THESE DE DOCTORAT DE

NANTES UNIVERSITE

ECOLE DOCTORALE N ° 605

Biologie Santé
Spécialité : Immunologie

Par

Jimmy SMADJA

Conception, Synthèse et Evaluation de Molécules

de Faible Poids Moléculaire Inhibitrices du
Système Interleukine (IL)-15

Thèse présentée et soutenue à Nantes, le 15 juin 2022

Unité de recherche : INSERM UMR 1307, CRCINA
Rapporteurs avant soutenance :

Jérôme Thibonnet Prof esseur des Universités, Université de Tours

Françoise Dumas Directeur de Recherche, CNRS, Université Paris Saclay

Composition du Jury :

Président : Jérôme Thibonnet Prof esseur des Universités, Université de Tours

Examinateurs : Françoise Dumas Directrice de Recherche, CNRS, Université Paris Saclay

Dir. de thèse : Erwan Mortier Directeur de Recherche, CNRS, Nantes Université

Co-dir. de thèse : Didier Dubreuil Prof esseur des Universités, Nantes Université

Invitées :
Monique Mathé-Allainmat Chargée de Recherche, CNRS, Nantes Université
Agnès Quéméner Ingénieur de Recherche, Inserm
« Un jour j’irai vivre en théorie, car en théorie tout se passe bien. »

Pierre DESPROGES
Remerciements

Les travaux de thèse faisant l’objet de ce manuscrit ont été réalisés au sein du CRCI2NA
(Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Intégrée Nantes Angers) de l’Université
de Nantes et du laboratoire CEISAM (Chimie et Interdisciplinarité : Synthèse, Analyse et
Modélisation) de l’Université de Nantes, dirigés respectivement par Marc GREGOIRE et Jean-
Michel Bouler, que je remercie pour m’avoir accueilli depuis 2018 au sein de leurs unités.

Je souhaite dans un premier temps à adresser mes sincères remerciements aux membres du
jury Pr. Jérôme THIBONNET et Dr. Françoise DUMAS qui ont accepté de lire et de juger ce
travail de thèse. Veuillez trouver dans ce paragraphe l’expression de ma gratitude et de mon
profond respect.

Je tiens à remercier toute l’équipe « des biologistes » comme nous les appelons. Un grand
merci à mon directeur de thèse Erwan MORTIER, pour la gentillesse dont tu as fait preuve et
pour la confiance que tu as su garder jusqu’à la fin. J’ai pris plaisir à venir travailler, je
n’oublierai pas nos échanges et « blagues pas drôles » qui m’ont fait rire pendant les
déjeuners. Je plains les nouveaux locataires de l’ISR2 qui retrouveront probablement les
vestiges de photos miniatures de notre ami en commun. Je remercie aussi mon encadrante
Agnès QUEMENER pour sa patience et sa tolérance. Elle a su prendre le temps de me
transmettre au mieux les compétences qui m’ont été nécessaires en biologie. Merci pour tout
le travail que tu as fourni. Je remercie également Isabelle BARBIEUX pour sa générosité, j’ai
gardé tes recettes de « grand-mère » qui me servent encore aujourd’hui, merci pour la
meilleure confiture que je n’ai jamais goutée! Je t’imagine quelque part en Martinique ou
Guadeloupe en train de boire du rhum agricole… Merci à Mike MAILLASSON pour toutes les
analyses SPR que tu as réalisé, mais aussi pour ta sympathie. Merci de m’avoir arraché la tête
et les cervicales lors du seul entraînement de boxe anglaise qu’on a pu faire. Une revanche
aurait dû avoir lieu en boxe française ! Merci à tous, j’aurai aimé vous apporter plus de fondant
au chocolat.

Je tiens à remercier les chimistes. Je remercie particulièrement mon co-directeur de thèse

Didier DUBREUIL pour l’aide que tu as su m’apporter quand rien n’allait, pour tes conseils qui
m’ont permis de me relever et d’avancer. Merci également à mon encadrante Monique
MATHE-ALLAINTMAT d’avoir toujours été présente, pour tes conseils et les discussions que
nous avons eu aussi bien au laboratoire qu’en dehors. Merci pour ton travail qui m’a permis
de tenir jusqu’au bout. Je remercie aussi Laurence ARZEL, tant pour son immense
investissement dans ce travail de thèse que pour nos moments partagés, aussi drôles
qu’insensés. Je suis toujours persuadé que tu as fait quelque chose à tes cheveux !…

Á Erwan, Didier, Monique, Agnès et Laurence merci pour tout.

Je remercie également l’ensemble des membres permanents que j’ai côtoyé pendant ces trois
années de thèse : Jacques LEBRETON, Sylvain COLLET, Muriel
PIPELIER, Arnaud TESSIER, Virginie BLOT, Laurence ARZEL et Matthieu RIVIERE.

Je remercie aussi à l’ensemble des équipes d’analyse et d’informatique : Julie HEMEZ,

Isabelle LOUVER, Virginie Silvestre, Benoît CHARRIER, Aurélien PLANCHAT, Julien
DEBONTRIDDER et Stéphane GUERIN pour leur investissement au sein du laboratoire
CEISAM.

Je n’oublie pas également de remercier Rui SOUSA, son directeur de thèse Jean-Yves Le
QUESTEL et son encadrante Adèle LAURENT qui nous ont permis d’explorer une nouvelle piste
de travail.

Je remercie aussi l’ensemble des non-permanents avec qui j’ai passé de bons moments, que
soit dans le laboratoire ou en dehors Axelle BERROU, Lenny HADDAD, Sophie RENOU, Pierre-
Alban LALYS, Camille SANCHEZ, Katy AKOUMANY, Aymeric SIARD, Asmaa TEBBA, Manon
DUPUIS, Momtez JMAI, Khaled BOUJDI, Gilles-Olivier GRATIEN, Camille TROUILLET et Pierre
SIEROCKI.

Merci à mes stagiaires : Marcel ANNEREAU, qui se souviendra longtemps de la température

de fusion de l’or. Constantin VITRE pour ton investissement dans le projet et ta sympathie, tu
auras participé avec brio à ce travail de thèse.

Je remercie mes amis Maxime METZ et Steve VINCENT pour les excellents moments de pur
détente (c’est complètement faux) passés ensemble. A l’année prochaine sur Warzone 2.

Merci à Nicolas DINH alias « petit Nico » pour les bons délires, toujours partant pour les
activités. Ce fut un plaisir de travailler en ta compagnie.

Merci à Matthieu RIVIERE, le Brice de Nice de Nantes, l’homme jamais disponible, à l’emploi
du temps aussi chargé qu’un ministre. D’agréables moments passés en ta compagnie, un mec
dont la gentillesse n’a d’égale que sa générosité. On se refera un squash un jour !

Merci Krystal GAILLARD pour avoir laissé ton ordinateur non verrouillé... Johann et moi avons
pu exprimer notre art, tes fonds d’écrans et ton mur facebook se souviendront longtemps de
nous. Je ne te remercie pas d’avoir cassé la canne du rotavap dans mon box ahaha. Merci
néanmoins de m’avoir prêté le pot de NaH, le DMF ultra sec et les ballons de 250 mL que tu
ne retrouvais jamais ! De bons moments partagés, tu embrasseras Louis PEAULT de ma part
sur la fesse droite, je suis sûr qu’il sera ravi.

Je ne remercie pas du tout Clément SANCHEZ. Cet individu particulièrement désagréable,

insolent et sans humour. Personne avec qui j’ai été contraint de partager mon bureau, qui
empiétait sans cesse. J’espère que tu te souviendras longtemps de mon c…croque-monsieur.
Ce paragraphe représente avec perfection nos conversations que souvent peu d’autres
personnes ne pouvaient comprendre. Ne fais pas lire ce paragraphe à Fady (bisou) qui sera
probablement jaloux. J’espère qu’on se reverra !
Merci à Thomas RIVIERE, une amitié tardive mais importante ! Un mec toujours de bonne
humeur, aussi gentil que gaffeur, à ne surtout pas laisser sans surveillance au labo plus de 3
heures au risque de perdre du matériel, le projet de recherche voire le labo ahah. De bons
moments partagés et d’autres encore à venir. On se reverra très certainement ;)

Johann LEBLANC, mon p’tit Jacky, le meilleur pour la fin comme on dit ? Je commence dans
un premier temps par te présenter mes excuses pour avoir exercé une mauvaise influence sur
toi. Thibault l’a dit, sans moi tu aurais très probablement fait une thèse et une soutenance
exemplaire… Ah zut, c’est c’que tu as fait, félicitations encore une fois ! Des perles comme toi
on en trouve pas tous les jours. Je te consacre ce petit paragrapheuuuh…petit paragraphe
pour te dire que….j’adore la paëlla ! Nous avons été inséparables, un peu comme Tic & Tac,
Michel & Augustin, Ben & Jerry’s, François Damiens & sa pie, bref t’as compris l’idée, on a
partagé de vrais moments d’amitié, des fous rires à l’émotion. Je suis content d’avoir croisé
ton chemin, un mec sincère et dévoué. L’histoire 2.0 de Jacky & Michel n’est pas finie. (Tu
auras remarqué que ce paragraphe est aussi synthétique que mes explications des règles des
jeux de société…)

Je terminerais par remercier mes parents, sans qui je ne serais sûrement pas là aujourd’hui
(captain obvious), je vous aime. Merci également à mon frère Steve, d’avoir fait le pitre pour
me faire rire quand mon sourire était aux abonnés absents. Merci aussi à Vincent, d’avoir
toujours été là pour moi, 20 ans d’amitié : #VJZ.

PS : Je tiens à présenter mes excuses à l’écran de projection que j’ai malheureusement

amoché lors de ma soutenance.
Liste des Abréviations et Acronymes

aa : Acide aminé 2 et IL-15 (IL-2Rβ, CD122)

AICD : Activation-Induced Cell Death IL-15R : Chaîne réceptrice commune aux IL-
Ad : Adamantyle 2, IL-15, IL-4, IL-7, IL-9 et IL-21
ARNm : ARN messager IPP : Interaction protéine-protéine
BAIB : bis-acétoxyiodobenzène IRF : Interferon Regulatory Factor (Facteurs
CDCl3 : Chloroforme deutéré régulateurs de l'interféron)
CHR : Cytokine binding Homology Region (domaine JAK : Janus-Associated Kinase (famille de tyrosine
de fixation d’une cytokine) kinases intracellulaires)
CLC : Cardiotrophin-Like Cytokine (cytokine de la LIF : Leukemia Inhibitory Factor (cytokine de la
famille des IL-6) famille des IL-6)
CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité mCPBA : Acide meta-chloroperbenzoïque
(système de reconnaissance du soi) NF-B : Nuclear Factor B (protéine de la superfamille
CNTF : Ciliary Neurotrophic Factor (famille de des facteurs de transcription)
cytokine à 4 hélices) NK : Natural Killer (lymphocytes NK)
CT-1 : Cardiotrophin-1 (cytokine de la famille des IL- NK-T : Natural Killer-T cell (lymphocytes NKT)
6) NMO : Oxyde de N-méthylmorpholine
DCM : Dichlorométhane OSM : Onconstatin M (cytokine appartenant à la
DBU : 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène famille des IL-6)
DMAP : 4-diméthylaminopyridine PMA : Phorbol Myristat Acetate (molécule chimique
DMF : N,N-diméthylformamide activatrice des NF-B et Protein Kinase C (PKC))
DMP : Périodinane de Dess-Martin PTB : Phosphotyrosine-binding (domaine protéique
DMSO : Diméthylsulfoxyde se fixant sur des phosphotyrosines)
éq. : Equivalent(s) PPh3 : Triphénylphosphine
G-CSF : Granulocyte-Colony Rdt : Rendement
Stimulating Factor (facteur stimulant les RLI : Protéine de fusion entre le domaine de
granulocytes) liaison de l’IL-15Rα et l’IL-15
G-CSFR : Granulocyte-Colony RMN : Résonance magnétique nucléaire
Stimulating Factor Receptor (récepteur des facteurs RX : Rayons X
stimulant les granulocytes) STAT : Signal Transducer and Activator of
GM-CSF : Granulocyte Macrophage-Colony Transcription (transducteur de signal et activateur
Stimulating Factor (facteur stimulant les de transcription)
granulocytes et macrophages) TA : Température Ambiante
HOMO : Orbitale moléculaire la plus haute occupée TBAF : Fluorure de tétrabutylammonium
IC50 : Concentration Inhibitrice Médiane TCR : T Cell Receptor (récepteur des cellules T)
IFN : Interféron TGF- : Transforming Growth Factor (cytokine)
Ig : Immunoglobuline THF : Tétrahydrofurane
IL : Interleukine TMS : Tri-méthylsilyl
IL-15R : Chaîne réceptrice spécifique de TNF : Tumor Necrosis Factor (facteur de nécrose
l’IL-15 tumorale)
IL-15R : Chaîne réceptrice commune aux IL-
Table des matières

INTRODUCTION .............................................................................................................................15

I - L ES INTERACTIONS PROTEINE-PROTEINE ...............................................................................................16

II - L ES CYTOKINES ET LEURS RECEPTEURS .................................................................................................22
II-1. Les cytokines...........................................................................................................................................................22
II-2. Les récepteurs des cytokines ...............................................................................................................................24
II-2.1. Les cytokines hématopoïétiques .................................................................................................................. 25
II-2.2. Les cytokines de la famille γc........................................................................................................................ 27
III - L’INTERLEUKINE-15 ....................................................................................................................29
III-1. Généralités .............................................................................................................................................................29
III-2. Les chaînes réceptrices de l’IL-15 ......................................................................................................................31
III-2.1. Les chaînes réceptrices de l’IL-15 communes à l’IL-2.................................................................................. 31
III-2.1.1. La chaîne réceptrice commune γc ....................................................................................................... 31
III-2.1.2. La chaîne réceptrice commune IL-2Rβ................................................................................................. 31
III-2.2. La chaîne réceptrice spécifique de l’IL-15 : IL-15R .................................................................................... 32
III-3. Les modes d’action de l’IL-15 .............................................................................................................................32
III-4. Les voies de signalisation de l’IL-15 ...................................................................................................................33
III-5. Les fonctions biologiques de l’IL-15...................................................................................................................35
III-5.1. Contexte physiologique ............................................................................................................................... 35
III-5.2. Contexte pathologique ................................................................................................................................ 36
III-5.2.1. Infections virales et microbiennes ....................................................................................................... 36
III-5.2.2. Pathologies auto-immunes et inflammatoires .................................................................................... 37
III-5.2.3. Cancer .................................................................................................................................................. 38
III-5.2.4. Autres pathologies ............................................................................................................................... 38
III-6. IL-15 et thérapies ..................................................................................................................................................39
III-6.1. Immunothérapie par l’IL-15......................................................................................................................... 39
III-6.2. Blocage des effets de la surexpression de l’IL-15........................................................................................ 40

PARTIE 1 – SYNTHESE DES PREMIERES MOLECULES INHIBITRICES DU SYSTEME IL -15.................................42

I – ETUDE DE MODELISATION : PREMIERE SERIE DE COMPOSES IBI.....................................................................42
I-1. L’interface IL-15/IL-2R comme cible thérapeutique.......................................................................................42
I-2. Construction du modèle de pharmacophore.....................................................................................................43
I-3. Criblage virtuel de banque de molécules ...........................................................................................................44
I-4. Docking et Scoring des molécules criblées.........................................................................................................44
I-5. Sélection du Hit .......................................................................................................................................................45
II – SYNTHESE DE LA PREMIERE SERIE DE COMPOSES IBI.................................................................................47
I-1. Stratégie de rétrosynthèse de la molécule Hit 1 ...............................................................................................47
I-2. Synthèse de la plateforme mercapto-triazole ...................................................................................................48
I-3. Synthèse du linker...................................................................................................................................................49
I-4. Alkylation de la plateforme mercapto-triazole..................................................................................................51
I-5. Modification du bras espaceur par élongation de chaîne ...............................................................................52
I-6. Modification de la nature du bras espaceur ......................................................................................................54
I-7. Bilan de la première étude SAR ............................................................................................................................61
III – SYNTHESE DE NOUVEAUX ANALOGUES IBI ..........................................................................................62
III-1. Identification d'une zone hydrophile par docking ..........................................................................................62
III-2. Modifications des motifs « N-triazole » et « N-phtalazinone » sur la molécule 1 (chaîne à 1 carbone)
...........................................................................................................................................................................................63
III-3. Modifications des motifs « N-triazole » et « N-phtalazinone » sur la molécule 1 (chaîne à 7 carbones)
...........................................................................................................................................................................................70
III-4. Introduction de la benzophénone comme « crosslinker »............................................................................79
 IV – EVALUATIONS DANS UN CONTEXTE BIO IN VITRO ...................................................................................85
IV-1. Test SPR ..................................................................................................................................................................86
IV-2. Test de la prolifération cellulaire .......................................................................................................................87
IV-3. Test de la phosphorylation de STA T5................................................................................................................88
IV-4. Résultats de l’étude SAR .....................................................................................................................................88
IV-4.1. Résultats avec les nouvelles molécules complémentaires 11, 13 et 63, de la première famille IBI........... 89
IV-4.2. Résultats avec les analogues N-substitués sur le triazole ou la phatalazinone .......................................... 91
V – DISCUSSION ET PERSPECTIVES.........................................................................................................98
PARTIE 2 – VERS UNE SELECTIVITE IL-15 VS IL-2 ...................................................................................99

I - SERINE 58, LA CLE DE LA SELECTIVITE ? ................................................................................................99

I-1. Etude par modélisation moléculaire ...................................................................................................................99
I-2. Définition d’un nouveau modèle de pharmacophore ................................................................................... 100
I-3. Sélection du Hit .................................................................................................................................................... 102
II – ANALOGUES DU HIT MODIFIE SUR LA PARTIE EST.................................................................................. 105
II-1. Stratégie de synthèse linéaire : La voie stannylée ........................................................................................ 105
II-1.1 Synthèse de la partie Est 2-amidothiophène (B) ......................................................................................... 106
II-1.2 Synthèse de la partie Ouest isoxazole stannylé (A)..................................................................................... 108
II-2 Stratégie de synthèse convergente .................................................................................................................. 113
III – ANALOGUES DU HIT (77A), MODIFIE SUR LA PARTIE OUEST .................................................................... 121
III-1. Stratégie de synthèse convergente avec le motif alkylant (68a) .............................................................. 121
III-1.1 Synthèse des précurseurs hydroxyméthyl-isoxazole (76) .......................................................................... 121
III-1.2 Synthèse des composés ciblés analogues de 77a modifiés en partie Ouest ............................................. 124
III-2. Vers la synthèse de l’analogue phénolique de 77h ..................................................................................... 131
IV – CONCLUSION......................................................................................................................... 132
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES .................................................................................... 133

BIBLIOGRAPHIE............................................................................................................................ 136

EXPERIMENTAL PART.................................................................................................................... 145

Table des Figures

Figure 1 : Exemples de différentes catégories d’IPP .........................................................................................................18

Figure 2 : Représentation schématique des récepteurs de cytokines partagés : γc (a), gp130 (b) et βc (c) ..........25
Figure 3 : Représentation de la structure d'un complexe de récepteurs de cytokines de type I .............................26
Figure 4 : Cas simplifié de la voie de signalisation JAK/STAT de l'érythropoïétine ......................................................27
Figure 5 : Représentation schématique des différents éléments de la famille des γc et de leurs récepteurs
respectifs...................................................................................................................................................................................29
Figure 6 : Représentation graphique des deux différents modes de présentation de l'IL-15 ...................................33
Figure 7 : Voies de signalisation de l'IL-15 ..........................................................................................................................34
Figure 8 : Schéma présentant une liste condensée de quelques sources cellulaires produisant l'IL -15, de
quelques cellules cibles, ainsi que du mécanisme par lequel elle exerce sa fonction et les conséquences qui en
découlent ..................................................................................................................................................................................35
Figure 9 : Approches pour bloquer les actions de l'IL-15 .................................................................................................41
Figure 10 : Structures cristallographiques des complexes IL-15/IL-15R et IL-2/IL-2R.................................................43
Figure 11 : Modèle de pharmacophore utilisé pour filtrer les banques de composés chimiques ...........................44
Figure 12 : Les différentes étapes du criblage virtuel ayant conduit à la sélec tion d’un hit .....................................45
Figure 13 : Mode d’interaction prédit du hit sélectionné sur la structure de l’IL -15 ..................................................46
Figure 14 : Schéma de rétrosynthèse de la molécule 1 à partir des 3 fragments : la plateforme mercaptotriazole
2, un dérivé d’halogénure d’acide acétique et la 2,4-dichloroaniline............................................................................47
Figure 15 : Structure des analogues du composé 1 avec variation de la longueur de chaîne. .................................53
Figure 16 : Evolution de l’IC50 (µM) des molécules testées sur l’effet inhibiteur de la prolifération de cellules
32Dβ induite par le RLI, en fonction de la longueur de chaîne aliphatique. .................................................................53
Figure 17 : Conformation des diols symétriques (a) et d’éthylène glycol en présence d’un cation Ag + (b) ...........58
Figure 18 : Structures des molécules IBI-03, IBI-15, IBI-50, IBI-74, IBI-55, IBI-110, IBI-111, leurs IC50 respectifs
(p-STAT5 et biologiques) obtenus. .......................................................................................................................................61
Figure 19 : Mode d’action de notre hit IBI-03....................................................................................................................62
Figure 20 : Pharmacomodulations introduites alternativement sur le N-Me triazole ou le N-Me phtalazinone du
hit 1a (Série 1) et le lead 1d (Série 2)...................................................................................................................................63
Figure 21 : Structure des 2 nouveaux intermédiaires cibles 40 et 41, N-triazole et N-phtalazinone substitués ...73
Figure 22 : Représentation du processus de marquage par photoaffinité ...................................................................81
Figure 23 : Unités photoréactives couramment utilisées. ...............................................................................................81
Figure 24 : Schéma de rétrosynthèse de la molécule 63 à partir des 3 synthons .......................................................83
Figure 24bis : Récapitulatif des modulations chimiques sur la série IBI ...................................................................835s
Figure 25 : Fonctionnement de la technologie Surface Plasmonic Resonance (SPR) et représentation d’un
sensorgramme. ........................................................................................................................................................................86
Figure 26 : Mécanisme de fluorescence par réduction de la Résazurine en Résorufine............................................87
Figure 27 : Fonctionnement de la technologie AlphaLISA ...............................................................................................88
Figure 28 : Structures des molécules IBI-03, IBI-15, IBI-50 et IBI-74 et leurs IC50 (prolifération cellulaire et p-
STAT5) respectifs ainsi que les résultats biologiques obtenus avec les analogues 11, 13 et 63...............................89
Figure 29 : Comparaison des structures IL-2 et IL-15 au niveau de la Sérine 58.. .................................................... 100
Figure 30 : Pharmacophores définis sur l’IL-15 et l’IL-2 au niveau de la Sérine 58 .................................................. 101
Figure 31 : Schéma résumant les différentes étapes du criblage virtuel ................................................................... 102
Figure 32 : Signal SPR sur la fixation à l’IL-15 obtenu avec les composés sélectionnés par le criblage virtuel ... 103
Figure 33 : Famille de composés issus du criblage virtuel sélectionnés par l’évaluation in vitro .......................... 104
Figure 34 : Données RMN 1 H d’un composé isoxazole stannylé en position 4. ........................................................ 111
Figure 35 : Dimérisation et isomérisation des NOs ........................................................................................................ 116
Figure 36 : Liste des 7 nouveaux composés synthétisés à par tir du hit 77a.............................................................. 132
Table des Schémas

Schéma 1 : Synthèse de la lactone (E) par réaction de Wittig……………………………………………………………………………48

Schéma 2 : Synthèse du composé 5 par condensation de la méthylhydrazine sur la lactone puis par réaction
de transamidification via l’hydrate d’hydrazine………………………………………………………………………………………………..48
Schéma 3 : Synthèse du mercaptotriazole 2. Condensation de l’isothiocyanate de méthyle sur l’hydrazide
puis cyclisation de l’intermédiaire thiosemicarbazide 6……………………………………………………………………………………49
Schéma 4 : Première séquence de synthèse envisagée……………………………………………………………………………..…....50
Schéma 5 : Acylation de la 2,4-dichloroaniline en one-pot à partir de l’acide 2-bromoacétique………………...……50
Schéma 6 : Réaction de S-alkylation du mercaptotriazole 2 avec l’amide bromé 9……………………………………..…...52
Schéma 7 : Structure des analogues du composé 1 avec variation de la longueur de chaîne…………………………...54
Schéma 8 : Identification des deux synthons pégylés 12 et 14, pour la synthèse d’analogues du composé 1..…55
Schéma 9 : Oxydation du 2-2-(2-chloroéthoxy)éthoxy)éthanol selon les conditions classiques de Jones…….……56
Schéma 10 : Réaction de N-acylation de la 2,4-dichloronaline à partir de l’acide chloré 15………………………………56
Schéma 11 : Synthèse du composé 11 par réaction de S-alkylation avec le partenaire chloré 12a.………………..…56
Schéma 12 : Synthèse du dérivé iodé 12b à partir du dérivé chloré 12a par réaction d’échange halogène selon
les conditions de Finkelstein……………………………………………………………………………………………………….……………………57
Schéma 13 : Synthèse du composé 11 par réaction de S-alkylation avec le partenaire iodé 12b…..…….…………...57
Schéma 14 : Réaction de monotosylation du 3,6,9,12-tétraoxatétradécane-1,14-diol………..……………………….…..58
Schéma 15 : Réaction d’oxydation de l’alcool 16 selon les conditions de Jones……………………………………….……...59
Schéma 16 : Réaction de N-acylation de la 2,4-dichloronaline par l’acide tosylé 14a……………………………….……...59
Schéma 17 : Synthèse du composé 13 par réaction de S-alkylation avec le partenaire tosylé 14a…………………...60
Schéma 18 : Synthèse du dérivé iodé 14b à partir du dérivé tosylé 14a…………….……………………………………………..60
Schéma 19 : Synthèse du composé 13 par réaction de S-alkylation avec le partenaire iodé 14b…………………..….61
Schéma 20 : Synthèse du composé 19……………………………………………………………………………………………………………..64
Schéma 21 : Synthèse du composé 20……………………………………………………………………………………………………………..64
Schéma 22 : Synthèse des composés 21, 22 et 23 à partir de l’intermédiaire commun 20……………………………….65
Schéma 23 : Synthèse de l’intermédiaire phtalazinone-NH 24………………………………………………………....................66
Schéma 24 : Synthèse du composé 25 par N-alkylation…………………………………………………………………………..……….66
Schéma 25 : Synthèse du composé 26 en 2 étapes…………………………………………………………………………………………..67
Schéma 26 : Synthèse du composé 27 par S-alkylation……………………………………………………………………..……………..67
Schéma 27 : Synthèse des composés 28, 29, 30 et 31 à partir de l’intermédiaire commun 27………………….……...69
Schéma 28 : Synthèse des composés 32, 33 et 34…………………………………………………………………………………………….70
Schéma 29 : Synthèse du composé 33 par acylation de la 2,4-dichloroaniline par l’acide 8-bromo
octanoïque……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….71
Schéma 30 : Proposition de mécanisme réactionnel de la réaction de rétro-Michael aboutissant à la
formation du composé 38………………………………………………………………………………………………………………………………..72
Schéma 31 : Synthèse de l’isothiocyanate 44…..……………………………………………………………………………………………….73
Schéma 32 : Comparaison entre l’utilisation du TsCl et du Boc 2 O pour le mécanisme d’isothiocyanation à
partir de l’intermédiaire 43………………………………………………………………………………………………………...…………………...74
Schéma 33 : Synthèse du composé 40…………………………………………………………………………………………….……………….75
Schéma 34 : Synthèse des composés 48 et 49……………………………………………………………………………….………………...76
Schéma 35 : Synthèse du composé 52……………………………………………………………………………….…………………………….76
Schéma 36 : Synthèse des agents alkylants 53 et 54………………………………………………………..……………………………...77
Schéma 37 : Synthèse des composés 41 et 59………………………………………………………………………….……………………...78
Schéma 38 : Synthèse des composés 59, 60 et 61…………………………………………………………………………………………….79
Schéma 39 : Mécanisme de formation de la liaison covalente entre la benzophénone et le squelette carbonée
de la protéine par irradiation UV à 308 nm………………………………………………………………………………………………………83
Schéma 40 : Synthèse du composé 63……………………………………………………………………………………………………………..84
Schéma 41 : Modèle de molécule associant les 3 différentes fonctions sur notre molécule HIT 1 : aldéhyde,
PEG et la 4-aminobenzophénone …………………………………………………………………………………………………………..……….98
Schéma 42 : Stratégie de synthèse de la famille de composés isoxazolo-thiophène….…………..……………………...104
Schéma 43 : Rétrosynthèse du composé D…………………………………………………………………………………………………….105
Schéma 44 : Proposition de mécanisme pour la réaction de Gewald……………………………….…………………………….106
Schéma 45 : Synthèse des fragments 2-amidothiophènes 68a-d…………………………………………………………………...107
Schéma 46 : Voies d’accès à l’isoxazole bromé J, (a) et stratégie de synthèse envisageable à partir de ce
précurseur J (b) ……………………………………………………………………………………………………………………………..……………...109
Schéma 47 : Tentative de synthèse de l’acétylène n-tributylétain 70. …………………………………………………………...110
Schéma 48 : Tentative de synthèse du composé 72a…………………………………………………………………………..………...111
Schéma 49 : Synthèse de l’intermédiaire stannylé 73……………………………………………………………………..……………..112
Schéma 50 : Rétrosynthèse de la stratégie convergente…………………………………………………..…………………………...114
Schéma 51 : Deux voies d’accès (MCR) aux isoxazoles…………………………………………………………………………………...114
Schéma 52 : Réaction de cycloaddition-1,3-dipolaire suivie de la réduction du composé 74a en mélange
avec le dimère 75……………………………………………………………………………………………………………………………………………115
Schéma 53 : Proposition de mécanistique di-radicalaire de formation du furoxane 75…………………..………………116
Schéma 54 : Mécanismes concerté (Huisgen) et radicalaire (Firestone) de cycloaddition d’alcynes et de
NOs………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..117
Schéma 55 : Réaction de O-alkylation entre l’alcool 76a et le dérivé iodé 68a…………………….…………………………119
Schéma 56 : Etape de O-alkylation vers les analogues ciblés 77a, 85-86……………………………………………..…………120
Schéma 57 : Stratégies de synthèse d’analogues 77a par voie convergente……………………………….………….………121
Schéma 58 : Schéma de synthèse des hydroxyméthyle isoxazoles 76a-d……………………………………………….……...121
Schéma 59 : Synthèse des hydroxyméthyl isoxazoles 76 par réduction des esters 74…………………………….………124
Schéma 60 : Réaction de O-alkylation vers les analogues 77b-g……………………………………………………….…….……..125
Schéma 61 : Exemples d’alkylation d’hydroxyméthyl isoxazole (Extrait de la littérature) …………………….………..127
Schéma 62 : Essais de dimérisation de 68a et dégradation de 77a en milieu basique……………….……………..…….128
Schéma 63 : Ouverture des esters d’isoxazole en milieu basique…………………………………………………….……………..128
Schéma 64 : Fragmentation de 3-H isoxazoles, en milieu basique………………………………………………………………….129
Schéma 65 : Etude de l’alkylation de 76e, avec BnBr et proportions relatives des composés identifiés RMN
1 H……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… …...129

Schéma 66 : Etude de stabilité de l’alcool 76a en milieu basique………………………………………………….………………..130

Schéma 67 : Hypothèse de formation de l’intermédiaire céto-nitrile………………………………………………................130
Schéma 68 : Essais de déméthylation du composé 77c…………………………………………………………..………………………131
Table des Tableaux
Tableau 1 : Structure et rendements des analogues hétérocycles aminés de 9. ........................................................51
Tableau 2 : Résultats (IC50 ) d’Inhibition de p-STA T5 (cellules NK-92) avec IL-15 (50 nM). ........................................82
Tableau 3 : Résultats (IC50 ) des tests de prolifération cellulaire avec les cellules 32D. ...........................................93
Tableau 4 : Résultats (IC50 ) des tests p-STA T5 avec les cellules NK-92..........................................................................94
Tableau 5 : Résultats de binding sur une série de composés sélectionnés. .................................................................96
Tableau 6 : Propriétés moléculaires des composés 1a, 1d, IBI-50, IBI-74, 63, 38, 35, 60, 61 97
Tableau 7 : Substrats cétoniques et rendements pour l’étape MCR (66a-d), l’étape d’acylation (67a-d) et l’étape
de SN (68a-d) de la séquence réactionnelle du Schéma 45. ........................................................................................ 108
Tableau 8 : Coefficients HOMO et LUMO calculés pour différents dipolarophiles (NOs) et dipôles acétyléniques
................................................................................................................................................................................................. 113
Tableau 9 : Conditions expérimentales pour la cycloaddition-1,3-dipolaire............................................................. 115
Tableau 10 : Conditions expérimentales pour la cycloaddition-1,3-dipolaire à partir 74....................................... 118
Tableau 11 : Conditions expérimentales pour la O-alkylation. .................................................................................... 119
Tableau 12 : Rendements de la O-alkylation de l’alcool 76a avec les intermédiaires iodés 68a-d....................... 120
Tableau 13 : Conditions expérimentales pour la cycloaddition-1,3-dipolaire vers la préparation des composés
76b-g ...................................................................................................................................................................................... .123
Tableau 14 : Conditions d’alkylations des alccols 76a-f avec l’alkylant 68 a.............................................................. 126
Conception, Synthèse et Evaluation de

Molécules de Faible Poids Moléculaire

Inhibitrices du Système Interleukine (IL)-15

Introduction
La survie de tous les organismes vivants dépend de leurs capacités à réguler leur
environnement interne. L'homéostasie représente cette capacité à maintenir un état
interne relativement stable, persistant malgré les perturbations extérieures. Cette
homéostasie repose en partie sur la communication intercellulaire, via des contacts directs
et spécifiques entre différents types de cellules mais aussi grâce à des médiateurs solubles
de faibles poids moléculaires, appelés cytokines. Ces cytokines interviennent non
seulement dans la régulation du développement et des fonctions effectrices du système
immunitaire, mais possèdent également des fonctions plus larges sur d’autres tissus et
systèmes biologiques. Ainsi, elles jouent un rôle primordial dans la défense de l’organisme.
L'IL-15 est une cytokine pro-inflammatoire, appartenant à la famille des cytokines IL-2,
impliquée dans la stimulation de l'activité des cellules T et tueuses naturelles (NK). La
dérégulation de l'expression de l'IL-15 contribue directement, entre autres, au
développement de maladies inflammatoires et auto-immunes, y compris la polyarthrite
rhumatoïde et la sclérose en plaques. Ainsi, le blocage sélectif de l'IL-15 visant à traiter la
polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis et d'autres troubles liés à l'IL-15 a été reconnu comme
une approche alternative viable et originale par rapport à l’utilisation de peptides et
d’anticorps. La conception de petites molécules originales inhibitrices des interactions
protéine-protéine (IPP) fait donc l’objet d’un intérêt croissant.
L'objectif de cette thèse était donc d'identifier et synthétiser des molécules de faible poids
moléculaires inhibitrices de l'IL-15, à l’interface avec son récepteur IL-2R réduisant ainsi
l'activité de la cytokine. Deux familles d'inhibiteurs de l'IL-15 seront présentées. Dans un
premier temps, à l’aide des travaux précédents de notre équipe, nous avons pu ajouter des
modifications supplémentaires à la première série de molécule labellisée IBI. Dans un
deuxième temps, en suivant la même stratégie (docking réalisé à partir du criblage virtuel
de bibliothèques de composés sur un pharmacophore), identifiés sur le site de liaison de
l'IL-15 avec l'IL-2R donnant ainsi notre deuxième famille labellisée IBIS. Ces séries de
composés seront évaluées pour leur capacité à inhiber la liaison entre l'IL-15 et son
récepteur.

15
I - Les interactions protéine-protéine

Les protéines sont les principaux acteurs de nombreuses fonctions cellulaires différentes et
constituent l'ensemble de la machinerie de la cellule. Leurs fonctions vont de la
signalisation aux moteurs moléculaires, en passant par la catalyse de réactions, le transport,
la synthèse et la dégradation des molécules. Elles sont également les éléments constitutifs
des capsides virales, responsables de l'entrée du virus dans la cellule, et participent
également à la réponse immunitaire. Il n'est donc pas surprenant que de nombreuses
fonctions biologiques impliquent des interactions entre deux ou plusieurs protéines,
formant des complexes protéine-protéine.

De nombreux travaux sont actuellement consacrés à la prédiction des IPP, car l'élucidation
de ces réseaux peut fournir des informations importantes sur la fonction cellulaire, ainsi
que sur les voies et la connectivité croisée. 1,2,3,4,5 De plus, la clarification des modes
d'association des protéines permet une meilleure connaissance de leur régulation
dynamique. Cependant, certains facteurs contribuent à la difficulté de l'étude de ces
complexes, tels que le caractère transitoire et le manque de stabilité de certaines IPP, y
compris celles impliquées dans la signalisation et la régulation. 6,7 Ainsi, ces complexes
biologiques ont un grand potentiel pour être exploités comme cibles de nouvelles thérapies
pour différentes maladies humaines. Dans ce contexte, la connaissance des différentes voies
impliquées, en particulier en ce qui concerne leur topologie, leur dynamique et leur
longueur, est cruciale non seulement pour comprendre l'effet d'un médicament particulier
sur une IPP spécifique, mais aussi pour aider à prédire les effets secondaires potentiels. 8

L'ensemble de tous les complexes générés par les IPP au niveau cellulaire constitue
l'interactome. Plusieurs facteurs contribuent à la complexité et à la dimension de
l'interactome. D'une part, le fait qu'une protéine sous sa forme monomérique puisse avoir
une fonction sensiblement différente de celle de sa forme multimérique/agrégée élargit
considérablement l'espace biologique à considérer.9 En outre, les complexes peuvent être
non obligatoires, différents environnements ou facteurs externes conduisant à leur
formation ou à leur rupture. 10 Un autre facteur contribuant à la taille massive de
l'interactome est le fait que les protéines peuvent s'organiser en complexes de différentes
manières : homo-oligomères entre deux ou plusieurs séquences protéiques identiques ;
hétéro-oligomères entre deux ou plusieurs séquences protéiques différentes. Le fait que les

1 P. M. Kim et al. Science 2006, 314, 1938-1941

2 R. M. Ewing et al. Mol. Syst. Biol. 2007, 3, 89-106
3
A. M. Yip et al. BMC Bioinform. 2007, 8, 22-36
4 J. Rachlin et al. Mol. Syst. Biol. 2006, 2, 66-78
5 G. T. Hart et al. Genome Biol. 2006, 7, 120-129

6 D. S. Kaladhar et al. Bioinform. 2012, 8, 437-439

7 M. R. Arkin et al. Nat. Rev. Drug. Discov. 2004, 3, 301-317
8
O. Keskin O et al. Chem. Rev. 2008, 108, 1225-1244
9 A. Suzuki et al. J. Biochem. 1987, 101, 267-274
10 S. Jones S et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 13-20

16
protéines puissent s'assembler en complexes dimères, trimères, tétramères, ... oligomères
augmente considérablement la taille de l'interactome. Il n'est donc pas surprenant que la
taille estimée de l'interactome se situe entre 130 000 et 650 000 IPP, dont seule une
fraction est connue. 11,12,13,14,15 Il est donc aussi utile que nécessaire d'organiser les IPP en
différentes catégories comme le montre la Figure 1 :

- Les IPP dans lesquelles les récepteurs membranaires sont impliqués, y compris les
protéines qui utilisent les réseaux complexes d'interactions pour produire des réseaux de
signalisation et qui sont capables de régler finement ces interactions en réponse à des stimuli
externes.16,17,18,19

- Les protéines oligomériques, homo- ou hétéromériques comme mentionnées

précédemment, où l'agrégation différentielle en fonction de l'environnement cellulaire
local joue un rôle clé.20

- Les interactions protéine-peptide, comprenant les réseaux de régulation qui forment le

peptidome (l'ensemble de tous les petits peptides, souvent avec des fonctions de régulation
inconnues).21

- Les interactions protéine-anticorps : les immunoconjugués ou immunocomplexes,

capables de reconnaître très spécifiquement différentes molécules et, à l'heure actuelle,
une source de potentiel quelque peu inexploitée pour la découverte de médicaments.

