Bergougnoux V. Biosynthèse & Sécrétion Parfum Chez Rosa X Hybrida L.

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ACADEMIE DE LYON
UNIVERSITE JEAN MONNET
THESE
Pour obtenir le grade de DOCTEUR
Discipline : Biologie Végétale
Biosynthèse et sécrétion du parfum

chez Rosa x hybrida L.
par
Véronique BERGOUGNOUX
Soutenue le 22 novembre 2005, devant le jury composé de :
Mme HOSSAERT-MCKEY Directeur de recherche CNRS, Montpellier Rapporteur

M. GANTET Professeur à l'Université de Montpellier II Rapporteur
M. HUGUENEY Maître de conférences à l'ENS de Lyon Examinateur
M. LEGENDRE Professeur à l'UJM – Saint-Etienne Directeur
Mme BAUDINO Maître de conférences à l'UJM – Saint-Etienne Co-directrice
ACADEMIE DE LYON
UNIVERSITE JEAN MONNET
THESE
Pour obtenir le grade de DOCTEUR
Discipline : Biologie Végétale
Biosynthèse et sécrétion du parfum

chez Rosa x hybrida L.
par
Véronique BERGOUGNOUX
Soutenue le 22 novembre 2005, devant le jury composé de :
Mme HOSSAERT-MCKEY Directeur de recherche CNRS, Montpellier Rapporteur

M. GANTET Professeur à l'Université de Montpellier II Rapporteur
M. HUGUENEY Maître de conférences à l'ENS de Lyon Examinateur
M. LEGENDRE Professeur à l'UJM – Saint-Etienne Directeur
Mme BAUDINO Maître de conférences à l'UJM – Saint-Etienne Co-directrice
Remerciements
Ma thèse a été réalisée au sein du laboratoire de Biotechnologies Végétales appliquées
aux plantes aromatiques et médicinales de l'Université Jean Monnet de Saint-Etienne, sous la
direction de Sylvie Baudino que je tiens à remercier pour l'encadrement et les conseils qu'elle
a su m'apporter tout au long de ces années de coopération. Je tiens également à la remercier de
toute la patience dont elle a su faire preuve au cours de la rédaction de mon mémoire de
doctorat.
Je remercie également Laurent Legendre, directeur du laboratoire, pour m'avoir

apporté quelques conseils techniques et surtout son aide dans la recherche d'un poste ATER.
Je souhaite remercier le professeur Martine Hossaert-McKey et le professeur Pascal

Gantet d'avoir accepté d’être les rapporteurs de cette thèse, ainsi que Philippe Hugueney,
maître de conférences à l'ENS de Lyon, qui a accepté d’en être examinateur.
Je tiens à remercier plus particulièrement Philippe Hugueney pour toutes les

techniques auxquelles il m'a formé, son aide et ses conseils. J'associe Gabriel Scalliet à ces
remerciements pour les résultats que nous avons obtenus ensemble.
Je remercie tout spécialement Jean-Louis Magnard qui m’a donné les clés des
techniques de biologie moléculaire. Je le remercie également pour l’amitié et le soutien qu’il
m’a apporté au cours de ces quatre années.
L'analyse des molécules volatiles du parfum n'aurait pas pu se faire sans l'aide
précieuse et les conseils de Frédéric Jullien. Au-delà d'un soutien technique, c'est bien souvent
un soutien moral qu'il m'a apporté. Je remercie également Magali Martin qui a réalisé pour
moi des analyses GC-MS. Si nous avons surtout collaboré dans le cadre de la recherche, nous
avons aussi établi un lien d'entre aide et de soutien entre doctorantes.
La microscopie serait restée un mystère pour moi, si je n'avais pas bénéficié de l'aide
et de l'expérience de Jean-Claude Caissard. Il a également contribué à l’acquisition de
données concernant l’analyse des composés volatils de rose.
Remerciements iii
Pour l’aspect microscopie, je voudrais également remercier Isabelle Anselme-Bertrand
du Centre Stéphanois de Microscopie et Claire Lionnet de la plateforme PLATIM (Lyon) qui
m’ont apporté leur aide.
Au sein du laboratoire, je tiens à remercier David Roujol, Caroline Joly et Florence

Gros qui m'ont apporté ponctuellement leur aide au cours de ces années de thèse.
Il me reste à remercier Sandrine Moja, Françoise Berger, Corinne Marcon et Caroline

Hernould pour leur sympathie. Je n'oublie pas tous les stagiaires qui ont fait partie de la vie du
laboratoire.
Une grande pensée à Mélanie Mauriat , thésarde colocataire de bureau, qui a partagé
ces années de thèse. Un grand merci pour le soutien moral, les éclats de rire et les galères
partagées … bref son amitié. J'ai également pu faire la connaissance de Cécile Micheau et
Magali Soria qui ont partagé également des moments inoubliables.
Je n'oublie pas mes parents et ma famille qui ont toujours cru en moi et qui ont su me
redonner confiance lorsque la motivation n'était plus au rendez-vous. Merci d'avoir supporté
mes sautes d'humeur. Merci de votre amour.
Pour finir, je tiens à préciser que ce travail de thèse a été réalisé dans le cadre d'un
programme région, financé par la Région Rhône-Alpes que je remercie. De plus, ce travail
n'aurait jamais pu se faire sans le Collectif des Rosiéristes de la région Rhône-Alpes qui a mis
à ma disposition tout le matériel végétal nécessaire à mon étude.
Remerciements iv
Sommaire
Remerciements ...................................................................................iii
Sommaire............................................................................................. 5
Abréviations ........................................................................................ 8
Avant-Propos..................................................................................... 10
I- La rose, histoire et importance économique ............................ 13
A- La généalogie des Roses ...................................................................... 13
B. Les utilisations des Roses ..................................................................... 18
C. Le parfum des roses .............................................................................. 21
II. Le rôle des composés volatils et les structures sécrétrices ..... 25
A. Huiles essentielles, parfums et insectes................................................ 25
B. Les structures sécrétrices ...................................................................... 33
III. La biosynthèse des composés volatils ................................... 41
A. Les terpènes, composés majoritaires des roses..................................... 42
B. Les autres composés volatils................................................................ 57
C. L’ingénierie des composés volatils....................................................... 64
IV. Conclusion............................................................................. 75
Matériels et Méthodes ....................................................................... 80
I. Matériel végétal, souches et plasmides .................................... 80
A. Matériel végétal .................................................................................... 80
B. Souches bactériennes ............................................................................ 82
C. Plasmides .............................................................................................. 82
II. Techniques d’analyse du parfum ............................................ 87
A. Extraction par solvant........................................................................... 87
B. Headspace dynamique .......................................................................... 89
C. Solid Phase Micro Extraction ou SPME............................................... 89
D. Analyse des composés volatils par Chromatographie en Phase Gazeuse
(CPG) .................................................................................................................... 91
E. Identification des composés .................................................................. 91
III. Techniques cytologiques ....................................................... 92
A. Microscopie optique et microscopie électronique à transmission ........ 92
B. Microscopie électronique à balayage environnementale et microscopie
confocale ............................................................................................................... 93
5
C. Mise en évidence des lipides et des terpènes sur matériel non fixé...... 93
IV. Techniques de dosage de l’amidon et du D-glucose ............. 94
A. Principe du dosage................................................................................ 94
B. Détermination des quantités d’amidon et de D-glucose libre ............... 94
V. Techniques de biologie moléculaire ...................................... 95
A. Extraction d’acides nucléiques ............................................................. 95
B. Obtention d’ADN complémentaire....................................................... 97
C. Construction de la banque d’ADNc double brin pour la RACE-PCR.. 98
D. Techniques d’amplification d’ADN par PCR ...................................... 99
E. Techniques de clonage ........................................................................ 102
F. Expression de protéines recombinantes .............................................. 105
G. Techniques d’étude des protéines....................................................... 108
H. Analyse par SDS-PAGE et Western-blot ........................................... 110
I. Tests d’activité ..................................................................................... 113
J. Obtention de plantes transgéniques de tabac ....................................... 114
Résultats .......................................................................................... 116
I. La production du parfum chez les roses................................ 116
A. La production du parfum au sein de la fleur....................................... 116
B. Les pétales : organes producteurs de parfum...................................... 123
C. Les différences entre les roses parfumées et les roses non parfumées 132
II. Isolement de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des monoterpènes
............................................................................................................... 139
A. La 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate réductoisomérase ou DXR ..... 141
B. La géranyl diphosphate synthase ou GPPS......................................... 159
Discussion........................................................................................ 165
I. Développement floral et sécrétion du parfum........................ 165
A. Les organes floraux des roses Hybrides de Thé produisent des bouquets de
composés spécifiques .......................................................................................... 165
B. Le parfum évolue au cours de l’épanouissement de la fleur............... 167
II. Structure du pétale, production et sécrétion des composés volatils 169
A. L’organisation générale du pétale....................................................... 169
B. Les deux épidermes du pétale sont sécréteurs .................................... 170
C . L’évolution des plastes dans le pétale................................................ 171
D. Les mécanismes de sécrétion.............................................................. 173
6
III. L’absence de parfum chez les roses sélectionnées pour la fleur coupée 176
A. Le parfum des roses non parfumées ................................................... 176
B. La structure des pétales des roses non parfumées est identique à celle des
roses parfumées ................................................................................................... 177
C. L’hypothèse de la cuticule .................................................................. 177
D. Les ressources carbonées chez les roses non parfumées .................... 178
IV. La DXR est impliquée dans la synthèse des terpènes chez la rose. 178
V. Une GPPS homodimérique ou hétéromérique chez la rose ?182
Références bibliographiques ........................................................... 185
7
Abréviations
ADH Alcool déshydrogénase
BA2H benzoïque acide 2-hydroxylase
BAMT S-adénosyl-L-méthionine:benzoïque acide carboxylméthyltransférase
BEAT Benzylalcool acétyltransférase
BF Bouton fermé
BJO Bouton juste ouvert
BO Bouton ouvert
BSMT S-adénosyl-L-méthyl:benzoïque acide/salicylique acide carboxylméthyltransférase
BTO Bouton très ouvert
BZL benzoate:CoA ligase
C4H cinnamique acide 4-hydroxylase
CaMV35S Promoteur 35S du virus de la mosaïque de tabac
CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
CDP-ME 4-diphosphocytidyl-2C-méthylérythritol
CDP-MEP 4-diphosphocytidyl-2C-méthylérythritol 2-phosphate
CMK CDP-ME kinase
CMS CDP-ME synthase
CPG Chromatographie en Phase Gazeuse
DMAPP Diméthylallyl diphosphate
DMT 3,5-diméthoxytoluène
DXP 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate
DXR 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate réductoisomérase
DXR DXP réductosiomérase
DXS DXP synthase
ESTs Expressed Sequence Tags
FE Fleur épanouie
FPP Farnésyl diphosphate
FPPS FPP synthase
FS Fleur sénescente
GFP Green Fluorescent Protein
GGPP Géranylgéranyl diphosphate
GGPPS GGPP synthase
GPP Géranyl diphosphate
GPPS GPP synthase
HDS HMBPP synthase
HMBPP 1-hydroxy-2-méthyl-2E-butényl 4-diphosphate
HMG-CoA 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A
HPLS Hydroperoxyde lyase
IDI IPP isomérase
IDS IPP synthase
Abréviations
8
IF Facteur d’isomérisation
IPP Isopentényl diphosphate
IPTG Isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside
LIS Linalol synthase
LOX Lipoxygénase
LSU Large subunit
MCS ME-cPP synthase
MEB Microscopie électronique environnementale à balayage
ME-cPP 2C-méthyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate
MEP 2C-méthyl-D-érythritol 4-phosphate
MET Microscopie électronique à transmission
MEV Mévalonate
MFS Menthofurane synthase
MVK MEV kinase
MVP 5-phosphomévalonate
MVPP 5-diphosphomévalonate
OOMT Orcinol-O-méthyltransférase
PINS Pinène synthase
PMD MVPP décarboxylase
PMK MVP kinase
POMT Phloroglucinol-O-méthylétransférase
ppb partie par billion (1 ppb = 1 µl dans 100 m3)
SA GTase UDP-Glc:salicylique acide glucosyltransférase
SAMT S-adénosyl-L-méthyl:salicylique acide carboxyl méthyltransférase
SPME Solid Phase Micro Extraction
SSU Small subunit
TIA Alcaloïdes indoles terpéniques
TMB 1,3,5-triméthoxybenzène
TPS Terpène synthases
VOCs Volatiles Organic Compounds (ou Composés Organique Volatils)
Abréviations
9
Avant-Propos
Les espèces du genre Rosa constituent l’un des groupes ornementaux les plus
importants au niveau économique à cause de leur popularité en tant que fleurs de jardin, fleurs
paysagères, plantes en pots, fleurs coupées, mais également à cause de leur utilisation comme
source d’huile essentielle pour l’industrie de la parfumerie (Gudin, 2000). Au niveau mondial,
la superficie des cultures de roses pour la fleur coupée est supérieure à 5000 ha, ce qui
correspond à 25 % des surfaces de l’ensemble des fleurs coupées. Plus de 120 espèces
botaniques, organisées en 10 sections composent ce genre (Rajapakse et al., 2001), mais
malgré cette richesse potentielle, seules sept à dix espèces appartenant à trois sections ont été
utilisées pour créer les 20000 cultivars commerciaux qui constituent la rose moderne (Martin
et al., 2001 ; Crespel et al., 2002).
Les roses sont aussi diverses par leurs formes que par leurs parfums et, depuis
quelques années, le parfum bénéficie d’un regain d’intérêt de la part du public. Pour répondre
à cette demande, le caractère parfumé est un critère de sélection largement pris en compte par
les obtenteurs, comme en témoignent leurs catalogues. En plus des parfums de roses
classiques, les rosiéristes développent des fragrances originales et l’on peut aujourd’hui
trouver des roses qui sentent les fruits (pomme, framboise etc…), l’anis ou la myrrhe.
Cependant, si le parfum est souvent bien présent chez les rosiers de jardin, il est beaucoup
plus discret, voire absent, chez les roses destinées à la production de fleurs coupées. En effet,
les roses modernes sont issues d’un long processus de sélection basé sur des critères comme
la résistance au froid et aux maladies, la forme des fleurs, la remontance et, pour les roses à
fleurs coupées, la tenue en vase. Chez ces dernières, la sélection de ces critères s'est souvent
accompagnée d'une perte du caractère parfumé. Les causes de cette disparition sont
actuellement inconnues, et cette méconnaissance rend ce caractère particulièrement difficile à
manipuler dans les schémas de sélection. D’après l’expérience des obtenteurs, le parfum se
caractérise par une héritabilité complexe, et ils constatent que, lors d’un croisement de rosiers
parfumés, seuls 10% de leurs descendants le sont. De plus, le parfum semble incompatible
avec d’autres caractéristiques comme, par exemple, une couleur rouge intense et la résistance
au botrytis (Gudin, 1995).
La région Rhône-Alpes est l’un des pôles mondial de création de nouvelles variétés de
rose pour les jardins et la fleur coupée. Depuis 1999, trois laboratoires français se sont
regroupés pour initier un programme de recherche sur le parfum des roses, soutenu par la
Avant-propos 10
région Rhône-Alpes. Il s’agit du laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes
(RDP, UMR 5667 CNRS/INRA/ENS/UCB Lyon 1) de l’Ecole Normale Supérieure de Lyon,
dirigé par C. Dumas, du laboratoire Génome et Evolution des Plantes Supérieures de
l’Université Claude Bernard Lyon I (GEPS, EA632), avec l’équipe de P. Heizmann et du
laboratoire de Biotechnologies Végétales appliquées aux plantes aromatiques et médicinales
(BVpam, EA 3061), dirigé actuellement par L. Legendre. L'objectif de ce programme, mené
en collaboration avec le Collectif des Rosiéristes de la Région Rhône-Alpes, est de mettre en
œuvre différents outils moléculaires pour identifier des marqueurs du caractère parfumé des
roses. Le parfum apparaissant comme un caractère particulièrement difficile à cerner dans les
schémas d’hybridation traditionnels, ces marqueurs devraient à terme fournir aux obtenteurs
des outils de sélection raisonnée du caractère parfumé. Lorsque ce programme a débuté,
aucun gène impliqué dans les voies de biosynthèse des composés du parfum n’était connu
chez la rose et aucune étude structurale récente du pétale de rose n’avait été menée, en
relation avec la sécrétion de composés volatils.
Ainsi, le laboratoire GEPS a travaillé sur la généalogie du parfum afin de comprendre
comment ce caractère se transmet lors des croisements (thèse M. Martin, dirigée par P.
Heizmann). Le laboratoire RDP, après avoir obtenu une banque d’EST de pétales de rose, a
développé une thématique de recherche sur la biosynthèse des composés aromatiques et des
dérivés des caroténoïdes (thèse G. Scalliet, dirigée par P. Hugueney), ainsi que sur l’étude des
gènes qui gouvernent le développement du pétale de rose. Le laboratoire BVpam s’est, quant
à lui, intéressé à la production du parfum.
Dans ce contexte, ma thèse, financée par la Région Rhône-Alpes, avait deux objectifs
principaux :
− Etudier le pétale de rose en tant qu'organe producteur et émetteur de
composés volatils,
− isoler et caractériser des gènes impliqués dans la production des
composés majoritaires du parfum des roses Hybrides de Thé, les
monoterpènes.
Dans un premier volet, nous avons souhaité réaliser une « cartographie » de la fleur de
rose pour répondre aux questions suivantes :
- Quels sont les organes floraux producteurs de parfum chez les roses
Hybrides de Thé ?
- Est-ce que l’ensemble du pétale produit du parfum ?
- Quels sont les tissus qui produisent le parfum au sein du pétale ?
Avant-propos 11
- Peut-on identifier des structures cellulaires liées à la production du
parfum ?
Pour cela, nous avons mis en œuvre des techniques cytologiques et
chromatographiques. Nous avons utilisé des roses considérées comme très parfumées et
d’autres inodores, afin de trouver des pistes expliquant l’absence de parfum chez ces
dernières.
Dans une deuxième partie des travaux, nous avons recherché des gènes impliqués dans
la biosynthèse des monoterpènes. Deux gènes ont retenu notre attention : le gène de la 1-
désoxy-D-xylulose 5-phosphate réductoisomérase et le gène de la géranyl diphosphate
synthase. Le premier gène intervient très précocement dans la voie de biosynthèse des
terpènes et des travaux chez la menthe ont montré que sa surexpression permettait
d'augmenter la quantité d'huile essentielle produite. Ce gène nous paraît donc un bon candidat
pour l'amélioration des variétés de rose utilisées pour la production de composés destinés à
l'industrie de la parfumerie. Le deuxième gène permet la formation du premier squelette de
base des monoterpènes. C’est donc un gène clé, potentiellement régulateur de la biosynthèse
de ces composés volatils.
Avant-propos 12
Il y a 5000 ans, les roses étaient déjà cultivées en Chine, à l’ouest de l’Asie et en
Afrique du Nord. La plus vieille représentation d’une rose a été découverte à Knossos, en
Crète, sur une fresque datant probablement du 18ème siècle avant J.-C. Elle correspondrait
peut-être à l’espèce Rosa x richardii (Testu, 1984). Dans la littérature et la poésie antiques, il
est souvent fait mention du rosier, sans qu’il soit toujours possible de préciser l’espèce avec
certitude. Pendant l’Antiquité, la rose décorait les tombes de Grèce et de Chine et avait une
haute valeur symbolique. Ainsi, elle symbolisait la discrétion à Rome, la vertu en Extrême-
Orient et le silence en Egypte. Avant d’être la plante de jardin la plus populaire, la rose était
utilisée pour son parfum et ses propriétés comestibles. De nombreuses informations sur les
utilisations des roses dans l’Antiquité nous sont fournies par les écrits de l’historien grec
Hérodote (490-420 av. J.-C.), du philosophe grec Théophraste (372-287 av. J.-C.) et du
naturaliste romain Pline l’ancien (23-79 av. J.-C.) (Testu, 1984). Par exemple, selon Pline, les
Romains cultivaient déjà les roses sous des serres chauffées en hiver par de l’eau chaude
(Testu, 1984). Ils utilisaient plus de 32 remèdes à base de différentes parties du rosier (Gudin,
2000). Le rosier est donc utilisé à des fins médicinales et décoratives depuis des temps
immémoriaux. Cependant, la popularité de la rose en tant que plante horticole a vraiment pris
son essor au 19ème siècle et s’est encore amplifiée au 20ème siècle. La rose est aujourd’hui la
première espèce ornementale par ordre d’importance économique (Gudin, 2000).
I- La rose, histoire et importance économique

A- La généalogie des Roses
1. Le genre Rosa
Les premiers fossiles du genre Rosa identifiés avec certitude ont été trouvés aux USA
et datent de 35 à 40 millions d’années (Weiss, 1997). Les Rosiers appartiennent à la famille
des Rosacées qui compte près de 115 genres et 3200 espèces. Ils sont répandus à travers
toutes les régions froides et tempérées de l’hémisphère Nord, depuis le cercle arctique
jusqu’aux sous-tropiques, dans des régions incluant les Etats-Unis, l’Iraq, l’Éthiopie, le
Bengale et le sud de la Chine (Gudin, 2000). Le genre Rosa regroupe près de 150 espèces et
près de 20 000 cultivars commerciaux (Rajapakse et al., 2001). La classification traditionnelle
du genre Rosa est celle de Rehder (1940). Elle est encore actuellement utilisée, avec quelques
Introduction bibliographique 13
remaniements (Wissemann, 2003). Le genre Rosa est divisé en quatre sous-genres :
− Le sous-genre Hulthemia n’est représenté que par une seule espèce diploïde,
Rosa persica, qui occupe une vaste zone subdésertique d’Asie centrale et se caractérise
notamment par des feuilles entières sans stipules. Elle est souvent considérée comme une
forme primitive des rosiers.
− Le sous-genre Platyrhodon, représenté par l’espèce Rosa roxburghii, s’étend
du Sud Laos à l’île d’Hokhaïdo. Cette espèce est diploïde et remarquable pour sa souplesse
d’adaptation. On l’utilise dans les jardins pour l’originalité de ses cynorrhodons couverts
d’aiguillons, qui ressemblent aux bogues de la chataîgne.
− Le sous-genre Hesperhodos, représenté principalement par l’espèce Rosa
stellata, apparaît comme un isolat occupant la zone côtière du Pacifique du Sud des Etats-
Unis.
− Le sous-genre Eurosa ou Rosa regroupe la plupart des espèces de roses et est
divisé en 10 sections (Redher, 1949) dont quelques caractéristiques sont données dans le
tableau 1 (Wissemann, 2003 ; Tarbouriech, 2001).
Le nombre de chromosomes des rosiers varie de 2n = 2x = 14 à 2n = 8x = 56, mais la

plupart des espèces du sous-genre Eurosa sont diploïdes ou tétraploïdes (Rout et al., 1999).
La quantité d’ADN 2C dans les roses diploïdes varie entre les sous-genres, les sections et les
cultivars. Elle va de 0,78 pg chez Rosa xanthina et Rosa sericea (section Pimpinellifoliae) à
1,29 pg chez ‘Félicité et Perpétue’ (hybride moderne). Néanmoins, à l’intérieur d’une même
section, les quantités d’ADN sont très similaires (Yokoya et al., 2000). Les rosiers
représentent un matériel difficile pour les études génétiques à cause de leur forte
hétérozygotie, leur niveau de ploïdie, en plus des difficultés liées à la reproduction (Crespel et
al., 2002).
2. domestication des Roses

Les roses modernes résultent d’un processus de domestication qui s’est développé au
cours du 19ème siècle et qui s’est poursuivi au 20ème siècle. De nombreux croisements et
hybridations ont été réalisés entre les roses d’origine européenne et les roses d’origine
chinoise (Fig.1). Plusieurs études sont menées pour préciser les étapes de cette domestication
et les relations phylogénétiques entre les différents groupes de rosiers (Martin et al., 2001). La
domestication a permis l’introduction dans les roses modernes de caractères horticoles
Tableau 1 : Caractéristiques des 10 sections du sous-genre Eurosa (d'après
Tarbouriech, 2001)
Section Exemples d'espèces
CANINAE
Arbustes, fleurs roses ou blanches, feuilles à 5 ou 7 folioles, Rosa canina L. ou rosier des chiens
aiguillons gros, recourbés R. rubiginosa L. (à feuilles odorantes)
R. villosa L. (dont les fruits sont riches en vitamine C)
R. montana Chaix ou rosier des montagnes
GALLICANAE
Buissons dressés, pas très élevés ; aiguillons recourbés de taille R. gallica L. ou rose de France (protégée par la loi)
variable, généralement mêlés de cils ; grandes fleurs roses. R. x damascena L. ou rose de Damas
Aptitude au drageonnage R. x centifolia Miller ou rose Cent-feuille
R. x centifolia f. muscosa (Mill.) ou rosier mousseux
PIMPINELLIFOLIAE
Rosiers à de feuilles de pimprenelle. Feuilles à nombreuses folioles R. pimpinellifolia L. : rosier à feuilles de pimprenelle qui a colonisé
(plus de 9) faisant penser à celles de la pimprenelle. Buisson bas. un grand nombre de milieux, du littoral aux pelouses alpines
Aiguillons droits de taille variée. Aptitude au drageonnage R. foetida Herm (fleur d'un jaune vif très lumineux) qui a donné la
belle couleur jaune des roses cultivées
R. foetida f. bicolor (Jacq.) E. Wilm : fleurs dont la face supérieure
des pétales est orange et la face inférieure est jaune cuivre
R. omeiensis f. pteracantha (Franch.) Redh & E.M. Wils. , avec des
aiguillons très larges, rouges, translucides
SYNSTYLAE
Pistil au centre de la fleur ressemble à une petite colonne (styles R. arvensis Huds. : rosier des champs à petites fleurs blanches qui
soudés) contrairement aux autres sections où le pistil est en forme de s'hybrident facilement avec R. gallica L.
coussinet. Rosiers grimpants ou rampants R. sempervirens L.: rosier au feuillage toujours vert des régions
méridionales, sensible au gel. Deux espèces originaires de l'Extrême-
Orient, R. multiflora Thunb. et R. wichuraiana Crep. sont à l'origine
de la plupart des variétés de rosiers grimpants
CINNAMONEAE
Rosiers cannelle. Buissons dressés assez hauts, souvant drageonnant R. majalis Herm. ou rose de mai dont la floraison est très précoce
Aiguillons droits avec des gradients de densité sur la tige. Fruits en R. pendulina L. ou R. alpina L. ou rose des Alpes : pratiquement
général allongés dépourvue d'aiguillons, aux fruits allongés pendant aux rameaux
R. rugosa Thunb. ou rosier rugueux du Japon aux feuilles gaufrées,
pouvant pousser sur des sols salés
R. acicularis Lindl. : seule espèce de rosier à dépasser le cercle
polaire
CAROLINAE
Regroupe quelques espèces d'Amérique du Nord. Feuillage souvent R. carolina L. ou rose de Caroline
brillant. Diffère de la section précédente par la forme des fruits, R. palustris Marsh. ou rose des Marais
habituellement globuleux aplatis, avec des akènes insérés seulement R. virginiana Mill. ou rose de Virginie
au fond du réceptacle
INDICAE
Roses de Chine R. chinensis Jacquin ou rose du Bengale
Des espèces de cette section, trouvées en Extrême-Orient, ont été R. x odorata (Andr.) Sweet ou rosier à odeur de thé
ramenées en Europe à la fin du XVIIIème siècle; par croisements, R. gigantea Colett. grimpant
elles ont permis d'obtenir des variétés remontantes, à la floraison R. chinensis var. viridiflora Dipp. ou rose verte
continue R. chinensis f. mutabilis (Correv.) Rehd. ou rosier à couleur variable
BANKSIANAE
Très longues tiges internes pouvant atteindre 10 cm; originaire de R. banksiae Ait. Ou rosier de Banks
Chine R. cymosa Tratt. A fleur en grappe et tout petit fruit
LAEVIGATAE
Originaire de Chine, contient une espèce et ses hybrides ; grimpante R. laevigata Mich. ou rose des Cheerokees
à grandes fleurs blanches, tiges à aiguillons recourbés, feuilles à 3 R. x anemonoïdes Rehd ou rose anémone à fleurs pourpres
folioles luisantes. Peu rustique
BRACTEATAE
Contient une espèces et ses hybrides. Feuillage persistant et brillant. R. bracteata JC Wendl. ou rose de Maccartney
Fleurs blanches R. x leonida Moldenke ou Maria leonida
Figure 1 : Généalogie simplifiée des rosiers modernes (d'après Maia and Vénard, 1976)
importants, comme la résistance au froid, la résistance aux maladies, la duplicature florale et
la remontance de la floraison (Maia et Venard, 1976).
Jusqu’au début du 19ème siècle, la plupart des roses appartenaient au groupe des rosiers
galliques d’origine européenne, qui sont souvent bien parfumés mais ont une floraison non
remontante. Seule Rosa x damascena ‘bifera’, connue dans le sud de l’Europe depuis le 14ème
siècle, présentait un caractère remontant.
L’introduction en Angleterre des roses de Chine au début du 19ème siècle a constitué
une étape importante dans l’évolution des roses de jardin. En fait, les premières roses de
Chine furent importées en Europe au 16ème siècle mais leur culture resta confinée au Sud de
l’Europe, principalement en Italie, en raison de leur sensibilité au froid. Quatre clones
fondateurs, issus probablement de croisements entre Rosa chinensis et Rosa gigantea et
introduits successivement au début du 19ème siècle donnèrent naissance aux roses modernes,
par hybridation avec les roses anciennes galliques (Maia and Vénard, 1976). Les premiers
groupes horticoles issus de ces croisements sont les rosiers Thé comme Rosa x hybrida ‘Lady
Hillingdon’, remontants mais assez sensibles au froid. Parallèlement à la création des rosiers
Thé, les hybrideurs avaient donné naissance à un autre groupe de rosiers horticoles, les
Hybrides Remontants, là encore par des croisements complexes entre des rosiers chinois et
des rosiers européens comme Rosa gallica. Malheureusement, si ces hybrides remontants
étaient bien rustiques, leur floraison était parcimonieuse. Des croisements de ces rosiers
Hybrides Remontants avec des rosiers Thé donna naissance aux rosiers modernes que l’on
appelle les Hybrides de Thé. Ces rosiers possèdent le caractère de floraison continue et parfois
le parfum de thé des roses de Chine, associés à la rusticité et à la résistance au froid des roses
galliques européennes. Toutes les variétés Hybrides de Thé actuelles sont tétraploïdes.
Classiquement, la variété ‘La France’ est considérée comme la rose fondatrice de la lignée des
Hybrides de Thé. Elle fut créée en 1867 par l’obtenteur lyonnais Jean-Baptiste Guillot. En
1897, un autre horticulteur lyonnais, Joseph Pernet-Ducher, croisa un Hybride de Thé avec la
rose sauvage Rosa foetida à fleurs d’un jaune très intense. La sélection des hybrides obtenus
donna naissance à la variété ‘Soleil d’or’, une rose possédant une couleur jaune inédite, ce qui
permit d’élargir la palette de couleurs disponible chez les rosiers.
Depuis la seconde guerre mondiale, les sélectionneurs exploitent les immenses
ressources génétiques que leur offrent les espèces botaniques du genre Rosa. On assiste à la
création de rosiers de plus en plus variés et adaptés à de multiples usages. Ainsi, des
croisements des Hybrides de Thé ont été réalisés avec plusieurs rosiers sauvages, par exemple
Rosa multiflora. Ceci a abouti à la constitution du groupe des Hybrides de Polyantha, ou
rosiers à fleurs groupées. On peut citer également l’essor récent des rosiers miniatures,
adaptés à la culture en pots, ou les rosiers robustes, résistants aux maladies, qui décorent les
bordures d’autoroute.
B. Les utilisations des Roses

Le genre Rosa est le genre économiquement le plus important de l’horticulture
ornementale. La production en serre de roses coupées représente un investissement variable
selon les zones de production. Ainsi, dans les pays tropicaux en voie de développement
(Colombie, Equateur, Kenya et Zimbabwe), cet investissement est de l’ordre de 20 à 50 $.m-2
d’exploitation alors qu’il est de 200 à 300 $.m-2 dans les pays développés de l’hémisphère
Nord (Pays-Bas, Scandinavie, Amérique du Nord). Pour les producteurs, il est donc plus
intéressant de délocaliser la production dans les pays de l’hémisphère Sud. Il existe un marché
substantiel du rosier dans les pays développés. Environ 20 millions de plants de rosiers de
jardin sont commercialisés uniquement au Royaume-Uni et des millions de rosiers miniatures
sont vendus chaque année dans le monde. Outre leur intérêt pour le jardin d’agrément, les
roses sont également utilisées dans l’industrie du parfum et de façon plus mineure dans
l’industrie agro-alimentaire.
1. La création de rosiers de jardin

Il existe peu de données concernant la production et la commercialisation des rosiers
de jardin et des rosiers miniatures.
La production française, répartie sur 3 grandes régions, estimée à plus de 15 millions
de plantes, est assurée par 150 rosiéristes sur 600 ha et correspond à 1000 variétés environ
(Delbard, 2002). L’achat de rosiers de jardin et de rosiers miniatures représente 40 % du total
des plantes ornementales. Au niveau européen, la commercialisation dépasse 100 millions de
plantes, dont 16 millions en Allemagne et 20 millions en Grande-Bretagne. La production
européenne est assurée en partie par les pays de l’Europe de l’Est. Ainsi, près de la moitié des
rosiers vendus en Allemagne sont issus de la production de la Pologne et de la Hongrie.
Un flux régulier de nouvelles variétés est également assuré. Ainsi, plus de 400
demandes de Certificats d’Obtentions Végétales ont été déposées depuis 1995. Les objectifs
de la sélection concernent bien sûr la forme et la beauté de la fleur mais également le port de
la plante, le parfum et surtout la résistance aux maladies. Des formes et un parfum rappelant
les roses anciennes comme R. x centifolia, sont recherchés par les consommateurs. Ceci
explique le succès des « roses anglaises » commercialisées par l’obtenteur David Austin, par
exemple. On assiste également à un engouement pour les rosiers dits 'paysagers’, peu
exigeants sur les conditions de culture. La durée moyenne de la sélection varie de 6 à 8 ans.
2. La production de fleurs coupées

Les surfaces totales cultivées en roses pour la fleur coupée représentent une superficie
de 5000 ha, ce qui correspond à 25 % des surfaces dévolues à l’ensemble de la culture des
fleurs coupées. La création de variétés et de porte-greffes adaptés aux différentes conditions
climatiques de production, ainsi qu’à la conservation et au transport sur des longues distances,
a permis une adaptation de l’offre à la demande (Delbard, 2002).
La production, essentiellement européenne à l’origine, a été profondément bousculée
par l’augmentation du coût des ressources énergétiques. La part élevée des coûts de main-
d’œuvre dans les pays européens et aux Etats-Unis a également participé à la délocalisation de
la production vers d’autres pays. Les principales zones de production sont aujourd’hui
concentrées en Hollande, en Amérique latine pour 30 % (Colombie, Equateur et Mexique), en
Afrique de l’Est pour 15 % (Kenya, Zimbabwe, Tanzanie, Ouganda et Éthiopie). La
production sud-américaine est destinée à l’exportation vers les Etats-Unis à 80 % et vers
l’Europe et la Russie à 20 %. La production africaine est destinée à 90 % à l’exportation vers
l’Europe.
Le nombre de variétés cultivées pour la fleur coupée est en forte augmentation. En
effet, en 2001, 420 variétés étaient cultivées, contre 230 en 1991 (Delbard, 2002). L’essor de
cette production de fleurs coupées implique des variétés adaptées ayant une croissance rapide,
une floraison abondante en toutes saisons (même avec un chauffage hivernal des serres
limité), une production de fleurs de grande valeur esthétique, présentant une bonne longévité
en vase et supportant bien le conditionnement et le transport (Meynet, 2001). A côté de ces
critères de sélection classique, d’autres sont maintenant pris en compte par les sélectionneurs :
parfums, formes et couleurs originales.
3. La production d’huiles essentielles

Depuis l’Antiquité, la parfumerie a toujours fait un grand usage de la rose, soit en
soliflore (la rose constitue l’essentiel du parfum), soit comme note de cœur associée à d’autres
essences dans les parfums dits ‘floraux’. Elle est encore actuellement utilisée dans de
nombreux parfums féminins.
Les roses anciennement utilisées pour l’industrie des arômes et parfums sont la rose de
Damas (Rosa x damascena), la rose de mai (Rosa x centifolia) longtemps cultivée de façon
intensive à Grasse, la rose des apothicaires (Rosa gallica), la rose blanche (Rosa alba) et la
rose de Chine (Rosa rugosa) (Lawrence, 1991). Actuellement, seules Rosa x damascena et
Rosa x centifolia sont encore cultivées sur des surfaces importantes, principalement en
Bulgarie, en Tunisie et au Maroc. En France, il ne reste qu’une production de quelques
hectares de Rosa x centifolia à Grasse, destinée à la fabrication des parfums de luxe comme
Chanel N°5.
Plusieurs produits sont obtenus à partir des roses. Par distillation à la vapeur de fleurs
entières, on obtient l’huile essentielle et l’eau de rose qui contient les composés les plus
hydrosolubles, comme le 2-phényléthanol. La Bulgarie, producteur principal d’huile
essentielle de rose, en exporte 1400 kg par an. Le rendement se situe entre 1 et 3 tonnes de
fleurs par hectare. Environ trois tonnes de roses sont par ailleurs nécessaires pour obtenir 1 kg
d’huile essentielle. En conséquence, le prix de l’huile essentielle est assez élevé, de 2000 à
7000 €.kg-1 en fonction des provenances (Schulz, 2003). La concrète est obtenue par une
extraction des pétales ou des fleurs entières par un solvant comme l’hexane ; c’est un produit
semi-solide qui contient des cires. Pour éliminer ces cires, la concrète est solubilisée par de
l’alcool, puis refroidie, ce qui fait précipiter les cires, et enfin filtrée. L’alcool est ensuite
évaporé sous vide : on obtient alors le produit le plus concentré en molécules odorantes et le
plus cher, l’absolu de rose. Il faut approximativement 400 kg de roses pour obtenir 1 kg de
concrète et 0,5 kg d’absolu (Weiss, 1997). Selon les parfumeurs, ces deux produits, l’huile et
l’absolu, ont des propriétés olfactives différentes. Une des différences dans la composition de
l’huile essentielle et de l’absolu de rose est la concentration en 2-phényléthanol. Il est très
présent dans l’absolu (60 à 75 %) et beaucoup moins dans l’huile (1 à 2 %) à cause de sa
solubilité dans l’eau (Kurkcuoglu et Baser, 2003).
Si l’on regroupe l’huile essentielle de rose et la concrète, la production annuelle
mondiale est estimée à environ 20 tonnes, les principaux producteurs étant la Bulgarie et la
Turquie (Schulz, 2003). Au niveau du chiffre d'affaires, l’huile essentielle de rose occupe la
troisième place avec 40 000 millions $ derrière l’huile de Mentha x piperita (96 000 millions
$), et de Mentha arvensis (57 600 millions $). Les huiles essentielles produites peuvent être,
soit consommées sur place, soit exportées, puis mélangées à différents produits de synthèse.
Près de 75 % de la production d’huile essentielle est importée en Europe, aux Etats-Unis, au
Japon, en Suisse et au Canada. L’huile essentielle de rose est utilisée par la France, les Etats-
Unis, l’Angleterre et le Japon, pour les produits cosmétiques et les parfums.
C. Le parfum des roses
1. Les grandes catégories de composés volatils

Les composés odorants sont de petites molécules organiques qui s’évaporent
facilement (VOCs, Volatile Organic Compounds) et interagissent avec les récepteurs olfactifs
des animaux. En général, les odeurs des plantes, et en particulier la fragrance des fleurs, sont
formées par le mélange de plusieurs molécules volatiles. Chez la rose, ce mélange est
particulièrement riche et complexe puisqu’on a pu décrire plus de 275 composés volatils dans
l’huile essentielle de Rosa x damascena (Ohloff et Demole, 1987). Pour ordonner cette
diversité chez les plantes et chez la rose en particulier, trois catégories de VOCs peuvent être
distinguées (Fig. 2) :
- Les terpènes sont des composés qui dérivent tous d’un même précurseur, l’isoprène.
Chez la plupart des roses, ce sont les composés les plus abondants. On trouve en grandes
quantités les alcools monoterpéniques comme le géraniol, le citronellol, le nérol et leurs
dérivés. Les alcools monoterpéniques donnent aux fleurs une odeur typique de rose. On note
également la présence de sesquiterpènes, plus lourds, comme le germacrène D. A côté de ces
composés majeurs, il existe chez la rose des dérivés de terpènes présents en quantités infimes
mais qui contribuent significativement à la fragrance de la fleur, à cause de leur pouvoir
olfactif élevé (Ohloff et Demole, 1987). C’est le cas des cétones de rose comme le dihydro-β-
ionol et la β-ionone (0,007 ppb).
- Les dérivés d’acide gras proviennent de la coupure des acides gras par des
lipoxygénases. Ils sont synthétisés abondamment par les feuilles et les sépales, souvent à la
suite d’une blessure, c’est pourquoi ils sont aussi appelés « green leaf volatiles ». Ils jouent un
rôle dans la défense directe.
Les composés aromatiques dérivent tous de la phénylalanine. Certains sont présents en
quantités très importantes chez certaines roses. C’est le cas du 2-phényléthanol, qui a une
odeur typique de rose dite odeur rosée. D’autres, comme le DMT (3,5-diméthoxytoluène) et le
TMB (1,3,5-triméthoxybenzène), donnent aux roses qui en possèdent en grandes quantités
une odeur qualifiée d’odeur de thé.
2. Les variétés parfumées

Chaque variété de rose synthétise donc un mélange complexe et unique de produits
volatils, ce qui fait que pour un nez exercé, aucune rose n’a exactement le même parfum. Bien
qu’aucune d’étude exhaustive n’ait été menée, le parfum est souvent bien présent chez les
Terpènes
Monoterpènes
OH
OH OH
OH
g cit n l
Sesquiterpènes
germacrène D
Cétones de rose
O
β-
Composés
OH OH
H3CO OCH3
3,5- OCH3
2-
diméthoxytoluène OH eugé
Dérivés d’acide
OH
cis-
Figure 2 : Composés volatils du parfum de rose appartenant à trois classes de composés.
roses botaniques. Il a ainsi été étudié chez Rosa brunonii (Kaul et al., 1999), Rosa canina
(Ozel et Clifford, 2004), Rosa chinensis (Joichi et al., 2005) et surtout Rosa rugosa (Dobson
et al., 1990, 1999) pour tester la possibilité d’en extraire commercialement de l’huile
essentielle.
A tous les stades de la domestication, le parfum a constitué un caractère extrêmement
important chez la rose cultivée. Les roses botaniques étant le plus souvent à fleurs simples
avec cinq pétales, et la fragrance se trouvant concentrée dans les pétales, le processus qui
conduit à la duplicature de la fleur, entraîne de fait une augmentation du caractère parfumé
des fleurs. Ainsi, Rosa gallica ‘officinalis’, variété de Rosa gallica à fleurs doubles (plus de
10 pétales) utilisée pour ses propriétés médicinales depuis le moyen-âge, est plus parfumée
que son ancêtre à fleurs simples.
Les roses les plus étudiées pour leur parfum sont Rosa x damascena et Rosa x
centifolia utilisées de façon intensive pour la production d’huile essentielle et d’absolu
(Kovats, 1987 ; Lawrence, 1997 ; Oka et al., 1999 ; Jirovetz et al., 2002 ). Ce sont des roses
européennes qui ont donc une odeur de rose classique. Cette odeur est due aux grandes
quantités d’alcools monoterpéniques et de 2-phényléthanol qu’elles renferment. A titre
d’exemple, le tableau 2 présente les principaux composés de l’huile essentielle de Rosa x
damascena ainsi qu’une description de l’impression olfactive qui leur est associée.
Chez les roses modernes du groupe des Hybrides de Thé, les parfums sont très variés
et s’écartent bien souvent de ce que l’on considère comme le parfum de rose typique. De plus,
ces dernières années, les obtenteurs ont développé chez les roses des fragrances originales
comme des odeurs de fruit (framboise chez ‘Prestige de Lyon’ et anis chez ‘Paul Ricard’ par
exemple). De nombreuses études ont également été réalisées sur le parfum de ces Hybrides de
Thé, avec souvent pour but une tentative de classification du parfum en plusieurs catégories
(tableau 3 ; Nakamura, 1987 ; Flament et al., 1993). Certains auteurs ont également essayé de
trouver des composés spécifiques de tel ou tel groupe horticole et de bâtir une généalogie du
parfum. Des composés aromatiques particuliers, le DMT et le TMB ont retenu l’attention de
ces auteurs (Nakamura, 1987 ; Joichi et al., 2005).
Il s’agit de composés spécifiques des roses chinoises comme Rosa gigantea dont le
parfum est constitué à 50 % de DMT. Certaines roses Thé comme ‘Lady Hillingdon’ ont
hérité de ce parfum de type chinois (70 % de DMT). Leur fragrance, qualifiée d’odeur de thé,
est bien due à ces composés originaux, même si la signification de la référence au thé est peu
claire. Le DMT est décrit comme ayant une odeur poudrée, épicée, additionnée d’une odeur
verte et humide. De nombreux Hybrides de Thé modernes renferment une faible quantité de
Tableau 2 : Quelques composés identifiés dans l'huile essentielle de Rosa x damascena de
Bulgarie et les impressions aromatiques correspondantes (d'après Jirovetz et al., 2002).
Composé Impression aromatique

α-pinène Boisée, odeur de pin
β-myrcène Balsamique doux, note de plastique
cis-3-hexénol Note verte ('alcool de feuille'), herbe fraîche
cis-rose oxyde Florale, note de rose et de géranium, verte
citronellal Fraîche, note d'agrumes, verte
linalol Florale rafraîchissante, note d'agrume
β-caryophyllène Odeur de terpène, boisée, épicée
géranial Douce, odeur de rose, florale, chaude
trans-β-damascénone Florale, odeur de rose
citronellol Florale, odeur intense de rose, légèrement fruitée
géraniol Odeur de rose, florale sucrée, fruitée, laiteuse
acétate de géranyl Odeur de rose et de lavande, doucement fruitée
nérol Florale, odeur de rose, légèrement fruitée
β-ionone Balsamique, odeur de violette diluée
méthyleugénol Epicée, odeur de clou de girofle
2-phényléthanol Florale, odeur de rose, notes de miel
Tableau 3 : Classification du parfum des roses (d'après Nakamura, 1987)

Classification du parfum Variété de roses
Damas (classique) Rosa x damascena
R. x centifolia
Damas (moderne) R. x hybrida 'Papa Meilland'
Thé R. x hybrida 'Lady Hillingdon'
Fruité R. x hybrida 'Harmonie'

R. x hybrida 'Double Delight'
Bleu R. x hybrida 'Blue perfume'
R. x hybrida 'Blue Moon'
Épicé R. moschata
R. rugosa
Divers R. multiflora
R. x hybrida 'Diana'
DMT, souvent en mélange avec des composés à odeur de rose classique.
Lorsque ces composés manquent, la faible quantité de DMT présente n’est
généralement pas perceptible par l'odorat humain et ces roses sont décrites comme
dépourvues de parfum (Shalit et al., 2004). La fragrance de nombreux rosiers semble n'avoir
été perdue qu'au cours des étapes récentes de la domestication, lors de la création des rosiers
Hybrides de Thé destinés à être cultivés en serre et à fournir les fleurs coupées, et pour
lesquelles le parfum aurait été considéré comme peu prioritaire en comparaison de caractères
comme le port, la forme, la couleur et la tenue en vase (Van de Pol, 1986). Certains auteurs
supposent l’existence d’une liaison génétique entre l’absence de parfum et certains caractères
agronomiques comme la résistance au Botrytis, à la maladie des taches noires, et la tenue en
vase (Gudin, 1995). Cependant, un parfum anisé est bien présent chez certaines variétés
destinées à la fleur coupée comme ‘Daïkiri’ (obtention Meilland), à longue tenue en vase. La
ou les causes de l’absence de parfum de rose typique chez les variétés pour la fleur coupée
reste à déterminer.
Enfin, une des difficultés dans l’étude des fragrances des fleurs et des roses en
particulier est la présence de très nombreux composés à l’état de traces qui ont souvent une
incidence importante sur le caractère parfumé, à cause de leur seuil de détection olfactif très
bas. Ces composés (ionones, oxydes de roses etc…) font l’objet de toute l’attention des
parfumeurs qui les isolent puis les synthétisent chimiquement afin de les utiliser dans leurs
compositions parfumées (Shizuki et al., 2002).
II. Le rôle des composés volatils et les structures sécrétrices

