNKRTA (18),
CGNKRAR (19), CGNKATR (20), CGNARTR (21), CGAKRTR (22), CANKRTR (23),
AGNKRTR (24)) were used in this docking simulation study. The FEB, predicted Ki, and
number of hydrogen bonds from each docking is shown in Tableau 16.
Tableau 16 : FEB, predicted Ki and number of hydrogen bonds of all ligands tested.
Peptides
Docking
Results CGNKRTR CGNKRTA CGNKRAR CGNKATR CGNARTR CGAKRTR CANKRTR AGNKRTR
17 18 19 20 21 22 23 24
ΔGba –1.60 –4.81 –3.24 –6.17 –3.59 –2.98 –4.84 –4.41
Kib (mM) 67.70 298.72 x10–3 419 29.89 x10–3 2.35 6.55 285.57 x10–3 581.80 x10–3
HBc 9 7 10 7 9 6 12 7
Notes: aFEB (kcal.mol–1); bdocking predicted inhibition constant; cnumber of hydrogen bond interactions (Ki: inhibition
constant; HB: hydrogen bond).
From the results obtained, CGNKATR (20) showed the lowest FEB. The docking
conformation of this analogue is presented in Figure 67.
262
glioblastome
Figure 67: Ligand–protein complex of peptide CGNKATR. Ligands are shown in yellow while hydrogen bonds are
shown in green.
The original peptide CGNKRTR (17) (Figure 68) interacted with Tyr–297, Gly–318,
Glu–348, and Thr–413 through hydrogen bonding, Asp–301 through attractive
electrostatic charge and Asp–320 through π–sulphur interaction. This peptide also has
hydrophobic interactions with the receptor through Gln–296, Asn–300, Pro–317, Glu–319,
Tyr–353, and Gly–414.
In comparison to the analogue CGNKATR (20) (Figure 69), this analogue interacted
with Pro–317, Glu–348, Thr–349, and Thr–413 through hydrogen bonding, Asp–320
through attractive electrostatic charge and Asp–320 through π–sulphur interaction. It
also interacted with the following residues through hydrophobic interactions, Tyr–297,
Gln–298, Asn–300, Trp–301, Thr–316, Pro–317, Ser–346, Lys–351, Tyr–353, and Ile–415.
The amino acid residues involved in the interaction between the CGNKRTR (17) and
the NRP–1 resemble similarly with the result that we obtained in our previous
publication.130 The TKPPR peptide analysed in the publication also interacted with
Tyr297, Asp320, Glu348 and Tyr353, and it was found that the peptide was stacked
between Tyr297 and Tyr 353, similar to the tLyp–1 peptide. The CGNKATR (20) analogue
that gave a lower FEB, showed interactions that are more similar with TKPPR. It
263
glioblastome
interacted with all amino acids reported to be interacting with TKPPR, proving its higher
affinity towards NRP–1 as compared to the tLyp–1.130
Figure 68: 2D diagram of ligand–protein complex of peptide CGNKRTR (tLyp–1), 17.
264
glioblastome
Figure 69: 2D diagram of ligand–protein complex of peptide CGNKATR, 20.
The conformation of these two ligands were different in the binding pocket of NRP–1,
which lead to the difference in term of their interactions with specific amino acids. This is
because the presence of alanine (A) in CGNKATR (20), which is the simplest amino acid,
has caused changes in the torsion of the molecule as compared to the tLyp–1 peptide. The
absence of a longer side chain in the middle of CGNKATR (20) may have allowed it to bind
more tightly at the binding site of NRP–1, thus allowing the terminal arginine of
CGNKATR (20) to avoid the hydrogen donor–donor interaction with residue Trp–411. This
situation may be the reason for the lower FEB of this analogue as compared to CGNKRTR
(17).
The difference between these two peptides are also reflected in their Ki values. The Ki
of CGNKATR (20) analogue is much lower than the tLyp–1 peptide, showing that the
analogue has a higher affinity towards NRP–1 receptor.
265
glioblastome
II.3.3.3. Synthesis and characterization of the peptides
The peptides CGNKRTR (17) and its ALA–scan analogues (CGNKRTA (18),
CGNKRAR (19), CGNKATR (20), CGNARTR (21), CGAKRTR (22), CANKRTR (23),
AGNKRTR (24)) were synthesized on solid phase and purified by HPLC leading to a final
purity superior to 95%. The structures of the peptides were confirmed by NMR and mass
spectrometry (see materials and methods section). The 1H NMR spectra revealed, for all
the peptides of Alascan containing the glycine, a doubling of the signal of NH α of this last
amino acid was observed indicating the existence of two conformations for this amino acid.
Surprisingly, this doubling of the signal was not observed for the original peptide,
indicating a change in the conformation of the peptide. Moreover, at this same position,
when the glycine was replaced by an alanine, only one signal was observed for NH α. The
signal corresponding to the NHα of the cysteine was not observed probably due to the
position N–terminal of this amino acid and thus a protonation of this amine function for
all the peptides.
II.3.3.4. Affinity for NRP–1
The affinity of the peptides was determined using ligand binding assay (LBA).
VEGF165 has a high affinity for NRP–1205 and was chosen as a competitor of the
synthesized peptides (Figure 70). We observed a value of IC50 similar for the peptides
KDKPPR and tLyp–1 indicating the efficient potential of this last one for NRP–1
targeting. The results highlighted that the C–terminal arginine is essential for the affinity
of NRP–1 according to the CendR motif. Moreover, the importance of the other arginine
and the lysine was also observed. However, it appeared that the cysteine and the glycine
are not involved in the good affinity of the tLyp–1.
266
glioblastome
Figure 70 : NRP–1 binding of peptides obtained using a competitive binding assay.
II.3.4. Conclusion
In this paper, we reported the molecular docking, the synthesis and the binding affinity
tests of the Alascan of the peptide tLyp–1. The molecular docking and the affinity studies
seem to give opposite observations. In fact, docking gives an idea on the “possible”
interacting amino acids with the receptor, but it is not conclusive. Docking results alone
are not strong enough to confirm the interaction between peptides and NRP–1 and in vitro
study is needed to proof the finding. Nowadays, there is a reverse approach in docking. We
do the experiment first, then the best results/ligand(s) obtained will be docked on the
receptor, to explain why it/they have good interactions. It is very tricky to relate the
results, at times. Because in docking, there are lots of receptor protein in the protein data
bank. Each has different resolution, with potential missing amino acids residues in each
of the model. So, based on our understanding, it is important to compare the docking
results with the LBA/in vitro study, but the results from experiments are stronger and
conclusive.
267
glioblastome
Concerning the affinity study, the fact that the cysteine is not essential could be useful
for future synthesis. Indeed, the fixation of this last amino acid to the peptide is difficult
and thus it could be removed or replaced by another amino acid.
268
glioblastome
III. Amélioration de la solubilité
III.1. Utilisation des cyclodextrines
Les cyclodextrines (CDs) appartiennent à la famille des oligosaccharides cycliques
constituées d’unités D–glucopyranoses liées entre elles par des liaisons α–1,4. Elles sont
produites naturellement par la dégradation enzymatique de l’amidon. Ces composés
présentent de nombreux avantages : ils sont biocompatibles, solubles dans l’eau et non
hygroscopiques. Trois familles de CDs naturelles sont parmi les plus utilisées : les α–, β–
et γ–CDs constituées respectivement de 6, 7 et 8 unités D–glucopyranoses (Figure 71).
Figure 71 : Structures chimiques des CDs naturelles.
Les CDs ont une forme conique et possèdent une cavité hydrophobe et une surface
hydrophile.206 Grâce à cette cavité, les CDs sont capables de servir d’hôtes pour des
molécules hydrophobes et ainsi améliorer leur solubilité par formation de complexes
d’inclusion.
La β–CD présente le meilleur compromis en termes de taille de sa cavité pour
l’inclusion de PSs. En revanche la γ–CD est la plus efficace, en raison de sa plus forte
solubilité dans l’eau, pour améliorer la solubilité par la formation de conjugués par liaison
covalente avec des PSs. En revanche, son coût est relativement élevé en comparaison avec
la β–CD.207
269
glioblastome
Nous avons décrit, dans une revue, leur utilisation en PDT pour des applications
antitumorales et notamment la formation de systèmes CD–PS afin d’améliorer la
solubilité et les propriétés photophysiques du PS en milieu aqueux.207 Une première
stratégie consiste en la formation de complexe d’inclusion (lien non covalent), c’est–à–dire
l’encapsulation du PS dans la cavité hydrophobe de la CD. Une seconde stratégie repose
sur la formation de conjugués CD–PS par liaison covalente entre les deux unités.
L’utilisation de la β–CD pour améliorer la solubilité de la P1–COOH et de la
5,10,15,20–Tétrakis(méso–hydroxyphényl)porphyrine (mTHPP) dans l’eau et leur
efficacité PDT a déjà été étudiée par notre équipe.208 Les deux PSs ont été liés à la β–CD
par complexes d’inclusion et la P1–COOH a également été conjuguée de manière covalente
par chimie click. Les deux systèmes ont montré une diminution de l’agrégation des PSs.
Les études in vitro sur des cellules U87 ont montré une meilleure phototoxicité lorsque le
PS est conjugué à la β–CD par liaison covalente (Figure 72). De ce fait, nous avons choisi
de coupler la β–CD de manière covalente à notre système.
270
glioblastome
Figure 72 : Viabilité cellulaire de cellules U87 traitée avec les complexes d'inclusion formé avec m–THPP (A) et la P1–
COOH (B) et le conjugué (C). Extraite de Ben Mihoub et al.208
III.2. Couplage de la β–CD au peptide et PS
III.2.1. Synthèse du composé β–CD–KK(Pyro–a)DKPPR (28)
La stratégie sélectionnée repose sur le couplage de la β–CD au peptide, préalablement
couplé au PS, par chimie click et plus particulièrement par addition de Michael thiol–
maléimide. Pour cela, un bras maléimide a été greffé sur l’extrémité N–terminale du
peptide et une fonction hydroxyle de la β–CD a été substituée par un thiol (β–CD–SH).209
Nous avons choisi de réaliser cette conjugaison, dans un premier temps, sur le PS
couplé au peptide KDKPPR sans l’Alc2 afin d’optimiser les conditions de synthèse.
271
glioblastome
Figure 73 : Synthèse du composé 28. (i) Couplage : Fmoc–Lys(Boc)–OH, HBTU, NMM, NMP, DMF, 12 h, Ta (ii)
déprotection : 20% pipéridine dans le DMF, 4 x 15 min, tamb, (iii) Couplage : Acide 6–Maléimidohexanoïque, HBTU, NMM,
NMP, DMF, 12 h, tamb, (iv) TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5), 2 h, tamb et (v) β–CD–SH, PBS, DMF, 24 h, 40°C.
En ce qui concerne la conjugaison de la β–CD, une lysine supplémentaire a été couplée
au composé 25 dans les mêmes conditions de couplage (HBTU, NMM, NMP, DMF) que
celles utilisées pour la synthèse de ce dernier décrites dans le Chapitre II. Toujours selon
272
glioblastome
le même mode opératoire et après déprotection de la fonction amine en position N–
terminale, le bras acide 6–Maléimidohéxanoïque a été couplé au composé 26 pour conduire
au composé 27 après clivage de la résine et déprotection des chaînes latérales. La réaction
de chimie click avec la β–CD–SH (préalablement synthétisée au cours d’un autre projet et
disponible au sein du laboratoire) a ensuite été réalisée dans un mélange PBS/DMF et
conduit à la formation du composé 28 avec un rendement de 26% après purification par
HPLC préparative (Figure 73).
III.2.2. Amélioration de la solubilité
L’amélioration de l’hydrophilie de la Pyro–a a été démontrée en RPLC avec un gradient
de 10 à 100% ACN dans l’eau + 0,1% TFA suivi d’un isocratique à 100% ACN + 0,1% TFA
pendant 10 min. Le temps de rétention de la Pyro–a est de 18,9 min et de 11,4 min, couplée
au peptide et à la β–CD (Tableau 17).
Tableau 17 : Récapitulatif des propriétés de solubilité dans l’eau des composés Pyro–a et β–CD–KK(Pyro–a)DKPPR.
Composés Temps de retention Log P
Pyro–a 18,9 min 0,97
28 11,4 min –0,68
La solubilité des composés dans l’eau a été déterminée à l’aide du coefficient de partage
log P. Une diminution significative de sa valeur lorsque la Pyro–a est couplée au peptide
et à la β–CD a pu être mise en évidence prouvant ainsi l’efficacité de la β–CD pour
améliorer la solubilité de la Pyro–a (Tableau 17).
III.2.3. Propriétés photophysiques
L’influence du couplage de la β–CD sur les propriétés photophysiques de la Pyro–a a
également été évaluée. Une augmentation importante de l’ε de la bande de Soret a pu être
observée pour le composé couplé à la β–CD. Une augmentation du Φf a pu être observé,
273
glioblastome
une légère différence a été déterminée pour la τ f. En revanche, une amélioration
significative de ΦΔ a été mise en évidence.
Figure 74 : Spectres d’absorption UV–visible normalisées des composés Pyro–a et 28 dans le D2O.
Tableau 18 : Coefficients d’extinction molaire ε, rendements quantiques de fluorescence (Φ f) et d'1O2 (ΦΔ) des
composés Pyro–a et 28, mesurés après excitation à 388 nm et durée de vie de fluorescence (τ f) mesurée à 407 nm et
d’1O2 (τΔ) mesurée à 415 nm mesurés dans le D2O.
ε (103) (L.mol–1.cm–1)
Composé Bande de QIV QIII QII QI Φf (%) ΦΔ τf (ns) τΔ (µs)