11 P. Thiel P et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2012, 51, 2012-2018
12 M. P. H. Stumpf et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105, 6959-6964
13 K. Venkatesan et al. Nat. Methods 2009, 6, 83-90
14
Q. C. Zhang et al. Nature 2012, 490, 556-560
15 M. J. Meyer et al. Nat. Methods 2018, 15, 107-114
16 V. V. Matveev et al. Theor. Biol. Med. Model. 2010, 7, 19-41

17 A. J. García-Sáez et al. Cell Death Differ. 2012, 19, 1733-1740

18 J. Kale et al. Cell 2012, 151, 1179-1184
19
A. S. Huart et al. PLoS One 2012, 7, e43391
20 K. E. Roberts et al. PLoS Comput. Biol. 2012, 8, e1002477
21 A. De Simone et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, 6951-6956

17
Figure 1 : Exemples de différentes catégories d’IPP. L’IL-15 avec sa chaîne réceptrice  (bleue) (a, code
PDB : 2Z3Q),22 l’-synectine oligomérisée (b, code PDB 6FLT), 23 le domaine PTB Numb complexé avec
le peptide NAK (c, code PDN : 1DDM),24 le complexe antigène/anticorps lysozyme/Fab HyHEL-10 (d,
code PDB : 3HFM).25

L'identification et la détection des complexes protéiques se fait assez couramment par des
méthodes expérimentales. Historiquement, différentes techniques ont contribué à cette
identification, y compris des techniques quantitatives, telles que le criblage double-hybride
chez la levure,26 l'immuno-précipitation,27 la chromatographie par filtration sur gel, 28 et
des techniques qualitatives, telles que l'ultracentrifugation analytique, 29 la calorimétrie,30
la spectroscopie optique. 31 Cependant, ces méthodes ne sont pas disponibles pour évaluer
les IPP dans les systèmes vivants, car elles nécessitent généralement une lyse cellulaire et
ne sont pas en mesure de détecter les interactions transitoires, d'une grande importance
lorsqu'il s'agit de protéines de signalisation, par exemple. C'est pourquoi de nouveaux
outils liés à l'imagerie moléculaire sont apparus, permettant de visualiser, de caractériser
et de mesurer les processus biologiques aux niveaux moléculaire et cellulaire chez l'homme
et dans d'autres systèmes vivants. 32 Cette catégorie de méthodes, qui comprend la
bioluminescence,33,34 la fluorescence35 et l'imagerie par tomographie d'émission de positons
(TEP), 36 a pu compléter les méthodes d'imagerie moléculaire déjà utilisées mais aussi
fournir des informations qui étaient auparavant hors de portée, comme l'évaluation in vivo
de médicaments qui favorisent ou inhibent l'assemblage de protéines homo- ou

22 M. Chirifu et al. Nat. Immunol. 2007, 8, 1001-1007

23 R. Guerrero-Ferreira et al. eLife 2018, 7, e36402
24 C. Zwahlen et al. EMBO J. 2000, 19, 1505-1515

25 E. A. Padlan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 5938-5942
26 S. Fields S et al. Nature 1989, 340, 245-246
27 N. E. Williams, Methods Cell. Biol. 2000, 62, 449-453

28 E. M. Phizicky et al. Microbiol. Rev. 1995, 59, 94-123

29
J. C. Hansen et al. Biochemistry 1994, 33, 13155-13163
30 M. L. Doyle, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8, 31-35
31 J. H. Lakey et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 1998, 8, 119-123

32 D. A. Mankoff, J. Nucl. Med. 2007, 48, 18N-21N

33 K. D. G. Pfleger et al. Cell. Signal. 2006, 18, 1664-1670
34
K. D. G. Pfleger et al. Nat. Protoc. 2006, 1, 337-345
35 B. N. Giepmans et al. Science 2006, 312, 217-224
36 T. F. Massoud et al. Nat. Med. 2010, 16, 921-926

18
hétérodimériques.37,38 Des progrès plus récents dans les technologies d'imagerie et de
logiciels ont permis d'utiliser la RMN et la cristallographie aux rayons X pour mieux
comprendre les IPP. Comme ces techniques sont capables de résoudre les protéines au
niveau atomique, elles permettent de déduire des informations structurelles qui étaient
jusqu'à présent impossibles.39 Plus récemment encore, des méthodes alternatives sont
apparues, comme la microscopie électronique à particule unique, qui permet d'analyser
des protéines difficiles à cristalliser dans des états fonctionnels spécifiques. Cette méthode
présente toutefois des difficultés en termes d'analyse des données; de plus, elle est limitée
aux protéines de poids moléculaire élevé, les petits ligands étant difficiles à observer. 40
Structurellement, les IPP sont très uniques, dans le sens où leurs énergies de liaison sont
fortement influencées par leurs surfaces hydrophobes complémentaires, et ne sont pas
seulement construites par des liaisons H et des ponts salins. 41 Habituellement, elles sont
composées d'un noyau hydrophobe, qui correspond souvent à la région la plus hydrophobe
de chaque partenaire, entouré d'une bordure polaire qui est accessible au solvant même
lorsque les deux protéines sont liées. 42,43 En termes de surface interfaciale, elle est
généralement supérieure à 600 Å2 par protéine, se situant le plus souvent entre 750 et 1500
Å2.44 Même en termes de structures d'interface, il y a une distinction importante à faire en
fonction du caractère transitoire ou permanent des IPP. Les oligomères permanents
présentent une liaison beaucoup plus forte entre les protéines, avec des interfaces plus
grandes et plus serrées, tandis que les interfaces transitoires présentent une surface plus
plate, ce qui permet à davantage de molécules d'eau d'être piégées entre les deux
partenaires. 8,44,45 De plus, la première famille est caractérisée par un effet hydrophobe plus
important que la seconde, les acides aminés présents dans les interfaces étant beaucoup plus
hydrophobes même sur les bords extérieurs. En ce qui concerne les interfaces transitoires,
elles possèdent toujours plus d'acides aminés hydrophobes que ce que l'on ob serve
généralement à l'intérieur d'une protéine ; cependant, leur effet est toujours beaucoup plus
faible que celui observé pour les oligomères obligatoires. 46,47 Cela n’est pas surprenant,
puisque les interfaces obligatoires passent beaucoup moins de temps exposé au solvant que
les interfaces transitoires. En examinant de plus près les types de résidus prédominants dans
chaque type d'interface, les interfaces temporaires présentent un nombre plus élevé de
liaisons hydrogène que les interfaces permanentes, tandis que ces dernières contiennent un
plus grand nombre de résidus non polaires (aromatiques et aliphatiques), surtout vers le

37 T. F. Massoud et al. Curr. Opin. Biotechnol. 2007, 8, 31-37

38 V. Villalobos et al. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2007, 9, 321-349
39 J. Vaynberg et al. Trends Biotechnol. 2006, 24, 22-27
40
Y. Cheng, Cell 2015, 161, 450-457
41 W. E. Stites, Chem. Rev. 1997, 97, 1233-1250
42 L. Young et al. Protein Sci. 1994, 3, 717-729

43 A. A. Bogan et al. J. Mol. Biol. 1998, 280, 1-9

44 L. Lo Conte et al. J. Mol. Biol. 1999, 285, 2177-2198
45
A. I. Archakov et al. Proteomics 2003, 3, 380-391
46 C. J. Tsai et al. Protein Sci. 1997, 6, 53-64
47 J. Janin et al. J. Mol. Biol. 1988, 204, 155-164

19
centre de la surface. Les interfaces temporaires ont tendance à contenir des résidus neutres,
alors que les interactions établies aux interfaces permanentes ont plus tendance à se faire
entre deux résidus chargés. Les faits discutés ici, tels que l'absence de résidus chargés dans
certains cas et la prédominance de plaques hydrophobes en général, ainsi que la forme
générale des IPP, présentent un ensemble particulier de défis lorsque l'on traite ces types
d'interactions comme des cibles pour la conception de médicaments. Cependant, un autre
point intéressant soulevé par la composition de ces types d'interactions est l'importance
apparemment plus grande de la flexibilité. En fait, la présence de plus grands résidus
hydrophobes, surtout dans le cas des interfaces transitoires, signifie que ces interfaces sont
hautement sensibles aux changements de conformation. Ainsi, il faut faire plus attention
en l'analyse de ces types d'oligomères, notamment par l'introduction de la flexibilité dans
le système. En fait, le point de départ d'une étude d'IPP est généralement une structure
cristallographique. En général, les complexes disponibles dans leurs structures cristallines
sont examinés et des conclusions peuvent être tirées, la protéine étant considérée comme
rigide dans cette conformation. Cependant, de nombreux facteurs indiquent que cette
approche n'est peut-être pas la plus précise. Dans certains cas, la conformation
cristallographique ne correspond pas nécessairement à celle que la protéine adopte le plus
souvent, 48,49 tandis qu'un problème supplémentaire peut survenir en raison des
changements imposés à la protéine par les conditions de cristallisation elles-mêmes.50 En
outre, les protéines peuvent avoir des modes de liaison différents qui donnent lieu à des
paysages d'énergie libre différents, un fait qui n'est pas observable dans la structure
cristallographique. 51
Enfin, une protéine peut avoir plus d'une conformation en solution, notamment lorsqu'elle
se trouve dans différents complexes, étant donné qu'une structure radiographique est une
moyenne d'un ensemble de structures, cette diversité structurelle ne sera pas présente dans
la structure. Il est donc crucial de traiter une protéine et, surtout, un complexe de deux
ou plusieurs protéines en interaction, comme des structures flexibles plutôt que statiques.
Afin d'échantillonner l'espace conformationnel occupé par une IPP, on peut utiliser des
méthodes telles que la dynamique moléculaire, qui permet d'introduire par le calcul de la
flexibilité dans une structure statique. Cette méthode ne résout pas entièrement tous les
problèmes, car elle est limitée par les barrières énergétiques entre les différents minima et
les échelles de temps. Cependant, il s'agit d'une méthode puissante qui peut, lorsqu'elle est
en possession de données biochimiques supplémentaires, alliée aux techniques
susmentionnées, apporter un éclairage beaucoup plus profond sur l'interface étudiée.
Un autre aspect à prendre en compte est l'influence inégale des différents résidus à
l'interface. Ceci peut être démontré par le remplacement systématique de chaque résidu
48 E. J. Fuentes et al. J. Mol. Biol. 2006, 364, 337-351
49
L. C. James et al. Science 2003, 299, 1362-1367
50 A. B. Lindner et al. J. Mol. Biol. 1999, 285, 421-430
51 N. Popovych et al. Nat. Struct. Mol. Biol. 2006, 13, 831-838

20
par une alanine, avec une mesure ultérieure des différences d'énergie libre de liaison (ΔΔ𝐺)
entre le type sauvage et chaque mutant.52 Une baisse de cette différence, au-delà d'un
certain seuil (c'est-à-dire ≥ 2 kcal/mol), indique que l'acide aminé est un hotspot. 53 Le
hotspot définit donc un résidu nécessaire et fortement impliqué dans une interaction entre
un ligand et son récepteur. Ces mesures peuvent être réalisées de manière expérimentale
ou computationnelle, la première étant laborieuse et longue, en raison du fait que chaque
mutant doit être produit, purifié et analysé individuellement. 54 C'est pourquoi des
méthodes informatiques d'identification et d'analyse des hotspots ont vu le jour, allant de
méthodes moins complexes (approches basées sur la connaissance) 55 à des méthodes plus
sophistiquées et plus longues (approches entièrement atomistiques, y compris la DM
susmentionnée). Une prédiction précise de ces zones a des implications cruciales dans la
conception de nouveaux médicaments, car ceux-ci devraient idéalement cibler des régions
spécifiques contenant des hotspots dans les IPP. 56
A ce jour, un grand nombre d’IPP se révèlent être « druggable » et offre donc de nouvelles
opportunités d’études pharmacologiques et thérapeutiques 57,58 qui ont déjà permis à
plusieurs équipes de mener des composés non-peptidiques jusqu'à leurs mise sur le
marché.59 De tels résultats sont aujourd’hui accessibles grâce au développement des outils
de criblage « screening » in silico et à la recrudescence des structures visant ce type de cibles
jusqu’alors considérées comme non-exploitables de par le manque d’information à leur
sujet.

52
B. C. Cunningham et al. Science 1989, 244, 1081-1085
53 T. Clackson et al. Science 1995, 267, 383-386
54 W. L. DeLano, Curr. Opin. Struct. Biol. 2002, 12, 14-20

55 I. S. Moreira et al. in Molecular Materials with specific interactions - Modeling and Design, 2007, 305-339
56 I. S. Moreira et al. Proteins 2007, 68, 803-812
57
A. Dömling, Curr. Opin. Chem. Biol. 2008, 12, 281-291
58 B. C. Raimundo et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 3111-3130
59 D. Kuritzkes et al. Nat. Rev. Drug. Discov. 2008, 7, 15616

21
II - Les cytokines et leurs récepteurs

II-1. Les cytokines

Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat, s’intéresse à une IPP qui implique la
cytokine Interleukine-15 (IL-15). Les cytokines sont des glycoprotéines agissant comme
des messagers cellulaires ayant généralement un effet immuno-modulateur. Il s'agit de
petites glycoprotéines (8 à 50 kDa), non structurales, dont les rôles physiologiques
impliquent l'homéostasie tissulaire et l'activation, la relocalisation et la différenciation
cellulaires. Leur nom implique leur fonction cellulaire (du grec cyto - cellule - et kinos -
mouvement). Cependant, en raison de leur forte présence dans le système immunitaire et
de leur origine cellulaire, elles ont été initialement appelées lymphocytes et
monokines. 60,61,62 En effet, leurs fonctions les plus anciennement connues allaient de la
régulation de la réponse du système immunitaire à l'inflammation et l'infection.
Néanmoins, lorsqu'il est apparu clairement que la plupart des cellules nucléées étaient
capables de synthétiser et de répondre à ces protéines, leur champ d'action s'est élargi et,
par conséquent aussi leur désignation. 63 Au fil des ans, il y a eu de nombreuses maladies
liées aux cytokines, leurs actions étant soit une cause, soit un effet de la maladie. Les
cytokines sont généralement produites en réponse à l'activation des cellules, servant de
communicateurs pour des fonctions spécifiques dans différents tissus. Elles sont produites
de manière rapide, la sécrétion immédiate ayant un effet à courte distance. Bien que leurs
fonctions protéiques partagent de nombreuses similitudes avec les hormones, elles
diffèrent par certaines caractéristiques clés qui nous permettent de les distinguer. Alors
que les hormones sont principalement produites par une glande ou un tissu spécifique, les
cytokines peuvent être produites à différents endroits. Les cytokines, sauf quelques
exceptions (comme l'IL-1 ou le TNF), agissent sur un microenvironnement (effet à courte
distance), alors que les hormones peuvent agir sur la plupart des cellules. 10
En général, les cytokines ne partagent pas de motifs de séquence d'acides aminés ni de
structures tridimensionnelles. Il n'y a pas de moyen standard de les classer en différentes
catégories, et différentes méthodes de classification existent, telles que celles basées sur
leurs activités biologiques 64 ou sur leurs récepteurs.65 Pour des raisons de simplicité, et
puisque ce chapitre n'a pas pour but d'être une description exhaustive des cytokines et de
leur activité, nous avons choisi cette dernière :

60 S. A. Rosenberg et al. N. Engl. J. Med. 1985, 313, 1485-1492

61 M. J. Selinger et al. Nature 1980, 285, 498-500
62 D. C. Dumonde et al. Nature 1969, 224, 38-42
63
S. Cohen et al. Cell. Immunol. 1974, 12, 150-159
64 C. A. Dinarello, Chest 2000, 118, 503-508
65 E. Vacchelli et al. Oncoimmunol. 2012, 1, 493-506

22
- les chimiokines, décrites à l'origine comme pouvant stimuler la migration de différents
types cellulaires, tels que les neutrophiles, les lymphocytes, les éosinophiles, les
fibroblastes et les kératinocytes. Ils partagent des structures secondaires et se distinguent
par un motif tétra cystéine (divisé en C, CC, CSC et CX 3C, en fonction de leur nombre et
de leur disposition),66

- les facteurs de croissance hématopoïétiques (HGF) ou cytokines hématopoïétiques,

nécessaires à l'équilibre, à la prolifération, à la différenciation et au maintien des cellules
souches hématopoïétiques, ainsi qu'à la réponse aux stimuli induisant l'expansion en lignées
cellulaires hématopoïétiques spécifiques. Ils peuvent être divisés, en fonction de leurs
récepteurs respectifs, ceux qui partagent la gp130 ou la chaine c, entre autres, et seront
développés plus loin dans cette section.67
- les membres de la famille IL-1, y compris IL-1, IL-1 et IL-18. Produites par les
macrophages activés, avec un rôle prépondérant dans l'inflammation locale et systémique,68

- les membres de la famille IL-10, avec six membres : IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 et
IL- 26. Leurs activités biologiques vont de l'immunosuppression (IL-10), à l'activité
antivirale (IL-29, par exemple), aux effets mitogènes et pro-survivants (par exemple IL-
19),69,70

- les membres de la famille IL-17, incluant six variantes : IL-17A-F. Habituellement

sécrétés en réponse à l'IL-23 par les cellules T auxiliaires, ils ont tendance à stimuler la
libération d'autres cytokines, dans une réponse pro-inflammatoire,71,72

- les interférons, qui " interfèrent " avec la réplication virale, en réponse à l'infection, ainsi
qu'avec l'activation des cellules immunitaires et la reconnaissance des cellules tumorales,
par la présentation de l'antigène aux lymphocytes T. Ils peuvent être subdivisés en Type I
(IFN, IFN, IFN, IFN, IFNω), Type II (IFNγ) et Type III (IL-28A, IL-28B, IL-29),73,74

66 I. Comerford et al. Immunol. Cell. Biol. 2011, 89, 183-184

67
G. H. Lyman et al. Cancer Treat. Res. 2011, 157, 3-10
68 L. A. O’Neill, Sci. STKE. 2000, re1
69 H. Fickenscher et al. Trends Immunol. 2002, 23, 89-96

70 A. Zdanov, Curr. Pharm. Des. 2004, 10, 3873-3884

71 Y. Iwakura et al. Immunity 2011, 34, 149-162
72
S. H. Chang et al. Cell. Signal. 2011, 23, 1069-1075
73 M. G. Katze et al. Nat. Rev. Immunol. 2002, 2, 675-687
74 J. M. González-Navajas et al. Nat. Rev. Immunol. 2012, 12, 125-135

23
- les membres de la famille du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), y
compris les isoformes du PDGF, les isoformes du facteur de croissance endothélial
vasculaire (VEGF) et six autres protéines. Ils induisent des fonctions mitogènes par
l'intermédiaire de deux récepteurs à tyrosine kinase ( et ) peuvent être libérés par les
plaquettes, les cellules musculaires lisses, les macrophages activés et les cellules
endothéliales,75

- les membres de la famille du facteur de croissance transformant  (TGF), avec trois

sous-types distincts de TGF et huit protéines supplémentaires faisant partie de la famille.
Ils exercent des effets antiprolifératifs, par le biais de l'augmentation de l'expression des
inhibiteurs du cycle cellulaire, et induisent la mort cellulaire en activant l'apoptose,76

- la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF), comprenant 15 protéines distinctes

capables de déclencher la mort cellulaire, dans des conditions spécifiques. Le membre le
plus ancien et le plus connu, le TNF joue un rôle dans de nombreuses maladies
inflammatoires, y compris, mais sans s'y limiter, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie de
Crohn ou le psoriasis.77,78

Après cette brève introduction, non exhaustive, sur les cytokines et leur classification, il
est maintenant temps de discuter des récepteurs des cytokines, avec une attention
particulière à la famille des facteurs de croissance hématopoïétiques, dont l'IL-15 et l'IL-2
font partie.

II-2. Les récepteurs des cytokines

Les récepteurs des cytokines sont des glycoprotéines transmembranaires, généralement

composées de plusieurs sous-unités. Les différentes sous-unités sont de nature très
distincte, avec des différences dans le poids moléculaire, le mode de liaison, ainsi que dans
le nombre de fois qu'elles traversent la membrane cellulaire. Les récepteurs peuvent être
constitués d'un seul type ou de plusieurs sous-unités distinctes, formant des récepteurs
homo-multimèriques ou hétéro-multimèriques, respectivement. La liaison d'un ligand à la
partie externe d'un récepteur trans-membranaire peut entraîner le recrutement
intracellulaire de molécules supplémentaires, déclenchant ainsi une cascade de signalisation
au sein de la cellule.

75 K. Pietras et al. Cancer Cell. 2003, 3, 439-443

76
B. Schmierer et al. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2007, 8, 970-982
77 S. Wang et al. Oncogene 2003, 22, 8628-8633
78 M. A. Palladino et al. Nat. Rev. Drug. Discov. 2003, 2, 736-746

24
 II-2.1. Les cytokines hématopoïétiques

Les cytokines hématopoïétiques (du grec ancien « haímatos », du sang, et «poíêsis»,

création) sont des cytokines impliquées dans la différentiation et l’expansion des cellules
sanguines. Ces cytokines sont reconnues par les récepteurs hématopoïétiques, ou
récepteurs de classe I qui constituent le groupe le plus important des récepteurs des
cytokines. La plupart de ces récepteurs n’induit pas de signal par homodimérisation mais
plutôt par hétérodimérisation ou trimérisation (IL-2, IL-15), tétramérisation et même hexa
et dodécamérisation. 79 Ces récepteurs oligomériques des cytokines hématopoïétiques
possèdent l’une des trois chaines suivantes définissant ainsi trois familles de cyt okines
hématopoïétiques (Figure 2) :

- les cytokines dont les récepteurs comportent la chaîne transductrice gp130

- les cytokines dont les récepteurs comportent la chaîne transductrice βc
- les cytokines dont les récepteurs comportent la chaîne transductrice γc

Figure 2 : Représentation schématique des récepteurs de cytokines partagés : γc (a), gp130 (b) et βc (c).
Certaines cytokines connues ayant des interactions connues avec ces récepteurs sont représentées par des
cylindres (Adapté de X. Wang et al.79).

Les récepteurs de cytokines hématopoïétiques, ou récepteurs de type I, sont des

glycoprotéines membranaires. Chacun de ces récepteurs comporte un domaine
transmembranaire, une extrémité NH2-terminal extracellulaire et une extrémité COOH-
terminal intracellulaire. Les régions extracellulaires sont variables, mais présentent toutes
une architecture de type « Cytokine binding Homology Region » (CHR)80 caractérisée par
deux domaines de type fibronectine III. Le premier domaine, situé le plus proche du NH2-
terminal, contient quatre résidus cystéines conservés qui forment deux ponts disulfures
intracaténaires successifs indispensables à la fonctionnalité du CHR. Le second domaine,
proche de la membrane cellulaire, possède un motif W-S-X-W-S (W : tryptophane, S :
79 X. Wang et al. Annu. Rev. Immunol. 2009, 27, 29-60
80 J. F. Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 6934-6938

25
sérine, X : acide aminé quelconque) conservé au sein de la famille des récepteurs
hématopoïétiques et indispensable à la fixation du ligand. 81 Des domaines supplémentaires
de type Immunoglobuline (Ig) et/ou FNIII peuvent être trouvés dans les régions
extracellulaires de certains récepteurs de type I. Les domaines de type Ig peuvent jouer un
rôle dans la liaison de la cytokine à son récepteur, tandis que les domaines de type FNIII
seraient impliqués dans les interactions entre les chaînes de récepteurs. 82 La structure
générique de ces types de récepteurs est représentée sur la Figure 3.

Figure 3 : Représentation de la structure d'un complexe de récepteurs de cytokines de type I.

La fixation de la cytokine sur son récepteur induit une oligomérisation des sous-unités
réceptrices et le rapprochement des domaines intracellulaires. Les JAKs, constitutivement
associées à ces domaines, sont alors activées et assurent leur propre phosphorylation et
celle des domaines intracellulaires des chaînes réceptrices. Les tyrosines phosphorylées des
chaînes réceptrices recrutent alors les « Signal Transducer Activator of Transcription »
(STATs), qui, une fois phosphorylés, seront transloqués sous forme dimérique dans le
noyau et agiront en tant que facteurs de transcription (Figure 4). Par ailleurs, JAK peut
déclencher une cascade de protéines kinases activées par des agents mitogènes (MAPK),
par le biais de la phosphorylation de Grb2. Grb2, ce qui entraîne également une
modification de l'expression génétique.

81 A. M. de Vos AM et al. Science 1992, 255, 306-312

82 A. Timmermann et al. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 2716-2726

26
Figure 4 : Cas simplifié de la voie de signalisation JAK/STAT de l'érythropoïétine. La liaison de
l'érythropoïétine induit la dimérisation du récepteur, ce qui permet à la Tyr kinase JAK de se lier à son
domaine interne (Adapté de D. L. Nelson83).

Bien que l’exemple présenté ci-dessus concerne le cas le plus simple de ces récepteurs, un
homodimère, la plupart des récepteurs de cytokine de type I sont en fait soit formés par
deux sous-unités différentes (IL-4, IL-7), trois sous-unités différentes (IL-2, IL-15), quatre
(IL-6, G-CSF/G-CSFR), etc. Comme il a été mentionné précédemment, cette famille est
ensuite divisée en différents groupes, représentés dans la figure 2, en fonction de la
composante de signalisation : la chaîne c, gp130 ou γc. Le premier groupe comprend les
récepteurs pour l’IL-3, IL-5 et GMCSF, le second ceux de l'IL-6, IL-11, LIF, CNTF, OSM,
CT-1, CLC et IL-27, le dernier ceux de l'IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 et IL-21. Ce travail
de thèse ayant été réalisé sur l'IL-15 et, dans une moindre mesure, sur l'IL-2, cytokines qui
appartiennent toutes deux à la famille des récepteurs γc, nous nous attacherons à la
description de ce type de récepteurs.

II-2.2. Les cytokines de la famille γc

Les membres de la famille des cytokines partageant la chaîne du récepteur γc sont tous
composés d'un faisceau de quatre hélices , possédant des effets redondants à la fois dans
l'homéostasie et la régulation de la réponse immunitaire, ainsi que des effets exclusifs pour
chacun. Il est intéressant de noter que l'IL-13 et la lymphopoïétine thymique stromale
(TSLP), deux cytokines étroitement liées à l'IL-4 et à l'IL-7, respectivement, n'utilisent pas
la chaîne γc, mais une chaîne de substitution (IL-13R1 pour l'IL-13 et TSLPR pour la
TSLP), qui peut avoir des caractéristiques comparables à la chaîne γc.84

83
D. L. Nelson et al. Lehninger Principles of Biochemistry, 2008 (Macmillan)
84 Y. Rochman et al. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9, 480-490

27
En ce qui concerne leurs fonctions spécifiques :

- l'IL-2 est un facteur de croissance pour les lymphocytes T, jouant un rôle dans la tolérance
immunitaire par l'induction de la mort cellulaire induite par l'activation, ainsi que par le
développement de cellules T régulatrices (Tregs) CD4+ FoxP3+,85,86

- l'IL-4 est principalement sécrétée par les mastocytes, les cellules Th2, les éosinophiles et
les basophiles et joue un rôle dans le changement de classe des IgE,87

- l'IL-7 joue un rôle dans le développement des cellules T dans la moelle osseuse et le
thymus, ainsi que dans l'homéostasie des cellules T naïves et mémoires en périphérie. En
outre, elle joue un rôle dans le développement des cellules B et des cellules lymphoïdes
innées, 88
- l'IL-9 induit l'activation des cellules épithéliales, des cellules B, des éosinophiles et des
mastocytes89, et joue un rôle anti-tumoral en augmentant l'activation des cellules T
CD8+,90

- l'IL-15 participe au développement des cellules tueuses naturelles (NK) et à l'homéostasie

des cellules T CD8+ à mémoire,91

- l’IL-21 induit la différenciation des cellules B en cellules plasmatiques, régulant également

la production d'immunoglobulines. Elle joue également un rôle dans la prolifération des
cellules NK, T CD4+ et des cellules T CD8+. 92

Concernant les récepteurs eux-mêmes, l'IL-4, l'IL-7, l'IL-9 et l'IL-21 se lient à des
récepteurs hétérodimériques, composés d'une chaîne spécifique (IL-4R, IL-7R, IL-
9R, IL-21R, respectivement) et de la chaîne γc.85

85
S. Sakaguchi et al. Cell 2008, 133, 775-787
86 T. A. Waldmann, Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 595-601
87 S. T. Holgate et al. Nat. Rev. Immunol. 2008, 8, 218-230

88 H. Spits et al. Nat. Rev. Immunol. 2013, 13, 145-149

89 H. P. Hauber et al. Int. Arch. Allergy Immunol. 2004, 134, 79-87
90
Y. Lu et al. J. Clin. Invest. 2012, 122, 4160-41719
91 M. K. Kennedy et al. J. Exp. Med. 2000, 191, 771-780
92 R. Spolski et al. J. Nat. Rev. Drug Discov. 2014, 13, 379-395

28
Figure 5 : Représentation schématique des différents éléments de la famille des γc et de leurs récepteurs
respectifs (Adapté de W. J. Leonard et al 93).

L'IL-2 et l'IL-15 sont les deux seuls membres de la famille qui se lient à la fois à un récepteur
dimérique commun formé ), des chaînes réceptrices IL-2Rβ et γc, et à un récepteur hétéro-
trimérique spécifique de haute affinité, composé d'une chaîne spécifique (IL-2R et IL-
15R) s’associant aux deux chaines réceptrices susmentionnées, respectivement (Figure
5). La chaîne réceptrice IL-2Rβ est structurellement similaire aux récepteurs spécifiques
des autres éléments de la famille, appartenant à la famille des récepteurs de type I.

III - L’interleukine-15

III-1. Généralités

L'IL-15, comme mentionné précédemment, est une cytokine hématopoïétique, membre

de la famille des cytokines qui utilisent la chaîne réceptrice γc. Elle a été initialement
identifiée en raison de sa similitude de fonction avec l'IL-2.94,95 En fait, cette similitude de
fonction n'est pas surprenante, puisque les deux cytokines partagent deux des trois
récepteurs (IL-2Rβ et γc).
L'IL-15 est une glycoprotéine soluble de 14-15 kDa, composée de 114 acides aminés. Elle
possède une séquence hautement conservée parmi les différentes espèces, l'IL-15 humaine
ayant 97% d'homologie avec l'IL-15 de singe et 73% d'homologie avec l'IL-15 de souris.95
L'IL-15 humaine possède deux ponts disulfures : Cys35-Cys85 et Cys42-Cys88
(homologues du pont disulfure unique de l'IL-2 : Cys58-Cys105). Il contient trois sites

93
W. J. Leonard et al. Immunity 2019, 50, 832-850
94 J. D. Burton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 4935-4939
95 K. H. Grabstein et al. Science 1994, 264, 965-968

29
potentiels de N-glycosylation vers l'extrémité C-terminale (Asn71, Asn79 et Asn112). 96
Comme les autres membres de la famille γc, il est composé de quatre hélices  dans une
configuration «up-up-down-down».Erreur ! Signet non défini. L'IL-15 et l'IL-2 ne présentent pas d
'homologie de séquence primaire ; néanmoins, les acides aminés nécessaires à la liaison à
leurs récepteurs partagés IL-2Rβ et γc sont conservés. 97,98 L'IL-15 a deux isoformes, basées
sur la longueur du peptide signal (peptide signal court - SSP - ou peptide signal long -
LSP). 95,99,100 L'isoforme SSP est exclusivement intracellulaire, n'étant pas sécrété,100,101
tandis que l'isoforme LSP est localisé au niveau de l'appareil de Golgi et du réticulum
endoplasmique. 102 Néanmoins, les deux isoformes peuvent être localisées dans le noyau. 103
L'IL-15 est exprimée de manière constitutive par une pléthore de types cellulaires, qu'ils
fassent partie du système immunitaire ou non. Elle peut être exprimée dans le placenta, les
muscles squelettiques, le foie, les reins, les poumons, le cœur et la peau, en dehors des
cellules du système immunitaire elles-mêmes.95,104 En revanche, l'IL-2 est principalement
exprimée par les cellules T activées et les cellules dendritiques.105

Les principales sources cellulaires d'IL-15 sont les cellules dendritiques, les
monocytes/macrophages et les cellules épithéliales.106,107 Elle peut également être produite
dans les cellules stromales de la moelle osseuse, les cellules épithéliales thymiques et les
intestins fœtaux. 108,109,110 De plus, les cellules épithéliales rénales, les cellules
épidermiques, les kératinocytes, les astrocytes et la microglie peuvent également exprimer
l'IL-15.111,112 Cependant, même avec ce vaste ensemble de cellules capables d'exprimer
l'ARNm de l'IL-15, la cytokine elle-même est rarement détectable dans des conditions
physiologiques,101,102 ce qui indique que son expression est étroitement régulée,
probablement en raison de son effet pro-inflammatoire. Une dérégulation de l'expression
de cette protéine pourrait conduire à des maladies auto-immunes.113
La régulation de l'IL-15 se fait, essentiellement, à trois niveaux : transcription, traduction,
post-traduction. Au niveau de la transcription, la régulation peut se faire soit par le facteur

96 N. A. Hanick et al. Biochemistry 2007, 46, 9453-9461

97 X. Wang et al. Science 2005, 310, 1159-1163
98
S. M. Zurawski et al. EMBO J. 1993, 12, 5113-5119
99 A. Onu et al. J. Immunol. 1997, 158, 255-262
100 Y. Tagaya et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 14444-14449
101 A. Gaggero et al. Eur. J. Immunol. 1999, 29, 1265-1274

102 G. Kurys et al. J. Biol. Chem. 2000, 275, 30653-30659

103 H. Nishimura et al. J. Exp. Med. 2000, 191, 157-170
104 T. A. Fehniger et al. Blood 2001, 97, 14-32

105 F. Granucci et al. Nat. Immunol. 2001, 2, 882-888

106
T. M. Doherty et al. J. Immunol. 1996, 156, 735-741
107 T. Musso et al. Blood 1999, 93, 3531-3539. Erratum in: Blood 2012, 120, 2155
108 G. Leclercq et al. J. Exp. Med. 1996, 184, 325-336

109 E. Mrózek et al. Blood 1996, 87, 2632-2640

110 A. M. Murray et al. Cytokine 1998, 10, 337-345
111
K. Kawai et al. J. Invest. Dermatol. 1998, 110, 961-965
112 M. Mohamadzadeh et al. J. Immunol. 1995, 155, 4492-4496
113 T. A. Waldmann, Arthritis Res. Ther. 2004, 6, 174-177

30
nucléaire NF-B, soit par les facteurs de transcription IRF-1 et 2. 114,115 Au niveau de la
traduction, la présence d'un certain nombre de codons d'initiation entraîne une régulation
négative, en réduisant l'efficacité de la traduction.116

III-2. Les chaînes réceptrices de l’IL-15

Afin d'exercer son activité, l'IL-15 se lie à trois chaînes réceptrices différentes pouvant
former deux types de récepteurs.

III-2.1. Les chaînes réceptrices de l’IL-15 communes à l’IL-2

III-2.1.1. La chaîne réceptrice commune γc

Structurellement, le récepteur γc est une glycoprotéine membranaire de 64 kDa, qui fait
partie des récepteurs de cytokines de type I. Il est formé de 369 aa, dont 22 font partie du
peptide signal. Le domaine intracellulaire est composé de 86 aa, le domaine
transmembranaire de 28 aa et le domaine extracellulaire de 233 aa. 117 La partie
intracellulaire ne contient pas d'activité kinase intrinsèque, cependant, elle possède un
domaine SH2, permettant à JAK3 de s'y lier. 118 Ainsi, pour que la signalisation ait lieu,
cette chaîne doit être associée au récepteur IL-2Rβ. Ce dernier est exprimé de manière
constitutive dans de nombreux types de cellules, son expression étant augmentée après une
activation par l'IL-2 ou l'IFNγ et diminuée par le TGF-β1.119

III-2.1.2. La chaîne réceptrice commune IL-2Rβ

De même que le récepteur γc, il s'agit d'une glycoprotéine membranaire de 70-75 kDa,
faisant également partie de la famille des récepteurs de cytokines de type I. 120,121 Sur un
total de 525 aa, le peptide signal est de 26 aa, le domaine intracellulaire de 286 aa, le
domaine transmembranaire de 25 aa et le domaine extracellulaire, contenant un domaine
CHR, est de 241 aa. 122 Il est exprimé dans les cellules immunitaires (cellules NK, cellules

114 K. Ogasawara et al. Nature 1998, 391, 700-703

115
T. Ohteki et al. J. Exp. Med. 1998, 187, 967-972
116 M. Kozak, Annu. Rev. Cell. Biol. 1992, 8, 197-225
117 T. Takeshita et al. Science 1992, 257, 379-382

118 J. Thèze et al. Immunol. Today 1996, 17, 481-486

119 M. C. Bosco et al. Blood 1994, 83, 2995-3002
120
M. Dukovich et al. Nature 1987, 327, 518-522
121 M. Tsudo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83, 9694-9698
122 M. Hatakeyama et al. Science 1989, 244, 551-556

31
T, monocytes et neutrophiles), son expression étant augmentée par la stimulation des
cellules T par le TCR, la PMA, l'IL-2 ou l'IL-4.123,124,125

III-2.2. La chaîne réceptrice spécifique de l’IL-15 : IL-15R

L'IL-15R ressemble beaucoup à l'IL-2R, c’est une protéine transmembranaire de type I

composée d'un domaine sushi.126 Totalisant 267 aa, le peptide signal est de 30, le domaine
intracellulaire de 41, le domaine transmembranaire de 18 et le domaine extracellulaire de
175.124 L'ARNm de l'IL-15 peut être exprimé dans les cellules T, B et NK, les macrophages,
les cellules dendritiques, les cellules stromales thymiques et les cellules de la moelle
osseuse, les cellules endothéliales vasculaires activées, le foie, le cœur et les poumons entre
autres. 126,127,128,129 Son expression est accrue en réponse à l'IFN-γ dans les macrophages, ou
en réponse à l'IL-2, un anticorps anti-CD3 ou du mitogène PMA, dans les cellules T.91 Sa
vaste distribution cellulaire est opposée à celle de l'IL-2R, ce qui met en évidence le large
spectre d'action de l'IL-15.

Les trois sous-unités réceptrices décrites précédemment peuvent s'associer de plusieurs

manières, produisant ainsi différents récepteurs fonctionnels de l'IL-15 avec des affinités
différentes. Le récepteur dimérique IL-2Rβ/γc a une affinité intermédiaire (Kd ≈ 10-9 M)
pour l'IL-15 et permet la signalisation en l'absence de l'IL-15R. L'IL-15R a une forte
affinité pour l'IL-15 (Kd ≈ 10-10M) et peut s'associer aux deux autres récepteurs, pour
former un récepteur trimérique à forte affinité pour l'IL-15 (Kd ≈ 10-11M).130

III-3. Les modes d’action de l’IL-15

Il existe deux modes d'action pour l'IL-15, la cis-présentation et la trans-présentation,

illustrés sur la Figure 6. La cis-présentation est commune à d'autres cytokines et implique
la liaison de l'IL-15 aux récepteurs dimériques ou trimériques exprimés à la surface d’une
même cellule. La trans-présentation est un nouveau mécanisme récemment décrit pour
l’IL-15 et consiste à l’expression coordonnée de l’IL-15 avec l’IL-15R à la surface de
cellules présentatrices d’antigènes (monocytes et cellules dendritiques) et à la présentation

123
H. P. Kim et al. Cytokine Growth Factor Rev. 2006, 17, 349-366
124 D. M. Anderson et al. J. Biol. Chem. 1995, 270, 29862-29869
125 H. Krause et al. Cytokine 1996, 8, 667-674

126 J. G. Giri et al. EMBO J. 1995, 14, 3654-3663

127 D. M. Anderson et al. Genomics 1995, 25, 701-706
128
U. K. Hanisch et al. J. Biol. Chem. 1997, 272, 28853-288560
129 M. Kurowska et al. NY Acad. Sci. 2002, 966, 441-445
130 J. L. de Jong et al. J. Immunol. 1996, 156, 1339-1348

32
en trans de l’IL-15 liée à sa chaîne réceptrice spécifique  à des cellules effectrices voisines
(NK ou T CD8+) n’exprimant que les récepteurs IL-2Rβ/γc.131,132,133

Figure 6 : Représentation graphique des deux différents modes de présentation de l'IL-15. À gauche, le
mode de présentation en cis, dans lequel l'IL-15 se lie aux récepteurs dimériques ou trimériques exprimés
par la cellule effectrice. À droite, le mode de présentation trans, dans lequel la cytokine est amenée à la
surface de la cellule, liée à son IL-15R et interagit avec le IL-2Rβ/γc à la surface de la cellule effectrice
(Adapté de B. Jabri et al. 134).

