Etude de la symbiose mutualiste entre Sitophilus oryzae et la bactérie intracellulaire Sodalis

pierantonius : visualisation, localisation et quantification du bactériome

Camille AMOURETTE1, Pauline BRETON1, Barbara DUROY1
1
INSA Lyon, Villeurbanne, France
Date : 22 avril 2022
Mots clés : Symbiose mutualiste, Sitophilus oryzae, Sodalis pierantonius, bactériome

Le charançon des céréales, ou Sitophilus oryzae, est un insecte ravageur responsable de la destruction de 25% des stocks céréaliers dans le monde. Il
héberge une bactérie symbiotique intracellulaire, Sodalis pierantonius, qui complémente sa nutrition et améliore sa fitness. Durant son développement
embryonnaire, il met en place les bactériocytes, des cellules spécialisées regroupées en un organe appelé le bactériome, pour accueillir la bactérie.
L’étude de cette symbiose mutualiste présente deux intérêts principaux. D’une part, ce coléoptère est l’un des plus gros ravageurs de cultures et stocks
de céréales à travers le monde et l’objectif de la France est de réduire de 50% son utilisation de pesticides chimiques d’ici 2025. Comprendre sa
symbiose mutualiste et nutritionnelle avec la bactérie S. pierantonius pour pouvoir la perturber est donc une stratégie alternative pour contrôler cet
insecte. D’autre part, cette symbiose avec S. pierantonius est relativement récente au regard de l'évolution. Les recherches sur ce sujet permettent
donc d’analyser les étapes précoces de l'établissement d'une symbiose entre les eucaryotes et les procaryotes.
Il est possible d’obtenir artificiellement en laboratoire des charançons dépourvus de symbiotes, appelés aposymbiotiques. Mêm e si ces derniers sont
viables, des différences sont observables par rapport à leurs homologues symbiotiques, notamment au niveau de la couleur et de la taille de leur
cuticule. L’hypothèse selon laquelle ces différences seraient liées à l'état symbiotique des charançons est émise.
Les méthodes d’hybridation in situ en fluorescence (FISH), cytométrie en flux et PCR quantitative permettront de visualiser, localiser et quantifier les
symbiotes au sein des tissus de l'hôte. Les bactéries sont présentes en très grande quantité les premiers jours de vie du charançon, et disparaissent
complètement au quinzième jour.
donc proportionnelle à la concentration bactérienne. Sur la Figure
Introduction 1, la quantité de bactéries symbiotiques chute entre le 5ème et le
Le charançon ou Sitophilus oryzae et la bactérie intracellulaire 15ème jour de vie des charançons. Les bactéries sont nettement
Sodalis pierantonius sont en symbiose mutualiste. Il s’agit d’une moins nombreuses au 15ème jour, avec quelques persistantes
interaction entre les deux êtres vivants qui apporte à chacune des seulement.
espèces des avantages évolutifs. Ainsi, cette relation permet à S. Les symbiotes sont principalement concentrés aux extrémités des
oryzae, un insecte ravageur de cultures céréalières, de supplémenter intestins, dans des cellules appelées les bactériocytes. Les intestins
sa nutrition en vitamines et acides aminés (Tyrosine et des charançons de 15 jours sont semblables à ceux des charançons
Phénylalanine), importants pour la formation de la cuticule aposymbiotiques de 5 jours, qui sont eux, quasiment sans bactéries.
notamment, grâce à la bactérie symbiotique. Cette dernière se situe
dans des cellules spécialisées nommées bactériocytes, elles-mêmes
regroupées en un organe, le bactériome.
Lors du passage du stade larvaire au stade adulte grâce à la
métamorphose, les charançons sauvegardent et réutilisent les
bactéries symbiotiques pour leur développement, puis les
transmettent aux générations suivantes par les ovocytes.