Soret (%)
Pyro–a 22,9 2,0 1,8 2,1 9,2 <1 – 6,7 –
28 33,3 3,4 3,6 3,6 10,0 6 16 7,5 19,6
Ces résultats, combinés à l’augmentation de l’hydrophilie du composé, font de la β–CD
un composé prometteur.
274
glioblastome
IV. Amélioration de l’alcoxyamine

L’alcoxyamine (Alc1) étudiée dans le chapitre II présentait l’inconvénient de ne pas
absorber la lumière dans le domaine visible et rendait par conséquent son application pour
des études in vitro impossible. Nous avons, par conséquent, étudié un nouveau modèle.
IV.1. Choix de la structure
Outre le problème de la longueur d’onde d’illumination, un problème de stabilité de
nos plateformes a été observé. En effet, après que les composés soient restés deux jours en
solution dans le DMSO pour le besoin des analyses RMN, une apparition du composé
d’homolyse a été observée en HPLC pour les composés 16 et 14. Ceci peut s’expliquer par
une force de liaison (BDE) C–ON trop faible dans le cas d’une alcoxyamine avec le motif
R–SG1. En effet, Gaudel–Siri et al.210 ont étudié l’évolution de la valeur de la BDE pour
différentes alcoxyamines. Ils ont notamment évalué sa valeur pour la liaison C–ON
d’alcoxyamines contenant un nitroxyde SG1 ou TEMPO lié à différents groupements
alkyles. Ils ont constaté que, quelque soit la nature du groupement alkyle, la valeur de la
BDE de la liaison C–ON était plus faible pour les alcoxyamines contenant le nitroxyde
SG1. Pour pallier ce problème de stabilité, nous avons choisi de modifier la nature du
nitroxyde de Alc1 en remplaçant le motif SG1 par un motif 4–carboxy–TEMPO possédant,
par conséquent, une BDE plus importante.
Concernant la partie alkyle, elle a été choisie afin de décaler le spectre d’absorption
dans le domaine du visible à 475 nm. Le motif choisi est un dérivé du DNPH (2,4–
Dinitrophenylhydrazine), l’Ethanone, 1–(4–éthylphenyl)–, 2–(2,4–dinitrophényl)
hydrazone. La molécule alors obtenue est donnée en Figure 75 et sera notée Alc2 dans la
suite de ce chapitre.
275
glioblastome
Figure 75 : Structure chimique de Alc2.
Cette molécule présente une absorption entre 320 et 500 nm (Figure 76). De plus, elle
possède une fonction acide permettant son couplage à un peptide.
Figure 76 : Spectre d'absorption UV–visible normalisée de Alc2 dans le DCM.
IV.2. Couplage d’Alc2 aux différents peptides
IV.2.1. Synthèse du composé Fmoc–K(Alc2) (30)
Afin de conserver l’extrémité N–terminale du peptide disponible pour le greffage d’une
β–CD, il a été choisi d’utiliser la même technique que celle utilisée pour le greffage du PS
au peptide, à savoir le couplage en solution à une lysine. L’Alc2 a donc été couplée sur la
276
glioblastome
chaîne latérale d’une lysine, après activation préalable de sa fonction acide en présence de
NHS comme décrit dans le Chapitre II (Figure 77).
Figure 77 : Couplage de Alc2 à la lysine. (i) NHS, EDCI, DCM/DMF, 12 h, 40°C et (ii) Fmoc–Lys–OH, Et3N, CHCl3/DMF, 12
h, tamb.
Cette synthèse a permis d’obtenir le composé 30 avec un rendement global de 70% et
une pureté supérieure à 98% après purification par chromatographie sur colonne de silice.
IV.2.2. Essais de couplage de Alc2 au peptide
Le couplage du composé 30 au peptide a tout d’abord été testé en l’absence du PS pour
optimiser les conditions de couplage dans un environnement présentant un encombrement
stérique réduit.
Le couplage du composé 30 au peptide KDKPPR a été effectué dans deux types de
conditions (i) celles du couplage de Alc1 au peptide KDKPPR, à savoir en présence de
PyBOP et DIPEA et (ii) celle du couplage du Fmoc–K(Pyro–a) au peptide DKPPR, à savoir
en présence de HBTU, de NMM et de NMP.
277
glioblastome
Figure 78 : Couplage du composé 30 au peptide 17. (i) PyBOP, DIPEA, DMF, 12 h, tamb et (ii) HBTU, NMM, NMP, DMF, 12
h, tamb.
A l’issu de ces deux essais de couplage, un micro–clivage a été effectué et une
disparition totale du produit de départ a été observé en LC–MS. En revanche, bien que le
produit attendu ait été observé, il était minoritaire et d’autres produits se sont formés
(Figure 79). Il est intéressant de noter que les mêmes produits secondaires sont détectés
dans les deux conditions réactionnelles, avec des proportions différentes.
Figure 79 : Chromatogramme HPLC obtenu, selon un gradient de 10 à 100% de ACN dans l’eau + 0,1% HCOOH en 15
min suivi d’un isocratique à 100% ACN + 0,1% HCOOH pendant 10 min à un débit de 0,8 mL.min–1, à l’issu des essais
de couplage du composé 30 au peptide KDKPPR en présence de (A) PyBOP, DIPEA, DMF ou (B) HBTU, NMM, NMP,
DMF. 1, [M+H]+ = 1420 Da ; 2, [M+H]+ = 1518 Da ; 3, [M+H]+ = 1601 Da (produit attendu) et 4, produit non ionisé en
masse.
278
glioblastome
En effet, dans le cas du couplage (A), le pic majoritaire est le pic 2 correspondant à une
perte de masse de 83 ([M+H]+ observée= 1518 Da) par rapport au produit attendu ([M+H]+
observée= 1601 Da). La nature de ce composé n’a pas été identifiée.
En revanche, dans le cas du couplage (B), le pic majoritaire est le pic 1 correspondant
à une perte de masse de 181 ([M+H]+ observée= 1420 Da) par rapport au produit attendu.
Ce produit secondaire formé correspond au composé d’hydrolyse en milieu acide de la
fonction hydrazone du composé 31, déprotégé sur ses chaines latérales et clivé de la résine,
dont le mécanisme est décrit en Figure 80. Cette observation nous indique que le produit
souhaité a pu être formé majoritairement, mais s’est ensuite dégradé lors du clivage du
support et la déprotection des chaînes latérales du peptide, en milieu acide.
279
glioblastome
Figure 80 : Mécanisme de l'hydrolyse du composé 31, déprotégé sur ses chaines latérales et clivé de la résine, durant
le clivage. Adaptée de Kalia et al.211
Ces observations nous indiquent que le motif DNPH n’est peut–être pas le plus indiqué
en terme de stabilité dans nos conditions de synthèse.
IV.3. Homolyse
Sous illumination, cette alcoxyamine doit être capable de générer d’une part un radical
alkyle et d’autre part le carboxy–TEMPO comme nitroxyde (Figure 81).
280
glioblastome
Figure 81 : Homolyse de Alc2 sous excitation lumineuse.
La photolabilité d’Alc2 sous illumination à 475 nm à une puissance de 22 mW.cm –2 a
été vérifiée dans des conditions similaires à celles utilisées dans le Chapitre II. Dans un
premier temps, l’Alc2 a été illuminée en solution dans le MeOH à une concentration de
480 µM. Aucun signal correspondant à la génération du nitroxyde n’a été observée après
1h45 (Figure 82).
Figure 82 : Signal RPE obtenue après 1h45 d'illumination à 475 nm (22 mW.cm –2) d'Alc2 en solution dans le MeOH à
480 µM.
Il a d’abord été envisagé que les radicaux formés se réarrangeaient trop rapidement
pour être observés et un quencheur (TEMPOL) a alors été ajouté à la solution pour vérifier
cette hypothèse. Après une heure d’illumination, aucune homolyse n’a pu être de nouveau
détectée.
281
glioblastome
Ayant observé précédemment une homolyse rapide de Alc1 aux grandes
concentrations, nous avons augmenté la concentration pour tenter d’observer l’homolyse
de Alc2. Malheureusement, le manque de solubilité d’Alc2 dans le MeOH ne nous a pas
permis d’étudier son homolyse. Par conséquent, il a été décidé d’utiliser un autre solvant,
le DMSO. Une solution à 3 mM dans le DMSO a alors été illuminée. Un début d’homolyse
a pu être mis en évidence après 1 heure d’illumination (Figure 83). En revanche, un signal
correspondant à seulement 0,2% de nitroxyde généré a pu être observé.
Figure 83 : (A) Evolution de l’intensité RPE du 4–carboxy–TEMPO au cours de l’illumination à 475 nm dans le DMSO à 3
mM et (B) Signal RPE du nitroxyde généré après une heure d’illumination.
hν
Selon l’équation (9) décrite dans le Chapitre I, E = , l’énergie est inversement
λ
proportionnelle à la longueur d’onde. En effet, plus la longueur d’onde utilisée est élevée,
moins le rayonnement est énergétique et nous pouvons donc supposer qu’à une longueur
d’onde de 475 nm, l’énergie envoyée sur l’Alc2 n’est pas suffisante pour générer une
homolyse rapide du composé. Pour vérifier cette hypothèse, la solution d’alcoxyamine dans
le DMSO a été illuminée à 360 nm à une puissance similaire (17,2 mW.cm –2) pendant une
heure. Comme précédemment, un faible signal a été observé. La génération de nitroxyde
est plus rapide dans ces conditions avec une concentration en nitroxyde de l’ordre de 0,7%
généré au bout d’une heure d’illumination (Figure 84).
282
glioblastome
Figure 84 : (A) Evolution de l’intensité RPE du 4–carboxy–TEMPO au cours de l’illumination à 360 nm dans le DMSO à 3
mM et (B) Signal RPE du nitroxyde généré après une heure d’illumination.
Les résultats obtenus indiquent que le modèle d’alcoxyamine choisie n’est pas optimal
pour des applications in vitro puisqu’il nécessite de fortes concentrations de composé pour
générer l’homolyse du composé à une puissance faible au bout d’un temps d’illumination
long. L’utilisation d’une source lumineuse possédant une plus forte puissance pourrait
permettre d’accélérer cette homolyse mais ne serait pas souhaitable pour des applications
biologiques.
V. Conclusion
Dans ce chapitre, nous nous sommes intéressés à l’amélioration des plateformes
décrites dans le chapitre précédent selon trois aspects : (i) le ciblage par internalisation de
nos plateformes dans les cellules, (ii) l’amélioration de la solubilité par utilisation de β–
CDs et (iii) le développement d’une alcoxyamine homolysable sous l’illumination dans le
domaine du visible compatible avec des applications PDT in vitro.
La première partie de ce chapitre a consisté en l’étude d’un nouveau peptide, le tLyp–
1 (CGNKRTR), présentant l’avantage d’être un tumor–homing peptide ainsi que d’être
internalisé dans le noyau des cellules et présentant une toxicité pour les cellules
cancéreuses. L’Alascan de ce peptide a été effectué pour évaluer l’importance de chaque
acide aminé et l’importance des deux arginines et de la lysine a été mise en évidence. En
283
glioblastome
revanche, la cystéine et la glycine ne se sont pas révélées essentielles. Ce constat nous
permettrait de retirer ces acides aminés ou d’utiliser la cystéine comme point d’ancrage
afin de coupler un PS ou une autre molécule par chimie click thiol–maléimide.
Dans un second temps, la β–CD a été couplée avec succès sur le peptide et le PS et a
permis d’améliorer la solubilité du composé. En effet, un plus faible temps de rétention en
RPLC a été observé pour le composé 28 ainsi qu’un plus faible log P (log P (Pyro–a) = 0,97
et log P (composé 28) = –0,68). De plus, le rendement quantique de production d’1O2 dans
le D2O est de 16 % alors qu’aucune production n’était observée pour le PS seul.
La dernière partie a consisté en l’étude d’une nouvelle alcoxyamine (Alc2). Après
greffage d’Alc2 sur une lysine en solution, des essais de couplage du composé formé sur le
peptide KDKPPR ont été effectuées par SPPS et ont révélé une instabilité de la structure
d’Alc2 dans les conditions de clivage en milieu acide. De plus, la photolabilité de Alc2 a été
évaluée sous illumination à 475 nm dans le MeOH et aucun signal d’homolyse n’a pu être
observé dans ces conditions. Un changement de solvant (DMSO) permettant une
augmentation considérable de la concentration a permis d’observer 0,2% d’homolyse après
1 heure d’illumination à 475 nm (22 mW.cm –1) et 0,7% à 360 nm (17,2 mW.cm–2). Ces
dernières observations ont conduit à rejeter ce modèle d’alcoxyamine pour de futures
études in vitro puisque les temps d’illumination et les concentrations utilisées sont
beaucoup trop élevés. Deux hypothèses peuvent expliquer cette constatation, d’une part le
changement du nitroxyde de SG1 au 4–carboxy–TEMPO conduisant à une force de la
liaison C–ON plus importante et donc plus difficile à homolyser et, d’autre part par le fait
que la lumière à 475 nm ne possède pas assez d’énergie pour induire une coupure efficace
de l’alcoxyamine.
284
CONCLUSIONS ET
PERSPECTIVES
285
286
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Depuis les années 70, l’intérêt pour la PDT ne cesse de croître pour le traitement de
nombreux cancers. En revanche, bien que grandement étudiée, elle continue de présenter
des inconvénients limitant son développement. En effet, de nombreux PSs ont été
commercialisés dans le monde mais la plupart d’entre eux ne sont pas ou peu sélectifs des
tissus tumoraux. De plus, la PDT présente une nécessité en oxygène pour être efficace.
Cette thèse a consisté en l’amélioration de ces deux aspects.
Pour cela, la preuve de concept reposant sur le développement d’une plateforme