III-4. Les voies de signalisation de l’IL-15

La transduction du signal est assurée par les chaînes réceptrices γc et IL-2Rβ, la chaîne α
n’intervenant pas. L’IL-2 et l’IL-15 activent différentes voies de signalisation, dont la voie
« Phosphatidyl Inositol 3-Kinase » (PI3K), la voie « Mitogen-Activated Protein Kinases »
(MAPK) et la voie principale « Janus Associated Kinases/Signal Transducer and Activator
of Transcription » (JAK/STAT). 135 La fixation de la cytokine sur son récepteur va induire
l’activation des protéines tyrosines kinases JAK1 et JAK3, qui après autophosphorylation,
vont phosphoryler les domaines intracellulaires des chaînes γc et IL-2Rβ et les protéines
STAT5 et STAT3, permettant ainsi leur dimérisation. Une fois dimérisées, ces protéines
STAT pourront migrer dans le noyau pour activer la transcription de gènes cibles (Figure
7).

131
P. R. Burkett et al. J. Exp. Med. 2004, 200, 825-834
132 S. Dubois et al. Immunity 2002, 17, 537-547
133
E. Mortier et al. Immunity 2009, 31, 811-822
134 B. Jabri et al. Nat. Rev. Immunol. 2015, 15, 771-783

135 J. X. Lin et al. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2018, 10, a028449

33
Figure 7 : Voies de signalisation de l'IL-15. A la suite de la fixation de l’IL-15 sur son récepteur en cis ou
en trans, l’activation se fait par trois voies. La première implique l'activation de JAK1/3/STAT3/5, les
protéines STAT phosphorylées formant des dimères se déplaçant vers le noyau pour l'activation
transcriptionnelle. Dans la deuxième voie de l'IL-15, la protéine adaptatrice Shc se lie à un résidu
phosphotyrosine sur IL-2Rβ, ce qui entraîne l'activation de la voie de signalisation Shc, Grb2, GAB2,
P13K et AkT.136 Dans la troisième voie, la signalisation IL-15 est associée à l'activation de Grb2 et SOS
pour former un complexe Grb2/SOS qui active la voie RAS-RAF MAPK impliquée dans la prolifération
cellulaire. Collectivement, ces voies de signalisation induisent l'expression et l'activation de c-Myc, c-Fos,
c-Jun, Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, NF-κB, et TNFα (Adapté de T. A. Waldmann et al. 137).

136 A. Mishra A et al. Clin. Cancer Res. 2014, 20, 2044-2050

137 T. A. Waldmann et al. J. Exp. Med. 2020, 217, e20191062

34
III-5. Les fonctions biologiques de l’IL-15

III-5.1. Contexte physiologique

Comme cela a déjà été évoqué, l'IL-15 a un large spectre d'activité, dont une partie est
résumée dans la Figure 8. L’IL-15 présente in vitro une certaine redondance fonctionnelle
avec l’IL-2, liée à une utilisation commune de deux chaînes transductrices. Mais à l’inverse
de l’IL-2 et de sa chaîne spécifique IL-2Rα, l’IL-15 et l’IL-15Rα présentent une large
distribution d’expression cellulaire et tissulaire. L’IL-15 exerce ainsi in vivo des activités
biologiques nombreuses et variées et intervient dans diverses pathologies.

Le système immunitaire est caractérisé par sa capacité à lutter rapidement et de manière

non spécifique contre des infections (immunité innée) et par sa capacité à éliminer
spécifiquement des pathogènes de manière dépendante des antigènes (immunité
adaptative). L’IL-15 est cruciale pour le développement, la prolifération, la survie et la
différenciation de différentes cellules qui participent à l'immunité innée et adaptative. Elle
agit sur la maturation et l’activation des cellules NK et elle régule l’homéostasie et la survie
des lymphocytes CD8 + mémoires. Elle induit la prolifération des lymphocytes CD8 + et
permet la production de cytokines pro-inflammatoires. Elle inhibe la mort cellulaire
induite par activation (AICD : Activation-induced cell death) déclenchée par l’IL-2.135

Figure 8 : Schéma présentant une liste condensée de quelques sources cellulaires produisant l'IL-15, de
quelques cellules cibles, ainsi que du mécanisme par lequel elle exerce sa fonction et les conséquences qui
en découlent (Adapté de B. Jabri et al.).

35
 III-5.2. Contexte pathologique

La protéine IL-15 est très rarement détectable dans des conditions physiologiques mais elle
peut être détectée dans certains contextes pathologiques. Aussi, l’IL-15 intervient dans la
défense anti-virale ou anti-microbienne (bactéries et parasites) mais également dans le
cadre de pathologies auto-immunes et de cancers.

III-5.2.1. Infections virales et microbiennes

Les infections in vitro de PBMC humains par le HHV-6 (human herpes virus type-6), le HHV-
7, le HSV-1 (Herpes Simplex Virus type-1) ou I’EBV (Epstein-Barr Virus) augmentent la
transcription et la sécrétion d’IL-15 par les monocytes et les cellules NK.138,139,140 L’IL-15
ainsi produite induit la cytotoxicité et la production d’IFNγ des cellules NK et limite
l’expansion virale. De même, une augmentation de la production d’IL-15 est observée in
vivo lors de l’infection par le virus de l’hépatite C (VHC). 141 A l’inverse, l’IL-15
participerait au développement d’une pneumonie induite par le virus Influenza A en
recrutant des lymphocytes T CD8+ au niveau pulmonaire. 142
Le cas de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est plus complexe.
En effet, l’IL-15 exerce deux fonctions contradictoires : la première active la réplication
du virus et la seconde stimule les fonctions immunitaires contre le virus.104
L’IL-15 possède un rôle lors de diverses infections : L’expression de l’IL-15 est augmentée
suite aux infections par Burkholderia pseudomallei, par le bacille de Calmette-Guérin (BCG)
ou par Mycobacterium tuberculosis.106,143
La surexpression d’IL-15 in vivo protège de l’infection par le BCG en augmentant la réponse
immunitaire cytotoxique des cellules NK et des lymphocytes T.144 L’IL-15 protège
également contre l’infection par Toxoplasma gondii.
L’administration d’IL-15 avant une infection par Plasmodium falciparum augmente la défense
immunitaire de l’hôte. 145 Lors d’une infection par Listeria monocytogenes, l’IL-15 produite
par les cellules épithéliales intestinales pourrait induire la prolifération et la sécrétion
cytokinique des IELs CD8 et la production d’IFNγ par les lymphocytes T CD8+
mémoires. 146,147

138 B. N. Atedzoe et al. J. Immunol. 1997, 159, 4966-4972

139 L. Flamand L et al. J. Clin. Invest. 1996, 97, 1373-1381
140
J. Gosselin et al. Blood 1999, 94, 4210-4219
141 S. Kakumu et al. Clin. Exp. Immunol. 1997, 109, 458-463
142 R. Nakamura et al. J. Virol. 2010, 84, 5574-5582

143 F. N. Lauw et al. J. Infect. Dis. 1999, 180, 1878-1885

144 M. Umemura et al. J. Immunol. 2001, 167, 946-956
145
M. M. Elloso et al. Immunol. Lett. 1998, 64, 125-132
146 K. Hirose et al. Infect. Immun. 1998, 66, 5677-5683
147 T. Yajima et al. Eur. J. Immunol. 2001, 31, 757-766

36
La sécrétion d’IL-15 suite à l’infection de monocytes par Mycobacterium leprae induit une
réponse cellulaire T locale. 148 Enfin, l’IL-15 présente une action anti-microbienne contre
Criptococcus neoformans et Candida albicans.149,150

III-5.2.2. Pathologies auto-immunes et inflammatoires

L’IL-15 intervient par exemple dans la polyarthrite rhumatoïde. Cette pathologie est une
maladie inflammatoire chronique affectant les jonctions osseuses périphériques. Elle est
caractérisée par une hyperplasie de la membrane synoviale et par une infiltration de cellules
immunitaires au niveau des liquides synoviaux. Ces fluides synoviaux présentent un taux
important de cytokines pro-inflammatoires comme le TNF et l’IL-6, mais aussi l’IL-15.151
L’IL-15 contribue aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin regroupant la
rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn (MC). Elles sont caractérisées par
des désordres gastro-intestinaux et extra-intestinaux. Les PBMC de patients atteints de
RCH ou de formes sévères de MC produisent plus d’IL-15 par rapport aux sujets sains et
aux sujets atteints de formes plus modérées de MC. 152 L’IL-15 pourrait également jouer
un rôle important dans le rejet de greffe allogénique. Ce phénomène inflammatoire met
en jeu diverses cytokines participant à l’infiltration et l’activation de cellules immunitaires
dans l’organe transplanté. L’expression de l’IL-15 est significativement augmentée dans
d’autres pathologies auto- immunes et inflammatoires. Par exemple, des taux accrus d’IL-
15 sont retrouvés dans le cas de sarcoïdoses, 153,154 d’inflammations hépatiques
chroniques, 155 de sclérose en plaques, 156 de maladies auto-immunes de la thyroïde, 157 de
lupus érythémateux,158 de diabète de type I159 ou encore de psoriasis.160,161

148 D. Jullien et al. J. Immunol. 1997, 158, 800-806

149 C. H. Mody et al. J. Infect. Dis. 1998, 178, 803-814
150 N. Vázquez et al. Infect. Immun. 1998, 66, 145-150
151 I. B. McInnes et al. Nat. Med. 1996, 2, 175-182

152 I. Kirman et al. Am. J. Gastroenterol. 1996, 91, 1789-1794

153 C. Agostini et al. J. Immunol. 1996, 157, 910-918
154 G. Zissel et al. Eur. Cytokine Netw. 2000, 11, 105-112
155 S. Kakumu et al. Clin. Exp. Immunol. 1997, 109, 458-463

156 M. Pashenkov et al. Scand. J. Immunol. 1999, 50, 302-308

157 R. A. Ajjan et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997, 82, 666-669
158 M. Aringer et al. Rheumatology (Oxford) 2001, 40, 876-881

159
S. Kuczyński et al. Diabetes Res. Clin. Pract. 2005, 69, 231-236
160 R. Rückert et al. J. Immunol. 2000, 165, 2240-2250
161 G. Bouchaud et al. J. Exp. Med. 2013, 210, 2105-2117

37
 III-5.2.3. Cancer

L’IL-15, du fait de sa capacité à recruter et stimuler des cellules NK et NK-T et des

lymphocytes cytotoxiques, présente un intérêt en thérapie anti-cancéreuse. Cependant,
cette cytokine peut également être impliquée dans le développement de diverses tumeurs,
principalement des cancers de type lymphoïde mais aussi différentes tumeurs solides. L’IL-
15 pourrait aussi jouer un rôle dans le développement de certains mélanomes. L’évolution
de ces tumeurs solides cutanées est en liaison avec l’exposition solaire et les rayonnements
UV induisant notamment une augmentation de la transcription de l’IL-15 par les
kératinocytes.162 Enfin, le système IL-15/IL-15R interviendrait dans divers autres types de
cancers lymphoïdes comme les lymphomes cutanés T, 163,164 les leucémies à grands
lymphocytes à grains, les leucémies lymphocytaires B et les myélomes,104 mais également
dans de nombreuses tumeurs solides: ostéosarcomes, cancers du poumon à petites cellules,
carcinomes rénaux, glioblastomes, neuroblastomes, mésothéliomes,

III-5.2.4. Autres pathologies

L’IL-15 interviendrait dans le cadre d’athéroscléroses et d’hypertension. En effet, une

surexpression des transcrits de l’IL-15 a été observée dans des lésions athérosclérotiques
murines et humaines. 165 Aussi l’inflammation stimulerait la production d’IL-15 par les
cellules musculaires dans le cadre de pathologies musculaires (polymyosite et
dermatomyosite), qui contribuerait à l’immuno-pathogénèse en recrutant et activant les
cellules T. 166 A l’inverse, l’administration d’IL-15 protège le muscle de dégénération dans
un modèle murin de myopathie de Duchenne. 167 Enfin, plusieurs études récentes ont mis
en évidence une diminution de l’IL-15 musculaire avec l’âge et ce phénomène serait à
l’origine de sarcopénies.168

162 M. Mohamadzadeh et al. J. Immunol. 1995, 155, 4492-4496

163 A. Mishra et al. Cancer Cell. 2012, 22, 645-655
164 A. Mishra et al. Cancer Discov. 2016, 6, 986-1005
165 D. M. Wuttge et al. Am. J. Pathol. 2001, 159, 417-423
166
T. Sugiura et al. Int. Immunol. 2002, 14, 917-924
167 L. J. Harcourt et al. Am. J. Pathol. 2005, 166, 1131-1141
168 E. Marzetti et al. Mech. Ageing Dev. 2009, 130, 272-280

38
III-6. IL-15 et thérapies

III-6.1. Immunothérapie par l’IL-15

L’IL-15 et l’IL-2 présentent in vitro des fonctions biologiques assez similaires cependant
elles présentent des fonctions spécifiques parfois très différentes in vivo. Les effets de ces
deux cytokines ont pu être comparés dans divers modèles pathologiques pour lesquels l’IL-
2 présente un intérêt thérapeutique. Ainsi, l’IL-15 est moins toxique que l’IL-2 et plus
efficace pour induire l’expansion de cellules NK, le maintien de la réponse lymphocytaire
et la survie des lymphocytes T CD8 mémoires. 169,170 L’IL-15 présente donc des intérêts
thérapeutiques chez l’homme en immunothérapies anti-virale, anti-microbienne et anti-
cancéreuse.

Les fonctions de l’IL-15 liées à la production et la maintenance des cellules T CD8+

mémoires en ont fait une candidate idéale pour les études d’incorporation d’adjuvant dans
les vaccins. 171,172,173,174,175 Une attention particulière a été portée quant à l’utilisation de
l’IL-15 adjuvante pour l’amélioration de l’efficacité des vaccins contre le HIV-1 ainsi que
le VIS par une amélioration des profils immunitaires et le contrôle de la charge virale.
Parmi les cellules régulées par l’IL-15, on trouve en plus des lymphocytes T CD8 +, les
cellules NK ayant une action cytotoxique directe sur les cellules tumorales. Il a été mis en
évidence un rôle essentiel de l’IL-15 dans le développement, l’activation et la prolifération
des cellules NK et NKT, cellules contribuant largement à une réponse anti-tumorale
Plusieurs essais d’administration direct de l’IL-15 libre ou sous forme de complexe IL-
15/IL-15R ont été réalisés donnant tous des effets très différents selon les pathologies
étudiées suggérant donc la mise en place de mécanismes d’action différents selon le type
de tumeur ciblée. 176 Un super agoniste de l’IL-15 a été développé au sein de l’équipe liant
l’IL-15 humaine et une partie de la chaîne réceptrice  par un linker de 20 aa. 177 Cette
molécule appelée RLI (Récepteur-Linker-Interleukine 15) a montré, in vitro, des effets
prolifératifs supérieurs à l’IL-15 ou à l’association non covalente IL-15/IL-15R178 et in
vivo, une mobilisation essentielle des cellules NK.179 RLI a également montré une activité
anti-tumorale augmentée en comparaison à l’IL-15 ou à l’IL-2 dans un modèle métastatique
de mélanome murin et un modèle de cancer colorectal humain.180 La molécule RLI est

169 E. Katsanis et al. Transplantation 1996, 62, 872-875

170 H. Kobayashi et al. Cancer Res. 2000, 60, 3577-3583
171 T. A. Waldmann, Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 595-601

172 A. Leone et al. Curr. HIV Res. 2009, 7, 83-90

173
S. A. Calarota et al. Immunol. Rev. 2004, 199, 84-99
174 J. A. Chabalgoity et al. Cytokine Growth Factor Rev. 2007, 18, 195-207
175 L. Rodrigues et al. Expert Rev. Vaccines 2009, 8, 167-177

176 M. Jakobisiak et al. Cytokine Growth Factor Rev. 2011, 22, 99-108
177 E. Mortier et al. J. Biol. Chem. 2006, 281, 1612-1619
178
G. Bouchaud et al. J. Mol. Biol. 2008, 382, 1-12
179 N. D. Huntington et al. J. Exp. Med. 2009, 206, 25-34
180 A. Bessard et al. Mol. Cancer Ther. 2009, 8, 2736-2745

39
actuellement en phase II pour le traitement de tumeurs solides avancées/métastatiques
seule ou en combinaison avec le Pembrolizumab, un anti-PD1.181
L’ALT-803 est une autre protéine de fusion composée de l’IL-15 mutée complexée au
domaine sushi de l’IL-15Rα, qui est fusionné à un fragment Fc d’immunoglobuline IgG1.
L’ALT-803 a prouvé son efficacité pour le traitement de différents cancers, tels que les
tumeurs malignes hématologiques, certains lymphomes, les tumeurs avancées… Il a été
testé lors de diverses phases I 182 et une phase II débutera prochainement.
L’administration de l’IL-15 en soutien aux vaccins ou pour l’élimination des cellules
tumorales semble être une voie efficace pour le traitement des maladies virales et des
cancers et donne toute son importance à cette cytokine.

III-6.2. Blocage des effets de la surexpression de l’IL-15

A l’opposé, diverses pathologies inflammatoires et auto-immunes (polyarthrite

rhumatoïde, maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, rejet de greffe, ...) et
différents cancers (ATL, TSP, ...) présentent une production anormalement élevée d’IL-
15. Une diminution de la quantité d’IL-15 circulante ou une inhibition de l’activité de la
cytokine pourrait apporter un bénéfice thérapeutique aux patients atteints de ces
pathologies.
Plusieurs approches ont été développées pour bloquer l’activité de l’IL-15 (Figure 9)
comme l'IL-15Rα soluble, des molécules d'IL-15 mutantes,183,184,185 des anticorps anti-IL-
15 ou IL-2Rβ,186,187,188 et des modifications de l'IL-2 qui bloquent l'interaction de l'IL-15
avec son récepteur,189,190 ainsi que des inhibiteurs de JAK. 191,192 Ainsi, le mutant RETR de
H9 super IL-2 (dénommé H9-RETR) se lie à la chaîne IL-2Rβ mais pas à la chaîne γ. BNZ-
1, un agent de 24 acides aminés analogues aux éléments partagés de l'hélice D de l'IL-2 et
de l'IL-15, se lie à la chaîne γc mais pas à l'IL-2Rβ. Ces deux agents empêchent
l'hétérodimérisation médiée par l'IL-2 et l'IL-15 de l'IL-2Rβ avec le γc, qui est nécessaire
à la signalisation.

181 ClinicalTrials.gov: NCT04234113

182 ClinicalTrials.gov: NCT01885897 (ALT-803 seul), NCT02523469 (ALT-803 + Nivolumab)
183 Y. J. Kim et al. Pharm. Res. 2001, 18, 548-550

184 S. Ferrari-Lacraz et al. J. Immunol. 2004, 173, 5818-5826

185
L. Zhao et al. Sci. Rep. 2016, 6, 25822-25832
186 J. C. Morris et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 401-406
187 T. A. Waldmann et al. Blood 2013, 121, 476-484

188 K. Sestak et al. Front. Immunol. 2018, 9, 1603-1613

189 S. Mitra et al. Immunity 2015, 42, 826-838
190
T. Nata et al. J. Biol. Chem. 2015, 290, 22338-22351
191 M. Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 12480-12485
192 T. T. Wang et al. Leukemia 2019, 33, 1243-1255

40
Figure 9 : Approches pour bloquer les actions de l'IL-15. Plusieurs agents qui inhibent l'activité de l'IL-
15 ont été développés, notamment l'IL-15Rα soluble, un mutant de l'IL-15,183 des anticorps spécifiques
de l'IL-15 ou de l'IL-2Rβ, des modifications mutantes de l'IL-2 (BNZ-1 et 2, H9-RETR), pour bloquer
l'interaction de l'IL-15 avec ses récepteurs,189,190 et des inhibiteurs de JAK.191 (Adapté de T. A.
Waldmann et al. 137).

41
PARTIE 1 – Synthèse des premières
molécules inhibitrices du système IL-15
Cette partie explique rapidement les raisons qui ont motivé l’équipe à choisir l’interface
IL-15R comme cible et quelle stratégie a été choisie pour générer une première famille
de molécules de faible poids moléculaire inhibitrices du système IL-15.193

I – Etude de modélisation : Première série de composés IBI

I-1. L’interface IL-15/IL-2R comme cible thérapeutique

Comme cela a été dit, l'IL-15 joue un rôle important dans l'immunité innée et adaptative.
Elle se lie à ses 3 sous-unités réceptrices IL-15R, IL-2R et γc formant un complexe
trimérique présent sur les cellules cibles et assurant la transduction du signal (Figure 10).
En cas de dérégulation des taux d’IL-15, des réponses immunitaires anormales apparaissent
et peuvent être à l’origine de maladies auto-immunes et inflammatoires. Il apparaît donc
nécessaire de déstabiliser le complexe IL-15/IL-15R pour limiter les effets délétères de la
surexpression de l’IL-15. La sous-unité γc étant commune aux interleukines 2, 4, 7, 9 et
21194, il devient dès lors difficile d’en faire une cible thérapeutique car cela implique des
problèmes importants de spécificité entre les différentes interleukines qui partagent cette
même chaîne γc. La sous-unité IL-15Rα a pour particularité de fixer spécifiquement l’IL-
15. Son rôle permet de fixer et d’orienter l’IL-15 sur le récepteur dimérique γc.
Néanmoins, inhiber cette interface reste très complexe. En effet, d’une part l’affinité
existante entre IL-15 et IL-15R (Kd = 100 pM)195 est beaucoup trop élevée pour espérer
rentrer en concurrence avec une molécule de faible poids moléculaire. D’autre part, le
complexe dimérique /γc est à lui seul capable de fixer l’IL-15 et est responsable de la
transduction du signal, contrairement à la chaîne IL-15R.

193
A. Quéméner et al. J. Med. Chem. 2017, 60, 6249-6272
194 S. R. Pulliam et al. Immunol. Lett. 2016, 169, 61-72
195 D. M. Anderson et al. J. Biol. Chem. 1995, 270, 29862-29869

42
Figure 10 : Structures cristallographiques des complexes IL-15/IL-15R et IL-2/IL-2R. Sur la gauche, la
représentation de l’IL-15 (en bleu) fixée sur son récepteur trimérique constitué des 3 sous-unités
réceptrices IL-15R (en gris), IL-2R (en jaune) et γc (en orange) (code PDB : 4GS7).196 Sur la droite,
la représentation de l’IL-2 (en vert) fixée sur son récepteur trimérique constitué des 3 sous-unités IL-2R
(en gris), IL-2R (en jaune) et γc (en orange) (code PDB : 2B5I).97

Ainsi, afin de moduler l’activité de l’IL-15, la cible de choix s’est naturellement orientée
vers l’interface entre l’IL-15 et l’IL-2R, les problèmes de sélectivité étant moins
nombreux car seule l’IL-2 est en compétition avec l’IL-15 sur la chaîne IL-2R.

I-2. Construction du modèle de pharmacophore

Un pharmacophore est une structure géométrique, qui matérialise les propriétés physico-
chimiques de l’interaction d’un ligand avec un récepteur. Ces propriétés, qui peuvent être
des propriétés de donneurs ou d’accepteurs de liaisons hydrogène, des propriétés
hydrophobes, ou encore des propriétés électrostatiques, sont représentées sous forme de
sphères. Ces sphères sont disposées selon un arrangement spatial défini par l’interface
ligand/récepteur ciblée. Un pharmacophore sert à filtrer des banques de molécules
chimiques pour sélectionner un sous-ensemble de composés respectant les propriétés
physico-chimiques complémentaires du récepteur ciblé. Cette étape permet de réduire
considérablement le nombre de composés à docker sur la structure du récepteur étudié.

Le modèle de pharmacophore pour l’interface IL-15/IL-15R a été réalisé à partir de la

structure de l’IL-15 extraite de la structure cristallographique du complexe IL-15/IL-
15R (PDB 2Z3Q, seule structure disponible à l’époque du criblage) et grâce au logiciel

196 A. M. Ring et al. Nat. Immunol. 2012, 13, 1187-1195

43
Discovery Studio (DS) (Dassault Systèmes). En l’absence de ligand connu, il a été construit
sur la base des résidus Asp8, Asn65, et Leu69 de l'IL-15 connus pour être impliqués dans
l’interaction avec la chaîne IL-2R, en rassemblant des propriétés de projection de donneur
ou d’accepteur de liaisons hydrogène et une propriété hydrophobe (Figure 11).197-198

Figure 11 : Modèle de pharmacophore utilisé pour filtrer les banques de composés chimiques. Le
pharmacophore a été construit sur la base des propriétés des résidus Asp8 (D8), Asn65 (N65) et Leu69
(L69) de l’IL-15 au niveau de l’interface avec la chaîne réceptrice IL-2R. Projection de donneur de liaison
hydrogène (HBD, sphères roses), projection de donneur ou accepteur de liaison hydrogène (HBDA,
sphère violette), propriété hydrophobe (HY, sphère bleue). Les sphères grises représentent des sphères
d'exclusion (Extrait de A. Quéméner et al. 193).

I-3. Criblage virtuel de banque de molécules

Le modèle de pharmacophore (Figure 11) a été utilisé pour filtrer virtuellement un peu
plus de 160 000 molécules issues de banques de composés chimiques commerciales
(Chembridge, Maybridge et Preswick.) ou académiques (Chimiothèque Nationale et NCI
(National Cancer Institute)). Les composés respectant les propriétés du modèle ont été
sélectionnés pour l’étape suivante de docking.

I-4. Docking et Scoring des molécules criblées

Le programme LigandFit 199 sous DS a ensuite été utilisé pour réaliser le docking de la
banque de composés filtrée sur le site de l’IL-15, dans un site centré sur les résidus Asp8,
Asn65 et Leu69. Les poses générées ont ensuite été triées et rangées en utilisant 5 fonctions
de score implémentées sous DS. Les composés les mieux classés à la fois pour les 5

197
D. K. Pettit et al. J. Biol. Chem. 1997, 272, 2312-2318
198 J. Bernard et al. J. Biol. Chem. 2004, 279, 24313-24322
199 C. M. Venkatachalam et al. J. Mol. Graph. Model. 2003, 21, 289-307

44
fonctions de score (top 15 %, soit environ 240 composés accessibles commercialement)
ont été retenus et achetés pour être évalués in vitro (Figure 12).

Figure 12 : Les différentes étapes du criblage virtuel ayant conduit à la sélection d’un hit (Adapté de A.
Quéméner et al. 193).

I-5. Sélection du Hit

Les premières évaluations biologiques in vitro réalisées sur les 240 molécules achetées ont
permis d’identifier grâce aux technologies de résonnance plasmonique de surface (SPR) et
de fluorescence homogène en temps résolu (HTRF), 36 composés (15 %) capables de se
lier à l’IL-15 et/ou d’inhiber l’interaction de l’IL-15 avec la chaîne réceptrice IL-2R
recombinante. De plus, la majeure partie de ces composés a montré un effet inhibiteur sur
un test fonctionnel cellulaire mesurant la prolifération cellulaire de cellules 32D
(exprimant le récepteur IL-2R/γc) dépendante de l’IL-15. Parmi eux, 5 ont donné des
valeurs d’IC 50 autour ou inférieures à 10µM. L’un d’entre eux a été sélectionné pour une
optimisation chimique (Figure 12). D’après son mode d’interaction sur l’IL-15 prédit par
des techniques de docking utilisant les programmes LigantFit et C-Docker (Figure 13), le
composé établirait des interactions hydrophobes -alkyle avec les résidus Ile68 et Leu69,
un « stacking » -amide avec les résidus Ser7 et Asp8 et une liaison hydrogène (carbone)
avec l’Asn65.

45
Figure 13 : Mode d’interaction prédit du hit sélectionné sur la structure de l’IL-15
(Adapté de A. Quéméner et al. 193).

A partir de ce hit, des optimisations chimiques ont été réalisées et ont abouti à la synthèse
d’une centaine de composés dont les meilleurs ont montré des valeurs d’IC 50 proches du
micromolaire et de la cinquantaine de nanomolaire respectivement sur les tests de
prolifération cellulaire et de phosphorylation de STAT5, un facteur de transcription lié aux
systèmes IL-15 et IL-2.193

46
II – Synthèse de la première série de composés IBI

I-1. Stratégie de rétrosynthèse de la molécule Hit 1

Les travaux ont débuté par la mise au point de la stratégie de synthèse pour accéder à la
molécule 1 (P1G9) identifiée suite aux analyses in silico et in vitro. Cette stratégie a été
envisagée comme représentée ci-dessous et nécessitera 3 fragments clés : une plateforme
mercapto-triazole 2, un dérivé d’halogénure d’acide acétique (bras espaceur) et la 2,4-
dichloroaniline (résidu amide) (Figure 14).

Figure 14 : Schéma de rétrosynthèse de la molécule 1 à partir des 3 fragments : la plateforme

mercaptotriazole 2, un dérivé d’halogénure d’acide acétique et la 2,4-dichloroaniline.

47
I-2. Synthèse de la plateforme mercapto-triazole

La première étape consiste à préparer la lactone 3-(E) par une oléfination de l’anhydride
phtalique via une réaction de Wittig, avec le (triphénylphosphoranylidène)acétate d’éthyle
(Schéma 1).200 Cet ylure stabilisé commercial est très largement utilisé pour obtenir des
esters ,-insaturés à partir de carbonyle de type cétone, aldéhyde ou même lactone. Les
deux isomères 3-(E)/3-(Z) ont été obtenus avec un rapport de 9:1. Cette réaction a pu
être menée à bien sur une échelle de l’ordre de la cinquantaine de millimoles.

Schéma 1 : Synthèse de la lactone (E) par réaction de Wittig. Condensation du

(triphénylphosphoranylidène)acétate d’éthyle sur l’anhydride phtalique.

La fonction lactone du substrat 3-(E) est convertie dans premier temps en dérivé
phtalazinone par ajout de la méthylhydrazine. Puis, sans isoler l’intermédiaire 4 formé,
l’ajout d’hydrazine monohydratée au mélange réactionnel permet d’obtenir la molécule
souhaitée 5.201 Ces 2 étapes réalisées en « one-pot » dans l’éthanol ont permis d’obtenir un
excellent rendement de 97 % (Schéma 2).

Schéma 2 : Synthèse du composé 5 par condensation de la méthylhydrazine sur la lactone puis par
réaction de transamidification via l’hydrate d’hydrazine.

200 C. R. Johnson et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, 23, 1004-1007
201 A. M. Sridhara et al. Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 4983-4989

48
La phtalazinone 5 est ensuite additionnée sur l’isothiocyanate de méthyle (Schéma 3) afin
de former dans un premier temps l’intermédiaire thiosemicarbazide 6 non isolé. Dans un
second temps, la cyclisation spontanée en milieu basique de l’intermédiaire 6 génère le
cycle 1,2,4-triazole202 attendu. Une simple filtration permet d’isoler le produit final 2
insoluble dans l’éthanol.

Schéma 3 : Synthèse du mercaptotriazole 2. Condensation de l’isothiocyanate de méthyle sur

l’hydrazide puis cyclisation de l’intermédiaire thiosemicarbazide 6.

Ainsi, la synthèse de la plateforme mercaptotriazole 2 a pu être réalisée en 4 étapes avec

un rendement global de 86 %. La montée en échelle s'est avérée facilement réalisable
(plusieurs grammes synthétisés) et le produit 2 reste très stable à température ambiante et
à l'air.

I-3. Synthèse du linker

Dans premier temps, il a été envisagé d'alkyler la fonction thiol du mercaptotriazole 2 avec
l’acide bromoacétique selon les conditions classiques décrites dans la littérature,203 pour
réaliser dans un second temps le couplage peptidique entre la 2,4-dichloroaniline et l'acide
7 obtenu (60 %). Néanmoins, les nombreux essais de couplage peptidique ont été par la
suite décevants (Schéma 4). C’est pourquoi la stratégie consistant à préparer
préalablement le bromoamide (partie EST) puis à alkyler le mercapto triazole obtenu
(partie OUEST) a été préférée.

202 U. Salgin-Gökşen et al. Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 5738-5751

203 M. De La Rosa et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 4444-4449

49
 Schéma 4 : Première séquence de synthèse envisagée
Conditions (a) 1-adamantylamine, DCC (2 eq.) DMAP, 24 h, TA, 0 % de conversion ; 1-adamantylamine, MsCl, N-
méthylimidazole, DCM, 17 h, reflux, 0 % de conversion ; (b) 2,4-dichloroaniline, EDCl, DMAP (0,1 éq.), THF/DMF, 17
h, TA, 0 % de conversion ; 2,4-dichloroaniline, MsCl, N-méthylimidazole, DCM, 17 h, reflux, rendement < 10 % (RMN
1H).

La synthèse du linker commence par l'acylation de la 2,4-dichloroaniline avec le chlorure

d’acide sélectionné. L'acide 2-bromoacétique est d'abord activé sous forme de chlorure
d'acyle dans les conditions classiques, en présence d'un léger excès de chlorure d'oxalyle,
de DMF en quantité catalytique dans le DCM, à température ambiante (Schéma 5).
Ensuite, après évaporation de l’excès de chlorure d'oxalyle, 1,1 équivalent de 2,4-
dichloroaniline en solution dans le DCM est ajouté en présence de 1,2 équivalent de
triéthylamine comme base pour générer l'amide bromé 9 souhaité avec un rendement de
70 %.

Schéma 5 : Acylation de la 2,4-dichloroaniline en one-pot à partir de l’acide 2-bromoacétique.

Grâce à cette voie d'acylation, plusieurs molécules analogues de 9 ont pu être synthétisées
à partir de différents hétérocycles aminés 193 (Tableau 1). Ces molécules ont ensuite été
engagées dans la réaction finale de S-alkylation selon les conditions de réaction de type
Williamson, comme décrit ci-après pour le Hit 1.

50
 Tableau 1 : Structure et rendements des analogues hétérocycles aminés de 9.

Goupe R Rdt (%)

93

85

66

57

70

58

I-4. Alkylation de la plateforme mercapto-triazole

La réaction de S-alkylation du précurseur mercaptotriazole 2 s'effectue dans des conditions

douces. Le partenaire électrophile bromé 9 est mis en réaction avec le thiol 2 en solution
dans le DMF en présence de carbonate de potassium en excès pendant 24 h à température
ambiante. Le produit attendu 1 est obtenu avec un rendement de 81 % après purification
sur gel de silice (Schéma 6).

51
 Schéma 6 : Réaction de S-alkylation du mercaptotriazole 2 avec l’amide bromé 9.

I-5. Modification du bras espaceur par élongation de chaîne

Au cours de ces travaux, l’effet de la longueur du bras espaceur et de la terminaison

amidique (R), sur l’activité inhibitrice potentielle des molécules a représenté les premiers
objectifs de pharmacomodulation (Figure 15). Il a ainsi été observé par la synthèse
d’analogues du composé 1 comportant la plus courte chaine (n = 1), que la modification
des résidus amidiques (Figure 15, R), n’améliorait pas les résultats biologiques de ces
composés (IC50 >> 30 M, inhibition de la prolifération des cellules 32D induite par
RLI) en comparaison avec la molécule Hit 1 (IC50 = 17,3 M).193

Dans un second temps, la variation de la longueur de la chaîne-espaceur est apparue comme

une modification structurale accessible chimiquement et susceptible d’influencer le
caractère inhibiteur des différentes molécules. Ainsi plusieurs nouvelles molécules ont été
préparées en modifiant la longueur de la chaine carbonée de 3 à 15 carbones avec des
rendements allant de 53 à 72 % (Schéma 7).

52
 Figure 15 : Structure des analogues du composé 1 avec variation de la longueur de chaîne.

Les résultats d’inhibition de la prolifération cellulaire (prolifération des cellules 32D

induite par RLI) ont permis de dresser la courbe (Figure 16) ci-dessous et de déterminer
la longueur de la chaîne-espaceur permettant d’optimiser l’activité, qui s’est avérée être
une chaine à 7 carbones.

Figure 16 : Evolution de l’IC50 (µM) des molécules testées sur l’effet inhibiteur de la prolifération de
cellules 32Dβ induite par le RLI, en fonction de la longueur de chaîne aliphatique.

Un nouveau composé lead 1d a ainsi été identifié correspondant à l’analogue de la molécule

1a avec 7 unités de groupement méthylénique introduit sur la chaine-espaceur et avec une
IC50 de 1,9 M sur le test de prolifération cellulaire. Toutefois les molécules 1c, 1e et 1f,
comportant 5, 10 ou 15 carbones sur l’espaceur ont aussi donné des résultats intéressants
avec des IC50 respectifs de 4.7 µM, 3.3 µM et 7,3 µM (Schéma 7).

53
 Schéma 7 : Structure des analogues du composé 1 avec variation de la longueur de chaîne.

I-6. Modification de la nature du bras espaceur

Lors des évaluations biologiques, des problèmes de solubilités ont été observés. En effet,
le caractère hydrophile de la molécule diminue au fur et à mesure que la longueur de chaîne
augmente. De fait, certains résultats biologiques ont pu être sous-estimés par précipitation
partielle de la molécule dans le milieu physiologique. Afin de tenter de s’affranchir de ce
problème, nous avons envisagé de remplacer la chaîne aliphatique par une chaîne oxygénée
(PEG) de longueur équivalente ou voisine pour deux molécules sélectionnées, les
molécules 1d (n = 7) et 1f (n = 15) (Schéma 8). La même stratégie de synthèse, a
conduit, en tenant compte des précurseurs commerciaux, à deux synthons pégylés 12 et
14, pour la synthèse des nouveaux analogues oxygénés 11 et 13 (Schéma 8).

54
Schéma 8 : Identification des deux synthons pégylés 12 et 14, pour la synthèse d’analogues du composé
1.

J’ai ainsi débuté la synthèse du dérivé d’acide pégylé 12 par l’oxydation du 2-(2-
chloroéthoxy)éthoxy)éthanol commercial dans des conditions d’oxydation de Jones (CrO3,
5,7 éq.) en solution dans l’acide sulfurique 1,5 M dans l’acétone à 0 °C jusqu’à température
ambiante204 (Schéma 9). Pour cette réaction Tomlinson et son équipe rapporte un
rendement voisin de 90 % sur une échelle de 10 millimoles. Le faible rendement de 46 %
obtenu dans notre cas s’explique par des difficultés rencontrées au cours de la phase de
purification de la réaction mais il nous a été toutefois permis d’isoler une quantité d’acide
15 suffisante pour poursuivre la synthèse sans devoir optimiser cette étape d’oxydation.

204 I. D. Tomlinson et al. Tetrahedron 2003, 59, 8035-8047

55
Schéma 9 : Oxydation du 2-2-(2-chloroéthoxy)éthoxy)éthanol selon les conditions classiques de Jones.

L’acide 15 obtenu est ensuite activé in situ en présence de 2 équivalents de chlorure

d’oxalyle dans le DCM, puis mis en réaction avec la 2,4-dichloroaniline selon les conditions
classiques décrites précédemment pour obtenir l’agent alkylant 12a avec un rendement de
49 % (Schéma 10).

Schéma 10 : Réaction de N-acylation de la 2,4-dichloronaline à partir de l’acide chloré 15.

Pour finir, le composé ciblé 11 a été obtenu par S-alkylation du mercaptotriazole 2 en

présence de 1,2 équivalent de l’agent alkylant 12a et un léger excès de carbonate de
potassium (1,5 éq.) en solution dans le DMF pendant 2 jours à température ambiante
(Schéma 11).

Schéma 11 : Synthèse du composé 11 par réaction de S-alkylation avec le partenaire chloré 12a.

56
Insatisfait du rendement de 20 %, nous avons souhaité l’améliorer en cherchant à
augmenter la réactivité du partenaire électrophile par substitution du chlore par un atome
d’iode. La réaction d’échange d’halogène Cl-I a donc été réalisée selon les conditions de
Finkelstein. En effet, celui-ci décrit dans son article de 1910205 l’obtention des dérivés iodés
avec de bons rendements lorsqu’il soumet les dérivés chlorés et bromés correspondants à
reflux dans une solution d’acétone contenant 15 % en masse de NaI. En s’inspirant de ces
conditions et en mettant le composé chloré 12a en présence d’un excès de NaI (5 éq.) à
reflux dans l’acétone, le composé iodé souhaité 12b est isolé de façon quantitative en
s’affranchissant d’une étape de purification (Schéma 12). En effet, le traitement nous
permet de récupérer le produit final propre après une simple évaporation de l’acétone,
puis ajout du DCM pour solubiliser le seul produit 12b (les sels de NaCl et de NaI étant
insolubles). Ce dernier est ensuite récupéré pur par simple filtration et évaporation du
solvant.

Schéma 12 : Synthèse du dérivé iodé 12b à partir du dérivé chloré 12a par réaction d’échange halogène
selon les conditions de Finkelstein.

A partir de l’agent alkylant 12b, les conditions classiques de la dernière réaction de S-

alkylation conduisent à la molécule cible 11 avec un rendement de 94 % (Schéma 13).

Schéma 13 : Synthèse du composé 11 par réaction de S-alkylation avec le partenaire iodé 12b.