A l’heure actuelle, pouvoir contrôler ce ravageur est un enjeu majeur Figure 1 - Traitement d’image provenant d’une manipulation FISH sur les intestins
de charançon par le logiciel Fiji. A : intestins de charançons symbiotiques âgés de
afin de protéger les cultures et stocks de céréales à travers le
5 jours (SymJ5) ; B : intestins de charançons symbiotiques âgés de 15
monde. Être capable de perturber la symbiose nutritionnelle entre jours (SymJ15) ; C : intestins de charançons aposymbiotiques âgés de 5 jours
le charançon et sa bactérie représenterait une alternative durable à (ApoJ5). L’image des intestins marqués au DAPI (filtre cyan) est superposée à
l’utilisation de produits chimiques, car aucun des deux ne peut l’image des intestins marqués par la sonde hybridée à l’ARN 16S bactérien (filtre
survivre sans cette relation symbiotique mutualiste. magenta hot).
Cette étude a donc pour but de confronter les différences entre les
charançons symbiotiques (Sym) et aposymbiotiques (Apo) de trois Cytométrie en flux
(J3), cinq (J5) et quinze jours (J15) et de visualiser, localiser et La cytométrie permet de déterminer quantitativement le nombre de
quantifier les symbiotes au sein des tissus de l’hôte. L’hypothèse bactéries symbiotiques présentes dans les intestins des charançons
selon laquelle les différences observées entre les différents individus à différents stades de développement. Sur la Figure 2, il est possible
seraient liées à l'état symbiotique des charançons sera testée au d’observer que le nombre de bactéries marquées est beaucoup plus
cours de cette étude. important chez SymJ5 que dans les autres conditions. Le nombre de
bactéries est également plus important chez ApoJ5 que chez
SymJ15, ce qui ne semble pas cohérent. En effet, plus de bactéries
Résultats et discussion
devraient être observées chez les charançons SymJ15 que chez les
Fluorescence in situ Hybridization (FISH) charançons ApoJ5, sans symbiotes. Les mêmes résultats ayant été
La microscopie à épifluorescence permet d’observer la présence et observés par les autres groupes, la question d’un potentiel souci
la localisation de bactéries intracellulaires dans les intestins de avec la transformation des charançons aposymbiotiques peut être
charançons à différents stades de leur développement, et en posée.
condition aposymbiotique. Le nombre de bactéries marquées selon le type de charançon
Le DAPI colore spécifiquement l’ADN, donc les noyaux de toutes les étudié, ainsi que dans le contrôle négatif sont indiqués dans
cellules. La sonde utilisée est hybridée à l’ARN 16S des bactéries et l’histogramme de la Figure 2. Le nombre de bactéries mesurées
permet de visualiser leur emplacement. L’intensité du marquage est
1
dans le contrôle négatif est très faible (153) et est donc négligeable. PCR quantitative
La valeur mesurée pour les charançons SymJ5 est largement La PCR quantitative permet d'établir un ratio entre la quantité
supérieure à celle des charançons SymJ15 (908 fois plus grande), et d'ADN procaryote et eucaryote, et donc de quantifier les bactéries
elle est 154 fois plus grande que chez les ApoJ5 cela confirme donc symbiotiques présentes dans les tissus de l’hôte. Cette technique
les observations faites avec l’analyse FISH. permet de confirmer les résultats obtenus par cytométrie.
Les résultats de la qPCR avec les pentes des droites d’étalonnage et
l’efficacité de chaque réaction sont reportés dans le Tableau 1.
Tableau 1 - Résultats obtenus de la pente de la droite d'étalonnage pour les gènes
β-actine et nuoCD et calcul de l'efficacité de la PCR d'après les formules données
dans Matériel et Méthodes