A. Huiles essentielles, parfums et insectes
1. L’attraction des pollinisateurs

La fonction généralement attribuée aux parfums floraux est l’attraction des insectes
pollinisateurs. Cependant, les cas où ce rôle a été formellement démontré sont
paradoxalement assez rares (Pichersky et Gershenzon, 2002). Dans certains cas, les composés
volatils émis sont spécifiques d’un insecte pollinisateur ou d’un groupe de pollinisateurs. Par
exemple, les esters benzéniques, comme le benzylacétate, sont émis par une majorité de fleurs
pollinisées par les papillons. Raguso et al. (1996) ont testé l’hypothèse selon laquelle ces
papillons sont attirés préférentiellement par ces composés. Des individus capturés de Hyles
lineata, papillon de nuit pollinisateur de Clarkia breweri, ont été exposés à différents
composés volatils et les réponses électro-antennographiques ont été enregistrées. Les plus
fortes réponses sont obtenues après une exposition au benzylacétate et au méthylsalicylate. La
relation entre la nature des composés volatils et l’insecte pollinisateur a été également mise en
évidence chez Cimcifuga simplex. En effet, deux sous-espèces non odorantes de C. simplex
sont pollinisées par des bourdons, tandis qu’une troisième émet du méthyl-anthranilate et de
l’isoeugénol qui attirent spécifiquement des papillons pollinisateurs (Piechulla et Pott, 2003).
Il a été montré, notamment chez l’orchidée Ophrys sphegodes (Schiestl et al., 1999),
que la nature des composés volatils émis évolue au cours de la pollinisation. Les fleurs d’O.
sphegodes sont visitées par des abeilles mâles solitaires (Andrena nigroaenea) qui confondent
la fleur avec la forme du corps de l’abeille femelle. Les abeilles mâles présentent alors un
comportement pseudocopulatoire (Fig. 3). Des analyses des composés volatils associées à la
détection électroantennographique ont révélé que la fleur émet des alcanes et des alcènes (C21-
C29), responsables de ce comportement. Ces composés sont normalement émis par les abeilles
femelles réceptives à l’accouplement. Il est étonnant de noter que les fleurs d’O. sphegodes
produisent et émettent ces composés dans des proportions identiques à celles des abeilles
femelles réceptives. Une fois pollinisées, les fleurs émettent du farnésyl hexanoate, composé
normalement émis par les abeilles femelles non réceptives. Ceci a pour conséquence de
repousser les insectes mâles qui se dirigent vers les fleurs adjacentes non pollinisées et cela
limite les dommages sur les graines en développement.
La relation entre O. sphegodes et A. nigroaenea révèle une pollinisation active, c’est-
à-dire que fleurs et insectes pollinisateurs ont acquis des caractères comportementaux et/ou
morphologiques assurant la pollinisation (Thompson, 1989). Dans le genre Ficus, 2/3 des 750
espèces sont pollinisées de façon active (Jousselin et al., 2003) et les guêpes pollinisatrices se
reproduisent à l’intérieur des inflorescences. La relation Ficus/guêpe est une relation
obligatoire dont dépend la survie des deux espèces.
En effet, il s’agit d’un mutualisme espèce-spécifique dans lequel chaque partenaire a
besoin de l’autre pour se reproduire (Grison-Pigé et al., 2002a). Lorsque les figues sont
réceptives à la pollinisation, elles émettent des composés volatils (Grison et al., 1999) attirant
les insectes (Ware et Compton, 1994 ; Gibernau et al., 1998). Les travaux de Grison-Pigé et
al. (2002a) montrent qu’il existe une spécificité étroite entre figuier et guêpes pollinisatrices.
Par ailleurs, la réponse de l’insecte n’est pas dépendante d’un composé spécifique produit par
le figuier. Les effluves florales de différentes variétés de Ficus se composent toujours des
mêmes composés, mais dans des proportions différentes (Grison-Pigé et al., 2002b).
A
B Femelle
FID
EAD
Fleur
FID
EAD
Figure 3 : Relation entre la fleur de l'orchidée Ophrys sphegodes et son pollinisateur, un

mâle de l'espèce solitaire d'abeille Andrena nigroaenea (Schiestl et al., 1999). A, la fleur
mime l'apparence et les odeurs d'une femelle réceptive, induisant chez le mâle un
comportement speudocopulatoire. B, Chromatogrammes obtenus après analyse des composés
volatils par CPG (FID) émis par une femelle réceptive et la fleur et détection
électroantennographique (EAD). La majorité des composés sont émis par la femelle réceptive
et par la fleur prête à être pollinisée.
Le rôle des composés volatils dans la pollinisation a été démontré indirectement chez
Antirrhinum majus. En effet, les fleurs de muflier émettent majoritairement du
méthylbenzoate, synthétisé à partir de l’acide benzoïque grâce à une réaction catalysée par la
S-adénosyl-L-méthionine : benzoïque acide carboxyl méthyltransférase (BAMT). Negre et al.
(2003) ont montré que l’émission de méthylbenzoate diminue de 70 % après la pollinisation.
Ce phénomène est associé à une diminution de l’activité BAMT, parallèlement à la
diminution des niveaux de transcrits du gène BAMT. Cette diminution de l’activité BAMT ne
commence que lorsque les tubes polliniques ont atteint l’ovaire.
Dobson et Bergström (2000) ont également étudié l’odeur du pollen produit par les
fleurs. Ils ont ainsi montré que cette odeur est plus prononcée chez les plantes pollinisées par
les insectes que chez les plantes pollinisées par les oiseaux ou le vent. Les insectes qui se
nourrissent du pollen peuvent discriminer entre différents types de pollen et différentes
plantes hôtes, sur la base de l’odeur du pollen. De plus, les composés volatils émis pourraient
avoir un rôle dans la protection du pollen grâce à leurs propriétés antimicrobiennes.
De nombreux terpènes sont produits et émis à la fois par les feuilles et les fleurs,
repoussant ou attirant les insectes. Les feuilles produisent généralement les composés volatils
à l’intérieur de structures spécialisées, alors que les composés volatils floraux sont produits
par des osmophores ou les cellules coniques épidermiques des pétales. Récemment, Dufaÿ et
al. (2003) ont rapporté une localisation atypique de la production des composés volatils
impliqués dans la pollinisation. En effet, chez Chamaerops humilis, palmier nain de
Méditerranée, les feuilles produisent des composés volatils qui attirent des charançons
pollinisateurs (Derelomus chamaeropsis), alors que les fleurs sont sans odeur. La production
d’odeur est limitée à l’anthèse et pourrait avoir la même fonction que les parfums floraux. Cet
exemple offre la première opportunité d’étudier la transition entre la production de parfum
foliaire et floral. En effet, chez d’autres espèces de palmiers phylogénétiquement proches de
C. humilis, le parfum est produit uniquement par les fleurs, comme chez Guithaia
grossefibrosa, ou à la fois par les feuilles et par les fleurs, comme chez Serenoa repens
(Dufaÿ, 2003).
Certains composés volatils floraux, comme le linalol, sont produits également par les
trichomes présents à la surface des sépales (Caissard et al., article soumis) et des feuilles. Le
linalol émis par les fleurs a un rôle hypothétique dans l’attraction des insectes pollinisateurs
alors que celui qui est produit par les feuilles interviendrait dans les mécanismes de défense
en empêchant l’oviposition des insectes ou la prédation des feuilles (Kessler et Baldwin,
2001). Au niveau des fleurs, ces molécules volatiles produites par les sépales pourraient
empêcher la prédation du bouton floral ou le vol de nectar, obligeant l’insecte à passer par
l’intérieur de la corolle.
2. La défense contre les herbivores

Lorsqu’une plante est soumise à l’attaque d’insectes herbivores, les quantités de
composés volatils émis par ses feuilles augmentent de façon significative. La nature de ces
composés varie avec le couple espèce végétale/insecte herbivore (Paré et Tumlinson, 1999).
Ils sont non seulement impliqués dans les mécanismes de défense directe par leurs propriétés
fongicides, bactéricides et insecticides, mais également dans les mécanismes de défense
indirecte en attirant les parasites ou les prédateurs des phytophages.
a. Les réactions de défense directe

Chez les Gymnospermes, la réaction de défense directe est basée sur la production
d’une résine, appelée oléorésine (Phillips et Croteau, 1999 ; Nagy et al., 2000). Cette
oléorésine est toxique, répulsive et susceptible d’engluer les xylophages. Elle peut également
inhiber la croissance des champignons pathogènes qui vivent en symbiose avec les
xylophages à la surface de leurs élytres (Nagy et al., 2000 ; Phillips et Croteau, 1999).
L’oléorésine est un mélange complexe de terpènes, avec une fraction térébenthine volatile
(monoterpènes en C10 et sesquiterpènes en C15) et une fraction résineuse non volatile
(diterpènes en C20). La térébenthine permet le transport des molécules plus lourdes de la
résine jusqu’au site de blessure. Au contact de l’atmosphère, les composés volatils de la
térébenthine s’évaporent, ne laissant qu’une masse semi-cristalline d’acides de résine qui
polymérisent. Ceci forme une barrière très dure qui scelle la blessure et piège les insectes
prédateurs et les agents microbiens (Phillips et Croteau, 1999 ; Trapp et Croteau, 2001a).
L’oléorésine est synthétisée et accumulée dans des structures sécrétrices spécialisées, les
cellules des canaux résinifères. En réponse à une attaque de xylophage, le sapin de Norvège
met en place un réseau de canaux résinifères traumatiques qui s’accompagne de l’induction de
l’activité des terpène synthases, assurant ainsi une synthèse de novo de composés terpéniques.
De plus, la composition de l’oléorésine induite est différente de celle de l’oléorésine produite
de façon constitutive (Martin et al., 2002).
Chez les Angiospermes, des plantes saines émettent une faible quantité de composés
volatils à partir de la surface de la feuille et/ou à partir de sites de stockage présents à la
surface des feuilles (Paré et Tumlinson, 1999). Dans certains cas, ces composés volatils
défensifs sont émis en réponse l’herbivorie, lorsque les structures sécrétrices internes ou
externes sont rompues. Certains composés volatils, comme les aldéhydes en C6 appelés
« green leaf volatiles », peuvent également être synthétisés lors de l’attaque : ils dérivent de la
coupure des acides gras sous l’action de la lipoxygénase qui a lieu dans la seconde qui suit la
blessure. Enfin, d’autres composés comme le trans-β-ocimène, l’indole ou encore l’ acétate
d'hexényl, sont synthétisés de novo des heures ou des jours après la blessure (Paré et
Tumlinson, 1997 ; 1999). Certains composés volatils comme le ß-farnésène, produits après
une attaque d’herbivores, ont un effet sur le comportement de l’insecte phytophage. En effet,
ce composé, sesquiterpène acyclique largement répandu chez les végétaux et les animaux, est
utilisé comme une phéromone d’alarme : des pucerons exposés au ß-farnésène deviennent
agressifs et se dispersent. L’implication de ce composé dans les mécanismes de défense vis-à-
vis des insectes herbivores a été étudiée chez plusieurs espèces comme Mentha x piperita
(Crock et al., 1997) et Trifolium repens (Mostafavi et al., 1996).
b. Les réactions de défense indirecte

Outre leur rôle direct dans la défense, les composés volatils peuvent avoir un rôle de
défense indirecte en attirant les prédateurs et/ou les parasites des insectes herbivores. Ainsi,
certains composés émis par les feuilles soumises à un insecte phytophage fournissent des
informations pour guider les femelles parasites des chenilles de Lépidoptères jusqu’au lieu
d’émission et les aident ainsi à trouver leur cible (Paré et Tumlinson, 1999). Par exemple,
l’analyse des composés volatils émis par Nicotiana attenuata après une attaque par des
insectes herbivores montre que trois composés (cis-3-hexénol, linalol et cis-α-bergamotène)
augmentent le taux de prédation des œufs de papillon par un prédateur généraliste. De plus, le
linalol diminue le taux d’oviposition du Lépidoptère. De cette façon, le nombre d’insectes
phytophages est réduit de plus de 90 % (Kessler et Baldwin, 2001).
Les réactions de défense indirecte peuvent avoir une composante systémique. En plus
d’une émission de composés volatils au niveau du site d’alimentation des herbivores, les
feuilles saines voisines présentent une augmentation de l’émission des composés volatils chez
le maïs (Turlings et Tumlinson, 1992) et chez le coton (Röse et al., 1996). Les expériences de
marquage chimique montrent que les composés volatils systémiques sont produits sur leur site
d’émission, c’est-à-dire par les cellules de feuilles intactes. Ceci suggère qu’un messager
chimique est transporté depuis le site de blessure jusqu’aux feuilles saines pour initier la
synthèse et l’émission des composés volatils (Paré et Tumlinson, 1999).
Outre cette communication entre les différents étages d’une plante soumise à une
attaque de phytophages, les composés volatils émis par ces plantes sont capables d’influencer
les plantes situées dans leur voisinage proche. Des travaux récents montrent que des plants de
Nicotiana attenuata, cultivés à proximité de plants de sauges (Artemisia tridentata) blessés
artificiellement, présentent moins de dommages liés aux herbivores que des plants de N.
attenuata cultivés à proximité de sauges non blessées (Kessler et Baldwin, 2001).
En conclusion, les plantes possèdent donc à la fois des défenses directes et indirectes
très actives contre les attaques des insectes phytophages (Fig. 4). Néanmoins, ces deux modes
de défense peuvent être antagonistes si les insectes phytophages, tolérants vis-à-vis des
toxines, les utilisent comme mécanisme de défense contre leurs propres prédateurs. Par
exemple, la larve du ver à cornes du tabac accumule suffisamment de nicotine dans son
hémolymphe lors de son alimentation sur Nicotiana tabacum pour réduire la croissance et la
survie de guêpes endoparasites. En conséquence, Nicotiana attenuata a une production de
nicotine réduite quand elle est attaquée par le ver à cornes et émet des composés terpéniques
qui attirent les prédateurs de l’insecte herbivore (Degenhardt et al., 2003).
3. Le cas des Roses

La rose étant avant tout une plante sélectionnée par l’homme, très peu d’études ont été
consacrées à son mode de pollinisation en conditions naturelles. Cependant, il est
généralement admis que la pollinisation dans le genre Rosa n’est pas due à un insecte
spécifique mais à un ensemble de pollinisateurs généralistes comme les abeilles (Proctor et
al., 1996). Yeboah Gyan et Woodell (1987) ont montré que R. canina est partiellement
autoincompatible et qu'elle est pollinisée, entre autre, par des bourdons. Les études portant sur
l’émission des composés volatils au cours de la journée décrivent toutes un rythme circadien
d’émission, suggérant là encore une pollinisation des roses sauvages par des insectes à activité
diurne (Helsper et al., 1998, Picone et al., 2004).
Chez de nombreuses espèces d’Angiospermes, les pétales sont généralement la source
majeure de composés volatils (Dobson et al., 1990). Les composés émis par les pétales de
rose sont présents à des degrés divers chez d’autres fleurs. Il a été montré pour certains
d’entre eux une action sur les pollinisateurs. Par exemple, le méthyleugenol est connu pour
ses propriétés attractives sur les papillons pollinisateurs et les scarabées (Shukla et Prasad,
1985).
La plupart des constituants identifiés chez les Hybrides de Thé cultivés sont déjà
présents, en quantités variables, chez les roses sauvages (Kaul et al., 1999 ; Ozel et al., 2004 ;
Joichi et al., 2005 ; Dobson et al., 1990).
Figure 4 : Interactions entre les plantes, les herbivores et les ennemis des herbivores,
sous le contrôle des terpènes volatils (d’après Degenhardt et al., 2003). (a) une attaque
d’herbivores induit une libération de terpènes, qui attirent les prédateurs et les parasites qui
pondent sur l’herbivore et l’utilisent pour leur larve. Les mêmes terpènes peuvent également
affecter d’autres herbivores, aussi bien en les attirant pour de la nourriture (b) qu’en les
repoussant pour la nourriture ou l’oviposition (c). De plus, les caractères impliqués dans la
défense indirecte peuvent affecter négativement le succès des prédateurs ou des parasites (d).
Les tentatives d’améliorer l’émission des terpènes chez les plantes cultivées doivent favoriser
les avantages (a et c) et défavoriser les désavantages (b et d).
Bien qu’aucune étude n’ait été réalisée chez la rose, il est probable que chez ces roses
sauvages, les composés volatils de la fragrance jouent pleinement leur rôle d’attraction des
pollinisateurs. Une étude récente portant sur le DMT (Shalit et al., 2004) a d’ailleurs montré
que les abeilles étaient capables de détecter ce composé et d’apprendre à l’associer à une
récompense, presque aussi rapidement que le géraniol.
En plus des pétales, d’autres parties de la fleur participent à l’émission de composés
volatils, parfois différents de ceux des pétales, et jouent leur rôle de signaux à destination des
insectes (Dobson et al., 1999). Il a par exemple été montré que chez Rosa rugosa, les odeurs
du pollen pourraient avoir un rôle dans la protection de ce pollen vis-à-vis des bourdons à
cause de leurs propriétés répulsives. L’eugénol, abondamment présent dans les organes mâles
des fleurs de nombreuses variétés de roses, possède une activité nématicide et sert d’inhibiteur
de l’herbivorie (Obeng-Ofori et Reichmuth, 1997).
Quelques études portent aussi sur les composés volatils émis par les sépales des roses.
Ces molécules volatiles, souvent différentes de celles des pétales et des étamines, sont
produites par des trichomes sécréteurs identiques à ceux des feuilles. Il s’agit de dérivés
d’acides gras (cis-3-hexénol), de monoterpènes (linalol) et de sesquiterpènes (Caissard et al.,
article soumis). Chez d’autres espèces, ces molécules ont été impliquées dans des mécanismes
de défense (Kessler et Baldwin, 2001).
B. Les structures sécrétrices

Les terpènes, et plus généralement les composés volatils, sont produits et sécrétés par
un grand nombre de structures anatomiques (Caissard et al., 2004 ; Fig. 5) : cellules isolées ou
idioblastes, cellules épidermiques des pétales, osmophores des Orchidacées, cavités des
Rutacées, trichomes des Lamiacées et canaux à résine des Gymnospermes (Fahn, 2000).
1. Les cellules sécrétrices des pétales

Contrairement à d’autres organes, les cellules sécrétrices des pétales n’ont été
localisées que de façon indirecte. Par exemple, l’absorption de rouge neutre dans des
territoires cellulaires particuliers, leur a fait attribuer la fonction d’osmophores (Vogel, 1962 ;
Stern et al., 1986), c’est-à-dire de territoires floraux émettant des odeurs. Selon les espèces,
les osmophores sont constitués de cellules coniques ou non (Stern et al., 1986 ; 1987).
Lorsqu’elles sont coniques, ces cellules ressemblent beaucoup aux cellules de l’épiderme
supérieur de très nombreux pétales (Fig. 5H à J). Très souvent, ces épidermes à cellules
coniques sont décrits comme sécréteurs même si certains auteurs ne leur attribuent qu’un rôle
cuticule soulevée
cavité sous-cuticulaire de
stockage de l'huile
cellules sécrétrices
queue
épiderme
cellule
basale
A mésophylle B C
D E F
os os
p os
p
p os
os
G H
H I J
Figure 5 : Diversité des structures de sécrétion. A, schéma d'un trichome glandulaire pelté
de menthe poivrée (Turner et al., 2000); B, surface de l'épiderme supérieur de feuille de
menthe (photographie : J.C. Caissard) ; C, trichomes glandulaires peltés de Mentha x piperita
(photographie : J.C. Caissard); D, trichomes de Nicotiana tabacum (Wagner et al., 2004) ; E,
trichome de Prostanthera ovalifolia (Gersbach, 2002) ; F, canal résinifère d'Abies grandis
(Martin et al., 2002) ; G, fleur de genêt d'Espagne (Spartium junceum) traitées au rouge
neutre pour localiser les osmophores (Esau, 1965); H, osmophores de Bulbophyllum
involutum, Orchidaceae (Teixeira et al., 2004); I et J, schémas d'une section à travers les
tissus sécréteurs d'osmophores d'une fleur de Ceropegia stapeliaeformis avant (I) et après (J)
émission de la fragrance : noter la diminution du nombre de grains d'amidon après l'émission
dans les cellules du tissu sous l'épiderme sécréteur (Esau, 1965). Ss, espace sous-cuticulaire ;
Ba, cellule basale ; cd, canal résinifère ; GST, trichome glandulaire sécréteur ; os,
osmophore ; p, pétale ; flèche, amidon.
dans la réflexion de la lumière (Kay et al., 1981).
L’inventaire des cellules sécrétrices des pétales est donc souvent basé sur l’aspect des
cellules plus que sur la réelle caractérisation d’un phénomène de sécrétion, par ailleurs
difficilement observable en dehors de glandes accumulatrices. Certaines espèces, comme
Plectranthus ornatus, arborent des glandes peltées et capitées à la surface de leurs organes
reproducteurs (Ascensao et al., 1999). Chez Antirrhinum majus, on trouve également des
trichomes clairement sécréteurs sur les épidermes des pétales. Néanmoins, ceux-ci ne
semblent pas impliqués dans la production de parfum (Kolosova et al., 2001a). Toutefois,
chez de nombreuses espèces, les pétales ne possèdent pas de glandes sécrétrices mais bien des
cellules épidermiques coniques.
Les cellules coniques ont une forme caractéristique en papille. Elles ont été observées
chez plus de 200 espèces d’Angiospermes (Kay et al., 1981), y compris dans le genre Rosa
(Stubbs et Francis, 1971 ; Kay et al., 1981). Cette forme conique papillée est connue pour
offrir une très grande surface d’évaporation et pour participer à la réflexion de la lumière. Le
gène MIXTA, responsable de cette forme, a été cloné chez Antirrhinum majus (Noda et al.,
1994). De façon surprenante, sa surexpression chez Nicotiana tabacum, sous le contrôle du
promoteur 35S, aboutit à la formation de trichomes sécréteurs ectopiques sur la plante dans sa
totalité, suggérant une relation entre la différenciation des cellules coniques papillées et des
trichomes sécréteurs (Glover et al., 1998).
Depuis ce travail, un des gènes impliqués dans la différenciation des trichomes
sécréteurs de la corolle d’A. majus a été cloné. Il s’agit d’un gène codant pour un facteur
MYB très proche du gène MIXTA (Perez-Rodriguez et al., 2005) : les mêmes types de gènes
réguleraient donc la différenciation des cellules coniques et des trichomes sécréteurs dans la
fleur d’A. majus. Par ailleurs, toujours chez A. majus, il a été montré que le gène BAMT (S-
Adenosyl-L-Méthionine : Benzoic Acid Carboxyl Méthyltransférase) responsable de la
biosynthèse du méthylbenzoate s’exprime spécifiquement dans l’épiderme supérieur des
pétales (Kolosova et al., 2001a). Ces résultats fournissent des arguments supplémentaires sur
la nature supposée sécrétrice des cellules coniques. Malheureusement, aucune preuve directe
n’a jamais été fournie comme dans les études de trichomes sécréteurs, par exemple.
2. L’exemple des trichomes sécréteurs

Les trichomes sécréteurs sont les structures sécrétrices les plus étudiées dans la
littérature. En effet, elles sont présentes chez de nombreuses familles végétales, comme, par
exemple, les Lamiacées, les Astéracées, les Géraniacées, les Solanacées et les Cannabinacées.
La morphologie des trichomes est très variée, avec des pieds longs ou courts, des têtes et des
pieds uni- ou pluricellulaires, ramifiés ou non et des têtes capitées ou peltées (Fig. 5A à E).
Cependant, de très nombreuses études ont montré que seules les cellules de tête étaient
sécrétrice. Selon les familles, ces cellules de tête sont recouvertes ou non d’une cuticule
imperméable. Ainsi, chez les Solanacées et les Rosacées, les sécrétions sont directement
émises dans l’environnement et la partie la plus visqueuse coule le long du pied du trichome.
Il n’est pas rare d’y voir des insectes englués. Chez, les Lamiacées, les trichomes sont
recouverts d’une cuticule. Très souvent, lors de la maturation des trichomes, celle-ci se
détache de la paroi pecto-cellulosique et l’huile essentielle s’accumule dans l’espace sous-
cuticulaire ainsi généré. Les composés sont relâchés lors de la rupture de la cuticule. Chez la
menthe, le taux d’évaporation des composés à travers la cuticule des glandes peltées est très
faible (moins de 5% sur une période de 6 mois) (Gershenzon et al., 2000). Ceci peut être mis
en relation avec la fonction de défense : en cas d’attaque, les composés répulsifs stockés sont
libérés immédiatement. Ce type de stockage a été observé chez de très nombreuses espèces
comme Salvia aurea (Serrato-Valenti et al., 1997) et Achillea millefolium (Figueiredo et Pais,
1994).
Au niveau ultrastructural, les glandes peltées productrices de composés terpéniques se
caractérisent par une prolifération intense du réticulum endoplasmique et par un très grand
nombre de leucoplastes (Ascensao et al., 1997 ; Turner et al., 2000a). Chez Leonotis
leonurus, les trichomes peltés sécrètent une oléorésine contenant des terpènes et des
flavonoïdes aglycones (Ascensao et al., 1997) alors que les trichomes capités sécrètent des
protéines et des polysaccharides acides et neutres, en plus des terpènes et flavonoïdes
aglycones (Ascensao and Pais, 1998). Dans les glandes capitées, qui sécrètent peu d’huiles
essentielles, les corps de Golgi sont très nombreux (Ascensao et Pais, 1998). Chez la même
espèce, deux types différents de trichomes sécrètent donc des composés différents. Cette
spécialisation dans les produits de sécrétion est également rapportée pour les trichomes
glandulaires présents à la surface des feuilles et des fleurs de Plectranthus ornatus (Ascensao
et al., 1999). La fonction précise des sécrétions produites par chaque type de trichomes est
mal connue, même s’il est généralement admis qu’elles sont impliquées dans la défense
chimique de la plante ou considérées comme une récompense florale pour les pollinisateurs
(Bottega et Corsi, 2000).
La présence de trichomes est connue chez les roses. Ainsi, la face inférieure des
feuilles de la rose botanique Rosa rugosa présente des trichomes glandulaires en forme de
champignon qui produisent et sécrètent des sesquiterpènes sous la forme de gouttelettes
(Hashidoko et al., 2001). Les sépales de certaines roses comme Rosa gallica, Rosa x
damascena et Rosa x centifolia présentent aussi des trichomes. La mutation « moussue »,
décrite chez certaines roses est en fait due à une prolifération de ces trichomes les uns sur les
autres (Caissard et al, article soumis). Comme nous l’avons déjà vu, ces trichomes n’ont pas
du tout la même composition en produits volatils que les pétales et rien n’est connu sur les
mécanismes de leur sécrétion au niveau cellulaire.
3. Les mécanismes cellulaires de la sécrétion

Les mécanismes cellulaires de la sécrétion sont très mal connus. Il est généralement
admis qu’il existe deux mécanismes fondamentaux (Fahn, 2000). Dans le premier cas, la
sécrétion granulocrine, des vésicules de pinocytose inverse fusionnent directement avec la
membrane plasmique ou sont entourées et détachées du cytoplasme par des invaginations de
la membrane. Dans le second cas, la sécrétion écrine, le transport des molécules se fait
directement au travers de la membrane plasmique (Fig. 6).
Le problème principal rencontré lors de l’étude d’une sécrétion granulocrine de
composés volatils est la localisation de ces composés dans la cellule. Aucun produit
spécifique de chaque type de composé n’existant, les colorations utilisées (réactif de Nadi,
Nile blue A etc…) sont généralement basées sur la nature lipidique des sécrétions. Elles sont
donc inutilisables dans le cas de sécrétions non lipidiques. De plus, les procédés de fixation et
d’inclusion employés pour la microscopie conduisent parfois à la disparition des vésicules
observées sur échantillons frais (Vassilyev, 2000). Ces restrictions sur les techniques
mentionnées, de nombreuses vésicules de sécrétion ont été mises en évidence dans des
contextes très variés, suggérant l’existence d’un système de sécrétion granulocrine.
Dans les trichomes sécréteurs, les mécanismes décrits n’ont pas toujours été reliés à
l’un ou l’autre des types de sécrétion, granulocrine ou écrine :
− sécrétion écrine chez Origanum dictamnus (Bosabalidis et Tsekos, 1982),
− transport actif du réticulum endosplasmique lisse jusqu’à la membrane plasmique chez
la menthe, Mentha x piperita (Turner et al., 2000a),
− bourgeonnement de la membrane plasmique chez Nepeta racemosa et Artemisia
annua (Bourett et al., 1994),
− sécrétion typiquement granulocrine chez Prostanthera ovalifolia par fusion de
vésicules à la membrane plasmique (Gersbach, 2002).
A B C
Figure 6 : Schéma montrant les mécanismes possibles de sécrétion (d'après Fahn, 1979).
A, sécrétion écrine de molécules volatiles ; B et C, sécrétion granulocrine.
Dans les autres structures sécrétrices, les osmophores, les canaux et les cavités, c’est
un processus granulocrine qui est le plus souvent suspecté (Pridgeon et al., 1985 ;
Bosabalidis, 1996 ; Brundrett et al., 1991 ; Bosabalidis et Tsekos, 1982). Dans toutes ces
études, les gouttelettes lipidiques proviennent souvent des plastes, du réticulum périplastidial
et du réticulum lisse mais aussi parfois des dictyosomes et d’autres organites.
Dans les canaux de Pinus halepensis, deux voies de sécrétion ont été détaillées (Fahn
et Benayoun, 1976 ; Benayoun et Fahn, 1979). Dans la première voie, des gouttes de résine
sont entourées et détachées par des invaginations de la membrane plasmique, au cours d’un
processus granulocrine. Dans la seconde voie, le réticulum et la membrane plasmique
fusionnent pour libérer directement les gouttes de résine dans la matrice extracellulaire.
Dans les osmophores de l’Arum, Sauromatum gutatum, un autre processus
granulocrine a été démontré (Skubatz et al., 1995). Chez cette espèce, les sesquiterpènes
volatils sont émis par le spadice le jour de la thermogenèse. Cependant, quelques jours avant
l’émission, des structures de réticulum endoplasmique rugueux, en forme de poches, au
contenu densément osmiophile, sont observées dans le cytoplasme ou en fusion avec la
membrane plasmique. Le jour de l’émission, ces poches sont vides. C’est l'un des exemples
de sécrétion granulocrine les plus clairs (Fig. 7).
La plupart des études concernant la structure des pétales portent sur la localisation des
pigments gouvernant la couleur des fleurs (Markham et al., 2000 ; Weston et Pyke, 1999). La
sécrétion des composés du parfum dans les cellules épidermiques du pétale est mal connue.
Sans que cela soit formellement démontré, on considère généralement que l’huile essentielle
dans ces cellules se présente sous la forme de gouttelettes dans le cytoplasme qui diffusent
sous forme gazeuse à travers la paroi cellulaire et la cuticule lorsqu’une certaine température
est atteinte (Esau, 1965 ; Fahn, 2000).
Des gouttelettes d’huile sont constamment produites pour remplacer celles qui se sont
évaporées (Kisser, 1958, cité par Fahn, 1979). Une étude assez ancienne sur l’ultrastructure
du pétale de rose (Stubbs et Francis, 1971) met en évidence la présence de corps
cytoplasmiques de nature inconnue et de structures fortement enroulées ressemblant à des
figures de myéline, de nature peut-être lipidiques. Ces structures pourraient être reliées à la
sécrétion des monoterpènes dans les cellules épidermiques.
Une étude sur les pétales de l’oeillet, Dianthus caryophyllus, a montré que certains
métabolites secondaires lipidiques, incluant des composés volatils de la fragrance comme les
dérivés d’acides gras pourraient être formés à l’intérieur de membranes dans les tissus du
Jour J-2/J-1 Jour J :
production de chaleur et
émission de composés volatils
HS
HS
Ex
Ex
Figure 7 : Sécrétion granulocrine par l’appendice de Sauromatum guttatum (d’après

Skubatz et al., 1995). Deux jours avant la production de chaleur et l’émission de
composés volatils, du matériel osmiophile s’accumule dans des poches de réticulum qui
fusionnent avec la membrane plasmique. Le jour J, les poches de RE, fusionnées à la
membrane plasmique, se vident de leur matériel osmiophile. HS, headspace ; Ex,
extraction ; o, matériel osmiophile ; rER, réticulum endoplasmique rugueux ; PM,
membrane plasmique ; CW, paroi cellulaire ; P, poche de rER remplie de matériel
osmiophile ; *, lumen de citerne de rER ; flèches pleines , membrane plasmique ; flèches
vides, membrane du rER.
pétale (Hudak et Thompson, 1996 ; 1997). Ces composés pourraient ensuite être libérés par
bourgeonnement de vésicules ressemblant à des corps lipidiques ou oléosomes. Ces vésicules
particulières, possédant une membrane à une seule couche de phospholipides, sont
généralement associées au stockage des triacylglycérols dans les graines.
Cependant, elles ont été décrites dans d’autres organes comme les feuilles et les
anthères (Wang et al., 1997 ; Wahlroos et al., 2003 ; Hsieh et Huang, 2005). Parallèlement, de
nombreux organites issus du réticulum ont été récemment décrits (Hara-Nishimura et
Matsushima, 2003 ; Matsushima et al., 2003). Certains de ces compartiments, de fonction
souvent inconnue, pourraient jouer un rôle dans les processus de sécrétion. Il a même été
prouvé que, chez Marchantia polymorpha, des corps lipidiques bien spécifiques contiennent
toutes les enzymes de la voie de biosynthèse des monoterpènes (Suire et al., 2000).
Récemment, un gène NpABC1 a été isolé chez Nicotiana plumbaginifolia. Il code pour
un transporteur ATP dépendant particulier (ATP binding cassette transporter) (Jasinski et al.,
2001). La protéine correspondante a été localisée dans la membrane plasmique par
immunomarquage. Son expression dans les feuilles est augmentée par le sclaréol, un diterpène
toxique sécrété par les trichomes foliaires du tabac et elle est capable de transporter ce
composé à l’extérieur des cellules. La découverte de ce transporteur de terpènes relance la
discussion sur l’existence des mécanismes de sécrétion écrine et granulocrine. Il est
vraisemblable, à l’examen de la littérature, que les deux mécanismes existent chez les plantes
et peut-être même coexistent au sein d’une même cellule pour la sécrétion de composés
différents.
III. La biosynthèse des composés volatils

L’élucidation des voies de biosynthèse des composés volatils des fleurs a débuté assez
récemment par les travaux pionniers des équipes de Pichersky et de Dudareva portant sur les
espèces Clarkia breweri et Antirrhinum majus (Pichersky et al., 1994 ; Raguso et Pichersky,
1995 ; Wang et al., 1997 ; Nam et al., 1999). Chez la rose, très peu de gènes impliqués dans la
synthèse du parfum ont été isolés (Channelière et al., 2002 ; Scalliet et al., 2002 ; Shalit et al.,
2003 ; Wu et al., 2004) mais d’autres espèces peuvent servir de modèles, soit parce que les
VOCs sont identiques, soit parce que les voies de biosynthèse présentent de nombreuses
similitudes. Par exemple, la plupart des gènes impliqués dans la biosynthèse des
monoterpènes par les trichomes de menthe ont été clonés (Lange et Croteau, 1999a ; Davis et
al., 2005 ; Ringer et al., 2005).
A. Les terpènes, composés majoritaires des roses

Les terpènes sont des composés qui dérivent tous d’une molécule unique à cinq
atomes de carbone, l’isopentényl diphosphate, ou IPP, et de son isomère le diméthylallyl
diphosphate, ou DMAPP. La synthèse des monoterpènes, sesquiterpènes et diterpènes peut
être résumée en quatre étapes. La première étape est la synthèse de l’IPP et son isomérisation
en DMAPP. La deuxième est la condensation de ces molécules par les prényltransférases pour
donner le GPP (géranyl diphosphate), le FPP (farnésyl diphosphate) et le GGPP
(géranylgéranyl diphosphate), précurseurs des mono-, sesqui- et diterpènes, respectivement.
Dans une troisième étape, les prényl diphosphates subissent des réactions de cyclisation
catalysées par un ensemble d’enzymes appelées terpène synthases (TPS) pour produire les
squelettes de base. Enfin, dans une quatrième étape, ces squelettes sont remaniés par des
enzymes de maturation des terpènes, ce qui aboutit à la formation de centaines de composés
différents.
1. La biosynthèse du précurseur, l’IPP

L’IPP et le DMAPP sont formés par deux voies biosynthétiques distinctes : la voie dite
classique du mévalonate/acétate, ou voie MEV qui se déroule dans le cytoplasme ou les
mitochondries, et la voie dite alternative indépendante du mévalonate, ou voie MEP (2C-
méthyl-D-érythritol 4-phosphate) qui a lieu dans les plastes.
a. La voie du mévalonate
La voie MEV a été découverte dans les années 1950 (Fig. 8). Le rôle du mévalonate
comme intermédiaire spécifique de la synthèse de l’IPP a été démontré de très nombreuses
fois chez les mammifères et les champignons, de même que chez les plantes et les
archébactéries. De ce fait, pendant de nombreuses années, on a pensé que cette voie de
biosynthèse était la seule voie de biosynthèse de l’IPP. La voie MEV a été largement décrite
par de nombreux auteurs (pour revue, voir Lichtenthaler et al., 1997).
Elle met en œuvre la condensation de trois unités d’acétyl-CoA pour former le 3-
hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme A (ou HMG-CoA) qui, après réduction par deux
molécules de NADPH, forme l’acide mévalonique (MEV). Le MEV est phosphorylé par la
Mévinoline
MEV
IDI
Figure 8 : Voie du mévalonate (MEV) de biosynthèse de l'IPP (d’après Rodriguez-

Concepcion et Boronat, 2002). HMG-CoA, 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoenzymeA ;
MEV, mévalonate ; MVP, 5-phosphomévalonate ; MVPP, 5-diphosphomévalonate ; IPP,
isopentényl diphosphate ; DMAPP, diméthylallyldiphosphate ; AACT, acétoacétyl-CoA
thiolase ; HMGS, HMG-CoA synthase ; HMGR, HMG-CoA réductase ; MVK, MEV kinase ;
PMK, MVPkinase ; PMD, MVPP décarboxylase ; IDI, IPP/DMAPP synthase.
MEV kinase (MVK) pour donner le 5-phosphomévalonate. Ce composé est alors phosphorylé
par la MVP kinase (PMK) pour donner le 5-diphosphomévalonate, décarboxylé par la MVPP
décarboxylase (PMD) pour donner l’IPP (Fig. 8 ; Rodriguez-Concepcion et Boronat, 2002).
b. La voie du 2C-méthyl-D-érythritol 4-phosphate

Des expériences de marquage radioactif ont montré que chez certains organismes,
comme les eubactéries, les algues vertes et dans les chloroplastes des plantes supérieures, la
formation de l’IPP passe par une voie alternative indépendante du mévalonate (Kuzuyama et
al., 1998). Cette voie alternative de biosynthèse de l’IPP a été découverte pour la première
fois par Rohmer et al. en 1993 chez E. coli. Elle a été nommée voie MEP car elle met en jeu
le 2C-méthyl-D-érythritol 4-phosphate.
Æ L’élucidation de la voie chez les bactéries
Les eubactéries ne possèdent pas la voie MEV et la synthèse de l’IPP se fait via la voie
MEP. L’identification des gènes impliqués dans cette voie a été réalisée grâce à des
expériences utilisant des mutants pour la voie MEP d’E. coli. Aujourd’hui, toutes les étapes
de cette voie sont caractérisées chez cette bactérie (Fig. 9).
L’étape initiale de la voie MEP est la formation du 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate
(DXP) par la condensation du pyruvate et du glycéraldéhyde 3-phosphate. Cette réaction est
catalysée par la protéine DXP synthase (ou DXS). Pour la deuxième étape, Rohmer et al.
(1996) ont proposé une réaction de réarrangement intramoléculaire du DXP, suivie d’une
réaction de réduction qui conduit au 2C-méthyl-D-érythritol 4-phosphate (MEP). L’enzyme
responsable de cette biosynthèse a été isolée chez des mutants d’E. coli dont le métabolisme
était bloqué entre le DXP et le MEP (Kuzuyama et al., 1998 ; Takahashi et al., 1998) : de tels
mutants sont incapables de se multiplier sur un milieu de base et leur survie est assurée grâce
à l’apport de MEP dans le milieu de culture. L’enzyme correspondant au gène muté yaeM est
la 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate réductoisomérase ou DXR.
Il est à noter que le DXP est non seulement un intermédiaire de la voie MEP mais
également un intermédiaire des voies de synthèse de la thiamine, ou vitamine B1 (Julliard et
Douce, 1991), et du pyridoxol, ou vitamine B6 (Hill et al., 1989). Ainsi, la réaction catalysée
par la DXR est la première étape spécifique de la voie conduisant aux terpènes.
Le MEP est transformé en 4-diphosphocytidyl-2C-méthylérythritol (CDP-ME) en
présence de CTP (Rohdich et al., 1999) par l’enzyme CDP-ME synthase (CMS). Le CDP-ME
est ensuite phosphorylé sur le carbone 2 pour donner le 4-diphosphocytidyl-2C-
Plaste
pyridoxol
thiamine
isoprènes
monoterpènes
gibbérellines chlorophylles
caroténoïdes tocophérols
phylloquinones plastoquinones
Figure 9 : Voie MEP plastidiale de synthèse de l'IPP (d'après Rodriguez-Concepcion et

Boronat, 2002). G3P, glycéraldéhyde 3-phosphate ; DXP, 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate ;
MEP, 2C-méthyl-D-érythritol 4-phosphate ; CDP-ME, 4-diphosphocytidyl-2C-
méthylérythritol ; CDP-MEP, 4-diphosphocytidyl-2C-méthylérythritol 2-phosphate ; ME-cPP,
2C-méthyl-D-érythritol 2,4-cyclodiphosphate ; HMBPP, 1-hydroxy-2-méthyl-2E-butényl 4-
diphosphate ; IPP, isopentényl diphosphate ; DMAPP, diméthylallyl diphosphate ; DXS, DXP
synthase ; DXR, DXP réductoiosomérase ; CMS, CDP-ME synthase ; CMK, CDP-ME
kinase ; MCS, ME-cPP synthase ; HDS, HMBPP synthase ; IDS, IPP synthase ; IDI,
IPP/DMAPP synthase ; fosm, fosmidomycine ; ABA, acide abscissique ; GPP, géranyl
diphosphate ; GPS, GPP synthase ; GGPP, géranylgéranyl diphosphate ; GGPPS, GGPP
synthase.
méthylérythritol 2-phosphate (CDP-MEP) (Lüttgen et al., 2000). Cette réaction est catalysée
par l’enzyme CDP-ME kinase (CMK). L’étude cristallographique de la CMK a permis de
définir les sites impliqués dans la réaction et pourrait donner des clés nécessaires à la
définition d’agents anti-microbiens (Miallau et al., 2003 ).
Chez E. coli le gène ygbP, codant pour la CDP-ME synthase, est étroitement lié sur le
chromosome à un autre gène, ygbB. Herz et al. (2000) ont montré que l’enzyme codée par ce
gène permet, en présence d’ions métalliques divalents (Mn2+ ou Mg2+), la formation du 2C-
méthyl-D-érythritol 2,4-cyclodiphosphate (ME-cPP). Cette enzyme est appelée la ME-cPP
synthase (MCS). L’étape suivante, catalysée par l’enzyme HMBPP synthase ou HDS,
convertit le ME-cPP en 1-hydroxy-2-méthyl-2E-butényl 4-diphosphate (HMBPP) (Hecht et
al. 2001).
La dernière étape de la voie MEP de biosynthèse de l’IPP est la formation de l’IPP et
du DMAPP par conversion du HMBPP. Cette réaction est catalysée par la protéine IDS (IPP
synthase) qui est capable de produire, à partir de HMBPP, de l’IPP et du DMAPP dans un
rapport de 5 : 1, respectivement (Altincicek et al., 2002). Avant l’obtention de ces résultats, il
était admis, à cause de la présence de l’IPP isomérase, que le DMAPP était produit
uniquement à partir de l’IPP, par une réaction d’isomérisation. Le fait que la protéine IDS soit
capable de produire une certaine quantité de DMAPP, en plus de l’IPP, explique pourquoi
l’absence d’IPP isomérase n’est pas létale pour les cellules.
Le séquençage complet de différents microorganismes a révélé une organisation «en
cluster» des gènes impliqués d’une part dans la voie MVA et d’autre part dans la voie MEP
de biosynthèse de l’IPP. Cependant, il n’existe pas de «cluster mixte», c’est-à-dire regroupant
des gènes des deux voies (Hecht et al., 2001).
Certains gènes de la voie MEP ont été isolés et caractérisés chez un grand nombre de
plantes, néanmoins tous les orthologues végétaux n’ont pas encore été identifiés (Tableau 4).
Æ Le fonctionnement de la DXR
La DXR, protéine que nous avons choisi d’étudier chez la rose, permet un
réarrangement intramoléculaire du DXP pour donner le composé intermédiaire MEP par un
processus de réduction aspécifique (Takahashi et al., 1998). Cette réaction se fait en présence
de NAPDH et de cations divalents qui peuvent être indifféremment du Mn2+, Co2+ ou Mg2+.
En 2000, un gène codant pour la DXR a été isolé chez la cyanobactérie Synechococcus
leopoliensis (Miller et al, 2000) Les cyanobactéries, à l’origine des chloroplastes des cellules
végétales via l’endosymbiose primaire, auraient donc apporté aux plantes la synthèse des
Tableau 4 : Gènes de la voie MEP identifiés chez les végétaux
Gène Espèce Référence bibliographique

DXS Oryza sativa Kim et al., 2005
Arabidopsis thaliana Araki et al., 2000
Capsicum annuum Bouvier et al., 1998
Lycopersicum esculentum Lois et al., 2000
Mentha x piperita Lange et al., 1998
DXR A. thaliana Schwender et al., 1999

M. x piperita Lange et Croteau, 1999a
L. esculentum Rodriguez-Concepcion et al., 2001
Ginkgo biloba Gong et al., 2005
CDP-MEP synthase A. thaliana Rohdich et al., 2000a
CDP-ME kinase L. esculentum Rohdich et al., 2000b
HDS A. thaliana Gutiérrez-Nava et al., 2004
IDS L. esculentum Botella-Pavía et al., 2004

A. thaliana Guevara-García et al., 2005
isoprénoïdes par la voie MEP. Cette enzyme est une cible potentielle pour l’obtention de
médicaments contre la malaria (Jomaa et al., 1999) ainsi que pour le développement de
nouvelles classes d’herbicides et d’antibiotiques (Kuzuyama et al., 1998).
Kuzuyama et al. (2000a) ont identifié, chez E. coli, les acides aminés impliqués dans
la réaction enzymatique. Ainsi deux acides aminés sont importants dans la conversion du
DXP en MEP : le Glu231 et la Gly14. Ce dernier acide aminé est non seulement localisé dans le
site de liaison au NADPH mais jouerait également un rôle dans le maintien de la structure
secondaire ou tertiaire de la protéine. Par ailleurs, l’alignement des séquences protéiques de
DXR d’E. coli, de bactéries et de plantes révèle l’existence de trois résidus histidine
conservés (His153, His209 et His257). Néanmoins, seule l’histidine en position 153 serait
impliquée dans la catalyse.
La structure cristallographique de la DXR (Yajima et al., 2002) a montré que la
protéine est composée de trois domaines : un domaine N-terminal de liaison au NADPH, un
domaine central et un domaine d’hélices α dans la partie C-terminale. Les résidus His153,
His209, Glu231 et His257 sont localisés dans le domaine central de la protéine, leur chaîne
tournée vers la poche catalytique. La portion de séquence située entre His209 et Met214 pourrait
jouer le rôle d’une écoutille qui fermerait le site actif quand le substrat est entré dans la poche
catalytique. La fonction phosphate du DXP se fixe au résidu His209 via une liaison
hydrogène qui pourrait fermer ‘l’écoutille’ pour fixer le substrat de façon efficace. En effet,
lorsqu’il n’y a pas de fonction phosphate au 1-désoxy-D-xylulose, l’oxydation du NADPH
n’est pas observée. Les réactions d’isomérisation et de réduction nécessitent deux cations
divalents. Ceux-ci interagissent avec les résidus Asp150, Glu152, Glu231 et Glu234. Enfin, les
résidus Thr10 et Lys37 sont importants dans la liaison du NADPH.
Æ La DXR chez les plantes

La DXR a été caractérisée chez de nombreuses espèces végétales : Arabidopsis
thaliana (Schwender et al., 1999), Mentha x piperita (Lange et Croteau, 1999a),
Catharanthus roseus (Veau et al., 2000) et Lycopersicum esculentum (Rodriguez-Concepcion
et al., 2001).
Le premier gène Dxr de plante a été isolé chez A. thaliana par une recherche dans des
banques de données de séquences végétales présentant des homologies avec la DXR d’E. coli
(Schwender et al., 1999). Les analyses de Southern blot montrent que ce gène est présent en
une seule copie dans le génome d’A. thaliana et qu’il contient 12 introns et 11 exons. Chez la
tomate et le maïs, la DXR est également un gène unique (Rodriguez-Concepcion et al., 2001 ;
Hans et al., 2004). Contrairement aux DXR bactériennes, les DXR de plantes ont une
séquence d’adressage aux plastes située en position N-terminale (Lange et Croteau, 1999a).
Par fusion avec la GFP, il a été montré que la DXR est importée dans les plastes des feuilles
chez A. thaliana. Les DXR de plantes présentent aussi un domaine riche en proline proche de
l’extrémité N-terminale de la protéine mature, absent des DXR bactériennes. Chez A.
thaliana, le gène est exprimé dans la plupart des organes de la plante, y compris les racines,
avec un niveau d’expression plus élevé dans les germinations et les inflorescences (Carretero-
Paulet et al., 2002).
De nombreux auteurs ont essayé de déterminer quelles sont les enzymes régulatrices
de la voie MEP. Par exemple, lors du mûrissement du fruit de tomates, l’accumulation des
caroténoïdes est inhibée par un traitement à la fosmidomycine, inhibiteur spécifique de la
DXR. Cependant, cette augmentation de la production de caroténoïdes n’est pas le résultat de
la surexpression du gène DXR, mais celui de la surexpression du gène DXS, situé en amont et
qui code pour l’enzyme qui permet la synthèse du substrat de la DXR (Rodriguez-Concepcion
et al., 2001). Chez C. roseus, les deux gènes, CrDXR et CrDXS, sont fortement surexprimés
dans des cultures de cellules induites pour la production d’alcaloïdes monoterpéniques par
rapport à des cultures non induites (Veau et al., 2000). Chez le maïs, le gène ZmDXR est
surexprimé dans les racines lors de l’infection par les champignons des mycorhizes
arbusculaires. La protéine DXR est localisée dans les plastes qui sont connectés en réseau par
de nombreux stromules, autour des arbuscules. La surexpression a pour conséquence
l’accumulation d’apocaroténoïdes dans les cellules racinaires, dont le rôle dans la
mycorhization n’est pas connu (Hans et al., 2004). Chez la menthe poivrée, des plantes
transformées avec l’ADNc de MpDXR, sous le contrôle du promoteur CaMV35S ont été
obtenues. La surexpression du gène DXR chez la menthe a permis d’augmenter la production
d’huile essentielle d’environ 50 %, sans en changer la composition (Mahmoud et Croteau,
2001).
Les étapes de la régulation de la voie MEP commencent tout juste à être élucidées.
D’après les travaux décrits ci-dessus, suivant les modèles biologiques étudiés, les deux
enzymes DXR et DXS sont potentiellement limitantes pour la synthèse de l’IPP. De plus,
aucune étude n’a été menée sur des tissus floraux produisant des grandes quantités de
terpènes, comme le pétale de rose. Le gène DXR, correspondant à la première étape spécifique
de la voie de biosynthèse des terpènes, semble être un bon candidat pour débuter l’étude de la
voie MEP chez la rose. La demande par les industries de la parfumerie et du secteur agro-
alimentaire de produits d’origine naturelle étant croissante, la surexpression de la DXR
pourrait permettre une augmentation de la production des composés volatils chez la rose.
Enfin, la caractérisation de ce gène pourrait apporter des informations sur l’absence de parfum
chez certaines variétés Hybrides de Thé.
2. Les étapes de l’IPP aux terpènes

a. Les prényltransférases et les terpènes synthases
Æ Les prényltransférases
Les prényltransférases catalysent la condensation de l’IPP avec un substrat allylique
comme le DMAPP, le GPP ou d’autres diphosphates d’isoprénoïdes de plus grande taille
(Clastre et al., 1993 ; Sommer et al., 1995).
Il existe trois types de prényltransférases (Fig. 10) :