205 H. Finkelstein, Darstellung organischer jodide aus den entsprechenden bromiden und chloride, 1910

57
Pour l’obtention de l’analogue pégylé 13, la synthèse du fragment chloro acide 14 (GP =
Cl) a été réalisée à partir du diol pégylé commercial, le 3,6,9,12-tétraoxatétradécane-
1,14-diol (Schéma 14). Néanmoins, en comparaison avec la monohalogénation qui
nécessitera plusieurs étapes de protections et déprotections, nous avons choisi une réaction
de monostosylation en s’appuyant sur les travaux de A. Bouzide et G. Sauvé.206,207 Ainsi à
partir de chlorure de tosyle (1 éq.), d’oxyde d’argent (1,5 éq.) et de l’iodure de potassium
en quantité catalytique en solution dans le DCM à 0 °C, le dérivé mono tosylé 16, est
obtenu avec un rendement de 66 % (Schéma 14).

Schéma 14 : Réaction de monotosylation du 3,6,9,12-tétraoxatétradécane-1,14-diol.

Cette réaction de monotosylation de diols symétriques peut s’expliquer par la formation

d’une liaison hydrogène intramoléculaire entre les deux fonctions alcools (Schéma 14).208
L’hydrogène Hb plus acide sera alors déprotoné par l’oxyde d’argent, pour réagir
rapidement avec le chlorure de tosyle. Cette réaction sera d’autant plus efficace avec des
oligo éthylène glycols du fait de la chélation du cation Ag + par les oxygènes de la chaine
PEG, renforçant ainsi la formation de la liaison hydrogène entre les deux fonctions
hydroxyles terminales (Figure 17).

Figure 17 : Conformation des diols symétriques (a) et d’éthylène glycol en présence

d’un cation Ag + (b)

206
A. Bouzide et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 5945-5948
207 A. Bouzide A et al. Org. Lett. 2002, 4, 2329-2332
208 W. K. Busfield et al. Spectrochim. Acta. 1973, 296, 1259-1264

58
Dans les conditions d’oxydation de Jones, l’alcool 16 est oxydé et purifié pour donner
l’acide correspondant 14a avec 88 % de rendement (Schéma 15).

Schéma 15 : Réaction d’oxydation de l’alcool 16 selon les conditions de Jones.

De la même façon que pour l’analogue 12a, la 2,4-dichloroaniline a été acylée par le
composé 14a activé sous forme de chlorure d’acyle par le chlorure d’oxalyle. Le composé
17 a ainsi été obtenu après purification avec un rendement de 52 % (Schéma 16).

Schéma 16 : Réaction de N-acylation de la 2,4-dichloronaline par l’acide tosylé 14a.

En engageant l’agent alkylant 17 dans la réaction de substitution nucléophile avec le

mercaptotriazole 2, le produit attendu 13 n’est formé qu’avec seulement 8 % de
rendement (Schéma 17). Etonnamment, l’intermédiaire tosylé 14a n’est finalement pas
assez réactif pour obtenir un rendement convenable dans les conditions utilisées [2 (1 éq.),
17 (1,1 éq.), K2CO3 (1,5 éq.) à température ambiante dans le DMF]. Ce rendement étant
trop peu satisfaisant, nous avons aussi envisagé de substituer le groupement tosyle par un
atome d’iode.

59
 Schéma 17 : Synthèse du composé 13 par réaction de S-alkylation avec le partenaire tosylé 14a.

En reprenant les conditions précédemment utilisées pour l’intermédiaire 12a, le tosylate

14a est mis en réaction dans l’acétone à reflux en présence d’un excès de NaI. L’analogue
iodé 14b attendu est obtenu pur par simple filtration, avec un rendement quantitatif
(Schéma 18).

Schéma 18 : Synthèse du dérivé iodé 14b à partir du dérivé tosylé 14a.

Finalement, la réaction de substitution nucléophile du dérivé iodé 14b avec le

mercaptotriazole 2 dans les conditions de type Williamson, fournit le composé 14a avec
un rendement légèrement amélioré de 38 % (Schéma 19). Les résultats biologiques
obtenus n’ayant pas montré de meilleurs résultats, nous n’avons pas cherché à optimiser ce
rendement.

60
 Schéma 19 : Synthèse du composé 13 par réaction de S-alkylation avec le partenaire iodé 14b.

I-7. Bilan de la première étude SAR

Les premiers travaux de pharmacomodulation de la molécule Hit 1 ont concerné la partie
Est de cette molécule, en introduisant des modifications chimiques sur la chaine-espaceur
et/ou sur la partie amidique terminale. Une première série de molécules inhibitrices du
système IL-15 a été identifiée avec des IC 50 de l’ordre du nanomolaire (test activité p-
STAT5) mais malheureusement sans sélectivité pour l’IL-15 versus IL-21 (Figure 10).

Figure 18 : Structures des molécules IBI-03, IBI-15, IBI-50, IBI-74, IBI-55, IBI-110, IBI-111,
leurs IC50 respectifs (p-STAT5 et biologiques) obtenus.

61
III – Synthèse de nouveaux analogues IBI
III-1. Identification d'une zone hydrophile par docking

Sur la base de notre premier modèle de pharmacophore impliquant les résidus Asp8,
Asn65, et Leu69 (Figure 11), nous nous sommes proposés de chercher à optimiser
l’affinité, voire la sélectivité, en ciblant des interactions complémentaires sur les zones
lipophiles au voisinage des hétérocycles phtalazinone et triazole. Ayant identifié des zones
hydrophiles au voisinage de ces hétérocycles (Figure 19 A, zones bleues), avec des
interactions potentielles avec des résidus comme les asparagines (N) ou aspartate (D)
(Figure 19 B), nous avons envisagé d’introduire des substituants avec des fonctions
polaires sur les positions N-Me de ces deux systèmes hétérocycliques. Ainsi deux nouvelles
séries d'analogues du hit 1a, comportant une chaine à un carbone et de son analogue avec
un lien à 7 carbones (1d) ont été ciblées : dérivés du triazole N-substitué et de phtalazinone
(Figure 20).

Figure 19 : Mode d’action de notre hit IBI-03 : A) Surface de Connolly de l’IL-15 basée sur l’index
d’hydrophobicité des résidus amino acides (hydrophobe en marron et hydrophile en bleu), et illustrant
le mode d’action du hit IB-I03. B) Représentation du mode d’action de IBI-03 en interaction avec les
résidus amino acides, notamment ceux proches due cycles triazole et phtalazinone (liaisons : pointillées
vertes = liaison H ; liaison pleine verte = liaison C-H ; lignes roses = interactions hydrophobes).

62
 Figure 20 : Pharmacomodulations introduites alternativement sur le N-Me triazole ou le N-Me
phtalazinone du hit 1a (Série 1) et le lead 1d (Série 2).

III-2. Modifications des motifs « N -triazole » et « N -phtalazinone » sur la molécule 1

(chaîne à 1 carbone)

Pour accéder à la première série d'analogues du composé 1a, comportant des substituants
hydrophiles sur le N1 du triazole, nous avons choisi de condenser le dihydro-phtalazinone
hydrazide 2 avec l’isothiocyanate 18 portant une fonction aldéhyde masquée sous la forme
d’un diéthylacétal. Ce dernier a été synthétisé à partir de la 3,3-diéthoxypropane-1-amine
(Schéma 20). Ainsi, dans les mêmes conditions que décrites précédemment, 5 équivalents
de l'isothiocyanate 18 ont été condensés avec l'hydrazide 2 en présence de 5 équivalents de
triéthylamine dans l’éthanol à reflux pendant deux heures pour donner le dérivé N-
substitué 19 avec 80 % de rendement.

63
 Schéma 20 : Synthèse du composé 19.

Par la suite, un équivalent de l’agent alkylant 9 a été mis en réaction avec le composé 19
en présence de bicarbonate de potassium en excès (2 éq.) dans le DMF pour conduire au
produit 20 avec 96 % de rendement (Schéma 21).

Schéma 21 : Synthèse du composé 20.

64
Cet intermédiaire clé 20 nous conduira à l’aldéhyde 21 par déprotection de la fonction
acétal, puis successivement à l’alcool 22 par réduction de l’aldéhyde, ou à l’acide 23 par
oxydation (Schéma 22). Ainsi, le composé 21 a été obtenu par hydrolyse acide du
composé 20 dans un mélange 50:50 de THF/HCl (1 M), à 40 °C pour fournir l’aldéhyde
souhaité avec 71 % de rendement (Schéma 22).
L’alcool 22 est ensuite obtenu avec 67 % de rendement par réduction de l’aldéhyde 21
correspondant en présence de 0,5 équivalent de NaBH4 dans l’éthanol pendant une heure
à 0 °C. L’acide 23, quant à lui, est formé par oxydation de l’aldéhyde 21 selon les
conditions de type Dalcanale. 209 Ce dernier a ainsi pu être isolé avec 60 % de rendement
(Schéma 22).

Schéma 22 : Synthèse des composés 21, 22 et 23 à partir de l’intermédiaire commun 20.

209 E. Dalcanale et al. J. Org. Chem. 1986, 51, 567-569

65
Au bilan, cette stratégie nous a permis d’accéder aux trois composés souhaités 21, 22 et
23, à partir du précurseur acétal 20. Une approche similaire a été mise en place pour
accéder à la série d'analogues du composé 1 N-substitués sur la phtalazinone. Le précurseur
N-H-phtalazinone 24 a alors été synthétisé à partir de l’ester conjugué 3-(E) par addition
d’un équivalent d’hydrazine monohydrate pendant 3 heures dans l’éthanol à reflux, pour
donner le dérivé N-H-phtalazinone 24 avec un rendement de 90 % (Schéma 23)

Schéma 23 : Synthèse de l’intermédiaire phtalazinone-NH 24.

Le bromo acétal commercial 2-(2-bromoéthyl)-1,3-dioxolane a été choisi comme agent

alkylant pour accéder au composé 25, comportant ainsi une fonction aldéhyde masquée.
La N-alkylation de la phtalazinone 24 a été réalisée en introduisant 1,5 équivalent de ce
réactif bromé dans le DMF en présence de 2 équivalents de carbonate de potassium comme
base pendant 4 heures à 60 °C. Après purification sur une colonne de gel de silice, l’acétal
désiré 25 a été obtenu avec 75 % de rendement (Schéma 24).

Schéma 24 : Synthèse du composé 25 par N-alkylation.

Comme décrit précédemment, la formation du cycle mercaptotriazole s’effectue à partir

du composé 25 en 2 étapes (Schéma 25). Dans un premier temps, l’addition d’un excès
d’hydrate d’hydrazine à reflux dans l’éthanol pendant 4 heures conduit à l’hydrazide
intermédiaire qui est ensuite engagé dans la réaction de condensation-cyclisation avec 5
équivalents du méthyl isothiocyanate commercial en présence de 1,5 équivalent de
triéthylamine dans l’éthanol à reflux, pour former le dérivé triazole-phtalazinone souhaité.

66
Le produit 26 est finalement obtenu avec 80 % de rendement sur les 2 étapes en purifiant
par simples filtration (Schéma 25).

Schéma 25 : Synthèse du composé 26 en 2 étapes.

Le composé 27 a alors accessible par alkylation du thiol 26 selon les conditions de

Williamson en présence de 1,1 équivalent de l’intermédiaire 9 et 1,5 équivalent de
carbonate de potassium dans le DMF pendant 2 heures à température ambiante (Schéma
26). L’acétal 27 est isolé avec 89 % de rendement après purification sur gel de silice.

Schéma 26 : Synthèse du composé 27 par S-alkylation.

C’est à partir de cet intermédiaire clé 27 que nous avons pu obtenir les dérivés aldéhyde
28, alcool 29, acide carboxylique 30 et N,N-diméthylaminopropyle 31 correspondants
(Schéma 27).
Ainsi, le composé 27 devait être déprotégé en milieu acide pour obtenir l’aldéhyde 28.
Néanmoins, en reprenant les conditions précédentes d’hydrolyse avec HCl (1 M)/THF à
60 °C, le composé se dégrade. C’est dans des conditions plus douces, en utilisant l’acide

67
para-toluène sulfonique en quantité sub-catalytique (0,5 éq.)210,211 en solution dans un
mélange acétone/eau 90:10 pendant une nuit à 60 °C, que l’aldéhyde 28 est obtenu avec
un rendement de 81 % après purification. A partir de cet aldéhyde 28, les analogues ciblés,
l’alcool 29 et l’acide carboxylique 30, ont été préparés dans les mêmes conditions de
réduction et d'oxydation que celles décrites précédemment pour les analogues triazolyle
N-substitués, avec respectivement 80 et 85 % de rendement (Schéma 27). Ici nous avons
également préparé l’analogue N-N’-diméthylaminopropyl 31 en mettant en œuvre une
réaction d’amination réductrice en présence de diméthylamine et de
triacétoxyborohydrure de sodium. Le composé 31 a ainsi été isolé avec un rendement
moyen de 33 %, non optimisé.

210 G. Coste et al. Tetrahedron Lett. 2006, 47, 671–674

211 D. Enders et al. Chem. Eur. J. 2008, 14, 2842-2849

68
Schéma 27 : Synthèse des composés 28, 29, 30 et 31 à partir de l’intermédiaire commun 27.

69
III-3. Modifications des motifs « N -triazole » et « N -phtalazinone » sur la molécule 1
(chaîne à 7 carbones)

A partir des intermédiaires 19 et 26 les acétals 33 et 34, précurseurs d’analogues de la

molécule lead 1d, ont été préparés efficacement par thioalkylation avec l’agent alkylant 32,
avec des rendements respectifs de 75 et 70 %. (Schéma 28).

Schéma 28 : Synthèse des composés 32, 33 et 34.

70
Après plusieurs tentatives pour hydrolyser l’acétal 33 en aldéhyde 35 correspondant (HCl
1 M/acétone à 40 °C ou à TA), seul un essai avec un rendement modéré de 59 % a permis
d’obtenir suffisamment de produit pour le caractériser et le tester en biologie (Schéma
29). On notera aussi qu’au cours de la réaction, le composé 38 issu de la réaction secondaire
de rétro-Michael à partir du produit final 35 s’est formé en quantité non négligeable
(Schéma 30).
Dans les conditions acides utilisées, la réaction de rétro-Michael est donc compétitive. En
effet, l’élimination de l’acroléine représente la force motrice de cette réaction.
Parallèlement, les quelques essais d’hydrolyse de l’acétal 34 ont conduit au produit attendu
39 mais en présence de plusieurs produits secondaires non caractérisés (Schéma 29). Ces
difficultés semblent aussi liées à la longue chaîne carbonée qui diminue fortement la
solubilité de nos produits dans le milieu réactionnel et par conséquent leur taux de
réactivité. Il est également à noter que la purification des réactions s’est avérée
particulièrement difficile à cause des faibles différences entre les rapports frontaux des
composés à séparer.

Schéma 29 : Synthèse du composé 33 par acylation de la 2,4-dichloroaniline par l’acide 8-bromo

octanoïque.

71
Face à ces difficultés nous avons choisi une alternative pour accéder aux analogues de 1b
ciblés, en évitant les réactions dans des conditions trop acides. Nous avons donc préféré
introduire une fonction alcool protégée sur le fragment porté par les azotes du triazole ou
de la phtalazinone (Figure 21), afin de mettre en œuvre des réactions d’oxydation pour
générer les aldéhydes ou acides carboxyliques souhaités. Ces substituants seront introduits
à partir du l’hydrazide 2 pour les dérivés substitués sur le N-triazole et de l’ester 24 pour
les analogues N-substitués sur la phtalazinone.

Schéma 30 : Proposition de mécanisme réactionnel de la réaction de rétro-Michael aboutissant à la

formation du composé 38.

72
 Figure 21 : Structure des 2 nouveaux intermédiaires cibles 40 et 41, N-triazole et N-phtalazinone
substitués.

La synthèse du composé 40 nécessite au préalable la préparation de l’isothiocyanate 44.

Celle-ci est réalisée à partir du 3-aminopropanol commercial en 2 étapes (Schéma 31).
Dans un premier temps, la fonction alcool est protégée par un groupement tert-
butyldiméthylsilyle selon les conditions classiquement utilisées, c’est-à-dire par réaction
d’1 équivalent de chlorure de tert-butyldiméthylsile en présence de 1,5 équivalent de
triéthylamine dans le DCM pendant une nuit à température ambiante. Le produit 42 a pu
être isolé après purification par distillation sous pression réduite (point d’ébullition 65-70
°C à 3.5 mm Hg) avec 90 % de rendement. La fonction amine du produit obtenu 42 est
ensuite transformée en fonction isothiocyanate selon les conditions décrites dans la
littérature.212,213 Ce sont les conditions de Dolles qui nous ont permis de réaliser la synthèse
de manière la plus efficace.

Schéma 31 : Synthèse de l’isothiocyanate 44.

212 R. Wong et al. J. Org. Chem. 2007, 72, 3969-3971

213 D. Dolles et al. ChemMedChem 2016, 11, 1270-1283

73
Dans cette réaction, l’intermédiaire non isolé 43 est d’abord formé par addition d’un large
excès de disulfure de carbone (10 éq.) sur le composé 42 en présence de triéthylamine (1,5
éq. dans le THF à 0 °C) (Schéma 32). Ensuite, l’addition d’un équivalent de dicarbonate
de di-tert-butyle, ou d’un équivalent de chlorure de tosyle, sur l’intermédiaire 43 formé
génère un second intermédiaire (respectivement 45 ou 46) qui par réarrangement permet
la formation de la fonction isothiocyanate 44 (Schéma 32). Dans le cas de l’utilisation du
dicarbonate de di-tert-butyle, le produit récupéré ne nécessite pas de purification car les
produits secondaires sont gazeux ou volatils comme le tert-butanol, le dioxyde de carbone
et l’oxysulfure de carbone.

Schéma 32 : Comparaison entre l’utilisation du TsCl et du Boc 2O pour le mécanisme

d’isothiocyanation à partir de l’intermédiaire 43. (Afin de simplifier le schéma, le contre ion ammonium
n’est pas représenté).

L’utilisation de Boc2O à la place du chlorure de tosyle nous a permis de passer de 45 %

(après purification) à 85 % de rendement (sans purification). L’intermédiaire
mercaptotriazole 47 est ensuite formé par condensation puis cyclisation de l’isothiocyanate
44 (1,5 éq.) à partir de l’hydrazide 2, en présence d’un excès de triéthylamine (4,5 éq.)
pendant deux heures à reflux dans l’éthanol. 47 est ainsi isolé avec 78 % de rendement
après purification sur gel de silice. Finalement, la molécule cible 40 est obtenue avec 73 %
de rendement par thioalkylation du composé 47 avec 1,2 équivalent de l’agent alkylant 32
dans les conditions déjà validées [K2CO3 (2 éq.), DMF, 12 h, TA] (Schéma 33).

74
 Schéma 33 : Synthèse du composé 40.

Le traitement de l’alcool silylé 40 avec le réactif de Olah (solution de fluorure d’hydrogène

en solution à 70% en masse dans la pyridine) additionné en large excès dans le THF pendant
2 heures à température ambiante permet l’obtention de l’alcool 48 avec un bon rendement
de 88 %. L’étape suivante consiste à oxyder l’alcool en acide carboxylique et cette réaction
a été réalisée avec le DAIB (2,4 éq.) et du TEMPO en quantité catalytique (0,3 éq.) 214 dans
un mélange 1:1 DCM/H2O pendant 16 heures à température ambiante, pour donner
l’acide carboxylique 49 avec 66 % de rendement (Schéma 34).

214 T. M. Hansen et al. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 57–59

75
 Schéma 34 : Synthèse des composés 48 et 49.

Pour accéder à l’analogue de 1d, comportant cette fois une chaine N,N-diméthyl
aminopropyle sur le noyau triazole, une stratégie similaire a été engagée (Schéma 35).
Ainsi le réactif isothiocyanate 50 est préparé à partir de la N,N-diméthyl-1,3-
propanediamine commerciale, selon les conditions utilisées pour la synthèse du composé
44, avec un rendement de 85 %. L’ajout d’un équivalent de 50 sur l’hydrazide 2 en solution
dans l’éthanol pendant 30 heures à reflux permet alors d’obtenir le dérivé mercaptotriazole
51 avec 54 % de rendement. Ce dernier engagé avec 1,8 équivalent du bromo amide 32
dans la réaction de thioalkylation conduit à la molécule finale 52 avec 45 % de rendement
(Schéma 35).

Schéma 35 : Synthèse du composé 52.

76
Les analogues triazoles N-substitués 48, 49 et 52, ont ainsi pu être synthétisés à partir d’une
stratégie de synthèse alternative, nous permettant de contourner les problèmes de synthèse
rencontrés lors de la première approche via les intermédiaires acétals. C’est pourquoi pour
la construction des analogues phtalazinone N-substitués, une approche similaire a été
retenue, en fonctionnalisant prioritairement la phtalazinone, pour accéder à la molécule 41
et son analogue diméthylamine 59.
Pour ce faire, dans un premier temps, il a été nécessaire de préparer les agents alkylants 53
et 54, non commerciaux. Le 1-bromopropanol a donc été silylé en présence de 1,1
équivalent d’agent silylant et de 2 équivalents d’imidazole, dans le DMF, à température
ambiante pendant 24 h, 215 pour donner le composé silylé 52 avec un rendement de 69 %.
Parallèlement le 3-N,N-diméthylaminopropanol est mésylé par addition de 2 équivalents
de chlorure de mésyle sur le N-N-diméthylamino propanol pour donner le chlorhydrate 54
pur, après une simple filtration, avec 83 % de rendement (Schéma 36).

Schéma 36 : Synthèse des agents alkylants 53 et 54.

A partir de l’ester N-H-phtalazinone 24, la N-alkylation a été réalisée avec les agents
alkylants, silylé 53 ou mésylé 54, pour donner respectivement les molécules 55 et 57. De
manière surprenante, un essai d’alkylation de 24 avec le dérivé silylé 53, dans le DMF en
présence de 3 équivalents de carbonate de potassium, n’a pas fourni le composé 55
attendu.216 C’est l’utilisation d’hydrure de sodium (1,5 éq.) comme base, dans le DMF à
60 °C, qui nous a permis d’obtenir le composé 55 avec un rendement de 60 %.

215
S. E. Hampton et al. ChemMedChem 2011, 10, 1816-1831
216 Fourmaintraux E, et al. Heterocycl. Commun. 1999, 5 (3), 213–216

77
Dans des conditions similaires, le mésylate 54 conduit au composé 57 avec un rendement
de 75 % (Schéma 37).
Par la suite, les deux molécules 55 et 57 ont été soumises aux mêmes conditions de
formation de l'hétérocycle triazole par hydrazinolyse suivie d’une cyclisation en présence
d’isothiocyanate de méthyle, pour conduire aux intermédiaires 56 et 58 avec des
rendements respectifs de 76 % et 56 %. L’étape de thioalkylation avec le bromo amide 32
donne finalement les molécules cibles 41 et 59 avec des rendements respectifs de 52 et 47
% (Schéma 37).

Schéma 37 : Synthèse des composés 41 et 59.

La suite de la séquence réactionnelle à partir de l’intermédiaire 41 est similaire à celle

appliquée pour son analogue 40. L’alcool protégé 41 par un groupement silyle subit une
déprotection en présence d’un excès du mélange HF.pyridine en solution dans le THF pour
donner l’alcool primaire 60 de façon quasi-quantitative (98 %). La première étape
d’oxydation pour générer l’aldéhyde a été envisagée dans un premier temps selon une
réaction d’oxydation de Swern dans les conditions classiques [chlorure d’oxalyle (2 éq.),
DSMO (4 éq.) à -78 °C puis ajout de l’alcool avec de la triéthylamine]. Malheureusement,
malgré plusieurs tentatives, nous n’avons pas réussi à obtenir l’aldéhyde 61 souhaité.
Nous nous sommes donc tournés vers l’utilisation du réactif de Dess-Martin. L’évolution
de cette réaction a été suivie par RMN 1H. Dans un premier temps 1,6 équivalent de DMP
ont été mis à réagir à température ambiante avec l’alcool 60. Après 20 heures de réaction,
nous observons par RMN du proton l’apparition du singulet à 9,81 ppm correspondant au
proton aldéhydique avec toutefois seulement 38 % de conversion. Un équivalent

78
supplémentaire de DMP a été introduit et 4 et 6 heures d’agitation plus tard, la conversion
atteint 70 %. Un dernier ajout d’un équivalent de DMP et de quelques millilitres de
DMSO, afin d’augmenter la solubilité du mélange réactionnel, nous conduit après 18 h à
une conversion totale. Après purification sur gel de silice, l’aldéhyde 61 est isolé avec 74
% de rendement. Enfin, l’oxydation de l’aldéhyde 61 selon les conditions classiques de
type Dalcanale a permis d’obtenir l’acide carboxylique 62 correspondant avec 37 % de
rendement (Schéma 38).

Schéma 38 : Synthèse des composés 60, 61 et 62.

J’ai synthétisé les 5 molécules cibles 49, 52, 59, 61 et 62 dans les deux séries « N-triazole »
et « N-phtalazinone » avec une chaîne espaceur à 7 carbones selon une voie de synthèse
différente par rapport aux premiers analogues à 1 seul carbone. Pour le motif triazole, nous
avons dû préparer les 2 intermédiaires clés isothiocyanates 44 et 50 permettant
d’introduire directement les fonctions souhaitées sur l’hétérocycle. Quant au motif
phtalazinone, c’est la synthèse des 2 agents alkylants 53 et 54 qui a permis de remplir cet
objectif.

III-4. Introduction de la benzophénone comme « crosslinker »

Les évaluations biologiques nous ont permis de déterminer si nos molécules se fixent à l'IL -
15 (BiACORE) et si elles ont des effets inhibiteurs (p-STAT5). Néanmoins, ces tests ne
nous permettent pas de confirmer avec exactitude notre modèle d'interaction entre nos

79
molécules ligands et l'IL-15. Les études in-silico sur lesquelles sont fondées notre étude
représente bien évidemment un support important, mais actuellement aucun résultat
expérimental ne permet d’affirmer, sans ambiguïté, que nos molécules inter agissent
précisément avec les résidus de l'IL-15 comme la modélisation le suggère et pas au niveau
de la cascade enzymatique qui dépend de ce système biologique.

La détermination de la structure des complexes ligand/recepteur et des sites de

reconnaissance reste donc une information extrêmement importante pour l’optimisation
des composés dans le cas d’une étude de RSA et pour la compréhension du mécanisme
d’action de ces ligands potentiels. Pour cela les biologistes font appel à diverses méthodes
pour localiser les surfaces protéiques responsables de la cohésion des complexes.
La méthode absolue reste la résolution par diffraction des rayons X donnant une image en
trois dimensions du complexe formé. Cette technique peut s’avérer être aussi puissante
que complexe à mettre en œuvre puisqu’elle implique la production des complexes
cristallisés qui souvent se trouve être une étape limitante de l’étude tant les conditions de
cristallisation sont exclusives de chaque complexe étudié. La cristallisation de l'IL-15 nous
reste malheureusement encore inextensible, et de plus, aussi coûteuse qu’incertaine.

Des alternatives existent à l’heure actuelle pour apporter des preuves permettant la
localisation des sites d’interaction entre les différentes entités composant l es complexes
protéiques. Parmi elles, la résonnance magnétique nucléaire, la mutagénèse dirigée et le
marquage covalent couplé à la spectrométrie de masse. Cette dernière méthode a
particulièrement attiré notre attention. En effet, elle semble tout à fait adaptée pour l’étude
de la fixation de molécules de faibles poids moléculaires sur des macromolécules telles que
des protéines. 217,218,219 Le principe du marquage covalent reste, à première vue,
relativement simple: le ligand, marqué par une fonction photosensible, doit être reconnu
par la cible puis, le complexe est irradié à une longueur d’onde qui permettra sa
transformation en une espèce chimique réactive susceptible de former une liaison covalente
avec une fonction chimique présente dans son environnement proche. Dans le cas d’un
récepteur tel qu’une protéine, les résidus marqués pourront être identifiés après une
digestion enzymatique du complexe et une analyse par spectrométrie de masse des chaines
peptidiques relarguées (Figure 22).

217
E. L. Vodovozova, Biochemistry 2007, 1, 1-20
218 A. Sinz, Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 22, 6390-6396
219 A. Sinz, Mass. Spectrom. Rev. 2006, 4, 663-682

80
 Figure 22 : Représentation du processus de marquage par photoaffinité. (Adapté de J. Sumranjit et
al.220).

Plusieurs fonctions chimiques sont candidates pour intégrer ce procédé de marquage

covalent par activation photo-induite, entre autres les molécules comportant les fonctions
benzophénone221 arylazide et diazirine 219 (Figure 23).

Figure 23 : Unités photosréactives couramment utilisées.

220 J. Sumranjit et al. Molecules 2013, 9, 10425-10451

221 G. D. Prestwich et al. Photochem. Photobiol. 1997, 2, 222-234

81
Dans notre première étude, plusieurs molécules dérivées du lead 1d, ont montré une
activité prometteuse dans le test fonctionnel p-STAT5 (Tableau 2)193 et notamment les
composés comportant des résidus lipophiles (éthyle, propyle, tertio-butyle) et/ou une
fonction oxygénée acceptrice d’hydrogène. En s'appuyant sur les travaux de la
littérature222, le motif benzophénone nous a semblé un bon choix comme « cross-linker »,
mais nous l’avons aussi considéré comme un substitut potentiel des motifs 4 -
propoxyphényle, ou 3-éthoxycarbonyl-phényle, qui ont conduit aux composés les plus
actifs, pour générer une nouvelle série d’analogues (Tableau 2).

Tableau 2 : Résultats (IC50) d’Inhibition de p-STAT5 (cellules NK-92) avec IL-15 (50 nM).

Goupe R IC50 (nM)

153
(Molécule Référence)

57

55

40

222 A. Mattarei et al. Chem. Eur. J. 2017, 49, 11945-11954

82
La benzophénone possède l'avantage de se lier au squelette carboné de la protéine lorsque
la fonction est soumise à la longueur 308 nm, limitant les interactions non spécifiques. En
effet, l’excitation de la benzophénone de la molécule 62 pourrait transformer la double
liaison C=O du carbonyle en une espèce radicalaire intermédiaire A1 capable de se lier de
façon covalente au carbone  du résidu acide aminé le plus accessible pour former le
complexe B1 (Schéma 39).

Schéma 39. Mécanisme de formation de la liaison covalente entre la benzophénone et le squelette

carbonée de la protéine par irradiation UV à 308 nm. Adapté de (Inspiré des travaux de A. Mattarei et
al.222).

La 4-aminobenzophénone étant commerciale, notre stratégie de synthèse a pu être reprise

pour préparer la molécule ciblée (Figure 24).

Figure 24 : Schéma de rétrosynthèse de la molécule 63 à partir des 3 synthons : la plateforme

mercaptotriazole 2 (en orange), l’acide 8-bromo octanoïque (en bleu) et la 4-aminobenzophénone (en
vert).

83
Selon notre protocole, l’amide 64 a été synthétisé avec 74 % de rendement par N-acylation
de la 4-aminobenzophénone à l’aide de l’acide 8-bromo octanoïque activé in-situ sous
forme de chlorure d’acyle en présence de 2 équivalents de chlorure d’oxalyle (Schéma
40). Le dérivé bromé 64 a ensuite été engagé dans une réaction d’échange halogène brome-
iode au reflux dans l’acétone en présence d’un excès de NaI (2,3 éq.) pendant 1h30. Le
dérivé iodé 65 obtenu (de façon quantitative) est ensuite mis en réaction avec le
mercaptotriazole 2 pour l’étape finale de thioalkylation. Un léger excès du dérivé iodé 65
(1,2 éq.) en présence de carbonate de potassium (1,5 éq.) en solution dans le DMF pendant
12h à température ambiante a permis d’obtenir le composé souhaité 63 avec 92 % de
rendement après purification par chromatographie sur gel de silice.

Schéma 40 : Synthèse du composé 63.

Le composé 63 est obtenu à partir du mercaptotriazole 2 avec un rendement global de 68

% sur 3 étapes.

84
IV – Evaluations dans un contexte bio in vitro

Tous ces nouveaux composés ont été testés in vitro pour évaluer leur affinité (SPR), ou leur
activités (prolifération et p-STAT5).

Nous avons pu ainsi réaliser la modulation de différentes fonctions à partir du Hit IBI-03
de départ. Dans un premier temps l’allongement de la chaîne à 7 carbones, qui permis
d’améliorer l’activité inhibitrice d’un facteur 25 (4,5 µM à 0,19 µM). Ensuite la nature de
cette chaîne a été modifiée pour intégrer une chaîne pégylée ce qui a permis d’améliorer la
solubilité des composés lors des tests in vitro.

Figure 254bis : Récapitulatif des modulations chimiques sur la série IBI.

85
IV-1. Test SPR

Les expériences de SPR ont été conduites à 25°C à l’aide d’un T200 (GE Healthcare,
Chalfont St Giles, UK). L’IL-15 recombinante, l’IL-2 ou le RLI (un super agoniste de l’IL-
15)177, sont liés de façon covalente à une puce support CM5 en utilisant la méthode de
couplage aux amines en accord avec les recommandations du fournisseur, et la fixation des
composés à 100 μM ou à des doses croissantes est évaluée. L’analyse des sensorgrammes
est réalisée à l’aide du logiciel BIAeval.

Figure 26 : Fonctionnement de la technologie Surface Plasmonic Resonance (SPR) et représentation

d’un sensorgramme. (Illustration extraite du lien www.reactionbiology.com/services/biophysical-
assays/surface-plasmon-resonance-spr)

86
IV-2. Test de la prolifération cellulaire

La prolifération des cellules 32Dβ induite par le RLI a été évaluée en utilisant le
test de réduction du bleu Alamar (AbDSerotec). Après 4 h de culture dans le milieu de
culture sans cytokine, les cellules (1x10 4) ont été cultivées pendant 65 heures dans le milieu
supplémenté avec 100 pM de RLI ou 1.5 nM d'IL-2, préalablement préincubées pendant
30 min avec des concentrations fixes ou croissantes de composés, ou le véhicule (milieu de
culture, DMSO 0,1 %, concentration finale). Du bleu d'Alamar (10 μL) a été ajouté dans
chaque puits, et après une période d'incubation d’environ 6 h à 37 °C, la fluorescence émise
à 590 nm sous excitation à 560 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de plaques multimode
EnSpire (Perkin Elmer). Les composés ont été testés en triplicats dans au moins trois
expériences indépendantes.

Figure 27 : Mécanisme de fluorescence par réduction de la Résazurine en Résorufine. Réaction

biochimique intracellulaire, s’effectuant au sein des mitochondries.

87
IV-3. Test de la phosphorylation de STAT5

Les cellules NK-92 ont été lavées et privées de cytokine pendant la nuit pour
réduire la phosphorylation basale. Les cellules (2x10 5) ont ensuite été stimulées à 37 ◦C
pendant 1 heure avec des concentrations fixes d'IL-15 ou d'IL-2 qui ont été préincubées
pendant 30 min. avec des concentrations croissantes de composés chimiques. À la fin de la
stimulation, les cellules ont été lysées et la phosphorylation de STAT5 a été mesurée
conformément aux instructions du fabricant en utilisant le kit p-STAT5 AlphaScreen
Surefire (Perkin Elmer Life Sciences). Le signal dans les puits a ensuite été détecté à l'aide
d'un lecteur de plaques multimode EnSpire Multimode Plate Reader (Perkin Elmer).

Figure 28 : Fonctionnement de la technologie AlphaLISA : Un anticorps biotinylé dirigé contre l'analyte

se lie aux billes donneuses revêtues de streptavidine. Un second anticorps dirigé contre l'analyte est
directement conjugué aux billes acceptrices. En présence de l'analyte, les deux billes se rapprochent.
L'excitation des billes donneuses à 680 nm génère des molécules d'oxygène singulet déclenchant une
série de réactions chimiques dans les billes acceptrices, ce qui se traduit par un pic d'émission de lumière
à 615 nm détectées et lues par l’instrument EnSpire Multimode Plate Reader. (Illustration extraite du
lien www.resources.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/man_alsu-pst5-a-hv)

IV-4. Résultats de l’étude SAR

Dans notre première approche, nous avons identifié les premiers inhibiteurs de l’IL-15 de
faible poids moléculaire, grâce à une étude de pharmacomodulation axée sur la partie
amidique terminale de notre hit 1a et de la longueur de la chaîne qui la relie au noyau
principal triazolo-phtalazinone. Plusieurs nouveaux composés avec des valeurs IC 50
comprises entre 50 et 150 nM dans des expériences cellulaires (p-STAT5), ont été
identifiés (Figure 28). Parmi ces composés, l’analogue 1d (n = 7) est apparu comme le
premier candidat inhibiteur prometteur. Néanmoins, aucun de ces inhibiteurs n’a révélé
de sélectivité pour l'IL-15, affichant la même activité inhibitrice sur la protéine IL-2
(Figure 28, molécules 1a, 1d, 1f, IBI-50 et IBI-74).
88
 IV-4.1. Résultats avec les nouvelles molécules complémentaires 11, 13 et
63, de la première famille IBI

Une partie de mon travail a consisté à compléter cette première famille de molécules
triazolo phtalazinone avec des composés comportant un lien polyoxygéné (PEG) (Schéma
8, composés 11 et 13) ou une partie amidique terminale benzophénone photosensible
(Schéma 40, composé 63)

Figure 29 : Structures des molécules IBI-03, IBI-15, IBI-50 et IBI-74 et leurs IC50 (prolifération
cellulaire et p-STAT5) respectifs ainsi que les résultats biologiques obtenus avec les analogues 11, 13 et
63.
89
Les résultats biologiques obtenus montrent une amélioration notable de la solubilité en
milieu biologique pour les composés oxygénés 11 (IBI-110) et 13 (IBI-111). Concernant
les résultats fonctionnels sur la prolifération cellulaire et p-STAT5, le remplacement de la
chaine carbonée par une chaine PEG n'apporte pas d'amélioration en termes d'IC 50 pour
une longueur de chaine de 7 carbones (IBI-110 vs IBI-15) mais permet en revanche de
récupérer une efficacité des composés pour une chaine plus longue (n=15, IBI-111 vs
IBI-55).
Concernant la molécule IBI-113 comportant un fragment benzophénone photosensible et
développé pour des études de cross-linking, nous obtenons de très bonnes valeurs d'IC 50
dans le test p-STAT5, de 50 et 80 nM respectivement pour IL-15 et IL-2. Cette molécule,
comme les molécules IBI-50 et IBI-74, reste parmi la plus active dans cette famille IBI.
De plus le résultat du test SPR montre bien que la molécule IBI-113 se lie efficacement
sur la protéine IL-15, avec une valeur de Kd de 3,5 M.

90
 IV-4.2. Résultats avec les analogues N-substitués sur le triazole ou la
phatalazinone

Sur la base des propriétés physico-chimiques des résidus exposés au site de liaison de l'IL-
2R sur l'IL-15 et sur l'amarrage du composé 1d à l'IL-15 (Figure 19), nous avons
poursuivi notre étude SAR en explorant les surfaces protéiques proches des fragments
triazole et phtalazinone du composé 1a (Figure 19A), en introduisant des substituants
hydrophiles sur les azotes chimiquement modulables des deux hétérocycles.
L'efficacité des nouveaux composés a été évaluée à l'aide des tests de prolifération cellulaire
(Tableau 2) et de phosphorylation Stat5 dépendants de l'IL-15 et de l'IL-2 (Tableau 3)
et, pour certains d'entre eux, leur liaison à l'IL-15 a été déterminée par la technologie SPR
(Tableau 4).

Dans le mode de liaison prédit du hit 1a (Figure 19B), le substituant méthyle de

l'hétérocycle triazole s'est avéré partager une liaison hydrogène avec le groupe carbamoyle
du résidu asparagine 65 (N65) de l'IL-15, et le substituant méthyle du fragment
phtalazinone semble favoriser les interactions hydrophobes avec les résidus isoleucine 68
et leucine 69 de l'IL-15. De plus, les résidus d'asparagine (Figure 19B, résidus N1, N4 et
N72) pointaient également au voisinage du fragment phtalazinone.

Pour chercher à optimiser la valeur de la liaison de cette famille d'inhibiteurs avec la

protéine IL-15, nous avons choisi de substituer le groupement N-méthyle par des
substituants hydrophiles séquentiellement sur les hétérocycles triazole ou phtalazinone
pour développer deux séries d'analogues des composés 1a et 1d (Figure 20, série 1 et
série 2).
Les analogues ciblés du hit 1a portant la chaîne la plus courte (série 1), n'ont uniformément
donné aucune inhibition notable dans le test de la prolifération cellulaire (Tableau 2)
comme celui de p-STAT5 (Tableau 3). Une exception reste l'analogue 20 dont le N-Me
triazole, est remplacé par un résidu propionaldéhyde, donnant des valeurs d’IC 50 dans les
deux tests proches de celles du hit 1a (valeurs IC50 de 6,0 et 4,2 M respectivement).