Pente de la droite Efficacité Pourcentage

d’étalonnage de la PCR d’efficacité (%)
β-actine -3,42 1,96 96
nuoCD -3,87 1,81 81

Les résultats des pourcentages d’efficacité doivent être compris

Figure 2 - Histogramme représentant le nombre de bactéries marquées dans le
contrôle négatif (SymJ5 non marqué) et dans les échantillons, selon le type de
entre 90 et 110% pour être considérés comme acceptables. Les
charançon (symbiotique ou aposymbiotique) et selon le stade de développement primers de la réaction pour le gène de la β-actine sont donc
suffisants, mais pas ceux pour nuoCD.
Analyse morphologique Par ailleurs, le gène hôte β-actine, a des valeurs supérieures de Ct à
Afin de déterminer pourquoi la bactérie symbiotique du charançon, celles du gène bactérien nuoCD, alors qu’ils avaient la même
S. pierantonius, ne colonise pas les tissus autres que les ovocytes et concentration initiale et ont été obtenus dans les mêmes conditions
les intestins malgré sa présence abondante dans les bactériocytes, de réaction. Le pourcentage d’efficacité de la β-actine est ainsi
une comparaison de morphologie a été réalisée entre cette dernière supérieur à celui de nuoCD. L’amplification de la β-actine par PCR
et E. coli, une bactérie pathogène non symbiotique. présente donc une meilleure sensibilité, notamment pour de faibles
concentrations en ADN matrice.
La condition SymJ5 a été définie comme référence car c’est là qu’il
y a le plus de symbiotes. Le ratio du nombre de gènes bactériens
sur le nombre de gènes eucaryotes dans différentes conditions
entre est donc calculé et les résultats sont présentés sur la Figure 5.
Les charançons ApoJ5 ont une densité bactérienne de 0%, ce qui
indique la fiabilité des résultats. Le nombre de bactéries augmente
Figure 3 - Observation de E. coli (à gauche) et S. pierantonius (à droite) au chez les coléoptères symbiotiques jusqu’au cinquième jour, où le
microscope à fluorescence et traités sur FIJI®
nombre maximal de symbiotes est atteint. Puis, cette densité
bactérienne chute pour n’être plus qu’à 2% au quinzième jour de
Grâce au logiciel FIJI®, de nombreuses caractéristiques des
vie du charançon.
bactéries S. pierantonius ont pu être observées, comme leur
Cependant, plus de bactéries que la normale dans les intestins de
périmètre, leur aire, leur circularité, … Initialement, les deux types de
des ApoJ5 ont été trouvées. L’hypothèse que la transformation des
bactéries font à peu près la même taille (autour de 1µm). Il est
charançons aposymbiotiques ne s’est pas faite à 100% est donc
possible d’observer sur la Figure 4 que les bactéries symbiotiques
émise.
ont une aire moyenne significativement plus grande que celle de E.
coli. Une hypothèse plausible serait que les bactéries S. pierantonius
sont mises en contact avec un peptide anti-microbien exprimé par 120
100
le charançon qui peut perturber la biologie des bactéries,
Densité bactérienne (%)

100
notamment la division cellulaire, qui devient alors trop grande pour
pouvoir sortir des bactériocytes. 80