- La géranyl diphosphate synthase (GPPS) permet d’obtenir un squelette en C10, le
GPP, précurseur des monoterpènes.
- La farnésyl diphosphate synthase (FPPS) assure la formation d’un squelette en C15,
le FPP précurseur des sesquiterpènes. Deux molécules de FPP peuvent aussi se condenser
pour donner des triterpènes en C30 (brassinostéroïdes, phytostérol…).
- La géranylgéranyl diphosphate synthase (GGPPS) donne un squelette en C20, le
GGPP, précurseur des diterpènes (gibbérellines, tocophérol…) ; deux molécules de GGPP
peuvent aussi se condenser pour donner des tétraterpènes en C40 (caroténoïdes).
Il est admis que la voie MEP plastidiale de synthèse de l’IPP est à l’origine de la
synthèse du GPP et GGPP, tandis que le FPP dérive de l’IPP synthétisé par la voie MEV
cytoplasmique ou mitochondriale. La nature des terpènes synthétisés par les plantes est donc
principalement déterminée par la spécificité des prényltransférases.
La comparaison des séquences des différentes prényltransférases a mis en évidence
l’existence de domaines conservés, notamment deux domaines riches en résidus aspartate
(DDXXD, avec X représentant n’importe quel résidu aminé) qui sont essentiels pour l’activité
catalytique. Les résidus aspartate lieraient le groupement diphosphate de l’IPP et le substrat
allylique par l’intermédiaire d’un pont magnésium. Des expériences de mutagenèse ont
montré que la tyrosine 81 était en partie responsable de la spécificité de produit. En effet,
plaste
IPP DMAPP IPP DMAPP

x1 GPPS
GPP FPPS
x3 x2
GGPPS Monoterpènes
(C10)
GGPP FPP
Sesquiterpènes (C15) Triterpènes (C30)

Diterpènes (C20) Tétraterpènes (C40) (Phytoalexines) (Phytostérols,
Tocophérols, (Caroténoïdes) brassinostéroïdes)
gibbérellines,
taxol)
Figure 10 : Différentes classes de terpènes et de prényltransférases. IPP, isopentényl

diphosphate ; DMAPP, diméthylallyl diphosphate ; GPP, géranyl diphosphate ; GPPS, GPP
synthase ; GGPP, géranylgéranyl diphosphate ; GGPPS, GGPP synthase ; FPP, farnésyl
diphosphate ; FPPS, FPP synthase.
lorsque ce résidu est muté en un résidu histidine, la FPPS perd son activité FPPS et acquiert la
capacité à produire du GGPP (Ohnuma et al., 1996a ; Ohnuma et al., 1996b).
La GPPS permet la formation du GPP, précurseur de tous les monoterpènes, cycliques
ou acycliques. Les premières purifications de GPPS ont été effectuées chez Salvia officinalis
(Croteau et Purkett, 1989), Lithospermum erythrorhizon (Heide et Berger, 1989), Vitis
vinifera (Clastre et al., 1993) et Pelargonium roseum (Suga et Endo, 1991).
La première séquence nucléotidique de GPPS a été obtenue en 1999 chez Mentha x
piperita (Burke et al., 1999). La purification de la protéine montre qu’elle est en fait
constituée de deux sous-unités de taille différente (SSU, small subunit, 28 kDa et LSU, large
subunit, 37 kDa). A partir de ces deux séquences protéiques, deux ADNc ont été isolés dans
une banque d’EST de glandes sécrétrices de menthe poivrée. La LSU présente jusqu’à 75 %
d’identité avec les GGPPS. Cependant, prises individuellement, aucune des deux sous-unités
n’est capable de produire du GPP ; il faut co-exprimer les deux protéines pour produire une
GPPS fonctionnelle. Chez la menthe, la GPPS est donc un hétérodimère ou un
hétérotétramère (Burke et Croteau, 2002).
D’autres séquences de GPPS ont été isolées par la suite. Les études ont abouti à la
conclusion qu’il existait deux formes de GPPS :
− une forme hétérodi- ou hétérotétramérique, isolée et caractérisée chez Mentha
piperita (Burke et al., 1999 ; Burke et al., 2004) et Antirrhinum majus (Tholl et
al., 2004),
− une forme homodimérique, isolée et caractérisée chez A. thaliana (Bouvier et
al., 2000) et Abies grandis (Tholl et al., 2001 ; Burke et Croteau, 2002) et
partiellement isolée chez d’autres espèces (Citrus sinensis, accession
AJ243739 ; Quercus robur, accession AJ298245).
La GPPS d’A. majus est un hétérodimère constitué d'une SSU et d'une LSU, voisine
des GGPPS (Tholl et al., 2004). Contrairement à ce qui a été décrit chez la menthe, lorsque le
gène codant pour la LSU d’A. majus est exprimé seul dans des cellules bactériennes, on
observe une activité GGPPS. Par contre, la SSU d’A. majus n’a aucune activité
prényltransférase. Le gène codant pour la LSU d’A. majus présente une expression
constitutive alors que le gène codant pour la SSU est exprimé spécifiquement dans les pétales
et en étroite corrélation avec la production de monoterpènes. Les LSU des GPPS
hétéromériques seraient responsables de l’activité catalytique, alors que les SSU seraient
responsables de la spécificité de substrat. En effet, la coexpression, chez E. coli , de la SSU de
la GPPS de Menthe et de la GGPPS d’Abies grandis permet l’obtention d’un hétérotétramère
fonctionnel, ayant une activité GPPS (Burke et Croteau, 2002).
Les GPPS homodimériques ont des séquences en commun avec les autres
prényltransférases. Par exemple, elles présentent toutes les motifs DDXXD et FQXXDDXD,
impliqués dans la liaison des substrats (Bouvier et al., 2000). Chez Abies grandis, Burke et
Croteau (2002) ont isolé quatre séquences très similaires entre elles (> 69 %). Exprimées chez
E. coli, trois de ces enzymes ont une activité GPPS alors que la quatrième a une activité
GGPPS. Elles présentent un pourcentage d’identité assez bas avec la GPPS d’A. thaliana (25
%). Ceci suggère qu’il n’est pas possible, au vu de la seule séquence, de prédire l’activité
d’une prényltransférase.
La localisation subcellulaire de la GPPS est controversée. En effet, certaines études
montrent qu’elle est cytosolique (Sommer et al., 1995), tandis que d’autres études ont mis en
évidence un adressage aux plastes (Clastre et al., 1993 ; Burke et al., 1999). Chez A. majus
des expériences d’immunomarquage montrent clairement que la SSU de la GPPS est localisée
dans les leucoplastes des cellules de l’épiderme du pétale (Tholl et al., 2004). Chez A.
thaliana, deux isoformes de la GPPS seraient produites en fonction de la méthionine utilisée
pour l’initiation de la transcription du gène : la forme la plus longue possèderait un peptide
d’adressage aux plastes, contrairement à la forme courte. Ces deux formes seraient impliquées
dans des voies de synthèse différentes (Bouvier et al., 2000). Chez Lithospermum
erythrorhizon, la GPPS est impliquée dans la synthèse de la shikonine qui est un dérivé de
monoterpène (Heide et Berger, 1989). Cette synthèse peut être inhibée par la mévinoline,
inhibiteur spécifique de la voie cytosolique MEV de synthèse de l’IPP (Sommer et al., 1995).
Il pourrait donc exister plusieurs formes différentes de ces enzymes, agissant dans les plastes
ou dans le cytosol.
Récemment une GPPS animale a été isolée pour la première fois chez Ips pini, le
scolyte du pin. Chez cette espèce, la protéine est impliquée dans la synthèse des monoterpènes
qui servent de phéromones d’agrégation (Gilg et al., 2005).
Æ Les terpène synthases

Toutes les TPS sont assez similaires dans leurs propriétés physiques et chimiques : en
effet, elles nécessitent la présence d’un ion métallique divalent comme cofacteur de la
catalyse, et toutes opèrent suivant des mécanismes électrophiles inhabituels (Trapp et
Croteau, 2001b). Des analyses de phylogénie entre les différents gènes Tps isolés chez les
angiospermes et les gymnospermes ont permis de subdiviser cette famille en 6 sous-familles,
désignées Tpsa jusqu’à Tpsf, dans lesquelles chaque membre possède au moins 40 %
d’identité (Fig. 11) (Bohlmann et al., 1998 ).
Les sous-familles Tpsa et Tpsb regroupent respectivement les sesquiterpène synthases
et les monoterpène synthases des angiospermes, tandis que les terpène synthases des
gymnospermes sont toutes regroupées au sein de la même famille Tpsd. Ceci suggère que les
TPS de Gymnospermes ont évolué à partir d’un ancêtre commun, indépendamment des TPS
d’Angiospermes.
Croteau et al. (1990) ont montré qu’environ 30 à 40 produits cycliques sont formés
chez la menthe à partir du GPP grâce à autant de monoterpène synthases. Toutes les
monoterpène synthases présentent des domaines conservés :
− Un site putatif d’adressage aux plastes,
− des motifs aspartate DDXXD, communs à toutes les TPS et aux
prényltransférases,
− des motifs arginine en tandem (RR), spécifiques des monoterpène
synthases, indispensables pour convertir le géranyl diphosphate en
linalyl diphosphate (Lücker et al., 2002 ; Shimada et al., 2004).
Chez la rose, la seule TPS caractérisée à ce jour est une germacrène D synthase.
L’ADNc correspondant à cette enzyme a été isolé d’une banque d’ESTs de pétales de Rosa x
hybrida ‘Fragrant Cloud’, variété très parfumée. Cette sesquiterpène TPS semble assez
spécifique puisque le seul produit formé est le Germacrène D, tout au moins in vitro.
L’expression de ce gène est maximale dans les pétales au moment de l’émission des
composés volatils. Il n’est pas exprimé dans les feuilles. Dans les pétales d’une autre variété
de rose ‘Golden gate’, dépourvue de parfum, son expression est indétectable (Gutermann et
al., 2002).
b. La maturation des terpènes

Les TPS permettent d’obtenir à partir du GPP, du FPP et du GGPP les squelettes
primaires des mono-, sesqui- et diterpènes, respectivement. Pour aboutir aux produits finaux,
ces squelettes primaires doivent subir d’autres modifications mettant en jeu des réactions
d’hydroxylation, d’oxydation, de réduction de double liaison, d’acylation, de glycosylation ou
de méthylation (Lange et Croteau, 1999a). Les enzymes impliquées dans cette maturation sont
très diverses.
Figure 11 : Arbre phylogénétique des terpène synthases (d’après Bohlmann et al., 1998).
Arbre construit selon les distances de Dayhoff et la méthode de ‘neighbor-joining’. L’échelle
représente une divergence de 1 %. Les nombres représentent les valeurs actuelles de bootstrap
des branches.
Chez la menthe, toutes les enzymes de la voie de biosynthèse des monoterpènes ont
été isolées et caractérisées et la localisation subcellulaire des enzymes a été étudiée. Il a ainsi
été montré que, si les premières étapes de la voie de biosynthèse des monoterpènes (formation
de l’IPP, du GPP et des squelettes primaires) sont plastidiales, les étapes ultérieures ont lieu
dans des sites très différents. Par exemple, la limonène-3-hydroxylase est une enzyme
localisée dans le réticulum endoplasmique, la (-)-isopipéritenone réductase possède un
adressage mitochondrial, tandis que la formation de la (-)-menthone a lieu dans le cytoplasme
des cellules (Turner et Croteau, 2004 ; Ringer et al., 2005 ; Davis et al., 2005).
Dans les pétales de rose, une Acétyl-Coenzyme A géraniol/citronellol
acétyltransférase (RhAAT1) permet à partir du géraniol la formation de l’acétate de géranyl,
ester volatil qui contribue à l’arôme de cette fleur (odeur de rose et de lavande, légèrement
fruitée). Cette enzyme a une spécificité de substrat peu importante puisqu’elle peut accepter
d’autres alcools, comme le citronellol ou le 1-octanol (Shalit et al., 2003). Elle appartient à la
famille des acétyltransférases de type BAHD (St-Pierre et De Luca, 2000). Elle est exprimée
exclusivement dans les pétales, au moment du pic de l’émission de parfum.
c. L’utilisation des deux voies de biosynthèse

Depuis la découverte de la voie MEP de biosynthèse de l’IPP en 1993, il était admis
qu’il existait une compartimentation nette des voies de biosynthèse des différentes classes de
terpénoïdes. Ainsi la voie MEV cytosolique et mitochondriale donne le FPP, précurseur des
sesqui- et triterpènes, comme les stérols (modulateurs de l’architecture membranaire et des
processus de croissance et de développement), les brassinostéroïdes (hormones), le dolichol
(impliqué dans la glycosylation protéique) et le groupement prényl utilisé lors de la
prénylation protéique et la biosynthèse des cytokinines. L’IPP et le DMAPP produits par la
voie MEP plastidiale sont à l’origine d’une part du GGPP, précuseurs des di- et tétraterpènes,
associés à la photosynthèse (caroténoïdes et chaînes des chlorophylles, plastoquinones et
phylloquinones) et aux hormones (gibbérellines et acide abscissique), et d’autre part du GPP,
précurseur des monoterpènes, impliqués dans les mécanismes de défense et d’attraction des
pollinisateurs.
Mais la scission des deux voies de biosynthèse de l’IPP n’est pas aussi tranchée. En
effet, l’IPP dérivé de la voie MEV peut être utilisé pour la synthèse des terpènes dans les
plastes et inversement l’IPP dérivé de la voie MEP peut être exporté dans le cytoplasme
(Kasahara et al., 2002). Des flux des autres prényl diphosphates (GPP, FPP ou GGPP) entre le
cytoplasme et les plastes peuvent également être envisagés. En effet, des expériences de
marquage et d’inhibition spécifique des voies de biosynthèse ont révélé que certains
composés ont une origine mixte, impliquant à la fois la voie MEV et la voie MEP (Rodriguez-
Concepcion et al., 2004).
Par exemple, les fleurs de camomille, Matricaria recutita, synthétisent des
sesquiterpènes, notamment du chamazulène, dont l’origine est mixte (Adam et Zapp, 1998 ;
Adam et al., 1999). Des expériences de marquage radioactif ont montré que le GPP et l’IPP
produits par la voie MEP étaient transférés dans le cytoplasme et mis en présence de l’IPP
dérivé de la voie MEV. Dans le cytoplasme, GPP et IPP plastidiaux, d’une part, et IPP
cytoplasmique, d’autre part, sont utilisés par la FPPS pour former le FPP. Une origine mixte
MEV/MEP a été démontrée pour d’autres composés terpéniques comme les monoterpènes et
sesquiterpènes volatils émis par le haricot de Lima (Piel et al., 1998). L’exemple le plus
documenté concerne les sesquiterpènes comme le nérolidol émis par l’épiderme des pétales
d’A. majus (Dudareva et al., 2005). Dans les pétales des fleurs de cette espèce, seule la voie
MEP plastidiale est active pour la formation des terpènes volatils. La circulation de l’IPP se
fait de manière unidirectionnelle, des plastes vers le cytoplasme. Il pourrait donc se produire
une sous-régulation d’une des voies dans certaines conditions environnementales ou dans des
types cellulaires spécifiques.
B. Les autres composés volatils

Le parfum des fleurs est un mélange complexe de composés volatils dont les terpènes
ne représentent en général qu’une partie. Suivant les espèces, d’autres composés sont
présents ; les principaux sont les dérivés d’acides gras et les composés aromatiques.
1. La biosynthèse des dérivés d’acides gras

De nombreux composés volatils responsables de la ‘note verte’ dans les fruits et les
fleurs, sont des dérivés de l’hexane comme le cis-3-hexénol (Jirovetz et al., 2002). Ils sont
aussi présents dans les feuilles sous le nom de « green leaf volatiles », où ils pourraient jouer
un rôle dans la défense contre les insectes prédateurs. Ils sont produits par la dégradation
d’acides gras polyinsaturés par la voie de la lipoxygénase (Fig. 12). Les étapes les plus
déterminantes de cette voie sont :
− La peroxydation de l’acide linoléique et linolénique par la lipoxygénase ou
LOX,
− la lyse des hydroperoxydes formés grâce à une réaction catalysée par
acide linolénique
LOX
acide 13-hydropéroxylinolénique
HPLS
ADH
cis-3-hexénal cis-3-hexénol
IF
IF
trans-3-hexénal IF trans-2-hexénal
ADH ADH
trans-3-hexénol trans-2-hexénol
Figure 12 : Voie de biosynthèse des dérivés d’acides gras (d’après Paré et Tumlinson,
1999). LOX, lipoxygénase ; HPLS, hydroperoxyde lyase ; IF, facteur d'isomérisation ; ADH,
alcool déshydrogénase.
l’hydroperoxyde lyase ou HPLS.
L’étude de mutants pour ces deux enzymes a été menée chez la pomme de terre (Salas
et al., 2005). Les mutants ne produisant pas d’hydroperoxyde lyase ont une activité
lipoxygénase augmentée, avec production de nombreux composés en C5. L’extinction de
LOX conduit à une réduction très importante des composés volatils des feuilles.
Chez Mentha viridis et Mentha pulegium, Gargouri et al. (2004) ont isolé une
hydroperoxyde lyase à partir des feuilles. Cette enzyme est responsable de la formation de
l’hexanal à partir de l’acide 13(S)-hydroperoxy-linoléique d’une part et de la formation du cis-
3-hexénal à partir de l’acide 13(S)-hydroperoxy-linolénique d’autre part. Le cis-3-hexénal
peut être isomérisé en trans-2-hexénal.
Chez la tomate, il existe au moins cinq isoformes de LOX, TomloxA à E. Les gènes
correspondant à ces enzymes ont été récemment clonés (Chen et al., 2004a). Par l’utilisation
de plantes transgéniques altérées dans la synthèse de ces protéines, les auteurs ont montré
qu’une des isoformes, TomloxC, était impliquée dans la formation des composés parfumés
dérivés des acides gras présents dans le fruit. Par des fusions avec la GFP, ils ont également
démontré que cette protéine est adressée aux chloroplastes, où elle pourrait utiliser
indifféremment l’acide linoléique et l’acide linolénique comme substrats. Dans les
germinations de Cucumis sativus, au contraire, il semble que certaines formes de LOX soient
localisées dans les corps lipidiques (Weichert et al., 2002).
Les produits de l’activité de cette enzyme sont métabolisés par l’hydroperoxyde lyase,
conduisant ainsi à la formation d’aldéhydes en C6 comme l’hexanal. Plusieurs formes de
LOX, localisées dans des organites différents, pourraient donc être à l’origine de ces
composés.
Malgré ces recherches, la voie de biosynthèse des composés volatils dérivés des acides
gras est peu étudiée. En particulier, dans les tissus floraux, aucune étude de la synthèse et de
la localisation subcellulaire de ces composés n’a jusqu’ici été réalisée (Dudareva et al., 2000).
2. La biosynthèse des composés aromatiques

Le métabolisme des composés aromatiques comprend des séries complexes de voies
biochimiques (Fig. 13) qui fournissent aux plantes des centaines de composés, souvent
spécifiques d’une espèce végétale. Tous ces composés dérivent du même précurseur, la L-
phénylalanine. Classiquement, les composés aromatiques sont divisés en deux
catégories (Knudsen et al., 1993) :
Figure 13 : Voies de biosynthèse des composés aromatiques (d’après Boatright et al.,
2004). La voie β-oxidative, dépendante du CoA, de synthèse de réduction des chaînes est en
bleue, alors que la voie non β-oxydative, indépendante du CoA est en noir. Les flèches
rouges indiquent la voie non b-oxydative dépendante du CoA. Les flèches pleines indiquent
les réactions biochimiques caractérisées, alors que les flèches en pointillé indiquent des étapes
possibles, non caractérisées. BSMT et SAMT, S-adénosyl-L-met:benzoique acide /
salicylique acide et salicylique acide carboxyl méthyltransférase, respectivement ; BA2H,
benzoïque acide 2-hydroxylase ; BZL, benzoate:CoA ligase ; C4H, cinnamique acide 4-
hydroxylase ; SA Gtase, UDP-Glc:salicylique acide glucosyltransférase. Les composés
volatils benzénoïdes et phénylpropanoïdes-associés encadrés en jaune sont les composés
analysés dans le parfum floral du pétunia et dans les tissus du pétale.
− Les phénylpropanoïdes
La plupart des phénylpropanoïdes ne sont pas volatils. Les plus répandus sont ceux qui
interviennent dans la synthèse de la lignine et les pigments comme les anthocyanes .
Néanmoins, les phénylpropanoïdes qui sont réduits au niveau du carbone 9 (en aldéhyde,
alcool ou alcane/alcène) et/ou présentent des additions alkyl sur les groupes hydroxyl du
noyau benzénique ou sur le groupe carboxyl sont volatils. On peut citer l’eugénol et le
méthyleugénol.
− Les benzénoïdes
Ils sont dérivés des phénylpropanoïdes par la coupure des carbones C8-C9. Le
mécanisme exact de cette coupure n’est pas complètement élucidé (Boatright et al., 2004). Ils
forment une branche latérale de la voie générale des phénylpropanoïdes, à partir de l’acide
trans-cinnamique. Le benzylalcool ainsi que le 2-phényléthanol et leurs dérivés sont très
présents dans les parfums floraux (Knudsen et Tollsten, 1993). Le DMT et le TMB,
synthétisés par les roses chinoises appartiennent aussi à cette catégorie de molécules.
a. La synthèse des composés aromatiques chez Clarkia breweri

Clarkia breweri et Antirrhinum majus sont deux espèces qui font l’objet de
nombreuses études afin de comprendre les voies de biosynthèse des benzénoïdes dans les
pétales.
Le parfum floral de C. breweri, espèce annuelle des côtes californiennes, est un
mélange de 8 à 12 composés volatils. Les plus abondants sont le linalol, l’oxyde de linalol et
le benzylacétate (Raguso et Pichersky, 1995). Néanmoins, eugénol, isoeugénol,
méthyleugénol et isométhyleugénol sont aussi des constituants importants du parfum floral de
cette espèce. Eugénol et isoeugénol ont une odeur piquante de clou de girofle, tandis que
méthyleugénol et isométhyleugénol ont un parfum doux qui rappelle l’odeur d’herbe
fraîchement coupée (Wang et Pichersky, 1998). L’enzyme S-Adénosyl-L-
Méthionine:(iso)eugénol O-méthyltransférase (IEMT) catalyse le transfert d’un groupement
méthyl sur l’eugénol et l’isoeugénol pour donner le méthyleugénol et l’isométhyleugénol,
respectivement. Le gène correspondant à cette enzyme a été isolé et caractérisé (Wang et al.,
1997 ; Wang et Pichersky, 1998).
Le benzylacétate constitue jusqu’à 40 % des composés émis par les fleurs de C.
breweri. Deux autres esters, le benzylbenzoate et le méthylsalicylate, comptent chacun pour
environ 5 % des composés volatils totaux (Raguso et Pichersky, 1995). L’enzyme responsable
de la formation du méthylsalicylate à partir du salicylate, la SAMT (salicylic acid
méthyltransferase) a été identifiée et caractérisée (Dudareva et al., 1998a ; Ross et al., 1999).
de même que l’acétyl-CoA:benzylalcool acétyltransférase (BEAT), responsable de la
formation du benzylacétate (Dudareva et al., 1998b).
L’activité de ces deux enzymes est plus importante dans les pétales de C. breweri que
dans les autres organes de la plante et varie avec le stade de développement. L’expression du
gène BEAT dans les pétales est maximale au moment de l’anthèse parallèlement à l’évolution
de l’activité enzymatique de la protéine BEAT et l’émission du benzylacétate. Néanmoins,
trois jours après l’anthèse, les niveaux d’ARNm et l’émission des composés volatils
diminuent alors que l’activité BEAT reste élevée pendant encore deux jours. Ceci suggère que
l’enzyme est relativement stable (Dudareva et al., 1998b).
b. La synthèse des composés aromatiques chez la rose

Certains composés aromatiques, comme le 2-phényléthanol, le DMT ou le TMB, sont
des éléments importants de la fragrance des roses. Les travaux concernant cette classe de
composés se sont multipliés au cours des trois dernières années.
Chez Rosa x damascena, l’espèce utilisée pour la production d’huile essentielle, le 2-
phényléthanol représente 62 à 68 % des composés de l’huile extraite des pétales par solvant.
En fournissant de la L-phénylalanine marquée radioactivement à des fleurs de Rosa x
damascena en cours de développement, Watanabe et al. (2002) et Hayashi et al. (2004) ont
montré que le 2-phényléthanol dérive de la L-phénylalanine selon plusieurs voies possibles
(Fig. 8). L’importance respective des différentes voies n’est pas encore clairement établie.
Dans les pétales, une grande partie du 2-phényléthanol est présent sous la forme non volatile
d’un complexe avec le β-D-glucose, le 2-phényléthyl-β-D-glucopyranoside (Ackermann et
al., 1989 ; Oka et al., 1999). Dans les boutons juste ouverts, le β-D-glucoside de
phényléthanol est très abondant alors que la forme volatile est présente à l’état de traces. Au
cours du développement floral, les quantités de 2-phényléthyl-β-D-glucopyranoside
diminuent tandis que les quantités de 2-phényléthanol libre augmentent, parallèlement à une
augmentation de l’activité β-glucosidase (Watanabe et al., 2002). Les travaux récents de
Hayashi et al. (2004) ont confirmé que l’activité β-glucosidase est liée à la production et à
l’émission du 2-phényléthanol et que les composés glycosylés sont bien les précurseurs des
formes volatiles. Il est à noter que certains monoterpènes comme le géraniol existent
également dans la fleur sous forme glycosylée. Cependant, leur implication dans la régulation
de l’émission du parfum est beaucoup moins certaine (Oka et al., 1999).
Récemment, une approche génomique a été mise en œuvre par une équipe française
(Channelière et al., 2002) et une équipe israélienne (Guterman et al., 2002) pour isoler des
gènes associés à la fragrance florale des roses. Une première banque d’ESTs a été obtenue à
partir de pétales de Rosa chinensis ‘Old blush’ (Channelière et al., 2002). 1794 séquences ont
été isolées parmi lesquelles 35,8 % correspondent à des séquences de fonctions inconnues ou
à des séquences absentes des bases de données. Ces séquences sont tout particulièrement
intéressantes car elles pourraient être impliquées dans des fonctions spécifiques du pétale. Des
fonctions putatives ont pu être attribuées aux 1151 séquences restantes. De très nombreuses
séquences correspondent à des gènes ayant une fonction dans les processus de défense ou de
stress ou codent pour des protéines associées aux membranes (protéines de transfert des
lipides et métallothionéines par exemple). 9,2 % des séquences correspondent à des gènes qui
codent pour des protéines impliquées dans le métabolisme primaire et le métabolisme
secondaire. Certaines séquences pourraient intervenir dans la production du parfum ou la
synthèse des pigments : GGPPS, IPP isomérase, phytoène synthase, sesquiterpène cyclase,
anthocyanidine synthase et protéine ressemblant à une leucoanthocyanidine dioxygénase.
Deux autres banques d’ESTs ont été obtenues à partir de pétales de deux variétés de
roses Hybrides de Thé, ‘Fragrant Cloud’, parfumée, et ‘Golden Gate’, dépourvue de parfum
(Gutermann et al., 2002).
Grâce à ces banques d’ESTs et à une approche de génomique fonctionnelle, des gènes
correspondant à des enzymes impliquées dans les dernières étapes de la biosynthèse du 3,5-
diméthoxytoluène (DMT) ont été isolés et caractérisés parallèlement par les deux équipes de
recherche (Scalliet et al., 2002 ; Lavid et al., 2002). Le DMT représente chez certaines
variétés de rose comme ‘Lady Hillingdon’ jusqu’à 70 % des composés volatils émis par les
pétales (Nakamura, 1987). Il est synthétisé à partir de l’orcinol par deux étapes successives de
méthylation, catalysées par deux O-méthyltransférases : OOMT1 et OOMT2 (Scalliet et al.,
2002 ; Lavid et al., 2002). L’expression des gènes correspondant à ces enzymes est spécifique
des pétales et des anthères, sites de production du parfum chez la rose. De plus, elle est plus
importante dans les pétales matures que dans les pétales jeunes (Scalliet et al., 2002). Lavid et
al. (2002) ont montré que l’OOMT1 catalyse préférentiellement la méthylation de l’orcinol,
tandis que l’OOMT2 est responsable de la méthylation du 3-méthoxy 5-hydroxytoluène
(MHT). La modélisation de la structure de ces deux enzymes montre que le résidu en position
127 dans la séquence de l’OOMT1 et en position 126 dans celle de l’OOMT2 est responsable
de la spécificité de substrat (Scalliet, 2003). Des expériences de mutagenèse dirigée, visant à
convertir la Tyr127 en Phe127 dans l’OOMT1 et la Phe126 en Tyr126 dans l’OOMT2 ont permis
d’inverser la spécificité de substrat de chacune des deux enzymes, prouvant ainsi que ce
résidu est responsable de cette spécificité (Scalliet et al., article sous presse). Le DMT est
donc synthétisé à partir de l’orcinol par deux étapes successives de méthylation suivant une
séquence maintenant bien définie (Fig. 14).
Les deux OOMT de rose sont capables de catalyser les dernières étapes de la synthèse
du 1,3,5-triméthoxybenzène ou TMB, autre composé aromatique important de la fragrance
florale de certaines variétés chinoises comme Rosa chinensis ‘Old Blush’. Néanmoins, elles
ne sont pas capables d’assurer la première étape de cette synthèse, la méthylation du
phloroglucinol (Fig.14). Par une méthode de purification de protéines, Wu et al. (2004) ont
isolé la protéine responsable de cette réaction, la phloroglucinol-O-méthyltransférase
(POMT). Comme celui des OOMT, l’ARNm du gène POMT est préférentiellement accumulé
dans les pétales, site principal de la synthèse des composés volatils.
Après analyse des articles décrits ci-dessus, il est manifeste que les composés
aromatiques représentent la classe de composés la plus étudiée chez la rose. Certains
composés, comme le DMT et le TMB, ont fait l’objet d’une attention particulière.
Néanmoins, il reste que très peu de gènes impliqués dans la synthèse des composés volatils
floraux ont été isolés et caractérisés chez cette plante.
C. L’ingénierie des composés volatils

Un des intérêts des composés volatils émis par les fleurs repose sur le fait qu'ils sont
impliqués dans des relations plante/insecte, et notamment dans la pollinisation. D’autre part,
les plantes aromatiques ont une valeur commerciale très importante. Elles sont la source de
parfums, d’arômes pour l’industrie agro-alimentaire et possèdent des propriétés utiles à
l’industrie pharmaceutique. La demande en composés aromatiques est légèrement supérieure
à l’offre. La chimie a été utilisée pour pallier à ce déficit et produire des molécules de
synthèse, mais dans certains cas, il est préférable d’utiliser les molécules naturelles
(McCaskill et Croteau, 1997). Sans parler de l’intérêt fondamental évident de telles
recherches, l’étude des mécanismes de production des composés volatils et l'identification des
gènes impliqués dans leur biosynthèse pourraient être envisagées avec les buts appliqués
suivants :
CH3 CH3 CH3
2’ 3’
HO CH3 HO OCH3 3HCO OCH3
orcinol 3-méthoxy 5-hydroxytoluène 3,5-diméthoxytoluène
OH OCH3 OCH3 OCH3

1 2 3
HO OH HO OH HO OCH3 3HCO OCH3
phloroglucinol 1,3,5-triméthoxybenzène
Figure 14 : Voie de biosynthèse du 3,5-diméthoxytoluène et du 1,3,5-triméthoxybenzène.

1, phloroglucinol O-méthyltransférase ou POMT (Wu et al., 2004) ; 2 et 2', orcinol O-
méthyltransférase 1 ou OOMT1 (Scalliet et al., 2002 ; Lavid et al., 2002) ; 3 et 3', orcinol O-
méthyltransférase 2 ou OOMT2 (Scalliet et al., 2002 ; Lavid et al., 2002).
− Connaître le rôle des composés individuels dans la pollinisation pour modifier
le ‘bouquet floral’ de certaines espèces qui n’acceptent qu’un nombre réduit de
pollinisateurs, comme le vanillier ou le cacaoyer, et ne peuvent être cultivées
en dehors de leur habitat naturel sans la mise en place de techniques
d'hybridation artificielles coûteuses (Dudareva et Nègre, 2005),
− fournir des plantes présentant des caractéristiques nouvelles à l'industrie de la
floriculture,
− produire par des cultures de cellules des composés présentant des profils
olfactifs recherchés comme les oxydes de rose et dont la synthèse est très
coûteuse (Yamamoto et al., 2002). Une telle approche pourrait être appliquée à
la production d'huiles essentielles et de composés volatils possédant une valeur
thérapeutique ou d'arômes pour l'industrie agro-alimentaire (Dudareva et
Negre, 2005) ;
− augmenter la production de composés volatils intéressants, par exemple en
inhibant les voies de synthèse des autres composés volatils mineurs ou en
augmentant les quantités d’enzymes impliquées dans la voie de synthèse
d’intérêt,
− améliorer la qualité des huiles essentielles, par exemple en inhibant
l’expression de certains gènes correspondant à des protéines responsables de la
synthèse de composés indésirables (Verpoorte et Memelink, 2002) ou
allergisants (Chaintreau et al., 2003).
Cependant, la manipulation de la production et de l’émission des composés volatils,

nécessite non seulement d'isoler et de caractériser les gènes responsables de leur synthèse,
mais également de connaître leur régulation.
1. La régulation de la production des composés volatils

La production et l'émission de composés volatils particuliers dans l'atmosphère dépend
à la fois du taux de leur synthèse, mais également de leur libération. Ces deux processus sont
contrôlés par des facteurs physiologiques qui déterminent la quantité de composés synthétisés
en influençant la disponibilité en intermédiaires de la voie de biosynthèse et l’activité
enzymatique. Des facteurs physico-chimiques interviennent en affectant l’émission des
composés, de leur site de biosynthèse vers l’air ambiant.
2. Les rythmes de production et d'émission des composés volatils
Généralement, les boutons floraux n’ont pas de parfum et la fragrance caractéristique
de la fleur apparaît pendant l’anthèse quand les pétales s’ouvrent (Schade et al., 2001). Il est
ainsi possible de produire les composés du parfum floral à partir de composés précurseurs
présents dans les boutons floraux de Jasminum polyanthum, lorsqu’on les traite avec une
préparation d’enzymes extraites de fleurs épanouies (Watanabe et al., 1993). Ceci met en
évidence le fait que les dernières réactions de biosynthèse sont régulées au cours du
développement et ont lieu uniquement lorsque la fleur commence à s’ouvrir : soit les enzymes
sont nouvellement synthétisées, soit elles sont activées au cours de l’épanouissement floral.
Chez de nombreuses fleurs, il a été démontré que les composés volatils sont généralement
synthétisés de novo dans les cellules sécrétrices à partir desquelles ils sont émis. (Dudareva et
al., 1996 ; Dudareva et Pichersky, 2000 ; Chen et al., 2004b; Gang et al., 2001 ; Lu et al.,
2002 ; Kolosova et al., 2001b). Il a également été montré que la biosynthèse des composés
volatils est bien corrélée à l’émission (Pichersky et al., 1994 ; Wang et al., 1997 ; Dudareva et
al., 2000) et que l’émission est contrôlée par l’activation des voies métaboliques spécifiques
à la production de ces molécules. En effet, on observe généralement l’accumulation d’ARNm
parallèlement à l’émission des composés volatils (Wang et al., 1997 ; Dudareva et al., 1998a
; Guterman et al., 2002).
Chez de nombreuses espèces végétales, l’émission des composés volatils au cours de
la journée suit un rythme cyclique. Les mécanismes impliqués dans le contrôle de cette
émission commencent seulement à être étudiés. Le rythme d’émission des composés volatils
est contrôlé par des facteurs exogènes, comme la lumière et la température (Jakobsen et
Olsen, 1994), ou par des facteurs endogènes (Loughrin et al., 1991 ; Helsper et al., 1998), ou
bien encore par une combinaison des deux types de facteurs (MacTavish et al., 2000). Il est
connu depuis de nombreuses années que les composés volatils floraux jouent un rôle dans la
pollinisation (Knudsen et Tollsten, 1993, Jurgens et al., 2000). Des rythmes diurnes ou
nocturnes ont parfois été reliés à l'activité de l'insecte pollinisateur. Ainsi, les espèces
pollinisées le jour par les abeilles ont une émission diurne, alors que les espèces pollinisées la
nuit, comme le pétunia (Verdonk et al., 2005), ont une émission nocturne, contrôlée de façon
endogène par un rythme circadien (Altenburger et Matile, 1988). Pendant longtemps, on a
pensé que la rythmicité de l’émission diurne n’était pas de nature circadienne mais était
contrôlée par le niveau d’irradiation (Jakobsen et Olsen, 1994 ; Altenburger et Matile, 1990).
Helsper et al. ont montré pour la première fois en 1998 que l’émission diurne des composés
volatils chez la rose obéissait à un rythme circadien. En effet, chez Rosa x hybrida 'Honesty'
les composés volatils, monoterpènes dérivés d’acides gras et composés aromatiques, sont
émis au cours du développement floral suivant un rythme diurne, avec un maximum au milieu
de la phase de jour. Ce rythme perdure lorsque la plante est maintenue constamment soit à
l'obscurité, soit à la lumière et sa période est légèrement supérieure à 24 h : ces
caractéristiques définissent un rythme circadien. Toujours chez la rose, Picone et al. (2004)
ont montré que l’évolution de l’émission de certains composés comme le 2-phényléthanol
pourrait être due à des changements rythmiques dans les proportions de formes libres et
glycosylées de ces molécules.
Chez d’autres espèces comme A. majus, l'émission diurne des composés du parfum est
également contrôlée par un rythme circadien (Dudareva et al., 2000 ; Kolosova et al., 2001b).
L’émission diurne de méthylbenzoate, composé majoritaire, coïncide avec la période
d’activité des bourdons. Il est synthétisé à partir de l’acide benzoïque par une réaction
catalysée par la S-adénosyl-L-méthionine:acide benzoïque carboxyl méthyltransférase
(BAMT). L'activité BAMT est constante sur une période de 48 h et élevée pendant la nuit,
alors que l'émission de méthylbenzoate est maximale le jour. Par contre, les quantités d’acide
benzoïque, substrat de l'enzyme BAMT, évoluent de façon rythmique au cours d'une période
de 24 h, et ce rythme est maintenu lors d’une période nocturne prolongée. Ceci indique que la
rythmicité d'émission du méthylbenzoate est liée, au moins en partie, à la rythmicité de la
disponibilité en substrat (Kolosova et al., 2001b).
a. Le contrôle génétique de la production des composés volatils

Au sein d’un même genre, toutes les espèces n’ont pas la même capacité de
production. Dans le genre Clarkia, les espèces C. concinna et C. breweri sont apparentées, la
première étant l’ancêtre supposé de la seconde. C. concinna est inodore, tandis que le parfum
de C. breweri est puissant, avec une grande quantité de benzylacétate (Raguso et Pichersky,
1995). De nombreuses études ont été menées afin de comprendre la régulation différentielle
des gènes du parfum chez ces deux espèces du même genre.
Par exemple, chez C. concinna, le gène BEAT (benzylalcool acétyltransférase),
impliqué dans la synthèse du benzylacétate, est très faiblement exprimé dans les pétales. Ceci
est dû au fait que, dans la majorité des cas, l’unique intron du gène n’est pas épissé
efficacement, ce qui conduit à la synthèse d’un ARNm non fonctionnel. Dans le cas où
l’intron est épissé, l’enzyme synthétisée a une affinité plus importante pour des substrats
différant du benzylalcool. Ainsi, la régulation de l’activité BEAT chez Clarkia implique des
mécanismes post-transcriptionnels différents selon les espèces (Nam et al., 1999). Selon les
auteurs, le gène BEAT de C. breweri pourrait avoir évolué à partir d’un gène codant pour une
acétyltransférase dont le substrat serait proche du benzylalcool. Alternativement, il est
possible que les fleurs de C. concinna aient perdu au cours de l’évolution leur capacité à
produire du benzylacétate. Le gène BEAT aurait muté, perdant ainsi sa fonction in vivo.
En plus de composés aromatiques comme le benzylacétate, les fleurs de C. breweri
synthétisent aussi un alcool monoterpénique en grande quantités, le linalol. Bien que les fleurs
de Clarkia soient pollinisées la nuit, aucun rythme d’émission de ce composé n’a été détecté.
Le gène responsable de la dernière étape de sa synthèse, LIS (linalol synthase) est le premier
gène d’une voie de biosynthèse des composés floraux à avoir été cloné (Dudareva et al.,
1996). Il est exprimé majoritairement dans les pétales et le pistil de C. breweri. Dans cet
organe, la majorité du linalol produit est converti en oxyde de linalol. C. concinna émet aussi
du linalol mais dans des concentrations 1000 fois plus faibles que C. breweri. Le gène LIS est
aussi présent chez cette espèce mais son expression est beaucoup plus faible et restreinte au
stigmate de la fleur. Ces résultats montre que chez C. breweri, l’expression de LIS a
probablement été augmentée et l’éventail de tissus exprimant ce gène a été élargi par rapport à
C. concinna. Des différences dans les séquences des promoteurs de ce gène chez les deux
espèces ont été notées mais on ne sait pas si ces différences sont responsables des différences
d’expression observées (Raguso et Pichersky, 1999).
De nombreux auteurs ont étudié les composés volatils produits par les plantes et noté
les différences existant entre les profils des espèces sauvages et des espèces cultivées. Chez
les fraises cultivées octoploïdes (variétés de Fragaria x ananassa), l'arôme est le résultat d'un
mélange complexe de 300 composés. Les espèces de fraisier cultivées produisent
majoritairement du linalol (monoterpène) et du nérolidol (sesquiterpène), alors que chez les
fraises sauvages diploïdes (F. vesca par exemple), on trouve essentiellement des
monoterpènes variés (α-pinène, ß-myrcène…) et de l'acétate de myrtényl.
Chez les espèces cultivées, le gène FaNES1, codant pour une nérolidol synthase, a été
isolé (Aharoni et al., 2004). Ce gène est absent du génome des espèces sauvages diploïdes. Il
code pour une protéine qui est tronquée à son extrémité N-terminale, probablement
cytoplasmique. L'enzyme est responsable de la synthèse du linalol et du nérolidol à partir du
GPP et du FPP, respectivement. Les auteurs suggèrent que l’implication originale de cette
enzyme dans deux voies de synthèse différentes vient de sa localisation dans le cytoplasme,
où elle est mise en contact avec le GPP et le FPP.
L'arôme des fraises sauvages est essentiellement monoterpénique. La formation de l'α-
pinène et du β-myrcène est catalysée une pinène synthase, codée par le gène FvPINS. Chez
les espèces cultivées, le gène FaPINS correspondant présente une mutation insertionnelle qui
le rend non fonctionnel. Cette mutation affecte grandement l'arôme du fruit. En effet, l'α-
pinène n'est plus produit, non plus que les produits qui en dérivent, comme l'acétate de
myrtényl et le myrténol.
L'évolution de l'arôme des fruits est donc le résultat de mécanismes moléculaires
indépendants (perte d'une fonction, acquisition d'une autre), sous des pressions d'évolution et
de sélection, probablement influencées par l'homme. En effet, chez les fraises sauvages, l'α-
pinène donne au fruit une odeur déplaisante de résine : ce caractère a probablement été contre-
sélectionné par l'homme. Par opposition, le linalol apporte au fruit une odeur douce, florale et
citronnée et le nérolidol une note verte de pomme et de rose. De plus, ces deux composés
améliorent la résistance aux pathogènes du fruit. Toutes ces caractéristiques ont probablement
été favorisées la sélection artificielle qui influence parfois favorablement la qualité
aromatique des fruits. Chez la tomate, un allèle du gène malodorous, présent chez les tomates
sauvages (Lycopersicon penellii) conduit à la présence d’une quantité importante et
indésirable de phénylacétaldéhyde (Tadmor et al., 2002). Il semble qu’au cours de la
domestication, ce gène ait été contre-sélectionné, ce qui a permis l’obtention de tomates à
l’odeur agréable, moins riche en phénylacétaldéhyde.
b. Le rôle des facteurs de transcription

Nous avons vu ci-dessus que la formation des composés volatils était régulée au cours
du développement de la fleur et que cette régulation pouvait être différente selon les variétés
au sein d’une même espèce. En effet, l'expression de gènes de une ou plusieurs voies
biochimiques est régulée au niveau transcriptionnel de façon orchestrée pour assurer la
production d'un mélange de composés volatils (Dudareva et Negre, 2005) qui atteint son
maximum lorsque la fleur est prête pour la pollinisation et que l’insecte pollinisateur est actif
(Negre et al., 2003 ; Dudareva et al., 2004 ). Cette régulation existe aussi pour les composés
volatils accumulés dans les feuilles et les fruits (Turner et al., 2001b ; Lewinshon et al.,
2001). Le contrôle transcriptionnel coordonné de gènes, assuré par des facteurs de
transcription, est probablement le mécanisme majeur dictant les niveaux finaux de métabolites
secondaires dans les cellules végétales. Jusqu’ici, peu de facteurs de transcription impliqués
dans la régulation de la synthèse des métabolites secondaires ont été identifiés. Des facteurs
de transcription jouant un rôle dans la régulation des voies de synthèse des flavonoïdes et des
alcaloïdes indoles terpéniques (TIA) ont cependant été caractérisés.
Chez de nombreuses espèces végétales, la régulation tissu-spécifique de gènes
impliqués dans la synthèse des anthocyanes est sous le contrôle de deux familles distinctes de
facteurs de transcription, présentant des homologies avec les protéines c-MYB et bHLH (Mol
et al., 1998). L'expression ectopique du gène PAP1 d'A. thaliana, homologue de c-MYB, a
pour conséquence l'augmentation très importante de la synthèse des flavonoïdes et une
pigmentation pourpre intense dans la plupart des organes de la plante (Borevitz et al., 2000).
Certains facteurs MYB peuvent avoir des effets répressifs sur les gènes de cette voie. Ainsi,
l'expression chez le tabac des deux facteurs MYB isolés chez l'œillet, AmMYB308 et
AmMYB330, a pour conséquence l'inhibition de l'accumulation de l'acide
hydroxycinnamique et du monoligol (Tamagnone et al., 1998). Près de 20 % des espèces
végétales accumulent des alcaloïdes qui dérivent de certains acides aminés. Les TIA dérivent
du tryptophane et de précurseurs terpéniques (Memelink et al., 2001). La production de TIA,
chez Catharanthus roseus, est finement contrôlée au cours du développement, mais aussi en
réponse à un stress ou à une attaque d'un pathogène. Ce contrôle est assuré par l'acide méthyl
jasmonique (MeJA), hormone de stress, par l'intermédiaire des facteurs de transcription
ORCA appartenant à la classe des domaines AP2-ERF (ORCA2 : Menke et al., 1999 ;
ORCA3 : van der Fits et Memelink, 2000). Récemment, trois nouveaux facteurs de
transcription (ZCT) ont été identifiés (Pauw et al., 2004). Ils appartiennent à la famille des
facteurs de transcription de type IIIA. Ils répriment non seulement l'activité des promoteurs de
la tryptophane décarboxylase et de la strictosidine synthase, mais aussi l'action du facteur
ORCA2 lorsque celui-ci est fixé sur le promoteur de la STR. L’effet répressif des facteurs
ZCT a pour conséquence l’inhibition de la voie de synthèse des TIA.
Bien que de nombreux gènes des voies de biosynthèse du parfum floral aient été
identifiés, la régulation de ces voies est encore une énigme. Récemment, des gènes impliqués
dans la régulation de la production des composés du parfum du pétunia ont été identifiés
(Verdonk et al., 2005). Petunia hybrida ‘Mitchell’ émet la nuit des composés volatils,
principalement des benzénoïdes. Le gène ODORANT1, membre de la famille MYB de type
R2-R3, est un élément régulateur de la production de ces composés. En effet, l’expression de
ce gène évolue parallèlement à la production des benzénoïdes. Son extinction se traduit par
une réduction importante de leur l'émission parallèlement à une diminution des niveaux de
transcripts de certains gènes impliqués dans la synthèse des précurseurs de la voie du
shikimate. Ce facteur MYB se lie au promoteur de la 5-énol-pyruvylshikimate synthase,
activant ainsi la voie de synthèse des précurseurs des benzénoïdes du parfum. Il est intéressant
de noter que la voie du shikimate est également impliquée dans la synthèse des anthocyanes et
que la suppression du gène ODORANT1 n'affecte pas la production des pigments. Ceci
s'explique peut-être par le fait que production de pigments et de composés du parfum sont
deux événements dissociés dans le temps.
ODORANT1 est le premier facteur de transcription dont le rôle dans la production des
composés volatils du parfum a été prouvé. D’autres régulateurs, impliqués par exemple dans
les voies de biosynthèse des terpènes et des dérivés d’acides gras seront vraisemblablement
bientôt caractérisés. L'élucidation de ces réseaux régulateurs aura sûrement une grande place
dans les stratégies d'ingénierie métabolique des composés volatils.
3. Quelques exemples d’ingénierie métabolique

a. L’amélioration de la menthe poivrée
Un exemple réussi de modification de la voie des terpènes est fourni par les travaux
sur la menthe poivrée. L’huile essentielle de cette espèce contient en plus du menthol un
composé indésirable, le menthofurane, qui contribue à en déprécier la flaveur. Chez des
plantes soumises à un stress, le menthofurane peut atteindre des quantités inacceptables pour
l’industrie.
Mahmoud et Croteau (2001) ont d’une part surexprimé le gène DXR et d’autre part
supprimé l’expression du gène de la menthofurane synthase (MFS) chez la menthe poivrée.
Deux groupes principaux de plantes ont été obtenus lors de la surexpression du gène
DXR :
− Le groupe TI est constitué par 42 plantes dont le phénotype n’est pas différent
de celui des plantes sauvages.
− Le groupe TII est représenté par 11 plantes dont les feuilles présentent une
pigmentation des feuilles très faible. Des analyses de Northern-blot révèlent
que l’absence de pigmentation est liée à un phénomène de co-suppression du
gène DXR.
Dans les plantes du groupe TI, l’activité DXR est 2 à 4 fois plus importante que dans
les plantes sauvages et la quantité d’huile essentielle est augmentée de près de 50 %. Aucune
altération de la composition de l’huile n’est observée. La suppression de l’expression du gène
MFS n’a pas d’effet sur l’huile essentielle chez la majorité des plantes transformées.
Néanmoins, quatre d’entre elles accumulent moins de menthofurane que les plantes sauvages
(35 à 55 % en moins) et plus de menthol.
Dans une autre exprérience, Mahmoud et al. (2004) ont transformé des plantes de
Mentha x piperita indépendamment avec les ADNc de la limonène synthase et de la limonène
3-hydroxylase de menthe. Bien que les deux ADNc soient surexprimés de façon constitutive
dans les plantes transgéniques obtenues, aucun changement n’est observé dans le rendement
ou la qualité de l’huile. Les auteurs concluent que la limonène synthase n’est pas surexprimée
de façon suffisante dans les cellules des trichomes sécréteurs. Dans l’expérience avec la
limonène 3-hydroxylase, un nombre anormalement élevé de plantes transgéniques
cosupprimées est obtenu, peut-être parce que une surexpression trop importante de cette
enzyme est toxique pour la plante. Dans ces plantes cosupprimées, le limonène s’accumule
dans l’huile essentielle, jusqu’à 80 % contre 2 % dans les plantes témoins.
Ces expériences d’ingénierie chez la menthe montrent qu’il est parfois possible de
modifier la quantité et la qualité des composés volatils produits par les cellules sécrétrices.
L’impact positif de la surexpression du gène DXR chez la menthe sur la production d’huile
essentielle montre que l’étude de la DXR chez la rose pourrait être intéressante dans une
logique d’amélioration du parfum chez cette espèce.
b. Les premières expériences d’ingénierie des composés volatils

floraux
L’ADNc correspondant à la linalol synthase de C. breweri a été introduite dans les
fleurs de pétunia (Lücker et al., 2001) et d’œillet (Lavy et al., 2001). Chez le pétunia,
l’introduction de ce gène se traduit par une accumulation, non pas de linalol, mais de linalyl-
β-D-glucopyranoside, qui pourrait être une forme de stockage du linalol, non volatile. En
effet, les monoterpènes sont toxiques pour les cellules s’ils ne sont pas émis ou stockés dans
des structures spécialisées. La présence du conjugué β-D-glucosidé pourrait suggérer que le
pétunia ne possède ni structure spécialisée de stockage, ni mécanisme de sécrétion adapté au
linalol (Lücker et al., 2001). Chez l’œillet sauvage qui ne produit pas de monoterpènes, la
surexpression de la linalol synthase de C. breweri entraîne bien une émission de linalol
(jusqu’à 6% des composés émis) et d’oxyde de linalol. Cependant, l’odorat humain n’est pas
capable de détecter le linalol émis. Il se peut que les quantités émises soient trop faibles, peut-
être à cause d’une quantité limitante de GPP disponible (Lavy et al., 2002).
Une expérience réalisée chez le pétunia montre également comment, en augmentant la
quantité de substat disponible, on peut augmenter la fragrance florale. Des plantes de Pétunia
transformées avec une construction antisense de la flavanone 3-hydroxylase ont été obtenues
dans le but de modifier la couleur des fleurs (Zucker et al., 2002). Comme cela était attendu,
chez les plantes transgéniques présentant une très faible expression de ce gène, des
modifications variées de la couleur des fleurs sont obtenues, jusqu’à une suppression totale de
la couleur rouge/orangée d’origine. De plus, les fleurs dont la couleur est très altérée sont
également plus odorantes que les fleurs non transformées, résultat qui n’était pas attendu. Ces
plantes émettent en effet des quantités de méthylbenzoate plus importantes que les plantes
non transformées. Dudareva et Pichersky (2000) ont montré que la production de ce composé
était régulée en partie par la quantité de substrat disponible, l’acide benzoïque. Il est donc
probable que le blocage de la voie des anthocyanes ait redirigé le flux de métabolites vers les
voies de biosynthèse des composés aromatiques, entraînant une surproduction d’acide
benzoïque (Zucker et al., 2002).
c. La production de composés volatils nouveaux chez le tabac