Dans la série 2 avec un lien à 7 carbones, l'introduction d'un groupement acétal (composé
33) sur le substituant N-triazole, d’une fonction hydroxyle protégée, ou non, sur l'un des
hétérocycles (composés 39, 48 ou composés 41, 60) se sont révélés délétères puisqu’un
effet inhibiteur faible, voire nul, a été mesuré dans les tests de prolifération cellulaire et de
p-STAT5 (Tableaux 3 et 4).
Une certaine amélioration a été observée avec l'introduction d'une fonction carboxylique
comme illustré sur l'analogue de triazole 49 (Tableau 4, IC50 = 9,5 M pour p-STAT5)
mais pas pour l'analogue de phtalazinone 62 (IC50 > 30 M pour p-STAT5). De plus, le
résidu diméthylaminopropyle a donné des résultats similaires dans le test de prolifération
cellulaire (IC50 = 2-4 M), qu'il soit greffé sur les hétérocycles triazole (composé 52) ou

91
sur les hétérocycles phtalazinone (composé 59, Tableau 3), mais sans effet inhibiteur de
ceux-ci (Tableau 4, IC50 > 30 M). Cette observation pourrait refléter un effet non
spécifique de ces composés aminés affectant la prolifération des cellules indépendamment
de la voie de signalisation STAT5.

Comme le dérivé aldéhydique 20 (chaine n = 1), le dérivé aldéhydique 35 avec la chaîne à

7 carbones est apparu comme l'inhibiteur le plus efficace dans cette série 2 avec son
analogue triazolyle NH (38) qui a donné une inhibition de p-STAT5 de 280 nM contre 710
nM pour 35. Comme ce composé 38 pourrait être issu d’un procédé de type rétro-Michael
à partir de 35, un doute subsiste sur la stabilité biologique de l'aldéhyde 35 et donc son
niveau d'efficacité dans ces bioessais. Cependant les composés 35 et son analogue NH 38 se
sont comportés de manière similaire au composé 1d, suggérant l'implication de liaisons
hydrogène plausibles avec la fonction carbamoyle de l'asparagine N65, comme illustré dans
le modèle de liaison (Figure 19B).

Finalement le groupement méthyle sur l'hétérocycle phtalazinone du composé lead 1d

semble avoir un rôle essentiel puisque sa substitution par des groupements plus polaires
(composés 59, 60, 62) conduit à des composés incapables d'inhiber la prolifération
cellulaire dépendante de l'IL-15, ainsi que phosphorylation de STAT5 (IC50 > 30 M), à
l’exception peut-être, là encore, de l’analogue aldéhydique 61 qui cependant reste cent
fois moins bon que le lead dans le test p-STAT5. Ces résultats peuvent renforcer le modèle
de liaison hypothétique qui indiquait l'interaction de résidus lipophiles tels que l'isoleucine
68 et la leucine 69 avec le fragment N-méthyl-phtalazinone.

De manière satisfaisante, les données obtenues à partir des tests de prolifération cellulaire
corrèlent celles trouvées dans le test p-STAT5, soulignant que les effets inhibiteurs
prolifératifs mesurés pour l'IL-15 et l'IL-2 avec ces analogues résultaient de l'inhibition de
la voie de signalisation de ces cytokines. Malheureusement, aucune sélectivité IL-15 versus
IL-2 n'a pu être obtenue avec ces nouvelles séries de dérivés.

92
 Tableau 3 : Résultats (IC50) des tests de prolifération cellulaire avec les cellules 32D.
( Tous les résultats en triplica, sont moyennés sur au moins deux ou trois essais. b RLI (100 pM). c IL-2
a

(1.5 nM))

Inhibition de la prolifération cellulaire (32Dβ)

IC50 (µM) a IC50 (µM) a

R1 R2
N° N°
RLI b IL-2c RLI b IL-2c
n=1 n=7

22,5 ± 21,1 ± 2,2 ± 3,9 ±

Me Me 1a 1d
4,5 3,4 0,4 1,2

12,1 ± 16,4 ±
Me 19 > 30 > 30 33
2,8 4,7

6,0 ± 6,4 ± 2,5 ± 5,5 ±

Me 20 35
1,2 1,3 0,6 1,1

1,1 ± 3,5 ±
H Me 38
0,1 0,3

Me 40 > 30 > 30

Me 21 > 30 > 30 48 > 30 > 30

23,5 ±
Me 22 > 30 > 30 49 > 30
4,9

3,7 ± 5,5 ±
Me 52
1,4 2,0

Me 27 > 30 > 30

Me 41 > 30 > 30

8,9 ± 11,7 ±
Me 28 ~ 30  30 61
1,4 1,9

93
Me 29 > 30 > 30 60 > 30 > 30

Me 30 > 30 > 30 62 > 30 > 30

18,8 ± 16,7 ± 2,3 ± 3,2 ±

Me 31 59
2,4 2,9 0,5 0,3

Tableau 4 : Résultats (IC50) des tests p-STAT5 avec les cellules NK-92.
(a Tous les résultats
b
sont moyennés sur au moins deux ou trois essais.
IL-15 (50 pM), c IL-2 (250 pM))

Inhibition de p-STAT5 avec les cellules NK-92

IC50 (µM) a IC50 (µM) a
R1 R2 N°
N°
n= IL-15b IL-2c IL-15b IL-2c
n= 7
1

4,5 ±
Me Me 1 7,7 ± 1,0 2 0,19 ± 0,05 0,35 ± 0,09
0,7

Me 19 > 30 > 30 33 ~ 30 > 30

4,2 ±
Me 20 8,6 ± 0,7 35 0,71 ± 0,15 0,96 ± 0,16
0,6

H Me 38 0,28 ± 0,08 0,45 ± 0,09

Me 40 > 30 > 30

Me 21 > 30 > 30 48 > 30 > 30

Me 22 > 30 > 30 49 9,5 ± 0,7 14,3 ± 2,7

94
 Me 52 > 30 > 30

Me 27  30 > 30

Me 41 > 30 > 30

Me 28 ~ 20 > 30 61 14,9 ± 2,6 21,9 ± 6,0

Me 29  30 > 30 60 > 30 > 30

Me 30 > 30 > 30 62 > 30 > 30

Me 31 > 30 > 30 59 > 30 > 30

Pour compléter notre étude, nous avons évalué la liaison des composés sélectionnés 1d,
35, 38, 60 et 61 à l'IL-15 en utilisant la technologie SPR (Tableau 5). L'affinité de ces
composés pour l'IL-15 a été déterminée et comparée à leur profil pharmacologique mesuré
dans le test p-STAT5 (Tableau 4). Nous observons que le dérivé propanol 60 non actif
dans les deux précédents tests, est capable de se lier à l'IL-15 avec une valeur Kd de 3,9
M. Son comportement doit probablement procéder par un mode différent et moins
spécifique que celui du composé 1d.

Les composés portant une fonction aldéhyde tels que 35 et 61, affichent des valeurs de Kd
proches de 5 M (respectivement Kd = 5,9 et 7,8 M) en accord avec leurs valeurs d’IC50
dans le test p-STAT5. De plus, ces données nous permettent de confirmer que l'aldéhyde
35 est bien capable de se lier à la protéine IL-15 laissant suggérer que les résultats
biologiques observés (Tableaux 3 et 4) ne résultent peut-être pas de son métabolite
optionnel 38 qui garde aussi une bonne affinité pour la protéine IL-15 (Kd = 2,4 M).
Tous ces composés présentent aussi des caractéristiques moléculaires très proches, avec un
LogP qui reste élevé et voisin de 6 (Tableau 6).

95
 Tableau 5 : Résultats de binding sur une série de composés sélectionnés.

Inhibition de p-STAT5 Interaction

Directe
(NK-92)
R1 R2 Composé SPR
IL-15 IL-15 binding
IC50 (µM) Kd (µM)

Me Me 1d 0,19 ± 0,05 1,3

Me 35 0,71 ± 0,15 5,9

H Me 38 0,28 ± 0,08 2,4

Me 60 > 30 3,9

Me 61 14,9 ± 2,6 7,8

96
 Tableau 6 : Propriétés moléculaires des composés 1a, 1d, IBI-50, IBI-74, 63, 38, 35, 60, 61 :
Méthodes et outils : Discovery Studio (Dassault Systèmes BIOVIA Release 2017, San Diego). ALogP:
Atom-based method published by Ghose and Crippen (1986) pour le calcul de LogP).

Nb
Poids Nb Surface
donneu Nb liaison
Compos ALog Moléculai accepteur Polaire
Formule Brute r de
és P re de liaison Moléculai
liaison rotation
(g.moL -1 ) H re (Å2 )
H

C21 H 18 Cl2 N6 O2
1a 3,764 489,378 6 1 6 117,78
S

C27 H30 Cl 2 N6 O2
1d 6,158 573,537 6 1 12 117,78
S

IBI-50 C30 H 38 N6 O3 S 5,685 562,726 7 1 15 127,01

IBI-74 C30 H 36 N6 O4 S 5,033 576,710 8 1 15 144,08

63 C34 H 36 N6 O3 S 6,233 608,753 7 1 14 134,85

C26 H28 Cl 2 N6 O2
38 5,952 559,511 6 2 12 128,64
S

C29 H32 Cl 2 N6 O3
35 5,910 615,574 7 1 15 134,85
S

C29 H3 4Cl 2 N6 O3
60 5,681 617,590 7 2 15 138,01
S

C29 H32 Cl 2 N6 O3
61 5,910 615,574 7 1 15 134,85
S

97
V – Discussion et Perspectives

Nous avons montré que des inhibiteurs que des inhibiteurs de cytokines présentent un
intérêt thérapeutique alternatif dans le cas de certaines pathologies où l’IL-15 et l’IL-2 sont
par exemple toutes deux surexprimées et nécessitent d’être régulées. Ainsi, il est
intéressant de vouloir continuer à exploiter le potentiel de nos familles de molécules sans
même chercher à atteindre une sélectivité particulière. De nombreuses modifications ont
été apportées au composé 1a pour enrichir l’étude de la relation structure-activité. Les
pharmacomodulations ont été apportées indépendamment les unes des autres sur différents
sites de la molécule, et malgré l’absence de sélectivité IL-15/IL-2, plusieurs modulations
ont montré leur efficacité. Réunir ces différentes modulations sur une seule et même
structure représenterait un objectif afin d’optimiser davantage les effets inhibiteurs. Ci-
dessous les 3 modifications envisagées (Schéma 41) :

- L’ajout de la chaîne propionaldéhyde au niveau du triazole

- L’installation de la chaîne pégylée courte (analogue de la chaîne carbonée C 7)
- Le remplacement de la 2,4-dichloroaniline par la 4-aminobenzophénone.

Schéma 41 : Modèle de molécule associant les 3 différentes fonctions sur notre molécule HIT 1 :
aldéhyde, PEG et la 4-aminobenzophénone.

98
PARTIE 2 – Vers une sélectivité IL-15 VS IL-2
I - Sérine 58, la clé de la sélectivité ?

I-1. Etude par modélisation moléculaire

Le travail de thèse de Rui Sousa 223 a permis de compléter l’identification des résidus qui
interagissent avec l’IL-2Rβ grâce à des expériences de dynamique moléculaire (DM)
réalisées sur le complexe de l’IL-15 avec son récepteur trimérique (code PDB 4GS7). Le
résultat de ces simulations a ainsi mis en évidence, outre les hot-spots déjà connus (Asp8,
Asn65, Leu69), d’autres résidus de l’IL-15 impliqués au niveau de l’interface avec la chaîne
β. Il s’agit des résidus Ser7, Lys11, Ser58 et Asp61 de l’IL-15, localisés sur l’hélice A (Ser7,
Lys11) et l’hélice C (Ser58, Asp61).224 Parmi ces résidus, la Ser58 située à l’extrémité de
l’hélice C, a particulièrement retenu notre attention. La DM a en effet suggéré une
potentielle interaction dynamique de cette Ser58 de l’IL-15 avec la Ser69 de l’IL-2Rβ, à
travers la formation d’une liaison hydrogène éphémère. 225 Contrairement aux hot-spots
précédemment identifiés, la plupart de ces résidus ne sont pas conservés sur l’IL-2. En
effet, après superposition des structures de l’IL-2 et de l’IL-15 (Figure 29), on observe
que les résidus Ser7, Lys11 et Ser58 présents sur l’IL-15 correspondent respectivement à
des résidus Leu19, Met23 et Arg81 sur l’IL-2, prédisposant des interactions différentes.
Seul le résidu Asp61 est conservé (Asp84 sur l’IL-2). Sur la base de ces résultats, un criblage
virtuel de banques de composés chimiques a été entrepris pour cibler cette nouvelle zone
identifiée sur l’IL-15 dans la perspective de sélectionner des composés plus sélectifs de l’IL-
15 que de l’IL-2.

223 R. Sousa, Structural insights of IL-15 through molecular dynamics simulations: Towards the rational design of specific
inhibitors. Thèse soutenue le 17/07/2019
224 R. P. Sousa et al. Molecules 2019, 24, 3261

225 A. Quéméner et al. J. Cell. Sci. 2019, 133

99
 Figure 30 : Comparaison des structures IL-2 et IL-15 au niveau de la Sérine 58. Superposition des
structures de l’IL-2 (orange) et de l’IL-15 (bleu) montrant la position des résidus ciblés (représentation
en bâtonnet) pour le criblage virtuel. Les résidus sont respectivement pour l’IL-15/IL-2 : Ser7/Leu19,
Asp11/Met23, Ser58/Arg81 et Asp61/Asp84. (Extrait de R. Soua.223).

I-2. Définition d’un nouveau modèle de pharmacophore

Dans un premier temps et comme lors du premier criblage décrit dans la Partie 1 de ce
chapitre, des modèles de pharmacophores ont été définis sur la base de la combinaison des
résidus Ser7, Lys11, Ser58 et Asp61 de l’IL-15 à l’aide du logiciel Discovery Studio (DS)
4.0 (Dassault Systèmes), en utilisant soit la structure cristallographique de l’IL-15, soit des
structures issues de la DM (4 structures dont 3 correspondant à une structure moyenne
tirée des intervalles de temps 25-50 ns, 50-75 ns et 75-100 ns et la structure finale de la
DM correspondant à 100 ns). 224

Des modèles de pharmacophore basés sur les résidus homologues (Leu19, Met23, Arg81
et Asp84) sur la structure cristallographique de l’IL-2, ou celles issues de la DM réalisée
sur le complexe de l’IL-2 avec ses 3 chaînes réceptrices (code PDB : 2B5I), 97 ont également
été construits en parallèle (Figure 30).

100
 Figure 31 : Pharmacophores définis sur l’IL-15 et l’IL-2 au niveau de la Sérine 58. Représentation en
ruban de la structure de l’IL-15 (à gauche) et de celle de l’IL-2 (à droite) avec les pharmacophores
respectifs utilisés pour chaque structure cristallographique. Les sphères vertes représentent des
projections d’accepteur de liaison hydrogène (HBA) (Lys11 et Ser58 sur l’IL-15 ; Arg81 sur l’IL-2), les
sphères roses correspondent à des projections de donneur de liaison hydrogène (HBD) (Asp61 sur l’IL-
15 ; Asp84 et Arg81 sur l’IL-2), la sphère violette représente une projection de donneur/accepteur de
liaison hydrogène (HBD/A) (Ser7 sur l’IL-15) et les sphères bleues correspondent aux zones
hydrophobes (près de Leu19 et Met23 sur l’IL-2). Les sphères grises sont les régions d’exclusion.
(Extrait de R. Sousa. 223).

Une banque regroupant 263 841 composés enrichie en composés ayant des propriétés
d’inhibiteurs d’IPP et provenant de plusieurs fournisseurs (Maybridge, Chembridge,
Asinex, ChemDiv, Enamine, Life Chemical) a ainsi été filtrée à l’aide de ces 2 types de
pharmacophores. La banque filtrée retenue (37 397 composés, 14,2% de la banque initiale)
respectant exclusivement les pharmacophores propres à l’IL-15 et excluant ceux propres à
l’IL-2, ou communs aux 2, a ensuite été dockée sur la structure cristallographique de l’IL-
15, ou sur une structure issue de la DM (la structure moyenne tirée de l’intervalle de temps
75-100ns), en utilisant le programme LigandFit et en définissant le site de docking au
niveau des résidus Ser7, Lys11, Ser58 et Asp61 de l’IL-15 (volume du site 944 Å3). Les
composés dockés ont d’abord subi un premier tri grâce à l’utilisation de 6 fonct ions de
score (Ligscore1, Ligscore2, PLP1, PLP2, Jain et PMF) implémentées sur DS. Les
composés ayant un score dans le Top 10% pour les 6 fonctions de score ont été retenus et
un calcul d’énergie d’interaction sur l’IL-15 a été entrepris en gardant les résidus du site
de docking flexibles (Asn4, Ser7, Asp8, Lys10, Lys11, Ala57, Ser58, Asp61, Glu64,
Asn65, Ile68, Leu69 et Asn72). Ce dernier calcul a permis d’attribuer à chaque composé
un rang par rapport à la cible IL-15. Ainsi 592 composés ont été sélectionnés par le docking
sur la structure cristallographique de l’IL-15 et 320 sur la structure issue de la DM. Ces
ligands ont ensuite été respectivement dockés sur la structure cristallographique de l’IL-2
et sur celle de l’IL-2 issue de la MD et finalement classés par rapport à la cible IL-2.

101
Au bilan, une centaine de ligands significativement mieux classés pour l’IL-15 que de l’IL-
2 a été sélectionnée pour être achetée et évaluée in vitro (Figure 31).

Figure 32 : Schéma résumant les différentes étapes du criblage virtuel. Les nombres en blanc
représentent le nombre de composés sélectionnés à chaque étape.

I-3. Sélection du Hit

Les composés acquis ont été testés dans un premier temps pour leur capacité à se lier à l’IL-
15 en utilisant la technologie de résonnance plasmonique de surface (SPR). L’IL-15
recombinante humaine est ainsi immobilisée de façon covalente sur une puce en utilisant la
méthode de couplage aux amines. La fixation des composés à une seule concentration, ou
à des concentrations croissantes, sur l’IL-15 immobilisée a été ensuite évaluée (Figure
32).

102
 Figure 33 : Signal SPR sur la fixation à l’IL-15 obtenu avec les composés sélectionnés par le criblage
virtuel. A gauche, la réponse des différents composés testés à une concentration (200 µM). A droite, la
réponse en cinétique d’un composé testé à deux concentrations (en haut, 20 et 200 µM) ou en doses
croissantes (en bas).

Parallèlement, l’effet inhibiteur des composés a été déterminé sur un test cellulaire
fonctionnel mesurant dans des cellules dépendantes de l’IL-15 ou de l’IL-2, la
phosphorylation de STAT5, un facteur de transcription lié aux systèmes IL-15 et IL-2. Les
cellules TF-1β utilisées ont l’avantage de répondre également au GM-CSF, une cytokine
très différente de l’IL-15 et de l’IL-2, mais dont le système de transduction est aussi couplé
à STAT5. Ainsi en utilisant ce test complémentaire sur GM-CSF, il est possible de
discriminer un effet inhibiteur spécifique de l’activation des récepteurs de l’IL-15/IL-2
(effet extra-dellulaire) d’un effet inhibiteur direct sur Stat5 (effet intra-dellulaire).
L’ensemble de ces évaluations a conduit à la sélection d’une famille de composés pour
lesquels une optimisation chimique a été envisagée (Figure 33).

103
 Compound PIRAMID3 - B7 Compound PIRAMID3 - H6 TF-1 PIRAMID6-D1
125 125 125

pSTAT5 Response (%)

pSTAT5 response (%)

pSTAT5 response (%)

100 100 100

75 75 75

50 50 50
IL-15E53K ED50=18.8µM IL-15E53K ED50=21.3µM IL-15E53K (200pM )
25 IL-2 ED50=92.9µM 25 IL-2 ED50=66.6µM 25 IL-2 (1.8nM )
GM-CSF GM-CSF GM -CSF (150pM )
0 0 0
10 - 1 10 0 10 1 10 2 10 - 1 10 0 10 1 10 2 10 - 1 10 0 10 1 10 2
Compounds (µM) Compounds (µM) Compounds (µM)

Figure 34 : Famille de composés issus du criblage virtuel sélectionnés par l’évaluation in vitro. En haut,
formule chimique des composés issus du criblage virtuel sélectionnés sur la base (en bas) de leur effet
inhibiteur de la phosphorylation de STAT5 induite par l’IL-15, l’IL-2 ou le GM-CSF dans des cellules
TF-1.

Une famille de composés isoxazolo-thiophène a ainsi été sélectionnée pour le

développement de potentiels inhibiteurs sélectifs de l'IL-15. Comme dans la première
approche IBI, la stratégie de synthèse de ces composés nécessitera la préparation de deux
fragments : Est dérivé du thiophène et Ouest dérivé d'isoxazole (Schéma 42).

Schéma 42 : Stratégie de synthèse de la famille de composés isoxazolo-thiophène.

104
II – Analogues du Hit modifié sur la partie Est

II-1. Stratégie de synthèse linéaire : La voie stannylée

Dans l'objectif de préparer de petites librairies de molécules analogues dans la série de

composés que nous avons identifiés, une première stratégie linéaire a été proposée. Celle-
ci repose sur la synthèse d'un intermédiaire clé stannylé C à partir des deux fragments
oxazolique A et Thiophène B (Schéma 43). Il a été, en effet anticipé que ce synthon C
permettrait d'introduire une variété de substituants en position 5 de l'isoxazole à la dernière
étape par couplage de Stille. 226 Comme de nombreux réactifs notamment halogénés
(aromatiques, aliphatiques…) sont disponibles commercialement, cette stratégie laissait
entrevoir l'accès à une diversité moléculaire. Toutefois, proposer un couplage
organométallique comme étape finale d'une synthèse peut représenter un obstacle dans le
développement d'une molécule à visée biologique en raison des problèmes de purifications
et de toxicité de résidus organométalliques résiduels. Néanmoins, dans une phase
préliminaire d'identification de ligands sélectifs de l'IL-15, nous avons tout de même
exploré cette voie de synthèse (Schéma 43).

Schéma 43 : Rétrosynthèse du composé D.

226a) W. J. Scott, J. K. Stille, J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 3033–3040; b) R. Selig et al. Tetrahedron 2011, 67, 9204–9213; c)
E. J. Corey et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 7600-7605

105
 II-1.1 Synthèse de la partie Est 2-amidothiophène (B)

La synthèse du fragment B débute par la construction du précurseur 2-aminothiophène qui

sera ensuite acylé. Les motifs 2-aminothiophènes substitués sont accessibles via une
réaction multi-composants (MCR), largement décrite et optimisée dans la littérature, 227 228
après avoir été publiée pour la première fois par Karl Gewald en 1966. 229 Celle-ci implique
la condensation d'un dérivé carbonylé énolisable et d'un dérivé cyanoacétate d'alkyle pour
former l'intermédiaire cyano ,-insaturé via une condensation de Knoevenagel. En milieu
basique, ce dernier réagit avec le soufre S8, puis se cyclise pour conduire après
réarrangement à l'amino thiophène attendu (Schéma 44).

Schéma 44 : Proposition de mécanisme pour la réaction de Gewald.

227
K. Wang et al. J. Comb. Chem. 2010, 12, 111–118
228 Y. Huang et al. Mol. Divers. 2011, 15, 3–33
229 K. Gewald et al. H. Chem Ber. 1966, 99, 94–100

106
En 2014, M. S. Abaeea et S. Cheraghi230 décrivent différents essais de condensation-
cyclisation entre des cétones cycliques, ou non cycliques, et le cyanoacétate d'éthyle, en
milieu aqueux et en présence d'une base organique, avec des rendements compris entre 75
et 98 %. Avec le cyclohexanone le rendement est de 95 %, dans les conditions de réaction
optimale, c'est à dire 7 heures de réaction à température ambiante à une concentration
molaire de 3 M dans l'eau et en présence d'un équivalent de triéthylamine. En suivant ces
conditions, nous avons engagé la synthèse des dérivés 2-aminothiophènes 66a-d à partir
du cyanoacétate d'éthyle et de dérivés de cétones cycliques sélectionnées introduits en
quantité stœchiométrique (Schéma 45). La seconde étape est une N-alkylation mettant en
jeu les composés 66a-d avec le chlorure de 2-bromoacétyle (1,5 éq.) commercial en
solution dans le DCM en présence de 2 équivalents de triéthylamine. Les 2 -
amidothiophènes 67a-d obtenus avec des rendements compris entre 79 et 96 %, après
purification sur colonne de gel de silice, subissent une réaction d'échange halogène Br-I
avec des rendements variables (58 à 90 %) dans les conditions classiques de Finkelstein (5
éq. de NaI pendant, 2 heures dans l'acétone à température ambiante) pour finalement
donner les composés iodés 68a-d quantitativement (Tableau 6).

Schéma 45 : Synthèse des fragments 2-amidothiophènes 68a-d.

230 M. Saeed Abaee et al. J. Sulfur Chem. 2014, 35, 261-269

107
 Tableau 7 : Substrats cétoniques et rendements pour l’étape MCR (66a-d), l’étape d’acylation (67a-
d) et l’étape de SN (68a-d) de la séquence réactionnelle du Schéma 45.

Rendements
Cétone
66 67 68
(amino) (bromo amide) (iodo amide)

96 % 90 % Quant.
a

79 % 80 % Quant.
b

88 % 65 % Quant.
c

86 % 58 % Quant.
d

II-1.2 Synthèse de la partie Ouest isoxazole stannylé (A)

Pour la synthèse du motif isoxazole stannylé, nous nous sommes inspirés des travaux de F.
Li et al., 231 dans lesquels 2 voies d’accès à un motif 5-bromo isoxazole L, sont proposées,
dont l’une nécessitera le passage par un intermédiaire stannylé H (Schéma 46a). Les
auteurs expliquent privilégier la voie commençant par une réaction de cycloaddition-1,3-
dipolaire à partir du 2-chloro-2-(hydroxyimino) acétate d'éthyle G car elle donne un
rendement de 67,5 % sur 2 étapes, contre seulement 9 % à partir du 2-hydroxyfumarate
de diéthyle E (Schéma 46a). Notons que notre stratégie linéaire pourrait aussi mettre en
œuvre l’isoxazole bromé K, qui pourrait être engagé par la suite dans une réaction de
couplage de Suzuki ou de Stille (Schéma 46 b).

231 F. Li et al. J. Med. Chem. 2017, 60, 1580–1590

108
Nous avons choisi, à partir de l’isoxazole stannylé H (Schéma 46a), et de réduire la
fonction ester éthylique en alcool primaire pour réaliser ensuite la O-alkylation avec les
différents intermédiaires halogénée 68a-d.

Schéma 46 : Voies d’accès à l’isoxazole bromé J (Adapté de F. Li et al.237), (a) et stratégie de synthèse
envisageable à partir de ce précurseur J (b).

Dans un premier temps, la synthèse du tributylétain acétylène 70 a été envisagée à partir

du composé commercial triméthylsilyl acétylène. Ce dernier, en présence de n-BuLi (1,5
éq.) dans le THF à -78 °C, fournit in situ l’anion correspondant qui réagira avec le chlorure
de tributylétain (1,5 éq.) à -78 °C. Après trois heures de réaction, le composé 69 est
obtenu de façon quantitative et sa structure validée, notamment par les données RMN 1H.
Par la suite, des tentatives de désilylation ont été réalisées. Les méthodes classiques utilisées
(K2CO3/MeOH et TBAF/THF) n’ont pas mené au produit attendu 70 (Schéma 47). Pour
ces 2 conditions utilisées, l’étude du spectre RMN 1H et 13C du brut réactionnel montre la
perte des signaux correspondants au TMS à 0.16 ppm. Cependant, aucun signal RMN du
proton acétylénique (attendu entre 2 et 3 ppm), ou du carbone acétylénique (attendu

109
autour des 70 ppm), caractéristiques n’a été observé. Par ailleurs, nous n’avons trouvé
aucune donnée de la littérature faisant état de la synthèse du composé 70 par déprotection
du composé 69.

Schéma 47 : Tentative de synthèse de l’acétylène n-tributylétain 70.

Afin de pallier ce problème, le composé 69 a été directement engagé dans la réaction de

cycloaddition-1,3-dipolaire (Schéma 48) dans les conditions décrites par Fang Li9 pour
donner la molécule 70 avec 82 % de rendement, validée par RMN 1H et HRMS sans
toutefois pouvoir identifier clairement le régioisomère 71a ou 71b (Schéma 48). Après
élimination du TMS en milieu méthanolique basique (K2CO3/MeOH), puis purification,
nous obtenons une molécule qui s’avère être le régioisomère 72b, avec un rendement de
73 %. Celui-ci est identifié par RMN 1H via le proton caractéristique de l’isoxazole dont le
déplacement diffère par rapport à 72a, comme décrit dans la littérature. Le proton de
l’isoxazole 72a devrait ainsi exprimer un singulet à 6,82 ppm, 232,233 alors que nous
observons celui du composé 72b à 8,19 ppm.

232 Y. Kondo et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 4249-4250

233 T. Sakamoto et al. Tetrahedron 1991, 47, 5111-5118

110
 Schéma 48 : Tentative de synthèse du composé 72a.

Nous avons relevé à travers les travaux de Yamanaka et collaborateurs 234 des données RMN
1
H d’un 4-triméthylétain isoxazole, analogue de 72b. La valeur du proton de l’isoxazole
apparait cette fois à 8,03 ppm. (Figure 34), confirmant la forme 72b que nous avons
obtenue.

Figure 35 : Données RMN 1H d’un composé isoxazole stannylé en position 4.

Le composé 70 étant commercial, nous avons repris l’étude de cycloaddition dans les
mêmes conditions que décrites précédemment (DCM, K2CO3), et obtenu les isoxazoles
72a et 72b avec des rendements allant de 30 à 70 % et un très bon ratio de 98:2 déterminé
par RMN 1H (Schéma 49). Il est à noter que le composé 72a reste peu stable et se dégrade
en milieu acide et à température ambiante. Finalement la fonction ester du composé 72a a
été réduite en alcool 73 en présence de 2 équivalents de borohydrure de sodium, avec un
rendement de 72 %.

234 T. Sakamoto et al. Chem. Pharm. Bull. 1993, 41, 478 – 480

111
 Schéma 49 : Synthèse de l’intermédiaire stannylé 73.

La régiosélectivité des cycloadditions 1,3-dipolaires peut être rationalisée par la théorie des
orbitales frontières. L’état de transition le plus stable sera orienté vers la combinaison des
deux atomes terminaux du dipôle et dipolarophile ayant les coefficients les plus élevés.
Cependant, il est aussi établi que des gènes stériques dans l’état de transition peuvent aussi
contrevenir au contrôle orbitalaire, et par ailleurs comme nous le discuterons par la suite
des mécanismes radicalaires peuvent aussi être considérés dans ces processus de formation
de cycles à 5 chaînons à partir d’un dipôle de type oxyde de nitrile.
Cependant, Yamanaka et collaborateurs236 suite à des calculs de modélisation justifieront la
formation majoritaire du régioisomère stannylé en position 4 (71b) à partir de
triméthylsilyl tributylstannyl acétylène (69) ou du régioisomère stannylé en position 5
(72a) à partir du tributylstannyl acétylène (70), par l’évaluation des coefficients associés
aux orbitales HOMO et LUMO (méthode MNDO-PM3 « modified neglect of diatomic
overlap, parametric method 3 ») des atomes impliqués dans la cycloaddition.
Considérant que les électrons se déplacent du dipolarophile acétylène (coefficient HOMO
important), vers le dipôle 1,3-oxyde de nitrile (coefficients LUMO important), les
régiosélectivités 71b et 72a se justifient (Tableau 8).

112
 Tableau 8 : Coefficients HOMO et LUMO calculés pour différents dipolarophiles (NOs) et dipôles
acétyléniques (méthode PM3). 236

Me CO2Et
HOMO LUMO HOMO LUMO
C 0,607 0,593 0,640 0,381
O -0,659 0,306 -0,653 0,293

H SiMe3
HOMO LUMO HOMO LUMO
C1 0,345 0,000 0,460 0,004
C2 0,375 0,000 0,402 -0,006

Toutefois comme observé par Yamanaka et collaborateurs, la stabilité de la molécule

stannylée cible 72a, lors des purifications par chromatographie sur colonne de gel de silice
nous a posé un problème, car sur cette phase relativement acide, nous pouvons observer
une perte du groupement tributylétain. Même si l’isoxazole stannylé 73 a pu être obtenu
avec un rendement correct, ce résultat reste trop aléatoire pour poursuivre dans cette voie
car nous observons trop de dégradation pouvant nous conduire à une impasse dans l’esprit
d’une diversité fonctionnelle.

II-2 Stratégie de synthèse convergente

Face à ces difficultés, nous nous sommes tournés vers une stratégie convergente, moins
élégante car nécessitant de construire chacun des intermédiaires isoxazole à partir d’un
alcyne vrai possédant déjà le cycle aromatique substitué en 4. Contrairement à la voie
précédente, pour chaque nouvel analogue ciblé il nous faudra donc synthétiser le
précurseur Ouest isoxazole correspondant (Schéma 50).

113
 Schéma 50 : Rétrosynthèse de la stratégie convergente.

Si plusieurs voies de synthèse pour accéder aux motifs isoxazoles sont décrites dans la
littérature,235 236 237 deux principales alternatives s’offraient à nous, soit à partir d’une aryl
méthylcétone et de l’oxalate d’éthyle (Schéma 51a),238 239 soit comme précédemment à
partir du chlorohydroxyimino acétate G en présence d’une base et d’un dérivé acétylénique
arylique, en milieu organique (Schéma 51b). Récemment cette dernière réaction a
également été étudiée dans l’eau.240

Schéma 51 : Deux voies d’accès (MCR) aux isoxazoles.

La seconde voie, que nous avions déjà utilisée a été choisie en première intention. La
réaction de cycloaddition entre le dérivé para-fluoro phényl acétylène et le chloro
hydroxyimino acétate nous a permis de générer l’isoxazole souhaité 74a (Schéma 52).

235 Y. Ma et al. Asian J. Org. Chem. 2020, 9, 1018-1021

236 F. Hu et al. Adv. Synth. Catal. 2015, 357, 2583-2614
237 P. e Melo et al. Curr. Org. Chem. 2005, 9, 925-958
238
N. Ye et al. J. Med. Chem. 2015, 58, 6033-6047
239 N. G. Johansson et al. ACS Med. Chem. Lett. 2020, 11, 605-610
240 C. Kesornpun et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 3997-4001

114
Toutefois, contrairement à précédemment, ce dernier apparaît en mélange avec le
furoxane 75 formé, issu de la dimérisation du réactif du chloro hydroxyimino acétate G.

Schéma 52 : Réaction de cycloaddition-1,3-dipolaire suivie de la réduction du composé 74a en

mélange avec le dimère 75.

Dans cette première étape de cyclisation 1,3-dipolaire, la nature organique (NEt 3) ou

inorganique (K 2CO3) de la base pour former l’oxyde de nitrile à partir du chloro
hydroxymine n’a pas d’influence sur l’apparition du composé secondaire 75 qui se forme
toujours, avec un ratio moyen d’environ 50:50 et un rendement brut estimé par RMN 1H
autour de 50 % (Tableau 9, essais 1 et 2). Le composé 75 est repéré par ses signaux
caractéristiques à 4,47 ppm (2 quadruplets) et 1,30 ppm (2 triplets).

Tableau 9 : Conditions expérimentales pour la cycloaddition-1,3-dipolaire.

(a) : Réactions réalisées au moins 3 fois. Conversion basée sur l’analyse des intégrations sur le spectre
RMN 1H.

Base
Essai Ratio(a) 74a/75
(1 éq.)

1 1/1 K2CO3 50:50

2 1/1 Et3N 50:50

Cette réaction de dimérisation aboutissant entre autres au furoxane 75 est connue dans la
littérature.241,242,243 La plupart des oxydes de nitriles (NOs) sont relativement instables et
conduiront à la dimérisation en furoxane L2 (Figure 35), selon un mécanisme radicalaire.
La dimérisation des oxydes de nitrile est particulièrement rapide à partir de nitriles

241
S. Roscales et al. Org. Biomol. Chem. 2018, 16, 8446
242 Z-X. Yu et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 15420-15425
243 J. Plumet, ChemPlusChem 2020, 85, 2252–2271

115
aliphatiques (oxyde d’acétonitrile, moins d’une minute) comparée aux oxydes de nitriles
aromatiques (plusieurs heures à température ambiante). D’autre part la délocalisation des
électrons dans des systèmes π, augmente la stabilité de ces NOs. La formation de 1,2,4-
oxadiazole N-oxyde L3 ou de dioxadiazine L4, reste moins importante tandis que la
formation d’isocyanates L5 apparaitra à très haute température.

Figure 36 : Dimérisation et isomérisation des NOs. 17

Le mécanisme di-radicalaire mis en évidence par Firestone, dans les années 70, 244 dans les
cycloadditions 1,3-dipolaires a également été proposé pour la formation du furoxane L2
(Schéma 53), sachant de plus que cette réaction peut être réversible.245

Schéma 53 : Proposition de mécanistique di-radicalaire de formation du furoxane 75.

Concernant le mécanisme de cycloaddition 1,3-dipolaire de ces oxydes de nitrile avec des

alcènes, ou alcynes, plusieurs hypothèses ont été proposées dans la littérature, dont le
mécanisme radicalaire (mécanisme de Firestone) et un mécanisme concerté (mécanisme de
Huisgen) (Schéma 54).

244 R. A. Firestone, Tetrahedron 1977, 33, 3009-3039

245 L. L. Fershtat et al. Tetrahedron Lett. 2014, 55, 2398–2400

116
Schéma 54 : Mécanismes concerté (Huisgen) et radicalaire (Firestone) de cycloaddition d’alcynes et de
NOs.

Pour ces réactions de cycloaddition 1,3-dipolaire, les auteurs expliquent que le mécanisme
concerté (mécanisme de Huisgen) semble être favorisé quand les dipôles-1,3 sont non
substitués, tandis que le mécanisme radicalaire (mécanisme de Firestone) deviendrait
favorable lorsque les dipôles-1,3 et les dipolarophiles sont substitués par des groupements
stabilisant les radicaux. A la lumière de ces hypothèses, nous avons réalisé une réaction sous
atmosphère inerte et à l’abri de la lumière afin de vérifier (ou non) l’hypothèse d’un
mécanisme radicalaire. Nous avons reproduit les conditions de l’essai 1 (Tableau 9) et le
résultat obtenu a été le même.

Par la suite nous avons essayé différents protocoles en modifiant le mode et l’ordre d’ajout
des réactifs. Classiquement la base est ajoutée rapidement et le rapport entre 74a et 75
reste voisin de 60:40. Nous avons additionné la triéthylamine au goutte à goutte à l’aide
d’un pousse seringue (0,2 mL/h pour 2 mL) et le résultat reste inchangé. Finalement en
ajoutant la chlorohydroxyimine G diluée (10-2 M) dans le mélange, le furoxane 75 est aussi
généré sans avantage observable.
Finalement, sachant que ces réactions de type Huisgen peuvent être catalysées par des
métaux comme le cuivre,246 un essai a été réalisé en présence de CuSO 4 catalytique et
d’ascorbate de sodium, en présence d’une base. 247 Si dans la littérature cette réaction
catalysée donne de bons rendements à partir d’oxydes de benzonitriles, les mêmes
conditions appliquées avec un équivalent de chlorohydroxyiminoacétate et un équivalent

246 F. Hu et al. Adv. Synth. Catal. 2015, 357, 2583-2614

247 F. Himo et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 210-216

117
de notre substrat para-fluoro phényl acétylène, n’ont apporté aucune amélioration, ni dans
l’avancement de la réaction, ni dans le résultat.
Il est aussi intéressant de noter que le furoxane 75 n’a pas ou peu été formé lors des
réactions de cycloaddition avec les acétylènes stannylés 69 et 70 (Schéma 48 et 49). Cette
observation nous laisse supposer que le 4-fluorophénylacétylène est moins réactif. En effet,
l’intermédiaire NO réagirait plus vite avec les acétylènes stannylés, ne laissant pas le temps
à l’oxyde de nitrile de se dimériser.
Le mélange 74a/75 a tout de même été directement engagé dans la réaction de réduction
pour obtenir l’alcool 76a correspondant (Tableau 10). Deux agents réducteurs ont tout
d’été utilisés en excès. Tous deux ont fourni de bons rendements (entre 71 et 88 %), mais
nous avons préféré retenir le NaBH 4 (5 éq.) plus pratique à utiliser à l’échelle du gramme
que le DiBAlH (3 éq.) en solution. Sur l’analyse RMN 1H des bruts de réaction, nous avons
observé la disparition du furoxane 75 après traitement de la réaction, qui semble donc avoir
été consommé ou dégradé.