trimodale (14), spécifique des néovaisseaux tumoraux, par fixation sur le récepteur NRP–
1, et présentant une efficacité à la fois en milieux hypoxique et normoxique, a été
développée. Cette plateforme, combinant un PS (Pyro–a) pour une PDT dépendante de
l’oxygène, une alcoxyamine (SG1–benzophénone) pour une action indépendante de
l’oxygène et un peptide (KDKPPR) pour cibler NRP–1, a été synthétisée avec succès ainsi
que les plateformes bimodales servant de références. Les propriétés de chacune des unités
ont ensuite été évaluées à savoir les propriétés photophysiques de la Pyro–a, la
photolabilité de l’alcoxyamine et l’affinité de KDKPPR pour NRP–1. L’étude des propriétés
photophysiques n’a pas montré d’interférences majeures de l’alcoxyamine et du peptide
sur les capacités d’émission de fluorescence et de production d’1O2 de la Pyro–a. L’étude de
photolabilité de l’alcoxyamine a montré un effet protecteur du peptide mais également une
compétition entre le PS et l’alcoxyamine, ces derniers absorbant tous les deux la lumière
UV. La génération de radicaux médiée par l’homolyse de l’alcoxyamine a été ralentie mais
n’a pas été bloquée par la compétition avec la Pyro–a ne modifiant pas ainsi les propriétés
de photolabilité de l’alcoxyamine. Une très bonne affinité de la plateforme trimodale (14)
pour le récepteur NRP–1 a été mise en évidence (CI50 = 0,46 µM) en comparaison avec le
peptide seul (CI50 = 11,5 µM).
Cette preuve de concept n’a, cependant, pas permis l’évaluation biologique in vitro de
cette plateforme car l’illumination UV utilisée pour l’homolyse de l’alcoxyamine n’est pas
compatible avec un traitement PDT in vitro.
Le second chapitre a consisté en l’amélioration de la plateforme développée selon trois

axes importants i) le ciblage du récepteur NRP–1 par le peptide tLyp–1 connu pour être
internalisé au sein de la cellule, ii) l’amélioration de la solubilité en milieu aqueux par
ajout d’une β–CD et iii) le développement d’une alcoxyamine homolysable par la lumière
visible pouvant être ainsi étudiée dans une application PDT in vitro.
287
Dans une première partie, un tumor–homing peptide, le tLyp–1 (CGNKRTR),

internalisé dans les cellules cancéreuses a été étudié. L’importance de chaque acide aminé
pour l’affinité du peptide envers le récepteur NRP–1 a été déterminée par une étude
« Alascan », c’est–à–dire le remplacement successif de chaque acide aminé par une
alanine. Cette étude a démontré l’importance des deux motifs arginine et de la lysine pour
la reconnaissance de NRP–1 concordant avec le motif CendR. Le couplage de la cystéine
s’étant révélé difficile, son importance révélée négligeable dans la séquence peptidique
peut donc permettre de la supprimer, le peptide GNKRTR sera synthétisé et son affinité
pour NRP–1 évaluée. Cette cystéine pourrait être sinon utilisée pour le couplage d’un PS
par réaction de chimie click thiol–maléimide. La glycine ne s’étant également pas révélée
essentielle, il serait intéressant de synthétiser également le peptide NKRTR et mesurer
son affinité.
Bien que l’affinité pour NRP–1 ait été déterminée par test LBA, il serait intéressant
par la suite de conjuguer un fluorophore sur le peptide à son extrémité N–terminale pour
étudier l’internalisation du peptide tLyp–1 et des peptides GNKRTR et NKRTR par
microscopie de fluorescence pour déterminer leur localisation intracellulaire.
Dans une seconde partie, la conjugaison de la β–CD au peptide et à la Pyro–a a été

effectuée afin d’améliorer la solubilité de la Pyro–a dans l’eau et par conséquent, améliorer
ses propriétés photophysiques. L’augmentation de la solubilité de la Pyro–a par
conjugaison avec la β–CD a été observée en RPLC par un temps de rétention du composé
beaucoup plus faible (11,4 min) que pour la Pyro–a (18,9 min) et une diminution du log P
(log P (Pyro–a) = 0,97 et log P (composé 28) = –0,68). En effet, une très faible fluorescence
et aucune production d’1O2 n’ont été observées dans le D2O pour la Pyro–a seule et
conjuguée au peptide KDKPPR. La conjugaison de la β–CD a conduit à une amélioration
significative de la production d’1O2 avec un ΦΔ de 16% (ΦΔ (Pyro–a) = 0%). Il serait
intéressant d’évaluer ce composé in vitro pour déterminer son impact sur la phototoxicité
de la Pyro–a.
Dans la dernière partie, une nouvelle alcoxyamine possédant une partie nitroxyde
carboxy–TEMPO et une partie alkyle basée sur la DNPH, notée Alc2, a été étudiée. Alc2
a été couplée avec succès à une lysine en solution pour conduire au composé 30 puis des
essais de couplage au peptide KDKPPR ont été effectués par SPPS. Le composé 31,
déprotégé sur ses chaines latérales et clivé de la résine, a été formé mais avec un
rendement très faible et une instabilité du composé en milieu acide a été révélée.
288
En parallèle, Alc2 a été illuminée sous lumière bleue à 475 nm dans le MeOH et aucune
homolyse n’a pu être observée dans de telles conditions. Une faible solubilité de Alc2 dans
le MeOH ne permettant pas d’étudier des concentrations de l’ordre du mM, un changement
de solvant (DMSO) a été effectué et une faible homolyse (0,2% de conversion) a été
observée après 1 heure d’illumination à 475 nm à une puissance de 22 mW.cm–2. Une
illumination à 360 nm a révélé une homolyse légèrement plus rapide mais qui reste tout
de même faible (0,7%). Cette homolyse insuffisante a permis de conclure que ce modèle
d’alcoxyamine n’était pas optimal pour de futures études in vitro. Ceci peut s’expliquer par
une force de la liaison C–ON trop importante pour être efficacement homolysée due au
changement de nitroxyde par rapport au Chapitre II et/ou par le fait que la lumière bleue
est moins énergétique que la lumière UV et que l’énergie émise est donc insuffisante pour
induire une homolyse.
Pour de futures études, il serait pertinent de garder, dans un premier temps, la même
partie alkyle pour l’alcoxyamine (motif basé sur le DNPH) et de remplacer la partie
nitroxyde carboxy–TEMPO par le SG1 pour étudier l’influence de la force de liaison sur la
photolabilité de l’alcoxyamine. Si ce changement se révélait efficace, il faudrait modifier
la stratégie de synthèse utilisée pour le greffage de l’alcoxyamine, la partie alkyle étant
dégradé en milieu acide. Pour cela, une idée serait de coupler l’alcoxyamine au peptide par
chimie click CuAAC, la réaction thiol–maléimide étant déjà utilisée pour le couplage de la
β–CD–SH. Le problème de cette approche est l’utilisation de cuivre pour la cycloaddition
azoture–alcyne ayant déjà posée un problème avec la Pyro–a. Pour contourner cette
difficulté, la stratégie pourrait être de ne pas greffer la Pyro–a par SPPS mais par chimie
click thiol–maléimide à la place de la β–CD–SH (Figure 85).
289
Figure 85 : Nouvelle stratégie de synthèse envisagée.
Pour cela, la β–CD–NH2 serait synthétisée puis couplée sur le peptide par formation
d’un lien urée. Une lysine fonctionnalisée par un bras azoture et une cystéine serait
ensuite couplée au peptide. En parallèle, la Pyro–a et l’alcoxyamine seraient
fonctionnalisées par un bras maléimide et un bras alcyne respectivement. La réaction
CuAAC entre le peptide clivé de la résine et l’alcoxyamine fonctionnalisée serait d’abord
effectuée, suivi de la réaction thiol–maléimide avec la Pyro–a.
Si l’homolyse se révélait en revanche inefficace après la modification de la partie