L’introduction d’un gène unique impliqué dans les voies de biosynthèse des composés
volatils a été rapportée de nombreuses fois (Lewinsohn et al., 2001 ; Lücker et al., 2001 ;
Lavy et al., 2002). Chez le tabac, trois enzymes utilisant le même substrat ont été introduites
dans la même plante (Lücker et al., 2004a). Il s’agit de trois monoterpène synthases, adressées
aux plastes, isolées chez le citron, utilisées seules ou en combinaison : la limonène synthase,
la terpinène synthase et la pinène synthase. L’introduction de ces trois enzymes dans des
plantes transgéniques a pour conséquence une production de monoterpènes en quantités 10 à
20 fois plus importantes que chez les plantes non transformées, avec de nombreux
monoterpènes absents des tabacs non transformés (limonène, γ-terpinène, ß-pinène…). Le
profil des composés émis par les fleurs et par les feuilles de tabac est donc profondément
modifié et ce changement est détectable par l’odorat humain (Lücker et al., 2004a).
Parallèlement, la limonène 3-hydroxylase de Mentha spicata, adressée au réticulum
endoplasmique (RE), a été introduite dans la lignée de tabac TERLIMPIN exprimant les trois
monoterpène synthases de citron (Lücker et al., 2004a). L’analyse des composés volatils émis
par les fleurs des plantes obtenues révèle que, malgré une localisation différente des enzymes
impliquées (plastes et RE), les fleurs produisent du (+)-trans-isopipériténol à partir du
limonène, contrairement aux fleurs de la lignée TERLIMPIN témoin (Lücker et al., 2004b).
Ceci implique que certains monoterpènes sont transportés, activement ou passivement, des
plastes au RE.
Ces expériences montrent qu’il est possible de faire produire à certaines espèces
végétales des composés volatils qui leur sont étrangers, à condition que le substrat soit
disponible (Lücker et al., 2004b). Le tabac semble être tout à fait adapté aux expériences de
bioingénierie dans l’idée d’augmenter les quantités de composés volatils de rose utiles à
l’industrie du parfum.
d. L’amélioration de l’arôme des fruits

Les arômes des fruits sont, comme les arômes floraux, des mélanges de composés
volatils perçus par l'odorat humain à des seuils très bas, jusqu’à 0,007 µg.L-1 dans l’eau
(Buttery et al., 1971). Les obtenteurs de variétés de fruits et légumes sont de plus en plus
attentifs à la qualité gustative et aromatique des fruits. Chez la tomate, l’amélioration des
propriétés gustatives par les techniques conventionnelles d’hybridation est limitée par la
multitude des gènes impliqués dans les voies de biosynthèse des composés volatils des
arômes. Le linalol est l’un des dix composés volatils les plus importants influençant le goût
des tomates (Buttery et al., 1971, 1990). Dans les tomates fraîches, il est présent à hauteur de
1 à 20 µg.g-1 (Buttery et al., 1988). L’ADNc de la LIS de C. breweri a été introduit chez la
tomate sous le contrôle d’un promoteur spécifique de fruit (Lewinsohn et al., 2001). Toutes
les plantes exprimant la LIS accumulent du linalol et ses dérivés oxygénés, sans effets
défavorables sur les autres composés, comme le lycopène et les tocophérols, qui ont
également une importance nutritionnelle.
Toujours chez la tomate, des plantes transformées avec les ADNc d’une alcool
déshydrogénase (ADH) ont un profil de dérivés d’acides gras modifié. Par exemple, les
quantités d’hexanol et de cis-3 hexénol sont plus élevées dans les plantes ayant une activité
ADH élevée. Dans une expérience de test en aveugle, ces fruits transgéniques ont été jugés
comme ayant une odeur de « fruit mûr » plus intense que les fruits non transformés.
D’autres expériences portant sur des alcool acétyltransférases isolées chez la fraise et
la banane ont mis l’accent une nouvelle fois sur l’importance de la disponibilité en substrat
(Beekwilder et al., 2004).
En conclusion, les travaux récents mentionnés ci-dessus font état du succès de

certaines expériences d’ingénierie métabolique (Mahmoud et Croteau, 2001 ; Lewinsohn et
al., 2001 ; Lücker et al., 2004a, 2004b). Ils soulignent surtout combien les résultats obtenus
sont encore imprévisibles (Lücker et al., 2001 ; Lavy et al., 2001 ; Zucker et al., 2002 ;
Beekwilder et al., 2004) et combien une meilleure compréhension des mécanismes
régulateurs de la production des composés volatils est nécessaire.
IV. Conclusion
L’analyse de la littérature concernant les composés volatils a révélé deux problèmes.
Tout d’abord, l’étude des structures sécrétrices est très bien documentée si l’on se réfère aux
trichomes sécréteurs. Par contre, la structure des épidermes sécréteurs a été très peu étudiée.
L’analyse bibliographique met en évidence les difficultés rencontrées lors de l'étude des
mécanismes impliqués dans la sécrétion (granulocrine ou écrine), et notamment les structures
de sécrétion.
Les voies de biosynthèse des composés volatils émis par les végétaux sont également
assez peu documentées, même si toutes les étapes de la voie de biosynthèse des composés de
l’huile essentielle de menthe sont élucidées. L’étude des voies de biosynthèse des composés
floraux a été initiée par Dudareva et Pichersky qui ont identifié les enzymes impliquées dans
la formation du parfum d’Antirrhinum majus et Clarkia breweri. Parmi les composés volatils,
les composés aromatiques et les composés terpéniques ont été plus étudiés que les composés
dérivés d’acide gras.
Chez la rose, l’étude des voies de biosynthèse des composés volatils floraux a débuté
très récemment. Une fois de plus, ce sont les composés aromatiques qui ont fait l’objet du
plus grand nombre de travaux de recherche. Lorsque cette thèse a débuté, aucun gène n’avait
été isolé. Nous avons décidé de nous focaliser sur les voies de biosynthèse des monoterpènes
floraux.
Matériels et Méthodes
I. Matériel végétal, souches et plasmides
A. Matériel végétal
1. Rosa x hybrida
a. Variétés de roses
La majorité des variétés utilisées sont des variétés sélectionnées par l’entreprise
Meilland Richardier (tableau 5). Parmi ces variétés, deux font l’objet d’une étude plus
approfondie : il s’agit de Rosa x hybrida ‘Papa Meilland’ et de Rosa x hybrida ‘The Mac
Cartney rose’.
b. Stades de développement
Six stades du développement floral de la rose sont définis (Fig. 15) et représentés par
les caractéristiques suivantes :
− Au stade ‘Bouton fermé’ (BF), les sépales sont redressés et recouvrent
entièrement les pétales ;
− au stade ‘Bouton juste ouvert’ (BJO), les sépales sont redressés mais laissent
apparaître les premiers pétales ;
− au stade ‘Bouton ouvert’ (BO), les sépales s’écartent des pétales et les pétales
les plus externes commencent à se déplier ;
− au stade ‘Bouton très ouvert’ (BTO), les sépales sont renversés et de nombreux
pétales sont dépliés ;
− au stade ‘Fleur épanouie’ (FE), tous les pétales sont dépliés,
− au stade ‘Fleur sénescente’ (FS), les pétales commencent à se détacher du
réceptacle floral, les étamines, les styles et les stigmates sont bien visibles.
2. Nicotiana tabacum et Nicotiana sylvestris

Deux espèces de tabac sont utilisées. Les expériences de localisation subcellulaire par
expression transitoire d’un gène après infiltration d’Agrobacterium tumefaciens, sont réalisées
sur l’espèce de tabac Nicotiana tabacum SR1 cv ‘Petit Havana’ (Fig. 16A).
Matériels et Méthodes 80
Tableau 5 : Variétés de rose utilisées au cours de l'étude. Les caractéristiques de couleur et
de parfum sont reprises des catalogues des obtenteurs. L’estimation du parfum va de ‘sans
parfum’ (-) à ‘très parfumée’ (+++).
Variétés Couleur Parfum Obtenteur Utilisation

‘Anna’ Saumon ++ Paul Pekmez Ressources carbonnées
Structure du pétale
Recherche de gènes
‘Black Baccara’ Rouge - Meilland Richardier Parfum
Ressources carbonnées
‘Charles de Gaulle’ Mauve +++ Meilland Richardier Ressources carbonnées
‘Christophe Colomb’ Orange + Meilland Richardier Ressources carbonnées
‘La Sévillana’ Vermillon - Meilland Richardier Ressources carbonnées
Madame Antoine Meilland’ Jaune + Meilland Richardier Ressources carbonnées
‘Marcel Pagnol’ Rouge ++ Meilland Richardier Ressources carbonnées
‘Panthère rose’ Rose + Meilland Richardier Ressources carbonnées
‘Papa Meilland’ Pourpre +++ Meilland Richardier Parfum
Recherche de gènes
‘Paul Ricard’ Jaune ++ Meilland Richardier Ressources carbonnées
‘Rouge Meilland’ Rouge - Meilland Richardier Ressources carbonnées
Recherche de gènes
‘The MacCartney rose’ Rose +++ Meilland Richardier Parfum
Recherche de gènes
'Hacienda' Rouge +++ Orard Structure du pétale
'Alister Stella Gray' Orange ++ Alexander Hill Gray Structure du pétale
'Royal Red' Rouge - Kordes Structure du pétale
Recherche de gènes
'Royal Baccara' Rouge - Meilland Richardier Structure du pétale
Recherche de gènes
'Sonia Rykiel' Rose ++ Guillot Structure du pétale
'Pariser Charme' Rose ++ Tantau Recherche de gènes
'Baronne Edmond de Rose +++ Meilland Richardier Structure du pétale
Rothschild'
Bouton fermé Bouton Bouton ouvert Bouton très Fleur épanouie

BF juste ouvert BO ouvert FE
BJO BTO
Figure 15 : Différents stades de développement de la variété Hybride de Thé 'The Mac
Cartney rose'.
Le tabac Nicotiana sylvestris est employé pour étudier l’effet de la surexpression d’un
gène sur les composés volatils produits (Fig. 16B).
B. Souches bactériennes
1. Escherichia coli
Quatre souches d’E. coli sont utilisées :
− La souche DH5α d’E. coli sert au clonage, à la multiplication et à la
conservation des gènes ;
− les souches M15 et XL1-blue d’E. coli permettent la production en
système bactérien des protéines recombinantes ;
− la souche TOP10 d’E. coli est une souche bactérienne employée avec le
système de clonage GatewayTM.
Les caractéristiques de ces quatre souches sont données dans le tableau 6.
2. Agrobacterium tumefaciens
La souche C58pMP90 d’A. tumefaciens permet de transformer efficacement les
cellules végétales. Elle est utilisée pour l’étude de la localisation subcellulaire par expression
transitoire d’un gène et la transformation stable du tabac. Les caractéristiques de cette souche
sont données dans le tableau 7.
C. Plasmides
1. Plasmide de séquençage, multiplication et conservation des gènes

Le plasmide pGEMT-easy (Promega) est utilisé pour le séquençage, la multiplication
et la conservation des gènes et fragments de gènes isolés tout au long de l’étude (Fig. 17). Le
clonage des gènes se fait au niveau d’un site multiple de clonage situé à l’intérieur du gène
lacZ, codant pour la β-galactosidase : ceci permet donc une sélection blanc-bleu des clones
ayant intégré l’insert.
2. Plasmides d’expression bactérienne

Différents plasmides d’expression bactérienne sont employés :
− Le vecteur pGEX-KG (Guan et Dixon, 1991) est une forme modifiée du
pGEX-2T ; il nous a été fourni par P. Hugueney (laboratoire RDP, ENS
A B
Figure 16 : Deux espèces de tabac utilisées aucours de l’étude : Nicotiana tabacum SR1
cv ‘Petit Havana’ (A) et Nicotiana sylvestris (B). (photographies : A, site internet du UW-
Madison Botanical Garden ; B, http://zfan.hp.infoseek.co.jp/present/nicotiana_sylvestris.jpg)
Tableau 6 : Souches d'Escherichia coli

Souche Génotype Résistance aux antibiotiques
kanamycine (résistance acquise
DH5α supE44 ∆lacU169 (φ 80 lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 au laboratoire )
thi-1 relA1
TOP10 F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15∆ lacX74 recA1 streptomycine

ara∆139 ∆ (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
XL1-blue ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdsSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 tétracycline

MRF’ recA1 gyrA96 relA1 lac [F’ proAB lac1qZ∆M15 Tn10 (Tetr)]
M15 NaIS, StrS, RifS, Thi–, Lac–, Ara+, Gal+, Mtl–, F–, RecA+, ampicilline
Uvr+, Lon+
Tableau 7 : Souche d'Agrobacterium tumefaciens

Souche Plasmide Résistance aux antibiotiques
C58 pMP90 (Koncz et Schell, 1986) rifampicine, gentamicine
pGEM-T Easy
Figure 17 : Carte du vecteur de clonage pGEMT-easy (Promega)
Lyon). Ce vecteur permet une fusion de la protéine d’intérêt avec la glutathion-S-transférase
en position N-terminale de la chaîne polypeptidique. Le gène est inséré au niveau des sites de
restriction BamHI/SstI (Fig. 18).
− Les vecteurs pQE appartiennent au système QIAexpress de la firme
QIAGEN. Le vecteur pQE30 permet la production de la protéine
d’intérêt avec une étiquette poly-histidine en position N-terminale et le
vecteur pQE70 permet la production de la protéine d’intérêt avec une
étiquette poly-histidine en position C-terminale. Le gène est introduit
dans le vecteur pQE30 au niveau des sites de restriction BamHI/SalI et
dans le vecteur pQE70 au niveau des sites de restriction SphI/BamHI
(Fig. 18).
3. Plasmides pour l’expression dans les cellules végétales

a. Transformation transitoire
Deux vecteurs sont utilisés pour étudier l’expression transitoire d’un gène dans les
cellules végétales :
− Le vecteur pCKgfpS65T (Reichel et al., 1996), fourni par P. Hugueney
(laboratoire RDP, ENS Lyon), permet l’expression d’un gène cloné au
niveau du site de restriction NcoI, sous le contrôle d’un promoteur
double CaMV35S (Fig. 19). Alternativement, des sites BspHI,
compatibles, sont générés aux extrémités 3’ pour les fragments
possédant des sites NcoI internes. La protéine produite est fusionnée à
la GFP (Green Fluorescent Protein) en position C-terminale. La GFP
fluoresce en vert lorsqu’elle est excitée par une longueur d’onde de 488
nm. Ce vecteur permet l’étude de la localisation subcellulaire par
expression transitoire d’un gène après transformation des cellules
végétales par biolistique.
− Le vecteur GatewayTM, pK7FGW2, produit par le laboratoire ‘Plant
Systems Biology’ de l’université de Gent (Karimi et al., 2002 ; Fig.
19), permet également l’expression de protéines de fusion à la GFP, en
position C-terminale. Il a été utilisé pour l’étude de la localisation
subcellulaire par expression transitoire d’un gène après transformation
des cellules végétales par infiltration d’A. tumefaciens. Ce vecteur
pGEX-KG
pGEX KG (pGEX 2T modifié)
Thrombin Oligonucléotide synthétique
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Leu Asp Ser Met Gly Arg Leu Glu Leu Lys Leu Asn Ser
CTG CTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT TCC GGT GGT GGT GGT GGT GGA ATT CTA GAC TCC ATG GGT CGA CTC GAG CTC AAG CTT AAT TCA
BamHI SmaI EcoRI XbaI NcoI SalI XhoI HindIII
SacI
Figure 18 : Vecteurs de clonage utilisés pour la production dans des cellules d’E. coli
d'une protéine recombinante fusionnée à la Gluthation-S-Transférase (pGEX-KG) ou
possédant une étiquette poly-histidine en position N-terminale (pQE30) ou en position
C-terminale (pQE70)
S65T
pCKgfpS65T
Figure 19 : Vecteurs de clonage utilisés pour l'expression transitoire d'un gène fusionné
à la GFP en position C-terminale dans les cellules végétales soit par transformation par
biolistique (pCKgfpS65T ; Reichel et al., 1996), soit par infiltration d’A. tumefaciens
(pK7FWG2 ; Karimi et al., 2002).
nécessite l’introduction du gène d’intérêt dans un vecteur d’entrée, le
pENTR/D-TOPO (Invitrogen).
Des vecteurs portant des constructions témoins sont employés afin de déterminer, par
comparaison, la localisation subcellulaire des protéines produites par les gènes d’intérêt :
− Le vecteur TpGFP est formé à partir du vecteur pCKgfpS65T dans lequel
la GFP est fusionnée à la séquence d’adressage aux plastes de la
protéine RhRCD4, caroténoïde-dioxygénase de rose (Scalliet, 2003).
− Le vecteur 35S::GFP nous a été fourni par P. Hugueney (laboratoire
RDP, ENS Lyon). C’est un vecteur GatewayTM contenant la GFP sans
séquence d’adressage. Elle est donc adressée au cytoplasme des
cellules.
b. Transformation stable
Le vecteur GatewayTM, pK2GW7, produit par le laboratoire ‘Plant Systems Biology’
de l’université de Gent en Belgique (Karimi et al., 2002 ; Fig. 20), permet la surexpression
stable d’un gène d’intérêt dans les cellules végétales, sous le contrôle du promoteur simple
CaMV35S. Ce vecteur nécessite d’abord l’introduction du gène d’intérêt dans un vecteur
d’entrée, le pENTR/D-TOPO (Invitrogen).
Le vecteur GatewayTM 35S::GFP contenant la GFP sans peptide d’adressage, décrit
précédemment, est utilisé comme témoin de transformation afin de s’assurer que les
modifications observées sont bien la conséquence de l’introduction du gène d’intérêt.
II. Techniques d’analyse du parfum

A. Extraction par solvant
L’extraction consiste à piéger les molécules odorantes par un solvant organique. Elle
est réalisée dans des fioles en verre à bouchon à vis étanches. Un extrait est obtenu à partir de
1 g de pétales frais et de 2 mL de solvant constitué d’hexane additionné de camphre à une
concentration de 40 mg.L-1. Le camphre sert de standard interne, permettant
l’homogénéisation des analyses. Dans le cas où la quantité de matériel végétal est
insuffisante, le rapport 1 pour 2 est respecté. Après 2 h d’agitation à température ambiante,
Figure 20 : Vecteur GatewayTM pK2GW7 de clonage d'un gène pour son expression
stable dans les cellules végétales (Karimi et al., 2002).
l’extrait est récupéré et placé dans des fioles adaptées au passeur de l’analyseur, puis analysé
par chromatographie en phase gazeuse (CPG).
Cette technique est utilisée pour étudier :
− Les composés volatils produits par les différents organes de la fleur,
− l’évolution des composés volatils au cours du développement floral,
− et la répartition des composés volatils dans la fleur, dans le pétale et
dans les différents tissus du pétale.
B. Headspace dynamique
La technique de headspace ou technique de ‘capture d’effluves’ (Fig. 21) a pour but de
piéger les composés volatils émis pendant un temps défini par une fleur sur un polymère
solide comme le Tenax (ARS Inc.).
Les roses produisent et émettent les composés volatils suivant un cycle diurne
circadien dans lequel le maximum d’émission se situe au milieu de la phase de jour (Helsper
et al., 1998). Afin de limiter les fluctuations dues à ce rythme d’émission, les analyses sont
faites entre 10 et 13 h.
Les fleurs à différents stades de développement sont enfermées dans un sac de
polyéthylène téréphtalate (Nalophan) équipé d’une entrée et d’une sortie. Deux pompes à vide
sont utilisées pour purifier l’air injecté à travers le sac (cartouches de charcoal Orbo32,
Supelco). L’air purifié est aspiré avec un débit 140 mL.min-1 et poussé avec un débit de 120
mL.min-1 : on peut estimer que le système est parcouru par un flux d’air de 311 mL.min-1. A
la sortie, les composés volatils sont collectés pendant 1 h dans une cartouche de verre (75 x 4
mm) contenant 30 mg de Tenax. Les composés volatils sont élués par deux fois 500 µL
d’hexane, puis 5 µL de camphre à 4 mg.L-1 sont ajoutés. L’extrait est concentré au 1/10ème
sous courant d’air puis analysé par CPG.
Cette technique est employée pour étudier les composés volatils émis au cours du
développement floral.
C. Solid Phase Micro Extraction ou SPME

L’analyse des composés volatils du parfum peut aussi se faire par piégeage des
molécules sur une fibre par la technique de Solid Phase Microextraction ou SPME (Fig. 22).
Le pétale est placé sur un support rigide inodore. Une chambre de piégeage est délimitée à
l’aide d’un cône bleu de pipette qui permet d’analyser les composés volatils émis par une
Flux d’air 2
entrant 4 1
Flux d’air
3 4
sortant
Figure 21 : Technique de collecte des effluves par 'headspace' dynamique (schéma

d’après P. Hugueney). 1, filtre de charbon actif ; 2, chambre ; 3, piège (fibre de Tenax) ; 4,
pompes. La photographie représente le dispositif lors d’une expérimentation.
Seringue de SPME
Fibre de SPME
Chambre
(délimitée par un cône de pipette)
Pétale
Support rigide
Figure 22 : Technique de SPME adaptée à l'analyse des composé volatils émis par les 2
épidermes du pétale de rose.
surface de pétale de 44 mm2. La fibre de SPME, de 65 µm de diamètre (Supelco), est
composée d’un mélange de polydiméthylsiloxane et de divinylbenzène. Elle est introduite
dans la chambre par l’orifice du cône et le piégeage est réalisé pendant 1 h à température
ambiante. La désorption des composés volatils se fait dans la chambre d’injection de la CPG.
Pour cela, la fibre est placée pendant 2 min dans la chambre d’injection à une
température de 240°C.
Cette technique permet d’étudier les composés volatils émis par les deux épidermes du
pétale.
D. Analyse des composés volatils par Chromatographie en Phase Gazeuse

(CPG)
L’analyse GC-FID (Gas Chromatography-Flame Ionisation Detector) est réalisée au
moyen d’un chromatographe en phase gazeuse Agilent 6850, équipé d’un détecteur de
flamme par ionisation (FID). L’azote est utilisé comme gaz vecteur avec un débit de 1
mL.min-1. Une colonne capillaire Varian CPSil5CB (30 m x 0,32 mm) est employée dans les
conditions suivantes : 3 min à 40°C, suivies d’une incrémentation de 2°C.min-1 jusqu’à une
température de 160°C, elle-même suivie d’une incrémentation de température de 12°C.min-1
jusqu’à 240°C. La température est ensuite maintenue pendant 2 min à 240°C. Deux µL
d’extrait sont injectés sur la colonne, selon le mode ‘split’ avec un rapport 10 : 1.
E. Identification des composés

Les composés volatils sont identifiés en comparant leurs temps de rétention avec les
temps de rétention de composés authentiques. Les composés suivants ont été employés : 2-
phényléthanol, géraniol, nérol, citronellol, β-caryophyllène et cis-3-hexénol fournis par la
firme Payan-Bertrand , 3,5-diméthoxytoluène ou DMT, fourni par P. Hugueney (RDP, ENS
Lyon), germacrène D (R.C. Treatt & Co. Ltd) et trans-2-hexénal (Aldrich). Le camphre est
utilisé comme étalon interne de façon à ramener chaque surface de pic en mg équivalent de
camphre. Un ratio de un est postulé (Picone et al., 2004).
Parallèlement, des analyses sont réalisées sur un chromatographe en phase gazeuse
couplé à un spectromètre de masse Agilent 6890. Les bases de données de spectres de masse
CNRS, Wiley 275 et Wist 98 sont employées pour l’identification des composés. Les
conditions de GC décrites précédemment sont maintenues. Les paramètres d’analyse sont les
suivants : voltage ionisant 70eV ; taux de balayage de masse 2,94/s pour 50-550 m/z. Ces
analyses par spectrométrie de masse ont été faites par M. Martin du laboratoire ‘Génome et
Evolution des Plantes Supérieures’ de l’Université Claude Bernard Lyon 1.
III. Techniques cytologiques

A. Microscopie optique et microscopie électronique à transmission
1. Fixation et inclusion
Des pétales de différentes variétés de roses sont prélevés sur des fleurs à différents
stades de développement, puis fixés dans les conditions suivantes : glutaraldéhyde 1,5 %
pendant 4 à 5 h à température ambiante suivi d’un rinçage au tampon cacodylate 0,1M (15
min à température ambiante, une nuit à 4°C et 1 h à température ambiante) et d’un rinçage à
l’eau pendant 5 min à température ambiante. Les échantillons sont ensuite post-fixés au
tétroxyde d’osmium (1 % dans l’eau) pendant 1 h à température ambiante. Après lavage, ils
sont déshydratés par passage dans des solutions d’éthanol de 50 % à 100 %.
L’inclusion est réalisée dans la résine Spurr suivant les instructions fournies par le kit
d’inclusion ‘Spurr resin embedding kit’ (Taab, Chemicals & Equipment for microscopy).
2. Coupes, colorations et observations

Pour la microscopie optique, des coupes semi-fines de 1 µm d’épaisseur sont réalisées
grâce à un ultramicrotome RMC MT 6000, placées sur des lames de verre puis colorées au
Paragon (mélange de fushine basique et de bleu de toluidine dans l'éthanol à 30 %). Les
observations sont faites à l’aide d’un microscope Leitz DMRB (Leika).
Pour la microscopie électronique à transmission (MET), des coupes ultra-fines (70 à
80 nm) sont réalisées grâce à un ultramicrotome RMC MT 6000, déposées sur des grilles de
200 mesh, recouvertes de formvar. Elles sont ensuite contrastées suivant un protocole
conventionnel de contraste à l’acétate d’uranyle, suivi d’une deuxième étape de contraste au
citrate de plomb (Reynolds, 1963). Les observations sont faites à l’aide d’un microscope
électronique à transmission Hitachi H-800, sous une tension de 75 kVolts.
B. Microscopie électronique à balayage environnementale et microscopie
confocale
Pour la microscopie électronique environnementale à balayage, des morceaux de
pétale sont découpés et directement collés sur un support. Ce support est ensuite placé dans la
chambre à pression contrôlée d’un microscope Hitachi S-3000N. Les échantillons sont
maintenus à une température comprise entre +4°C et -20°C grâce à l’effet Pelletier. Une
pression de 110 Pa et une tension de 15 kV sont appliquées pour les observations.
Pour les études de localisation subcellulaire, les zones des échantillons, transformées
de façon transitoire, sont prélevées à l’aide d’un scalpel et placées entre lame et lamelle dans
une goutte d’eau. Les observations sont effectuées à l’aide d’un microscope à balayage
confocal droit Zeiss Axioplan 2 équipé du système confocal LSM 510 (plate-forme PLATIM,
INSERM-ENS Lyon). La GFP est excitée par une longueur d'onde de 488 nm émise par un
laser Argon/krypton. Un filtre d’émission BP 505-550 nm est utilisé. Les observations se font
soit à l’aide d’un objectif Plan-Neofluar 10 x0,3 Ph1, soit à l’aide d’un objectif à immersion à
eau de type C-Apochromat 40x/1,2 W. Les images et empilements obtenus sont enregistrés,
analysés et annotés grâce au logiciel LSM5 Image Browser (Zeiss).
C. Mise en évidence des lipides et des terpènes sur matériel non fixé
La coloration par le réactif de NADI a été mise au point par David et Carde (1964).
Elle permet de différencier des structures lipidiques ne contenant pas de terpènes (coloration
bleue) et des structures lipidiques contenant des terpènes (coloration violette). Le réactif de
NADI est un mélange d’une solution alcoolique d’α-naphtol 1 % (m/v dans éthanol 40 %) et
d’une solution aqueuse de N-N-diméthyl-p-phénylènediamine-dihydrochloride 1 % (m/v)
dans un tampon phosphate 50 mM pH 7,2 (0,5/0,5/49 ; v/v/v).
Des coupes sont faites à main levée sur des pétales frais, puis placées dans le réactif de
NADI pendant 30 min à l’obscurité. L’observation se fait en microscopie optique après avoir
monté les coupes entre lame et lamelle. Les terpènes sont visualisés par leur coloration
violette.
IV. Techniques de dosage de l’amidon et du D-glucose
A. Principe du dosage
Pour réaliser ces dosages, les instructions fournies avec le kit de dosage de l’amidon
de Boehringer Mannheim/R-Biopharm ont été suivies. La détermination de la quantité
d’amidon présente dans les pétales repose sur une réaction enzymatique qui permet de
produire une molécule de NADPH par molécule de D-glucose libéré de l’amidon.
L’amidon est hydrolysé en D-glucose en présence d’amyloglucosidase à pH 4,6. Le D-
glucose est phosphorylé en D-glucose-6-phosphate par l’hexokinase, en présence d’ATP, à pH
7,6. Cette phosphorylation s’accompagne de la formation d’ADP. Le D-glucose-6-phosphate
est ensuite oxydé en gluconate-6-phosphate par la Glucose 6P-déshydrogénase en présence de
NADP+, avec formation de NADPH et H+. Pour chaque molécule de D-glucose formé par
l’hydrolyse de l’amidon, il se forme une molécule de NADPH. La quantité de NADPH est
déterminée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 340 nm.
B. Détermination des quantités d’amidon et de D-glucose libre

L’amidon contenu dans les pétales est solubilisé en présence de diméthylsulfoxyde
(DMSO) et d’acide chlorhydrique (HCl). Brièvement, 1 g de pétale est prélevé, réduit en
poudre dans l’azote liquide puis introduit dans une fiole à bouchon contenant 20 mL de
DMSO et 5 mL d’HCl 8M. La fiole est placée pendant 30 min à 1 h dans un four à 60°C et
agitée doucement et régulièrement. La fiole est ensuite refroidie rapidement sous l’eau
courante et 40 ml d’eau ultrapure sont ajoutés. Le pH de la solution est ajusté à une valeur de
4 avec une solution de NaOH 5M. Le volume est enfin ajusté à 100 mL avec de l’eau
ultrapure. La solution doit décanter quelques min afin que les débris cellulaires se déposent au
fond de la fiole.
Le dosage de l’amidon se fait selon les conditions décrites par le protocole fourni avec
le kit. Brièvement, 200 µL de tampon citrate pH 4,6 contenant de l'amyloglucosidase à 14
U.mL-1 sont ajoutés à 100 µL d'échantillon à doser. Après une incubation de 15 min à 60 °C,
1 mL d'eau distillée et 1 mL de tampon triéthanolamine pH 7,6 contenant du NADP (3
mg.mL-1), de l'ATP (7 ml.mL-1) et du sulfate de magnésium sont ajoutés. Après 3 min
d'incubation, une première mesure de DO à 240 nm est effectuée. Vingt µL de suspension
enzymatique contenant l'hexokinase (0,3 U.µL-1) et la glucose-6-phosphate déshydrogénase
(0,1 U.µL-1) sont ajoutés. Après 15 min d'incubation, la D.O. est mesurée une deuxième fois.
La concentration en amidon se calcule en appliquant la formule suivante :
camidon = [(V x MMa)/(ε x d x v x 1000)] x ∆Aamidon,
avec V, volume final de la réaction (2,32 mL) ; v , volume d’échantillon (0,1 mL) ;
MMa, masse moléculaire de l’amidon (162,1) ; d, distance de la cuve (1 cm) ; ε, coefficient
d’extinction du NADPH pour une DO de 340 nm (6,31 mmol-1.cm-1) et ∆Aamidon, [A2-
A1]échantillon – [A2-A1]blanc échantillon.
V. Techniques de biologie moléculaire

A. Extraction d’acides nucléiques
1. Extraction d’ARN totaux à partir de matériel végétal

L’extraction des ARN totaux de rose est réalisée sur différents tissus, des pétales
prélevés à différents stades de développement, des feuilles matures, des sépales, des étamines
et des pistils (styles et stigmates). Le protocole utilisé est adapté de celui de Cock et al.
(1997).
Le matériel végétal (1 g) est broyé dans l’azote liquide, transféré dans un tube Falcon
de 15 mL dans lequel sont ajoutés 5 mL de tampon d’extraction (Tris HCl 0,2 M pH 9 ; KCl 4
M ; glucose 0,2 M ; MgCl2 35 mM ; EDTA 25 mM) et 5 mL de phénol/chloroforme/alcool
isoamylique (25/24/1 ; v/v/v). Les tubes sont agités 1 min puis centrifugés 4 min à 2000 g à
4°C. Une nouvelle phase d’extraction au phénol/chloroforme/alcool isoamylique est réalisée
sur le surnageant dans les mêmes conditions. Le surnageant est ensuite réparti dans des tubes
Eppendorf de 2 mL par fraction de 800 µL et 800 µL de phénol/chloroforme/alcool
isoamylique sont ajoutés ; les tubes sont mélangés pendant 2 min avant d’être centrifugés 5
min à 20000 g à 4°C. Le surnageant est récupéré et une première précipitation des ARN est
réalisée à -80°C pendant 15 min après ajout de 50 µL d’acide acétique 1 M et de 400 µL
d’éthanol 100 %. Après une centrifugation de 30 min à 22000 g à 4°C, le culot est repris dans
de l’acétate de sodium 3 M pH 6,3, centrifugé 5 min à 22000 g à 4°C puis repris par 50 µL de
tampon d’extraction. Toutes les fractions sont regroupées dans un seul tube et 600 µL de
phénol/chloroforme/alcool isoamylique sont ajoutés. Le tube est agité pendant 2 min avant
d’être centrifugé 5 min à 22000 g à 4°C. Le surnageant est récupéré et une deuxième
précipitation des ARN est réalisée pendant 15 min à -80°C en ajoutant 60 µL d’acide acétique
1M et 900 µL d’éthanol 100 %. Après une centrifugation de 30 min à 22000 g à 4°C, le culot
est lavé par de l’éthanol 70 % puis de l’éthanol 100 %, séché à l’air libre puis repris par 30 µL
d’eau Versol (Laboratoire Aguettant) dépourvue d’activité RNAse. Deux fractions aliquotes
sont prélevées de façon à estimer d’une part la concentration en ARN totaux par
spectrophotométrie (DO 260 nm) et d’autre part la qualité des ARN par migration sur un gel à
1,3 % d’agarose, coloré au bromure d’éthidium.
2. Extraction d’ARN messagers de feuilles de Nicotiana sylvestris

Les ARNm de feuilles matures de N. sylvestris sont extraits avec le kit de purification
d'ARNm 'SV total RNA isolation' (Promega). Les ADNc sont ensuite obtenus par une
réaction de réverse transcription, suivant les indications décrites au § B.2.
3. Extraction d’ADN génomique de tabac

L'ADN génomique des tabacs régénérés après transformation par A. tumefaciens est
extrait selon la technique d'Edwards et al. (1991).
Un disque foliaire de tabac est prélevé à l'emporte-pièce à l'aide d'un tube Eppendorf.
Le tissu est réduit en pâte à l'aide d'un pilon, puis 400 µL de tampon d'extraction (Tris HCl
200 mM pH 8 ; EDTA 25 mM ; NaCl 250 mM, SDS 0,5 %) sont ajoutés. Après une
centrifugation de 2 min à 20000 g à température ambiante, une extraction par 400 µL de
phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1 ; v/v/v) est réalisée sur le surnageant. Après
une centrifugation de 2 min à 20000 g à température ambiante, l'ADN génomique est
précipité pendant 2 min à température ambiante après avoir ajouté 300 µL d'isopropanol à 300
µL de surnageant. Après une centrifugation de 5 min à 20000 g à température ambiante, le
culot d'ADN génomique est lavé et séché par 100 µL d'éthanol 70 % et d’éthanol 100 %. Le
culot est ensuite repris dans 50 µL de tampon TE (Tris HCl 10 mM pH 8 ; EDTA 5 mM).
4. Mini et maxipréparation d’ADN plasmidique

a. Minipréparation et maxipréparation d’ADN plasmidique d’E. coli
Les minipréparations d’ADN plasmidique sont réalisées à partir de 2 mL de culture
bactérienne suivant le protocole de lyse alcaline décrit par Sambrook et al. (1989).
Les maxipréparations d’ADN plasmidique sont réalisées à partir de 25 à 50 mL de
culture bactérienne suivant le protocole de lyse alcaline décrit par Ish-Horowicz et Burke
(1981).
b. Maxipréparation d’ADN plasmidique d’A. tumefaciens
1,5 mL de milieu LB contenant les antibiotiques adéquats sont ensemencés avec une
colonie isolée d’A. tumefaciens. Une pré-culture est ainsi réalisée pendant 48 h à 27°C sous
faible agitation. La pré-culture est ensuite transférée dans 50 mL de milieu LB contenant les
antibiotiques adéquats. Après 24 à 36 h à 27°C sous faible agitation, la culture est centrifugée
5 min à 2000 g. Le culot bactérien est repris par 10 mL de tampon TESS (Tris HCl 10 mM
pH 8 ; EDTA 1 mM ; NaCl 0,5 M ; sarkosyl 5 %) et de nouveau centrifugé 5 min à 2000 g.
Le culot est repris dans 10 ml de tampon TEG (Tris HCl 25 mM pH 8 ; glucose 50 mM ;
EDTA 10 mM) additionné de lysozyme (2 mg.mL-1). L’ensemble est placé pendant 20 min
dans la glace. La lyse alcaline est réalisée en ajoutant 20 mL d’une solution de NaOH 0,2 M
et SDS 10 %. Après avoir mélangé le tube par inversion, il est placé dans la glace pendant 10
à 20 min. Quinze mL d’acétate de sodium 3 M pH 4,8 sont ajoutés et l’ensemble est à
nouveau incubé dans la glace pendant 20 min. Après une centrifugation de 20 min à 4°C à
2000 g, le surnageant est récupéré et précipité par 90 mL d’éthanol 100 % froid pendant 20
min à -20°C. L’ADN plasmidique est centrifugé pendant 20 min à 4°C et repris par 1 mL
d’eau, auquel sont ajoutés 50 µg de RNAse. Après une incubation de 30 min à 37°C, des
étapes de purification au phénol, puis au phénol/chloroforme et enfin au chloroforme sont
réalisées. L’ADN est alors précipité par 1/10 du volume d’acétate de sodium 0,3 M et 2
volumes d’éthanol 100 % pendant au moins 30 min à -20°C. Après une centrifugation de 20
min à 10000 g à 4°C, le culot est lavé par de l’éthanol 70 %, séché et repris dans 50 µL de
tampon TE (Tris HCl 10 mM pH 8 ; EDTA 1 mM).
B. Obtention d’ADN complémentaire
1. Traitement à la DNAse I
Cinquante microgrammes d’ARN totaux sont traités à la DNAse I (Promega) pendant
30 min à 37°C, selon les conditions définies par le protocole du fournisseur. La DNAse I est
ensuite éliminée par une étape de purification au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/
/24/1 ; v/v/v). Les ARN totaux sont concentrés par précipitation à -80°C pendant 30 min après
ajout d’acide acétique 1 M et d’éthanol 100 %. Après une centrifugation de 30 min à 22000 g
à 4°C, le culot est lavé à l’éthanol 70 % et à l’éthanol 100 %, séché à l’air libre et repris par
15 µL d’eau Versol (laboratoire Aguettant). Les ARN sont analysés sur un gel à 1,3 %
d’agarose coloré au bromure d’éthidium et dosés par spectrophotométrie.
2. Réaction de réverse-transcription
Cinq microgrammes de chaque préparation d’ARN traitée à la DNAse I sont soumis à
la réaction de réverse transcription (RT). Cinq µg d’ARN sont dilués dans un volume final de
10 µL puis dénaturés 5 min à 65°C dans un bloc chauffant. Cette étape permet d’éliminer les
structures secondaires des ARN messagers qui pourraient gêner la RT. Neuf µL de mélange
réactionnel sont alors ajoutés (4 µL de tampon 10X (Invitrogen), 1 µl de RNAse inhibiteur
(Promega) à 40 U.µL-1, 2 µL de DTT 0,1 M, 1 µL de dNTP 10 mM et 1 µL d’amorces polyT
à 500 µg.mL-1). Le mélange est ensuite incubé 5 min à température ambiante pour permettre
l’accrochage des amorces polyT sur les ARN. 1 µL de réverse-transcriptase (Invitrogen) à 200
U.µL-1 est ajouté au mélange qui est ensuite incubé 1 h à 42°C. L’enzyme est inactivée par
une incubation de 5 min à 95°C.
3. Vérification de la qualité des ADN complémentaires

Afin de vérifier la qualité des ADNc obtenus, une PCR est réalisée sur les ADNc
dilués avec des amorces, fournies par P. Hugueney (RDP, ENS Lyon), permettant d’amplifier
un fragment du gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, ou GAPDH
(annexe 1). Ce gène a été isolé chez la rose Rosa chinensis ‘Old Blush’, à partir d’une banque
d’ESTs (Channelière et al., 2002).
Le mélange PCR est composé de 2 µL de tampon 10X de la Taq polymérase
(Promega), 2 µL de dNTP 1 mM, 2 µL d’amorce sens 10 µM, 2 µL d’amorce antisens 10 µM,
0,2 µL de Taq polymérase (Promega) et de 2 µL d’ADNc dilué ; le volume est ajusté à 20 µL
avec de l’eau Versol. Après 30 cycles d’amplification, les produits PCR sont déposés sur un
gel à 1 % d’agarose, coloré au bromure d’éthidium.
C. Construction de la banque d’ADNc double brin pour la RACE-PCR
1. Purification des ARN messagers

Les ARN messagers de pétales sont purifiés à partir des ARN totaux suivant les
instructions du kit ‘Straight A’s mRNA Isolation System Kit’ (Novagen).
Brièvement, le principe repose sur l’utilisation de billes magnétiques sur lesquelles des
amorces oligodT sont fixées. Les ARNm, porteurs d’une queue polyA à leur extrémité 3’, se
fixent sur ces billes au niveau des amorces oligodT. Après plusieurs lavages, les ARNm sont
récupérés par une élution à 65°C dans 2 fois 150 µL d’eau Versol (laboratoire Aguettant). Les
ARNm sont précipités une nuit à -80°C après ajout de 1,2 µL de glycogène, 30 µL d’acétate
de sodium 3 M pH 6,3 et 900 µL d’éthanol 100 %. Après une centrifugation de 30 min à
22000 g à 4°C, le culot est lavé par de l’éthanol 70 % et de l’éthanol 100 %, séché à l’air libre
puis repris dans 10 µL d’eau Versol.
2. Obtention de la banque d’ADNc double brin

Pour obtenir la banque d’ADNc double brin nécessaire pour les expériences de RACE-
PCR, le kit ‘Marathon’ (Clontech) est utilisé suivant les instructions du fournisseur.
Brièvement, les ARNm de Rosa x hybrida ‘Rouge Meilland’ sont purifiés à partir
d’ARN totaux extraits de pétales prélevés sur des fleurs au stade ‘bouton ouvert’. Le premier
brin d’ADNc est synthétisé par l’AMV réverse transcriptase en présence d’amorces oligodT.
L’ARN est dégradé et parallèlement le deuxième brin d’ADNc est obtenu grâce à un mélange
d’ADN polymérase I, de RNAse H et d’ADN ligase d’E. coli. L’enzyme T4 ADN polymérase
permet ensuite d’obtenir un ADNc double brin aux extrémités franches. Des adaptateurs de
séquence connue sont ligués aux ADNc double brin grâce à la T4 DNA ligase. Ce mélange
d’ADNc est ensuite dilué aux 1/50 et 1/250 pour être utilisé dans les réactions de RACE-PCR.
D. Techniques d’amplification d’ADN par PCR

Les séquences des oligonucléotides utilisés pour les amplifications PCR sont données
dans l’annexe 1.
1. Amplification par oligonucléotides dégénérés

La recherche de deux gènes impliqués dans la voie de synthèse des monoterpènes est
réalisée suivant une stratégie PCR basée sur des homologies de séquences. Ainsi, pour les
deux gènes, DXR et GPPS, des séquences connues chez d’autres espèces sont recherchées
dans les bases de données et alignées de façon à définir des oligonucléotides dégénérés dans
les zones les plus conservées.
Le mélange d’amplification PCR est composé de 2 µL de tampon de réaction (Tris
HCl 100 mM pH 9, KCl 500 mM, Triton X-100, MgCl2 15 mM), 2 µL de dNTP 1 mM, 2 µL
d’amorce sens 10 µM, 2 µL d’amorce antisens 10 µM, 0,2 µL de Taq-polymérase (Promega)
et 2 µL de matrice (ADNc dilué) ; le volume est ajusté à 20 µL avec de l’eau ultrapure.
La réaction PCR est faite dans les conditions suivantes : 95°C, 5 min ; 45 cycles de
[95°C, 30 sec – 45°C, 30 sec – 72°C, 1 min] ; 72°C, 7 min. Le produit d’amplification est
déposé sur un gel d’agarose 1 % contenant du bromure d’éthidium.
Pour l’obtention de la DXR et de la GPPS de rose, la matrice est de l’ADNc obtenu à
partir d’ARNm de pétales de la rose ‘Rouge Meilland’ prélevée au stade ‘bouton juste ouvert’
et de la rose ‘The MacCartney rose’ prélevée au stade ‘bouton ouvert’. Pour l’isolement de la
DXR de N. sylvestris, des ADNc de feuilles matures sont utilisés.
2. RACE-PCR
L’obtention des extrémités 5’ et 3’ des gènes se fait par une succession de deux PCR
en utilisant comme matrice la banque d’ADNc obtenue avec le kit ‘Marathon’. Lors de la
première PCR, un oligonucléotide (AP1 fourni avec le kit) reconnaissant l’adaptateur est
associé à un oligonucléotide spécifique du gène. La deuxième PCR est réalisée avec des
oligonucléotides plus internes dans la séquence de l’adaptateur (oligonucléotide AP2) et dans
la séquence du gène. Le mélange PCR est composé de 5 µL de tampon de réaction (Tricine-
KOH 400 mM pH 8.7 ; KOAc 150 mM ; Mg(OAc)2 35 mM ; SAB (sérum albumine bovine)
37,5 µg.mL-1 ; Tween 20 0,05 % ; Nonidet-P40 0,05 %), 1 µL de dNTP 10 mM, 1 µL
d’amorce AP1 ou AP2 10 µM, 1 µL d’amorce gène spécifique (1 ou 2), 1 µl de Taq
Advantage 2 (Clontech) et 1 µl de matrice (banque d’ADNc) diluée au 1/100 ; le volume est
ajusté à 50 µL avec de l’eau ultrapure.
La réaction d’amplification est faite dans les conditions suivantes : 95°C, 5 min ; 5
cycles de [95°C, 30 sec – 72°C, 2 min 30] ; 5 cycles de [95°C, 30 sec – 70°C, 2 min 30] ; 25
cycles de [95°C, 30 sec – 68°C, 2 min 30]. Une fraction aliquote des produits PCR est
déposée sur gel d’agarose 1 % contenant du bromure d’éthidium.
3. PCR « fidèles » en vue de l’obtention de séquences entières des gènes

Ce type de PCR est utilisé pour d’une part obtenir le gène dans sa totalité après avoir
défini avec des logiciels d’analyse (BioEdit ou DNAstar) une séquence virtuelle
correspondant aux gènes entiers, et d’autre part obtenir les séquences des gènes utilisées pour
l’expression de protéines recombinantes dans des systèmes bactériens ou dans les cellules
végétales de façon transitoire ou stable.
Ces PCR sont réalisées avec la polymérase hautement fidèle Pfu HotStart Turbo-
polymerase (Stratagène). Le mélange PCR est composé de 2 µL de tampon de réaction (Tris
HCl 200 mM pH 8,8 ; MgSO4 20 mM ; KCl 100 mM ; (NH4)2SO4 100 mM ; Triton X-100
1% ; SAB 1 mg.mL-1), 2 µL de dNTP 1 mM, 2 µL d’amorce sens 10 µM, 2 µL d’amorce

antisens 10 µM, 0,2 µL de polymérase et 2 µL de matrice ; le volume est ajusté à 20 µL avec
de l’eau ultrapure.
L’amplification est faite pendant 30 cycles de PCR avec des paramètres ajustés en
fonction des oligonucléotides utilisés et de la taille du fragment à amplifier (1 min pour
chaque 1000 pb). Une fraction aliquote des produits PCR est déposée sur gel d’agarose 1 %
contenant du bromure d’éthidium.
4. RT-PCR semi-quantitative
Les réactions de RT-PCR semi-quantitatives nécessitent une normalisation de tous les
échantillons. Le gène GAPDH s’exprime à un niveau équivalent quel que soit le tissu ou le
stade de développement considéré (Channelière et al., 2002). Il a donc été choisi pour
normaliser tous les échantillons.
Le mélange PCR se compose de 2 µL de tampon de réaction de Taq-polymérase (déjà
décrit), 2 µL de dNTP 1 mM, 2 µL d’amorce sens 10 µM, 2 µL d’amorce antisens 10 µM, 0,2
µl Taq-polymérase (Promega) et 2 µL de matrice ; le volume est ajusté à 20 µL avec de l’eau
ultrapure.
La réaction PCR est faite dans les conditions suivantes : 95°C, 5 min ; 25/30 cycles de
[95°C, 30 sec – 55°C, 30 sec – 72°C, 1 min] ; 72°C, 7 min. Le produit d’amplification est
déposé sur un gel d’agarose 1 % contenant du bromure d’éthidium et l’intensité de chaque
signal est estimée visuellement. Différentes dilutions des échantillons d’ADNc sont utilisées
jusqu’à avoir des signaux d’intensité identique pour tous les échantillons utilisés.
Parallèlement, des oligonucléotides sont définis à partir des séquences des gènes isolés afin
d’amplifier une fraction du gène. Une PCR est réalisée dans les mêmes conditions sur les
échantillons normalisés.
5. Hybridation des membranes de RT-PCR semi-quantitative

Les produits d’amplification des expériences de RT-PCR semi-quantitative sont
déposés sur un gel d’agarose à 1 % contenant du bromure d’éthidium, puis transférés en
présence de soude (16 g.L-1) sur une membrane de nylon Hybond N+ pendant une nuit. Les
membranes sont ensuite hybridées une nuit à 65°C avec les sondes correspondant au gène
recherché (RhDXR, RhGPPS ou GAPDH), marquées au [α-32P]-dCTP. Elles sont ensuite
exposées sur un écran Phosphoimager afin de quantifier la radioactivité avant d’être exposées
sur un film autoradiographique (Kodak Biomax MS). Le nombre de coups radioactifs obtenu

pour chaque sonde (RhDXR ou RhGPPS) est rapporté à celui obtenu pour la sonde GAPDH
afin d’affiner la normalisation des échantillons.
6. PCR sur ADN génomique de N. sylvestris

Le mélange PCR se compose de 2 µL de tampon de réaction de Taq-polymérase
(Promega), 2 µL de dNTP 1 mM, 2 µL d’amorce sens 10 µM, 2 µL d’amorce antisens 10 µM,
0,2 µl Taq-polymérase (Promega) et 5 µL d’ADN génomique ; le volume est ajusté à 20 µL
avec de l’eau ultrapure.
La réaction PCR est faite dans les conditions suivantes : 95°C, 5 min ; 30 cycles de
[95°C, 30 sec – 55°C, 1 min – 72°C, 1 min] ; 72°C, 7 min. Le produit d’amplification est
déposé sur un gel d’agarose 1 % contenant du bromure d’éthidium.
E. Techniques de clonage
1. Purification sur gel des fragments PCR

Les produits d’amplification sont déposés sur un gel d’agarose 1 % puis purifiés
suivant les instructions du kit de purification sur gel ‘QIAquick Gel extraction kit’
(QIAGEN). Brièvement, le fragment d’ADN est excisé du gel d’agarose à l’aide d’un scalpel,
placé dans un tube Eppendorf et pesé. Pour chaque 100 mg de gel, 100 µL de tampon QG
(fourni avec le kit) sont ajoutés. Le tube est incubé 10 min à 50°C. Après dissolution du gel,
le mélange est transféré sur une colonne et centrifugé 1 min à 13000 g. La colonne est lavée
avec 750 µL de tampon PE (fourni avec le kit) et centrifugée 2 fois 1 min à 13000 g. Le
fragment d’ADN est élué par 50 µL de tampon Tris HCl 10 mM pH 8,5 avec une
centrifugation de 1 min à 13000 g.
2. Clonage de fragments dans le vecteur pGEMT-easy

Le clonage de fragments d’ADN dans le vecteur pGEMT-easy est utilisé pour
séquencer, multiplier et conserver tous les fragments d’ADN.
La ligation dans le vecteur pGEMT-easy peut se faire une nuit à 4°C ou 2 h à
température ambiante. Afin de s’assurer d’une bonne efficacité de la ligation, l’insert est
concentré en respectant un rapport insert /vecteur de 3 : 1, en accord avec les instructions du
kit (Promega). Le mélange de ligation est composé de 2,5 µL de tampon ligase 2X, 0,5µL de
vecteur, 0,5 µL de T4-DNA ligase à 3 U.µL-1 et de 1,5 µL d’insert.