Tableau 10 : Conditions expérimentales pour la cycloaddition-1,3-dipolaire à partir 74.

(a) : Rendement sur 2 étapes, cycloaddition et réduction.

Agent Rendement
Essai Equivalent Solvant Temps Temp. (°C)
Réducteur 76a(a)
DiBAlH
1 3 DCM 5h TA 71 %
(1M dans DCM)
2 NaBH4 5 EtOH 16 h TA 88 %
3 NaBH4 5 THF/EtOH 16 h TA 85 %

Une fois l’alcool 76a obtenu, celui-ci a été engagé dans la réaction de O-alkylation avec
l’amidothiophène 68a (Schéma 55). L’hydrure de sodium utilisé est dispersé à 60 % dans
l’huile minérale. Dans un premier temps des essais de O-alkylation ont été réalisés en
quantité stœchiométrique entre l’alcool 76a, l’hydrure de sodium et le dérivé iodé 68a
(Schéma 55). Après deux heures de réaction, la réaction n’est pas totale, mais n’évolue
plus (Tableau 11, essai1). En RMN 1H, nous observons la formation d’un produit
secondaire dont la structure a pu être élucidée. Il s’agit du dimère 78 caractérisé
notamment par un singulet à 4,45 ppm et l’absence du NH amidique caractéristique.
Malheureusement le mélange 77a/78 n’est pas séparable sur gel de silice. En RMN 1H,
nous pouvons estimer les quantités relatives de produit attendu 77a, du dimère 78 et de
l’alcool 76a de départ dans le brut réactionnel à respectivement 16 %, 26 % et 58 %, ce
qui reste cohérent.

118
 Schéma 55 : Réaction de O-alkylation entre l’alcool 76a et le dérivé iodé 68a.

La présence du dimère et de l’alcool laisse supposer une formation incomplète de

l’alcoolate. Plusieurs essais ont été réalisés afin de prévenir la formation de 78. Aucune
réaction en condition stœchiométrique n’a permis d’éviter la formation du dimère 78
(Tableau 11, essais 1 à 2). C’est en introduisant l’alcool 76a en excès (2 éq.) par rapport
au dérivé iodé 68a que nous obtenons le produit 77a avec un minimum de formation de
dimère 78 (Tableau 11, essais 3 et 4).

Tableau 11 : Conditions expérimentales pour la O-alkylation.

(a) : Rapport basé sur l’analyse des intégrations sur le spectre RMN 1H du brut.
(b) : Rapport basé sur l’analyse des intégrations sur le spectre RMN 1H après purification.

76a Temps de 68a Ratio

Essai NaH (éq.)
(éq.) réaction (éq.) 76a/ 77a/78
1 1 1,1 10-15 min 1 53:16:26a
2 1 1,1 35 min 1 mélange
3 1 2 10-15 min 1 23 71:6 a
4 2 2,2 10-15 min 1 0:100:0 b

Ces conditions ont toutefois été appliquées avec les amido-thiophènes 68b, 68c et 68d
analogues de 68a, (Schéma 56). Ainsi, l’hydrure de sodium (2,2 éq.) est ajouté aux alcools
76b-d (2 éq.) en solution dans le DMF. Après 15 minutes à température ambiante, le
dérivé iodé 68a est ajouté au mélange. Nous avons ainsi pu obtenir après purification sur
gel de silice, trois nouveaux composés 77b-d avec des rendements respectifs cependant
très modestes de 25, 42 et 50 % (Tableau 12).

119
 Schéma 56 : Etape de O-alkylation vers les analogues ciblés 77a, 83-85.

Tableau 12 : Rendements de la O-alkylation de l’alcool 76a avec les intermédiaires iodés 68a-d.

68a 68b 68c 68d

Composés
R=

Rendement 53 % 25 % 42 % 50 %

120
III – Analogues du Hit (77a), modifié sur la partie Ouest

III-1. Stratégie de synthèse convergente avec le motif alkylant (68a)

Ayant un accès rapide et efficace à l'agent alkylant thiophénique 68a, la synthèse d'une
petite librairie d'analogues du composé hit 77a a été complétée selon la même voie
convergente en utilisant des analogues oxazoles de 76a (Schéma 57).

Schéma 57 : Stratégies de synthèse d’analogues 77a par voie convergente.

III-1.1 Synthèse des précurseurs hydroxyméthyl-isoxazole (76)

Pour accéder aux alcools oxazoliques, la première étape restera une étape de cycloaddition
entre les dérivés acétyléniques commerciaux La-f et le chloro hydroxyimino acétate G,
conduisant aux isoxazoles esters 74a-d correspondants. La seconde étape comme
précédemment sera une réduction en présence de borohydrure de sodium pour donner les
alcools 76a-d attendus dans cette série (Schéma 58).

Schéma 58 : Schéma de synthèse des hydroxyméthyle isoxazoles 76a-d.

121
Au cours de la synthèse du composé 77a, quelques difficultés ont été rencontrées
notamment lors de la cycloaddition pour former le fragment Ouest, conduisant à des
quantités non négligeables du dimère 75, difficile à supprimer par purification. Deux bases
ont été testées le carbonate de potassium (peu soluble dans le THF) et la triéthylamine,
conduisant toutes deux à des résultats similaires et un rendement en composés 74a/75
voisin de 60% en mélange.
Pour la synthèse des intermédiaires isoxazoles 74b-e, le choix de la base s’est porté sur la
triéthylamine ou carbonate de potassium selon le mode de la préparation de 74a (Tableau
13, essais 1-4, 6 et 7). Toutefois, le dimère 75 se forme encore systématiquement et en
quantité toujours non négligeable, comme nous l’avions suspecté selon les résultats
observés au côté de 74a. Les composés attendus 74b-e sont toujours isolés très
difficilement par chromatographie sur silice avec des rendements finaux très variables
compris entre 17 % et 74 %.
Le dérivé p-OMe 74c (Tableau 13, essai 3) est, lui, obtenu pur mais avec seulement 36%
de rendement après une séparation délicate avec le composé 75 formé majoritairement.
En effet, l’excès de réactif hydroxyimino acétate G (5,4 mmol) s’est totalement transformé
en dimère 75 dont 2,2 mmol ont été isolées. Cette condition nous a cependant permis de
caractériser et d’identifier avec certitude le composé 75. Les dérivés nitro-isoxazoles 74d
et 74g apparaissent également séparables du composé secondaire 75, même difficilement.

En présence de triéthylamine, le composé p-nitrophényle 74d (Tableau 13, essai 4) est

formé avec un faible rendement de 17 %. Pour cet essai, même après 48 heures, la réaction
est encore loin d’être complète puisque l’analyse du spectre RMN 1H du brut de réaction
révèle un rapport entre le substrat alcyne résiduel et le produit attendu de 2,5 :1.
Cependant, l’excès du réactif hydroxyimino acétate G s’est totalement transformé en
composé secondaire 75.
Afin de limiter la formation du dimère 75, qui ici semble plus rapide, il a été choisi de
sélectionner une base insoluble telle que la résine Amberlyst A-21 (Tableau 13, essai 5).
Dans ces conditions hétérogènes, après addition de 2 équivalents de réactif chloro
hydroxyimine et de base, en deux fois sur 48 heures, le rendement en oxazole 74d a été
optimisé à 71 %, après simple filtration et purification sur colonne de gel de silice.

Des conditions similaires mises en œuvre avec l’alcyne m-NO2 (Tableau 13, essai 8),
donne le composé 74g avec un rendement purifié de 57 %. Ces conditions n’ont bien sûr
pas été appliquées pour les composés isoxazoles difficilement séparables du dimère 75.

122
 Tableau 13 : Conditions expérimentales pour la cycloaddition-1,3-dipolaire vers la préparation des
composés 76b-g. (a) Résine basique Amberlyst A-21 (1,3 méq./mL, 6,6 mL). (b) Addition des réactifs
(B et base) en deux fois, le second éq. rajouté après 24h à TA. (c) Composés 74 et 75 difficilement
séparables, rapport déterminé sur l’analyse du spectre RMN 1H après purification.

Solvant / 74 (/75) c
Essai Réactif A Réactif B Base
Temps (h) Rdt

74b (/75)
K2CO3
1 1 éq. DCM / 4 h (49:51)
(1 éq.)
34 %
74b (/75)
Et3N
2 1 éq. DCM / 4 h (50:50)
(1 éq.)
35 %
74c (/75)
Et3N
3 2 éq. THF /36 h (40 : 60)
(1,2 éq.)
36 %
Et3N 74d
4 1,5 éq. THF /48 h
(1,5 éq.) 17 %
Résine A-21a 74d
5 2,5 éq. THF /48 h b
(2,5 éq.) 71 %

K2CO3 74e (/75)

6 1 éq. THF /48 h
(1,2 éq.) (85:15)

Et3N 74f (/75)

7 1 éq. THF /48 h
(1.2 éq.) (80:20)

Résine A-21a 74g

8 2,5 éq. THF / 48h b
(2,5 éq.) 57 %

123
La seconde étape de réduction en présence de 4-5 équivalents de NaBH4 dans l’éthanol ou
un mélange EtOH/DCM conduit aux alcools 76b-g attendus avec de bons rendements
compris entre 70 et 85 % (Schéma 59). Comme en série fluorée 74a, pour optimiser
cette étape de réduction, les esters 74b-g ont été mis en réaction, en mélange avec le
composé 75 lorsque la purification n’a pas été optimale, et la phase de traitement a toujours
permis d’éliminer le dimère 75 à ce stade (indétectable dans les bruts réactionnels). Les
alcools 76 ont ainsi été isolés purs à ce stade et les rendements ont été ajustés selon la
proportion d’ester 74 initialement estimée dans le mélange lorsque cela s’imposait.

Schéma 59 : Synthèse des hydroxyméthyl isoxazoles 76 par réduction des esters 74.

III-1.2 Synthèse des composés ciblés analogues de 77a modifiés en partie

Ouest

Une fois les alcools 76 obtenus, ceux-ci ont été engagés dans la réaction de O-alkylation
avec l’amidothiophène 68a pour conduire à une série d’analogues de type 77a (Schéma
60). Les conditions expérimentales ont été mises en œuvre en utilisant 1 ou 2 équivalents
d’alcool 76 déprotonné avec l’hydrure de sodium (temps de réaction de 15-30 minutes)
pour former l’alcoolate correspondant, avant addition de l’alkylant iodé 68a. Les résultats
de différents essais réalisés avec les alcools 76b-g en comparaison avec 76a, pour lequel
nous avions obtenus un rendement de 25% en composé isolé, sont présentés dans le
Tableau 14.

124
Dans de nombreux cas, la RMN 1H du brut de réaction a révélé la présence d’un, voire
deux produits secondaires formés durant la réaction. Comme lors de la synthèse de 77a,
le dimère 78 est présent à chaque essai (avec un déplacement du méthylène caractéristique
du cycle dioxopipérazine à 4,45 ppm), mais nous observons aussi parfois dans certains cas
un nouveau sous-produit d’ouverture, avec un système ABX caractéristique du motif
(COCH(CN)CH2CO) à 4,96 ppm (CHCN), 3,46 ppm (CHa) et 3,10 ppm (CHb)
(Schéma 60). Malheureusement, là encore, les sous-produits 79e et 79f, et parfois 78,
sont inséparables des produits finis 77e et 77f par flash chromatographie, que ce soit en
phase normale ou en phase inverse. Ainsi les dérivés o-OMe 77e et m-F 77f n’ont-ils pas
pu être isolés purs (Tableau 14, essais 6-9), bien que les autres composés 77b-d et 77g
ont, eux, pu être purifiés avec des rendements qui restent toutefois faibles, compris entre
12% et 41%.

Schéma 60 : Réaction de O-alkylation vers les analogues 77a-g.

125
 Tableau 14 : Conditions d’alkylations des alccols 76a-f avec l’alkylant 68a
(a) Rapport estimé sur l’analyse des intégrations du spectre RMN 1H avant purification
(b) NP = non purifié

Rapport RMN 1Ha

(Rdt. purifié)
Essai Alcool NaH Temps
R 68a 79
(éq.) (éq.) (Solvant) 76 77 78

76a 1h 1
1 p-F 1 2,2 1,1 0 0
(2) (DMF) (50 %)

76b 4h 1
2 H 1 1 1 0 0
(1) (THF) (36 %)
76c 40 min 1
3 p-OMe 1,1 1,5 0 0 0
(1) (DMF) (41 %)
76d 1 h 30 0,5
4 p-NO2 1 2 1 0 0
(1) (DMF) (20 %)
76d 1 h 30 0,5
5 p-NO2 1 2 2 0 0
(2) (DMF) (21 %)
76e 2 h 30 0,78
6 m-F 1 2,2 1 0 0,39
(2) (DMF) (NP)b
2 h 30
76f
7 o-OMe 1,1 1,5 (DMF) 1 0,6 0,35 0
(1)
76f KHMDS Nuit
8 o-OMe 1,1 1 0 0 0
(1) (1,5) (DMF)
76f 1 h 15 0,2
9 o-OMe 1 2,2 1 0,1 0,25
(2) (DMF) (NP)b
76g 2 h 30 0,3
10 m-NO2 1 2,2 1 0,2 0
(2) (DMF) (12 %)

Ces résultats nous ont permis de mettre en évidence que cette O-alkylation des
hydroxyméthyl-isoxazoles 76, que l’on pouvait supposer simple avec le composé iodé 68a,
conduit à des résultats complexes et des rendements très moyens. Les difficultés pour
générer l’alcoolate et son instabilité due à la présence du motif isoxazole peuvent justifier
ces résultats.
De rares exemples de la littérature illustrent ce type de réaction parasite. Nous avons relevé
les travaux de G.D Diana et collaborateurs sur la synthèse d’analogues du Disoxaril 248
mettant en œuvre une alkylation du même type avec des agents alkylants por tant des
chaines oxygénées (Schéma 61, a). De même, dans des conditions plus drastiques D. D.

248 G. D. Diana et al. J. Med. Chem. 1993, 36, 3240-3250

126
Billadeau et al. 249 alkylent un simple dérivé hydroxyméthyl isoxazole avec le 5-bromo
valérate, avec un rendement qui reste faible de 26 % (Schéma 61, b).

Schéma 61 : Exemples d’alkylation d’hydroxyméthyl isoxazole (Extrait de D. D. Billadeau et al.249).

Dans nos conditions, l’excès d’hydrure de sodium, dans le DMF, peut également
déprotonner la fonction amide sur le réactif de départ 68a (voire même sur le produit
d’arrivé), ce qui pourrait générer potentiellement le dimère 78. Toutefois des essais de
déprotonation du composé 68a en présence de 1,2 équivalent d'hydrure de sodium pendant
2 heures à température ambiante, ou avec un large excès de base, durant une nuit, n’ont
jamais révélé la formation du dimère 78 (Schéma 62, a). Dans le premier cas le composé
iodé reste stable, tandis que dans le second cas il se dégrade totalement. Ceci laisserait
suggérer que ce n’est pas l’hydrure qui active le NH-amidique, ou que le dimère se
formerait à partir du produit d’arrivée 77, ce qui a été écarté grâce à une étude de stabilité
du composé 77a. En effet, après plusieurs heures en milieu basique NaH/DMF, le composé
77a se révèle parfaitement stable (Schéma 62, b).

249 A. P. Kozikowski et al. J. Med. Chem. 2008, 51, 4370-4373

127
 Schéma 62 : Essais de dimérisation de 68a et dégradation de 77a en milieu basique.

Dans certain cas, nous observons la formation du composé d’ouverture de l’isoxazole,

composé 80. A notre connaissance aucune référence de la littérature ne décrit ce
réarrangement à partir de l’hydroxyméthyl-isoxazole. Toutefois, cette ouverture de
l’isoxazole en milieu basique est bien connue à partir des esters ou aldéhydes
correspondants. A titre d’exemple, Pi-Tai Chou et collaborateurs 250 ont exploité cette
réaction pour générer un nouveau colorant organique à partir de l’ester isoxazole
correspondant (Schéma 63).

Schéma 63 : Ouverture des esters d’isoxazole en milieu basique.

De même, une fragmentation de dérivés isoxazoles vers des nitriles acycliques, a été
illustrée à travers les travaux de H-G Schmalz et al. dans une réaction de couplage d’un 4-
isoxazolyl boronate avec divers halogénures d’aryle 251 (Schéma 64).

250 Y-T. Li et al. Tetrahedron 2010, 66, 4223-4229

251 J. Velcicky et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 6948-695

128
 Schéma 64 : Fragmentation de 3-H isoxazoles, en milieu basique.

Pour notre part, une étude d’alkylation de l’alcool 76e, a été menée en présence d’un
agent alkylant réactif et simple, le bromure de benzyle. Ici encore, le résultat reste
complexe, puisque plusieurs composés ont été identifiés en mélange par RMN 1H et
spectrométrie de masse (Schéma 65).

Schéma 65 : Etude de l’alkylation de 76e, avec BnBr et proportions relatives des composés identifiés
RMN 1H.

129
D’autre part, lorsque l’alcool fluoré 76a est mis en milieu basique (NaH) dans le DMF
durant plus de 20 heures, nous observons sa conversion totale en composé d’ouverture
céto-nitrile correspondant, confirmée via la RMN 1H par comparaison du produit obtenu
avec le composé commercial. Nous remarquons que seule la forme cétonique est obtenue
à partir de 76a, contrairement au dérivé méta-fluoré 76e qui donne exclusivement la forme
énol (34 %, Schéma 66) quel que soit le solvant de RMN 1H (CDCl3 ou C6D6).

Schéma 66 : Etude de stabilité de l’alcool 76a en milieu basique.

Une hypothèse de formation de cet intermédiaire céto-nitrile est présentée sur le Schéma
67.

Schéma 67 : Hypothèse de formation de l’intermédiaire céto-nitrile.

Nous pouvons supposer que des phénomènes électroniques défavorisant l’ouverture de

l’isoxazole, comme un groupement donneur sur le cycle aromatique, sont susceptibles de
contrer cette réaction d’ouverture secondaire. Si on obtient effectivement un meilleur
rendement en produit p-méthoxy 77c attendu à partir de l’alcool 76c (Tableau 13, essai
4), ceci ne se confirme pas avec l’alcool o-méthoxy 76e qui conduit à un résultat plus
complexe, peut-être dû à une gêne stérique. L’absence de substituant, comme dans le cas

130
de 76b n’induit pas de réaction secondaire, dans le THF (Tableau 13, essai 4). Finalement
les effets attracteurs mésomères (NO 2) ou inductifs (F) restent complexes à analyser, mais
comme observé durant l’étude d’alkylation de 76e par le bromure de benzyle (Schéma
65), une ouverture du cycle isoxazole est aussi observée à partir des alcools 76 para ou
meta-fluorés (Tableau 13).

III-2. Vers la synthèse de l’analogue phénolique de 77h

Suspectant la présence d’une liaison hydrogène entre le fluor du composé 77a et la sérine
58 de la protéine IL-15, nous avons logiquement envisagé de préparer l’analogue phénoxy
de 77a. Celui-ci devait être accessible à partir du composé 77b, par déméthylation. Ainsi
77b a été mis en réaction en présence de BBr 3, dans le THF anhydre. La réaction évoluant
lentement, un équivalent supplémentaire de BBr 3 a été ajouté puis la réaction a été laissée
sous agitation toute la nuit. Le produit souhaité 77h n’a malheureusement pas été obtenu
alors qu’une coupure de l’éther central a été majoritairement observée conduisant à 55%
d’alcool 76c (Schéma 68).

Schéma 68 : Essais de déméthylation du composé 77c.

131
IV – Conclusion

Dans la deuxième partie de mon travail sur la recherche de ligands sélectifs, antagonistes
de l’IL-15, nous avons exploré des voies de synthèse pour préparer une petite librairie
d’analogues du hit 77a, identifiée via l’approche bio-informatique. Deux voies de synthèse
ont été explorées pour préparer ces composés, une voie stannylée linéaire qui a échouée et
une voie convergente plus classique.
Selon la seconde approche, malgré la simplicité apparente des structures ciblées, de
nombreuses difficultés ont été rencontrées, tant dans la préparation des précurseurs alcools
76, que dans l’obtention des produits finis ciblés 77.
A ce jour nous avons obtenu 7 nouveaux composés analogues du hit 77a (ci-dessous)
modifiés sur la partie Ouest (77) ou Est (83-85). Ces composés seront bientôt évalués,
comme inhibiteurs plus sélectifs de l’IL-15 dans les tests préliminaires de prolifération
cellulaire ainsi que d’inhibition de p-STAT5.

Figure 37 : Liste des 7 nouveaux composés synthétisés à partir du hit 77a.

132
Conclusions Générales et Perspectives
Les objectifs de cette thèse étaient de réduire les effets néfastes de la surexpression de l’IL-
15 via l’utilisation de petites molécules inhibitrices et sélectives du système IL-15 par
rapport à l’IL-2. Cette approche pluridisciplinaire (modélisation, criblage virtuel, synthèse
et optimisations chimiques, évaluations biologiques) s’est révélée très prometteuse. En
effet, il s'agit de la première tentative réussie de ciblage du système IL-15 par une approche
d'inhibiteurs d’ IPP qui ouvre la voie à l'identification de nouvelles classes de médicaments
thérapeutiques pour les pathologies liées à l'IL-15. Au cours de cette étude, la synthèse de
molécules potentielles inhibitrices sélectives de l’IL-15 a donc été menée. A l’issue de ces
travaux, deux familles de molécules IBI et IBIS ont été synthétisées, pharmacomodulées
puis évaluées in vitro.

A partir des inhibiteurs d'IL-15 identifiés dans la première étude SAR et sur la base des
données structurales de docking obtenues avec notre hit 1, nous avons développé deux
nouvelles séries d'inhibiteurs de l'IL-15 avec des modifications spécifiques sur les
hétérocycles N-triazole ou N-phtalazinone. Malgré l’optimisation de l’activité inhibitrice
des nouveaux analogues IBI, aucune sélectivité IL-15 vs IL-2 n’a été observée. Ainsi, vingt-
cinq composés ont été préparés et testés dans deux bio essais fonctionnels, la prolifération
cellulaire et le bio essai p-STAT5. Que ce soit dans la Série 1 ou la Série 2, nous savons
désormais que la substitution du groupement méthyle par des fonctions polaires sur
l’hétérocycle phtalazinone est délétère. En effet, les composés 59, 60 et 62 ne sont pas
capables d’inhiber la prolifération cellulaire (IL-15 dépendante) et la phosphorylation des
protéines STAT5. Comme expliqué dans la partie IV-4.2, cette observation renforce
l’idée selon laquelle il existerait une liaison hypothétique entre des résidus lipophiles tels
que l'isoleucine 68 et la leucine 69 avec le fragment N-méthyl-phtalazinone.
En revanche, les meilleurs composés ont été découverts avec la famille N-triazole modifié,
où l'azote est soit substitué par une chaîne propionaldéhyde (Série 1, composé 20, IC50 =
6 µM - Série 2, composé 35, IC50 = 710 nM), soit substitué par une chaîne carboxylique
(Série 2, composé 49, IC50 = 9,5 µM) ou libre (Série 2, composé 38, IC50 = 280 nM).
Nous avons également identifié le nouvel analogue benzophénone IBI-113 qui compte
parmi les meilleurs inhibiteurs avec une IC50 de 50 nM. D’autres modifications pourraient
peut-être améliorer l’activité inhibitrice comme décrit dans la partie V du chapitre 1,
néanmoins il y a peu d’espoir sur l’obtention d’une sélectivité significative entre IL-15 et
IL-2.

L’étude sur la nouvelle famille de molécules IBIS a posé de nombreux problèmes lors de la
synthèse du fragment isoxazole (partie Ouest). Deux voies principales s’offrent à nous pour
obtenir ce motif isoxazole souhaité. La première est celle que nous avons choisis, engage
une réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire entre le chlorohydroxyimino acétate G et un
dérivé acétylénique arylique. La seconde permet d’obtenir le même motif à partir d’une
aryl méthylcétone et de l’oxalate d’éthyle. Il serait sûrement intéressant d’explorer cette

133
voie que nous n’avons pas investigué, afin de contourner les problèmes rencontrés avec les
réactions de cycloaddition-1,3-dipolaire. De meilleures conditions pourraient obtenues, et
qui permettraient de synthétiser un large panel d’analogues plus facilement.
La voie stannylé mériterait plus de temps et de patience, je pense que la synthèse de
l’intermédiaire stannylé 73 pouvait être une des solutions alternatives. En effet, le couplage
de Stille peut pallier les problèmes de fonctionnalisation de l’isoxazole en introduisant plus
facilement de la diversité au niveau des groupements aryles mais également plus
rapidement, car cette réaction arrive en dernière étape. La dernière possibilité pourrait
éventuellement de s’inspirer directement de la publication de F. Li et al. 237 pour obtenir le
composé bromé J (Schéma 46, page 109) afin d’effectuer un couplage de Suzuki en
dernière étape, après avoir réalisé la O-alkylation.

Bien que de nombreux verrous synthétiques nous ont ralenti dans l’accomplissement des
synthèses et des modulations souhaitées pour obtenir les structures chimiques adéquates
pour valider ou non notre modèle, ce travail de recherche et d’investigation ne représente
qu’un début. Il permettra, par la suite, de découvrir la (les) molécule(s) qui
déverrouilleront l’inhibition sélective recherchée. Ces travaux auront permis remplir une
partie de l’objectif souhaité : Nous avons réussi à obtenir des molécules avec des activités
honorables sur IL-15 mais avec la même activité sur le système IL-2. Néanmoins, ces
molécules sont revalorisables dans le cas de pathologies différentes, notamment dans le cas
de certaines leucémies où les deux cytokines, IL-15 et IL-2, doivent être inhibées.

134
135
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144
4

Experimental Part
General considerations:

All solvents used were reagent grade and TLC was performed on silica-dovered aluminum sheets
(Kieselgel 60F254, MERCK). Eluted TLC was revealed using UV radiation ( = 254 nm), or
molybdate solution. Flash column chromatography was performed on silica gel 60 ACC 40 -63 µm
(SDS-CarloErba). NMR spectra were recorded on an Avance I 300 MHz Bruker, on an Avance III
400 MHz Bruker and an Avance III 500 MHz Bruker 500 at room temperature, on samples
dissolved in an appropriate deuterated solvent. References of tetramethylsilane (TMS) for 1H and
deuterated solvent signal for 13C were used. Chemical displacement values () are expressed in parts
per million (ppm) and coupling constants (J) in Hertz (Hz). High-Resolution Mass Spectrometry
(HRMS in Da unit) analyses were recorded on a Xevo-Q-Tof Waters in the CEISAM Laboratory
(AMaCC platform, Nantes) or on a LC-Q-TOF (Synapt-G2 HDMS, Waters) in the IRS-UN center
(Mass Spectrometry platform, Nantes).

145
 ((E)-3-oxo-1,3-dihydroidobenzofuran-1-ylidene)acetate (3)

Ethyl (triphenylphosphoranylidene)acetate (9.59 g, 27.5 mmol, 1.1 eq.) was added portionwise for
10 mi to a suspension of phthalic anhydride (3.71 g, 25 mmol, 1 eq.) in toluene (150 mL). Once
completion of the addition, the stirring was maintained for 3 hours at 20 °C then the mixture was
refluxed for 1 hour until formation of a dark red solution. The mixture was concentrated in vacuum
at 40 °C. The residue was dissolved in DCM, adsorbed on silica to be eluted with DCM. The pure
product 3 was finally obtained as a white powder (4.81 g, 22 mmol, 88 %).
Only the E-isomer was isolated.

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
9.01 (dt, J = 8 Hz, J = 0.9 Hz, 1H, HAr), 7.93 (ddd, J = 7.7 Hz, J = 1.2 Hz, 1H, HAr), 7.78 (ddd, J
= 8.6 Hz, J = 7.4 Hz, J =1.2, 1H, HAr), 7.67 (ddd, J = 7.4 Hz, J = 7.4 Hz, J = 0.9 Hz, 1H, HAr),
6.10 (s, 1H, CH), 4.27 (q, J = 7.1 Hz, 2H, CH2), 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
165.7 (CO lactone), 165.6 (CO ester), 157.9 (CIV), 136.2 (CIV), 135.3 (CHAr), 132.5 (CHAr), 128.3
(CHAr), 126.6 (CIV), 125.4 (CHAr), 102.5 (CH), 61.0 (CH2), 14.3 (CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C12H11O 4 [M+H]+ 219.0652, found: 219.0644.

146
2-(3-methyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)acetohydrazide (5)

To a 1 M solution of 3 (2.83 g, 13 mmol, 1 eq.) in EtOH (15 mL), was added methylhydrazine
dropwise (0.68 mL, 13 mmol, 1 eq.). The mixture was then stirred for 30 minutes, and hydrazine
monohydrate was added dropwise (3.8 mL, 78 mmol, 6 eq.). The solution was then heated at reflux
for 3 hours and the resulting suspension was cooled to 20° C and filtered. The resulting white
powder was washed with Et 2O. The product 5 was obtained as a white powder (2.85 g, 12.3 mmol,
94 %) and directly used in the next step without further purification.

1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6)  (ppm):
9.36 (bs, 1H, NH), 8.28 (d, J = 7.6 Hz, 1H, HAr), 7.92 (m, J = 3.6 Hz, 2H, 2 x HAr), 7.85 (m, J =
4.3 Hz, HAr), 4.27 (bs, 2H, NH2), 3.77 (s, 2H, CH2), 3.70 (s, 3H, CH3).

13
C NMR (75 MHz in DMSO-d6)  (ppm):
167.77 (CO hydrazide), 158.44 (CO), 141.62 (CN), 133.08 (CHAr), 131.70 (CHAr), 129.37 (CIV),
127.65 (CIV), 125.97 (CHAr), 125.72 (CHAr), 38.79 (CH3), 37.54 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C11H13N4O 2 [M+H]+ 233.1033, found: 233.1035.

147
4-((5-mercapto-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-yl)methyl)-2-methylphthalazin-1(2H)-one (2)

To a suspension of hydrazide 5 (2.76 g, 11.9 mmol, 1 eq.) in EtOH (28 mL) was added methyl
isothiocyanate (4.34 g, 60 mmol, 5 eq.), triethylamine (8.3 mL, 60 mmol, 5 eq.) and the reaction
mixture was heated to reflux under vigorous stirring for 8 hours. The resulting suspension was
cooled to 20 °C and filtered. The resulting powder was washed with Et2O. The product 2 was
finally obtained as a yellowish solid (3.35 g, 11.7 mmol, 98 %) and can be used in the next step
without further purification.

1
H NMR (400 MHz in DMSO-d6)  (ppm):
13.56 (bs, 1H, SH), 8.30 (m, 1H, HAr phthal), 7.97-7.84 (m, 3H, 3 x HAr phthal), 4.51 (s, 2H,
CH2), 3.67 (s, 3H, NCH3 phthal), 3.49 (s, 3H, NCH3 triazole).

13
C NMR (100 MHz in DMSO-d6)  (ppm):
166.9 (CN(SH)), 158.4 (CO), 149.6 (CN triazole), 140.3 (CN phthal), 133.2 (CHAr), 131.9
(CHAr), 128.7 (C-SH), 127.1 (CIV), 126.0 (CHAr), 125.6 (CHAr), 39.0 (CH3 phthal), 30.2 (CH3
triazole), 28.3 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C13H14N5OS [M+H]+ 288.09136, found 288.09189.

148
2-(2-(2-chloroethoxy)ethoxy)acetic acid (15)

A 1.5 M solution of sulfuric acid (60 mL) containing chromium VI oxide (5.71 g, 57.1 mmol, 5.7
eq.) was added dropwise to a solution of 2-(2-(2-chloroethoxy)ethoxy)ethan-1-ol (1.69 g, 10 mmol,
1 eq.) in acetone (50 mL) at 0 °C. Upon complete addition of the alcohol, the solution was allowed
to warm up and stirred for 36 hours at room temperature. The reaction was quenched by addition
of iPrOH until the solution turned to dark green. Inorganic chromium salts were removed by
filtration on celite. The solution was concentrated under reduced pressure. The residue was added
water and DCM to extract the product. After filtration and concentration under reduced pressure
the product 15 was obtained as a dark blue oil (843 mg, 4.62 mmol, 46 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
4.19 (s, 2H, CH2CO2H), 3.86–3.75 (m, 4H, OCH2CH2O), 3.75–3.70 (m, 2H, OCH2), 3.70–3.61
(m, 2H, ClCH2).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3)  (ppm):
173.08 (CO2H), 71.54 (CH2), 71.30 (CH2), 70.52 (CH2), 68.65 (CH2CO2H), 42.67 (ClCH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C6H11O 4ClNa [M+Na]+ 205.0250; found 205.0244.

149
2-(2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy)ethyl 4-methylbenzenesulfonate (16)

To a solution of 3,6,9,12-tetraoxatetradecane-1,14-diol (600 mg, 2.52 mmol, 1 eq.) in DCM (20

mL) was added Ag2O (963 mg, 4.15 mmol, 1.65 eq.) and KI (96 mg, 0.580 mmol, 0.2 eq.). The
reaction mixture was allowed to stir for 5 minutes. Para-toluenesulfonyl chloride (475 mg, 2.5
mmol, 0.99 eq.) was added and the mixture stirred at 0 °C for 6 hours. The reaction mixture was
then filtered through a small pad of silica gel using DCM/MeOH 95:5. The solvent was evaporated,
and the residue purified by flash chromatography (DCM/MeOH, 95:5) to afford 16 as a colorless
oil (655 mg, 1.67 mmol, 66 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
7.85 –7.66 (m, 2H, 2 x HAr), 7.39 – 7.29 (m, 2H, 2 x HAr), 4.20 – 4.11 (m, 2H, CH2OTs), 3.77 –
3.50 (m, 18H, 9 x OCH2), 2.44 (s, 3H, CH3).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3)  (ppm):
144.93 (CIV-CH3), 133.22 (CIV-SO3), 129.97 (2 x CHAr), 128.14 (2 x CHAr), 72.65 (OCH2), 70.91
(OCH2), 70.75 (2 OCH2), 70.70 (OCH2), 70.67 (OCH2), 70.49 (OCH2), 69.38 (CH2OTs), 68.85
(CH2-CH2OTs), 61.90 (HOCH2), 21.78 (CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C17H28O 8SNa [M+Na]+ 415.1404, found 415.1403.

150
14-(tosyloxy)-3,6,9,12-tetraoxatetradecanoic acid (14a)

A 1.5 M solution of sulfuric acid (12 mL) containing chromium VI oxide (1 g, 10.01 mmol, 6 eq.)
was added dropwise to a solution of alcohol 16 (655 mg, 1.27 mmol, 1 eq.) in acetone (6 mL) at 0
°C. Upon complete addition of 16, the solution was allowed to warm up and stirred at room
temperature for 20 hours. The reaction was quenched by addition of iPrOH. The solution was
allowed to stir until the solution turned to blue/dark green. The flask was cooled with an ice bath
for 5 minutes, then inorganic chromium salts were removed by filtration. Inorganic chromium salts
were removed by filtration on celite. The filtrate was dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated
under reduced pressure to give 14a as a colorless viscous oil (600 mg, 1,48 mmol, 88%).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
7.89–7.71 (m, 2H, 2 x CHAr), 7.44–7.30 (m, 2H, 2 x CHAr), 4.17 (m, 2H, CH2OTs), 4.14 (s, 2H,
CH2CO2H), 3.80–3.48 (m, 14H, 7 x CH2), 2.45 (s, 3H, CH3).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3)  (ppm):
171.69 (CO2H), 144.98 (CIV), 133.16 (CIVS), 130.00 (2 x CHAr), 128.14 (2 x CHAr), 71.74 (OCH2),
70.96 (OCH2), 70.85 (OCH2), 70.56 (OCH2), 70.49 (OCH2), 70.26 (OCH2), 69.36 (CH2OTs),
69.22 (CH2CO2H), 68.85 (OCH2), 21.79 (CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C17H26O 9SNa [M+Na]+ 429.1186, found 429.1195.

151
2-(2-(2-chloroethoxy)ethoxy)-N -(2,4-dichlorophenyl)acetamide (12a)

To a solution of acid 15 (430 mg, 2.35 mmol, 1 eq.) in DCM (12 mL), oxalyl chloride (0.492 mL,
5.75 mmol, 2.44 eq.) and drops of DMF were added at 0 °C. Once addition was complete, the
resulting yellow solution was stirred vigorously. Upon full conversion, the reaction mixture was
concentrated under reduced pressure to remove all the oxalyl chloride remaining. A solution of
2,4-dichloroaniline (389 mg, 2.4 mmol, 1.02 eq.) and triethylamine (0.36 mL, 2.6 mmol, 1.10 eq.)
in DCM were then added portion wise to the solution. The resulting mixture was stirred 6 hours
then concentrated under reduced pressure. The residue was solubilized in AcOEt and triethylamine
salts were removed by filtration. The organic layer was washed with brine, dried over Na 2SO 4,
filtrated and concentrated. The resulting crude was purified by flash chromatography
(cyclohexane/AcOEt, 80:20) to recover 12a as a brown oil (383 mg, 1.17 mmol, 49 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
8.98 (s, 1H, NH), 8.38 (d, J = 8.9 Hz, 1H, HAr), 7.40 (d, J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 7.26 (dd, J = 8.9, 2.4
Hz, 1H, CHAr), 4.18 (s, 2H, NHCOCH2), 3.84–3.72 (m, 6H, 3 x CH2), 3.67–3.56 (m, 2H, ClCH2).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3)  (ppm):
168.07 (HNCO), 133.01 (HNCOCIV), 129.55 (ClCIV), 129.01 (CHAr), 128.06 (CHAr), 123.94
(ClCIV), 122.40 (CHAr), 71.68 (OCH2), 71.46 (OCH2), 71.15 (HNCOCH2), 70.64 (OCH2), 42.78
(ClCH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C12H14NO 3Cl3Na [M+Na]+ 347.9925, found 347.9937.

152
14-((2,4-dichlorophenyl)amino)-14-oxo-3,6,9,12-tetraoxatetradecyl-4-
methylbenzenesulfonate (17)

To a solution acid 14a (270 mg, 0.664 mmol, 1 eq.) in DCM (12 mL), oxalyl chloride (0.12 mL,
1.33 mmol, 2 eq.) and drops of DMF were added at 0 °C. Once addition was complete, the resulting
yellow solution was stirred vigorously. Upon full conversion, the reaction mixture was concentrated
under reduced pressure to remove all the oxalyl chloride remaining. A solution of 2,4-
dichloroaniline (118 mg, 0.73 mmol, 1.1 eq.) and triethylamine (0.185 mL, 1.33 mmol, 2 eq.) in
DCM were then added portion wise to the solution. The resulting mixture was stirred overnight
then concentrated under reduced pressure. The mixture was added silica gel, concentrated under
reduced pressure, then purified by column chromatography on silica gel (cyclohexane/AcOEt,
80:20) to recover 17 as a yellow oil (190 mg, 0.345 mmol, 52 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
9.00 (s, 1H, NH), 8.36 (d, J = 8.9 Hz, 1H, HAr dichloro), 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 2H, 2 x HAr OTs),
7.38 (d, J = 2.4 Hz, 1H, HAr dichloro), 7.36–7.29 (m, 2H, 2 x HAr OTs), 7.28–7.21 (m, 1H, HAr
dichloro), 4.16 (s, 2H, HNCOCH2), 4.17–4.11 (m, 2H, CH2OTs), 3.83–3.77 (m, 2H, OCH2),
3.76–3.71 (m, 2H, OCH2), 3.69–3.64 (m, 4H, 2 x OCH2), 3.63–3.59 (m, 2H, OCH2), 3.56 (s, 4H,
2 x OCH2), 2.43 (s, 3H, CH3).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3)  (ppm):
168.26 (HNCO), 144.91 (CIVOTs), 133.23 (SCIV), 133.07 (HNCOCIV), 129.94 (2 x CHArOTs),
129.48 (CHAr dichloro), 128.97 (CHAr dichloro), 128.10 (2 x CHAr OTs), 128.00 (ClCIV), 124.00
(ClCIV), 122.44 (CHAr dichloro), 71.56 (OCH2), 71.06 (HNCOCH2), 70.89 (OCH2), 70.79
(OCH2), 70.67 (OCH2), 70.61 (OCH2), 69.33 (CH2OTs), 68.85 (OCH2), 21.75 (CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C23H28NO 8SCl2 [M-H]- 548.0913, found 548.0911.