nitroxyde, il faudrait envisager une modification des conditions d’illumination pour
l’homolyse de l’alcoxyamine. Pour cela, il serait intéressant de greffer notre plateforme à
des NPs excitables par les rayons X, beaucoup plus énergétiques que la lumière visible, et
pouvant ensuite transférer leur énergie par FRET à la plateforme, à la fois à la Pyro–a et
à l’alcoxyamine. L’utilisation de NPs permettrait également de résoudre le problème de
solubilité dans l’eau de la plateforme.
Une autre solution serait de développer une alcoxyamine pouvant être excité par un
processus biphotonique.
290
PARTIE
EXPERIMENTALE
291
292
PARTIE EXPERIMENTALE
I. Synthèse et caractérisations des composés
I.1. Produits chimiques
Tous les produits chimiques commerciaux ont été utilisés sans autre purification. La
Pyro–a a été achetée auprès de BOC Sciences (Shirley, NY, USA). Le PyBOP a été acheté
auprès de Merck (Darmstadt, Allemagne). La résine Fmoc–Arg(Pbf)–Wang, les Fmoc–
acide aminé–OH et le HBTU ont été achetés auprès d’Iris Biotech GmbH (Marktredwitz,
Allemagne). L'acétate d’éthyle, l’acétate de zinc, l’anhydride acétique, le DCM, le DMF, le
DMSO, l’EDCI, l’éther diéthylique, l’éther de pétrole, l’EtOH, l'hydrochlorure de Fmoc–
Lys–OH, le NHS, la propargylamine, le 1–octanol et le TFA ont été achetés auprès de
Sigma–Aldrich (St Louis, MO, USA). La N–méthylmorpholine (NMM), la N–
méthylpyrrolidinone (NMP), la N,N–diisopropyléthylamine (DIPEA) et le
triisopropylsilane (TIPS) ont été achetés auprès d’Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA).
L’acide 6–maléimidohéxanoïque, l’acétonitrile (ACN), le chloroforme et le MeOH ont été
achetés auprès de Biosolve (Dieuze, France). La triéthylamine a été achetée auprès de
Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, États–Unis). La pipéridine a été achetée auprès
d’Acros Organics. Le THF a été acheté auprès de VWR (Radnor, PA, États–Unis). La β–
CD–SH a été synthétisée au sein de l’équipe.212 De l'eau ultrapure (Milli–Q, ρ >18 MΩ⋅cm)
a été utilisée pour la préparation des solutions aqueuses.
I.2. Instruments
Les chromatographies analytiques sur couche mince (CCM) ont été réalisées en
utilisant des plaques Merck Kieselgel 60 F254 ; les tâches ont été détectées par
illumination UV et une solution d'acide phosphomolybdique dans l'EtOH a été utilisée
comme révélateur par chauffage.
Les analyses HPLC ont été faites à l'aide d’une HPLC Shimadzu LC–10ATvp avec une
colonne Agilent Pursuit 5 C18 (5 µm, 150 × 4,6 mm) à un débit de 1 mL.min–1 équipée d'un
détecteur UV à réseau de photodiodes (Varian Prostar 335–190–950 nm) et d'un détecteur
spectrofluométrique (Shimadzu RF–10AXL–200–650 nm). La détection UV a été effectuée
à 415 nm pour la Pyro–a, 260 nm pour Alc, 445 nm pour Alc2, 254 nm pour le groupement
Fmoc et 214 nm pour les peptides. La détection de fluorescence à 650 nm de la Pyro–a a
été réalisée après une excitation à 415 nm. Les solvants utilisés ont été acidifiés avec 0,1%
de TFA.
293
Les spectres RMN 1H, COSY et TOCSY ont été enregistrés dans le DMSO–d6 à
température ambiante (T = 298 K) sur un spectromètre BRUKER AVANCE à 300 MHz.
Les déplacements chimiques (δ) sont donnés en parties par million (ppm) et en utilisant le
pic résiduel du DMSO (δ = 2,5 ppm) comme référence interne. Les constantes de couplage
(J) sont données en hertz (Hz) et les multiplicités sont indiquées comme suit : s = singulet,
d = doublet, dd = doublet dédoublé, t = triplet, q = quadruplet, m = multiplet et br = large.
Les chromatogrammes LC–MS ont été effectués sur une HPLC Shimadzu LC–20AB
avec une colonne Agilent Pursuit 5 C18 (5 µm, 150 × 4,6 mm) à un débit de 0,8 mL.min–1,
équipée d’un dégazeur (Shimadzu DGU–20A3) et d’un détecteur UV à réseau de
photodiodes (Shimadzu SPD–M20A) et couplée à un spectromètre de masse (Shimadzu
LC–MS–2020). Les solvants utilisés ont été acidifiés avec 0,1% d’acide formique. Les
spectres de masse à haute résolution (HRMS) ont été enregistrés sur un spectromètre
Brucker MicroTof–Q HR au "Service commun de Spectrométrie de Masse", Faculté des
Sciences et Technologies (Vandœuvre–lès–Nancy, France).
I.3. Procédures générales
I.3.1. SPPS
Les peptides ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur de peptides ResPepXL
automatisé (Intavis AG, Bioanalytical Instruments) avec une méthodologie Fmoc/tBu. Les
chaînes latérales de l'arginine, de l'acide aspartique et de la lysine ont été respectivement
protégées par les groupes Pbf, OtBu et Boc. Des résines Fmoc–Arg(Pbf)–Wang et Fmoc–
Ala–Wang gonflées dans le DCM ont été utilisées. La déprotection du groupement Fmoc a
été effectuée en présence d’une solution de pipéridine à 20% dans le DMF. Cette étape a
été réalisée deux fois, une première fois pendant 4 min et une seconde fois pendant 7 min.
L'acide aminé suivant a été couplé en ajoutant un excès de Fmoc–AA–OH (6 éq), HBTU (5
éq), NMP (3 éq) et NMM (10 éq) dans le DMF. Cette étape a été répétée deux fois pendant
18 min. Une dernière étape de capping, utilisant une solution d'anhydride acétique à 5%
dans le DMF, a été effectuée pendant 5 min, pour piéger toutes les fonctions amines
n’ayant pas réagi par acétylation. Les étapes de déprotection, de couplage et de capping
ont été répétées jusqu'à la fin de la synthèse du peptide. Les excès de réactifs et les
solutions de pipéridine ont été éliminés par plusieurs lavages avec le DCM, EtOH et DMF.
Les micro–clivages et clivages de la résine, ainsi que la déprotection des chaînes latérales
du peptide, ont été effectuées en présence d’une solution de TFA/TIPS/H 2O (92,5/2,5/5,
v/v/v) pendant 2 h et 1 h respectivement. La résine a ensuite été filtrée et lavée avec du
294
TFA et du DCM. Les filtrats ont ensuite été évaporés sous pression réduite et les composés
ont été précipités dans l’éther diéthylique à froid par centrifugation. Les suivis de réaction
ont été effectués par LC–MS.
I.3.2. Purification par HPLC préparative
Les composés synthétisés par SPPS ont été purifiés avec le même équipement que pour
les HPLC analytiques mais avec une colonne Agilent Pursuit 5 C18 (5 µm, 150 × 21,2 mm)
à un débit de 12 mL.min–1, à l’exception du composé 14 purifié sur une Spot Prep II avec
un système intégré d’Armen Instruments, avec une colonne Agilent Pursuit 5 C18 (5 µm,
150 × 21,2 mm), équipée d'un spectrophotomètre UV/Vis à double longueur d’onde à 415
nm et 214 nm à un débit de 15 mL.min–1.
Les solvants utilisés ont été l’eau et l’ACN respectivement acidifiés avec 0,1% TFA
pour la plupart des composés et avec 0,4% TFA pour le composé 14.
I.4. Synthèse du composé ester Pyro–a–NHS (1)
Dans l'obscurité et sous atmosphère inerte, la Pyro–a (100 mg, 190 µmol, 1 éq) a été
solubilisée dans un mélange anhydre de THF/DMF (20 mL, 80/20, v/v), puis le NHS (32,3
mg, 280 µmol, 1,5 éq) et EDCI•HCl (53,8 mg, 280 µmol, 1,5 éq) ont été ajoutés à la solution.
Le mélange a été agité à 40°C, pendant 23 h. La solution a ensuite été évaporée sous
pression réduite. La purification du produit brut a été effectuée par chromatographie sur
colonne de silice avec un éluant DCM/EtOH (97/3, v/v). Le composé 1 a été obtenu sous
forme de solide bleu foncé avec un rendement de 85% et une pureté HPLC de 97%.
Rf = 0,70 (DCM/EtOH = 97/3, v/v). 1H NMR (300 MHz, DMSO–d6, δ) : –1,96 (s, 1H, NH
pyrrole, interchangeable*), 0,25 (s, 1H, NH pyrrole, interchangeable*), 1,61 (t, J = 7,5 Hz,
3H, CH3CH2–), 1,76 (d, J = 7,2 Hz, 3H, CH3CH–), 2,10 (m, 2H, –CH2CH2COO–), 2,80 (m,
2H, –CH2CH2COO–), 2,85 (m, 4H, CH2 NHS), 3,20 (s, 3H, CH3C=, interchangeable**), 3,42
(s, 3H, CH3C=, interchangeable**), 3,59 (s, 3H, C H3C=, interchangeable**), 3,68 (m, 2H,
CH3CH2–), 4,39 (d, J = 12 Hz, 1H, CHCH2CH2COO), 4,68 (m, 1H, CH3CH–), 5,08 (d, J =
295
20,1 Hz, 1H, =C–CH2CO, interchangeable***), 5,21 (d, J = 20,1 Hz, 1H, =C–CH2CO,
interchangeable***), 6,20 (d, J = 11,7 Hz, 1H, H2C=CH–, cis), 6,37 (d, J = 17,7 Hz, 1H,
H2C=CH, trans), 8,2 (dd, J = 18 Hz et J = 11,7 Hz, 1H, H2C=CH–), 8,87 (s, 1H, β–H, –C–
CH=C–, interchangeable****), 9,42 (s, 1H, β–H, –C–CH=C–, interchangeable****) et 9,70
(s, 1H, –C–CH=C–, interchangeable****). HRMS (ESI+) : m/z calculée pour C37H37N5O5
[M + H]+ 632,2867 ; mesurée [M + H]+ 632,2822. UV/Vis (EtOH) : λmax (log ε) = 410 (4,61),
510 (3,63), 539 (3,61), 607 (3,57), 666 nm (4,28).
I.5. Synthèse du composé Fmoc–K(Pyro–a) (2)
Dans l'obscurité et sous atmosphère inerte à 0°C, le composé 1 (89 mg, 140 µmol, 1 éq)
a été solubilisé dans du chloroforme anhydre (25 mL). La triéthylamine (43 µL, 310 µmol,
2,2 éq) a été ajoutée à la Fmoc–Lys–OH Nε–chlorhydrate (68,5 mg, 170 µmol, 1,2 éq),
initialement solubilisée dans du DMF anhydre (2,5 mL), pour être finalement ajoutée à la
solution d’ester Pyro–a–NHS. Le mélange a alors été agité à température ambiante,
pendant 21 h, sous argon. La solution a ensuite été évaporée sous pression réduite. La
purification du produit brut a été effectuée par chromatographie sur colonne de silice avec
un éluant DCM/EtOH (gradient de 90/10 à 60/40, v/v). Le composé 2 a été obtenu sous
forme de solide bleu foncé avec un rendement de 98% et une pureté HPLC de 97%.
Rf = 0,40 (DCM/EtOH = 90/10, v/v). 1H NMR (300 MHz, DMSO–d6, δ) : –2,01 (s, 1H, NH
pyrrole, interchangeable*), 0,19 (s, 1H, NH pyrrole, interchangeable*), 1,27 (m, 2H, γ–CH2
Lys), 1,54 (m, 4H, β et δ–CH2 Lys), 1,61 (t, J = 7,2 Hz, 3H, CH3CH2C=), 1,77 (d, J = 7,2
Hz, 3H, CH3CH–), 2,09 (m, 2H, –CHCH2CH2COO–), 2,30 (m, 1H, –CHCH2CH2COO–,
interchangeable**), 2,58 (m, 1H, –CHCH2CH2COO–, interchangeable**), 2,97 (m, 2H, ε–
C H2 Lys), 3,19 (s, 3H, CH3C=, interchangeable***), 3,42 (s, 3H, C H3C=,
interchangeable***), 3,58 (s, 3H, CH3C=, interchangeable***), 3,67 (q, J = 7,2 Hz, 2H,
296
CH3CH2C=), 3,79 (m, 2H, α–H Lys), 3,99 (m, 1H, CH Fmoc), 4,07 (m, 2H, CH2 Fmoc), 4,25
(d, J = 8,1 Hz, 1H, CHCH2CH2COO), 4,53 (q, J = 6,9 Hz, 1H, CH3CH–), 5,07 (d, J = 20,1
Hz, 1H, =C–CH2CO, interchangeable****), 5,21 (d, J = 20,1 Hz, 1H, =C–CH2CO,
interchangeable****), 6,18 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H2C=CH–, cis), 6,37 (d, J = 18,0 Hz, 1H,
H2C=CH–, trans), 7,20 et 7,60 (m, 8H, CH phényl–Fmoc), 7,30 (m, 1H, ε–NH Lys), 7,77 (t,
1H, NH Lys), 8,18 (dd, J = 17,7 Hz et J = 11,4 Hz, 1H, H2C=CH–), 8,84 (s, 1H, –C–CH=C–
, interchangeable*****), 9,40 (s, 1H, –C–CH=C–, interchangeable*****), 9,67 (s, 1H, –C–
CH=C–, interchangeable*****), 12,52 (br, 1H, –COOH). HRMS (ESI+) : m/z calculée pour
C55H57N5O5 [M + H]+ 885,4334 ; mesurée [M + H]+ 885,4269. UV/Vis (EtOH) : λmax(log ε) =
413 (4,92), 512 (3,92), 543 (3,86), 612 (3,87), 669 nm (4,59).
I.6. Caractérisation du composé K(Pyro–a)DKPPR (7)
La synthèse de ce composé a déjà été décrite dans la publication incluse dans le