La polymérase hautement fidèle (Pfu HotStart Turbo-polymerase, Stratagène) ne
présente pas d’activité de polyadénylation. Pour sous-cloner un fragment amplifié avec ce
type de polymérase, il est nécessaire d’ajouter des groupements adénosine aux extrémités du
fragment amplifié.
A 7 µL de produit PCR purifié, sont ajoutés 1 µL de Taq-polymérase (Promega), 1 µL
de dATP 10 mM et 1 µL de tampon de réaction de l'enzyme Taq-polymérase. L’ensemble est
placé 15 à 30 min à 72°C. La même réaction peut être réalisée directement sur les 20 µL de
réaction PCR. Dans tous les cas, une purification des produits PCR est nécessaire afin
d’éliminer les dATP non incorporés.
L’introduction des plasmides dans la souche DH5α est réalisée grâce à un choc
thermique (42°C pendant 60 sec suivi d'un passage dans un bain de glace ; Sambrook et al.,
1989).
3. Sous-clonage dans les vecteurs d’expression bactérienne

Les fragments d’ADN à sous-cloner dans des vecteurs d’expression sont amplifiés par
PCR avec des amorces dont la séquence contient les sites de restriction nécessaires. Après
amplification, ils sont dans un premier temps clonés dans le vecteur pGEMT-easy (Promega)
dans les conditions déjà décrites. Après vérification de la séquence, le plasmide est multiplié,
purifié et l’insert est isolé par digestion.
Parallèlement, le vecteur d’expression bactérienne est également multiplié et digéré
par les enzymes adéquates.
L’insert est ensuite ligué au vecteur grâce à l’action de la T4-DNA ligase (Promega).
Les rapports insert/vecteur, ainsi que le mélange de réaction sont les mêmes que ceux utilisés
lors de la ligation d’un insert dans le vecteur pGEMT-easy. Les plasmides sont ensuite
introduits dans les souches DH5α et M15 par choc thermique.
4. Sous-clonage par recombinaison avec le système GATEWAYTM

L’introduction d’un gène dans un vecteur GatewayTM nécessite l’obtention d’un
vecteur d’entrée pENTR/D-TOPO contenant le gène d’intérêt. La réaction se fait grâce à la
topoisomérase I, extraite de Vaccinia virus. Son rôle biologique est de couper et de religuer
l'ADN pendant la réplication. Elle reconnaît spécifiquement la séquence pentamérique 5´-
(C/T)CCTT-3´ et forme une liaison covalente avec le phosphate de la thymidine en 3'. Elle
coupe un des deux brins d'ADN, assurant le déroulement de l'hélice d'ADN, puis associe les

extrémités du brin coupé. Pour exploiter l'activité de ligation de la topoisomérase I, le vecteur
pENTR-D/TOPO est linéarisé et la topoisomérase est fixée de façon covalente sur les
extrémités 3' des deux brins d'ADN. Elle permet aux vecteurs de se refermer en intégrant une
séquence d'ADN avec des extrémités compatibles. Le gène est donc amplifié par PCR avec
des amorces permettant d'ajouter des sites attL1 et attL2 de recombinaison au gène d'intérêt,
mais aussi du côté 5' quatre bases supplémentaires (CACC) qui vont assurer le clonage
directionnel du gène dans le vecteur pENTR-D/TOPO. Le clonage se fait dans les conditions
décrites par le protocole fourni avec le vecteur (Invitrogen). Des cellules TOP10 d’E. coli sont
ensuite transformées avec ce vecteur par choc thermique suivant le protocole fourni par le
fournisseur (Invitrogen), puis sélectionnées sur un milieu Luria Broth (LB, Sigma) contenant
de la kanamycine à 50 mg.L-1. L’ADN plasmidique est extrait par lyse alcaline, puis vérifié
par restriction et séquençage.
Lorsque le vecteur d’entrée est vérifié, l’insert est introduit dans le vecteur GatewayTM
grâce à une réaction de recombinaison mettant en jeu la LR-clonase (Invitrogen). La
recombinaison se fait entre des sites de recombinaison semblables à ceux des phages λ, et
plus précisément entre les sites attL (1 et 2) et attR (1 et 2) du vecteur d'entrée et du vecteur
de destination, respectivement. La réaction se fait dans les conditions décrites par le protocole
d'utilisation de la LR-clonase (Invitrogen). Des cellules DH5α d’E. coli sont transformées par
choc thermique. Les cellules sont sélectionnées sur un milieu LB contenant de la
streptomycine ou de la spectinomycine, indifféremment, à 50 mg.L-1. L’ADN plasmidique est
récupéré par lyse alcaline, puis vérifié par restriction et séquençage.
Le vecteur ainsi obtenu est enfin introduit par choc thermique dans des cellules
C58pMP90 d’A. tumefaciens. Pour cela, 200 µL de cellules compétentes sont ajoutés dans
100 µL de milieu LB contenant 5 µg d'ADN plasmidique. L'ensemble est placé pendant 5 min
dans l'azote liquide, puis pendant 25 min à 37°C au bain-marie. Dix mL de milieu LB sont
ajoutés aux bactéries et l'ensemble est placé toute une nuit à 27 à 28°C sans agitation. La
culture bactérienne est ensuite centrifugée pendant 10 min à 6000 g et le culot est repris par
300 µL de milieu LB, puis une fraction aliquote est étalée sur un milieu LB contenant de la
rifampicine (50 mg.L-1), de la gentamycine (20 mg.L-1) et de la streptomycine (50 mg.L-1).
5. Vérification des produits de clonage et technique de séquençage

Tous les vecteurs plasmidiques sont multipliés et récupérés par minipréparation ou
maxipréparation d’ADN. Ils sont triés par restriction suivant les instructions données pour
chaque enzyme par le fournisseur (Promega). Le séquençage des fragments d’intérêt est
effectué par la firme GenomeExpress (Meylan, France). Le tableau 8 reprend l’ensemble des
constructions obtenues et utilisées dans notre étude.
F. Expression de protéines recombinantes
1. Expression en système bactérien

a. Vecteur de fusion à la glutathion-S-transférase (GST)
Cent mL de milieu LB additionné de 50 mg.L-1 d’ampicilline sont ensemencés avec 2
mL d’une pré-culture réalisée à partir d’une colonie isolée de cellules XL1-blue d’E. coli
contenant le vecteur d’expression pGEX-KG. La culture est placée sous agitation à 37°C
jusqu’à atteindre une DO de 0,8 à 600 nm. L’expression protéique est induite en présence
d’isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside ou IPTG 0,2 mM pendant 2 h à 37°C sous
agitation. Les bactéries sont ensuite centrifugées pendant 6 min à 6000 g, puis reprises par 5
mL de tampon (Tris HCl 100 mM pH 7,5 ; NaCl 50 mM).
b. Vecteurs pQE
Une colonie isolée de cellules M15 d’E. coli contenant les vecteurs d’expression pQE
est ensemencée dans 5 mL de milieu LB additionné de 50 mg.L-1 de kanamycine et de 50
mg.L-1 d’ampicilline (LB-K-A) et mise en pré-culture une nuit sous agitation à 37°C.
La pré-culture est diluée au 1/100 dans du milieu LB-K-A, puis remise en culture sous
agitation à 37°C jusqu’à atteindre une DO à 600 nm comprise entre 0,6 et 0,8. L’ajout d’IPTG
dans le milieu de culture permet l’induction de la production protéique. Différentes
concentrations d’IPTG sont testées (de 0,1 mM à 1 mM). De même, la durée de l’induction
varie de 1 h à 6 h. Enfin, les inductions sont réalisées à 30°C et 37°C afin de tenter de
remédier aux problèmes liés à l’insolubilité de la protéine. En parallèle, des cultures dont la
production protéique n’est pas induite par ajout d’IPTG sont maintenues dans les mêmes
conditions. A la fin de la période d’induction, les cultures bactériennes sont centrifugées 20
min à 2000 g à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les culots bactériens sont
conservés à -80°C jusqu’à purification des protéines.

Tableau 8 : Différentes constructions utilisées au cours de l'étude
Nom Vecteur Description
TpGFP pCKgfpS65T Vecteur témoin d’adressage

aux plastes de la GFP
pDXR-GFP pCKgfpS65T Séquence d’adressage de la

DXR de rose fusionnée à la
GFP
35S::GFP pK7FWG2 GFP sans peptide

d’adressage
DXR-GFP pK7FGW2 Séquence totale de la DXR

de rose fusionnée à la GFP
DXR-S30 pQE30 Séquence DXR sans le

domaine riche en proline
DXR-L30 pQE30 Séquence DXR avec le

DXR-S70 pQE70 Séquence DXR sans le

DXR-L70 pQE70 Séquence DXR avec le

SurexDXR pK2GW7 Séquence entière de la DXR

de rose sous le contrôle du
promoteur CaMV35S
pGEX-GPPS pGEX-KG Séquence de la GPPS de rose

délétée de la séquence
putative d’adressage aux
plastes

2. Expression transitoire dans les cellules végétales
a. Transformation par biolistique
Les expériences de transformation transitoire par biolistique sont réalisées sur des
cellules d’épiderme d’oignon et sur des cellules d’épiderme supérieur de pétale de rose, selon
un protocole mis au point par G. Scalliet et P. Hugueney (laboratoire RDP, ENS Lyon).
L’appareillage utilisé lors de l’ensemble des tirs est un ‘gun Bio-Rad system PDS/He’ (Bio-
Rad). Les tissus, épidermes d’oignon ou pétales, sont placés dans des boîtes de Pétri
contenant deux épaisseurs de papier filtre imbibées d’eau.
Les plasmides utilisés pour cette expérience sont multipliés en grande quantité et
isolés selon le protocole de maxipréparation d’ADN plasmidique. Des billes d’or de 0,6 µm
de diamètre (Bio-Rad) sont préparées selon le protocole suivant : Les billes sont lavées deux
fois dans l’éthanol à 70 % puis reprises par 500 µL de glycérol 50 % stérile et aliquotées par
fractions de 50 µL. L’ADN plasmidique est ensuite fixé sur les billes. Pour chaque tube de 50
µL de billes, 5 µL d’ADN plasmidique à 1 µg.µL-1, 50 µL de CaCl2 2,5 mM et 20 µL de
spermidine 0,1 M sont ajoutés. Le tube est mélangé au Vortex 2 à 3 min, puis les billes sont
centrifugées 30 sec. Le surnageant est éliminé, les billes sont rincées une fois par de l’éthanol
70 %, puis une deuxième fois par de l’éthanol 100 %. Elles sont ensuite reprises par 50 µL
d’éthanol 100 %.
Six µL de cette préparation sont déposés sur des membranes (macrocarrier), placées
au-dessus d’une grille de projection, située en position moyenne par rapport au disque de
rupture. Les échantillons végétaux sont placés dans une chambre à vide à 9 cm de la plaque
porteuse du macrocarrier. Lorsque le vide atteint 25 pouces équivalent de mercure, une
pression d’hélium de 1100 psi est appliquée, rompant le disque de rupture et provoquant la
pulvérisation des billes à la surface des échantillons. Les échantillons sont ensuite placés une
nuit dans une chambre climatisée à une température de 20 à 25°C.
b. Transformation par infiltration d’A. tumefaciens

L’infiltration des feuilles de tabac est réalisée suivant le protocole de Batoko et al.
(2000). Une colonie isolée est utilisée pour ensemencer 2 mL de milieu LB contenant les
antibiotiques adéquats (20 mg.L-1 de gentamycine et 100 mg.L-1 d’antibiotique spécifique de
la construction). La culture est incubée à 28°C jusqu’à atteindre la phase stationnaire de
croissance (2 à 3 jours). Un mL de la culture est transféré dans un tube Eppendorf, centrifugé
à température ambiante pendant 5 min à 500 g, puis le culot est rincé 2 fois par 1 mL de
tampon d’infiltration (annexe 2). Le culot est enfin repris par 1 mL de ce même tampon. La

suspension bactérienne est diluée de façon à ajuster la concentration de l’inoculum à une DO
de 0,1 à 600 nm. L’infiltration de la suspension bactérienne est réalisée grâce à une seringue
sans aiguille après avoir fait une petite blessure. La surface de feuille infiltrée est délimitée à
l’aide d’un feutre indélébile, puis la plante est replacée dans les conditions de croissance
habituelles. Les observations sont faites en général 3 jours après infiltration.
Cette technique a été adaptée aux pétales de roses Hybrides de Thé. Les pétales sont
prélevés sur une fleur au stade ‘Bouton ouvert’. Un petit trou est pratiqué à l’aide d’une
pointe fine de dissection sur l’épiderme supérieur au niveau de l’onglet : on peut facilement
suivre la progression de la solution bactérienne à l’intérieur des pétales. Les pétales sont
ensuite placés dans des boîtes de Pétri contenant deux épaisseurs de papier filtre imbibées de
2 mL d’eau. Les boîtes sont ensuite scellées et conservées dans une pièce climatisée à 25°C
pendant 3 jours jusqu’au moment de l’observation.
G. Techniques d’étude des protéines
1. Purification de protéines totales de pétales de rose

Pour les extractions de protéines totales de pétale de rose, 50 mg de matériel végétal
sont broyés dans l'azote liquide, la poudre est versée dans un tube Eppendorf et 200 µL de
tampon SDG 2X (Tris HCl 125 mM pH 6,8 ; SDS 5 % ; DTT 4 % ; glycérol 40 %) sont
ajoutés. Le matériel est chauffé à 100°C 5 min, puis centrifugé 5 min à 11000 g. Le
surnageant est récupéré et la concentration en protéines est déterminée.
2. Purification des protéines recombinantes fusionnées à la GST

Après l’induction de l’expression protéique et mise en suspension des bactéries dans
un tampon adéquat, les bactéries sont soniquées 3 fois par pulses de 10 sec. Après
centrifugation, 100 µL du lysat bactérien sont prélevés afin d’analyser la fraction protéique
totale soluble. 50 µL de résine gluthation (Amersham-Bioscience) sont ajoutés au lysat
bactérien et l’ensemble est agité pendant 30 min à température ambiante afin de permettre
l’accrochage des protéines de fusion. L’échantillon est centrifugé quelques secondes à 20 g de
façon à récupérer tout le surnageant qui est ensuite analysé (fraction ‘flow through’). La
résine est placée sur une colonne, rincée 3 fois avec 1 mL de tampon (Tris HCl 100 mM pH
7,5 ; NaCl 50 mM), puis placée dans un tube Eppendorf en enlevant le maximum de
surnageant. La protéine d’intérêt est libérée de la partie GST de la résine par un traitement de
6 h à température ambiante par 10 unités de thrombine (Amersham-Bioscience) pour 100 µL
(fraction d’élution). Les différentes fractions protéiques sont analysées par SDS-PAGE et un
test d’activité enzymatique est réalisé sur la fraction d’élution.
3. Purification des protéines recombinantes présentant une étiquette poly-

histidine
a. Purification en conditions dénaturantes
La purification en conditions dénaturantes est réalisée suivant les instructions du kit
‘QIAexpressionist’ (QIAGEN).
Brièvement, le culot bactérien est repris dans un tampon de lyse (Tris HCl 10 mM pH
8 ; NaH2PO4 100 mM ; urée 8 M) dans un rapport de 5 mL.g-1 de culot bactérien. La lyse des
bactéries est réalisée en agitant au Vortex, tout en évitant la formation de mousse. Les débris
bactériens sont précipités par une centrifugation de 20 à 30 min à température ambiante à
10000 g. Pour 4 mL de lysat bactérien, 1 mL de résine Ni-NTA est ajouté. L’ensemble est
agité doucement 60 min à température ambiante. Le mélange lysat/résine est chargé sur une
colonne de purification. La fraction ‘flow-through’ est collectée : elle contient toutes les
protéines qui ne se sont pas fixées à la résine. La colonne est lavée deux fois par 4 mL de
tampon de lavage (Tris HCl 10 mM pH 6,3 ; NaH2PO4 100 mM ; urée 8 M). La protéine
recombinante est éluée par quatre fractions de 500 µL de tampon d’élution (Tris HCl 10 mM
pH 4,5 ; NaH2PO4 100 mM ; urée 8 M). Toutes les fractions sont récupérées individuellement
et déposées sur un gel SDS-PAGE 10 % pour analyse.
b. Purification en conditions natives

La purification sous forme native de la protéine recombinante est réalisée avec la
résine BD-Talon (BD-Biosciences-Clontech) car cette résine est plus spécifique que la résine
Ni-NTA agarose.
Brièvement, le culot bactérien est repris par 3 mL de tampon d’équilibration/lavage
(EL) froid, contenant du lysozyme à une concentration finale de 0,75 mg.mL-1, puis incubé 30
min à température ambiante. L’ensemble est broyé dans un mortier froid avec 7,5 mL
d’Alumina (Sigma) pendant 5 min. Le broyat est transféré dans un tube Nalgène et mortier et
pilon sont rincés par 2 mL de tampon EL. Le broyat est centrifugé 20 min à 4°C à 10000 g. Le
surnageant, correspondant à l’échantillon clarifié, est récupéré pour la purification.
Deux mL de résine BD-Talon, équilibrée dans du tampon EL sont ajoutés à
l’échantillon protéique. L’ensemble est agité doucement pendant 20 min à température
ambiante, puis centrifugé 10 min à 700 g à 4°C. Le surnageant, correspondant à toutes les
protéines ne possédant pas d’étiquette poly-histidine, est conservé pour analyse. La résine est
lavée par 2 fois avec 10 mL de tampon EL, avec une agitation de 10 min à température
ambiante, suivie d’une centrifugation de 5 min à 700 g à 4°C. A chaque fois, les fractions de
lavage sont conservées pour analyse. La résine est remise en suspension par 1 mL de tampon
EL, puis transférée sur une colonne de 2 mL. Le tampon EL est récupéré par gravité (3ème
fraction de lavage), puis un 4ème lavage de la résine est réalisée avec 5 mL de tampon EL.
L’élution de la protéine se fait en rajoutant 5 mL de tampon d’élution fourni avec le kit : des
fractions de 500 µL sont récupérées. La concentration en protéine de toutes les fractions
d’élution est évaluée. Elles sont déposées sur un gel SDS-PAGE 10 % pour analyse.
c. Dosage des protéines par la technique de Bradford

La concentration des protéines est dosée avec la méthode décrite dans le ‘BioRad
protein assay’ (BioRad), adaptée de la méthode de Bradford (1976). Le dosage se fait par une
mesure spectrophotométrique à une DO de 600 nm. Une gamme de concentration de SAB
permet d’obtenir une courbe étalon à partir de laquelle la concentration en protéines de
l’échantillon est déterminée. Brièvement, une fraction aliquote de l’échantillon de protéines
est diluée dans 800 µL d’eau, puis 200 µL de réactif de Bradford sont ajoutés. La solution est
mélangée et incubée pendant 15 min à température ambiante. La lecture de DO est ensuite
réalisée.
H. Analyse par SDS-PAGE et Western-blot
1. Electrophorèse des protéines par SDS-PAGE

Les expériences de SDS-PAGE sont réalisées avec le système ‘Mini PROTEAN II
electrophoresis cell’ de BioRad. La composition des gels est donnée en annexe 3. Les
échantillons de protéines sont déposés avec un volume de tampon de charge (Tris HCl 50 mM
pH 6,8 ; dithiothreitol 100 mM ; SDS 2 % ; bleu de bromophénol 0,1 % ; glycérol 10 %). La
migration se fait pendant 1 h 30 sous une tension de 110 à 130 volts.
Après migration, le gel est fixé pendant 30 min à température ambiante sous faible
agitation dans une solution de méthanol/acide acétique/eau (40/10/50 ; v/v/v). La coloration
est faite pendant 30 min sous agitation à température ambiante dans du bleu de Coomassie
(0,25 g de Coomassie brillant blue R250 dans une solution de méthanol/acide acétique/eau
[40/10/50 ; v/v/v]). Elle est suivie d’une phase de différentiation dans une solution d’acide
acétique 10 %. Les gels sont séchés suivant les indications du kit ‘Gel drying kit’ (Promega).
2. Détection des protéines par Western-blot
Lorsqu’une analyse par Western-blot doit être réalisée, les gels SDS-PAGE ne sont ni
fixés, ni colorés au bleu de Coomassie.
Les protéines sont transférées sur une membrane PVDF (Roche Diagnostics) grâce au
système ‘Mini PROTEAN II electrophoresis cell’ de BioRad. Le transfert se fait en 1 h à
température ambiante sous un voltage constant de 100 volts dans un tampon de transfert (Tris
HCl 25 mM pH 8,3 ; glycine 192 mM ; méthanol 15 %). Avant le transfert, la membrane est
rincée rapidement dans du méthanol, lavée deux fois dans de l’eau et équilibrée pendant au
moins 30 min dans le tampon de transfert. De même, gel, papiers filtres et éponges sont
équilibrés dans ce tampon. Le montage se fait suivant les instructions fournies avec
l’appareillage. Après transfert, la membrane est colorée pendant 10 min dans du rouge
Ponceau (Ponceau S 0,2 % - p/v ; acide trichloroacétique 3% - v/v), puis différenciée par des
lavages successifs dans du tampon TBS-T (Tris HCl 10 mM pH 8 ; NaCl 150 mM ; Tween 20
0,05 %). Un blocage des membranes de 2 h à température ambiante sous faible agitation est
ensuite réalisé dans une solution de blocage (poudre de blocage fournie avec le kit diluée à 1
% dans du tampon TBS-T). La membrane est incubée une nuit à 4°C en présence de
l’anticorps primaire dilué dans la solution de blocage. La membrane est lavée deux fois 10
min dans du tampon TBS-T à température ambiante sous faible agitation, puis incubée 30
minutes sous agitation à température ambiante en présence de l’anticorps secondaire lié à la
peroxydase, dilué dans la solution de blocage. La membrane est ensuite lavée deux fois dans
du tampon TBS-T. La révélation se fait en présence du substrat Lumi-lightPLUS suivant la
technique dite de ‘transparency’, décrite dans le manuel du kit ‘Lumi-lightPLUS western-
blotting kit (mouse/rabbit)’ de Roche Diagnostics. Il permet une détection par
chimiluminescence et révélation sur un film Kodak X-OMAT AR (Amersham-Biosciences).
Les couples d’anticorps utilisés sont décrits dans le tableau 9.

Tableau 9 : Anticorps utilisés pour les Western-blot
Type de protéine Anticorps primaire Réactifs secondaires
DXR recombinante avec une Anticorps anti-histidine Anticorps anti-souris (kit

étiquette poly-histidine (Sigma, référence : H1029), ‘Lumi-LightPLUS western-
dilué au 1/1000 blotting kit (mouse/rabbit)’ de
Roche Diagnostics
[référence : 2015218]), dilué
au 3/1000
OOMT dans les pétales de Anticorps anti-OOMT Anticorps anti-lapin

rose (Scalliet, 2003) (Amersham)

I. Tests d’activité
1. Complémentation d’une souche déficiente en DXR

La caractérisation enzymatique de la DXR de rose est réalisée par complémentation
d’une souche déficiente en DXR, suivant un protocole déjà décrit (Rodriguez-Concepcion et
al., 2001). Elle a été réalisée par E.M. Uros-Gracia, sous la direction du Dr M. Rodriguez-
Concepcion de l’Université de Barcelone (Espagne).
Les vecteurs pQE30 et pQE70 ayant intégré soit la forme longue, soit la forme courte
de la DXR de rose, sont introduits dans la souche 'dxr::TET' de cellules EcAB1-2 d’E. coli,
dans laquelle le gène DXR est interrompu par l’insertion du marqueur TET qui confère la
résistance à la tétracycline. Les transformants positifs sont sélectionnés sur un milieu LB
contenant de la tétracycline à 7,5 mg.L-1, de l’ampicilline à 100 mg.L-1 et de l’IPTG à 0,02 %
pour induire l’expression à partir du promoteur T5. Quand cela est nécessaire, du
méthylérytrol est ajouté (Rodriguez-Concepcion et al., 2000).
2. Activités prényltransférases
Les tests d’activité des prényltransférases sont réalisés par G. Scalliet et P. Hugueney
du laboratoire RDP, ENS Lyon.
L’activité prényltransférase de la protéine codée par le gène RhGPPS est étudiée et
comparée aux activités prényltransférase de protéines isolées et caractérisées, AtGPPS isolée
chez A. thaliana (Bouvier et al., 2000) et RhGGPPS isolée chez la rose à partir d’une banque
d’ESTs (Channelière et al., 2002).
Les tests d’activité prényltransférase sont réalisés comme suit : 100 à 300 ng de
protéine purifiée sont ajoutés à 100 µL de tampon de réaction (Tris HCl 100 mM pH 7,5 ;
MgCl2 2 mM ; MnCl2 10 µM ; DTT 2 mM ; DMAPP 10 µM ou 100 ng d’IPP-isomérase
purifiée chez A. thaliana) et 5 µL [1-14C]-IPP à 60 mCi.mmol-1 (Amersham-Bioscience).
Les incubations sont réalisées à 30°C pendant 2 h. Le milieu réactionnel est ensuite
déphosphorylé par la phosphatase alcaline. 100 µL de Tris 1 M sont ajoutés suivi de 10 µg de
phosphatase alcaline d’intestin de veau (Sigma) ; le milieu est incubé 4 h à 37°C avant d’être
extrait par 100 µL de chloroforme.
La séparation des isoprénols est réalisée en phase inverse, sur plaques de silice
greffées en C18 (plaques Chromafix C18ec, Macherey-Nagel). La migration est effectuée en
présence de méthanol/eau (70/30 ; v/v). Les références frontales sont déterminées par la

révélation de témoins (géranylgéraniol, farnésol et géraniol) par pulvérisation d’un mélange
vanilline/acide sulfurique.
J. Obtention de plantes transgéniques de tabac

Le protocole de transformation de tabac utilisé est dérivé de celui de Horsch et al.
(1985).
1. Obtention des explants

Des plantules de tabac, Nicotiana sylvestris, sont cultivées en pots stériles sur un
milieu de culture T (annexe 4). La transformation du tabac avec la souche d’A. tumefaciens
contenant le vecteur de surexpression du gène RhDXR est réalisée sur 200 explants, prélevés
sur de jeunes feuilles issues de culture in vitro. Pour le témoin de transformation, 100 explants
sont transformés avec une souche d'A. tumefaciens contenant le vecteur Gateway dans lequel
la GFP est exprimée de façon constitutive (35S::GFP, tableau 8).
2. Préparation des bactéries

Une culture de 10 mL de milieu LB, additionné de rifampicine à 50 mg.L-1, de
gentamycine à 20 mg.L-1 et de streptomycine à 50 mg.L-1, est ensemencée avec une colonie
isolée de la souche d’A. tumefaciens contenant le vecteur de transformation. La souche est
cultivée pendant 36 h à 27°C sous faible agitation. Dans 20 ml de milieu LB contenant les
mêmes antibiotiques, 1 mL de la pré-culture est ajouté. La culture est maintenue une nuit à
27°C sous faible agitation.
3. Transformation des explants

La culture bactérienne est centrifugée 15 min à 500 g, puis rincée deux fois par 20 mL
de milieu TT (annexe 4). Elle est ensuite reprise dans 20 mL de milieu TT et diluée au 1/10
dans ce même milieu.
Les explants sont placés dans des bocaux stériles contenant 100 mL de culture diluée
au 1/10 (50 explants par pot). L’ensemble est placé à 27°C pendant 30 min sous faible
agitation. Les explants sont séchés rapidement sur papier filtre stérile, puis placés dans des
boîtes de Pétri contenant du milieu TT sans antibiotique (10 explants/boîte). Les boîtes sont
ensuite placées pendant 2 jours à la lumière dans une pièce climatisée à 25°C pour la co-
culture.

Les explants sont ensuite repiqués sur un milieu TT (5 explants par boîte) additionné
d’augmentin à 400 mg.L-1 et de kanamycine à 200 mg.L-1, ainsi que des hormones BAP 1
mg.L-1 et ANA 0,1 mg.L-1. Ils sont remis en culture dans une pièce climatisée à 25°C. Au
bout de 3 semaines, les premiers cals se forment. Les explants, puis les cals, sont repiqués
tous les 15 jours sur le même milieu jusqu’à la formation de bourgeons, puis de plantules.
4. Entretien des transformants

Lorsque les plantules sont suffisamment développées, elles sont placées dans des
boîtes de Pétri contenant 25 mL de milieu T, additionné de kanamycine à 200 mg.L-1. Au bout
de 15 à 21 jours, les plantules sont enracinées et sont acclimatées en serre dans des pots
individuels. Pour maintenir une humidité relative élevée, les plantes sont recouvertes d’un
film plastique transparent durant une semaine. L’acclimatation est réalisée à 24°C sous une
intensité lumineuse de 550 µmol.m-2.s-1 (lampe Mazda MAIH 400) et une photopériode de 16
h de jour et 8 h de nuit.

Résultats
I. La production du parfum chez les roses
A. La production du parfum au sein de la fleur
1. Les organes producteurs du parfum

Il est généralement admis que la fragrance des roses provient des pétales (Esau, 1965).
Cependant, des études chez la rose sauvage Rosa rugosa (Dobson et al., 1999) ont montré que
les autres organes de la fleur produisaient aussi des composés volatils. Dans une première
expérience, nous avons voulu savoir si cela était également le cas chez les roses modernes
Hybrides de Thé, qui font l’objet de notre étude. Pour cela, une analyse des composés volatils
est réalisée par extraction sur différents organes floraux de la variété ‘Papa Meilland’ prélevée
au stade ‘bouton très ouvert’ (BTO) : sépales, pistils (styles et stigmates), étamines et pétales.
L’analyse, réalisée plusieurs fois, donne des résultats équivalents. Le tableau 10 présente les
résultats obtenus pour une expérience représentative.
Pétales et étamines sont les organes qui renferment le plus de composés volatils. Les
pistils sont 2,9 et 3,8 fois moins concentrés que les pétales et les étamines, respectivement.
Dans ces trois organes, toutes les classes de composés sont représentées : dérivés d’acide gras,
terpènes, composés aromatiques ; néanmoins, les monoterpènes et leurs dérivés sont
majoritaires puisqu’ils représentent 37,6 % (étamines) à 60 % (pistils) des composés
identifiés. On retrouve de façon générale les mêmes composés volatils dans ces trois organes
floraux, mais les proportions sont très différentes. Par exemple, étamines et pistils renferment
des quantités d’eugénol et de méthyleugénol 10 à 35 fois plus importantes que celles des
pétales.
Dans les pétales, les alcools monoterpéniques sont les composés majoritaires
puisqu’ils représentent 54,3 % des composés volatils totaux. Parmi ces composés, le géraniol
est prédominant (41,9 %). Nérol (6,8 %) et citronellol (5,6 %) sont deux autres alcools
monoterpéniques présents en quantités très importantes. Ces trois alcools monoterpéniques
donnent à cette variété une odeur de rose typique. Outre les monoterpènes, les composés
aromatiques sont également des composés majeurs du parfum. Ainsi le 2-phényléthanol (6,4
%) lui confère également un parfum typique de rose, avec une note miellée. Le 3,5-
diméthoxytoluène ou DMT (1,4 %), typique des roses chinoises, est responsable de ‘l’odeur
de thé’.
Résultats 116
Tableau 10: Composés volatils majeurs identifiés par extraction dans différents organes
floraux de la variété 'Papa Meilland' au stade BTO. Les valeurs représentent les
pourcentages de l’aire totale des pics des chromatogrammes de GC-FID. La quantité totale est
donnée en µg.g-1 PF. - : composé non détecté dans les conditions de l’expérimentation.
composés organes
pétales étamines pistils sépales
ß-phellandrène - <1 - <1

trans-2-hexénal <1 <1 1,0 61,5
cis-3-hexényl-acétate <1 <1 - 3,0
hexylformate <1 - 3,1 <1
cis-3-hexénol - - - 5,0
trans-2-hexénol - - <1 2,8
linalol - - - 1,8
trans-ß-caryophyllène <1 <1 - 1,0
néral <1 2,1 1,2 -
germacrène D <1 <1 - <1
heptadécane <1 1,5 - <1
guaiadiène - <1 1,5 -
bicyclogermacrène <1 1,3 - -
géranial 2,4 7,7 2,0 <1
acétate de géranyl <1 <1 - <1
citronellol 5,6 7,9 18,6 3,0
nérol 6,8 4,6 17,9 1,1
DMT 1,4 4,6 1,9 <1
géraniol 41,9 15,3 20,2 3,2
benzylalcool <1 <1 3,3 <1
nonadecane 14,1 3,9 - <1
2-phényléthanol 6,4 6,2 6,3 1,6
hydroxytoluène butylé 8,1 7,9 6,0 <1
nonadecène 1 - 4,2 3,6 -
méthyleugénol <1 2,2 4,3 -
heinécosane 5,1 15,6 5,7 4,1
TMB <1 <1 <1 -
eugénol - 7,3 2,1 -
composés totaux 343,3 437,9 116,7 64,4
Résultats 117
D’autres composés, comme le nonadécane (14,1 %, hydrocarbone à longue chaîne),
représentent une part importante des composés extraits des pétales. Cependant, ces composés
sont très peu volatils et ne sont probablement pas émis en grande quantité.
Les sépales renferment également des composés volatils, mais dans des quantités
moins importantes. Par exemple, les sépales renferment 6,8 fois moins de composés que les
étamines. Leur nature est également très différente de celle des composés volatils des pétales,
étamines et pistils. En effet, les composés volatils des sépales appartiennent majoritairement à
la classe des dérivés d’acide gras (trans-2-hexénal, cis-3-hexénol, cis-3-hexényl-acétate). En
plus des dérivés d’acides gras, les sépales contiennent des monoterpènes, sesquiterpènes et
d’autres composés que l’on retrouve dans les pétales, étamines et pistils mais dans des
quantités beaucoup moins importantes : par exemple, les pétales renferment 75 fois plus de
géraniol que les sépales. Par contre, les sépales du renferment du linalol, composé absent des
pétales, étamines et pistils chez cette variété.
Les quantités totales de composés volatils sont voisines dans les pétales et les
étamines. Néanmoins, lorsque l’on considère la masse totale de chacun de ces organes, les
pétales ont une masse totale d’environ 30 g pour la variété de rose étudiée, tandis que les
étamines ne représentent qu’une masse totale d’environ 1 g. Ainsi, si on rapporte la quantité
de composés volatils à la masse totale de chaque organe, les pétales représentent 24 fois plus
de composés volatils que les étamines. En conclusion, même si les étamines apportent une
contribution significative, les pétales sont la source majeure du parfum chez cette variété de
rose.
2. La répartition du parfum au sein de la fleur

Afin de caractériser la production du parfum dans le pétale, nous avons tout d’abord
répondu à deux questions préliminaires :
− Tous les pétales d’une même fleur produisent-ils les mêmes composés dans les
mêmes proportions ?
− Toutes les zones du pétale produisent-elles les mêmes composés dans les
mêmes proportions ?
Pour répondre à la première question, tous les pétales d’une fleur, prélevée au stade
‘fleur épanouie’ sont analysés individuellement. L’expérience, réalisée plusieurs fois et sur
deux variétés différentes (‘Papa Meilland’ et ‘The Mac Cartney rose’), montre que tous les
pétales d’une même fleur, à l’exception des pétales les plus internes, produisent les mêmes
composés volatils, dans des quantités et des proportions équivalentes. Les pétales les plus
Résultats 118
internes étant plus concentrés en composés volatils (de 1,5 à 2 fois), ils n’ont pas été utilisés
pour les analyses qui suivent.
L’observation de la face supérieure du pétale en microscopie électronique

environnementale à balayage (MEB) montre une structure différente des cellules de la
périphérie du pétale vers l’onglet (Fig. 22). En effet, si les cellules sont très coniques en
périphérie et dans la zone centrale, elles deviennent de plus en plus plates lorsque l’on se
rapproche de l’onglet. Si l’on se base sur l'hypothèse selon laquelle les cellules coniques de
l’épiderme supérieur du pétale sont seules responsables de la production et de l’émission des
composés volatils du parfum (Loomis et Croteau, 1973), on peut envisager que toutes les
cellules à la base du pétale ne soient pas capables de produire et d’émettre ces composés
volatils.
Afin de répondre à cette question, des pétales de la variété ‘The Mac Cartney rose’
sont prélevés sur une fleur au stade BTO et divisés en 4 zones concentriques. L’analyse par
extraction des composés volatils présents dans chacune de ces zones est réalisée plusieurs fois
et des résultats identiques sont obtenus. La figure 23 et le tableau 11 présentent les résultats
représentatifs obtenus pour une expérience. Les quantités de composés volatils présents dans
les cellules du pétale diminuent depuis la périphérie jusqu’à la zone proche de l’onglet (Fig.
23). Si l’on s’intéresse aux pourcentages des différents composés majoritaires, on constate
que ceux-ci varient très faiblement dans les zones 1 et 2. Dans les zones 3 et 4, certains
composés, comme le linalol, passent en dessous du seuil de détection et le géraniol devient
majoritaire (Tableau 11). Suite à ces résultats, dans les analyses qui suivent, la zone la plus
proche de l'onglet n'a pas été prélevée.
3. L'évolution du parfum au cours du développement floral

Nous souhaitions étudier les structures cytologiques présentes dans le pétale en
relation avec la production de parfum. Pour cela, il était important de définir au préalable la
cinétique de cette production du parfum au cours du développement floral.
L’étude de l’émission des composés volatils du parfum de la variété ‘Papa Meilland’
au cours de son développement floral est réalisée grâce à la technique classique de headspace
dynamique dans laquelle une fleur entière est enfermée dans un sac en plastique inerte.
Pendant 1 h, les composés volatils sont piégés sur du Tenax, puis élués par de l’hexane. Afin
de minimiser les variations environnementales, les fleurs à différents stades de développement
Résultats 119
Z1
Z4
A B
Figure 23 : Zones de la face supérieure des pétales de la variété 'The Mac Cartney rose'
stade BTO observées en microscopie électronique environnementale à balayage. A,
cellules en périphérie, zone 1 (Z1) ; B, cellules proches de l’onglet, zone 4 (Z4). Les barres
représentent une échelle de 50 µm.
600
Z1
500
400 Z4
µg..g-1 PF
300
200
100
0
Zone 1 Zone 2 Zone 3 Zone 4
Figure 24 : Répartition dans un pétale des composés volatils majeurs du parfum extraits
de la variété 'The Mac Cartney rose' prélevée au stade BTO.
Tableau 11 : Composés volatils majeurs du parfum extraits des quatre zones du pétale
d’une fleur de la variété ‘The Mac Cartney rose’ prélevée au stade BTO
composés zone
1 2 3 4
µg.g-1PF % µg.g-1PF % µg.g-1PF % µg.g-1PF %
2-phényléthanol 53 10 47 9 22 10 0 0
linalol 39 7 22 5 0 0 0 0
nérol 72 13 68 13 44 19 39 23
géraniol 311 58 296 59 159 71 128 77
acétate de
citronellyl 62 12 69 14 0 0 0 0
composés totaux 537 100 502 100 225 100 167 100
Résultats 120
sont analysées à la même heure de la journée. Au moins trois analyses sur des fleurs
différentes sont réalisées pour chaque stade de développement.
Les composés volatils des pétales des mêmes fleurs sont ensuite extraits afin de
déterminer leur concentration. La figure 25 et le tableau 12 présentent les résultats obtenus.
Aussi bien en extraction qu’en émission, les quantités de composés volatils détectées
augmentent au cours du développement de la fleur ; le maximum de composés volatils est
détecté au stade BTO/FE, c’est-à-dire quand la fleur est ouverte. Au stade BJO, l’émission de
composés volatils est très faible dans nos conditions d’expérimentation. De plus, la plupart
des composés volatils émis à ce stade sont des dérivés d’acides gras et des isomères du pinène
(monoterpène). Au stade FS, les quantités émises, bien que significatives, sont plus faibles
qu’au stade précédent, BTO/FE.
Parmi les composés volatils émis, les alcools monoterpéniques (géraniol, nérol et
citronellol) et leurs dérivés représentent une part très importante des composés volatils totaux
quel que soit le stade de développement, excepté le stade BJO. Ainsi, en fonction du stade de
développement, ils représentent de 63 à 73 % des composés totaux. Cette importance des
composés monoterpéniques est également vérifiée lorsque l’on considère les extraits : en
effet, au stade BTO/FE, ils représentent 61 % des composés volatils totaux présents dans les
pétales.
En revanche, les quantités de DMT dans le pétale n’évoluent pas de la même façon
que les quantités de monoterpènes. En effet, ce composé représente un pourcentage
légèrement plus important dans les stades précoces de développement (3,5 % au stade BO)
qu’aux stades tardifs (1,6 % aux stades BTO/FE).
Au moment où la fleur est totalement épanouie, deux composés aromatiques, eugénol
et méthyleugénol, sont émis à un faible niveau (2,5% des composés totaux), alors qu’ils ne
sont pas ou très peu présents dans les extraits de pétale. Ces composés sont probablement
émis par les étamines, dans lesquelles ils font partie des composés majoritaires (voir §A.1).
Certains composés, comme le nonadécane, sont présents dans les extraits, mais sont
très faiblement émis. Ceci est du à leur faible volatilité.
L’analyse des composés volatils présents dans les pétales et émis par les fleurs chez
d’autres variétés de rose très parfumées, et notamment la variété ‘The MacCartney rose’,
donne des résultats similaires concernant l’évolution des composés volatils au cours du
développement floral. Par ailleurs, si l’on prend en compte le rapport entre les composés
volatils émis et la concentration en composés volatils dans le pétale, celui-ci est maximum au
stade BTO/FE, suggérant que tous les composés volatils ne sont pas émis au stade BO.
Résultats 121
A B
500 60
450
50
µg.fleur-1 .h -1
400
350 40
µg.g-1 PF
300
250 30
200
150 20
100 10
50
0 0
BJO BO BT O/FE FS BJO BO BT O/FE FS
Figure 25 : Evolution des composés volatils extraits des pétales (A, extraction) et émis
par les fleurs (B, headspace) au cours du développement floral de la variété 'Papa
Meilland'. Les barres représentent l'erreur standard.
Tableau 12 : Composés volatils majeurs extraits des pétales (EX) et émis par les fleurs
(HS) de la variété 'Papa Meilland' au cours de son développement floral. Pour
l’extraction, les quantités sont exprimées en µg.g-1 PF +/- erreur-standard ; pour le
‘headspace’, les quantités sont exprimées en µg.fleur-1.h-1.
composés stade
BJO BO BTO/FE FS
HS EX HS EX HS EX HS EX
dérivés d’acide gras 0,1 20,1 0,6 5,1 3,9 5,9 1,2 9,4
citronellol et dérivés 0,0 0,0 0,7 27,6 2,4 22,0 0,4 9,6
géraniol et dérivés 0,0 0,0 6 113,7 22,7 195,8 3,6 39,1
nérol et dérivés 0,0 0,0 1,3 28,9 4,0 39,1 0,5 8,1
autres monoterpènes 0,1 12,3 0,1 7,3 0,1 2,5 0,0 2,0
isomères de germacrène 0,0 0,0 0,0 4,7 0,1 2,8 0,0 0,0
autres sesquiterpènes 0,0 0,0 0,1 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0
2-phényléthanol 0,0 3,0 1,3 67,9 1,9 74,5 0,9 78,2
DMT 0,0 0,0 0,9 13,4 1,3 6,9 0,4 2,4
autres benzénoïdes 0,0 0,0 0,2 6,3 0,6 7,7 0,1 7,1
eugénol et méthyleugénol 0,0 0,0 0,0 0,0 1 0,0 0,0 0,0
hydrocarbones à longue
0,0 6,1 0,2 102,5 1,5 71,1 0,0 5,5
chaîne
composés non identifiés 0,1 0,0 0,1
0,7 0,3 0,0 0,1 0,0
378,1 39,8 428,2 161,3
0,3 41,5 11,5 7,1
composés totaux +/- +/- +/- +/-
+/-0,1 +/-7,6 +/-2,6 +/-3,2
14,0 14,9 22,0 31,5
Résultats 122
En conclusion, malgré ces petites différences entre l’extraction et la collection des
composés volatils par headspace, il existe, chez les roses intensément parfumées, une
corrélation étroite entre ce qui est à l’intérieur du pétale et ce qui est émis par la fleur tout au
long de son développement.
B. Les pétales : organes producteurs de parfum