153
N-(2,4-dichlorophenyl)-2-(2-(2-iodoethoxy)ethoxy)acetamide (12b)

In a microwave tube, chloro compound 12a (75 mg, 0.230 mmol, 1 eq.) and NaI (172 mg, 1.15
mmol, 5 eq.) were solubilized in acetone (8 mL) and heated at reflux during 2 hours in microwave.
The mixture was concentrated under reduced pressure and solubilized in DCM. The resulting
solution was filtrated to remove the NaI and NaCl salts, dried over Na 2SO 4 and concentrated to
give 12b as a white-off paste (80 mg, 0.191 mmol, 83 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
8.97 (s, 1H, NH), 8.38 (d, J = 8.9 Hz, 1H, HAr), 7.40 (d, J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 7.26 (dd, J = 8.9,
2.4 Hz, 1H, HAr), 4.19 (s, 2H, HNCOCH2), 3.94 – 3.69 (m, 6H, 3 x OCH2), 3.25 (t, J = 6.7 Hz,
2H, ICH2).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
168.07 (HNCO), 133.02 (HNCOCIV), 129.57 (ClCIV), 129.02 (CHAr), 128.07 (CHAr), 123.95
(ClCIV), 122.43 (CHAr), 72.24 (OCH2), 71.48 (OCH2), 71.21 (HNCOCH2), 70.17 (ICH2CH2),
2.46 (ICH2).

HRMS (ES+):
m/z calculated for C12H14NO 3Cl2INa [M+Na]+ 439.9287, found 439.9293

154
N-(2,4-dichlorophenyl)-14-iodo-3,6,9,12-tetraoxatetradecanamide (14b)

NaI (64 mg, 0.427 mmol, 5 eq.) was added to the solution of acetone (4 mL) containing the tosyl
compound 14a (47 mg, 0.085 mmol, 1 eq.). The middle was allowed to stir at reflux for 1.5 hours,
then cooled down to room temperature. Remaining salts were filtered, and the filtrate was
concentrated under reduced pressure thus diluted in DCM. The middle was dried over, filtered and
concentrated to give the 14b as a yellow oil. (43 mg, quant.)

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.98 (s, 1H, NH), 8.34 (d, J = 9 Hz, 1H, HAr), 7.38 (d, J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 7.25 (dd, J = 9 Hz,
2.4 Hz, 1H, HAr), 4.18 (s, 2H, COCH2), 3.82-3.77 (m, 2H, OCH2,), 3.76-2.36 (m, 12H, 6 x CH2),
3.24 (t, 2H, J = 7.2 Hz, 1H, ICH2).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):
168.13 (HNCO), 132.77 (HNCOCIV), 129.36 (ClCIV), 128.80 (CHAr), 127.82 (CHAr), 123.90
(ClCIV), 122.35 (CHAr), 71.91 (OCH2), 71.28 (OCH2), 70.81 (COCH2), 70.66 (OCH2), 70.56
(OCH2), 70.49 (OCH2), 70.36 (OCH2), 70.08 (OCH2), 2.40 (ICH2).

HRMS (ES+)
m/z calculated for C16H22NO 5Cl2I [M+Na]+ 527.9817, found 527.9814

155
N-(2,4-dichlorophenyl)-2-(2-(2-((4-methyl-5-((3-methyl-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-
yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)ethoxy)ethoxy)acetamide (11)

DMF was added to a flask charged with mercapto-triazole 2, (50 mg, 0.174 mmol, 1 eq.), iodo
alkylamide 12b, (87.3 mg, 0.208 mmol, 1.2 eq.) and K2CO 3 (36 mg, 0.261 mmol, 1.5 eq.). The
stirring was maintained at room temperature over the weekend. The resulting yellow solution was
added AcOEt, washed with water, brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under
reduced pressure. The resulting crude was purified by column chromatography on silica gel
(DCM/MeOH, 95:5) to afford 11 as a colorless paste (95 mg, 0.164 mmol, 94 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
8.96 (s, 1H, NH), 8.44 (d, J = 7.2 Hz, 1H, CHAr phthal), 8.36 (d, J = 8.9 Hz, 1H, CHAr), 8.23 (d,
J = 8.0 Hz, 1H, CHAr phthal), 7.90–7.70 (m, 2H, 2 x CHAr phthal), 7.37 (d, J = 2.3 Hz, 1H, CHAr),
7.26–7.21 (m, 1H, CHAr), 4.47 (s, 2H, CH2), 4.15 (s, 2H, HNCOCH2), 3.85 (t, J = 6.1 Hz, 2H,
OCH2), 3.81 (s, 3H, NCH3 phthal), 3.80–3.73 (m, 2H, OCH2), 3.75–3.68 (m, 2H, OCH2), 3.52
(s, 3H, NCH3 triazole), 3.41 (t, J = 6.1 Hz, 2H, SCH2).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3)  (ppm):
168.16 (HNCO), 159.59 (CO), 152.19 (SCIV), 151.66 (CIV triazole), 140.78 (CIV triazole), 133.47
(CHAr phthal), 133.06 (HNCOCIV), 132.00 (CHAr phthal), 129.53 (CHAr), 129.14 (ClCIV), 128.99
(CHAr), 128.03 (CIV), 127.25 (CHAr phthal), 125.40 (CHAr phthal), 123.99 (ClCIV), 122.42 (CHAr),
71.41 (OCH2), 71.18 (HNCOCH2), 70.40 (OCH2), 69.87 (OCH2), 39.54 (NCH3 phthal), 32.47
(SCH2), 30.69 (NCH3 triazole), 30.17 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C25H27N6O 4SCl2 [M+H]+ 577.1197, found 577.1192.

156
N-(2,4-dichlorophenyl)-14-((4-methyl-5-((3-methyl-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-
yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)-3,6,9,12-tetraoxatetradecanamid (13)

Mercapto triazole 2 (22.5 mg, 0.078 mmol, 1 eq.), iodo compound 14b (39 mg, 0.078 mmol, 1 eq.)
and K2CO 3 (16.2 mg, 0.117 mmol, 1.5 eq.) were dissolved in DMF (5 mL) and the mixture was
allowed to stir 5 hours at room temperature. The resulting mixture was diluted in AcOEt (20 mL),
washed with brine, extracted with AcOEt, dried over Na 2SO 4 and concentrated under reduced
pressure. The crude was purified by flash chromatography (DCM/MeOH, 98:2) and gave 13 as a
colorless oil (20 mg, 0.030 mmol, 38 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3)  (ppm):
8.99 (s, 1H, NH), 8.47–8.40 (m, 1H, CHAr phthal), 8.34 (d, J = 8.8 Hz, 1H, CHAr), 8.30–8.16 (m,
1H, CHAr phthal), 7.92–7.62 (m, 2H, 2 x CHAr phthal), 7.37 (d, J = 2.4 Hz, 1H, CHAr), 7.25–7.20
(m, 1H, CHAr), 4.46 (s, 2H, CH2), 4.15 (s, 2H, COCH2), 3.80 (s, 3H, NCH3 phthal), 3.79–3.75
(m, 4H, 2 x OCH2), 3.75–3.69 (m, 2H, OCH2), 3.67–3.63 (m, 2H, OCH2), 3.63–3.59 (m, 2H,
OCH2), 3.59–3.56 (m, 4H, 2 x OCH2), 3.55 (s, 3H, NCH3 triazole), 3.38 (t, J = 6.2 Hz, 2H, SCH2).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3)  (ppm):
168.23 (HNCO), 159.57 (CO), 152.14 (SCIV), 151.67 (CIV), 140.81 (CIV), 133.44 (CHAr phthal),
133.05 (HNCOCIV), 131.97 (CHAr phthal), 129.49 (CHAr), 129.11 (ClCIV), 128.97 (CHAr), 128.00
(CIV), 127.20 (CHAr phthal), 125.38 (CHAr phthal), 124.00 (ClCIV), 122.45 (CHAr), 71.56 (OCH2),
71.07 (HNCOCH2), 70.91 (OCH2), 70.75 (OCH2), 70.66 (OCH2), 70.60 (OCH2), 70.43 (OCH2),
69.73 (OCH2), 39.51 (NCH3 phthal), 32.66 (SCH2), 30.73 (NCH3 triazole), 30.16 (CH2).

HRMS (ESI-):
m/z calculated for C29H33Cl2N6O 6S [M+H]+ 663.1556, found 663.1559.

157
1,1-diethoxy-3-isothiocyanatopropane (18)

To a solution of 3,3-diethoxypropan-1-amine (1.78 mL, 11 mmol, 1 eq.) and anhydrous

triethylamine (5 mL, 33 mmol, 3.3 eq.) in THF (10 mL) at 0 °C was added CS2 (0.66 mL, 11 mmol,
1 eq.) over a period of 30 minutes and then stirred at 2 hours at room temperature. The mixture
was cooled to 0 °C before tosyl chloride (2.3 g, 12.1 mmol, 1.1 eq.) was added and the reaction
mixture was stirred at 30 minutes up to room temperature. 1 N HCl (10 mL) and t-butyl methyl
ether (10 mL) were added to the mixture. The aqueous layer was extracted with t-butyl methyl ether
(10 mL) and the combined organic layers dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated. The crude
oil was purified by flash chromatography (PE/AcOEt, 98:2 to 96:4) to afford 18 as a colorless oil
(1.83 g, 9.68 mmol, 88 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
4.61 (t, 3J = 5.5 Hz, 1H, CH), 3.73-3.46 (m, 6H, NCH2, 2 x OCH2), 2.01-1.93 (m, 2H, CH2), 1.21
(t, 3J = 7.0 Hz, 6H, 2 x CH3).

13
C NMR (75MHz, CDCl3) δ (ppm):
130.2 (SCN), 100.2 (CH), 62.4 (OCH2), 41.3 (CH2), 34.2 (CH2), 15.4 (2 x CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C8H15NO 2NaS [M+Na]+ 212.0716, found 212.0709.

158
4-((4-(3,3-diethoxypropyl)-5-mercapto-4H-1,2,4-triazol-3-yl)methyl)-2-methylphthalazin-
1(2 H)-one (19)

To a suspension of hydrazide 2 (190 mg, 0.82 mmol, 1 eq.) in anhydrous ethanol (4 mL) at room
temperature under argon atmosphere was added isothiocyanate 18 (155 mg, 0.82 mmol, 1 eq.)
followed by triethylamine (0.57 mL, 4.1 mmol, 5 eq.). The mixture was refluxed overnight under
argon atmosphere. After completion of the reaction, the mixture was allowed to cool to room
temperature, concentrated, and directly purified by flash column chromatography on silica gel
(DCM/AcOEt, 50:50) to afford the desired product 19 as a white powder (265 mg, 0.66 mmol,
80 %).

1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
13.55 (s, 1H, SH), 8.34-8.26 (m, 1H, HAr phthal), 8.05-7.98 (m, 1H, HAr phthal), 7.96-7.84 (m, 2H,
HAr phthal), 4.57 (t, 3J = 5.1 Hz, 1H, CH), 4.52 (s, 2H, CH2), 4.01 (m, 2H, NCH2), 3.67 (s, 3H,
NCH3), 3.58-3.47 (m, 2H, OCH2), 3.43-3.35 (m, 2H, OCH2), 2.04-1.95 (m, 2H, NCH2CH2), 1.02
(t, 3J = 7.0 Hz, 6H, 2 x CH2CH3).

13
C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
166.6 (CIVC=N), 158.4 (CO), 149.3 (CIV-C=N), 140.6 (CIV-C=N), 133.2 (CHAr phthal), 132.0 (CHAr
phthal), 128.8 (CIV), 127.1 (CIV), 126.1 (CHar-Phthal), 125.6 (CHar-Phthal), 100.0 (CH), 60.6 (2
x CH2CH3), 39.6 (NCH2), 38.8 (NCH3), 30.7 (NCH2CH2), 28.8 (CH2), 15.1 (2 x CH2CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C19H25N5NaO 3S [M+Na]+ 426.1570, found 426.1566.

159
 N-(2,4-dichlorophenyl)-2-((4-(3,3-diethoxypropyl)-5-((3-methyl-4-oxo-3,4-
dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)acetamide (20)

To a solution of thiol 19 (230 mg, 0.57 mmol, 1 eq.) in DMF (10 mL) under argon atmosphere at
room temperature was added K 2CO 3 (118 mg, 0.86 mmol, 1.5 eq.) and a solution of α-
bromoamide 6 (177 mg, 0.63 mmol, 1.1 eq.) in DMF (1 mL) was added. The mixture was then
stirred at room temperature for 1 hour until completion. A saturated solution of ammonium
chloride was added, and the product was extracted AcOEt. The organic layer was washed several
times with brine, dried over Na 2SO 4 and concentrated. The crude product was purified by flash
column chromatography on silica gel (DCM/MeOH, 98:2) to afford the desired compound 20 as
a white powder (318 mg, 0.55 mmol, 96 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
10.13 (s, 1H, NH), 8.50-8.39 (m, 1H, HAr Phthal), 8.26-8.15 (m, 2H, HAr Phthal, Har), 7.85-7.73
(m, 2H, 2 x HAr Phthal), 7.30 (d, 4J = 2.3 Hz, 1H, Har), 7.18 (dd, 3J = 8.9 Hz, 4J = 2.3 Hz, 1H, Har),
4.54 (s, 2H, CH2), 4.50 (t, 3J = 4.8 Hz, 1H, CH), 4.13-4.01 (m, 4H, NCH2, SCH2), 3.80 (s, 3H,
NCH3), 3.66-3.54 (m, 2H, 2 x OCH2), 3.49-3.38 (m, 2H, 2 x OCH2), 2.02-1.88 (m, 2H,
NCH2CH2), 1.15 (t, 3J = 7.0 Hz, 6H, 2 x CH3).

13
C NMR (75MHz, CDCl3) δ (ppm):
167.3 (CO), 159.5 (CO), 152.9 (CIV-C=N), 151.5 (CIV-C=N), 140.9 (CIV-C=N), 134.0 (CIV), 133.4 (CAr
Phthal), 132.0 (CAr Phthal), 129.5 (CIV), 129.1 (CIV, CAr), 128.0 (CIV), 127.5 (CAr), 127.3 (CAr
Phthal), 125.2 (CAr Phthal), 124.8 (CIV), 123.2 (CAr), 100.1 (CH), 62.1 (2 x CH2), 40.1 (NCH2),
39.5 (NCH3), 36.0 (SCH2), 33.1 (NCH2CH2), 29.9 (CH2), 15.3 (2 x CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C27H31Cl2N6O 4S [M+H]+ 605.1499, found 605.1503.

160
N-(2,4-dichlorophenyl)-2-((5-((3-methyl-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4-(3-
oxopropyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)acetamide (21)

To a solution of ketal 20 (100 mg, 0.17 mmol, 1 eq.) in THF (5 mL) at room temperature was
added a 1 N solution of hydrochloric acid (33 % v/v). The mixture was stirred 2 h at 40 °C and
quenched by addition of a saturated solution of Na 2CO 3 until pH 7. The product was extracted
with DCM. The organic layers were combined, washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and
concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by flash column
chromatography on silica gel (DCM/MeOH, 97:3) to afford the desired compound 21 as a white
powder (64 mg, 0.12 mmol, 71 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
9.97 (s, 1H, NH), 9.77 (s, 1H, CHO), 8.47-8.42 (m, 1H, HAr Phthal), 8.23-8.16 (m, 2H, HAr Phthal,
Har), 7.86-7.75 (m, 2H, HAr Phthal), 7.31 (d, 4J = 2.4 Hz, 1H, Har), 7.19 (dd, 3J = 8.9 Hz, 4J = 2.4
Hz, 1H, Har), 4.62 (s, 2H, CH2), 4.30 (t, 3J = 7.0 Hz, 2H, NCH2), 4.05 (s, 2H, SCH2), 3.76 (s, 3H,
NCH3), 2.88 (t, 3J = 7.0 Hz, 2H, NCH2CH2).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):
197.9 (CHO), 166.9 (CONH), 159.5 (C=O), 153.0 (CIV-C=N), 151.3 (CIV-C=N), 140.9 (CIV-C=N), 133.9
(CIV), 133.5 (CHAr Phthal), 132.2 (CHAr Phthal), 129.6 (CIV), 129.1 (CHar), 129.0 (CIV), 128.0 (CIV),
127.6 (CHAr), 127.4 (CHAr Phthal), 125.2 (CHAr Phthal), 124.8 (CIV), 123.2 (CHAr), 42.6 (NCH2),
39.5 (NCH3), 37.6 (NCH2CH2), 36.1 (SCH2), 30.0 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C23H21Cl2N6O 3S [M+H]+ 531.0773, found 531.0784.

161
N-(2,4-dichlorophenyl)-2-((4-(3-hydroxypropyl)-5-((3-methyl-4-oxo-3,4-
dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)acetamide (22)

To a solution of aldehyde 21 (80 mg, 0.15 mmol, 1 eq.) in ethanol (5 mL) at 0 °C was added
sodium borohydride (3.2 mg, 0.085 mmol, 0.5 eq.). After stirring 1 h at 0 °C, the mixture was
quenched by addition of a saturated solution of ammonium chloride. The volatiles were removed,
the crude was diluted in DCM, washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated
under reduced pressure. The crude product was purified by flash column chromatography on
silica gel (DCM/MeOH, 100:0 to 95:5) to afford the desired alcohol 22 as a white powder (60.9
mg, 0.110 mmol, 67 %).

1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
9.97 (s, 1H, NH), 8.31-8.27 (m, 1H, HAr Phthal), 8.05-8.01 (m, 1H, HAr Phthal), 7.92-7.83 (m, 2H,
HAr Phthal), 7.79 (d, 3J = 8.8 Hz, 1H, HAr), 7.63 (d, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 7.39 (dd, 3J = 8.8 Hz, 4J
= 2.4 Hz, 1H, HAr), 4.68 (t, 3J = 4.9 Hz, 1H, OH), 4.55 (s, 2H, CH2), 4.16 (s, 2H, SCH2), 4.09 (t,
3
J = 7.4 Hz, 2H, NCH2), 3.67 (s, 3H, NCH3), 3.45-3.39 (m, 2H, CH2OH), 1.82-1.74 (m, 2H,
NCH2CH2).

13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
166.6 (CO), 158.3 (CO), 152.7 (CIV-C=N), 149.2 (CIV-C=N), 141.3 (CIV-C=N), 133.8 (CIV), 133.1 (CHAr
Phthal), 131.8 (CHAr Phthal), 129.3 (CIV), 128.9 (CHAr), 128.8 (CIV), 127.6 (CHAr), 127.1 (CIV),
126.5 (CIV), 126.0 (CHAr, CHAr Phthal), 125.7 (CHAr Phthal), 57.5 (CH2OH), 41.2 (NCH2), 38.8
(NCH3), 36.8 (SCH2), 32.1 (NCH2CH2), 28.6 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C23H23O 3N6Cl2S [M+H]+ 533.0924, found 533.0919.

162
3-(3-((2-((2,4-dichlorophenyl)amino)-2-oxoethyl)thio)-5-((3-methyl-4-oxo-3,4-
dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-4-yl)propanoic acid (23)

To a solution of aldehyde 21 (80 mg, 0.15 mmol, 1 eq.) in a mixture of tert-butanol/water (3:1, 8
mL) at room temperature was added 2-methyl-2-butene (0.8 mL, 7.5 mmol, 50 eq.), followed by
NaH2PO 4 dihydrate (235 mg, 1.5 mmol, 10 eq.). The mixture was stirred 20 minutes before sodium
chlorite (61 mg, 0.68 mmol, 4.5 eq.) was added. The mixture was stirred 2 h at room temperature
and ethyl acetate was added followed by an aqueous 1N HCl solution. The aqueous layer was
extracted with ethyl acetate. The organic layers were combined and washed with brine, dried ov er
Na 2SO 4 and concentrated to obtain the desired compound 23 as a white solid (0.09 mmol, 49 mg,
60%).

1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
9.97 (s, 1H, NH), 8.31-8.26 (m, 1H, HAr Phthal), 8.05-8.00 (m, 1H, HAr Phthal), 7.91-7.82 (m, 2H,
HAr Phthal), 7.75 (d, 3J = 8.8 Hz, 1H, HAr), 7.62 (d, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 7.38 (dd, 3J = 8.8 Hz, 4J
= 2.4 Hz, 1H, HAr), 4.60 (s, 2H, CH2), 4.26 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, NCH2), 4.14 (s, 2H, SCH2), 3.65
(s, 3H, NCH3), 2.70 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, NCH2CH2).

13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
171.8 (CO), 166.6 (CO), 158.4 (CO), 152.7 (CIV-C=N), 149.2 (CIV-C=N), 141.4 (CIV-C=N), 133.8 (CIV),
133.1 (CHAr Phthal), 131.9 (CHAr Phthal), 129.4 (CIV), 128.9 (CHAr), 128.8 (CIV), 127.7 (CHAr),
127.2 (CIV), 126.7 (CIV), 126.3 (CHAr), 126.1 (CHAr Phthal), 125.7 (CHAr Phthal), 40.2 (NCH2),
38.7 (NCH3), 37.2 (SCH2), 33.6 (NCH2CH2), 28.7 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C23H20O 4N6Cl2NaS [M+Na]+ 569.0536, found 569.0531.

163
Ethyl 2-(3-(2-(3-méthyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)acetate (24)

To a solution of 3 (4.34 g, 20 mmol, 1 eq.) in THF (80 mL), was added a 1 M solution of hydrazine
in THF. The mixture was then heated to reflux for 15 minutes. The mixture was finally
concentrated then recristallized in toluene to obtain 24 as a white solid (4.6 g, 19.8 mmol, 99 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3)  (ppm):
11.3 (bs, 1H, NH), 8.49 (m, 1H, HAr), 7,83 (m, 1H, HAr), 7,78 (m, 1H, HAr), 7,73 (m, 1H, Har), 4.18
(q, 3J = 7.2 Hz, 2H, CH2CH3), 3.98 (s, 2H, CH2), 1.22 (t, 3J = 7.2 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3)  (ppm):
169.7 (CO ester), 160.9 (CONH), 141.8 (CIV), 133.8 (CHAr), 131.7 (CHAr), 130.0 (CIV), 128.2
(CIV), 127.2 (CHAr), 124.8 (CHAr), 61.6 (CH2CH3), 39.1 (CH2), 14.2 (CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C12H13N2O 3 [M+H]+ 233.0921, found 233.0931.

164
Ethyl 2-(3-(2-(1,3-dioxolan-2-yl)ethyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)acetate (25)

To a solution of 24 (2 g, 8.6 mmol, 1 eq.) in DMF at 40 °C was added K2CO 3 (2.3 g 17 mmol, 2
eq.) under inert atmosphere. The mixture was stirred at 40 °C and the bromoacetal commercial
(2.3 g, 12.9 mmol, 1.5 eq.) was added. The mixture was stirred overnight, quenched with water and
extracted with DCM. The organic layer was washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and
concentrated under reduced pressure. The crude was purified by column chromatography on silica
gel (DCM/Isopropanol, 100:0 to 95:5) to afford the desired compound 25 as a yellow solid (2.13
g, 6.41 mmol, 75 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.46 (dd, 3J = 6.6 Hz, 4J = 1.7 Hz, 1H, HAr Phthal), 7.83-7.71 (m, 2H, HAr Phthal), 7.68 (dd, 3J =
6.6 Hz, 4J = 1.7 Hz, 1H, HAr Phthal), 5.03 (t, 3J = 4.6 Hz, 1H, CH), 4.37 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H,
NCH2), 4.18 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, CH2CH3), 4.01-3.82 (m, 6H, CH2, 2 x CH2-diox ), 2.27-2.18 (m,
2H, NCH2CH2), 1.23 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):
169.8 (C=O), 159.3 (C=O), 140.4 (CIV-C=N), 133.0 (CHAr Phthal), 131.5 (CHAr Phthal), 129.4 (CIV),
128.2 (CIV), 127.5 (CHAr Phthal), 124.5 (CHAr Phthal), 102.8 (CH), 65.1 (2 x CH2-diox ), 61.5
(CH2CH3), 46.6 (NCH2), 39.2 (CH2), 32.8 (NCH2CH2), 14.3 (CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C17H21N2O 5 [M+H]+ 333.1445, found 333.1447.

165
2-(2-(1,3-dioxolan-2-yl)ethyl)-4-((5-mercapto-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-
yl)methyl)phthalazin-1(2H)-one (26)

To a solution of ester 25 (362 mg, 1.1 mmol, 1 eq.) in ethanol (3 mL) at room temperature was
slowly added hydrazine monohydrate (320 µL, 6.54 mmol, 6 eq.). The mixture was refluxed for 4
h. After completion of the reaction, the solution was allowed to cool to room temperature , the
precipitate was filtered, washed with diethyl ether and dried over Na 2SO 4. The white solid hydrazide
was used in the next step without further purification.

1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
9.34 (s, 1H, NH), 8.28 (d, 3J = 7.6 Hz, 1H, HAr Phthal), 7.96-7.80 (m, 3H, HAr Phthal), 4.93 (t, 3J
= 4.5 Hz, 1H, CH), 4.40-4.10 (m, 4H, NCH2, NH2), 3.94-3.73 (m, 6H, 3 x CH2), 2.11-2.00 (m,
2H, NCH2CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C15H16N2NaO 3 [M+Na]+ 319.1401; found 319.1402.

166
To a suspension of the hydrazide previously obtained (312 mg, 0.98 mmol, 1 eq.) in ethanol (4
mL) at room temperature under inert atmosphere were added successively methylisothiocyanate
(395 µL, 4.9 mmol, 5 eq.) followed by triethylamine (689 L, 4.9 mmol, 5 eq.). The mixture was
refluxed overnight under argon atmosphere. After completion of the reaction, the solution was
allowed to cool to room temperature. The precipitate was filtered, washed with diethyl ether and
dried over Na 2SO 4. The thiol 26 was obtained as a solid and used without further purification
(326 mg, 0.87 mmol, 89 %).

1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
13.56 (bs, 1H, SH), 8.30 (dd, 4J = 1.3 Hz, 3J = 7.6 Hz, 1H, HAr Phthal), 8.07-8.00 (m, 1H, HAr
Phthal), 7.99-7.85 (m, 2H, HAr Phthal), 4.86 (t, 3J = 4.5 Hz, 1H, CH), 4.52 (s, 2H, CH2), 4.17 (t,
3
J = 7.3 Hz, 2H, NCH2), 3.91-3.71 (2m, 4H, 2 x CH2), 3.46 (s, 3H, NCH3), 2.06-1.95 (m, 2H,
NCH2CH2).

13
C NMR (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
167.0 (CIVSH), 158.0 (C=O), 149.5 (CIV-C=N), 140.5 (CIV-C=N), 133.2 (CHAr Phthal), 131.9 (CHAr
Phthal), 128.5 (CIV), 127.2 (CIV), 126.2 (CHAr Phthal), 125.4 (CHAr Phthal), 101.7 (CH), 64.3 (2
x CH2-diox ), 45.6 (NCH2), 32.1 (NCH2CH2), 30.1 (NCH3), 28.9 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C17H19N5NaO 3S [M+Na]+ 396.1101; found 396.1091.

167
2-((5-((3-(2-(1,3-dioxolan-2-yl)ethyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4-methyl-
4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)-N -(2,4-dichlorophenyl)acetamide (27)

To a solution of thiol 26 (310 mg, 0.83 mmol, 1 eq.) in DMF (15 mL) under argon atmosphere was
added K2CO 3 (172 mg, 1.24 mmol, 1.5 eq.). The mixture was stirred for 15 minutes at room
temperature before a solution of α-bromoamide 9 (258 mg, 0.91 mmol, 1.1 eq.) in DMF (1 mL)
was added. After completion of the reaction, a saturated solution of NH4Cl was added. The mixture
was extracted with AcOEt. The organic layer was washed with brine, dried over MgSO 4, filtered
and concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by flash column
chromatography on silica gel (DCM/MeOH, 97:3) to afford the desired product 27 as a white
powder (425 mg, 0.74 mmol, 89 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
10.08 (s, 1H, NH), 8.47-8.41 (m, 1H, HAr Phthal), 8.26-8.18 (m, 2H, HAr, HAr Phthal), 7.85-7.73
(m, 2H, HAr Phthal), 7.31 (d, 4J = 2.4 Hz, 1H, Har), 7.19 (dd, 3J = 8.9 Hz, 4J = 2.4 Hz, 1H, Har),
4.97 (t, 3J = 7.3 Hz, 1H, CH), 4.51 (s, 2H, CH2), 4.34 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, NCH2), 4.05 (s, 2H,
SCH2), 3.97-3.79 (m, 4H, OCH2CH2), 3.56 (s, 3H, NCH3), 2.21-2.13 (m, 2H, CH2).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):
167.2 (CONH), 159.1 (CON Phthal), 152.9 (CIV-C=N), 152.1 (CIV-C=N), 140.5 (CIV-C=N), 134.0 (CIV),
133.5 (CHAr Phthal), 132.0 (CHAr Phthal), 129.5 (CIV), 129.1 (CHar), 128.9 (CIV), 128.2 (CIV), 127.6
(CHAr), 127.5 (CHAr), 125.1 (CHAr), 124.7 (CIV), 123.2 (CHAr), 102.6 (C-O), 65.1 (2 x CH2O), 46.5
(NCH2), 36.0 (SCH2), 32.9 (CH2), 30.9 (NCH3), 30.2 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C25H24O 4N6Cl2NaS [M+Na]+ 597.0855, found 597.0882.

168
N-(2,4-dichlorophenyl)-2-((4-methyl-5-((4-oxo-3-(3-oxopropyl)-3,4-dihydrophthalazin-1-
yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)acetamide (28)

To a solution of ketal 27 (105 mg, 0.18 mmol, 1 eq.) in acetone/water mixture (9:1, 18 mL) at room
temperature was added para-toluenesulfonic acid (310 mg, 1.8 mmol, 10 eq.). The mixture was
stirred overnight at 60 °C. After completion of the reaction, the mixture was quenched by addition
of a saturated aqueous NaHCO 3 solution. The product was extracted with DCM, the organic layers
were washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The
crude product was purified by flash column chromatography on silica gel (DCM/MeOH, 97:3) to
afford the desired aldehyde 28 (77 mg, 0.15 mmol, 81 %).

1
H NMR (300 MHz, CHCl3) δ (ppm):
10.04 (s, 1 H, NH), 9.77 (t, 4J = 1.5 Hz, 1H, CHO), 8.45-8.40 (m, 1H, HAr Phthal), 8.24 (d, 3J =
8.9 Hz, 1H, HAr), 8.21-8.16 (m, 1H, HAr Phthal), 7.87-7.76 (m, 2H, HAr Phthal), 7.31 (d, 4J = 2.4
Hz, 1H, HAr), 7.19 (dd, 3J = 8.9 Hz, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 4.53 (t, 3J = 6.4 Hz, 2H, NCH2), 4.48
(s, 2H, CH2), 4.05 (s, 2H, SCH2), 3.53 (s, 3H, NCH3), 2.91 (td, 4J = 1.5 Hz, 3J = 6.4 Hz, 2H,
CH2COH).

13
C NMR (75 MHz, CHCl3) δ (ppm):
199.9 (CHO), 167.1 (CONH), 159.2 (CON Phthal), 152.6 (CIV-C=N), 152.1 (CIV-C=N), 141.0 (CIV-C=N),
134.0 (CIV), 133.8 (CHAr Phthal), 132.3 (CHAr Phthal), 129.5 (CIV), 129.1 (CHAr), 128.8 (CIV), 128.0
(CIV), 127.6 (CHAr), 127.5 (CHAr), 125.2 (CHAr), 124.7 (CIV), 123.2 (CHAr), 45.0 (NCH2), 42.4
(CH2COH), 36.1 (SCH2), 30.8 (NCH3), 30.0 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C23H20Cl2N6O 3NaS [M+Na]+ 553.0592, found 553.0610.

169
N-(2,4-dichlorophenyl)-2-((5-((3-(3-hydroxypropyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-
yl)methyl)-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)acetamide (29)

To a solution of the aldehyde 28 (80 mg, 0.15 mmol, 1 eq.) in ethanol at 0 °C was added sodium
borohydride (12 mg, 0.3 mmol, 2 eq.). After stirring 1 hour at 0 °C, the mixture was quenched by
addition of saturated aqueous NH4Cl solution. The volatiles were removed, the crude was diluted
in DCM, washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure.
The crude product was purified by flash column chromatography on silica gel (DCM/MeOH,
100:0 to 97:3) to afford the desired alcohol 29 as a white power (64 mg, 0.12 mmol, 80 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
10.02 (s, 1 H, NH), 8.48-8.42 (m, 1 H, HAr Phthal), 8.28 (m, 2H, HAr, HAr Phthal), 7.89-7.76 (m,
2H, HAr Phthal), 7.30 (d, 4J = 2.3 Hz, 1H, HAr), 7.19 (dd, 3J = 8.9 Hz, 4J = 2.3 Hz, 1H, HAr), 4.52
(s, 2H, CH2), 4.35 (t, 3J = 6.1 Hz, 2H, NCH2), 4.05 (s, 2H, SCH2), 3.60-3.51 (m, 5H, NCH3,
CH2OH), 1.98 (m, 2H, CH2).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
167.0 (CONH), 160.1 (CON Phthal), 152.7 (CIV-C=N), 152.0 (CIVC=N), 141.5 (CIVC=N), 134.0 (CIV),
133.8 (CHAr Phthal), 132.3 (CHAr Phthal), 129.6 (CIV), 129.0 (CHar), 128.8 (CIV), 127.8 (CIV), 127.6
(CHar), 127.5 (CHar), 125.2 (CHar), 124.7 (CIV), 123.2 (CHar), 58.7 (CH2OH), 47.8 (NCH2), 36.1
(SCH2), 31.7 (CH2), 30.8 (NCH3), 30.1(CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C23H23O 3N6Cl2S [M+H]+ 533.0929, found 533.0932.

170
3-(4-((5-((2-((2,4-dichlorophenyl)amino)-2-oxoethyl)thio)-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-
yl)methyl)-1-oxophthalazin-2(1H)-yl)propanoic acid (30)

To a solution of aldehyde 28 (192 mg, 0.36 mmol, 1 eq.) in a mixture of tert-butanol/water (3:1, 18
mL) at room temperature was added 2-methyl-2-butene (1.27 g, 18.3 mmol, 50 eq.), followed by
NaH2PO 4 (569 mg, 3.65 mmol, 10 eq.). The mixture was stirred 20 minutes before NaClO 2 (148
mg, 1.64 mmol, 4.5 eq.) was added. The mixture was stirred 2 h at room temperature and ethyl
acetate was added followed by an aqueous 1 N HCl solution. The aqueous layer was extracted with
ethyl acetate, the organic layers were combined, washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and
concentrated under reduced pressure. The carboxylic acid 30 was obtained pure as a white powder
(167 mg, 0.31 mmol, 85 %).

1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
12.32 (bs, 1H, CO2H), 9.97 (s, 1H, NH), 8.31-8.27 (m, 1H, HAr Phthal), 8.13-8.09 (m, 1H, HAr
Phthal), 7.94-7.85 (m, 2H, HAr, HAr Phthal), 7.88 (d, 3J = 8.8 Hz, 1H, HAr), 7.63 (d, 4J = 2.4 Hz,
1H, HAr), 7.39 (dd, 3J = 8.8 Hz, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 4.55 (s, 2H, CH2), 4.28 (t, 3J = 7.1 Hz, 2H,
NCH2), 4.09 (s, 2H, SCH2), 3.58 (s, 3H, NCH3), 2.68 (t, 3J = 7.1 Hz, 2H, CH2CO2H).

13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
172.4 (CO2H), 166.8 (CONH), 158.2 (CONPhthal), 152.9 (CIV-C=N), 149.4 (CIV-C=N), 141.3 (CIV-C=N),
133.8 (CIV), 133.3 (CIV), 132.0 (CHAr Phthal), 129.4 (CIV), 129.0 (CHAr), 128.6 (CIV), 127.7 (CIV),
127.3 (CHar), 126.6 (CIV), 126.3 (CHAr Phthal), 126.2 (CHar), 125.8 (CHAr), 46.1 (CH2N), 36.9
(SCH2), 32.5 ( CH2CO2H), 30.6 (NMe), 28.9 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C23H20Cl2N6O 4NaS [M+Na]+ 569.0542, found 569.0524.

171
N-(2,4-dichlorophenyl)-2-((5-((3-(3-(dimethylamino)propyl)-4-oxo-3,4-
dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)acetamide (31)

To a solution of aldehyde 28 (80 mg, 0.15 mmol, 1 eq.) in MeOH (2 mL) at room temperature was
added dimethylamine (21 µL, 0.16 mmol, 1.1 eq.) followed by AcOH (1 eq.). The mixture was
stirred at room temperature for 40 minutes before NaBH(OAc) 3 (40 mg, 0.18 mmol, 1.2 eq.) was
added. After completion, the solution was quenched with saturated aqueous NaHCO 3 solution,
extracted with DCM, washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under
reduced pressure. The crude was diluted with Et 2O, filtered and concentrated to afford the product
31 as a white powder (28 mg, 0.05 mmol, 33 %).

1
H NMR (300 MHz, CHCl3) δ (ppm):
10.02 (s, 1 H, NH), 8.39 (d, J = 7.9 Hz, 1 H, HAr Phthal), 8.18-8.14 (m, 2H, Har, HAr Phthal),
7.78-7.73 (m, 2H, HAr Phthal), 7.27-7.25 (m, 1H, HAr), 7.14 (m, 1H, HAr), 4.47 (s, 2H, CH2), 4.18
(t, 2H, 3J = 7.3 Hz, CH2N(CH3)2), 4.01 (s, 2H, SCH2), 3.54 (s, 3H, NCH3), 2.41-2.36 (m, 2H,
CH2), 2.22 (s, 6H, N(CH3)2), 1.98-1.91 (m, 2H, CH2).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):
167.1 (CONH), 159.1 (CON Phthal), 152.8 (CIV-C=N), 151.9 (CIV-C=N), 140.7 (CIV-C=N), 133.9 (CIV),
133.5 (CHAr Phthal), 132.0 (CHAr Phthal), 129.4 (CIV), 129.0 (CHAr), 128.7 (CIV), 128.1 (CIV), 127.5
(CHAr), 127.3 (CHAr Phthal), 125.1 (CHAr Phthal), 124.6 (CIV), 123.1 (CHAr), 56.5 (CH2N(CH3)2),
49.3 (CH2N), 45.0 (N(CH3)2), 36.0 (SCH2), 30.8 (NCH3), 30.0 (CH2), 26.5 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C25H28Cl2N7O 4S [M+H]+ 560.1402, found 560.1402.

172
N-(2,4-dichlorophenyl)-8-((4-(3,3-diethoxypropyl)-5-((3-methyl-4-oxo-3,4-
dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)octanamide (33)

To a solution of thiol 18 (187 mg, 0.46 mmol, 1 eq.) in anhydrous DMF (6 mL) at room temperature
under argon atmosphere was added K 2CO 3 (95 mg, 0.69 mmol, 15 eq.), followed by a solution of
bromoamide 7 (188 mg, 0.51 mmol, 1.1 eq.) in DMF at 0 °C. The mixture was stirred 4 h at room
temperature, quenched with water and extracted with AcOEt. The combined organic layers were
washed with brine, dried over MgSO 4, filtrered and concentrated under reduced pressure. The
product 33 was obtained in quantitave yield without any purification.

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.43 (dd, 3J = 7.7 Hz, 4J = 1.2 Hz, 1H, HAr Phthal), 8.32 (d, 3J = 8.8 Hz , 1H, HAr), 8.22 (d, 3J = 7.7
Hz, 1H, HAr Phthal), 7.77 (m, 2H, HAr Phthal), 7.60 (bs, 1H, NH), 7.36 (m, 1H, HAr), 7.23 (m,
1H, HAr), 4.53 (s, 2H, CH2), 4.50 (t, 3J = 5.2 Hz, 1H, CH), 4.05 (m, 2H, NCH2), 3.80 (s, 3H,
NCH3), 3.61 (m, 2H, 2 x OCH2), 3.45 (m, 2H, 2 x OCH2), 3.23 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, SCH2), 2.40
(t, 3J = 7.30 Hz, 2H, CH2CO), 1.93 (m, 2H, NCH2CH2), 1.72 (m, 4H, 2 x CH2), 1.37 (m, 6H, 3 x
CH2), 1.17 (t, 6H, 2 x CH3).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
171.4 (CO), 159.6 (CO), 151.9 (CIV-C=N), 151.8 (CIV-C=N), 141.1 (CIV-C=N), 133.6 (CAr Phthal), 133.4
(CIV), 131.9 (CAr Phthal), 129.2 (CIV), 128.8 (CAr), 128.0 (2 x CIV), 128.0 (CAr), 127.2 (CAr Phthal),
125.5 (CAr Phthal), 123.3 (CIV), 122.6 (CAr), 100.2 (CH), 61.9 (2 x OCH2), 40.1 (NCH2), 39.5
(NCH3), 37.9 (CH2CO), 33.3 (NCH2CH2), 33.1 (SCH2), 30.0 (CH2), 29.5 (2 x CH2), 29.0 (CH2),
28.8 (CH2), 28.5 (CH2), 25.4 (CH2), 15.4 (2 x CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C33H42N6O 4SCl2 [M+H]+ 689.2444, found 689.2448.