60

40 28
20
2 0
0
SymJ3 SymJ5 SymJ15 ApoJ5
Condition

Figure 5 - Densité bactérienne dans les tissus du charançon en fonction de

différentes conditions, résultats normalisés par rapport à l’individu SymJ5

Figure 4 - Aire moyenne des bactéries, avec la p-value **=1,55x10-13

2
 Etude du taux de survie des charançons exposés à meilleure protection aux différentes variations de leur
différentes conditions environnementales environnement.
Des charançons symbiotiques et aposymbiotiques âgés de 5 jours
ont été placés dans différentes conditions de température et Conclusions et perspectives
d’humidité afin de voir si la présence de bactéries symbiotiques a A l’aide des différentes techniques étudiées, il a été possible de
un effet sur leur taux de survie sous différentes pressions visualiser, localiser et quantifier les bactéries symbiotiques Sodalis
environnementales. pierantonius chez Sitophilus oryzae. Ces bactéries semblent servir à
Tableau 2 - Taux de survie (%) des charançons en fonction des conditions testées former la cuticule des charançons, mais une fois que celle-ci est
pendant 11 jours
finie, ils se débarrassent des symbiotes présents dans leurs intestins.
Contrôle (27°C 32°C 32°C 27°C 4°C Il a été découvert que la quantité de symbiotes augmente chez les
+ 70% réplicat réplicat sec (arrêté charançons jusqu’au 5ème jour puis diminue jusqu’à une quasi-
d’humidité) 1 2 à J+7) disparition au 15ème jour. A ce stade-là, l’insecte a éliminé les
Symbiotique 100 6,67 63,63 0 26,7 bactéries de son intestin, ce qui signifie qu’il n’en a pas besoin dans
Aposymbiotique 93,3 0 10 0 33,3 le reste de sa vie car le rapport coût/bénéfice n’est plus intéressant
pour lui. Cependant, une partie des bactéries symbiotiques est
conservée dans les ovaires des femelles pour les transmettre à la
descendance. Il serait donc intéressant de regarder les bactéries
dans les ovocytes en afin de compléter les observations faites.
Pour compléter cette étude, des recherches pourraient donc être
menées pour comprendre par quel(s) phénomène(s) la bactérie
symbiotique est éliminée de l’intestin des charançons. Au vu des
images du FISH, il est possible d’émettre l’hypothèse que ce ne sont
pas seulement les bactéries qui disparaissent, mais également les
cellules qui les contiennent, les bactériocytes. L’hôte tue-t-il les
bactéries ? Ou meurent-elles par mort cellulaire ? Pour répondre à
ces questions, il serait intéressant de voir s’il y a des marqueurs de
mort cellulaire telles que l’apoptose ou la nécrose, présents lors de
la disparition des symbiotes. De plus, une analyse transcriptomique
par RNA-Seq pourrait permettre d’observer s’il y a des changements
Figure 6 - Courbes de survie des charançons en fonction des différentes conditions d’expression des gènes pour comprendre lesquels sont impliqués
testées dans cette disparition.
Par ailleurs, la comparaison morphologique entre Sodalis
Il est possible d’observer sur le Tableau 2 et la Figure 6, que les pierantonius et E. coli a permis d’émettre l’hypothèse selon laquelle
charançons aposymbiotiques semblent, de manière générale, plus l’hôte libère des peptides antimicrobiens dans son intestin,
sensibles aux stress environnementaux que les charançons bloquant la division de l’ADN de la bactérie et empêchant ainsi les
symbiotiques. Cela se retrouve même dans les courbes de survie des symbiotes de sortir des bactériocytes à cause de leur taille trop
charançons à 27°C et 70°C d’humidité qui sont les conditions idéales importante.
de culture des charançons : les charançons symbiotiques gardent Enfin, une amorce de recherche de l’impact des conditions
un taux de survie de 100% tout du long de l’expérience, alors que environnementales sur la survie des charançons symbiotiques et
celui des charançon aposymbiotiques baisse au bout d’un jour puis aposymbiotiques a également été réalisée au cours de ces
reste stable. Pour les autres conditions, comme à 32°C et à 27°C sec, expériences. La différence phénotypique majeure observée entre
des taux de survie identiques le premier jour sont observés, avant charançon symbiotique et aposymbiotique concerne la couleur et
d’avoir une baisse chez les deux types de charançons, mais plus la taille de leur cuticule. Il a été montré que les charançons