Les analyses des composés volatils du parfum réalisées chez les Hybrides de Thé au
cours de notre étude et chez la rose sauvage Rosa x rugosa (Dobson et al., 1999) montrent
que les pétales sont les organes qui produisent le plus de parfum chez ces roses. Une étude de
la structure du pétale ainsi qu’une analyse de la localisation du parfum dans cet organe ont
donc été mises en œuvre afin de déterminer s’il existe des sites spécialisés dans la production
et l’émission du parfum dans les pétales de rose, et si des structures cellulaires spécifiques
sont mises en place dans les pétales lors de la production et de l’émission des composés
volatils.
1. La structure du pétale de rose

a. Les deux épidermes du pétale
Dans un premier temps, nous avons utilisé la microscopie afin de caractériser au
niveau structural le modèle de notre étude : le pétale de rose. Les pétales de rose sont
délimités par deux couches d’épiderme, séparées par un parenchyme de type lacuneux. La
microscopie électronique environnementale à balayage (MEB) permet l’étude de la surface
d’un pétale de rose, sans qu’il soit nécessaire de fixer et de métalliser les échantillons comme
dans le cas de la microscopie électronique à balayage classique. Ceci permet de réduire les
artéfacts liés à ces étapes de préparation de l’échantillon.
L’épiderme inférieur du pétale est plat (Fig. 26A), avec une cuticule intensément striée
(Fig. 26C). De longs poils unicellulaires sont parfois observés, mais aucun trichome sécréteur
n’est présent.
L’épiderme supérieur est constitué de cellules dont la forme évolue au cours du
développement de la fleur. En effet, au stade ‘bouton fermé’ (BF), les cellules de l’épiderme
supérieur sont de petite taille, régulières et leur surface est ridée (Fig. 26D). Au cours du
développement de la fleur, ces cellules deviennent plus coniques et les rides s’atténuent sauf
au niveau de l’apex des cellules (Fig. 26B et E à I).
Résultats 123
G
po
p
c
v
pl
a
B F I
C D E J
Figure 26 : Structure des épidermes du pétale des roses Hybrides de Thé. A, épiderme
inférieur de la variété ‘The Mac Cartney rose’ stade BTO observé en MEB. B, épiderme
supérieur de la variété ‘The Mac Cartney rose’ au stade BO observé en MEB. C, détail de la
cuticule de l’épiderme inférieur de la variété ‘The Mac Cartney rose’ stade BTO. D,
épiderme supérieur de la variété ‘The Mac Cartney rose’ au stade BF observé en MEB. E,
épiderme supérieur de la variété ‘The Mac Cartney rose’ au stade FE observé en MEB. F,
coupe transversale de l’épiderme supérieur de la variété ‘Papa Meilland’ au stade BO observé
en microscopie optique. G à I, coupes tangentielles de l’apex d’une cellule de l’épiderme
supérieur de la variété ‘Anna’ au stade BO observé en MET. J, épiderme supérieur de la
variété ‘Hacienda’ au stade FE observé en MEB, noter la présence de gouttelettes au sommet
des cellules (flèche). p, paroi ; c, cuticule ; pl, plaste ; a, amidon ; v, vacuole ; po, poil. Les
barres représentent une échelle de 50 µm pour A à E et J, de 10 µm pour F et 2 µm pour G à I.
Résultats 124
Chez les variétés parfumées, au moment où la fleur est totalement épanouie, il est
possible d’observer des gouttelettes à la pointe des cellules de l’épiderme supérieur (Fig. 25J).
Comme ces gouttelettes n’ont jamais été observées chez les roses sans parfum, elles
correspondent probablement aux composés volatils. Il est possible que le léger vide exercé à
l’intérieur de l’enceinte du MEB soit responsable de la formation de ces gouttelettes par
agrégation. Néanmoins, ces gouttelettes sont aussi parfois visibles lorsqu’on observe
l’épiderme supérieur d’un pétale en microscopie optique entre lame et lamelle.
b. L'évolution du pétale au cours du développement de la fleur

La microscopie optique est utilisée pour étudier l’évolution de la structure du pétale au
cours du développement floral de plusieurs variétés de rose, et plus particulièrement de la
variété ‘Papa Meilland’. Pour cela, des coupes transversales semi-fines sont réalisées sur des
pétales prélevés sur des fleurs à différents stades de développement et colorées au Paragon
(Fig. 27A à I).
Aux stades BF (Fig. 27A) et BJO (Fig. 27B), les cellules de l’épiderme supérieur ont
une forme plus ou moins rectangulaire. Leur cuticule et leur paroi cellulaire sont fines et leur
cytoplasme est dense. Observées en microscopie électronique à transmission (MET), elles ont
un noyau large et leurs plastes ont une structure qui rappelle celle des chloroplastes (Figure
27G). Leur cytoplasme contient de très nombreuses vacuoles de petite taille (Fig. 27H) qui
fusionnent au cours du développement pour donner une ou quelques très grosses vacuoles.
Sous les cellules des épidermes, se trouve une couche de cellules sous-épidermiques dont le
cytoplasme est également très dense. Les cellules de l’épiderme supérieur sont reliées entre
elles et avec les cellules du sous-épiderme par de nombreux plasmodesmes (Figure 27I). La
partie centrale du pétale est remplie d’un parenchyme lacuneux, composé de cellules peu
jointives très vacuolisées et de larges espaces intercellulaires. Les cellules de l’épiderme
inférieur ont une forme rectangulaire et sont généralement plus grosses que les cellules de
l’épiderme supérieur, recouvertes d’une cuticule et d’une paroi plus épaisses. Leur cytoplasme
est également relativement dense. Au stade BJO, des amyloplastes sont souvent visibles dans
les cellules des deux épidermes et du parenchyme (Fig. 27B, flèches rouges).
Lorsque les boutons floraux commencent à s’ouvrir (stade BO et BTO), les cellules
des deux épidermes, ainsi que les cellules du parenchyme, renferment de très nombreux et
volumineux amyloplastes (Fig. 27C et D, flèches rouges). Le parenchyme se désorganise et
devient de plus en plus lacuneux. C’est à ce stade que la fleur commence à émettre des
composés volatils.
Résultats 125
Figure 27 : Micrographies optiques (A à F) et électroniques (G à I) de coupes
transversales de pétales de la variété ‘Papa Meilland’. A, stade BF ; B, stade BJO ; C,
stade BO ; D, stade BTO ; E, stade FE ; F, stade FS ; G, cellule de l’épiderme supérieur
au stade BF ; H et I, cellules de l’épiderme supérieur au stade BJO. v, vacuole ; m,
mitochondrie ; c, cytoplasme ; p, paroi ; pl, plaste ; n, noyau ; ►, plasmodesmes ; flèches
rouges, amidon. Les barres représentent une échelle de 10 µm pour A à F, de 0,5 µm pour G
et H et 1 µm pour I.
Résultats 126
Lorsque la fleur est épanouie et émet le maximum de composés volatils (stade FE), les
cellules de l’épiderme supérieur ont acquis leur forme de papille conique caractéristique (Fig.
27E). Les vacuoles des cellules des épidermes occupent la quasi-totalité de la cellule et sont
remplies de précipités qui pourraient correspondre à des pigments (anthocyanes) ou à des
tanins. De plus, les amyloplastes ont disparu (Fig. 27E).
Lorsque la fleur est sénescente (stade FS), la désorganisation du pétale est maximale :
les cellules du sous-épiderme ne sont plus visibles et le parenchyme lacuneux est
pratiquement dépourvu de cellules (Fig. 27F).
2. La production du parfum par le pétale

Les analyses en MEB confirment que chez la rose, comme chez d’autres espèces, les
cellules des deux épidermes du pétale ont des caractéristiques différentes : les cellules de
l’épiderme supérieur ont une forme de papille conique et l’ensemble formé par la cuticule et
la paroi est fin, tandis que les cellules de l’épiderme inférieur sont plus volumineuses,
rectangulaires et recouvertes d’une épaisse couche formée par la cuticule et la paroi.
De plus, depuis fort longtemps, il est supposé que les cellules de l’épiderme supérieur
du pétale, à cause leur forme particulière, sont les seules responsables de l’émission des
composés volatils du parfum (Loomis et Croteau, 1973). Néanmoins, à notre connaissance,
aucune étude n’a été menée afin de confirmer ou d’infirmer cette hypothèse. En mettant au
point une technique de séparation des épidermes du pétale en les pelant et en adaptant la
technique de SPME, nous avons cherché à savoir si les deux épidermes du pétale des roses
Hybrides de Thé sont capables de produire et d’émettre les composés volatils du parfum ou
bien si seul l’épiderme supérieur possède ces deux fonctions.
a. La production des composés volatils dans les deux épidermes

L’analyse des composés volatils présents dans les cellules des deux épidermes du
pétale est réalisée par extraction à l’hexane. Brièvement, à l’aide d’une pince très fine,
l’épiderme supérieur d’un pétale est séparé du parenchyme et de l’épiderme inférieur, et
l’épiderme inférieur d’un autre pétale est séparé du parenchyme et de l’épiderme supérieur.
Une extraction par l’hexane des composés volatils du parfum est réalisée sur les différentes
parties du pétale. Deux variétés de rose sont utilisées pour cette expérience : la variété ‘The
Mac Cartney rose’ et la variété ‘Baronne Edmond de Rothschild’. Les résultats de
l’expérience sur la variété ‘Baronne Edmond de Rothschild’ sont présentés dans la figure
28A. Des résultats similaires sont obtenus sur l’autre variété. Les concentrations en composés
Résultats 127
volatils sont toujours plus élevées dans les fractions correspondant aux épidermes seuls que
dans les fractions correspondant au parenchyme plus épiderme. Ceci suggère que les deux
épidermes sont les sites de concentration des composés volatils. La concentration en
composés volatils est légèrement plus importante dans l’épiderme supérieur (Fig. 28A). Ces
résultats prouvent que l’épiderme supérieur n’est pas le seul site de concentration des
composés volatils puisque la concentration en composés volatils des cellules de l’épiderme
inférieur est relativement élevée, même si elle n’égale pas celle de l’épiderme supérieur.
b. L'émission des composés volatils par les deux épidermes

L’émission des composés volatils par les deux épidermes du pétale de la variété ‘The
Mac Cartney rose’ est réalisée en adaptant la technique de SPME. Le pétale prélevé sur une
fleur au stade BTO est placé sur un support inerte et un cône de pipette permet de délimiter
une chambre d’analyse. La fibre de SPME est introduite dans cette chambre par l’extrémité du
cône et les composés volatils sont piégés pendant 1 h sur la fibre. La désorption de la fibre se
fait pendant 2 min à 240°C dans la chambre d’injection du chromatographe et les composés
volatils sont analysés par GC-FID. Les composés volatils émis par les deux épidermes du
même pétale sont ainsi successivement analysés. L’expérience est répétée plusieurs fois et
aucune différence significative n’est observée dans l’émission des deux épidermes (Fig. 28B).
Ce résultat prouve que l’épiderme inférieur émet des composés volatils de la même façon que
l’épiderme supérieur.
c. La localisation tissulaire d’une enzyme responsable de la synthèse

du DMT
L’orcinol-O-méthyltransférase (OOMT) est une enzyme qui intervient dans les
dernières étapes de la synthèse du DMT, appartenant à la famille des composés aromatiques
et conférant une 'odeur de thé’ au parfum de certaines roses, notamment les roses d’origine
chinoise. La localisation tissulaire de l’OOMT par Western-blot dans les pétales de rose a été
réalisée par P. Hugueney (laboratoire RDP, ENS Lyon).
Les protéines du pétale entier, de l’épiderme supérieur et enfin de l’épiderme inférieur
sont extraites à partir de pétale de la variété ‘Anna’ qui synthétise des quantités très
importantes de DMT et dont les épidermes sont facilement pelés. La figure 28C montre que
l’OOMT est présente dans les deux épidermes du pétale de rose.
Résultats 128
1400 Epiderme
supérieur
µg.g-1 PF 1200
1000
800
B 600
400 10 µm
200 Parenchyme
0
supérieur
épiderme
épiderme
inférieur
supérieur +
parenchyme
parenchyme
pétale entier
inférieur +
épiderme
épiderme
A
Epiderme
18 10 µm inférieur
-2 -1
16
ng.mmcamphre.mm .h
14
12
-2 -1
.h
10
Épiderme supérieur
Épiderme inférieur
8 C
ng équivalent
Pétale entier
4
2
Témoin
0
épiderme épiderme
supérieur inférieur
B
Figure 28 : Analyse des composés volatils extraits (A) dans les tissus du pétale de la
variété 'Baronne Edmond de Rothschild' au stade BTO ou émis (B) par les deux faces
d’un pétale de la variété 'The Mac Cartney rose' au stade BTO. Pour B, la moyenne a été
faite sur 4 analyses et les barres représentent l’erreur standard. C, localisation par Western-
blot de l’OOMT de rose, impliquée dans les dernières étapes de la synthèse du DMT (P.
Hugueney, RDP, ENS de Lyon). 5 µg de protéines totales extraites des pétales de la variété
‘Anna’ sont déposées dans chaque puits ; témoin, protéine recombinante purifiée.
Résultats 129
Etant donné que des quantités équivalentes de protéines sont déposées dans chaque puits,
l’OOMT est présente dans les deux épidermes à des niveaux équivalents.
En conclusion, les trois expériences décrites ci-dessus montrent que les deux
épidermes du pétale de rose produisent et émettent des composés volatils et renferment une
enzyme responsable de la synthèse de ces composés.
3. Les structures cellulaires du pétale

La littérature est riche d’études cytologiques ayant pour but de mettre en évidence des
structures spécifiques de cellules sécrétrices, notamment dans les trichomes sécréteurs. Par
exemple, les glandes peltées des Lamiacées, productrices de composés terpéniques, se
caractérisent par une prolifération intense du réticulum endoplasmique et par un très grand
nombre de leucoplastes (Ascensao et al., 1997 ; Turner et al., 2000a). Nous avons donc utilisé
la MET afin de savoir si des structures spécifiques sont mises en place dans les pétales de rose
au cours du développement floral, parallèlement à la production de composés volatils.
a. Les structures caractéristiques des pétales de rose aux stades BO,

BTO et FE
Au stade BO, les cellules de l’épiderme supérieur du pétale contiennent de nombreux
plastes renfermant plusieurs grains d’amidon dont les tailles sont variables d’un plaste à
l’autre (Fig. 29C). Au stade BTO, la paroi des cellules de l’épiderme supérieur du pétale
forme un réseau à l’intérieur de la cuticule (Fig. 29A). Ce stade se caractérise également par
l’abondance de corps de Golgi associés à de nombreuses vésicules (Fig. 29B), ainsi que par
de nombreuses mitochondries.
Au stade FE, quand la fleur émet le maximum de composés volatils, les amyloplastes
sont pratiquement absents du cytoplasme des cellules de l’épiderme supérieur du pétale. Ce
stade se caractérise par l’abondance de plastes renfermant de nombreuses inclusions
lipidiques osmiophiles denses aux électrons, les plastoglobules (Fig. 29E et G). On observe
parfois à ce stade des plastes renfermant à la fois de l’amidon et des plastoglobules (Fig.
29D). A proximité des plastes, le réticulum endoplasmique forme des empilements, auxquels
sont associées des vésicules de réticulum (Fig. 29F). Des enroulements membranaires,
Résultats 130
p
c
?
† a
p v
A B C
p
p
a p
* *
D E F
a vl
? p ? v
v vl ? ? pla
p
v v
p
G H I
Figure 29 : Micrographies électroniques à transmission des cellules de l’épiderme
supérieur du pétale de rose. A et B, cellules de l’épiderme supérieur du pétale de la variété
‘Papa Meilland’, stade BTO ; C, cellules de l’épiderme supérieur du pétale de la variété
‘Alister Stella Gray’, stade BO ; D, cellule de l’épiderme supérieur du pétale de la variété
‘Royal Red’, stade FE ; E, cellule de l’épiderme supérieur du pétale de la variété ‘The Mac
Cartney rose’, stade FE ; F, cellule de l’épiderme supérieur du pétale de la variété ‘Paul
Ricard’, stade FE ; G, cellule de l’épiderme supérieur du pétale de la variété ‘Alister Stella
Gray’, stade FE ; H, cellule de l’épiderme supérieur du pétale de la variété ‘Alister Stella
Gray’, stade FE ; I, cellule de l’épiderme supérieur du pétale de la variété ‘Papa Meilland’,
stade FE. c, cuticule ; p, paroi ; pl, plaste ; a, amidon ; v, vacuole ; pla, plasmodesmes ; vl,
vésicules lipidiques ; *, plastoglobules ; †, vésicules golgiennes ; fm, figure de myéline ;
flèche, vésicules de réticulum ; ☼, corps multivésiculaires. Les barres représentent une
échelle de 0,1 µm (B et F), 0,5 µm (A, D, E, H et I) et 1 µm (C et G).
Résultats 131
rappelant des figures de myéline, sont également observés (Fig. 29G). La présence de
nombreuses vésicules lipidiques au contenu dense caractérise également ce stade (Fig. 29H et
I). Au niveau de la membrane plasmique, de nombreuses invaginations sont visibles, ainsi
que, parfois, de nombreuses vésicules regroupées, formant des corps multivésiculaires (Fig.
29H et I).
Les organites présents dans l’épiderme inférieur des pétales de rose sont les mêmes
que ceux décrits ci-dessus dans l’épiderme supérieur.
b. La localisation subcellulaire des terpènes

Nos expériences montrent que chez Rosa x hybrida, il n’existe pas de structures
spécialisées dans la production du parfum : les deux épidermes du pétale produisent et
émettent les composés volatils. Afin de localiser les terpènes à l’intérieur des cellules de ces
deux épidermes, la coloration au réactif de NADI est utilisée. Cette coloration permet de
différencier des inclusions lipidiques (coloration bleue) de celles renfermant des terpènes
(coloration violette).
La coloration au réactif de NADI est mise en oeuvre sur les pétales frais de
nombreuses roses, parfumées et non parfumées. Il est nécessaire de choisir des variétés de
couleur pâle ou blanche parce que les anthocyanes gênent l’observation de la coloration au
NADI. Dans les cellules des épidermes des pétales de toutes les roses, de nombreuses
vésicules lipidiques de petite taille sont visibles et colorées en bleu (Fig. 30A et B).
Dans les cellules de l’épiderme supérieur d’un pétale d’une rose parfumée produisant
des terpènes, des vésicules plus grosses colorées en violet sont observées, ce qui indique un
contenu terpénique (Fig. 30C). Ces vésicules sont également visibles dans les cellules de
l’épiderme inférieur. Elles ne sont jamais observées dans les cellules des pétales de roses
contenant peu ou pas de terpènes. La présence de ces gouttelettes lipidiques est donc liée à la
production et/ou au stockage des composés terpéniques. Elle confirme également que les deux
épidermes renferment ce type de composés.
C. Les différences entre les roses parfumées et les roses non parfumées
Certaines roses, notamment celles cultivées pour la fleur coupée sont quasiment
dépourvues de parfum (Gudin, 1995). Nous souhaitions savoir cette absence de parfum était
due au fait que ces roses produisent peu ou pas de composés volatils, ou bien si elle reflétait
un défaut dans l’émission des composés volatils.
Résultats 132
A ?
?
B C
Figure 30 : Micrographies optiques après une coloration avec le réactif de NADI de

cellules de l'épiderme supérieur de pétales de la variété ' Sonia Rykiel' (A et B) et de la
variété 'Alister Stella Gray' (C), aux stade BTO. Flèches rouges, vésicules lipidiques ; ►,
vésicules lipidiques contenant des terpènes. Les barres représentent une échelle de 10 µm.
Résultats 133
1. Les composés volatils d'une rose inodore
La variété ‘Black Baccara’ est commercialisée par la firme Meilland Richardier pour
le marché de la fleur coupée. Elle est considérée comme pratiquement inodore. Les composés
volatils extraits à partir des pétales et émis par les fleurs de cette variété au cours de son
développement floral sont analysés de la même façon que ceux de la variété ‘Papa Meilland’
(cf. § A-3). La figure 31 et le tableau 13 présentent les résultats obtenus. Les quantités de
composés volatils extraites chez la variété ‘Black Baccara’ sont beaucoup plus faibles que
celles extraites chez la variété ‘Papa Meilland’, au même stade de développement. Ainsi, au
stade BTO/FE, les pétales de la variété ‘Papa Meilland’ renferment 428,2 µg.g-1 PF de
composés volatils contre 85,5 µg.g-1 PF de composés volatils chez la variété ‘Black Baccara’,
soit une quantité de composés volatils 6 fois moins importante. Les composés volatils majeurs
extraits des pétales de la variété ‘Black Baccara’ sont le DMT et des dérivés d’acides gras.
Les pétales renferment également une grande quantité d’hydrocarbones à longue chaîne.
Aucun alcool monoterpénique n’est détecté.
Tout au long de son développement floral, la variété ‘Black Baccara’ émet
majoritairement du DMT, dans des quantités très faibles. En effet, les quantités de composés
volatils émis sont 27 fois moins importantes que celles de la variété ‘Papa Meilland’ au même
stade. Parmi ces composés volatils émis, on trouve également de l’eugénol et du
méthyleugénol, absent des extraits. Leur présence s’explique par le fait que l’analyse de
l’émission des composés volatils est réalisée sur la totalité de la fleur. Ces deux composés
volatils, et tout particulièrement l’eugénol, sont volatils spécifiques des étamines chez ces
roses Hybrides de Thé (cf § A.1). Même si, tout comme pour la variété ‘Papa Meilland’,
l’émission des composés volatils est maximale au stade BTO/FE, elle est presque aussi
importante au stade BO. De plus, le rapport entre les quantités de composés volatils émis et la
concentration en composés volatils dans les pétales de la variété ‘Black Baccara’ est faible par
rapport à celui observé chez la variété ‘Papa Meilland’. En effet, les pétales de la variété
‘Papa Meilland renferment, au stade BTO/FE, 6 fois plus de composés volatils que ceux de la
variété ‘Black Baccara’ mais les fleurs émettent 27 fois plus de composés. Il semble donc que
la variété inodore produit très peu de composés volatils et en émet des quantités encore plus
faibles.
Par ces expériences, nous pouvons conclure que la variété ‘Black Baccara’ est capable
de synthétiser de petites quantités de certains composés volatils, comme le DMT. Mais pour
des raisons inconnues, cette variété n’est pas capable de produire et d’émettre les composés
Résultats 134
A B
120 10
9
100 8
-1
7
µg.fleur-1 .h
80
µg.g -1 PF
6
60 5
4
40
3
20 2
1
0 0
BJO BO BT O/FE FS BJO BO BT O/FE FS
Figure 31 : Evolution des composés volatils extraits des pétales (A) et émis par les fleurs
(B) au cours du développement floral de la variété ‘Black Baccara’. Les barres d’erreur
représentent l’erreur standard.
Tableau 13 : Composés volatils majeurs extraits des pétales (EX) et émis par les fleurs
(HS) de la variété ‘Black Baccara’ au cours de son développement floral. Pour
l’extraction, les quantités sont exprimées en µg.g-1 PF +/- erreur-standard ; pour le headspace,
les quantités sont exprimées en µg.fleur-1.h-1.
composés stade
BJO BO BTO/FE FS
HS EX HS EX HS EX HS EX
dérivés d’acides gras 0,1 21,1 0,2 13,7 0,1 10,5 0,2 8,1
monoterpènes 0,3 17,4 0,0 10,3 0,0 6,7 0,0 3,2
DMT 0,0 0,0 0,8 8,7 0,8 18,5 0,5 1,1
méthyleugénol 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,0
hydrocarbones à longue
0,0 9,6 0,0 39,2 0,1 44,9 0,0 3,6
chaîne
composés non identifiés 0,6 0,0 0,4 3,5 0,4 5,0 0,5 11,6
0,9 48,0 1,4 75,3 1,5 85,5 1,2 27,7
composés totaux
+/-0,5 +/- 4,9 +/-0,7 +/- 8,8 +/-0,8 +/-10,5 +/-1,0 +/- 3,5
Résultats 135
volatils caractéristiques des roses Hybrides de Thé parfumées, les alcools monoterpéniques et
le 2-phényléthanol.
2. La structure du pétale des roses non parfumées

L’étude cytologique décrite au § B a également été conduite sur plusieurs roses
décrites comme très peu ou pas parfumées (‘Black Baccara’, ‘Rouge Meilland’, ‘Royal red’).
Que ce soit en microscopie optique sur coupes semi-fines ou en microscopie électronique sur
coupes ultra-fines, ces études n’ont pas permis pas de mettre en évidence de différences très
nettes entre les deux types de roses, parfumées ou non. Par exemple, tout comme chez les
roses parfumées, le pétale de la variété ‘Black Baccara’ est constitué de deux épidermes,
d’une couche sous-épidermique et d’un parenchyme lacuneux. Les cellules de l’épiderme
supérieur évoluent au cours de leur développement : petites et de forme régulière aux stades
BF et BJO, elles deviennent coniques papilleuses aux stades BO, BTO et FE. Les cellules du
pétale de cette variété renferment également de l’amidon sous forme d’amyloplastes aux
stades BJO, BO et BTO. Ces plastes évoluent ensuite en plastes contenant des plastoglobules.
La différence entre roses parfumées et non parfumées ne peut donc pas être expliquée
par une absence de structures spécifiques de production des terpènes. Nous avons suggéré
qu’il existait une différence entre les ratios extraction/émission pour les deux variétés étudiées
au § B.2 et C.1, ‘Black Baccara’ et ‘Papa ‘Meilland’. Cette différence entre roses parfumées
et non parfumées doit être confirmée par l’analyse d’autres variétés. Néanmoins, une des
hypothèses, fréquemment avancée pour expliquer ce phénomène, est que la cuticule présente
à la surface des épidermes représente une barrière à l’émission des composés volatils
(Goodwin, 2003). Cette cuticule particulière aurait été sélectionnée parallèlement à une
longue tenue en vase.
Pour tester cette hypothèse, l’épaisseur de la cuticule des cellules de l’épiderme
supérieur des pétales des variétés ‘Papa Meilland’ et ‘Black Baccara’ est mesurée sur des
micrographies électroniques à transmission. Brièvement, sur une même micrographie, 10
mesures d’épaisseur sont faites, permettant de donner une valeur moyenne de l’épaisseur de la
cuticule sur cette photographie. Pour chaque variété, dix micrographies de cellules de
l’épiderme supérieur de pétales prélevés aux stades BTO et FE sont analysées, provenant d’au
moins trois pétales différents.
Dans ces conditions d’analyse, aucune différence significative n’est observée puisque
pour les deux variétés, la cuticule des cellules de l’épiderme supérieur du pétale a une
épaisseur de 0,5 +/- 0,1 µm.
Résultats 136
3. Les ressources carbonées dans le pétale de rose
L’étude cytologique de la structure du pétale au cours du développement floral montre
que les pétales aux stades BJO, BO et BTO contiennent de nombreux et volumineux
amyloplastes. Ces organites étant beaucoup moins nombreux au stade FE, il se produit donc
une dégradation de l’amidon, parallèlement à l’émission du parfum. Les composés volatils,
notamment les monoterpènes, dérivent du glucose. Il est donc possible que l’absence de
monoterpènes chez les roses non parfumées soit liée à une limitation en ressources carbonées
sous forme d’amidon ou de D-glucose libre.
Pour tester cette hypothèse, la quantité d’amidon accumulée dans les pétales est tout
d’abord analysée chez la variété ‘The Mac Cartney rose’ tout au long de son développement
floral. Chez cette variété, la quantité d’amidon est maximale aux stades BJO et BO (Fig. 32)
et les pétales au stade FE renferment des quantités très faibles d’amidon. Ceci confirme les
observations de microscopie et met en évidence une dégradation de l’amidon dans le pétale
parallèlement à une augmentation de l’émission du parfum au cours du développement floral.
Afin de savoir s’il existe une relation entre quantités d’amidon et quantités de
monoterpènes dans le pétale, onze variétés de la firme Meilland Richardier, présentant des
caractéristiques de parfum différentes, sont analysées à la fois pour leur composition en
composés volatils et pour les quantités d’amidon qu’elles renferment. Toutes les plantes sont
cultivées en champ dans des conditions équivalentes. Les résultats sont présentés dans le
tableau 14 et la figure 33. Les composés volatils extraits des pétales des onze variétés,
prélevés sur des fleurs au stade BTO, sont analysés par GC-FID. Les variétés décrites comme
inodores (‘Black Baccara’, ‘Rouge Meilland’, ‘La Sevillana’) contiennent de très faibles
quantités de composés volatils, et le composé majoritaire est le plus souvent le DMT (tableau
14). Sur la base des quantités de composés monoterpéniques extraits des pétales, nous
pouvons définir trois catégories de roses :
− Classe I : variétés sans monoterpènes : ‘Black Baccara’, ‘La Sevillana’,
‘Rouge Meilland’, ‘Paul Ricard’ et ‘Mme Antoine Meilland’ ;
− Classe II : variétés dont les quantités de monoterpènes sont inférieures à
100 ng.mg-1 PF : ‘Marcel Pagnol’, ‘Christophe Colomb’ et ‘Panthère
rose’ ;
− Classe III : variétés renfermant des quantités très importantes de
monoterpènes (> 100 ng.mg-1 PF) : ‘The MacCartney rose’, ‘Charles de
Gaulles’ et ‘Papa Meilland’.
Résultats 137
25
mg amidon.g PF
20
-1
15
10
0
BF BJO BO FE
Stades de développement
Figure 32 : Evolution de la quantité d’amidon dans les pétales de la variété ‘The Mac
Cartney rose’ au cours de son développement floral. Les barres représentent l’erreur
standard, calculée sur 3 répétitions.
Résultats 138
Ces catégories établies sur la base des quantités de monoterpènes se superposent à des
catégories établies sur la base de la quantité totale de composés volatils. Ainsi, les pétales de
la variété ‘Paul Ricard’ contiennent peu de composés terpéniques et de façon générale peu de
composés volatils ; par opposition, ceux de la variété ‘Papa Meilland’ contiennent de très
grandes quantités de terpènes et de façon générale une quantité très importante de composés
volatils (tableau 14). Ces variétés riches en monoterpènes sont également celles qui sont
données comme très parfumées dans les catalogues des obtenteurs.
Pour chacune de ces variétés, le contenu en amidon est analysé à deux stades de
développement : BJO et BTO. Pour la majorité des variétés, les quantités d’amidon sont plus
importantes au stade BJO (Fig. 33). Les résultats obtenus ne permettent pas d’établir une
corrélation entre les quantités d’amidon présentes aux stades BJO et BTO et la capacité à
produire des composés volatils au stade BTO.
Ainsi, au stade BJO, les pétales de la variété ‘Christophe Colomb’ contiennent une
quantité importante d’amidon (48,5 mg.g-1 PF) alors que la quantité de monoterpènes présente
dans les pétales au stade BTO est faible (37 µg.g-1 PF). Par opposition, les pétales de la
variété ‘Papa Meilland’ qui contiennent une quantité très importante de monoterpènes (446
µg.g-1 PF) au stade BTO accumulent peu d’amidon (10,6 mg.g-1 PF) au stade BJO.
Par la technique de dosage employée, il est également possible d’analyser les quantités
de D-glucose libre dans les pétales. En effet, pour être mobilisé pour la biosynthèse, l’amidon
doit être transformé en D-glucose libre. Pour toutes les variétés étudiées, la quantité de D-
glucose libre est plus élevée au stade BTO qu’au stade BJO (Fig. 33). Cependant, il n’existe
aucune corrélation entre la quantité de D-glucose libre et la quantité de monoterpènes ou de
composés totaux.
II. Isolement de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des

monoterpènes
La compréhension de la production et de l’émission du parfum chez la rose passe par
la caractérisation des enzymes responsables de la synthèse des composés volatils. Les
monoterpènes, en particulier les alcools monoterpéniques, représentent la plus grande
proportion des composés volatils chez Rosa x hybrida. Ils sont synthétisés à partir de
Résultats 139
Tableau 14: Analyse par extraction de la composition du parfum de 11 variétés de roses
prélevées au stade BTO. Les quantités sont exprimées en µg.g-1 PF.
variétés de R. x hybrida L.
‘The Mac Cartney rose'

'Christophe Colomb'
'Charles de Gaulle'
'Mme A.Meilland'
'Rouge Meilland'
'Marcel Pagnol'
'Black Baccara'
'Papa Meilland'
'Panthère rose'
'La Sevillana'
'Paul Ricard'
dérivés d'acides gras 1 0 5 6 1 0 37 4 11 4 4
monoterpènes 0 0 0 0 31 37 0 75 267 238 446
sesquiterpènes 0 4 0 0 15 40 4 69 31 53 0
DMT 14 0 19 17 3 0 0 0 0 0 0
Autres composés aromatiques 0 14 0 1 0 0 102 14 5 84 69
Composés totaux 16 17 23 24 50 77 143 161 314 379 519
A B
70 600 90 600
80
60 500 500
70
mg amidon.g-1 PF
50
µg.g-1 PF
mg glucose.g-1 PF
µg.g-1 PF
400 60 400
40 50
300 300
30 40
200 30 200
20
20
10 100 100
10
0 0 0 0
'La Sevillana'
'La Sevillana'
'Paul Ricard'
'Black baccara'
'Rouge Meilland'
'Marcel Pagnol'
'Charles de Gaulle'
'Black baccara'
'Paul Ricard'
'Marcel Pagnol'
'Rouge Meilland'
'Charles de Gaulle'
'Panthère rose'
'Panthère rose'
'Christophe Colomb'
'Mme A.Meilland'
'Papa Meilland'
'Mme A.Meilland'
'Christophe Colomb'
'Papa Meilland'
'The Mac Cartney rose'

'The Mac Cartney rose'
BJO BTO Composés totaux BJO BTO Composés totaux
Figure 33 : Evolution de l'amidon (A) et du D-glucose libre (B) en relation avec la

quantité de composés totaux extraits des pétales au cours du développement floral de 11
variétés de rose. Pour les composés totaux, les pétales sont prélevés au stade BTO.
Résultats 140
l’isopentényl diphosphate (ou IPP), produit par la voie plastidiale de synthèse dont la
première étape spécifique est une réaction catalysée par la 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate
réductoisomérase (DXR).
L’IPP et son isomère le diméthylallyl diphosphate (DMAPP) sont ensuite assemblés
‘tête-bêche’ dans une réaction catalysée par la géranyl diphosphate synthase (GPPS) pour
donner le géranyl diphosphate (GPP). C’est pourquoi nous avons choisi d’étudier ces deux
enzymes clés dans la synthèse des monoterpènes.
A. La 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate réductoisomérase ou DXR
1. La DXR et les terpènes du pétale de rose

La fosmidomycine, ou acide 3-(N-formyl-N-hydroxyamino)-propylphosphonique, est
un agent antibactérien potentiel contre la plupart des bactéries Gram-négatives et quelques
bactéries Gram-positives. Sa structure mime celle du 1-désoxy-D-xylulose 5-phosphate
(DXP), intermédiaire de la voie MEP de synthèse de l’IPP, et substrat de la DXR. Il existe
une compétition entre la fosmidomycine et le DXP au niveau du site de liaison du substrat de
la DXR. De nombreuses études ont démontré que cette molécule est un inhibiteur spécifique
des DXR végétales et bactériennes (Engprasert et al., 2005).
Afin d’apporter une preuve de l’implication de la voie MEP de synthèse de l’IPP, et
plus particulièrement de la DXR, dans la biosynthèse des terpènes du pétale de rose, nous
avons mis au point un système d’infiltration de ces pétales qui permet de suivre l’effet de
l’inhibition de la DXR par la fosmidomycine sur la production des composés volatils.
Pour définir la concentration optimale de fosmidomycine et étudier le comportement
des pétales après infiltration, une expérience préliminaire est réalisée sur la variété ‘Pariser
Charme’. Les résultats montrent qu’un traitement à la fosmidomycine 100 µM, dans les
conditions d’expérience, entraîne une diminution de la quantité de monoterpènes dans les
pétales au bout de 24 h.
Afin de valider ce résultat, une expérience est réalisée sur la variété ‘Papa Meilland’.
Dans cette deuxième expérimentation, quatre fleurs au stade BTO sont utilisées. Pour chaque
fleur, les pétales sont étudiés par paire suivant une cinétique commençant 24 h après
l’infiltration : un pétale est infiltré avec une solution de Tris HCl 10 mM pH 7,5 et l’autre
pétale est infiltré avec la fosmidomycine 100 µM. Les composés volatils présents dans les
pétales sont extraits par l’hexane et analysés par GC-FID.
Cette deuxième expérience permet de confirmer les résultats obtenus précédemment, à
savoir qu’un traitement à la fosmidomycine entraîne une diminution faible mais significative
Résultats 141
(18 % après 30 h par exemple) de la quantité de monoterpènes produits par les pétales (Fig.
34). A l’opposé, les quantités de composés aromatiques ne sont pas affectées par le
traitement.
La fosmidomycine inhibant spécifiquement l’activité DXR, les résultats montrent que
cette enzyme est bien présente dans les cellules du pétale de rose et qu’elle intervient dans la
production des monoterpènes chez cette fleur.
2. L'isolement du gène RhDXR

Une stratégie basée sur des homologies de séquence est utilisée afin de rechercher le
gène codant pour la DXR de rose. Trois séquences nucléotidiques connues codant pour des
DXR sont alignées à l’aide du logiciel DNAstar (DNASTAR Inc.) afin de définir des
oligonucléotides dégénérés dans les zones les plus conservées (annexe 5). Les séquences
utilisées sont les séquences de Mentha x piperita (accession AF116825), d’Arabidopsis
thaliana (accession AY091405) et de Catharanthus roseus (accession AF250235).
Parmi les nombreux couples d’oligonucléotides dégénérés utilisés, le couple dx1/dx6
(annexe 1) permet d’amplifier un fragment initial de 788 paires de base (pb) à partir d’ADNc
obtenu à partir d’ARN de pétales de la variété ‘Rouge Meilland’, prélevés sur une fleur au
stade BJO. Grâce à des réactions de RACE-PCR, les extrémités 3’ et 5’ du gène sont isolées.
Des oligonucléotides spécifiques sont définis à partir de la séquence théorique complète de
façon à pouvoir amplifier l’ADNc du gène dans sa totalité.
La séquence nucléotidique ainsi obtenue a une longueur de 1559 pb, correspondant à
une ORF de 1413 pb. La protéine correspondante est constituée de 471 acides aminés, soit
une masse moléculaire calculée de 51,3 kDa et un pI de 6,4 (Fig. 35). Cette séquence est
comparée avec le logiciel Blast à toutes les séquences enregistrées dans les bases de données.
Les scores d’identité avec les autres DXR connues chez les plantes sont donnés dans le
tableau 15. La séquence protéique déduite de l’ADNc isolé chez la rose présente un niveau
d’identité très élevé avec d’autres DXR connues (de 78,3 % avec la DXR de Mentha x
piperita à 85,5 % avec la DXR d’Arabidopsis thaliana). D’une manière générale, les DXR
présentent entre elles des pourcentages d’identité très élevés et sont des protéines
extrêmement conservées chez les végétaux. La séquence isolée chez la rose est appelée
RhDXR quand il s’agit de la séquence nucléotidique et RhDXR quand il s’agit de la séquence
protéique, conformément aux règles de nomenclature.
Résultats 142
A
300
250
µg.g -1 PF
200
150
100
50
0
24 30 48 54
heures après infiltration
B
60
50
µg.g -1 PF
40
30
20
10
0
24 30 48 54
C
200
150
µg.g -1 PF
100
50
0
24 30 48 54
T ris-HCl 10 mM pH 7,5 Fosmidomycine 100 µM
Figure 34 : Influence d'un traitement à la fosmidomycine sur les composés volatils

extraits des pétales de la rose 'Papa Meilland' au stade BTO. A, composés totaux ; B,
composés aromatiques ; C, monoterpènes. Les analyses ont été faites sur 4 fleurs différentes
et les barres représentent l’erreur-type.
Résultats 143
L’alignement de la séquence RhDXR avec les séquences DXR de A. thaliana, C.
roseus et M. x piperita permet de retrouver des domaines conservés suivants (Fig. 35) :
− Un site de coupure d’une séquence putative d’adressage aux plastes dont le
motif est CSX (avec X = A, V ou M),
− un domaine riche en proline dont le motif est P(P/Q)PAWPG(R/T)A
− un site putatif de liaison au NADP dont le motif est GSTGSIG,
quatre acides aminés indispensables pour la réaction de réducto-isomérisation : le
groupement glutamate en position 304 et les groupements histidine en position 214, 271 et
314.
3. La localisation subcellulaire de la protéine RhDXR

Les alignements de séquences DXR connues avec celle de la rose mettent en évidence
la présence éventuelle d’un site de coupure d’un peptide d’adressage plastidial. Deux logiciels
de prédiction d’adressage (ChloroP et TargetP, disponibles sur le site internet :
http://www.expasy.ch/tools/) sont utilisés afin de vérifier cet adressage. Le logiciel ChloroP met
en évidence dans la protéine RhDXR une séquence de 48 acides aminés d’adressage aux
plastes, mais ne permet pas de prédire avec certitude cet adressage. Par contre, le logiciel
TargetP prédit avec une probabilité de 77 % que la protéine RhDXR possède une séquence
peptidique de 48 acides aminés qui permet un adressage aux plastes. Même si ces
programmes informatiques prédisent une localisation plastidiale de la DXR, il était nécessaire
de démontrer cette localisation in vivo. La technique d’expression transitoire d’un gène est
utilisée pour étudier la localisation subcellulaire de la DXR fusionnée à la GFP. Deux
techniques de transformation sont mises en oeuvre : la transformation par biolistique et la
transformation par infiltration d’A. tumefaciens.
a. Transformation par biolistique

La technique d’expression transitoire après transformation par biolistique est une
technique dont l’efficacité est réduite. En effet, le nombre de cellules transformées dans les
épidermes d’oignon est aléatoire d’un bombardement à l’autre. Néanmoins, nous avons
observé des cellules transformées avec les deux constructions : la construction témoin dans
laquelle la GFP est fusionnée à un peptide d’adressage plastidial caractérisé (TpGFP) et la
construction pDXR-GFP dans laquelle les 119 premiers acides aminés de la protéine RhDXR
sont fusionnés à la GFP dans le vecteur pCKgfpS65T (Reichel et al., 1996).
Résultats 144
*
* *
Figure 35 : Alignement de la séquence de RhDXR et de 3 autres séquences de DXR

connues ; encadré en rouge, site putatif de coupure de la séquence d’adressage aux plastes ;
encadré en bleu, domaine riche en proline ; encadré en vert, site de liaison au NADPH ; *, 4
acides aminés impliqués dans la liaison du DXP.
Tableau 15 : Scores d'identité protéique (logiciel BIOEDIT sur la base de la matrice de

similitude PAM250) de différentes DXR connues et de la séquence isolée chez la rose (la
séquence totale des protéines avec le peptide d’adressage aux plastes a été prise en
compte). Rh, Rosa x hybrida ; At, Arabidopsis thaliana ; Mp, Mentha x piperita ; Cr,
Catharanthus roseus ; Le, Lycopersicum esculentum ; Sr, Stevia rebaudia ; Aa, Artemisia
annua ; Hv, Hordeum vulgare ; Os, Oriza stavia ; Lu, Linum usitatissimum ; Zm, Zea mays
RhDXR AtDXR MpDXR CrDXR LeDXR SrDXR AaDXR HvDXR OsDXR LuDXR ZmDXR
RhDXR - 0.855 0.783 0.834 0.845 0.801 0.795 0.814 0.840 0.808 0.840
AtDXR - 0.759 0.813 0.827 0.780 0.775 0.800 0.828 0.796 0.828
MpXR - 0.792 0.803 0.762 0.755 0.745 0.744 0.751 0.752
CrDXR - 0.869 0.828 0.815 0.807 0.802 0.824 0.817
LeDXR - 0.813 0.807 0.802 0.824 0.828 0.841
SrDXR - 0.871 0.753 0.776 0.809 0.778
AaDXR - 0757 0.766 0.817 0.768
HvDXR - 0.860 0.764 0.880
OsDXR - 0.777 0.913
LuDXR - 0.783
ZmDXR -
Résultats 145
Les cellules de l’épiderme d’oignon sont grandes et il est donc facile d’observer les
organites. Avec le témoin TpGFP, la fluorescence se manifeste sous la forme de très
nombreux points d'environ 5 µm de diamètre à l’intérieur de la cellule, correspondant aux
plastes (Fig. 36A). Ils sont parfois reliés entre eux par des structures correspondant
probablement aux stromules (Pyke et Howells, 2002). Les cellules transformées avec la
construction pDXR-GFP présentent le même type de marquage fluorescent, c’est-à-dire des
points d'environ 5 µm de diamètre, reliés entre eux par des stromules (Fig. 36B).
L’efficacité de transformation des cellules de l’épiderme supérieur des pétales de roses
est beaucoup plus réduite que celle des cellules de l’épiderme d’oignon. Néanmoins, quelques
très rares cellules sont observées qui présentent une fluorescence sous la forme de points
d’environ 1 µm de diamètre (Fig. 36C). Ces résultats obtenus sur les pétales de rose sont donc
peu probants.
Cependant, si l’on prend en compte les résultats obtenus sur l’épiderme d’oignon,
l’observation des marquages fluorescents confirme les prédictions des logiciels de bio-
informatiques : la DXR de rose est adressée aux plastes.
b. Transformation par infiltration d’A. tumefaciens

Il est également possible de faire exprimer à des cellules de façon transitoire des gènes
grâce à une technique d’infiltration d’une souche d’A. tumefaciens renfermant le vecteur
d’expression dans lequel le gène d’intérêt est fusionné à la GFP. Cette technique est utilisée
en routine sur le tabac pour un grand nombre d’études de localisation subcellulaire (Batoko et
al., 2000). Nous avons donc tenté de transposer cette technique chez la rose.
Dans un premier temps, les constructions et la technique d’infiltration sont testées sur
les feuilles du tabac Nicotiana tabacum SR1 cv ‘petit Havana’. Lorsque la GFP n’est pas
fusionnée à une séquence d’adressage, la fluorescence est localisée à la périphérie de la
cellule, dans le cytoplasme. Le noyau possède également une fluorescence importante due à la
forte intensité de l’expression (Fig. 36D). Dans le cas de la fusion DXR-GFP, la fluorescence
est restreinte aux plastes (Fig. 36E). Lorsque les mêmes constructions sont infiltrées dans les
pétales de rose, les résultats obtenus sont les mêmes, c’est-à-dire un marquage localisé dans
les plastes (Fig. 36F). Par cette technique, comme pour la transformation transitoire par
biolistique, l’efficacité de la transformation de la rose est cependant beaucoup plus réduite
que celle de la transformation de tabac.
Résultats 146
C
A B D
E F
Figure 36: Localisation subcellulaire de la DXR de rose dans différents tissus végétaux.
A, expression transitoire de la construction témoin TpGFP dans une cellule d’épiderme
d’oignon après transformation par biolistique ; B, expression transitoire de la construction
pDXR-GFP dans une cellule d’épiderme d’oignon après transformation par biolistique ; C,
expression transitoire de la construction pDXR-GFP dans une cellule d’épiderme supérieur de
rose après transformation par biolistique ; D, expression transitoire de la GFP sans peptide
d’adressage après transformation d’une cellule d’épiderme de tabac par infiltration d’A.
tumefaciens ; E, expression transitoire de la construction DXR-GFP après transformation
d’une cellule d’épiderme de tabac par infiltration d’A. tumefaciens ; F, expression transitoire
de la construction DXR-GFP après transformation d’une cellule d’épiderme de rose par
infiltration d’A. tumefaciens. flèches, stromules. Les barres d’échelle représentent une échelle
de 50 µm pour A et B, 20 µm pour D et E, 5 µm pour F et 2 µm pour C.
Résultats 147
4. La caractérisation enzymatique de la DXR de rose
L’ADNc isolé à partir des pétales de rose correspond à une protéine dont la séquence
est fortement conservée chez les végétaux, la DXR. L’étude de la localisation subcellulaire de
cette protéine, ainsi que les logiciels bioinformatiques de prédiction d’adressage confirment
que la protéine est adressée aux plastes, lieux de la synthèse de l’IPP par la voie MEP dans
laquelle intervient la DXR. Toutes les données indiquent donc que la protéine codée par le
gène isolé chez la rose est une DXR. Afin de prouver qu’elle est fonctionnelle, une stratégie
de complémentation d'une souche d’E. coli déficiente en DXR est utilisée.
a. La production de la protéine RhDXR

Afin de réaliser les expériences de complémentation et de définir les paramètres
cinétiques de RhDXR, nous avons voulu savoir si elle était produite efficacement chez E. coli.
La production de la protéine RhDXR sans son peptide d’adressage est réalisée grâce à
des vecteurs d’expression commercialisés par QIAGEN permettant de fusionner la protéine
d’intérêt à une étiquette histidine soit en position N-terminale (pQE30), soit en position C-
terminale (pQE70). Dans les deux cas, deux formes de protéine de fusion sont obtenues : une
forme longue avec le domaine riche en proline spécifique des DXR eucaryotes, appelée DXR-
L, et une forme courte sans ce domaine, appelée DXR-S. Au total, quatre constructions sont
donc testées, DXR-L30, DXR-S30, DXR-L70 et DXR-S70 (Fig. 37A).
Les protéines sont tout d’abord extraites des bactéries sous forme dénaturée. Les
formes courtes DXR-S sont produites dans des quantités assez importantes, visibles après
coloration des protéines au bleu de comassie (Fig. 37B). Cependant, la production de la
protéine sous sa forme longue (DXR-L30) est très faible puisque qu’elle est difficilement
visible sur gel après coloration au bleu de Coomassie (Fig. 37C). Néanmoins, l’utilisation
d’un anticorps dirigé contre la queue poly-histidine permet de détecter sa présence parmi les
protéines bactériennes totales (Fig. 37D). La protéine DXR-L70 n’est pas détectée, même par
western blot (Fig. 37C et D).Il est à noter que dans le cas des constructions réalisées dans le
vecteur pQE30 dans lequel l’étiquette 6xHis est située en position N-terminale de la protéine,
d’autres protéines de taille inférieure à la taille attendue sont révélées par l’anticorps anti-
histidine. Ceci peut s’expliquer par le fait que la traduction peut être partielle, donnant des
protéines plus courtes mais néanmoins détectées par l’anticorps anti-histidine.
Lorsque l’on considère les formes courtes, DXR-S70 et DXR-S30, on constate que le
vecteur pQE70 permet de produire des quantités plus importantes de protéines recombinantes
que le vecteur pQE30 (Fig. 37B).
Résultats 148
A Domaine riche en proline
pQE30 DXR- pQE70 DXR-

B
vide S30 vide S70
PM ni i ni i ni i ni i
116 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
31 kDa
C DXR-L30 DXR-L70 D DXR-L30 DXR-L70