Chapitre II § VIII.
297
1H NMR (300 MHz, DMSO–d6, δ) :
NH α–H β–H δ–H Autres

Pyro–a – – – – –1,93 (s, 2H, NH pyrrole, interchangeable*), 0,29
(s, 2H, NH pyrrole, interchangeable*), 1,64 (m, 3H,
CH3CH2C=), 1,80 (m, 3H, CH3CH–), 2,05 (m, 2H, –
CHCH2CH2COO–), 2,39 (m, 1H, –CHCH2CH2COO–
, interchangeable**), 2,62 (m, 1H, –
CHCH2CH2COO–, interchangeable**), 3,23 (s, 3H,
CH3C=, interchangeable***), 3,45 (s, 3H, CH3C=,
interchangeable***), 3,63 (s, 3H, C H3C=,
interchangeable***), 3,76 (m, 2H, CH 3CH2C=), 4,31
(m, 1H, –CHCH2CH2COO), 4,60 (m, 1H, CH3CH–),
5,12 (d, J = 20,1 Hz, 1H, =C–CH2CO,
interchangeable****), 5,24 (d, J = 20,1 Hz, 1H, =C–
CH2CO, interchangeable****), 6,21 (d, J = 11,7 Hz,
1H, H2C=CH–, cis) et 6,42 (d, J = 18,3 Hz, 1H,
H2C=CH–, trans), 8,23 (m, 1H, H2C=CH–), 8,90 (s,
1H, –C–CH=C–, interchangeable*****), 9,46 (s, 1H,
–C–CH=C–, interchangeable*****), 9,74 (s, 1H, –
C–CH=C–, interchangeable*****)
Lys1 8,08 4,41 1,63 1,34 ε–CH2 = 3,03 ; γ–CH2 = 1,27
Asp 8,66 4,55 2,50 –
2,68
Lys2 7,75 4,41 1,58 1,45 ε–CH2 = 2,72 ; γ–CH2 = 1,31
Pro1 – 4,31 1,97 3,45 γ–CH2 = 1,86
2,16 3,52
Pro2 – 4,48 1,77 3,41 γ–CH2 = 1,83
2,03 3,60
Arg 7,98 4,13 1,60 3,09 γ–CH2 = 1,51 ; ε–NH = 7,69
1,73
HRMS (ESI+) : m/z calculée pour C65H89N15O11 [M + H]+ 1256,6939, [M + 2H]2+ 628,8506 ;
mesurée [M + H]+ 1256,6986, [M + 2H]2+ 628,8562. UV/Vis (MeOH) : λmax (log ε) = 410
(4,81), 507 (3,81), 538 (3,78), 608 (3,75), 666 nm (4,44).
298
I.7. Synthèse de la plateforme trimodale Alc1’–K(Pyro–

a)DKPPR (14)
I.7.1. Essai de synthèse par chimie click
I.7.1.1. Synthèse du composé ester Alc1’–NHS (8)
Dans l'obscurité et sous atmosphère inerte, l’Alc1’ (50,7 mg, 93 µmol, 1 éq) a été
solubilisée dans un mélange anhydre AcOEt/DMF (16 mL, 15/1, v/v), puis le NHS (16,2
mg, 141 µmol, 1,5 éq) et EDCI•HCl (26,91 mg, 141 µmol, 1,5 éq) ont été ajoutés à la
solution. Le mélange a été agité à 35°C, pendant 24 h. Le milieu réactionnel a ensuite été
évaporé sous pression réduite. Le composé 8 a été obtenu sous forme d'un solide blanc et
utilisé directement dans l’étape suivante sans purification.
I.7.1.2. Synthèse du composé Alc1’–alcyne (9)
Dans l'obscurité et sous atmosphère inerte à 0°C, le composé 8 (58,7 mg, 93 µmol,1 éq)
a été solubilisé dans un mélange CHCl3/DMF anhydre (10,5 mL, 20/1, v/v). La
triéthylamine (19,4 µL, 140 µmol, 1,5 éq) et la propargylamine (8,9 µL, 140 µmol, 1,5 éq)
ont ensuite été ajoutées à la solution d’ester Alc1’–NHS. Le mélange a alors été agité à
température ambiante pendant 30 h sous argon. Le milieu réactionnel a été lavé avec une
solution aqueuse de NaCl (3 x 20 mL) puis les phases aqueuses ont été extraites avec
l’AcOEt (3 x 15 mL). Les phases organiques ont été réunies, séchées sur sulfate de
magnésium (MgSO4) et évaporées sous pression réduite. Le composé 9 a été obtenu sous
forme d'un solide blanc utilisé directement dans l’étape suivante sans purification.
299
I.7.1.3. Synthèse du composé azido–K(Pyro–a)DKPPR (11)
La réaction de couplage entre le composé 10 et l’acide azidohexanoïque (3 éq) a été

effectuée en présence de HBTU (3 éq), NMP (3 éq) et NMM (9 éq) dans le DMF et le
mélange réactionnel a été agité pendant 2 h. Tous les excès de réactifs solubles ont été
éliminés par filtration et lavage avec du DMF, de l'EtOH et du DCM. Le composé 11 brut
a ensuite été obtenu après clivage de la résine et déprotection des chaînes latérales en
présence d’une solution de TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5, v/v/v) pendant 2 h puis la résine a
été filtrée et lavée avec du TFA et du DCM. Le filtrat a été séché sous vide et le composé
11 a été précipité dans l'éther diéthylique à froid par centrifugation pour obtenir un solide
vert. Il a été utilisé dans l’étape suivante sans purification.
I.7.1.4. Synthèse du composé azido–K(Zn–Pyro–a)DKPPR

(12)
L’insertion du zinc au sein du composé 11 a été réalisée selon le protocole décrit par
Sakai et al.167 Le composé 11 (10,6 mg, 8 µmol, 1 éq) a été solubilisé dans le DMF (10 mL)
puis Zn(OAc)2 (66,7 mg, 304 µmol, 40 éq) a été ajouté à la solution. Le milieu réactionnel
a ensuite été agité à 40°C pendant 2h30. Le milieu réaction a été repris dans le DCM (30
300
mL) et lavé à l’eau (3 x 30 mL). Les phases aqueuses ont ensuite été extraites avec le DCM
(3 x 20 mL) puis les phases organiques ont été réunies et séchées sur MgSO 4 puis
évaporées sous pression réduite. Le produit 12 a été obtenu sous forme d’un solide vert
sans purification.
I.7.1.5. Tentative de synthèse du composé Alc1’–click–

K(Pyro–a)DKPPR (13)
Les composés 9 (4,6 mg, 8 µmol, 1 éq) et 12 (18,20 mg, 12 µmol, 1,5 éq) ont été
solubilisés dans le DMF (4 mL) et CuSO4 (0,2 mg, 0,8 µmol, 0,1 éq) et l’ascorbate de sodium
(0,8 mg, 4 µmol, 0,5 éq), préalablement solubilisés dans l’eau (1 mL), ont été ajoutés à la
solution. Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 24 h puis le
milieu réactionnel a été évaporé sous pression réduite pour conduire à l’obtention d’un
solide vert.
Le solide obtenu a été immédiatement solubilisé dans le TFA (5 mL) à 0°C et la solution
ainsi obtenue a été agitée pendant 5 min selon un protocole décrit par Simpson et Smith 168.
Le milieu réactionnel a été dilué dans le DCM (40 mL) puis neutralisé avec une solution
aqueuse d’NaHCO3 saturée (100 mL). La phase organique a ensuite été lavée avec une
solution aqueuse de NaHCO3 (2 x 50 mL) et de l’eau (2 x 50 mL). Les phases aqueuses ont
ensuite été extraites avec du DCM (2 x 50 mL). Les phases organiques ont finalement été
combinées, séchées sur MgSO4 puis évaporées sous pression réduite pour conduire à
l’obtention d’un solide vert. La formation du produit 13 n’a pu être observée en LC–MS.
I.7.2. Caractérisation de la plateforme 14 synthétisée par SPPS

301
Alc1’ – – – – 0,80–2,00 (m, 16H, CH3CCH–,–NCHP– et CH3CN–

), 1,09 (m, 3H, CH3CH2O–, interchangeable#), 1,18
(m, 3H, CH3CH2O–, interchangeable#), 1,35 (m, 3H,
CH3CH–), 3,89 (m, 2H, CH3CH2O–,
interchangeable##), 4,08 (m, 2H, CH3CH2O–,
interchangeable##), 5,07 (m, 1H, CH3CH–), 7,00–
7,60 (m, 9H, CH phényl),
Pyro–a – – – – –1,91 (s, 1H, NH pyrrole, interchangeable*), 0,31 (s,
1H, NH pyrrole, interchangeable*), 1,65 (m, 3H,
CH3CH2C=), 1,80 (m, 3H, CH3CH–), 2,09 (m, 2H, –
CH3C=, interchangeable***), 3,44 (s, 3H, CH3C=,
interchangeable***), 3,63 (s, 3H, CH3C=,
interchangeable***), 3,72 (m, 2H, CH3CH2C=), 4,30
5,11 (m, 1H, =C–CH2CO, interchangeable****), 5,23
(m, 1H, =C–CH2CO, interchangeable****), 6,19 (d, J
= 11,7 Hz, 1H, H2C=CH–, cis), 6,41 (d, J = 17,7 Hz,
1H, H2C=CH–, trans), 8,25 (m, 1H, H2C=CH–), 8,88
(s, 1H, –C–CH=C–, interchangeable*****), 9,48 (s,
1H, –C–CH=C–, interchangeable*****) et 9,78 (s,
1H, –C–CH=C–, interchangeable*****).
Lys1 7,82 4,44 1,56 1,43 ε–CH2 = 3,00 ; γ–CH2 = 1,25
Asp 8,33 4,55 2,48 –
2,65
Lys2 7,66 4,44 1,52 1,44 ε–CH2 = 2,72 ; γ–CH2 = 1,32
Pro1 – 4,31 1,94 3,49 γ–CH2 = 1,83
2,15 3,53
Pro2 – 4,48 1,74 3,42 γ–CH2 = 1,80
2,09 3,61
Arg 7,96 4,14 1,59 3,11 γ–CH2 = 1,50 ; ε–NH = 7,58
1,73
302
HRMS (ESI+) : m/z calculée pour C93H127N16O17P [M + 2H]2+ 886,4724 ; mesurée [M + 2H]2+
886,4712. UV/Vis (MeOH) : λmax (log ε) = 410 (4,71), 507 (3,73), 539 (3,71), 609 (3,71), 666
nm (4,37).
I.8. Caractérisation du composé Alc1’–KDKPPR (16)