rapide chez les aposymbiotiques. Le stress qui semble avoir l’effet symbiotiques survivent globalement mieux aux variations de
le plus important sur les charançons est la perte d’humidité. En effet, conditions environnementales que les aposymbiotiques.
à 27°C sec, le taux de survie passe très rapidement à zéro. Pour la L’hypothèse selon laquelle l’ensemble de ces différences seraient
condition à 4°C, l’expérience n’a pas pu être menée jusqu’à la fin car liées à l'état symbiotique des charançons est donc vérifiée. Et leur
les charançons ont été sortis de leurs conditions de culture trop tôt, cuticule joue probablement un rôle dans la survie au stress
mais dans cette condition, les charançons aposymbiotiques
environnemental mais cela reste à démontrer par d’autres
semblent très légèrement mieux résister à la basse température.
méthodes.
Cela semble incohérent par rapport aux autres résultats et peut être
expliqué par le fait que les charançons aposymbiotiques ont peut- Une meilleure compréhension de ces phénomènes pourrait ainsi
être eu un problème de transformation. Ces résultats seront donc permettre de trouver des solutions naturelles pour lutter contre ce
ignorés.
ravageur de cultures de céréales à travers le monde.
Finalement, les observations faites semblent indiquer que les
bactéries symbiotiques aident les charançons à mieux résister et
plus longtemps aux différents stress environnementaux. Cela Matériel et méthodes
pourrait être dû au fait que les bactéries semblent impliquées dans Fluorescence in situ Hybridization (FISH)
la formation de la cuticule des charançons, ce qui leur offrirait une La technique FISH permet de visualiser et localiser les symbiotes
dans les tissus intestinaux des charançons. Il y a marquage des ARN
3
16S du symbiote par des sondes ADN fluorescentes spécifiques et bactérie, est rapporté au nombre de copies du gène β-actine, de
marquage des acides nucléiques au sein des tissus de l’hôte au l’ADN du charançon, afin de donner une indication de la densité du
DAPI. L’observation est faite au microscope à fluorescence ou symbiote dans les tissus eucaryotes de l’hôte.
cytométrie en flux. Les images sont ensuite analysées avec le Extraction de l’ADN
logiciel Fiji. Dans un premier temps, un individu de chaque condition est isolé
L’expérience est réalisée sur des intestins de charançons puis congelé à -80°C. Puis son ADN est extrait à l’aide du kit
symbiotiques de 5 et 15 jours et aposymbiotiques de 5 jours, Macherey Nagel « Genomic DNA from Tissue » de NucleoSpin. Ce
préalablement fixés dans du PFA 4% pendant 24h (cinq réplicas par dernier permet d’extraire de l’ADN génomique à partir de cellules
condition). Un pré-traitement est ensuite réalisé afin de ou de tissus, sur une membrane de gel de silice (cf. Protocole p8).
perméabiliser les membranes et déprotéiniser les cellules des PCR quantitative
intestins. Une étape de pré-hybridation a ensuite lieu, où l’ARN 16S L’ADN génomique est ensuite amplifié et quantifié grâce à une
des bactéries symbiotiques est hybridé avec une sonde ADN qPCR en SYB-Green, un intercalant de l’ADN qui est 20 fois plus
spécifique. L’hybridation a ensuite lieu, les inserts sont lavés et fluorescent quand il est lié que sous forme libre. La mesure de la
déposés dans une plaque 24 puits avec un mélange de DAPI et de fluorescence émise permet ainsi de mesurer la quantité d’ADN
glycérol. Enfin les échantillons sont montés sur une lame de synthétisé à chaque cycle d’amplification.
microscope, dans du glycérol et maintenus à l’obscurité afin d’éviter La méthode de qPCR relative est utilisée : ApoJ5 est défini comme
le photoblanchiment. Les lames sont observées au microscope contrôle car il est considéré comme ne contenant pas de symbiotes.
Olympus IX81, sous filtre bleu pour le DAPI (350nm – 470nm), rouge SymJ5 est l’individu qui a le plus grand nombre de symbiotes. Ainsi,
pour la sonde couplée au tetramethylrhoamide TRITC (535nm - une gamme étalon de l’échantillon SymJ5 réalisée par dilutions en
610nm) et vert FITC pour l’autofluorescence (480nm - 535nm). série (dilution 10, 100, 1 000, 10 000), ainsi qu’un mix de PCR (3µL
Cytométrie en flux d’eau du kit ROCHE, 0.5µL de primer Forward, 0.5µL de primer
La cytométrie en flux permet de compter le nombre de bactéries Reverse, 5µL de Master mix ROCHE) sont préparés pour chaque