PM ni i ni i ni i ni i
116 kDa 116
97 kDa 97
66
66 kDa
45 kDa 45
31 kDa 31
Figure 37 : Production de quatre formes de DXR recombinante. A, Séquences protéiques

des formes courtes (DXR-S30 et DXR-S70) et des formes longues (DXR-L30 et DXR-L70)
de RhDXR ; B, Gel SDS-PAGE des formes courtes (DXR-S30 et DXR-S70) après extraction
en conditions dénaturantes ; C, Gel SDS-PAGE des formes longues (DXR-L30 et DXR-L70)
après extraction en conditions dénaturantes ; D, Western-blot avec un anticorps anti-histidine
pour visualiser la production des formes longues (DXR-L30 et DXR-L70). Gel SDS-PAGE
10 %, 7 µg de protéines bactériennes totales ont été déposées dans chaque puits avant (ni) et
après une induction par 1 mM d’IPTG pendant 3 h à 37°C (i). DXR-L30, forme longue de la
DXR dans le vecteur pQE30 ; DXR-L70, forme longue de la DXR dans le vecteur pQE70 ;
DXR-S30, forme courte de la DXR dans le vecteur pQE30 ; DXR-S70, forme courte de la
DXR dans le vecteur pQE70 ; PM, marqueur de poids moléculaire.
Résultats 149
1 2 3 4 5 6 7 8 9
200 kDA
116 kDA
97,4 kDA
66 kDA
45 kDA
31 kDA
21,5 kDA
14,5 kDA
Figure 38 : Purification sur résine Ni-NTA agarose en conditions dénaturantes (urée 8

M) de la protéine recombinante RhDXR possédant une étiquette poly-histidine en
position C-terminale (DXR-S70). 1, marqueur de poids moléculaire ; 2, culture non induite ;
3, protéines totales d’une culture induite par 0,5 mM IPTG à 37°C pendant 2h30 ; 4, fraction
non accrochée sur la résine Ni-NTA agarose ; 5, fraction de lavage 1 ; 6, fraction de lavage 2 ;
7, fraction d’élution 1 ; 8, fraction d’élution 2 ; 9, fraction d’élution 3.
Résultats 150
Nous avons donc tenté d’obtenir la protéine DXR-S70 et de la purifier. Cette
purification est possible seulement après extraction en conditions dénaturantes (Fig. 38). La
protéine est donc probablement produite sous la forme insoluble de corps d’inclusion.
Différentes conditions d’induction ont été testées pour tenter de remédier à ce problème : la
concentration en IPTG (0,1, 0,5 ou 1 mM), la température (37°C et 30°C), ainsi que la durée
de l’induction (de 3 à 6 h) ont été modifiées. Malgré tous ces tests, les conditions pour
l’obtention d’une protéine DXR recombinante soluble et en quantité importante n’ont pu être
définies.
Afin de savoir si une faible quantité de DXR-S70 est néanmoins produite sous forme
soluble, la purification en conditions natives de celle-ci est réalisée sur une résine de type BD-
Talon à partir de 2 L de culture induite pendant 4 h à 30 ou 37°C avec 0,5 mM d’IPTG. Après
purification, des fractions aliquotes des différentes fractions de purification sont analysées par
western blot avec un anticorps anti-histidine. Les signaux obtenus sont très faibles et il est
difficile de savoir si une fraction de la protéine DXRS-70 est présente sous forme soluble
dans les bactéries (données non montrées). Les paramètres de production de la protéine n’ont
donc pas pu être définis.
b. Stratégie utilisée pour la caractérisation enzymatique

La caractérisation fonctionnelle de la DXR est réalisée par une expérience de
complémentation. En effet, il existe une souche d’E. coli, EcAB1-2, chez laquelle le gène
DXR situé sur le chromosome est interrompu par l’insertion du marqueur TET, lui conférant
une résistance à la tétracycline. Bien que cette interruption soit létale, les cellules EcAB1-2
peuvent se multiplier sur un milieu additionné de 2C-méthyl-D-érythritol 4-phosphate (MEP),
produit normalement par la DXR (Rodríguez-Concepcíon et al., 2000). Dans les cellules
bactériennes, la voie du mévalonate (MEV) de synthèse de l’IPP n’existe pas. Les dernières
étapes de cette voie ont été introduites chez cette souche d’E. coli par génie génétique. Ainsi,
ces cellules peuvent se multiplier dans un milieu contenant du mévalonate via la voie MEV de
synthèse de l’IPP, indépendamment de la voie MEP, interrompue au niveau du gène DXR.
L’objectif de cette expérimentation est d’introduire le gène RhDXR dans les cellules
EcAB1-2, puis de les multiplier sur un milieu sans mévalonate ni ME (MEP déphosphorylé
qui est plus facilement transporté dans la bactérie que le composé phosphorylé). Si elles sont
capables de se multiplier dans ces conditions, le gène RhDXR introduit est capable de
restaurer leur auxotrophie vis-à-vis du MEP.
Résultats 151
c. Complémentation de la souche EcAB1-2 d’E. coli déficiente en
DXR
Les expériences de complémentation ont été réalisées par Eva Maria Urós-Gracia sous
la direction du Dr Manuel Rodríguez-Concepcíon de l’université de Barcelone (Espagne).
Les quatre constructions définies au paragraphe A.4.a sont introduites dans des
cellules bactériennes EcAB1-2. Dans un premier temps, les bactéries transformées avec les
vecteurs d’expression sont cultivées sur un milieu contenant du MEV. Les quatre souches
bactériennes exprimant chacune une forme de la DXR de rose se développent parfaitement
dans ces conditions : en présence de MEV, ce sont les dernières étapes de la voie MEV de
synthèse de l’IPP qui sont mobilisées pour le bon développement des cellules (Fig. 39). Les
cellules sont ensuite striées sur des boîtes ne contenant plus de MEV : seules les formes
longues (DXR-L30 et DXR-L70) de la protéine sont capables de restaurer avec efficacité la
fonction déficiente dans les cellules EcAB1-2 ; les formes courtes (DXR-S30 et DXR-S70) se
multiplient difficilement sur un milieu ne contenant pas de MEV (Fig. 39).
Ces expériences permettent de conclure que l’ADNc isolé chez la rose code pour une
DXR fonctionnelle puisqu’elle permet de restaurer la fonction déficiente dans les cellules
EcAB1-2. La complémentation étant beaucoup moins efficace avec la forme courte, le
domaine riche en résidus proline, présent dans les formes longues, est probablement
indispensable au bon fonctionnement de la protéine. Cependant, dans les cellules M15 d’E.
coli, nous n’avons pas réussi à produire les formes longues en quantité suffisante pour les
détecter sur gel de protéines, coloré au bleu de Coomassie. Comme la purification de la
protéine n’a pas été réalisée à partir de la souche EcAB1-2, on peut émettre deux hypothèses :
soit la protéine est produite en quantité beaucoup plus importante dans cette souche, soit la
faible quantité produite suffit pour la complémentation. Néanmoins, on ne peut pas exclure
que dans ces souches EcAB1-2 d’E.coli, la forme courte de la DXR soit produite en quantités
très faibles ou complètement insoluble, comme lorsqu’elle est produite dans les cellules M15
d’E. coli. Cette insolubilité pourrait être responsable de l’absence de restauration de fonction
dans les cellules déficientes en DXR.
5. Profils d’expression du gène RhDXR

La transcription du gène RhDXR a été étudiée par RT-PCR semi-quantitative afin de
déterminer s’il existe une corrélation entre la production de monoterpènes et l’expression du
gène dans les pétales de rose. Ainsi, l’expression du gène a été suivie d’une part dans
plusieurs tissus de la variété ‘The Mac Cartney rose’ dont le parfum est majoritairement
Résultats 152
DXR-L30
DXR-L70 DXR-S30
DXR-S70
Figure 39 : Complémentation de la souche EcAB1-2 d'E. coli déficiente en DXR avec

l'ADNc du gène RhDXR. +MEV, milieu contenant du mévalonate ; -MEV, milieu sans
mévalonate ; DXR-L30, forme longue de la DXR dans le vecteur pQE30 ; DXR-S30, forme
courte de la DXR dans le vecteur pQE30 ; DXR-L70, forme longue de la DXR dans le
vecteur pQE70 ; DXR-S70, forme courte de la DXR dans le vecteur pQE70.
Résultats 153
constitué de monoterpènes, et d’autre part au cours du développement floral de cette même
variété. L’expression de ce gène a également été étudiée chez d’autres variétés de rose
présentant des caractéristiques du parfum différentes : la variété ‘Papa Meilland’ dont le
puissant parfum est composé majoritairement de monoterpènes, la variété ‘Anna’ dont le
parfum plus discret est essentiellement constitué de composés aromatiques et la variété ‘Royal
Baccara’ qui est inodore.
Le gène codant pour la GAPDH de rose a été utilisé comme référence pour normaliser
les différents échantillons d’ADNc utilisés. Les réactions de RT-PCR semi-quantitatives ont
été réalisées plusieurs fois, transférées sur des membranes puis hybridées avec des sondes
spécifiques de chaque gène. La figure 40 représente les résultats obtenus pour une expérience.
Chez la variété ‘The MacCartney rose’, RhDXR est exprimé dans tous les organes
testés : feuilles matures, sépales, pistils, étamines et pétales (Fig. 40A). L’expression du gène
dans les feuilles matures est très faible. Nous n’avons pas testé son expression dans les
feuilles jeunes. Chez A. thaliana, AtDXR est exprimé plus intensément dans les feuilles jeunes
que dans les feuilles matures et que son expression dans les feuilles est moins importante que
dans les inflorescences (Carretero-Paulet et al., 2002). Dans les pétales de rose, RhDXR est
exprimé à tous les stades de développement, même s’il semble qu’il soit légèrement plus
exprimé dans les stades précoces (Fig. 40B).
L’ARNm du gène RhDXR est présent dans les pétales de toutes les variétés de rose,
indépendamment du type de parfum qui les caractérise. Par ailleurs, l’expression du gène chez
les variétés ‘Papa Meilland’ et ‘Royal Baccara’ semble être légèrement plus importante dans
les stades tardifs (Fig. 40C).
Dans nos conditions d’expérimentation, l’expression du gène RhDXR n’est donc ni
spécifique des pétales, ni spécifique de la production de monoterpènes. Des expériences de
RT-PCR quantitatives sont envisagées de façon afin d'affiner les résultats obtenus.
6. La surexpression du gène RhDXR chez Nicotiana sylvestris

a. Choix de l’espèce pour la surexpression
Bien que RhDXR soit probablement constitutif chez la rose, il est possible que sa
surexpression conduise à une augmentation de la production de composés volatils, comme
cela a été montré chez la menthe (Mahmoud et Croteau, 2001). Pour le tester, nous n’avons
pas pu utiliser le rosier.
Résultats 154
A B C
rhdxr rhdxr rhdxr
gap-dh gap-dh gap-dh

40 000 000 40 000 000 40 000 000
35 000 000 35 000 000 35 000 000
30 000 000 30 000 000 30 000 000
25 000 000 25 000 000 25 000 000
cpm
cpm
cpm
20 000 000 20 000 000 20 000 000
15 000 000 15 000 000 15 000 000
10 000 000 10 000 000 10 000 000
5 000 000 5 000 000 5 000 000
0 0 0
RB-BJO
RB-BO
MC-BJO
RB-BTO
sépales
MC-BF
MC-BO
MC-BTO
PM-BO
PM-BTO/FE
feuilles matures
MC-FE
étamines
pistils
Anna-BJO
Anna-BO
Anna-BTO
pétales
Figure 40 : Etude par RT-PCR semi-quantitative de l'expression du gène RhDXR dans

les différents tissus de roses (A), au cours du développement floral de la variété ‘The
MacCartney rose’ (B) et chez différentes variétés de roses (C). MC, ‘The Mac Cartney
rose’ ; PM, ‘Papa Meilland’ ; RB, ‘Royal Baccara’ ; BF, bouton fermé ; BJO, bouton juste
ouvert ; BO, bouton ouvert ; BTO, bouton très ouvert ; FE, fleur épanouie. Les membranes de
RT-PCR ont été hybridées avec des sondes marquées au [α-32P]-dCTP, correspondant à
chacun des gènes. Les histogrammes représentent les valeurs normalisées par rapport à une
même valeur de référence obtenue pour le gène GAPDH.
Résultats 155
En effet, actuellement, la transformation du rosier n’est pas maîtrisée, que ce soit au
laboratoire BVpam de Saint-Etienne ou dans les laboratoires partenaires (RDP, ENS de Lyon
ou INRA d’Angers).
Nous avons donc recherché une plante se transformant facilement et se rapprochant de
la rose pour son caractère parfumé. Notre choix s’est porté sur le tabac N. sylvestris. En effet,
cette espèce émet des composés volatils suivant un rythme circadien avec un pic nocturne
d’émission, suggérant une pollinisation nocturne par des papillons (Raguso et al., 2003). Son
parfum se compose de monoterpènes (β-myrcène, trans-β-ocimène, linalol, α-terpinéol), de
sesquiterpènes (β-caryophyllène, α-humulène, oxyde de caryophyllène), de composés
aromatiques (benzaldéhyde, benzylalcool, 2-phényléthanol, méthylbenzoate, benzylacétate,
benzylvalérate) et de dérivés d’acides gras (cis-3-hexénol, cis-jasmone). De plus, c’est une
espèce qui se transforme facilement par A. tumefaciens et la technique de transformation est
maîtrisée au sein du laboratoire.
b. Obtention des plantes transgéniques

Deux cents explants issus de feuilles de plants de tabac cultivés in vitro ont été
transformés avec une souche d’A. tumefaciens contenant la construction SurexDXR (vecteur
GatewayTM de surexpression dans lequel a été introduit l’ADNc total de la DXR sous le
contrôle du promoteur CaMV35S). Parmi ces explants, 83 ont produits des cals et régénérés
des plantules (efficacité de transformation 41,5 %). Au cours de la multiplication des cals et
de l’enracinement des plantules, certains événements ont été perdus à cause de
contaminations. Néanmoins, 72 explants ont été maintenus et pour chaque explant, une
plantule est acclimatée en serre et conservée. Parallèlement, une vingtaine de plantes ayant
intégré une construction témoin (35S::GFP) ont été obtenues et sont acclimatées en serre.
Leur analyse permettra de vérifier que les modifications éventuelles des profils terpéniques
sont bien dues à la surexpression du gène RhDXR et non pas à l’introduction d’un gène
exogène dans le génome du tabac.
c. Clonage de la DXR de Nicotiana sylvestris

Afin de caractériser les plantes transgéniques, il sera nécessaire de suivre l'expression
du gène RhDXR dans les feuilles et les pétales. L’expression de la DXR étant peut-être
constitutive chez le tabac, les niveaux d'expression du gène risquent de refléter à la fois
l'expression du gène DXR endogène du tabac et celle du gène DXR de rose. Nous avons donc
mis au point une stratégie de discrimination par CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic
Résultats 156
Sequence) qui repose sur un polymorphisme de site de restriction dans les deux gènes à
distinguer. Ainsi, un fragment d'ADN est amplifié par PCR puis digéré par une ou plusieurs
enzymes de restriction ; le polymorphisme de longueur des fragments est révélé par
électrophorèse.
Nous avons donc isolé une partie de la séquence codante de la DXR chez le tabac N.
sylvestris. Dans un premier temps, les ARNm de feuilles matures de N. sylvestris sont extraits
et les ADNc sont obtenus par une réaction de réverse transcription. Dans un deuxième temps,
une PCR est réalisée dans les mêmes conditions que celles décrites au § V.D.1 du 'Matériels
et Méthodes'. Les oligonucléotides dégénérés DX1 et DX6, utilisés pour isoler le gène DXR
de rose, sont employés dans cette PCR. La séquence obtenue a une longueur de 752 pb et
présente 82 % d'identité au niveau acide nucléique avec la séquence RhDXR (annexe 7). Dans
la séquence DXR de tabac, il est possible d'amplifier un fragment de 400 pb avec les amorces
RT-DXR (annexe 1). Dans cette zone, RhDXR se distingue de l’ADNc isolé chez le tabac par
la présence d'un site EcoRV en position 310-315 (annexe 8). Après PCR sur les ADNc de
rose et de tabac, les deux gènes se différencient grâce à leur polymorphisme de restriction
(Fig. 41).
d. Analyse préliminaire de deux transformants

Afin de vérifier que le gène RhDXR s'est bien intégré dans le génome du tabac, une
PCR est réalisée sur ADN génomique avec les amorces RT-DXR (annexe 1) dans les
conditions décrites dans le § V.D.6 du 'Matériels et Méthodes'. Quatre tabacs différents sont
utilisés : deux tabacs transformés avec le gène RhDXR (clones DXR-46 et DXR-49), un tabac
transformé avec 35S:GFP et un tabac N. sylvestris non transformé. Les amorces RT-DXR
permettent d'amplifier un fragment de taille attendue (400 pb) uniquement chez les tabacs
DXR-46 et DXR-49. Il est possible d'observer un fragment de taille supérieure chez tous les
tabacs. Les amorces RT-DXR se trouvant de part et d’autre d’un intron, ce fragment
correspond probablement à la séquence de la DXR présente dans l’ADN génomique du tabac.
Après digestion par EcoRV, le fragment amplifié chez les plantes transgéniques est clivé en
deux fragments (Fig. 42).
Lorsque les plantules seront suffisamment développées, une première série d’analyses
CPG sera réalisée sur les feuilles et les fleurs. En effet, le gène RhDXR est sous le contrôle du
Résultats 157
PM Rh Ns PM Rh Ns
2500 pb 2000 pb
2000 pb 1500 pb
1500 pb 1000 pb
800 pb
1000 pb 600 pb
800 pb 400 pb
600 pb
200 pb
400 pb
A B
Figure 41 : Génération d'un CAPS DXR. A, fragments PCR amplifiés avec les amorces
RT-DXR à partir d'ADNc de pétale de la rose 'The MacCartney rose' et d'ADNc de feuilles de
N. sylvestris ; B, profils de restriction obtenus après digestion par EcoRV des fragments PCR.
PM, marqueurs de poids moléculaires ; Rh, Rosa x hybrida ; Ns, Nicotiana sylvestris.
Digestion EcoRV
PCR RT-DXR du produit amplifié
35S::GFP
35S::GFP
DXR-49
DXR-46
DXR-49
DXR-46
Ns
PM
Ns
PM
1000 pb
800 pb
* *
600 pb
400 pb
200 pb
Figure 42 : Vérification par PCR avec les amorces RT-DXR de l'insertion du gène
RhDXR dans le génome de tabac. Noter qu'après une digestion par EcoRV, le fragment a
une taille plus petite. Noter également la présence d'un fragment d'environ 800 pb (*)
correspondant à la séquence amplifiée sur l'ADN génomique. PM, marqueur de poids
moléculaires ; DXR-46 et DXR-49, deux tabacs N. sylvestris transformés avec la construction
SurexDXR ; 35S::GFP, tabac N. sylvetris transformé avec la construction 35S::GFP ; Ns,
tabac N. sylvestris non transformé.
Résultats 158
promoteur CaMV35S dont l’expression est constitutive. L’effet de la surexpression de ce
gène peut donc être analysé au niveau de ces deux organes. Les profils terpéniques des plantes
transformées seront comparés aux profils terpéniques des plantes témoins. Les plantes seront
conservées jusqu’à l’obtention des graines. Les graines des plantes présentant une
surproduction de composés terpéniques seront conservées afin de pouvoir poursuivre par des
études de biologie moléculaire sur la 2ème génération de plantes.
B. La géranyl diphosphate synthase ou GPPS

La GPPS permet la formation du GPP, précurseur de tous les monoterpènes, cycliques
ou acycliques. Il existe deux formes de GPPS, une forme homodimérique, comme chez A.
thaliana (Bouvier et al., 2000) et Abies grandis (Tholl et al., 2001 ; Burke and Croteau,
2002), et une forme hétérodi- ou hétérotétramérique, comme chez M. x piperita (Burke et al.,
1999) et Antirrhinum majus (Tholl et al., 2004). Lorsque nous avons débuté nos recherches, la
GPPS hétérotétramérique d’A. majus n’était pas connue. Une seule GPPS hétérodimérique
était connue, chez la menthe. Par contre trois séquences de GPPS homodimériques étaient
disponibles dans les banques de données. Nous avons fait l’hypothèse que chez la rose, il
existait une GPPS de forme homodimérique.
1. Isolement du gène codant pour une GPPS homodimérique chez la rose

La recherche du gène GPPS chez la rose repose sur une stratégie PCR basée sur des
homologies de séquences. Trois séquences de GPPS homodimériques connues et caractérisées
sont alignées de façon à définir des oligonucléotides dégénérés dans les zones les plus
conservées (annexe 6). Il s’agit des séquences GPPS d’A. thaliana (accession Y17376 ;
Bouvier et al., 2000), de Citrus sinensis (accession AJ243739) et de Quercus robur (accession
AJ298245). Les oligonucléotides S1 et AS1 (annexe 1) permettent d’amplifier un fragment de
940 pb à partir de l’ADNc obtenu à partir d’ARN de pétales des variétés ‘Rouge Meilland’ et
‘The Mac Cartney rose’, prélevées au stade BO. Grâce à des réactions de RACE-PCR, les
extrémités 5’ et 3’ du gène sont isolées. Des oligonucléotides spécifiques sont ensuite définis
à partir de la séquence théorique complète de façon à pouvoir amplifier l’ADNc du gène dans
sa totalité. Les ADNc obtenus à partir des deux variétés sont identiques.
La séquence nucléotidique obtenue a une longueur de 1777 pb, correspondant à une
ORF de 1278 pb. La protéine correspondante est constituée de 426 acides aminés, soit une
Résultats 159
masse moléculaire calculée de 47,1 kDa et un pI de 6,0. La séquence protéique de la GPPS de
rose partage 64 % d’identité avec la GPPS d’A. thaliana et seulement 20 % d’identité avec
GPPS d’Abies grandis, autre GPPS homodimérique isolée et caractérisée. Les domaines
DDXXD et FQXXDDXXD, impliqués dans la liaison de l’IPP et du DMAPP, sont conservés
dans la séquence isolée chez la rose (Fig. 43). Elle est appelée RhGPPS pour faire référence
au gène et RhGPPS lorsqu’il s’agit de la protéine, conformément à la nomenclature.
Les logiciels de prédiction de localisation subcellulaire (ChloroP et TargetP) ne
permettent pas d’attribuer une compartimentation nette de RhGPPS. La séquence GPPS d’A.
thaliana présente une séquence d’adressage aux plastes de 100 acides aminés. En 2000,
Bouvier et al. ont montré que l’initiation de la traduction pouvait avoir lieu à partir de deux
résidus méthionine, produisant ainsi une forme longue et une forme courte de la GPPS. Mais
ils ont démontré que seule la forme longue est importée dans les plastes. Même si la séquence
N-terminale de la protéine RhGPPS ne partage que 33 % d’identité avec la séquence
d’adressage de la GPPS d’A. thaliana, ces séquences sont très conservées dans leur région C-
terminale (Fig. 43). Il est donc possible que dans la séquence GPPS de rose, les 100 premiers
acides aminés aient un rôle dans l’adressage aux plastes.
2. Caractérisation enzymatique de la protéine RhGPPS

La confirmation de la fonction de la protéine RhGPPS est réalisée par la formation de
GPP à partir d’IPP et DMAPP en présence de la protéine recombinante.
Pour cela, des amorces spécifiques de la RhGPPS sont déterminées de façon à
amplifier la région codante du gène sans le peptide putatif d’adressage aux plastes. Le gène
est ensuite introduit par digestion et ligation dans le vecteur pGEX-KG (Pharmacia), en fusion
avec la glutathion-S-transférase (vecteur pGEX-GPPS).
La production de la protéine recombinante est induite par l’IPTG dans des cellules
XL1-blue d’E. coli. La protéine recombinante est purifiée sur une résine d’affinité (glutathion
sépharose 4B). La figure 44 montre qu’il est possible de produire de faibles quantités de
protéine recombinante et qu’elle reste majoritairement fixée à la résine. Pour récupérer la
protéine RhGPPS, la résine est traitée à la thrombine.
La caractérisation enzymatique de la protéine recombinante purifiée est faite par G.
Scalliet et P. Hugueney (laboratoire RDP, ENS de Lyon). Les tests d’activité sont réalisés en
14
présence d’IPP marqué au C et de DMAPP ou d’IPP marqué seul et de l’enzyme IPP
isomérase d’A. thaliana purifiée après expression de la protéine recombinante chez E. coli.
Les produits de la réaction enzymatique sont déphosphorylés par l’action de la phosphatase
Résultats 160
Figure 43 : Alignement de la séquence de RhGPPS et de 3 autres séquences de GPPS
homodimériques connues ; encadrés en rouge, deux domaines putatifs de liaison du substrat
DDXXD et FQXXDDXXD ; encadré en vert le site putatif d’adressage aux plastes. Les
acides aminés surlignés en noir correspondent à des acides aminés communs.
PM P1 P2 P3 P4
200,0 kDa
116,0 kDa
97,5 kDa
66,0 kDa
45 ,0 kDa
31,0 kDa
Figure 44 : Expression et purification partielle de la protéine recombinante GST-

RhGPPS sur gel SDS-PAGE. P1, Fraction totale ; P2, Fraction soluble ; P3, Fraction éluée ;
P4, Fraction résine ; PM, marqueurs de poids moléculaire.
Résultats 161
alcaline, séparés par chromatographie sur couche mince, détectés par autoradiographie, puis
identifiés par comparaison à des standards purifiés (géraniol, farnésol, géranylgéraniol).
La GPPS d’A. thaliana, (AtGPPS, Bouvier et al., 2000) et la GGPPS de rose
(RhGGPPS, Channelière et al., 2002 ; Scalliet, 2003) sont utilisées comme témoins d’activité
prényltransférase. RhGGPPS est capable de produire du géranylgéraniol, alors que RhGPPS
ne permet pas de produire du géraniol (Fig. 45). Les expériences réalisées avec AtGPPS ne
permettent pas non plus la synthèse de géraniol. Il est donc possible que dans nos conditions
d’expérimentation, ces deux protéines, RhGPPS et AtGPPS ne soient pas produites sous leur
forme active. Il est également possible qu’elles soient produites sous forme active mais en
quantités trop faibles pour que leur activité soit détectable.
3. Profil d’expression du gène RhGPPS

La transcription du gène RhGPPS est étudiée par RT-PCR semi-quantitative afin de
déterminer s’il existe une corrélation entre la production de monoterpènes et l’expression du
gène dans les pétales de rose. L’expression du gène est donc suivie dans tous les tissus et au
cours du développement floral de la variété ‘The Mac Cartney rose’. L’expression de ce gène
est également étudiée chez d’autres variétés : la variété ‘Papa Meilland’ dont le puissant
parfum est composé majoritairement de monoterpènes, la variété ‘Anna’ dont le parfum plus
discret est essentiellement constitué de composés aromatiques et la variété ‘Royal Baccara’
qui est inodore. Le gène codant pour la GAPDH de rose est utilisé comme référence pour
normaliser les échantillons d’ADNc utilisés (Channelière et al., 2002). Les RT-PCR semi-
quantitatives sont réalisées plusieurs fois, transférées sur membrane et hybridées avec des
sondes spécifiques de chaque gène. La figure 46 présente les résultats obtenus pour une
expérience représentative.
D’après nos résultats, l’expression du gène RhGPPS est probablement constitutive. En
effet, il est exprimé dans tous les organes : feuilles matures, sépales, pistils, étamines et
pétales. De plus, ce gène n’est pas spécifique des roses dont le parfum est composé de
monoterpènes. En effet, il est exprimé non seulement dans les pétales de la variété ‘The
MacCartney rose’ qui produisent des monoterpènes, mais également dans ceux des variétés
‘Anna’ et ‘Royal Baccara’ qui n’en produisent pas ou des quantités très faibles.
L’expression du gène RhGPPS n’est donc ni pétale spécifique, ni spécifique des roses
produisant des monoterpènes. De plus, la fonction de cette protéine n’a pas pu être démontrée
in vitro. Pour ces raisons, la caractérisation de la protéine RhGPPS homodimérique n’a pas
été poursuivie.
Résultats 162
Isopenténol (C5)
Géraniol (C10)
Géranyl-géraniol (C20)
1 2 3 4
Figure 45 : Radiographie de
la chromatographie sur couche mince phase inverse des produits d’incubations des
diverses prényltransférases. 1, extrait brut des protéines totales d’E.coli ; 2, protéine
AtGPPS purifiée ; 3, protéine RhGPPS purifiée ; 4, protéine RhGGPPS purifiée.
GAPDH
RhGPPS
' The Mac Cartney rose '
' Royal baccara '

' Anna '
Pistils
Étamines
Sépales
Feuilles matures
Pétales
+++ ++ +/- parfum
+++ - +/- monoterpènes
Figure 46 : Etude par RT-PCR semi-quantitative de l'expression du gène RhGPPS dans

les différents tissus de roses et dans les pétales de différentes variétés de roses. Les
membranes de RT-PCR sont hybridées avec des sondes marquées au [α-32P]-dCTP,
correspondant à chacun des gènes. Le gène GAPDH de rose est utilisé pour normaliser les
différents échantillons.
Résultats 163
4. Recherche d’une GPPS hétéromérique chez la rose
Récemment, une GPPS hétérodimérique a été isolée à partir des pétales d’A. majus
(Dudareva et al., 2004). Cette protéine est constituée d'une petite sous-unité (SSU) et d'une
grosse sous-unité (LSU). La LSU possède une activité de GGPPS, alors que la SSU seule ne
possède pas d’activité prényltransférase. Lorsque les deux gènes sont coexprimés dans des
cellules bactériennes, une GPPS active est produite.
Suite aux résultats décrits aux paragraphes précédents, nous avons cherché à savoir si,
chez la rose, il existait une GPPS hétérodimérique comme chez A. majus. Parmi les séquences
de la banque d’ESTs de pétales de la rose chinoise ‘Old Blush’ (Channelière et al., 2002) se
trouve une séquence correspondant probablement à une GGPPS. Nous avons émis
l’hypothèse que cette GGPPS correspondait à la grosse sous-unité de la GPPS de rose (LSU).
Nous avons recherché par une stratégie PCR basée sur des homologies de séquences la petite
sous-unité de la GPPS (SSU).
Les séquences des petites sous-unités de trois GPPS hétéromériques (Mentha x
piperita, acession AF182827 ; Clarkia breweri, accession AY534745 ; Antirrhinum majus,
accession AY534686) ont été alignées de façon à définir des oligonucléotides dégénérés dans
les zones les plus conservées. Six oligonucléotides dégénérés ont ainsi été définis et employés
en combinaison. Différentes matrices ont été utilisées (ADNc obtenus à partir de pétales de la
variété ‘Papa Meilland’ ou ‘The Mac Cartney rose’ prélevés à différents stades de
développement BO, BTO). Toutefois, aucun fragment d’ADN présentant des homologies de
séquences avec la petite sous-unité de la GPPS d’A. majus n’a été obtenu.
Résultats 164
Discussion
Comme cela l'a été mentionné dans l'avant-propos, mon travail de thèse s'inscrit dans
le cadre d'un programme financé par la région Rhône-Alpes portant sur le parfum des roses.
De façon générale, Il s'agit de mieux comprendre les mécanismes de la production et de
l'émission des composés volatils chez la rose. A terme, l’objectif de ces recherches est de
savoir pourquoi une rose est parfumée, quand une autre ne l'est pas. Nous avons abordé cette
problématique à différents niveaux. Tout d'abord, nous nous sommes attaché à caractériser le
pétale de rose en tant qu'organe producteur et émetteur de parfum chez les roses Hybrides de
Thé. Nous avons tout particulièrement cherché à mettre en évidence des structures
caractéristiques de la production de monoterpènes. Une analyse comparative a été réalisée
chez des roses parfumées et non parfumées afin de savoir si l'absence de parfum était liée à
l'absence de structures cellulaires spécifiques. Notre deuxième objectif était d'étudier la voie
de biosynthèse responsable de la formation des monoterpènes. Ces composés constituent une
proportion très importante des composés volatils des roses modernes Hybrides de Thé.
Connaître les enzymes impliquées dans leur synthèse est une première étape, nécessaire pour
comprendre pourquoi une rose est inodore. Lorsque nous avons commencé ce travail, aucune
enzyme impliquée dans la synthèse des composés volatils notamment celle des monoterpènes,
n'avait été isolée chez la rose. Nous avons donc caractérisé deux gènes clés de cette voie de
biosynthèse. A la lumière des résultats que nous avons obtenus, les points suivants peuvent
être discutés :
I. Développement floral et sécrétion du parfum

A. Les organes floraux des roses Hybrides de Thé produisent des
bouquets de composés spécifiques
Avant d’étudier la production du parfum dans le pétale de rose, il nous a semblé
important de caractériser les composés volatils émis par les différents organes des roses
Hybrides de Thé. Nous avons donc réalisé une analyse chimique des composés volatils
présents dans les sépales, les pétales, les étamines et les pistils (styles et stigmates). Cette
expérience a déjà été réalisée chez d’autres espèces comme Boronia megastima (MacTavish
et Menary, 1997), Chrysanthemum coronarium (Flamini et al., 2003) et la rose sauvage Rosa
rugosa (Dobson et al., 1990). Dans toutes ces études, les auteurs ont mis en évidence que
Discussion 165
chaque partie de la fleur a un profil de composés spécifique. Nos résultats confirment
largement ceux de Dobson et al. chez R. rugosa. Chez les roses Hybrides de Thé comme
‘Papa Meilland’, même si certains composés sont communs aux quatre organes, les quantités
et les proportions sont différentes et la présence de certains composés est propre à chaque
organe. Cependant, les odeurs des différentes parties de la fleur ne sont pas exactement les
mêmes dans notre étude et celle de Dobson et al. (1990). Ainsi, par exemple, les sépales de la
variété ‘Papa Meilland’ produisent essentiellement des dérivés d'acides gras, alors que ceux
de R. rugosa renferment surtout des sesquiterpènes. Ces composés sont spécifiques des
nombreux trichomes glandulaires présents à la surface des sépales et des feuilles chez cette
espèce (Hashidoko, 1996). Les composés volatils extraits des pétales de R. rugosa et Rosa x
hybrida appartiennent majoritairement à la famille des terpènes et des composés aromatiques.
Les organes de la fleur émettent donc un bouquet de composés spécifiques, qui ont
probablement des rôles écologiques différents. En effet, des dérivés d'acides gras et certains
monoterpènes sont impliqués dans les réactions de défense, soit de façon directe à cause de
leur toxicité, soit de façon indirecte en attirant les insectes prédateurs et/ou parasites des
insectes herbivores (Arimura et al., 2005). Dans les sépales de la variété 'Papa Meilland', on
trouve du trans-2-hexénal et du linalol, caractérisés comme molécules de défense (Kessler et
Baldwin, 2001). Les sépales pourraient donc offrir une barrière chimique, en plus d'une
barrière mécanique, contre l'agression des insectes phytophages qui créent des dommages au
niveau des organes reproducteurs. D’après Hashidoko et al. (1992a ; 1992b), les
sesquiterpènes des trichomes glandulaires présents sur les feuilles et les sépales, jouent aussi
un rôle dans la défense contre les pathogènes. Leur effet anti-appétent sur les larves de
Spodoptera litura, la chenille du tabac a été démontré. Dans les pétales, les étamines et les
pistils, les composés de défense sont peu représentés. Dans ces trois organes, on retrouve de
façon générale les mêmes composés volatils mais dans des proportions différentes. Les pistils
et les étamines produisent et émettent deux composés volatils qui ne sont pas ou peu produits
par les pétales, l'eugénol et le méthyleugénol. Selon Dobson et al. (1999), ces deux composés
ont une forte activité antimicrobienne et pourraient offrir une protection aux gamétophytes
mâles. Ainsi, chez la rose sauvage R. rugosa, un rôle différent dans la biologie de la fleur a
été attribué à chaque organe : les pétales, par leur forme, leur couleur et leur parfum, attirent
les insectes pollinisateurs, les composants de l’androcée guident les insectes pollinisateurs
jusqu'au pollen et limitent le développement microbien, et les sépales protègent la fleur en
bouton des attaques d'insectes herbivores (Dobson et al., 1990). La caractérisation des
composés volatils produits par les différents organes floraux des roses Hybrides de Thé
Discussion 166
aboutit aux mêmes conclusions. Ainsi, au cours de la domestication, les bouquets de
composés volatils associés aux fonctions de chaque organe semblent avoir été conservés.
B. Le parfum évolue au cours de l’épanouissement de la fleur

Dans une rose Hybride de Thé comme celle de la variété ‘Papa Meilland’, le poids des
pétales est environ 30 fois supérieur à celui des étamines. Ainsi, même si nous avons montré
que la concentration en composés volatils dans les deux organes était pratiquement
équivalente, la fragrance de la fleur est majoritairement due aux pétales. La suite de notre
étude s’est donc focalisée sur cet organe.
Notre analyse chimique des composés volatils dans les pétales au cours du
développement floral met en évidence une relation très nette entre production de parfum et
épanouissement de la fleur. En effet, chez la rose ‘Papa Meilland’, la quantité de parfum
présente dans les pétales augmente au cours du développement floral jusqu’au moment où la
fleur est épanouie. Les mêmes observations ont été faites chez d’autres espèces comme par
exemple le tabac Nicotiana suaveolens. Dans les fleurs de ce tabac, les quantités de composés
volatils augmentent de façon importante après anthèse (Loughrin et al., 1992). Cette relation
étroite entre parfum et développement floral est associé, là encore, à la capacité de la fleur à
attirer les insectes pollinisateurs.
Comme cela a été montré chez d’autres espèces comme Boronia megastigma
(MacTavish et Menary, 1997) et Chrysanthemum coronarium (Flamini et al., 2003), la
quantité de des composés volatils émis est relativement bien corrélée à la quantité de
composés volatils présente dans les pétales. D’une manière générale, les roses dont les pétales
renferment beaucoup de composés volatils en émettent de grandes quantités et inversement,
les roses inodores ont des concentrations de composés très faibles dans leurs pétales. C’est
aussi ce qu’ont montré Shalit et al. (2004) sur Rosa x hybrida ‘Fragrant Cloud’ et ‘Golden
gate’. Cependant, chez la variété ‘Papa Meilland’, le rapport entre les quantités de composés
volatils présentes dans le pétale et celles émises par celui-ci est plus faible au stade BO qu’au
stade BTO/FE. Cela pourrait signifier que lorsque la fleur n’est pas totalement épanouie, des
composés volatils sont produits mais pas émis. Pour être validé, ce résultat inattendu devrait
bien entendu être confirmé par des expériences sur d’autres variétés parfumées. Il serait
également nécessaire de faire des analyses à des intervalles de temps rapprochés, afin de
s’affranchir des variations dues au rythme d’émission des composés volatils.
Discussion 167
Dans notre étude, la plupart des composés du parfum évoluent parallèlement au cours
du développement de la fleur. Shalit et al. (2004) ont obtenu les mêmes résultats sur deux
variétés de Rosa x hybrida. Ils en concluent que l’émission des différentes classes de
composés pourrait être régulée par des mécanismes similaires. Des études très fines des
rythmes d’émission des composés volatils montrent néanmoins que ces rythmes peuvent être
spécifiques pour tel ou tel composé. Par exemple, les travaux de Helsper et al. (1998) sur
Rosa x hybrida ‘Honesty’ montrent que certains composés comme la dihydro-ß-ionone ont un
rythme d’émission particulier. Chez l’œillet, Schade et al. (2001) suggèrent aussi une
régulation développementale indépendante pour chaque composé. Chez Rosa x damascena,
tous les composés présentent un rythme d’émission avec généralement un pic à la fin de la
photopériode (Picone et al., 2004). Toutes ces données, parfois contradictoires, soulignent la
complexité de l’étude de l’émission rythmique des nombreux composés volatils émis par les
fleurs, en particulier la rose.
Selon certains auteurs, les précurseurs du parfum seraient déjà présents dans les
pétales de boutons fermés sous la forme de conjugués β-D-glucosidés non volatils (Ackerman
et al., 1989 ; Riou et al., 1998 ; Reuveni et al., 1999 ; Jakobsen et Christensen, 2002 ;
Hayashi et al., 2004). Ainsi, chez le jasmin (Jasminum polyanthum), des extraits de boutons
floraux, mis en présence d’une préparation d’enzymes issues de fleurs ouvertes, sont capables
de produire les composés parfumés (Watanabe et al., 1993). Chez le narcisse, une corrélation
étroite a été établie entre l’augmentation de la production des composés volatils et
l’augmentation de l’activité β-glucosidase (Reuveni et al., 1999). Chez Vanilla planifolia, les
composés aromatiques sont piégés dans les vacuoles sous forme conjuguée avec le glucose et
libérés au cours de la maturation du fruit par des glucosidases endogènes (Prince et al., 1994).
Chez Rosa x damascena, le 2-phényléthanol est produit dans les stades précoces sous la
forme d’un composé β-D-glucosidé. Au cours du développement floral, la proportion de
composé β-D-glucosidé diminue, tandis que la proportion de 2-phényléthanol libre augmente,
parallèlement à une augmentation de l’activité β-glucosidase (Watanabe et al., 2002). Ainsi,
des formes conjuguées des composés volatils pourraient avoir un rôle dans le stockage et
peut-être le catabolisme de certains composés volatils. Pour les monoterpènes, cela n’a pas été
formellement démontré et le rôle des composés glucosidés n’est pas clair (Oka et al., 1999).
Dans le cadre de notre étude, une analyse des conjugués β-D-glucosidés et des formes libres
respectives au cours du développement floral de la rose serait utile. En particulier, elle nous
permettrait de savoir si l’augmentation de la quantité de D-glucose libre que nous avons
Discussion 168
observée dans les pétales au cours du développement floral est reliée à l’hydrolyse de
composés glycosylés.
II. Structure du pétale, production et sécrétion des composés volatils

Notre analyse des composés volatils du parfum dans les différents organes d’une rose
a clairement identifié les pétales comme le site de production de la fragrance florale. Une
caractérisation plus détaillée de cet organe nous semblait donc indispensable pour comprendre
les mécanismes impliqués dans la production et l'émission du parfum. Nous avons donc étudié
la structure du pétale des roses Hybrides de Thé au cours du développement floral à l’aide de
techniques de microscopie, parallèlement à la production et à l'émission des composés
volatils.
A. L’organisation générale du pétale

La structure des pétales de rose est similaire à celle des pétales d'A. thaliana (Pyke et
Page, 1998), de giroflée (Weston et Pyke, 1999) et de nombreuses autres espèces. Les pétales
de rose sont constitués de deux épidermes et d’un parenchyme lacuneux. Les cellules de
l’épiderme supérieur d’un pétale de rose subissent de profondes modifications au cours du
développement floral. Le cytoplasme dense au stade BF se vacuolise au cours du
développement floral, se réduisant à une fine couche contre les parois de la cellule au stade
FE. Par ailleurs, la forme des cellules de l’épiderme supérieur évolue au cours du
développement. En effet, elles sont petites, régulières sur un pétale prélevé au stade BF et
présentent des ‘rides’ sur toute leur surface. Lorsque la fleur est épanouie, les cellules de
l'épiderme supérieur ont la forme conique en papille et les ornementations sont restreintes à
l'apex. Ces ornementations peuvent être considérées comme des excès de paroi/cuticule
nécessaires à l’expansion du pétale au cours du développement floral. Ainsi, chez la giroflée
(Erysimum cheiri), l'augmentation de la taille du pétale ne se fait pas par division, mais par
expansion cellulaire (Weston et Page, 1999). Chez A. majus, l'augmentation de la surface du
pétale est due à une expansion rapide de celui-ci au cours de son développement. Elle se
manifeste par un affinement de la cuticule et de la paroi des cellules des lobes supérieur et
inférieur des pétales (Goodwin et al., 2003). Nous avons également observé cet
amincissement des parois et de la cuticule dans les cellules des épidermes du pétale de rose.
Discussion 169
B. Les deux épidermes du pétale sont sécréteurs
L’étude en microscopie électronique à balayage environnemental des pétales de rose
révèle que les cellules de l’épiderme supérieur n’ont pas la même forme sur toute la surface
du pétale : les cellules sont coniques dans les zones distales et plus plates dans les zones
proches de l’onglet. Cette différence de forme s’accompagne d’un gradient de production des
composés volatils au sein du pétale. Notre étude montre également que les deux épidermes du
pétale ont des caractéristiques structurales différentes : les cellules de l’épiderme inférieur
sont grandes et plates, alors que les cellules de l’épiderme supérieur sont petites et coniques,
avec de nombreux replis. Aucun des deux épidermes du pétale de rose ne présente de
trichomes sécréteurs. Des gouttelettes, observées à l’apex des cellules de l’épiderme supérieur
des pétales des roses parfumées pourraient correspondre aux composés lipidiques du parfum,
les gouttes d’huile essentielle ayant fusionné artificiellement dans l’environnement de la
chambre du microscope à balayage ou dans l’espace entre lame et lamelle, lors d’observation
en microscopie optique.
La capture d’effluves des deux épidermes de la rose ‘The Mac Cartney Rose’ montre
qu’ils sont tous deux capables d’émettre des composés volatils dans des quantités
équivalentes. Afin de savoir si les deux épidermes renferment les enzymes de voies de
biosynthèse des composés volatils, la localisation de l’OOMT, impliquée dans les dernières
étapes de la biosynthèse du DMT, a été faite sur les différents tissus du pétale par Western-
blot. Les résultats montrent que l’OOMT est présente dans les deux épidermes du pétale. Des
tests d’activité sur des extraits de protéines des deux épidermes pourraient confirmer que les
deux épidermes renferment des enzymes fonctionnelles. Néanmoins, ce résultat suggère que
les cellules des deux épidermes possèdent la machinerie indispensable à la synthèse des
composés volatils. Très peu d’enzymes ont été localisées dans le pétale à l’échelle tissulaire.
Chez C. breweri, des expériences d’hybridation in situ montrent que les enzymes LIS
(Dudareva et al., 1996) et IEMT (Dudareva et Pichersky, 2000), intervenant dans la synthèse
des composés volatils, sont exprimés dans les deux couches de cellules épidermiques des
pétales. Chez A. majus, l’enzyme BAMT, visualisée par immunocytochimie, est localisée
dans les deux épidermes du pétale (Kolosova et al., 2001). En microscopie optique,
l’épiderme interne des lobes, aux cellules coniques en papilles, semble plus marqué.
Cependant, en microscopie électronique, un marquage important est détecté dans les cellules
non coniques de l’épiderme interne des lobes du pétale. Nos résultats semblent donc en
accord avec ces données de la littérature, même si l’épiderme supérieur est souvent mentionné
comme étant le seul épiderme sécréteur du pétale (Glover et Martin, 2002 ; Dudareva et al.,
2005). La forme conique en papille des cellules de l'épiderme supérieur du pétale de rose est
Discussion 170
caractéristique de plus de 80 % des espèces végétales (Kay et al., 1981). Les cellules
concentrent la lumière absorbée et augmentent ainsi l'intensité de couleur du pétale (Gorton et
Vogelmann, 1996). Chez les fleurs d'A. majus, elles sont également responsables de
l'augmentation de la fréquence de visite des pollinisateurs. La preuve de cette fonction a été
apportée par des analyses en champ comparant l’attractivité de fleurs sauvages d’A. majus et
de fleurs mutées dans le gène MIXTA, présentant un épiderme des pétales plat (Glover et
Martin, 1998). Ces auteurs proposent que cette forme conique en papille aide l'insecte à
s'orienter sur la fleur en lui fournissant des signaux tactiles qui renforcent le syndrome de
pollinisation. Il a également été suggéré que cette forme des cellules joue un rôle dans
l’émission des composés du parfum en assurant une surface d’échange plus importante avec
le milieu environnant (Glover et Martin, 2002). D’après nos résultats, la différence
d’anatomie entre les deux épidermes, supérieur et inférieur, n’entraîne pas de différence
marquante dans l’émission des composés volatils. Des analyses sur un éventail plus large de
variétés parfumées et avec d’autres enzymes sont encore nécessaires pour pouvoir généraliser
nos résultats. Néanmoins, s’ils se vérifient, ils confirment, comme la diversité des cellules
sécrétrices peut le laisser penser, que la fonction de sécrétion n’est pas inféodée à un type
cellulaire particulier.
C . L’évolution des plastes dans le pétale