Alc1’ – – – – 1,13 (m, 9H, CH3–CCH–), 1,17 (m, 3H, CH3–CH2O–
, interchangeable#), 1,24 (m, 3H, CH3–CH2O–,
interchangeable#), 1,48 (m, 3H, CH3–CH–), 1,20–2,0
(m, 7H, –NCH–P– et CH3–CN–), 3,93 (m, 2H, CH3–
CH2O–, interchangeable##), 4,03 (m, 2H, CH3–
CH2O–, interchangeable##), 5,17 (m, 1H, CH3–CH–),
7,45 et 7,58 (m, 9H, CH phényle)
Lys1 7,92 4,26 1,60 1,47 ε–CH2 = 2,75 ; γ–CH2 = 1,32
Asp 8,40 4,61 2,54 –
2,71
Lys2 7,82 4,44 1,60 1,47 ε–CH2 = 2,75 ; γ–CH2 = 1,32
Pro1 – 4,36 1,86 3,56 γ–CH2 = 1,90
2,05 3,62
Pro2 – 4,56 1,83 3,48 γ–CH2 = 1,86
2,14 3,66
Arg 8,02 4,16 1,61 3,13 γ–CH2 = 1,56 ; ε–NH = 7,72
1,76
HRMS (ESI+) : m/z calculée pour C60H95N12O15P [M + H]+ 1255,6850, [M + 2H]2+ 628,3461
; mesurée [M + H]+ 1255,6750, [M + 2H]2+ 628,3450.
303
I.9. Synthèse du peptide t–Lyp1 et des peptides de l’Alascan
La synthèse et les caractérisations de ces peptides ont déjà été décrites dans la
publication incluse dans le Chapitre III § III.2.
I.10. Synthèse du composé Mal–KK(Pyro–a)–DKPPR (27)
La réaction de couplage entre le composé 25 et la Fmoc–Lys(Boc)–OH (3 éq) a été

effectuée en présence de HBTU (3 éq), NMP (3 éq) et NMM (9 éq) dans le DMF et le
mélange réactionnel a été agité pendant 12 h. Tous les excès de réactifs solubles ont été
éliminés par filtration et lavage avec du DMF, de l'EtOH et du DCM. Après déprotection
de l’extrémité N–terminale du composé 26 ainsi obtenu, en présence d’une solution de
pipéridine dans le DMF (20/80, v/v), l’acide maléimidohexanoïque (1,2 éq) a été couplé
dans les mêmes conditions que la lysine. Le composé 27 brut a ensuite été obtenu après
clivage de la résine et déprotection des chaînes latérales en présence d’une solution de
TFA/TIPS/H2O (92,5/2,5/5, v/v/v) pendant 2 h puis la résine a été filtrée et lavée avec du
TFA et du DCM. Le filtrat a été séché sous vide et le composé a été précipité dans l'éther
diéthylique à froid par centrifugation. Le composé 27 a été purifié par HPLC préparative
avec un gradient de 10% à 100% ACN dans l’eau + 0,1% TFA en 15 min suivi d’un
isocratique à 100% ACN + 0,1% TFA pendant 10 min et finalement obtenu sous forme d’un
solide vert avec un rendement de 16% et une pureté HPLC > 99%.
304

Pyro–a – – – – –1,90 (s, 2H, NH pyrrole, interchangeable*), 0,33 (s,
2H, NH pyrrole, interchangeable*), 1,65 (m, 3H,
CH3CH2C=), 1,81 (m, 3H, CH3CH–), 2,17 (m, 2H, –
CH3C=, interchangeable***), 3,45 (s, 3H, C H3C=,
interchangeable***), 3,64 (s, 3H, C H3C=,
interchangeable***), 3,75 (m, 2H, CH 3CH2C=), 4,30
5,14 (d, J = 20,2 Hz, 1H, =C–CH2CO,
interchangeable****), 5,24 (d, J = 20,2 Hz, 1H, =C–
CH2CO, interchangeable****), 6,23 (d, J = 11,7 Hz,
1H, H2C=CH–, cis) et 6,41 (d, J = 16,7 Hz, 1H,
H2C=CH–, trans), 8,25 (m, 1H, H2C=CH–), 8,90 (s,
1H, –C–CH=C–, interchangeable*****), 9,49 (s, 1H,
–C–CH=C–, interchangeable*****) et 9,78 (s, 1H, –
C–CH=C–, interchangeable*****)
Mal – – – – 6,91 (s, 2H, OC–CH=CH–CO), 3,23 (m, 2H), 2,01 (m,
2H), 1,37 (m, 4H), 1,08 (m, 2H)
Lys1a 7,89 4,18 1,71 1,59 ε–CH2 = 2,99 ; γ–CH2 = 1,51
Lys2a 7,79 4,19 1,59 1,46 ε–CH2 = 2,99 ; γ–CH2 = 1,29
Asp 8,12 4,50 2,66 – –
2,46
Lys3 a 7,64 4,43 1,55 1,47 ε–CH2 = 2,74 ; γ–CH2 = 1,29
Pro1 – 4,31 2,61 3,55 γ–CH2 = 2,15
2,36 3,51
Pro2 – 4,49 2,64 3,61 γ–CH2 = 2,09
2,47 3,43
Arg 7,96 4,14 1,71 3,09 γ–CH2 = 1,51 ; ε–NH = 7,54
1,59
a Interchangeables.
MS (ESI+) : m/z calculée pour C81H112N18O15 [M + H]+ 1579, [M + 2H]2+ 790, [M + 3H]3+ 527
et [M + 4H]4+ 395 ; mesurée [M + H]+ 1579, [M + 2H]2+ 790, [M + 3H]3+ 527 et [M + 4H]4+
395.
305
I.11. Synthèse du composé β–CD–KK(Pyro–a)–DKPPR (28)
Le composé β–CD–SH (10,10 mg, 9 µmol, 1,35 éq) a été solubilisé dans un tampon PBS
(2 mL) et la solution a été chauffée à 40°C. le composé 27 (10,21 mg, 6 µmol, 1 éq)
préalablement solubilisé dans le DMF (1,2 mL), a été ajouté goutte à goutte en 6 portions
toutes les 15 min. Le milieu réactionnel a ensuite été agité pendant 24 h puis évaporé sous
pression réduite. Un suivi par RMN 1H a été effectué confirmant la disparition du signal
à 6,91 ppm correspondant à la double liaison du maléimide. Le composé 28 a été purifié
par HPLC préparative selon un gradient de 10% à 100% ACN dans l’eau + 0,1% TFA en
15 min suivi d’un isocratique à 100% ACN + 0,1% TFA pendant 10 min et finalement
obtenu sous forme d’un solide vert avec un rendement de 26% et une pureté HPLC > 99%.
MS (ESI+) : m/z calculée pour C123H182N18O49S [M + 2H]2+ 1365, [M + 3H]3+ 910 et [M +

4H]4+ 683 ; mesurée [M + 2H]2+ 1365, [M + 3H]3+ 910 et [M + 4H]4+ 683.
306
I.12. Synthèse du composé ester Alc2–NHS (29)
Dans l'obscurité et sous atmosphère inerte, l’Alc2 (250 mg, 474 µmol, 1 éq) a été
solubilisée dans un mélange anhydre de DCM/DMF (20 mL, 85/15, v/v), puis le NHS (81,8
mg, 711 µmol, 1,5 éq) et EDCI•HCl (136,3 mg, 711 µmol, 1,5 éq) ont été ajoutés à la
solution. Le mélange a été agité à 40°C, pendant 20 h. La solution a ensuite été évaporée
sous pression réduite. Le composé 29 a été obtenu sans purification avec un rendement
quantitatif et utilisé tel quel pour l’étape suivante.
I.13. Synthèse du composé Fmoc–K(Alc2) (30)
Dans l'obscurité et sous atmosphère inerte à 0°C, le composé 29 (269,8 mg, 433 µmol,
1 éq) a été solubilisé dans du CHCl3 (18 mL). La triéthylamine (133 µL, 953 µmol, 2,2 éq)
a été ajoutée à la Fmoc–Lys–OH Nε–chlorhydrate (210 mg, 520 µmol, 1,2 éq), initialement
solubilisé dans du DMF anhydre (2 mL). Cette solution a été ajoutée à la solution du
composé 29. Le mélange réactionnel a alors été agité à température ambiante sous argon
pendant 24 h. Les mêmes équivalents de triéthylamine et de Fmoc–Lys–OH Nε–
chlorhydrate ont été de nouveau ajoutés et la solution a été agitée pendant encore 24 h.
Le milieu réactionnel a ensuite été évaporé sous pression réduite. La purification du
produit brut a été effectuée par chromatographie sur colonne de silice avec un éluant
DCM/EtOH (gradient de 95/5 à 85/15, v/v). Le composé 30 a été obtenu sous forme de solide
307
orange et d’un mélange de 4 stéréoisomères avec un rendement de 70% et une pureté

HPLC de 98%.
1H NMR (300 MHz, DMSO–d6, δ) : 0,62 (s, 3H, C(CH3)–CH3 a, interchangeable*), 1,01 (s,
3H, C(CH3)–CH3 a, interchangeable*), 0,85 (s, 3H, C(CH3)–CH3 b, interchangeable**), 1,23
(s, 3H, C(CH3)–CH3 b, interchangeable**), 1,35 (m, 2H, γ–CH2 Lys), 1,39 (m, 2H, C(O)–
CH–CH2–C, interchangeable***), 1,53 (m, 2H, C(O)–CH–CH2–C, interchangeable***),
1,43 (m, 3H, NO–CH–CH3) 1,64 (m, 4H, β et δ–CH2 Lys), 2,45 (m, 1H, C(O)–CH–CH2–C),
2,59 (s, 3H, N=C–CH3) 3,00 (m, 2H, ε–CH2 Lys), 3,83 (m, 2H, α–H Lys), 4,20 (m, 1H, CH
Fmoc), 4,29 (m, 2H, CH2 Fmoc), 4,80 (m, 1H, NO–CH–CH3), 7,28 (m, 1H, ε–NH Lys), 7,34
et 7,82 (m, 8H, CH phényl–Fmoc), 7,39 (m, 2H, C–CH=CH–C–C(=N)), 7,78 (m, 1H, NH
Lys), 7,90 (m, 2H, C–CH=CH–C–C(=N)), 8,07 (m, 1H, C(NO2)–CH=CH–C–NH), 8,37 (m,
1H, C(NO2)–CH=CH–C–NH) et 8,88 (m, 1H, C(NO2)–CH=C(NO2)).
MS (ESI+) : m/z calculée pour C47H55N7O10 [M + H]+ 878 ; mesurée [M + H]+ 878.
I.14. Essais de synthèse du composé Fmoc–K(Alc2)KDKPPR

(31)
La réaction de couplage entre les composés 17 et 30 (1,2 éq) a été effectuée soit en
présence de HBTU (3 éq), NMP (3 éq) et NMM (9 éq) dans le DMF soit en présence de
PyBOP (3 éq) et DIPEA (3 éq) dans le DMF. Dans les deux cas, le mélange réactionnel a
été agité pendant 12 h. Tous les excès de réactifs solubles ont été éliminés par filtration et
lavage avec du DMF, de l'EtOH et du DCM. A l’issu de ces synthèses, des micro–clivages
en présence de TFA/TIPS/H2O (95/2,5/5, v/v/v) ont été effectués pendant 1 h puis la résine
a été filtrée et lavée avec du TFA et du DCM. Le filtrat a été séché sous vide et le composé
a été précipité dans l'éther diéthylique à froid par centrifugation.
308
II. Détermination des propriétés photophysiques