présentes dans les intestins des charançons étudiés (Sym J5, Sym gène à amplifier (cf. Protocole p11-12). 1µL d’ADN purifié et 9µL de
J15 et Apo J5). Cette technique permet une caractérisation rapide et mix sont déposés dans chaque puits d’une plaque 96 puits.
précise des cellules. A la sortie, la taille (mesure FSC) et la granularité Les droites d’étalonnage sont alors tracées en fonction des cycles
(mesure SSC) des cellules présentes dans l’échantillon sont Threshold (Ct) de chaque réaction de PCR. La valeur de leur pente
obtenues. Le cytomètre utilisé est un cytomètre BD Accuri TM C6. permet de calculer l’efficacité de la PCR grâce à l’Équation 1. Les
Afin d’analyser les bactéries présentes dans l’intestins des deux gènes sont amplifiés dans les mêmes conditions, ce qui
charançons, trois intestins par condition étudiée ont été isolés, permet de comparer la valeur obtenue du cycle Threshold de
broyés (afin de casser les cellules eucaryotes) puis centrifugés (pour manière significative. De plus, avant d’interpréter les résultats, il est
éliminer les gros déchets). Le culot a ensuite été fixé chimiquement nécessaire de vérifier qu’il n’y a pas eu de contamination du produit
au PFA 4%, lavé au PBS puis filtré sur membrane de nylon 50µm afin en visualisant la melting curve.
de ne récupérer que les bactéries. Chaque échantillon a ensuite été Équation 1 – Formules de détermination de l'efficacité absolue de la qPCR
centrifugé de nouveau puis repris dans du PBS.
∆𝐶𝑡 𝑁𝑢𝑜𝐶𝐷 = ∆𝐶𝑡 𝑁𝑢𝑜𝐶𝐷 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟ô𝑙𝑒 𝐴𝑝𝑜 − ∆𝐶𝑡 𝑁𝑢𝑜𝐶𝐷 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟ô𝑙𝑒 𝑒𝑥𝑝é𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙
Afin d’analyser les échantillons obtenus au cytomètre, 3µL d’un mix
∆𝐶𝑡 𝛽𝑎𝑐𝑡𝑖𝑛𝑒 = ∆𝐶𝑡 𝛽𝑎𝑐𝑡𝑖𝑛𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟ô𝑙𝑒 𝐴𝑝𝑜 − ∆𝐶𝑡 𝛽𝑎𝑐𝑡𝑖𝑛𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟ô𝑙𝑒 𝑒𝑥𝑝é𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙
IP/Syto9 ont été ajoutés dans 10µL de l’échantillon afin de marquer −
1
𝐸 = 10 𝑝𝑒𝑛𝑡𝑒
les cellules, pour que le cytomètre puisse les détecter. Ces deux
%𝑒𝑓𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖𝑡é = (𝐸 − 1) × 100
marqueurs sont des intercalants de l’ADN : l’IP fluoresce dans (𝐸𝑁𝑢𝑜𝐶𝐷 )∆𝐶𝑡 𝑁𝑢𝑜𝐶𝐷
l’orange et se fixe sur l’ADN des cellules mortes, alors que le Syto9 𝐸𝑓𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖𝑡é 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑒 =
(𝐸𝛽𝑎𝑐𝑡𝑖𝑛𝑒 )∆𝐶𝑡 𝛽𝑎𝑐𝑡𝑖𝑛𝑒
fluoresce dans le vert et s’intercale dans l’ADN de toutes les cellules. L’efficacité de la PCR peut varier en fonction de différents
Cela permet de distinguer les bactéries vivantes des bactéries paramètres : la qualité de l’échantillon, l’efficacité du Master Mix et
mortes. le dosage.
Le témoin négatif était constitué de 50µL de l’échantillon SymJ5 qui
n‘ont pas été marqués, et le blanc a été réalisé avec du PBS. Les Etude du taux de survie des charançons exposés à
solutions de 10µL ont ensuite été analysées. L’excitation des différentes conditions environnementales
marqueurs a été réalisée à 488nm et la valeur du threshold fixée à Des charançons symbiotiques et aposymbiotiques âgés de 5 jours
5500. sont placés dans des bocaux fermés, avec renouvellement d’air et
nourriture en abondance. Les bocaux sont ensuite placés dans
Analyse morphologique
différentes conditions environnementales : 27°C (conditions
Un échantillon des bactéries récupérées pour la cytométrie (sans le
normales), 2 réplicats à 32°C, 27°C avec une humidité ambiante
mix IP/Syto 9) a été utilisé pour observer les bactéries symbiotiques
faible et 4°C. Les charançons vivants et morts sont ensuite
au microscope à fluorescence Olympus IX81. Le marquage des
comptabilisés à J+1, 3, 4, 6, 7, 8, 10 et 11.
bactéries a été fait au DAPI. Les images ont ensuite été traitées grâce
au logiciel FIJI®.
Références bibliographiques
[1] Basics of real-time PCR
Extraction d’ADN et PCR quantitative [2] Anna Zaidman-Rémy, Glen Calvar, Protocole de Travaux Pratiques de
Le but de la technique de PCR quantitative en temps réel est de Biotechnologies et Imagerie Cellulaire
déterminer précisément la quantité de symbiotes présents dans les
différents charançons étudiés (SymJ3, SymJ5, SymJ15 et ApoJ5). Le
nombre de copies du gène nuoCD, présent dans l’ADN de la
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