L’évolution des plastes est la caractéristique la plus visible dans les pétales au cours du
développement floral chez la rose. Dans les trichomes glandulaires de nombreuses espèces, on
trouve un type bien particulier de plastes, les leucoplastes. Carde (1984) décrit ces plastes
comme des ‘plastes non-verts, non-pigmentés, morphologiquement différents de tout autre
type de chloroplastes ou chromoplastes’. Ils ont été observés dans les trichomes foliaires
sécréteurs d’huiles essentielles riches en monoterpènes de Leonitis leonurus (trichomes peltés,
Ascensao et al., 1997) et Prostanthera ovalifolia (Gersbach, 2002), ainsi que dans les cellules
des canaux sécréteurs de Rhus toxicodendron (Vassilyev, 2000). Ils sont impliqués dans la
synthèse des monoterpènes dans les fruits de Citrofortunella mitis (Gleize et al. 1983). Chez
A. thaliana, qui n’est pas considérée comme une espèce produisant du parfum, les
chloroplastes, initialement présents dans le pétale jeune, se différencient progressivement en
leucoplastes dans le pétale de la fleur épanouie (Pyke et Page, 1998). Chez Mentha x piperita,
la limonène synthase, enzyme impliquée dans la synthèse des monoterpènes, est localisée
dans les leucoplastes des cellules glandulaires (Turner et al., 1999). Chez A. majus, la petite
sous-unité de la GPPS est localisée par immunomarquage dans les leucoplastes des lobes du
Discussion 171
pétale (Tholl et al., 2004). De nombreuses autres enzymes des voies de biosynthèse des
terpènes, comme la GPPS de Mentha x piperita, sont plastidiales (Turner et Croteau, 2004).
Ainsi, un gène codant pour une caroténoïde-dioxygénase a été isolé dans le pétale de rose
(Scalliet, 2003). Ce gène code pour une enzyme probablement responsable de la formation
des cétones de rose. Il possède une séquence d’adressage aux plastes et l'étude de la
localisation subcellulaire de ce gène par fusion à la GFP a confirmé cet adressage.
Chez la rose, lorsque le bouton floral est fermé et encore protégé par les pétales, les
plastes ont une structure qui rappelle celle des chloroplastes. Au cours du développement, ces
plastes se différencient en amyloplastes contenant de nombreux grains d’amidon. La présence
de chloroplastes, aux stades précoces du développement floral, pourrait indiquer que les
cellules des épidermes du pétale ont une certaine activité photosynthétique permettant, au
moins en partie, la synthèse de métabolites qui seront stockés sous la forme d’amidon, visible
dès le stade BJO dans des amyloplastes. Dans les baies de raisin, les plastes des cellules du
péricarpe contiennent des quantités suffisantes de chlorophylle pour assurer la production de
métabolites à l’origine de l’amidon stocké dans ces mêmes plastes (Hardie et al., 1996). Il est
néanmoins possible que les précurseurs de l’amidon soient importés depuis des organes à
forte activité photosynthétique jusqu’aux cellules du pétale.
Quand la fleur est épanouie, les cellules des épidermes du pétale de rose ont des
plastes qui renferment de nombreux plastoglobules. Ces plastes remplis d’inclusion lipidiques
ne répondent pas à la définition de Carde (1984). Ils sont plutôt voisins des chromoplastes des
fruits, voire des élaïoplastes rencontrés dans les anthères (Wu et al., 1997). Aucun plaste de
type leucoplaste n’est donc observé chez la rose à aucun stade de développement.
La même transition, de plastes remplis d’amidon à des plastes remplis de
plastoglobules, a déjà été rapportée dans les cellules sécrétrices de terpènes. Dans les baies de
Vitis vinifera, Hardie et al., (1996) ont émis l’hypothèse d’un lien entre la diminution de
l’amidon et l’apparition de plastoglobules dans les plastes du péricarpe d’une part, et le
contenu en monoterpènes des cellules, d’autre part. Les plastoglobules représenteraient un
environnement adapté à l’accumulation des monoterpènes qui, non liés à un sucre, sont
totalement insolubles dans les phases aqueuses.
Des plastes remplis de plastoglobules sont généralement considérés comme typiques
des cellules produisant des monoterpènes. Ils ont par exemple été décrits dans les trichomes
sécréteurs des feuilles de Fagonia glutinosa (Fahn et Shimony, 1998) et dans ceux des
fleurons d’Achillea millefolium (Figueiredo et Pais, 1994). Le matériel présent dans les
plastoglobules est assimilé par ces auteurs aux composés lipidiques sécrétés par ces trichomes
à des stades de développement ultérieurs. Bien qu’il soit possible que les plastoglobules
Discussion 172
denses aux électrons soient reliés à la sécrétion de composés volatils, aucune preuve n’est
apportée par ces différentes études.
Chez les Orchidacées, les composés volatils sont émis par des zones des pétales
appelées osmophores. La structure des cellules de ces osmophores est souvent assez voisine
de celle de l’épiderme d’un pétale comme celui de la rose. En dessous des cellules de
l’épiderme des osmophores, la présence d’une ou plusieurs couches de cellules très riches en
amyloplastes a été remarquée depuis très longtemps (Vogel, 1962). Ces amyloplastes
disparaissant parallèlement à l’émission du parfum, les auteurs supposent qu’ils fournissent
l’énergie nécessaire à la synthèse des composés parfumés (Vogel, 1962 ; Esau, 1965). Dans
les feuilles de Cymbopogon flexuosus, Singh et al., (1991) ont montré, en utilisant de
l’amidon marqué, que le marquage passait progressivement de l’amidon à l’huile essentielle.
Dans les cellules des épidermes des pétales de roses parfumées, ces organites pourraient jouer
le même rôle dans la synthèse des monoterpènes.
En même temps, l’amidon présent dans les pétales pourrait servir aussi servir dans
d’autres processus nécessitant une grande quantité d’énergie, comme l’expansion du pétale
(Ho et Nichols, 1977 ; Hammond, 1982 ; Evans et Reid, 1988). Chez la rose, notre étude
montre que la diminution des quantités d’amidon s’accompagne d’une augmentation des
quantités de D-glucose libre. Ho et Nichols (1977) ont aussi observé une augmentation en
sucre soluble parallèlement à une diminution du contenu en amidon dans la corolle de la rose
‘Sonia’ au cours de son développement. Ils ont postulé que, dans les pétales en
développement, l’hydrolyse de l’amidon est à l’origine de l’augmentation des sucres solubles
dans les cellules ce qui favorise l’entrée d’eau et donc l’expansion cellulaire. Parallèlement,
l’épanouissement de la fleur s’accompagne d’une augmentation de l’activité amylase dans les
pétales de rose (Hammond, 1982). Plus récemment, il a été montré que lorsque l’on inhibe la
dégradation de l’amidon en sucres libres, les fleurs du lis asiatique ne sont plus capables de
s’ouvrir (Bieleski et al., 2000).
D. Les mécanismes de sécrétion

Une autre caractéristique des cellules de l’épiderme du pétale au cours du
développement floral est la prolifération des membranes qui forment des enroulements
caractéristiques. Ces enroulements peuvent prendre plusieurs aspects. Certaines structures,
que nous avons observées dans les pétales, sont très régulières et ressemblent à des figures de
myéline (Fig. 29G). Stubbs et Francis (1971) avaient déjà observé ces structures de nature
probablement lipidique chez la rose ‘Lady Seton’ sans leur attribuer un rôle physiologique.
Discussion 173
Nous avons également observé d’autres figures moins régulières, souvent situées à proximité
des plastes et qui sont peut-être dérivées du réticulum endoplasmique (Fig.29F). L’association
plastes/RE est fréquente dans les systèmes sécréteurs (Figueiredo et Pais, 1994 ; Turner et al.,
2000a). Le réticulum endoplasmique joue un rôle important dans la synthèse et le transport
des sesquiterpènes et des stéroïdes, ainsi que dans la conversion de la phénylalanine en acide
cinnamique, précurseur des phénylpropanoïdes (Schöpker et al., 1995). Chez la menthe,
certaines enzymes, comme la limonène 6-hydroxylase, ont été localisées par
immunocytochimie dans le RE (Turner et Croteau, 2004). Dans les cellules de l’épiderme des
pétales de rose au stade ‘Fleur épanouie’, l’implication des plages de RE dans la production
et/ou la sécrétion des composés volatils est possible mais non démontrée.
D’autres enzymes des voies de biosynthèse du parfum sont cytoplasmiques, comme la
pulégone réductase de Mentha x piperita (Turner et Croteau, 2004). L’acétyl-CoA
géraniol/citronellol acétyltransférase, impliquée dans la synthèse de dérivés de monoterpènes
(acétate de géranyl et acétate de citronnellyl), a été isolée chez la rose (Shalit et al., 2003),
mais sa localisation subcellulaire n’est pas encore établie. Néanmoins, on peut supposer que
cette enzyme est cytoplasmique. En effet, elle appartient à la même famille d'enzymes que la
BAMT isolée chez A. majus, responsable de la formation du méthylbenzoate, dont la
localisation cytoplasmique a récemment été démontrée (Kolosova et al. 2001b).
Outre les figures de RE, les cellules de l’épiderme supérieur des pétales aux stades
BTO et FE renferment de très nombreuses vésicules dont le contenu n’est pas osmiophile
(Fig.29H et I). Ces vésicules sont regroupées par paquet au sein d’une enveloppe, souvent
proche de la vacuole. Ces vésicules avaient déjà été décrites par Stubbs et Francis (1971) sous
le terme de corps multivésiculaires (ou CMV) avec un rôle supposé avoir dans la sécrétion
des monoterpènes. La présence de CMV a été également rapportée par Ascensão et Pais
(1998) dans les trichomes capités de L. leonurus qui sécrètent surtout des protéines et des
polysaccharides. Selon eux, la présence de CMV est en étroite relation avec la voie de
l’endocytose, bien décrite dans les cellules eucaryotes. Les cellules glandulaires de L.
leonurus présentent une forte activité d’exocytose ; l’augmentation de la surface membranaire
qui en découle pourrait être balancée, au moins en partie, par un processus d’endocytose,
impliqué dans la récupération de la membrane plasmique. Les vésicules seraient ensuite
dégradées au niveau de la vacuole par l’intermédiaire de ces CMV (Hawes et al., 1995).
Nous avons également mis en évidence la présence de nombreuses vésicules lipidiques
d’environ 1µM de diamètre, souvent à proximité de la membrane plasmique des cellules de
l’épiderme (Fig. 29H et I). La coloration au réactif de NADI en microscopie optique a montré
la présence de vésicules plus volumineuses renfermant des terpènes (Fig. 30C). Il est possible
Discussion 174
que la taille supérieure des vésicules observées en microscopie optique soit un artéfact dû à la
fusion de vésicules plus petites lors de la coloration. Ces deux types de vésicules lipidiques
représenteraient en fait les mêmes organites. Des vésicules lipidiques ont déjà été mises en
relation avec la production du parfum chez certaines plantes. Ainsi, les cellules des thalles de
l’hépatique Marchantia polymorpha synthétisent des sesquiterpènes et renferment de
volumineux oléosomes. Il a récemment été montré que certaines enzymes du métabolisme des
terpènes, comme la FPPS, la GPPS et la GGPPS sont présentes dans ces organites (Suire et
al., 2000). Hudak et Thompson (1997) ont isolé à partir de pétales d’oeillet des vésicules,
contenant à la fois de protéines et de lipides. D’après ces auteurs, ces particules, ressemblant à
des oléosomes, renferment des composés du parfum, par exemple des dérivés d’acides gras.
Elles pourrraient être impliquées dans le transport et/ou le stockage de ces composés volatils.
Chez la rose, nous avons donc observé un certain nombre de vésicules (CMV,
vésicules lipidiques) mais la fusion de ces vésicules avec la membrane plasmique n’a pas été
observée de façon significative. Nous ne savons donc pas si elles jouent un rôle dans le
transport des molécules volatiles depuis leur site de production jusqu’à leur site d’émission. Il
est néanmoins possible que cette fusion des vésicules soit de nature transitoire et que nos
observations, nécessairement fragmentaires, ne l’aient pas mise en évidence. Ces vésicules
pourraient également représenter une forme de stockage des composés volatils puisque
certains de ces composés sont toxiques pour la cellule. Au laboratoire, la purification et la
caractérisation des vésicules lipidiques est en cours. En particulier, nous réalisons des
expériences pour identifier les protéines éventuellement présentes dans ces structures, ainsi
que les composés du parfum qu’elles contiennent.
Nous n’avons donc pas prouvé formellement l’existence d’un processus de sécrétion
granulocrine dans le pétale de rose et l’hypothèse d’une sécrétion de nature écrine reste
ouverte. Selon Fahn (2000), dans le cas d’une sécrétion écrine, les molécules volatiles, de
faible poids moléculaire, sont transportées jusqu’à la membrane plasmique par un processus
moléculaire actif, ou par simple diffusion, sans participation de vésicules (Fig. 6).
Récemment, il a été montré que des métabolites secondaires pouvaient être véhiculés
par des transporteurs ABC liant l’ATP (Goossens et al., 2003 ; Stukkens et al., 2005). Ces
protéines ABC correspondent à une famille de protéines ubiquitaires dont la structure
moléculaire permet le transport de substrats variés à travers les membranes biologiques via la
liaison et l’hydrolyse de l’ATP. La liste des molécules transportées est impressionnante et
inclut des peptides, des sucres, des lipides, des acides inorganiques et des stéroïdes. Les
transporteurs ABC sont impliqués dans l’extrusion des composés cytotoxiques. Quand on sait
que certains composés volatils du parfum sont toxiques pour la cellule, on peut envisager
Discussion 175
qu’ils soient pris en charge par des transporteurs ABC. Chez Nicotiana plumbaginifolia, la
protéine membranaire NpPDR1 transporte un diterpène antifungique, le sclaréol ; elle est
impliquée dans les réactions de défense constitutives et induites par le jasmonate (Stukkens et
al., 2005). La recherche de ces protéines dans le pétale de rose pourrait se révéler
particulièrement intéressante. L’implication de protéines de structure différente mais pouvant
assurer la même fonction de transport, comme les LTP, est aussi à envisager.
III. L’absence de parfum chez les roses sélectionnées pour la fleur

coupée
La production du parfum est un processus complexe qui fait intervenir un très grand
nombre de voies métaboliques et probablement un très grand nombre de compartiments
subcellulaires. La compréhension des mécanismes qui ont abouti à la perte du parfum chez
certaines variétés sera probablement difficile. Afin d’apporter des informations sur les
mécanismes responsables de cette perte du caractère parfumé, nous avons comparé la variété
très parfumée ‘Papa Meilland’ à la variété inodore ‘Black Baccara’.
A. Le parfum des roses non parfumées

Les composés volatils de plusieurs roses considérées comme inodores ont été analysés
par extraction. Toutes les roses choisies (‘Royal Red’, ‘Royal Baccara’, ‘Black Baccara',
‘Rouge Meilland’) renferment dans leurs pétales, à des degrés divers, des composés volatils,
mais dans des quantités trop faibles pour être détectées par l’odorat humain. En général, ces
roses inodores ne produisent pas d’alcools monoterpéniques comme le géraniol, le citronellol
et le nérol. Néanmoins, la rose complètement dépourvue de parfum n’existe probablement pas
et cette absence de véritable « témoin négatif » a beaucoup pénalisé notre étude.
Nous avons étudié plus en détail les composés volatils de la rose ‘Black Baccara’, par
extraction et headspace. L’analyse montre, là encore, que si elle est dépourvue de parfum pour
l’homme, elle produit et émet des composés volatils, DMT et dérivés d’acides gras
principalement. Néanmoins, les quantités produites sont bien inférieures aux quantités
produites par la variété parfumée ‘Papa Meilland’. Shalit et al. (2004) ont aussi analysé la
rose inodore ‘Golden gate’ et constaté qu’un des seuls composé émis était le DMT. De plus,
chez ‘Black Baccara’, le rapport entre quantités émises et quantités dans le pétale est très
largement inférieur à ce même rapport chez la variété parfumée ‘Papa meilland’. Pour valider
Discussion 176
ce résultat, il faudrait le confirmer par des expériences similaires sur d’autres couples de
variétés. Il est néanmoins possible qu'il existe une barrière à l’émission des composés volatils
produits par la variété ‘Black Baccara’.
B. La structure des pétales des roses non parfumées est identique à celle
des roses parfumées
Au niveau ultrastructural, les pétales de la variété ‘Black Baccara’ et ceux des autres
variétés inodores que nous avons analysées ne présentent pas de différence majeure avec ceux
de la variété parfumée. Les cellules de l’épiderme supérieur évoluent de la même façon :
d’abord régulières et de petites tailles au stade BF, elles acquièrent leur forme caractéristique
conique en papille au cours du développement floral et se vacuolisent fortement. La
microscopie électronique à transmission révèle la présence des mêmes organites :
amyloplastes aux stades BJO, BO et BTO qui disparaissent lorsque la fleur est épanouie et
sont remplacés par des plastes à plastoglobules. Des plages de réticulum sont également
observées. Ainsi, toutes les structures caractéristiques des variétés très parfumées semblent
mises en place chez cette rose inodore. Après coloration au réactif de Nadi, de nombreuses
vésicules bleues de nature lipidique sont visibles. Cependant, aucune vésicule violette n’est
observée, ce qui témoigne de l’absence de terpènes en grandes quantités chez ces roses
inodores. Toutes ces observations, en microscopies optique et électronique semblent indiquer
que l'absence de parfum n’est pas liée à l'absence de structures cellulaires spécifiques.
C. L’hypothèse de la cuticule
Sur la base d’observations faites par les créateurs de variétés de rose, il est supposé
depuis longtemps que l’absence d’effluves est liée à une cuticule plus épaisse chez les roses
n’émettant pas de parfum. Des mesures montrent que les cellules de l’épiderme supérieur des
pétales des variétés ‘Papa Meilland’ et ‘Black Baccara’ sont recouvertes d’une cuticule de
même épaisseur. Ceci suggére que le défaut d’émission chez la variété ‘Black Baccara’ n’est
pas du à la barrière physique que représente l’épaisseur de la cuticule. Néanmoins, les
mesures ont été réalisées sur des clichés de microscopie électronique à transmission. Avec
cette technique, il n’est pas exclu que les différences d’épaisseur, si elles sont minimes, ne
soient pas détectées. Par ailleurs, l’épaisseur de la cuticule n’est probablement pas le seul
paramètre à prendre en compte. L’abondance en cires varie énormément d’une espèce à
l’autre : une cuticule riche en cires favorise le passage des substances lipidiques mais
constitue une barrière pour les composés hydrosolubles (Nepi et al., 1996). Goodwin et al.
Discussion 177
(2003) rapportent que la composition en cires de la cuticule pourrait être déterminante pour sa
perméabilité, notamment en définissant la taille du maillage pour la diffusion. Néanmoins, ces
auteurs ont aussi montré que la cuticule du pétale d’A. majus ne constituait pas une barrière
significative pour l’émission des composés volatils. Une étude de la composition chimique de
la cuticule ou d’autres propriétés physico-chimiques de celle-ci, chez des roses très parfumées
et des roses inodores permettrait d’éclairer cette question.
D. Les ressources carbonées chez les roses non parfumées

L’évolution des plastes au cours du développement floral est similaire chez les roses
non parfumées et les roses parfumées. Dans les fleurs au stade BF, les plastes ressemblent à
des chloroplastes. Les pétales aux stades BJO, BO et même BTO renferment de volumineux
amyloplastes. Lorsque les fleurs commencent à émettre des composés volatils, la taille des
grains d’amidon diminue et des plastoglobules lipidiques denses aux électrons apparaissent. Il
semble donc qu’il existe un lien très étroit entre ces trois événements : disparition de
l’amidon, apparition des plastoglobules et émission des composés volatils. Il est donc très
probable que l’amidon est utilisé pour la production de molécules parfumées. Nous avons
donc émis l’hypothèse que cet amidon était limitant chez les rose dépourvues de parfum et
qu’il existait un lien entre l’importance du stock d’amidon et la synthèse du parfum. Les
résultats de notre étude montrent que ce n’est pas le cas. L’accumulation d’amidon dans les
plastes des cellules du pétale et l'augmentation de D-glucose libre ne sont pas des facteurs
limitants dans la production de composés volatils du parfum chez les roses non parfumées. La
ou les causes de l’absence de parfum chez ces roses doit être recherchée dans d’autres
phénomènes.
IV. La DXR est impliquée dans la synthèse des terpènes chez la rose.
Les roses Hybrides de Thé parfumées synthétisent des grandes quantités de terpènes. Il
est maintenant largement admis que les monoterpènes sont synthétisés à partir de l'IPP et du
DMAPP, produits dans les plastes par la voie MEP identifiée en 1993 par Rohmer et al. La
DXR catalyse la deuxième étape clé de cette voie et la première étape engagée uniquement
dans la synthèse des terpènes (Takahashi et al., 1998).
Afin de mettre en évidence une corrélation entre la synthèse des terpènes dans le
pétale et la présence de la DXR, l’effet de son inhibiteur spécifique, la fosmidomycine, a été
Discussion 178
étudié. Les traitements à la fosmidomycine de fleurs de deux variétés de rose, produisant des
monoterpènes, ont eu le même résultat : la diminution de la production des monoterpènes.
Cependant cette diminution n’est pas très importante (18 % dans le cas de la variété ‘Papa
Meilland’). L’utilisation de fosmidomycine à 2 mM dans une culture enrichie en glandes
sécrétrices de menthe entraîne une diminution de 51 % de la production de monoterpènes
(Lange et al., 2001). Une expérience similaire à la nôtre a récemment été décrite chez A.
majus. Les fleurs entières sont mises en vases dans une solution de fosmidomycine 100 µM.
L’inhibition de l’émission des monoterpènes est de 60 % après les trois premières heures de
traitement. Chez la rose, nous avions réalisé quelques essais avec ce mode d’application, sans
succès, peut-être à cause de la taille de la fleur, qui est beaucoup plus importante que celle
d’A. majus. Néanmoins, il est possible que l’application de l’inhibiteur par infiltration ou la
concentration utilisée ne soient pas optimales. De plus, nous avons étudié la quantité de
terpènes présents dans le pétale et non leur émission, qui pourrait être affectée par le
traitement de manière plus importante. Bien que cela soit très peu probable (Dudareva et al.,
2005), il est également possible que l’inhibition de la voie MEP de synthèse de l’IPP par la
fosmidomycine soit contrebalancée par la voie MEV. En effet, des travaux récents sur le tabac
tendent à prouver que les deux voies ne sont pas strictement cloisonnées et qu’il existe des
passerelles entre elles (Hemmerlin et al., 2003). Des expériences complémentaires seraient
donc utiles pour déterminer si une inhibition plus complète, en particulier de l’émission des
composés, peut être obtenue. Quoi qu’il en soit, nos résultats montrent que la DXR est bien
impliquée dans la synthèse des terpènes chez la rose.
Un ADNc codant pour une DXR a donc été isolé à partir de pétales de rose. La
comparaison des différentes séquences connues révèle des pourcentages d’identité très élevés
entre les différentes DXR. Ceci peut s’expliquer par le fait que la DXR est impliquée dans
une voie de biosynthèse qui permet de produire des composés vitaux pour la cellule
(hormones : acide abscissique et gibbérellines ; chlorophylles, tocophérols, plastoquinones,
chaînes phytols,…). Tous les motifs conservés, indispensables pour l'activité catalytique de la
protéine, sont présents dans la séquence de rose.
La comparaison de la séquence de RhDXR avec les autres séquences DXR connues
met en évidence la présence d’un site de coupure d’une séquence d’adressage aux plastes dont
le motif est CSX, avec X représentant soit un groupement alanine, valine ou méthionine. La
partie N-terminale de la séquence en amont de ce site de coupure est peu conservée mais elle
est enrichie en résidus sérine, caractéristique des peptides d’adressage aux plastes (von Heijne
et al., 1989). La fusion de RhDXR à la GFP nous a permis de déterminer son adressage dans
Discussion 179
les cellules d’oignon, de tabac et de rose. Par comparaison avec le signal obtenu avec une
séquence connue pour assurer un adressage aux plastes, nous avons montré que RhDXR est
adressée aux plastes, quel que soit le système végétal considéré. Cette localisation plastidiale
avait été observée pour la première fois dans les feuilles d’A. thaliana (Carretero-Paulet et al.,
2002). Chez le maïs, Hans et al. (2004) ont montré par immunocytochimie que la DXR se
trouve dans des plastes très modifiés, autour des arbuscules des mycorhizes. Dans les
épidermes de rose, les plastes sont de deux types suivant le stade de développement,
amyloplastes aux stades BJO, BO et BTO et plastes à plastogloglobules aux stades BTO et
FE. Il est donc probable que RhDXR est localisée dans ces deux organites.
La complémentation d’une souche d’E. coli déficiente en DXR (Rodriguez-

Concepcion et al., 2001) a permis de confirmer que l’ADNc isolé chez la rose, RhDXR, code
bien pour une protéine fonctionnelle. La protéine contient un domaine riche en proline dont le
motif est P(P/Q)PAWPG(R/T)A. Ce domaine riche en en résidus proline, conservé dans la
forme longue de la DXR est probablement indispensable au bon fonctionnement de l’enzyme
puisque la forme courte de l’enzyme ne permet pas aux cellules mutées de se développer
normalement. Chez A. thaliana, un résultat similaire a été obtenu par Carretero-Paulet et al.
(2002) Ils concluent que ce domaine, absent des DXR procaryotes, contient des éléments
importants pour la stabilité et/ou l’activité, au moins dans le cas d’une expression chez E. coli.
L’analyse de la structure secondaire de la DXR (logiciel GOR4 : Combet et al., 2000) révèle
que ce domaine est compris dans une région ‘coil’, c’est-à-dire une région impliquée dans les
interactions protéine/protéine. Selon Carretero-Paulet et al. (2002), il pourrait intervenir dans
des interactions spécifiques avec des protéines régulatrices ou d'autres enzymes de la voie
MEP.
Parce que la DXR est la première étape clé de la voie MEP de biosynthèse des
terpènes plastidiaux, elle pourrait être un point clé de la régulation de cette voie. Ainsi chez A.
thaliana, l'expression du gène AtDXR est régulée au cours du développement et des quantités
importantes de transcripts s'accumulent dans les germinations et les inflorescences (Carretero-
Paulet et al., 2002). De même, les transcrits correspondant à la DXR s’accumulent dans les
cultures cellulaires de Catharanthus roseus, induite à produire des alcaloïdes terpéniques
(Veau et al., 2000). Enfin, lors de la mycorhization des racines de maïs, le gène DXR est
surexprimé dans les cellules colonisées par les champignons des mycorhizes arbusculaires.
Cette surexpression a pour conséquence l’accumulation de caroténoïdes qui pourraient jouer
un rôle dans la structure des mycorhizes (Hans et al., 2004). Toutes ces études plaident en
Discussion 180
faveur d’un rôle régulateur de la DXR dans les phénomènes considérés. Dans d’autres cas, la
DXR est exprimée de façon constitutive. Le mûrissement du fruit de tomate, associé à une
augmentation de la quantité de caroténoïdes, est un autre processus mettant en jeu la DXR.
Cependant, la régulation de la biosynthèse des caroténoïdes n'est pas assurée par au niveau de
la DXR, mais au niveau d’autres étapes, catalysées par la DXS (Rodriguez-Concepcion et al.,
2001) et l’HDR (hydroxyméthylbutényl diphosphate réductase, Botella-Pavia et al., 2004).
Récemment, la DXR de Ginkgo biloba a été isolée (Gong et al., 2005). Cette première DXR
de gymnospermes présente les mêmes caractéristiques que toutes les DXR d'Angiospermes
connues à ce jour. Une analyse phylogénétique montre que GbDXR est plus ancienne que les
autres DXR de plante. Le gène GbDXR est exprimé dans tous les tissus, même si l’ARNm est
moins abondant dans les feuilles.
Chez les roses Hybrides de Thé, l'étude de l’expression du gène DXR au cours du
développement de la fleur, en corrélation avec la production de terpènes a été réalisée. Nous
n’avons mis en évidence aucune corrélation entre l’expression du gène et la quantité de
terpènes produits dans les organes de la plante. De plus, les roses produisant une faible
quantité de terpènes ont le même taux d’expression de la DXR que celles qui en produisent
peu. Les travaux de Dudareva et al. (2005), portant sur la synthèse des terpènes par les pétales
d'A. majus, montrent que, chez cette espèce, le gène DXR s’exprimé dans tous les organes,
sauf les sépales, avec une expression préférentielle dans les lobes des pétales, organes
producteurs de terpènes. Le gène DXS, dont la protéine permet la synthèse du DXP, substrat
de la DXR, est fortement exprimé dans les lobes des pétales et les feuilles. De plus, la
rythmicité de la production du parfum suivant l’horloge circadienne est régulée par
l'expression du gène DXS. Selon les auteurs, l'absence d'oscillation rythmique des niveaux de
transcripts DXR pourrait être due à un rôle mineur de la DXR dans la régulation de la voie
MEP chez le muflier ou bien à une régulation post-transcriptionnelle de l'activité DXR
(Dudareva et al., 2005).
En conclusion, la régulation de la voie de biosynthèse des terpènes plastidiaux est
complexe et met probablement en jeu plusieurs enzymes, plus ou moins déterminantes selon
les phénomènes biologiques examinés. Dans le cas de la production des terpènes dans le
pétales, nos travaux indiquent que la DXR n’est probablement pas régulatrice. Néanmoins,
comme Dudareva et al. (2005), il est possible d'envisager une régulation post-
transcriptionnelle de l'activité DXR dans les pétales de rose en corrélation avec la production
des composés volatils du parfum. Afin de répondre à cette question, des expériences de
western blot, à l'aide d'un anticorps dirigé contre la DXR ainsi que des dosages d’activité dans
plusieurs variétés de rose et les différents organes, sont envisagés.
Discussion 181
Chez Mentha x piperita, l’expression du gène DXR est détectée par northern blot dans
des feuilles jeunes mais pas dans des feuilles matures (Mahmoud et Croteau, 2001). Ces
auteurs ont postulé que l'étape catalysée par la DXR est une étape régulatrice et que cette
enzyme est une cible potentielle pour le contrôle du flux dans la voie MEP. Ainsi, ils ont
montré qu'il était possible d’augmenter la quantité d’huile essentielle en surexprimant le gène
DXR chez la menthe. Chez la rose, l’expression du gène RhDXR ne régule probablement pas
in vivo la production des monoterpènes du parfum. Néanmoins, il est possible que sa
surexpression permette d’augmenter les quantités de composés produits, comme dans le cas
de la menthe. La transformation et la régénération de la rose n’étant pas encore maîtrisée,
nous avons choisi une autre plante facilement transformable, Nicotiana sylvestris. De plus,
cette espèce émet, entre autres, des terpènes suivant un rythme circadien avec un pic nocturne
d’émission, suggérant une pollinisation nocturne par des papillons (Raguso et al., 2003). Le
gène RhDXR a donc été introduit chez N. sylvestris sous le contrôle d’un promoteur constitutif
et la caractérisation des transformants au niveau moléculaire, ainsi que l'analyse des composés
volatils est en cours.
Pour conclure, nous avons isolé chez la rose un gène codant pour une DXR
fonctionnelle, dont l’expression ne semble pas liée à la production de parfum et dont la
surexpression chez le tabac est en cours. Dans le cas où la surproduction de RhDXR
permettrait d’augmenter les rendements en composés volatils chez le tabac, nous pourrions
transférer cette technologie dans le végétal cible : la rose. L’isolement et la caractérisation
d’autres enzymes de la voie MEP, potentiellement régulatrices, pourraient également être
envisagés. En particulier, la DXS, dont l’expression suit le rythme circadien d’émission des
composés volatils chez A. majus, semble une cible intéressante.
V. Une GPPS homodimérique ou hétéromérique chez la rose ?

Les monoterpènes, cycliques ou acycliques, sont synthétisés dans les plastes à partir de
la condensation de l’IPP et du DMAPP en GPP. Cette réaction est catalysée par la
prényltransférase GPPS. La première caractérisation d’un ADNc correspondant à la GPPS a
été réalisée en 1999 chez la menthe poivrée (Burke et al., 1999). La protéine est un
hétérodimère constitué de deux sous-unités de taille différente (28 et 37 kDa), qui prises
individuellement ne sont pas capables de produire du GPP. D’autres séquences de GPPS ont
Discussion 182
été isolées par la suite. Les études ont abouti à la conclusion qu’il existait deux types de
GPPS :
- Une forme homodimérique, isolée et caractérisée chez Arabidopsis thaliana (Bouvier
et al., 2000) et Abies grandis (Tholl et al., 2001 ; Burke et Croteau, 2002),
- Une forme hétérodi- ou hétérotétramérique, isolée et caractérisée chez la menthe
poivrée (Burke et al., 1999) et dans les pétales d’Antirrhinum majus (Tholl et al., 2004).
Lorsque nous avons cherché à isoler la GPPS de Rosa x hybrida, la GPPS
hétérotétramérique d’A. majus n’était pas encore connue et les GPPS homodimériques étaient
donc plus fréquentes que les GPPS hétérotétramériques. Nous avons postulé qu’il existait une
GPPS homodimérique chez R. x hybrida. Une recherche par oligonucléotides dégénérés a
abouti à l’isolement d’un ADNc de 1777 pb, correspondant à une protéine de 426 acides
aminés. Les domaines DDXXD et FQXXDDXXD impliqués dans la liaison de l’IPP et du
DMAPP, caractéristiques des prényltransférases, sont conservés dans la séquence isolée chez
la rose. La séquence protéique partage 64 et 20 % d’identité avec les séquences protéiques des
GPPS d’A. thaliana, et d’Abies grandis (AgGPPS2), respectivement. Burke et Croteau (2002)
avaient déjà noté les faibles pourcentages d’identité entre les séquences d’A. thaliana et d’A.
grandis. Les GPPS d’A. grandis sont beaucoup plus proches de la GGPPS de la même espèce.
Burke et Croteau (2002) en concluent qu’il est impossible de prédire la spécificité de substrat
d’une prényltransférase en anlysant sa séquence.
La caractérisation enzymatique de la protéine RhGPPS n’a pas permis de mettre en
évidence d’activité prényltransférase. Néanmoins, cela ne signifie pas pour autant que
l’ADNc isolé ne code pas pour une protéine fonctionnelle. En effet, la GPPS d’A. thaliana,
isolée et caractérisée par Bouvier et al. (2000) nous a servi de témoin d’activité GPPS. Or
dans nos conditions d’expérimentation, nous n’avons pas obtenu d’activité avec AtGPPS.
Cela peut signifier que nos conditions expérimentales ne permettent pas d'obtenir les protéines
sous leur forme active. Dans les expériences de Bouvier et al. (2000), AtGPPS est étudiée
sous la forme d’une protéine recombinante possédant une extension de 6 résidus histidine en
position C-terminale. Cependant, ces auteurs purifient la protéine par immunoprécipitation.
Ceci suggère que la production et la caractérisation de la GPPS sous forme active dans les
bactéries sont difficiles. De plus, la GPPS est en général une enzyme plastidiale (Soler et al.,
1992), présentant normalement un peptide d’adressage aux plastes, qui n’est pas prédit par les
logiciels bioinformatiques. Pour produire la protéine recombinante RhGPPS dans un système
bactérien, nous avons défini, par comparaison avec la séquence AtGPPS, une région N-
terminale d’adressage aux plastes et avons produit une protéine délétée de ce domaine. Il se
peut que la protéine recombinante ne corresponde pas à la protéine mature in vivo, ce qui
Discussion 183
expliquerait qu’elle ne soit pas fonctionnelle in vitro. Afin de déterminer sa localisation
subcellulaire, des expériences préliminaires de fusion de RhGPPS avec la GFP avaient été
effectuées par G. Scalliet (2003). L’observation de cellules transformées avec ces
constructions n’avait donné aucun résultat. Néanmoins, ces expériences devraient être
réalisées à nouveau, en fusionnant plusieurs zones de la protéine avec la GFP.
Pour conclure, d’autres systèmes d’expression devraient être mis en œuvre pour
caractériser la fonction de la protéine codée par l’ADNc isolé chez la rose. Une expérience
possible serait de surexprimer le gène RhGPPS dans une plante comme le tabac ou la rose. On
pourrait également inhiber son expression, par interférence d’ARN.
L’étude de l’expression du gène RhGPPS a été réalisée sur différents tissus de rose et
au cours du développement floral de rose de différentes variétés. Les résultats de RT-PCR
montrent que RhGPPS est exprimé de façon constitutive, et dans toutes les variétés, qu’elles
produisent ou non des monoterpènes. Là encore, il est possible qu'il existe une régulation
post-transcriptionnelle de l'activité GPPS chez la rose. Des western-blot avec un anticorps
dirigé contre la GPPS permettraient de le préciser. De tels anticorps, dirigés contre la GGPS
d’A. thaliana ont été testés chez la rose par G. Scalliet. Malheureusement, ils ne reconnaissent
pas la protéine de rose produite chez E. coli. (Scalliet, 2003). Chez A. majus et C. breweri, la
production de monoterpènes fait intervenir des GPPS hétérodimériques (Tholl et al., 2004).
La petite sous-unité est majoritairement exprimée dans les lobes du pétale qui produisent le
parfum alors que la grande sous-unité est exprimée de façon constitutive. Chez A. thaliana,
l’expression d’AtGPPS a été montrée par northern blot dans les feuilles.
Parce que la protéine GPPS isolée chez la rose n’est pas spécifique des pétales et de la
production de monoterpènes dans ceux-ci, nous avons pensé qu’il pouvait exister une forme
hétérodimérique comme chez A. majus (Tholl et al., 2004). Cette recherche chez la rose d’une
GPPS hétérodimérique n’a pas abouti.
Selon Bouvier et al. (2000), la différence observée entre les GPPS de Mentha et d’A.
thaliana pourrait être liée au fait que la GPPS de menthe est localisée dans les trichomes,
tandis que la GPPS d’Arabidopsis est localisée dans le parenchyme foliaire contenant des
chloroplastes. Néanmoins, chez A. majus, la GPPS est produite dans les cellules de l’épiderme
du pétale et non pas à l’intérieur de cellules spécialisées. Il n’existe donc pas de relation entre
la forme de GPPS et la localisation tissulaire.
La forme hétéromérique de la GPPS est selon toute vraisemblance largement
représentée chez les angiospermes puisqu’il a été possible de l’isoler dans différentes clades :
Discussion 184
Lamiacées (Mentha, Burke et al., 1999), Plantaginacées (Antirrhinum, Tholl et al. 2004) et
Onagracées (Clarkia, Tholl et al., 2004). Néanmoins, cette forme n’est pas présente chez
toutes les Angiospermes. En effet, il n’existe aucune GPPS hétéromérique dans le génome
totalement séquencé d’A. thaliana (Tholl et al., 2004). Par ailleurs, chez les Gymnospermes,
tels que Abies grandis, la séquence de la GPPS homodimérique ressemble à des GGPPS
(Burke et Croteau, 2002). Toutes ces données suggèrent que des activités GPPS ont évolué
indépendamment de nombreuses fois au cours de l’évolution des plantes. La caractérisation
récente d’une GPPS chez un insecte, qui présente des pourcentages d’identité très faibles avec
les GPPS de plantes va dans le même sens (Gilg et al., 2005).
Pour conclure, nous avons isolé chez la rose un ADNc codant pour une GPPS, mais
l’activité de la protéine correspondante n’a pas pu être démontré in vitro. Tous les éléments
sont réunis pour dire que, chez la rose, la GPPS est homodimérique comme chez Arabidopsis.
Il serait intéressant de poursuivre la caractérisation de cette enzyme. Dans un premier temps,
l’adressage de la protéine pourrait être étudié par le biais de protéines de fusion avec la GFP.
Dans un deuxième temps, l’effet de la surexpression ou de l’inhibition de l’expression du
gène RhGPPS sur la production des monoterpènes chez des espèces productrices d’huile
essentielle pourrait être évalué.
Au cours de mon travail de thèse, l’étude de la production du parfum des roses a été
appréhendée à différents niveaux et par différentes techniques.
Dans un premier temps, la caractérisation des pétales de rose, parallèlement à la
production de composés volatils du parfum, a permis de fournir le contexte structural
nécessaire pour l’étude des voies de biosynthèse et de leur régulation. Au cours de cette étude,
nous avons obtenu des résultats remarquables. En effet, pour la première fois, à notre
connaissance, nous avons mis en évidence que les deux épidermes du pétale sont impliqués
dans la production et l’émission des composés volatils du parfum. Nous avons également pu
observé des vésicules contenant des terpènes. Nous avons montré que l’absence de parfum
chez les roses inodores n’était pas due à une absence de structures sécrétrices.
Discussion 185
Nous avons isolé deux gènes potentiellement impliqués dans la synthèse des composés
monoterpéniques : RhDXR et RhGPPS. L’expression de ces deux gènes n’est pas différente
dans
les roses parfumées et dans celles qui sont dépourvues de parfum. La fonction de
RhGPPS reste à prouver. La fonction de l’autre protéine, RhDXR, a été démontrée, ainsi que
sa localisation plastidiale. L’effet de sa surexpression est actuellement testée dans des tabacs
transgéniques. La caractérisation d’autres gènes, notamment le gène codant pour la DXS, et
l’isolement de facteurs de transcription, permettraient de mieux comprendre les mécanismes
de la régulation de la production et de l'émission des composés volatils chez la rose.
Discussion 186
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Annexe 1 : Séquences des oligonucléotides utilisés par les techniques de biologie moléculaire.
Nom de Utilisation Séquence

l’oligonucléotide
DX1 Oligo sens dégénéré du GAYATHGTNGCNGARAATCC
gène DXR
DX6 Oligo antisens dégénéré ATNGGNARNCGCATRTCNGGCCA
du gène DXR
S1 Oligo sens dégénéré du GAGTACTTCTTCAAAATGGGAGTGGA
gène GPPS AGGGAAA
AS1 Oligo antisens dégénéré ACTTGGTCCTTGTAATGACTCTTTCAG
du gène GPPS TGAGATCT
DXR-RA-AS1 Amorce antisens de CCTTGCTCCCCAGGAATGATCTCAGG
RACE-PCR DXR 5’ CTTGTCT
DXR-RA-AS2 Amorce antisens de TAGGGCCACAACTCTGAACTTTTCGG
RACE-PCR DXR 5’ GATTTTC
(nested)
DXR-RA-S1 Amorce sens de RACE- TCGTCCATTCGATGATTGAAACTCAG
PCR DXR 3’ GATTC
DXR-RA-S2 Amorce sens de RACE- AGCACAGTTGGGTTGGCCGGATATGC
PCR DXR 3’ (nested) GACTAC
RA-AS2 Amorce antisens de TGACATTCAGAGCTGTTGACATTAAT
RACE-PCR GPPS 5’ AATAAGACC
RA-AS3 Amorce antisens de CACCCCCATTTTAAAGAAGTACTCAG
RACE-PCR GPPS 5’ CAGA
(nested)
RA-S1 Amorce sens de RACE- ACCTTCTAACTATCTTCGTCCTCACTC
PCR GPPS 3’ TCGGGCAA
RA-S2 Amorce sens de RACE- GGAATACAGAGGACAAGGGAGCTAG
PCR GPPS 3’ (nested) CAAGAAAACA
FL-DXR-S ADNc entier de la DXR GGGGTTCTTTGTTTTTTGGACTTTTGG
FL-DXR-AS ADNc entier de la DXR TTCATACATAAACAACCCCATCTACG
CCACATCTA
FL-GPPS-S ADNc entier de la GPPS TTCCCACCTTTCTGATTCGT
FL-GPPS-AS ADNc entier de la GPPS TCAACAGTGTGTTATTTGTGGTG
eA01A Amorce sens du fragment ATCCATTCATCACCACCGACTACA
du gène GAPDH
eA01B Amorce antisens du GCATCCTTACTTGGGGCAGAGA
fragment du gène
GAPDH
RTS-DXR Amorce sens de RT-PCR GGCCCTTTTGTTCTTCCTCTT
DXR
RTAS-DXR Amorce antisens de RT- CCGGCCAACCCAACTGTGCTA
PCR DXR
RT1-S Amorce sens de RT-PCR TGCGTGCAAGACAGCAATGTATAGCA
GPPS GAAGTGA
RT1-AS Amorce antisens de RT- GAGCAGTAATGATGCCATGGCGGATG
PCR GPPS TCA
DXR/GFP-S Amorce sens de fusion CCATCATGACTCTGAATCTGTCTCCA
Annexes 207
DXR-GFP dans le vecteur GCTGA
pCAT
DXR/GFP-AS2 Amorce antisens de CGCTCATGAACACCTGATCGACAAGA
fusion DXR-GFP dans le AGAG
vecteur pCAT
SurexDXR-S Amorce sens utilisée pour CACCTCTTTGTTTTTTGGACTTTTGGA
la surexpression du gène TTGC
RhDXR dans le tabac et la
fusion à la GFP dans un
vecteur GatewayTM
pK7FWG2-AS Amorce antisens utilisée TGCGAATACAGGGGTTGAACTTGTTG
pour la fusion à la GFP A
dans un vecteur
GatewayTM
SurexDXR-AS Amorce antisens de GCTCATGCGAATACAGGGGTTGAACT
surexpression du gène TGTTGAGC
RhDXR dans le tabac
Compl-Bor-S Amorce sens de la forme CCGGATCCCAAGCACCACCTC
longue de la DXR pour le
vecteur pQE30
DXR-Compl-S2 Amorce sens de la forme GGGGGATCCGCTTTTCCGGAGCCCGG
courte de la DXR pour le CCG
vecteur pQE30
DXR-Compl-AS Amorce antisens de la CCCGTCGACCGAATACAGGGGTTGAT
DXR pour le vecteur G
pQE30
DXR-L70-S Amorce sens de la forme CCCGCATGCAAGCACCACCTC
longue de la DXR pour le
vecteur pQE70
DXR-S70-S Amorce sens de la forme CCCGCATGCCAAAGCCTAT
courte de la DXR pour le
vecteur pQE70
DXR-70-AS Amorce antisens de la CCCGGATCCTGCGAATACAG
DXR pour le vecteur
pQE70
ExpRGS Amorce sens de la GPPS GCGGGATCCTCTGATGAGCTATCACT
pour le vecteur pGEX- TATTGCT
KG
ExpRGAS Amorce antisens de la CGCGAGCTCTTACTTCGTTCTTGTAAT
GPPS pour le vecteur GACTAG
pGEX-KG
Annexes 208
Annexe 2 Composition du tampon d’infiltration utilisé lors de la transformation
transitoire par Agrobacterium tumefaciens.
Mes 500 mM 1 mL
Na2HPO4, 7H20 200 mM 0,1 mL
Glucose 0,05 g
Acétosyringone (3,5 diméthoxy 4-hydroxy acétophénone) 50 mM 100 µl
H2O qsp 50 mL
Annexe 3 : Composition des gels SDS-PAGE 10 %
Gel de résolution (pour 2 gels)

Acryl / bis-acryl (BIORAD) 2,5 mL
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 4 mL
Glycérol 40 % 3 mL
H20 2,3 mL
SDS 20 % 60 µL
TEMED 12 µL
Persulfate d’ammonium 10 % 120 µL
Gel de concentration ( pour 2 gels)
Acryl / bis-acryl (BIORAD) 400 µL
Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 1,24 mL
H20 3,36 mL
SDS 20 % 18 µL
TEMED 12 µL
Persulfate d’ammonium 10 % 120 µL
Annexes 209
Annexe 4 : Composition des milieux T et TT utilisés lors de la transformation stable de
Nicotiana sylvestris.
Milieu TT de callogénèse et Milieu T d’entretien et

de régénération (1 litre) d’enracinement (1 litre)
MS5524 4,4 g
MS5519 4,4 g
Vitamins B5 de Gamborg
2 ml
(X500)
Saccharose 30 g 20g
Agar 8g 8g
pH 5,6 ou 5,7 5,8
BAP 1 mg 0,1 mg éventuellement
ANA 0,1 mg
Augmentin 400 mg
Kanamycine 200 mg 200 mg
Les hormones et antibiotiques, stérilisés sur filtre 0,22 µm, sont ajoutés au milieu
après 20 min d’autoclavage à 120°C.
Milieux (références Sigma-Aldrich)
composés M5524 (mg/L) MS6899 (mg/L)

Nitrate d'ammonium 1650,0 1650,0
Acide borique 6,20 6,20
Chlorure de calcium anhydre 332,20 332,20
Chlorure de cobalt hexahydraté 0,025 0,025
Sulfate de cuivre pentahydraté 0,025 0,025
EDTA (dihydrate de sodium) 37,26 37,26
Sulfate de fer heptahydraté 27,8 27,80
Sulfate de magnésium anhydre 180,7 180,70
Sulfate de manganèse 16,9 16,90
Myo-ionositol 100,0
Iodure de potassium 0,83 0,83
Nitrate de potassium 1900,00 1900,0
Phosphate de potassium monosodique 170,00 170,0
Molybdate de sodium dihydraté 0,25 0,25
Hydrochlorure de thiamine 0,40
Sulfate de zinc heptahydraté 8,60 8,60
Annexes 210
Annexe 5 : Séquence nucléotide de RhDXR
Annexes 211
Annexe 6 : Séquence nucléotidique de RhGPPS
Annexes 212
Annexe 7 : Séquence nucléotidique d’un fragment de la séquence NsDXR, amplifié
avec les amorces dégénérées DX1 et DX6
Annexes 213
Annexe 8 : Polymorphisme de site de restriction dans la région du gène DXR amplifié
avec les amorces RT--DXR
Séquence du site de restriction EcoRV : GAT’ATC
Annexes 214

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UNIVERSITE JEAN MONNET

Discipline : Biologie Végétale

Biosynthèse et sécrétion du parfum

Soutenue le 22 novembre 2005, devant le jury composé de :

Mme HOSSAERT-MCKEY Directeur de recherche CNRS, Montpellier Rapporteur

UNIVERSITE JEAN MONNET

Discipline : Biologie Végétale

Biosynthèse et sécrétion du parfum

Soutenue le 22 novembre 2005, devant le jury composé de :

Mme HOSSAERT-MCKEY Directeur de recherche CNRS, Montpellier Rapporteur

Je remercie également Laurent Legendre, directeur du laboratoire, pour m'avoir

Je souhaite remercier le professeur Martine Hossaert-McKey et le professeur Pascal

Je tiens à remercier plus particulièrement Philippe Hugueney pour toutes les

Au sein du laboratoire, je tiens à remercier David Roujol, Caroline Joly et Florence

Il me reste à remercier Sandrine Moja, Françoise Berger, Corinne Marcon et Caroline

I- La rose, histoire et importance économique

Le nombre de chromosomes des rosiers varie de 2n = 2x = 14 à 2n = 8x = 56, mais la

2. domestication des Roses

B. Les utilisations des Roses

1. La création de rosiers de jardin

2. La production de fleurs coupées

3. La production d’huiles essentielles

1. Les grandes catégories de composés volatils

2. Les variétés parfumées

Figure 2 : Composés volatils du parfum de rose appartenant à trois classes de composés.

Composé Impression aromatique

Tableau 3 : Classification du parfum des roses (d'après Nakamura, 1987)

Thé R. x hybrida 'Lady Hillingdon'

Fruité R. x hybrida 'Harmonie'

II. Le rôle des composés volatils et les structures sécrétrices

1. L’attraction des pollinisateurs

Figure 3 : Relation entre la fleur de l'orchidée Ophrys sphegodes et son pollinisateur, un

2. La défense contre les herbivores

a. Les réactions de défense directe

b. Les réactions de défense indirecte

3. Le cas des Roses

B. Les structures sécrétrices

1. Les cellules sécrétrices des pétales

2. L’exemple des trichomes sécréteurs

3. Les mécanismes cellulaires de la sécrétion

Figure 7 : Sécrétion granulocrine par l’appendice de Sauromatum guttatum (d’après

III. La biosynthèse des composés volatils

A. Les terpènes, composés majoritaires des roses

1. La biosynthèse du précurseur, l’IPP

Figure 8 : Voie du mévalonate (MEV) de biosynthèse de l'IPP (d’après Rodriguez-

b. La voie du 2C-méthyl-D-érythritol 4-phosphate

Figure 9 : Voie MEP plastidiale de synthèse de l'IPP (d'après Rodriguez-Concepcion et

Gène Espèce Référence bibliographique

DXR A. thaliana Schwender et al., 1999

CDP-MEP synthase A. thaliana Rohdich et al., 2000a

CDP-ME kinase L. esculentum Rohdich et al., 2000b

HDS A. thaliana Gutiérrez-Nava et al., 2004

IDS L. esculentum Botella-Pavía et al., 2004

Æ La DXR chez les plantes

2. Les étapes de l’IPP aux terpènes

Il existe trois types de prényltransférases (Fig. 10) :

IPP DMAPP IPP DMAPP

Sesquiterpènes (C15) Triterpènes (C30)