Tous les spectres ont été mesurés en utilisant des cuves quartz à 4 faces.
II.1. Absorption
Les spectres d’absorption ont été enregistrés avec un spectrophotomètre UV–visible

double faisceau UV–3600 (Shimadzu, Marne la Vallée, France). Les solutions mères ont
été préparées à des concentrations de 1 mg.mL –1 dans le DMSO puis diluées dans les
solvants étudiés jusqu’à obtenir une absorbance inférieure à 0,2 à la longueur d’onde
d’excitation.
II.2. Emission de fluorescence et de luminescence de l’ 1O2
Les spectres d’émission de fluorescence et d’1O2 ont été mesurés avec un

spectrofluorimètre Fluorolog FL3–222 (Horiba Jobin Yvon, Longjumeau, France) équipé
d’une lampe à arc xénon de 450 W, d’un compartiment porte–cuve thermostaté (25°C),
d’un photomultiplicateur UV–visible R928 (Hamamatsu Japon) et d’un détecteur
infrarouge InGaAs refroidi à l’azote liquide (DSS–16A020L Electro–Optical System Inc,
Phoenixville, PA, USA). Le faisceau d’excitation est diffracté par un monochromateur
double réseaux SPEX (1200 traits/mm blasé à 330 nm). La fluorescence a été mesurée par
le détecteur UV–Visible via le monochromateur d’émission double réseaux SPEX (1200
traits/mm blasé à 500 nm). La production d’1O2 a été mesurée par le détecteur infrarouge
via le monochromateur d’émission double réseaux SPEX (600 traits/mm blasé à 1 µm) et
un filtre passe haut à 780 nm.
Le rendement quantique en fluorescence a été déterminé par l’équation (17) :
If DO0 n 2 (17)
ϕf = ϕf0 . . .( )
If0 DO n0
Avec Φf et Φf0, les rendements quantiques, If et Ifo, les intensités de fluorescence, DO et

DO0, les densités optiques et n et n0, les indices de réfraction, de l’échantillon et de la
référence respectivement.
La référence utilisée pour le calcul du rendement quantique de fluorescence est la

tétraphénylporphyrine dans le toluène avec un Φf0 de 0,11.213
Le rendement quantique de production d’1O2 est déterminé par l’équation (y) :
I DO0 (18)
ϕ Δ = ϕΔ 0 . .
I0 DO
309
Avec ΦΔ et ΦΔo, les rendements quantiques de production d’ 1O2, I et I0, les intensités de
production d’1O2 et DO et DO0 les densités optiques, de l’échantillon et de la référence
respectivement.
La référence utilisée pour le calcul du rendement quantique de production d’1O2 est le Rose
de Bengale dans le DMSO avec ΦΔ0 = 0,16, dans l’EtOH avec ΦΔ0 = 0,68, dans le D2O avec
ΦΔ0 = 0,76 et dans le MeOH avec ΦΔ0 = 0,76.69
Les durées de vie de fluorescence ont été mesurées en utilisant pour l’excitation une
diode laser pulsée à 407 nm (LDH–P–C–400M, FWHM < 70 ps, 1 MHz) couplée à un
générateur d’impulsions PDL 800–D (PicoQuant GmbH, Berlin, Germany) et pour la
détection une photodiode à avalanche SPCM–AQR–15 (EG & G, Vaudreuil, Canada)
couplée à un filtre passe haut à 650 nm.
L’acquisition a été réalisée par un module PicoHarp 300 associé à un routeur 4 voies
PHR–800 (PicoQuant GmbH, Berlin, Germany). Les déclins de fluorescence ont été
enregistrés en utilisant la méthode de comptage monophotonique (Time Correlated Single
Photon Counting TCSPC). Les données ont été collectées jusqu’à obtenir 1000 coups
accumulés dans un canal puis analysés en utilisant le logiciel de TCSPC Fluofit
(PicoQuant GmbH, Berlin, Germany) basé sur une reconvolution itérative utilisant un
algorithme de Levensberg–Marquandt permettant l’obtention de déclins multi–
exponentiels (principalement mono– ou bi–exponentiels dans notre cas).
Les mesures de durées de vie d’1O2 ont été réalisées avec un spectrophotomètre
TEMPRO–01 (Horiba Jobin Yvon, Longjumeau, France) composé d’une diode d’excitation
pulsée SpectraLED–415 à 415 nm, d’un compartiment porte–cuve, d’un monochromateur
d’émission de type Seya–Namioka (600 – 2000 nm) et d’un tube photomultiplicateur
proche infra–rouge régulé thermo–électriquement H10330–45 (Hamamatsu, Japon). Le
montage est piloté par le module de comptage FluoroHub–B et les logiciels DataStation et
DAS6 (Horiba Jobin Yvon).
II.3. Photoblanchiment
Cette partie a été décrite la publication incluse dans le Chapitre II § VIII.
310
III. Photolabilité des alcoxyamines
III.1. Dispositifs d’illumination
III.1.1. Illumination de Alc1
III.1.1.1. Suivi par HPLC – Irradiateur
Lors des essais de photoclivage par irradiations aux rayons X, les échantillons ont été
irradiés à l'aide d'un irradiateur biologique à rayons X, X–RAD 320 (Precision X–Ray INC.,
North BRANFORD, CT, USA), avec une anode en tungstène. Les photons ont été produits
par des tubes à rayons X et ont produit des distributions d'énergie continues. Les
paramètres du tube étaient réglés à des énergies moyennes des photons de 160 et 320
keV avec un courant réglé de 0,5 à 12,5 mA. Un filtre en Al de 2 mm a été utilisé pour
éliminer les photons de faible énergie.
III.1.1.2. Suivi par HPLC – Lampe à vapeur de mercure
Lors des premières expériences avec suivi par HPLC du photoclivage, l’illumination
des cuves a été effectuée à l’aide d’une lampe à vapeur de mercure haute pression 500 W
présentant des raies principales à 254 et 365 nm, avec une puissance de 125 mW.cm–2.
III.1.1.3. Suivi par RPE – Lampe UV
Lors des expériences suivantes avec suivi par RPE du photoclivage, l'illumination des
capillaires a été effectuée à l'extérieur de la cavité avec une chambre d'illumination
fabriquée en laboratoire à l’Institut de Chimie de Strasbourg, composée de 4 ampoules UV
identiques avec un maximum de 365 nm, soit h = 3,4 eV et E = 1,5 mW.cm –2 par lampe
(mesurée avec un wattmètre (1936–C Newport)).
III.1.2. Illumination de Alc2 – Lampe AURA light
Les illuminations des capillaires à 475 nm ont été effectuées avec une lampe AURA
light engine® équipée de 5 sources lumineuses contrôlées indépendamment à 360 nm, 475
nm, 555 nm, 635 nm et 730 nm, couplée à une fibre optique. Les sources à 360 nm et 475
nm ont été utilisées avec des puissances de sortie respectives de 17,5 mW.cm –2 et 22
mW.cm–2.
311
III.2. Préparations des échantillons
III.2.1. Suivi par HPLC
Les solutions illuminées ont été préparées à une concentration de 10 –3 M dans le DMSO
avec 2 éq de TEMPO et illuminées dans une cuve quartz à 4 faces. Des prélèvements ont
été effectuées au cours de l’illumination et diluées par 20 dans l’ACN avant d’être analysés
par HPLC.
III.2.2. Suivi par RPE
Cette partie a été décrite dans la publication incluse dans le Chapitre II § VIII.
III.3. Spectroscopie RPE
La méthodologie utilisée pour cette technique dans l’ensemble de cette thèse est décrite
dans la publication incluse dans le Chapitre II § VIII.
IV. Tests d’affinité LBA

Cette partie a été décrite dans la publication incluse dans le Chapitre II § VIII.
V. Modélisation moléculaire
Cette partie a été décrite dans la publication incluse dans le Chapitre III § III.3.
VI. Détermination des Log P

La lipophilie des composés a été déterminée par la méthode traditionnelle « shake–
flask » dans un mélange 1–octanol/eau Milli–Q à 37°C. Cent microlitres de solutions de
chaque composé à 1 mM dans le DMSO, ont été mélangés avec un volume égal de n–octanol
et d'eau Milli–Q dans un tube à hémolyse. Les tubes à essai ont été agités pendant 3 heures
à 37°C, puis laissés au repos pendant 15 minutes. Après séparation, 100 μL de chaque
phase ont été prélevés et dilués dans 2 ml d'EtOH et les absorptions des solutions ont été
mesurées par UV–vis (410 nm). Le coefficient de partage des composés, log P, a été
déterminé par l’équation (19) :
Aφorga (19)
log P = log
Aφaq
312
Où Aφorga est l’absorption de la phase organique (n–octanol) et A φaq est l’absorption de la
phase aqueuse.
313
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Receptor β–Cyclodextrin Immobilized on Nanostructured Gold Surfaces, J.
Nanomater., 2014, 2014, 207258.
213 T. L. C. Figueiredo, R. A. W. Johnstone, A. M. P. S. Sørensen, D. Burget and P. Jacques,
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Water–Insoluble Porphyrins and Metalloporphyrins in Organic Solvents and in
Aqueous Media, Photochem. Photobiol., 1999, 69, 517–528.
325
326
ANNEXE : LISTE DES
PUBLICATIONS
327
328
P1) Larue L., Ben Mihoub A., Youssef Z., Colombeau L., Acherar S., André J.C.,
Arnoux P., Baros F., Vermandel M., Frochot C. Using X–ray in photodynamic
therapy: an overview. Photochem. Photobiol. Sci. 2018, 17, 1612–1650. IF = 2.80.
P2) Ben Mihoub A., Larue L., Moussaron A., Youssef Z., Colombeau L., Baros F., Frochot
C., Vanderesse R., Acherar S. Use of Cyclodextrins in Anticancer Photodynamic
Therapy Treatment. Molecules. 2018, 23 (8), 1936. IF = 3.06.
P3) Youssef Z., Yesmurzayeva N., Larue L., Juan–Hureaux V., Colombeau L., Acherar S.,
Frochot C. New targeted gold nanorods for the treatment of glioblastoma by
photodynamic therapy. J. Clin. Med. 2019, 8 (12), 2205. IF = 3.30.
P4) Toubia I., Nguyen C., Diring S., Ali L., Larue L., Aoun R., Frochot C., Gary–Bobo
M., Kobeissi M., Odobel F. Synthesis and Anticancer Activity of Gold Porphyrin
Linked to Malonate Diamine Platinum Complexes. Inorg. Chem. 2019, 58 (18),
12395–12406. IF = 4.82.
P5) Larue L., Myrzakhmetov B., Ben–Mihoub A., Moussaron A. Thomas N., Arnoux P.,
Baros F. Vanderesse R., Acherar S., Frochot C. Fighting Hypoxia to Improve PDT.
Pharmaceuticals. 2019, 12 (4). IF = 4.42.
P6) Larue L., Moussounda Moussounda Koumba T., Le Breton N Vileno B., Arnoux
P., Jouan–Hureaux V., Boura C., Audran G., Bikanga R., Marque S., Acherar S.,
Frochot C. The design of a targeting and O 2–independent platform to improve
Photodynamic Therapy: A proof of concept, acceptée dans ACS Applied
Biomaterials. 2021, 4 (2), 1330–1339.
329
330
ANNEXE : LISTE DES
COMMUNICATIONS
SCIENTIFIQUES
331
332
Communications internationales
▪ Communications orales :
CIo1) Larue L., Colombeau L., Arnoux P., Baros F., Audran G., Marque S.
R. A., Boura C., Acherar S., Frochot C. New platforms for improving the
treatment of glioblastoma by PhotoDynamic Therapy, 2019 ESP–IUPB
World Congress, Barcelone (Espagne), 25 – 30 Août 2019.
CIo2) Larue L., Koumba TMM., Le Breton N., Vileno B., Arnoux P., Jouan–
Hureaux V., Boura C., Audran G., Bikanga R., Marque S., Acherar S.,
Frochot C. A Targeted and Oxygen–independent PDT: A proof of concept,
Photodynamic Therapy and Photodiagnosis Update E–CONGRESS 2020,
5–6 Novembre 2020.
▪ Communications écrites :
CIe1) Larue L., Colombeau L., Arnoux P., Baros F., Audran G., Marque S. R. A.,
Boura C., Acherar S., Frochot C. New Platforms for improving the treatment of
glioblastoma by photodynamic therapy Photodynamic Therapy and Photodiagnosis
Update, Kochel Am See (Allemagne), 19 – 22 Septembre 2018.
CIe2) Larue L., Colombeau L., Arnoux P., Baros F., Audran G., Marque S. R. A.,
Boura C., Acherar S., Frochot C. New Platforms for improving the treatment of
glioblastoma by photodynamic therapy, Ecole thématique (5th ESP Photobiology
School), New Platforms for improving the treatment of glioblastoma by
photodynamic therapy, Brixen (Italie), 10 – 16 Juin 2018.
Communications nationales
▪ Communication orale
CNo1) Larue L., Colombeau L., Arnoux P., Baros F., Audran G., Marque S. R. A.,
Boura C., Acherar S., Frochot C. Développement de nouvelles plateformes pour
une thérapie photodynamique indépendante de l’oxygène, 2ème Journée Française
sur la thérapie photodynamique, Lille (France), 28 novembre 2019.
▪ Communication écrite
CNe1) Achard M., Acherar S., André J.C., Arnoux P., Barberi–Heyob M., Baros F.,
Bastogne T., Bechet D., Boura C., Colombeau L., Frochot C., Jouan–Hureaux V.,
333
Goria S., Larue L., Moussaron A., Pinel S., Rétif P., Roques–Carmes T., Thomas N.,
Vanderesse R., Youssef Z., PDTeam’s projects, 1ère journée française sur la thérapie
photodynamique, Lille (France), 30 novembre 2017.
Participation à un congrès sans communication
CHIMI Meeting: Fluorescence: from benchtop to clinical use, Dijon (France), 25 – 26

Janvier 2018.
334
Développement de nouvelles plateformes pour l’amélioration du traitement du
glioblastome par thérapie photodynamique
Mots–clés : thérapie photodynamique, espèces réactives de l'oxygène, cancer.
Le traitement des tumeurs malignes du cerveau, dont le glioblastome multiforme est la forme la plus
agressive, est un défi majeur de la cancérologie. La thérapie photodynamique (PDT) apparaît comme
une technique prometteuse dans ce contexte. La PDT permet une destruction des cellules cancéreuses
par l’action de trois éléments à savoir un photosensibilisateur (PS), la lumière et l’oxygène. Après
photoexcitation sous lumière visible, le PS engendre, en présence d’oxygène, la formation d’espèces
réactives de l’oxygène dont d’oxygène singulet (1O2), toxiques, qui vont détruire les tissus avoisinants.
Malheureusement, la PDT souffre de deux inconvénients majeurs qui sont le manque de sélectivité de
nombreux PSs actuellement utilisés cliniquement ainsi que le besoin d’oxygène pour être efficace. Pour
pallier le manque de sélectivité, le ciblage des néovaisseaux tumoraux est une approche prometteuse.
L’affinité du peptide KDKPPR pour le récepteur NRP–1 surexprimé sur les cellules endothéliales a déjà
été prouvée par notre équipe. Concernant le manque d’oxygène, nous nous sommes intéressés aux
alcoxyamines capables de générer des radicaux alkyles toxiques par activation lumineuse, même en
milieu hypoxique. Ces alcoxyamines photoactivables sont décrites dans la littérature mais jamais
utilisées dans le traitement de tumeurs. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé une
plateforme trimodale combinant un PS et un alcoxyamine photoactivable pour une PDT en milieu
normoxique et hypoxique, respectivement, et un peptide pour cibler NRP–1. La synthèse de cette
plateforme a été réalisée avec succès. L’étude de cette plateforme a montré un maintien de la capacité à
former de l’1O2 et de l’affinité pour NRP–1. Grâce à la technique de spectroscopie RPE, les radicaux
engendrés par l’illumination de l’alcoxyamine ont pu être détectés. Bien que prometteuse, cette
plateforme n’est pas applicable en PDT en raison d’une photoactivation de l’alcoxyamine à une longueur
d'onde UV inadaptée. La seconde partie de cette thèse a donc été consacrée à l’optimisation de cette
plateforme. Nous nous sommes focalisés sur trois pistes : 1) le design d’une nouvelle alcoxyamine
absorbant à de plus hautes longueurs d’onde 2) l’amélioration de la solubilité de la plateforme en greffant
une cyclodextrine et 3) le développement d’un nouveau peptide ciblant NRP–1 et pouvant être internalisé
dans les cellules.
Development of new platforms to improve the treatment of glioblastoma by

photodynamic therapy
Key–words: photodynamic therapy, reactive oxygen species, cancer.
The treatment of malignant brain tumors, of which glioblastoma multiform is the most aggressive
form, is a major challenge in oncology. Photodynamic therapy (PDT) appears to be a promising technique
in this context. PDT destroys cancer cells by the action of three elements: a photosensitizer (PS), light
and oxygen. After photoexcitation under visible light, PS generates, in the presence of oxygen, the
formation of reactive oxygen species including singlet oxygen (1O2), toxic, which will destroy surrounding
tissues. Unfortunately, PDT suffers from two major drawbacks which are the lack of selectivity of many
PSs currently used clinically as well as the need for oxygen to be effective. To overcome the lack of
selectivity, targeting tumor neovessels is a promising approach. The affinity of KDKPPR peptide for the
overexpressed NRP–1 receptor on endothelial cells has already been demonstrated by our team.
Regarding the lack of oxygen, we were interested in alkoxyamines able of generating toxic alkyl radicals
by light activation, even in hypoxic environment. These photoactivatable alkoxyamines are described in
the literature but never used in tumor treatment. In this thesis, we developed a trimodal platform
combining a PS and a photoactivatable alkoxyamine for PDT in normoxic and hypoxic medium,
respectively, and a peptide to target NRP–1. The synthesis of this platform was successfully performed.
The platform study confirmed the conservation of the ability to form 1O2 and the NRP–1 affinity. The
detection of the photogenerated radicals from alkoxyamine is detected by EPR spectroscopy. Although
promising, this platform is not applicable in PDT due to the use of an unsuitable UV wavelength for
photoactivation of alkoxyamine. The second part of this thesis was devoted to the platform optimization.
We focused on three avenues: 1) Design of a new alkoxyamine absorbing at higher wavelengths, 2)
Improvement of the platform solubility by grafting a cyclodextrin and 3) Development of a new NRP–1–
targeted peptide which can be internalized in cells.

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Développement de nouvelles plateformes pour

l’amélioration du traitement du glioblastome par

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D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite

Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4

Pour l’obtention du titre de

Docteur de l’Université de Lorraine

Développement de nouvelles plateformes pour

Par Ludivine LARUE

Rapporteurs : Muriel AMBLARD DR CNRS, IBMM, Université de Montpellier

Valérie HEITZ Professeur, LSAMM, Université de Strasbourg

Examinateurs : Cédric BOURA MdC, CRAN, Université de Lorraine

Serge MORDON DR INSERM, OncoThAI, Université de Lille

Céline FROCHOT DR CNRS, LRGP, Université de Lorraine (Directrice de

Samir ACHERAR MdC, LCPM, Université de Lorraine (Co–directeur de

Invités : Sylvain MARQUE Professeur, ICR, Université Aix Marseille

Bertrand VILENO CR CNRS, Laboratoire POMAM, Université de

Laboratoire Réactions et Génie des Procédés – Université de Lorraine–CNRS (UMR 7274)

Je remercie le Pr Valérie Heitz et le Dr Muriel Amblard pour avoir accepté d’évaluer

Je tiens ensuite à remercier ma directrice de thèse, Céline Frochot et mon co-directeur

Mes remerciements s’adressent ensuite aux membres de la PDTeam, anciens et

Un grand merci également à Clément, Laetitia, Louise, Lubin, Ophélia, Sylvain et

INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................................... 1

CHAPITRE I : LA THERAPIE PHOTODYNAMIQUE POUR TRAITER LE CANCER ................... 7

CHAPITRE II : LA PDT CIBLEE ET INDEPENDANTE DE L’OXYGENE : UNE PREUVE DE

I. CIBLAGE DU RECEPTEUR NRP–1 PAR DES PEPTIDES............................................................................ 173

I. CONTEXTE ET OBJECTIFS ................................................................................................................... 243

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ................................................................................................ 285

PARTIE EXPERIMENTALE ............................................................................................................... 291

ANNEXE : LISTE DES PUBLICATIONS ........................................................................................... 327

ANNEXE : LISTE DES COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES .................................................... 331

FIGURE 7 : SPECTRE ELECTROMAGNETIQUE. ....................................................................................................... 28

INDIQUEE PAR UNE DOUBLE FLECHE.133 .................................................................................................... 175

FIGURE 26 : STRUCTURE CHIMIQUE DE LA PLATEFORME SYNTHETISEE (NOTEE ALC1’–K(PYRO–A)DKPPR)...... 175

FIGURE 28 : MECANISME DE DEPROTECTION DU GROUPEMENT FMOC................................................................ 182

AU PEPTIDE EN ELONGATION (VOIE A) ET LA REACTION SECONDAIRE CONDUISANT A LA GUANIDINYLATION DE

LA FONCTION AMINE N–TERMINALE DU PEPTIDE EN EXPANSION (VOIE B).155 ............................................. 188

DEPROTECTION DE L’EXTREMITE N–TERMINALE, LE COMPOSE A FINALEMENT ETE CLIVE DU SUPPORT ET

RENDEMENT GLOBAL DE 25% APRES PURIFICATION PAR HPLC PREPARATIVE........................................... 190

DMF/H2O, 24 H, TAMB ET (II) TFA, 5 MIN, 0°C. ......................................................................................... 194

(DETECTION UV : 415 NM). ..................................................................................................................... 196

PENDANT 10 MIN (DETECTION UV : 260 NM). ........................................................................................... 197

FIGURE 49 : HOMOLYSE DE L'ALCOXYAMINE BENZOPHENONE–SG1’ SOUS EXCITATION LUMINEUSE. ................. 205

FIGURE 54 : FORMES MESOMERES DU NITROXYDE. ........................................................................................... 211

MEOH. ................................................................................................................................................... 216

LIAISON DU PEPTIDE A UN RECEPTEUR PRIMAIRE SUR L’ENDOTHELIUM DE LA TUMEUR, (II) LE CLIVAGE DU

LIAISON A NRP–1 MEDIEE PAR LE MOTIF CENDR, CONDUISANT A LA PERMEABILITE VASCULAIRE ET

HYDROGEN BONDS ARE SHOWN IN GREEN. ............................................................................................... 263

FIGURE 81 : HOMOLYSE DE ALC2 SOUS EXCITATION LUMINEUSE. ..................................................................... 281

FIGURE 83 : (A) EVOLUTION DE L’INTENSITE RPE DU 4–CARBOXY–TEMPO AU COURS DE L’ILLUMINATION A 475

TABLEAU 8 : EXEMPLES DE CARBODIIMIDES UTILISES EN SPPS. ....................................................................... 185

A 415 NM DES COMPOSES PYRO–A, 7 ET 14 DANS DIFFERENTS SOLVANTS. ................................................ 203

MIN. ........................................................................................................................................................ 251

FLUORESCENCE (ΤF) MESUREE A 407 NM ET D’ 1

Cette thèse consiste au design de nouvelles plateformes PDT spécifiques des