173
8-((5-((3-(2-(1,3-dioxolan-2-yl)ethyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4-methyl-
4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)-N -(2,4-dichlorophenyl) octanamide (34)

To a suspension of thiol (0.41 g, 1.1 mmol, 1 eq.) was added bromoalkylamide 32 (0.44 g, 1.2 mmol,
1.2 eq.) and K2CO 3 (0.165 g, 1.2 mmol, 1.2 eq.) in DMF (20 mL). The stirring was maintained for
18 to 24 h at 20°C then the mixture was quenched with a saturated solution of NH 4Cl. The product
was extracted with AcOEt, the organic layers were washed with water then brine. After drying over
MgSO 4, the organic layer was concentrated under reduced pressure and the solid residue was
purified by column chromatography on silica gel to give 34 as a white solide (507 mg, 0.77 mmol,
70 %).

1
H NMR (300 MHz in CDCl3) δ (ppm):
8.42 (dd, 3J =7.7 Hz, 4J = 1.7 Hz, 1H, HAr Phthal), 8.32 (d, 3J = 8.9 Hz, HAr), 8.23 (dd, 3J = 7.7 Hz,
HAr Phthal), 7.77 (m, 2H, HAr Phthal), 7.62 (bs, 1H, NH), 7.35 (m, 1H, HAr), 7.23 (dd, 3J = 8.9
Hz, 4J = 2.4 Hz, HAr ), 4.98 (t, 3J = 4.6 Hz , 1H, CH), 4.50 (s, 2H, CH2), 4.34 (t, 3J = 7.2 Hz, 2H,
NCH2), 3.89 (m, 4H, 2 x CH2 diox ), 3.53 (s, 3H, NCH3), 3.19 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, NHCOCH2),
2.40 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, SCH2), 2.18 (m, 2H, CHCH2), 1.72 (m, 4H, 2 x CH2), 1.36 (m, 6H, 3 x
CH2).

13
C NMR (75 MHz in CDCl3) δ (ppm):
171.41 (CONH), 159.19 (CO), 152.17 (CIVS), 151.94 (CIV), 140.85 (CIV), 133.51 (CHAr Phthal,
CIV), 131.95 (CHAr Phthal), 129.07 (CIV), 128.88 (CIV), 128.77 (CHAr), 128.16 (CHAr), 127.99 (CIV),
127.34 (CHAr Phthal), 125.39 (CHAr Phthal), 123.29 (CIV), 122.54 (CHAr), 102.61 (CH), 65.12 (2
x CH2 diox ), 46.46 (NCH2), 37.88 (NHCOCH2), 33.03 (SCH2), 32.87 (CHCH2), 30.74 (NCH3),
30.32 (CH2), 29.46 (CH2), 29.00/28.76/28.44 (3 x CH2), 25.35 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C31H37N6O 4SCl2 [M+H]+ 659.1974, found 659.1981.

174
N-(2,4-dichlorophenyl)-8-((5-((3-methyl-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4-(3-
oxopropyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)octanamide (35) and N -(2,4-dichlorophenyl)-2-((5-
((3-methyl-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)acetamide
(38)

To a solution of ketal 33 (206 mg, 0.3 mmol, 1 eq.) in acetone (7.5 mL) was added para-
toluenesulfonic acid (5.1 mg, 0.03 mmol, 0.1 eq.) and then a 1 N solution of hydrochloric acid (3
mL, 10 eq.), at room temperature. The reaction was stirred for 24 h at room temperature. The
mixture was quenched by addition of a saturated solution of Na 2CO 3 until pH 7-8. The product
was extracted with AcOEt, organic layers washed with brine, dried over Na 2SO 4 filtered and
concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by flash column
chromatography on silica gel (CHCl 3/MeOH, 99:1 to 98:2) to give a first fraction 38 (30 mg, 0.054
mmol, 17 %) and the desired compound 35 in a second fraction as a white amorphous powder
(110 mg, 0.18 mmol, 59 %).

Compound 35
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
9.71 (s, 1H, CHO), 8.42-8.39 (m, 1H, HAr Phthal), 8.28 (d, 3J = 6.6 Hz, 1H, HAr), 8.21-8.19 (m,
1H, HAr Phthal), 7.81–7.72 (m, 2H, 2 x HAr Phthal), 7.62 (s, 1H, NH), 7.33 (m, 1H, HAr), 7.21
(dd, 3J = 8.8 Hz, 4J = 2.2 Hz, 1H, HAr), 4.55 (s, 2H, CH2), 4.27 (t, 3J = 7.1 Hz, 2H, NCH2), 3.75
(s, 3H, NCH3), 3.21 (t, 3J = 7.1 Hz, 2H, SCH2), 2.81 (t, 3J = 7.2 Hz, 2H, CH2CO), 2.39 (t, 3J =
7.4 Hz, 2H, CH2CONH), 1.77-1.65 (m, 4H, 2 x CH2), 1.42-1.34 (s, 6H, 3 x CH2).

175
13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
197.7 (CHO), 171.2 (CONH), 159.3 (CO), 151.7 (CIV-C=N), 151.3 (CIV-C=N), 141.0 (CIV-C=N), 133.4
(CIV), 133.3 (CHAr Phthal), 131.9 (CHAr Phthal), 128.9 (CIV), 128.6 (CHAr), 127.8 (CIV), 127.7
(CHAr Phthal), 127.0 (CHAr), 125.3 (CHAr Phthal), 122.5 (CHAr), 42.9 (NCH2), 39.3 (NCH3), 37.6
(NCH2CH2), 37.2 (SCH2), 33.0 (CH2), 29.9 (CH2), 29.3 (CH2), 28.8 (CH2), 28.6 (CH2), 28.3
(CH2), 25.1 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C29H33Cl2N6O 3S [M+H]+ 615.1712, found 615.1719.

Compound 38
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.30-8.27 (m, 1H, Har-Phthal), 8.25 (br s, 1H, NH), 7.81-7.79 (m, 1H, Har), 7.72-7.63 (m, 3H, 3 x Har-
Phthal), 7.33 (d, J = 2.4 Hz, 1H, Har), 7.19 (dd, J = 8.8 Hz, J = 2.3 Hz, 1H, Har), 4.42 (s, 2H, CH2),
3.67 (s, 3H, NMe), 3.07 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH2S), 2.38 (t, J = 7.3 Hz, 2H, CH2CONH), 1.72-
1.60 (m, 4H, 2 x CH2), 1.38-1.24 (s, 6H, 3 x CH2).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
171.6 (CONH), 159.6 (CO), 157.3 (CIV-C=N), 142.22 (CIV-C=N), 133.4 (CIV), 133.2 (CHAr Phthal),
131.7 (CHAr Phthal), 129.2 (CIV), 128.8 (CHAr), 127.9 (CIV), 127.8 (CHAr Phthal), 127.1 (CHAr),
125.1 (CHAr Phthal), 123.5 (CIV), 122.7 (CHAr), 39.5 (NCH3), 37.8 (SCH2), 32.7 (CH2), 31.7
(CH2), 29.5 (CH2), 28.9 (CH2), 28.7 (CH2), 28.3 (CH2), 25.3 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C26H29Cl2N6O 2S [M+H]+ 559.1450, found 559.1464.

176
3-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)propan-1-amine (42)

To a solution of 1-amino-3-propanol (1 mL, 13 mmol, 1 eq.) and TBS-Cl (2.15 g, 14 mmol, 1.1 eq.)
in dry DCM was added triethyalmine (2.7 mL, 19 mol, 1.5 eq.). The cloudy mixture was vigorously
stirred at room temperature for 12 hours. The resulting clear solution was washed with water and
the organic layer was dried over Na 2SO 4, filtered, and concentrated under reduced pressure. The
crude oil was purified by distillation under reduced pressure (bp 65-70 °C at 3.5 mm) to give the
product 42 as a colorless oil (2.23 g, 11.8 mmol, 90 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
3.69 (t, 3J = 6.1 Hz, 2H, OCH2), 2.79 (t, 3J = 6.8 Hz, 2H, NCH2), 1.75 – 1.52 (m, 2H, CH2), 1.47
(s, 2H, NH2), 0.88 (s, 9H, 3 x CH3), 0.04 (s, 6H, 2 x SiCH3).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
61.40 (OCH2), 39.58 (NCH2), 36.45 (CH2), 26.07 (3 x CH3), 18.43 (SiCIV-tBu), -5.22 (2 x SiCH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C9H24NOSi [M+H]+ 190.1620, found 190.1627

177
Tert-butyl(3-isothiocyanatopropoxy)dimethylsilane (44)

Under inert atmosphere, a solution of compound 42 (1.21 g, 6.4 mmol, 1 eq.) in dry THF (15 mL)
was added triethylamine (2.13 g, 21 mmol, 3.3 eq.). The solution was cooled to 0 °C and carbon
disulfide (3.8 mL, 64 mmol, 10 eq.) was slowly added to the resulting light-yellow solution. After
addition was complete, the mixture was stirred at room temperature until completion ( 1H NMR
monitoring into dithiocarbamate salt). The reaction mixture was cooled to 0 °C and a solution of
Boc2O (1.39 g, 6.4 mmol, 1 eq.) in anhydrous THF (5 mL) was added dropwise. The reaction was
allowed to warm up to room temperature. Solvents were removed in vacuo and cold Et 2O was
added. Triethylamine precipitate was filtered off and the filtrate concentrated under reduced
pressure to give the product 44 as an orange oil (1.26 g, 5.44 mmol, 85 %).

1
H NMR (300 MHz in CDCl3)  (ppm):
3.58 (t, 3J = 6.6 Hz, 2H, SCNCH2), 2.36 (t, 3J = 6.9 Hz, 2H, (CH3)2NCH2), 2.20 (s, 6H, N(CH3)2),
1.82 (p, 3J = 6.7 Hz, 2H, CH2).

13
C NMR (75 MHz in CDCl3)  (ppm):
130.01 (SCN), 56.17 ((CH3)2NCH2), 45.58 (N(CH3)2), 43.14 (SCNCH2), 28.13 (CH2).

HRMS (ES+):
m/z calculated for C6H12N2S [M+H]+ 232.1184, found 232.1191.

178
4-((4-(3-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)propyl)-5-mercapto-4H-1,2,4-triazol-3-yl)methyl)-2-
methylphthalazin-1(2H)-one (47)

To a suspension of hydrazide 5 (300 mg, 1.29 mmol, 1 eq.) in EtOH (18 mL) was added the
corresponding isothiocyanate 44 (380 mg, 1.64 mmol, 1.28 eq.) and Et3N (0.81 mL, 5.81 mmol, 4.5
eq.). The resulting mixture was heated at reflux for 14 h. The resulting solution was concentrated,
the residue was solubilized in AcOEt and washed with brine. The organic layer was dried over
Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by column
chromatography on silica gel (cyclohexane/AcOEt, 50:50) to afford the thiol 47 as a white solid
(450 mg, 1.01 mmol, 80 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.54–8.43 (m, 1H, HAr Phthal), 7.90–7.72 (m, 3H, 3 x HAr Phthal), 4.42 (s, 2H, CH2), 4.23 (t, 3J =
7.1 Hz, 2H, NCH2), 3.80 (s, 3H, NCH3), 3.68 (t, 3J = 5.5 Hz, 2H, CH2O), 2.05 (m, 2H,
NCH2CH2), 0.83 (s, 9H, 3 x CH3-tBu), 0.04 (s, 6H, 2 x SiCH3).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):
167.8 (CIV-C=N), 159.5 (CO), 139.9 (2 x CIV-C=N), 133.3 (CHAr Phthal), 132.0 (CHAr Phthal), 128.9
(CIV), 128.1 (CIV), 127.6 (CHAr Phthal), 124.5 (CHAr Phthal), 59.7 (CH2O), 41.8 (NCH2), 39.6
(NCH3), 30.7 (NCH2CH2), 29.4 (CH2), 25.9 (3 x CH3-tBu), 18.3 (CIV), -5.2 (2 x SiCH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C21H31N5O 2SSi [M+H]+ 446.2036, found 446.2046.

179
N-(2,4-dichlorophenyl)-8-((4-(3-hydroxypropyl)-5-((3-methyl-4-oxo-3,4-
dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)octanamide (48)

To a solution of the silylated alcohol 40 (160 mg, 0.219 mmol, 1 eq.) in distilled THF (15 mL) was
carefully added a solution of HF 70 wt % in pyridine (16.40 mmol, 75 eq.). The resulting colorless
solution was stirred 16 h at room temperature. The reaction mixture was quenched with saturated
aqueous NaHCO 3 solution and extracted with AcOEt. The organic layer was washed with brine,
dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by
column chromatography on silica gel (DCM/MeOH, 95:5) to afford the corresponding alcohol 48
as a white amorphous solid (120 mg, 0.19 mmol, 88 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.48–8.39 (m, 1H, HAr Phthal), 8.33 (d, 3J = 8.9 Hz, 1H, HAr), 8.25 (d, 3J = 7.5 Hz, 1H, HAr Phthal),
7.83–7.73 (m, 2H, 2 x HAr Phthal), 7.59 (s, 1H, NH), 7.37 (m, 1H, HAr), 7.22 (m, 1H, HAr), 4.52
(s, 2H, CH2), 4.11 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, NCH2), 3.81 (s, 3H, NCH3), 3.71–3.60 (m, 2H, CH2OH),
3.23 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, SCH2), 2.41 (t, 3J = 7.5 Hz, 2H, CH2CONH), 1.81 (m, 6H, CH2), 1.37 (s,
6H, CH2).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):
171.4 (CONH), 159.6 (CO), 151.9 (CIV-C=N), 151.7 (CIV-C=N), 141.4 (CIV Phthal), 133.5 (CIV-NHCO),
133.4 (CHAr Phthal), 131.9 (CHAr Phthal), 129.2 (CIV-Cl), 129.1 (CIV), 128.8 (CHAr), 128.1 (CIV),
128.0 (CHAr), 127.1 (CHAr Phthal), 125.7 (CHAr Phthal), 123.4 (CIV-Cl), 122.6 (CHAr), 58.9
(CH2OH), 41.2 (NCH2), 39.4 (NCH3), 37.9 (CH2CONH), 33.1 (SCH2), 32.2 (CH2), 30.1 (CH2),
29.5 (CH2), 29.0 (CH2), 28.7 (CH2), 28.4 (CH2), 25.3 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C29H35Cl2N6O 3S [M+H]+ 617.1868, found 617.1868.

180
3-(3-((8-((2,4-dichlorophenyl)amino)-8-oxooctyl)thio)-5-((3-methyl-4-oxo-3,4-
dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-4-yl)propanoic acid (49)

TEMPO (11.6 mg, 0.074 mmol, 0.26 eq.) and BAIB (221 mg, 0.688 mmol, 2.4 eq.) were added to
a solution of alcohol 48 (177 mg, 0.286 mmol, 1 eq.) in DCM/H2O (1:1 mixture, 20 mL) under
inert atmosphere. After completion the mixture was quenched with aqueous solution of Na 2S2O 3
(10%) and extracted with AcOEt. The organic layer was washed with brine, dried over
Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by column
chromatography on silica gel (DCM/MeOH-AcOH (3%), 90:10) to afford the product 49 as a
white syrup (120 mg, 0.190 mmol, 66 %).

1
H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.43 (d, 3J = 7.0 Hz, 1H, HAr Phthal), 8.31 (d, 3J = 8.7 Hz, 1H, HAr), 8.18 (m, 1H, HAr Phthal),
7.89–7.68 (m, 2H, 2 x HAr Phthal), 7.63 (s, 1H, NH), 7.37 (m, 1H, HAr), 7.24–7.21 (m, 1H, HAr),
4.60 (s, 2H, CH2), 4.27 (t, 3J = 7.2 Hz, 2H, NCH2), 3.78 (s, 3H, NCH3), 3.25 (t, 3J = 7.2 Hz, 2H,
SCH2), 2.72 (t, 3J = 7.2 Hz, 2H, CH2COOH), 2.41 (t, 3J = 7.6 Hz, 2H, CH2CONH), 1.82–1.59
(m, 4H, 2 x CH2), 1.45–1.30 (m, 6H, 3 x CH2).

13
C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm):
172.9 (COOH), 171.7 (CONH), 159.7 (CO), 152.2 (CIV-C=N), 151.7 (CIV-C=N), 141.4 (CIV), 133.5
(CIV-NHCO), 133.4 (CHAr Phthal), 131.9 (CHAr Phthal), 129.2 (CIV-Cl), 129.1 (CIV), 128.8 (CHAr),
128.1 (CIV), 128.0 (CHAr), 127.2 (CHAr), 125.4 (CHAr Phthal), 123.5 (CIV-Cl), 122.8 (CHAr), 40.2
(NCH2), 39.5 (NCH3), 37.9 (CH2CONH), 34.1 (CH2COOH), 33.3 (SCH2), 29.8 (CH2), 29.4
(CH2), 28.9 (CH2), 28.7 (CH2), 28.4 (CH2), 25.3 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C29H33Cl2N6O 4S [M+H]+ 631.1660, found 631.1661.

181
4-((4-(3-(dimethylamino)propyl)-5-mercapto-4H-1,2,4-triazol-3-yl)methyl)-2-
methylphthalazin-1(2H)-one (51)

To a suspension of hydrazide 5 (95.5 mg, 0.41 mmol, 1 eq.) in EtOH (1 mL) was added 49 (65.9
mg, 0.457 mmol, 1.02 eq.) and Et3N (0.26 mL, 1.85 mmol, 4.5 eq.). The resulting mixture was
heated to reflux 30 h. The mixture was cooled to room temperature and concentrated under
reduced pressure. The residue was solubilized in DCM, washed with brine, the organic layer was
dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by
column chromatography on silica gel (DCM/MeOH-Et3N (5%), 85:15) to afford the
corresponding thiol 51 as a brown sticky solid (60 mg, 0.17 mmol, 54 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.60–8.37 (m, 1H, HAr Phthal), 7.99–7.60 (m, 3H, 3 x HAr Phthal), 4.47 (s, 2H, CH2), 4.22–4.04
(m, 2H, NCH2), 3.80 (s, 3H, NCH3), 2.88 (s, 1H, SH), 2.33 (t, 3J = 6.7 Hz, 2H, CH2N(CH3)2),
2.22 (s, 6H, N(CH3)2), 2.00 (p, 3J = 6.9 Hz, 2H, CH2).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):
167.9 (C-SH), 159.5 (CO), 149.2 (CIV-C=N), 140.1 (CIV-C=N), 133.3 (CHAr Phthal), 132.0 (CHAr
Phthal), 128.9 (CIV), 128.0 (CHAr Phthal/CIV), 127.5 (CHAr Phthal/CIV), 124.6 (CHAr
Phthal/CIV), 55.9 (CH2N(CH3)2), 46.0 (NCH3), 45.1 (NCH3), 42.6 (NCH2), 39.6 (NCH3-Phthal),
29.8 (CH2), 25.6 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C17H23N6OS [M+H]+ 359.1644, found 359.1654.

182
N-(2,4-dichlorophenyl)-8-((4-(3-(dimethylamino)propyl)-5-((3-methyl-4-oxo-3,4-
dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)octanamide (52)

To a suspension of mercapto-triazole 51 (160 mg, 0.446 mmol, 1 eq.) was added bromoamide 32
(295 mg, 0.803 mmol, 1.8 eq.) and K2CO 3 (123 mg, 0.892 mmol, 2 eq.) in DMF until dissolution.
After stirring at room temperature to complete conversion, the resulting clear yellow solution was
quenched with a saturated aqueous NH4Cl solution. AcOEt was added, the organic layer was
washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude
was purified by column chromatography on silica gel (DCM/MeOH-Et3N (5%), 90:10) to afford
the product 52 as a white solid (288 mg, 0.20 mmol, 45 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.43 (m, 1H, HAr Phthal), 8.33 (d, 3J = 8.9 Hz, 1H, HAr), 8.28–8.17 (m, 1H, HAr Phthal), 7.84–7.69
(m, 2H, 2 x Har-Phthal), 7.60 (s, 1H, NH), 7.36 (d, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 7.23 (m, 1H, HAr), 4.53 (s,
2H, CH2), 3.99 (m, 2H, NCH2), 3.81 (s, 3H, NCH3), 3.22 (m, 2H, CH2S), 2.40 (t, 3J = 7.5 Hz, 2H,
CH2CONH), 2.23 (t, 3J = 6.7 Hz, 2H, CH2N(CH3)2), 2.18 (s, 6H, 3 x CH2), 1.73 (m, 6H, 3 x
CH2), 1.39 (m, 6H, 3 x CH2).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):
171.4 (CONH), 159.6 (CO), 151.9 (CIV-C=N), 151.7 (CIV-C=N), 141.4 (CIV-C=N), 133.5 (CIV-NH), 133.4
(CHAr Phthal), 131.9 (CHAr Phthal), 129.2 (CIV-Phthal), 129.0 (CIV-Cl), 128.8 (CHAr), 128.0 (CIV-Phthal),
128.0 (CHAr), 127.1 (CHAr Phthal), 125.6 (CHAr Phthal), 123.2 (CIV-Cl), 122.5 (CHAr), 56.1
(CH2N(CH3)2), 45.4 (N(CH3)2), 42.3 (NCH2), 39.5 (NCH3), 37.9 (CH2CONH), 33.1 (SCH2),
30.2 (CH2), 29.5 (CH2), 29.1 (CH2), 28.8 (CH2), 28.5 (CH2), 27.6 (CH2), 25.4 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C31H39Cl2N7O 2S [M+H]+ 644.2339, found 644.2341.

183
(3-bromopropoxy)( tert-butyl)dimethylsilane (53)

To a solution of 3-bromopropanol (3 g, 21.6 mmol, 1 eq.) in dry DMF (20 mL) was added
TBDMSCl (3.6 g, 23.7 mmol, 1.1 eq.) and imidazole (2.94 g, 43.2 mmol, 2 eq.). Stirring was
maintained overnight at room temperature. The crude was diluted with Et 2O, washed with water
and brine, filtered and dried over MgSO 4 to give compound 53 used without further purification
(4 g, 15.7 mmol, 73 %).

1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
3.74 (t, 3J = 5.7 Hz, OCH2), 3.64 (t, 3J = 6.6 Hz, 2H, BrCH2), 1.95 (m, 2H, OCH2CH2), 0.98 (s,
9H, tBu), 0.0 (s, 6H, 2 x CH3).

Litt data: ChemMedChem 2011, 6, 1816 – 1831

3-(dimethylamino)propyl methanesulfonate hydrochloride (54)

To a solution of N-dimethyl-3-aminopropanol (2.4 mL, 20 mmol, 1 eq.) in dry dichloromethane

(40 mL) was added MsCl (3 mL, 40 mmol, 2 eq.) at 0 °C and the mixture was stirred at room
temperature for 36 h. The precipitate was filtered and gave the pure expected compound 54 as a
white powder (3.65g, 16.6 mmol, 83 %), which was used without further purification.

1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
11.17 (s, 1 H, HN(CH3)2), 4.31 (t, 2H, J = 7.3 Hz, CH2OMs), 3.23 (s, 3H, SO2CH3), 3.15-3.08
(m, 2H, CH2N(CH3)2), 2.73 (s, 3H, NCH3), 2.71 (s, 3H, NCH3), 2.17-2.08 (m, 2H, CH2).

Litt. data: J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1452-1458

184
Ethyl 2-(3-(3-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)propyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-
yl)acetate (55)

To a solution of 24 (1.16 g, 5 mmol, 1 eq.) in DMF (30 mL) was added NaH 60% suspension in
oil (0.3 g, 7.5 eq., 1.5 eq.) under argon, and after gas completion the bromoalkyle 53 (2.53 g, 10
mmol, 2 eq.) in DMF solution (2 mL) was added. The mixture was stirred at 40° C during 48 h.
then quenched with water and extracted with AcOEt. The organic layer was washed with brine,
dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by
column chromatography on silica gel (cyclohexane/AcOEt, 100:0 to 70:30) to afford the desired
ester 55 as an oil (1.2 g, 2.95 mmol, 60 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.48-8.45 (m, 1H, HAr Phthal), 7.81-7.73 (m, 2H, HAr Phthal), 7.69-7.67 (m, 1H, HAr Phthal), 4.30
(t, 3J = 7.2 Hz, 2H, NCH2), 4.18 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, CH2CH3), 3.96 (s, 2H, CH2CO2Et), 3.73 (t,
3
J = 6.3 Hz, 2H, CH2OSi), 2.11-2.02 (m, 2H, NCH2CH2), 1.24 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3), 0.89 (s,
9H, 3 x CH3-tBu), -0.04 (s, 6H, 2 x SiCH3).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):
169.8 (CO), 159.2 (CO), 140.1 (CIV-C=N), 132.9 (CHAr Phthal), 131.3 (CHAr Phthal), 129.2 (CIV),
128.1 (CIV), 127.3 (CHAr Phthal), 124.3 (CHAr Phthal), 61.4 (CH2CH3), 60.71 (CH2O), 48.6
(NCH2), 39.0 (CH2), 31.6 (NCH2CH2), 25.9 (3 x CH3-tBu), 18.3 (CIV), 14.1 (CH3), -5.4 (2 x SiCH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C21H33N2O 4Si [M+H]+ 405.2210, found 405.2199.

185
2-(3-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)propyl)-4-((5-mercapto-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-
yl)methyl)phthalazin-1(2H)-one (56)

To a solution of ester 55 (0.4 g, 0.98 mmol, 1 eq.) in ethanol (5 mL) at room temperature was added
hydrazine monohydrate (300 µL, 6 mmol, 6 eq.). The mixture was stirred at 42° C during 24 h then
a second portion of hydrazine monohydrate was added (300 µL, 6 mmol, 6 eq.) and the mixture
was refluxed overnight. After completion of the reaction, the solution was allowed to cool to room
temperature and the precipitate was filtered, washed with AcOEt and dried over Na 2SO 4. The solid
hydrazide (0.32 g, 0.82 mmol, 84 %) was used in the next step without further purification.

1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
9.33 (s, 1H, NH), 8.29–8.27 (m, 1H, CHAr), 7.92–7.83 (m, 3H, CHAr), 4.25 (s, 2H, NH2), 4.17 (t,
3
J = 7.1 Hz, 2H, NCH2), 3.78 (s, 2H, CH2CO), 3.67 (t, 3J = 6.1 Hz, 2H, OCH2), 1.93 (m, 2H,
CH2), 0.85 (s, 9H, 3 x CH3-tBu), 0.02 (s, 6H, 2 x SiCH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C19H31N4O 3Si [M+H]+ 391.2165, found 391.2166.

Under inert atmosphere, to a solution of the hydrazide previously obtained (154 mg 0.394 mmol,
1 eq.), methyl isothiocyanate (158 mg, 2.17 mmol, 5.5 eq.) in ethanol (12 mL) were added
triethylamine (0.275 mL, 1.97 mmol, 5 eq.). The mixture was refluxed 3 h 30 then concentrated
under reduced pressure. Et 2O was added to the resulting residue followed by evaporation. The
solid was then triturated in an Et2O/cyclohexane mixture. The thiol 56 was obtained by filtration
as a white solid (160 mg, 0.359 mmol, 91 %).

186
1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
13.50 (s, 1H, SH), 8.49–8.21 (m, 1H, CHar), 8.05–8.00 (m, 1H, CHAr), 7.97–7.83 (m, 2H, 2 x CHAr),
4.50 (s, 2H, CH2), 4.14 (t, 3J = 7.1 Hz, 2H, NCH2), 3.63 (t, 3J = 6.1 Hz, 2H, CH2O), 3.47 (s, 3H,
NCH3), 1.89 (m, 2H, CH2), 0.82 (s, 9H, 3 x CH3-tBu), -0.02 (s, 6H, 2 x SiCH3).

13
C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
167.0 (CIV-SH), 158.1 (CO), 149.4 (CIV-C=N), 140.4 (CIV), 133.2 (CHAr), 131.9 (CHAr), 128.5 (CIV),
127.3 (CIV), 126.2 (CHAr), 125.5 (CHAr), 60.2 (OCH2), 47.4 (NCH2), 31.1 (CH2), 30.1 (NCH3),
28.9 (CH2), 25.7 (3 x CH3-tBu), 17.8 (CIV), -5.4 (2 x SiCH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C21H32N5O 2SSi [M+H]+ 446.2038, found 446.2046.

187
8-((5-((3-(3-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)propyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-
yl)methyl)-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)-N -(2,4-dichlorophenyl)octanamide (41)

The mercapto-triazole 56 (120 mg, 0.269 mmol, 1 eq.), bromoamide 32 (118 mg, 0.323 mmol, 1.2
eq.) and K2CO 3 (56 mg, 0.403 mmol, 1.5 eq.) were dissolved in DMF and stirred overnight. The
mixture was quenched with water and extracted with AcOEt. The organic layer was washed with
brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The resulting crude
was purified by column chromatography on silica gel (DCM/MeOH, 85:15). The desired product
41 was obtained as a colorless syrup (140 mg, 0.191 mmol, 71 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.47–8.39 (m, 1H, HAr Phthal), 8.33 (d, 3J = 8.9 Hz, 1H, HAr), 8.30–8.23 (m, 1H, HAr Phthal),
7.83–7.70 (m, 2H, 2 x HAr Phthal), 7.60 (s, 1H, NH), 7.36 (d, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 7.23 (dd, 3J =
8.9 Hz, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 4.48 (s, 2H, CH2), 4.28 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, NCH2), 3.73 (t, 3J = 6.1
Hz, 2H, OCH2), 3.54 (s, 3H, NCH3), 3.19 (t, 3J = 7.4 Hz, 2H, SCH2), 2.40 (t, 3J = 7.5 Hz, 2H,
CH2CONH), 2.14–1.96 (m, 2H, CH2), 1.80–1.65 (m, 4H, 2 x CH2), 1.48–1.30 (m, 6H, 3 x CH2),
0.89 (s, 9H, 3 x CH3-tBu), 0.04 (s, 6H, 2 x SiCH3).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
171.4 (CONH), 159.3 (C=O), 152.1 (CIV), 152.0 (CIV-S), 140.8 (CIV), 133.6 (CIV-CONH), 133.4 (CHAr
Phthal), 131.9 (CHAr Phthal), 129.1 (CIV), 128.9 (CIV-Cl), 128.8 (CHAr), 128.3 (CIV), 128.0 (CHAr
Phthal), 127.3 (CHAr Phthal), 125.5 (CHAr Phthal), 123.3 (CIV-Cl), 122.6 (CHAr), 60.8 (OCH2),
48.8 (NCH2), 37.9 (CH2CONH), 33.0 (CH2), 31.9 (CIV), 30.7 (NCH3), 30.4 (CH2), 29.5 (CH2),
29.0 (CH2), 28.8 (CH2), 28.5 (CH2), 26.0 (3 x CH3-tBu), 25.4 (CH2), 18.4 (CIV-Si), -5.2 (2 x SiCH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C35H49N6O 3SSiCl2 [M+H]+ 731.2731, found 731.2733.

Ethyl 2-(3-(3-(dimethylamino)propyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-yl)acetate (57)

188
To a solution of amino mesylate 54 in its HCl form (1.08 g, 5 mmol, 1 eq.) in suspension in DMF
(8 mL) was added NaH 60% suspension in oil (0.6 g, 15 mmol, 3 eq.) under argon, and after gas
completion the ester 24 (58 mg, 2.5 mmol, 1 eq.) in DMF (8 mL) was added. The mixture was
stirred at 40°C overnight then quenched with water and extracted with AcOEt. The organic layer
was washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The
crude was purified by column chromatography on silica gel (DCM/MeOH, 98:2 to 94:6) to afford
the desired amine 57 as an oil (0.6 g, 1.89 mmol, 75 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.48-8.45 (m, 1H, CHAr), 7.81–7.73 (m, 2H, 2 x CHAr), 7. 71-7.68 (m, 1H, CHAr), 4.27 (t, 3J = 7.2
Hz, 2H, NCH2), 4.19 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, CH2CH3), 3.96 (s, 2H, CH2CO2Et), 2.41, (t, 2H, 3J =
7.4 Hz, 2H, CH2N(CH3)2), 2.25 (s, 6H, N(CH3)2), 2.07-1.99 (m, NCH2CH2), 1.24 (t, 3H,
CH2CH3).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
169.7 (CO2Et), 159.2 (CO), 140.2 (CIV), 132.9 (CHAr), 131.3 (CHAr), 129.2 (CIV), 128.0 (CIV), 127.3
(CHAr), 124.3 (CHAr), 61.3 (CH2O), 56.8 ((CH3)2NCH2), 49.3 (NCH2), 45.3 (2 x CH3), 39.0
(CH2COOEt), 26.5 (CH2), 14.1 (CH3CH2O).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C17H24N3O 3 [M+H]+ 318.1818, found 318.1821.

189
2-(3-(dimethylamino)propyl)-4-((5-mercapto-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-
yl)methyl)phthalazin-1(2H)-one (58)

To a solution of the ester 57 (500 mg, 1.57 mmol, 1 eq.) in ethanol (8 mL) at room temperature
was added hydrazine monohydrate (620 µL, 12.56 mmol, 8 eq.). The mixture was refluxed
overnight. After completion of the reaction, the solution was concentrated under reduced pressure.
The crude was diluted with DCM, the organic layer was washed with water, dried ov er
Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The solid hydrazide (0.3 g, 0.99 mmol,
63 %) was directly used in the next step without further purification.

1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm):
9.32 (s, 1H, NH), 8.30–8.27 (m, 1H, CHAr), 7.93–7.91 (m, 2H, 2 x CHAr), 7.87–7.83 (m, 1H, CHAr),
4.25 (s, 2H, NH2), 4.13 (t, J = 7.3 Hz, 2H, NCH2), 3.79 (s, 2H, CH2CO), 2.27 (t, 3J = 6.9 Hz, 2H,
CH2N(CH3)2), 2.13 (s, 6H, N(CH3)2), 1.89-1.82 (m, 2H, CH2)

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C15H22N5O 2 [M+H]+ 304.1773, found 304.1783.

Under inert atmosphere, to a solution of this hydrazide previously obtained (114 mg, 0.375 mmol,
1 eq.) and methyl isothiocyanate (125 mg, 2.25 mmol, 6 eq.) in ethanol (12 mL) were added Et 3N
(0.261 mL, 1.88 mmol, 5 eq.). The mixture was refluxed for 3 h 30, then concentrated under
reduced pressure. The resulting yellow crude was taken up in Et 2O, the precipitate was filtered and
washed with Et 2O. The thiol 58 was recovered as a white solid (120 mg, 0.335 mmol, 89 %).

190
1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.51–8.33 (m, 1H, CHAr), 7.99–7.86 (m, 1H, CHAr), 7.85–7.63 (m, 2H, 2 x CHAr), 4.35 (s, 2H,
CH2), 4.21 (t, J = 7.2 Hz, 2H, NCH2), 3.54 (s, 3H, NCH3), 2.60–2.38 (m, 2H, CH2N(CH3)2), 2.29
(s, 6H, N(CH3)2), 2.11–1.78 (m, 2H, CH2).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
168.5 (CIV-SH), 159.2 (CO), 148.9 (CIV-triazole), 139.8 (CIV), 133.4 (CHAr Phthal), 132.0 (CHAr
Phthal), 128.7 (CIV), 128.2 (CIV), 127.6 (CHAr Phthal), 124.4 (CHAr Phthal), 56.5 (CH2N(CH3)2),
49.4 (NCH2), 44.9 (N(CH3)2), 31.1 (NCH3), 30.2 (CH2), 26.3 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C17H23N6OS [M+H]+ 359.1646, found 359.1654.

191
N-(2,4-dichlorophenyl)-8-((5-((3-(3-(dimethylamino)propyl)-4-oxo-3,4-
dihydrophthalazin-1-yl)methyl)-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)octanamide (59)

The mercapto-triazole 58 (65 mg, 0.181 mmol, 1 eq.), bromoamide 32 (80 mg, 0.217 mmol, 1.2 eq.)
and K2CO 3 (37 mg, 0.272 mmol, 1.5 eq.) were dissolved in DMF and stirred at room temperature
overnight. The resulting yellow solution was quenched with water and extracted with AcOEt. The
organic layer was washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced
pressure. The resulting crude was purified by column chromatography on silica gel (DCM/MeOH,
85:15) to give the desired product 59 as a white powder (55 mg, 0.085 mmol, 47 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.48–8.40 (m, 1H, HAr Phthal), 8.33 (d, 3J = 8.9 Hz, 1H, HAr), 8.24 (dd, 3J = 7.5, 1.2 Hz, 1H, HAr
Phthal), 7.86–7.71 (m, 2H, 2 x HAr Phthal), 7.60 (s, 1H, NH), 7.37 (d, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 7.24
(dd, 3J = 8.9, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 4.49 (s, 2H, CH2), 4.25 (t, 3J = 7.2 Hz, 2H, NCH2), 3.55 (s,
3H, NCH3), 3.19 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, SCH2), 2.50 (s, 2H, CH2N(CH3)2) , 2.41 (t, 3J = 7.5 Hz, 2H,
CH2CONH), 2.34 (s, 6H, N(CH3)2), 2.08 (d, 3J = 8.5 Hz, 2H, CH2), 1.78–1.68 (m, 4H, 2 x CH2),
1.50–1.32 (m, 6H, 3 x CH2).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
171.4 (CONH), 159.3 (CO), 152.1 (CIV), 151.9 (CIV-C=N), 141.2 (CIV), 133.6 (CHAr Phthal, CIV-NH),
132.0 (CHAr Phthal), 129.1 (CIV), 128.9 (CIV-Cl), 128.8 (CHAr), 128.2 (CIV), 128.0 (CHAr), 127.3
(CHAr Phthal), 125.4 (CHAr Phthal), 123.3 (CIV-Cl), 122.6 (CHAr), 56.9 (CH2N(CH3)2), 49.3
(NCH2), 45.2 (N(CH3)2), 37.9 (CH2CONH), 33.1 (SCH2), 30.7 (NCH3), 29.9 (CH2), 29.5 (CH2),
29.0 (CH2), 28.8 (CH2), 28.5 (CH2), 26.5 (CH2), 25.4 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C31H40N7O 2SCl2 [M+H]+ 644.2343, found 644.2341.

192
N-(2,4-dichlorophenyl)-8-((5-((3-(3-hydroxypropyl)-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-
yl)methyl)-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)octanamide (60)

To a solution of the silylated alcohol 41 (480 mg, 0.672 mmol, 1 eq.) in distilled THF (20 mL) was
carefully added a solution of HF (70 wt % in pyridine, 0.9 mL). The resulting colorless solution
was stirred 4 h at room temperature. The reaction mixture was quenched with saturated solution
of NaHCO 3 until neutral pH and extracted with DCM. The organic layer was washed with brine,
dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure to afford the corresponding
alcohol 60 as a white solid (400 mg, 0.648 mmol, 98 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.45 (dd, 3J = 7.7, 1.7 Hz, 1H, HAr Phthal), 8.33 (d, 3J = 8.8 Hz, 1H, HAr), 8.26 (d, 3J = 7.8 Hz, 1H,
HAr Phthal), 7.88–7.75 (m, 2H, 2 x HAr Phthal), 7.61 (s, 1H, NH), 7.37 (d, J = 2.4 Hz, 1H, HAr),
7.25–7.21 (m, 1H, HAr), 4.55 (s, 2H, CH2), 4.36 (t, J = 6.1 Hz, 2H, NCH2), 3.62–3.45 (m, 5H,
CH2OH, NCH3), 3.22 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, SCH2), 2.41 (t, 3J = 7.5 Hz, 2H, CH2CONH), 1.99 (m,
2H, CH2), 1.82–1.68 (m, 4H, 2 x CH2), 1.38 (s, 6H, 3 x CH2).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
171.2 (CONH), 160.0 (CO), 152.3 (CIV), 151.6 (CIV-S), 141.6 (CIV), 133.7 (CHAr Phthal), 133.4
(CIV-CONH), 132.1 (CHAr Phthal), 129.0 (CIV), 128.8 (CIV), 128.7 (CHAr), 127.9 (CHAr), 127.6 (CIV),
127.3 (CHAr Phthal), 125.3 (CHAr Phthal), 122.4 (CHAr), 122.4 (CIV), 58.4 (CH2O), 47.6 (NCH2),
37.7 (CH2CONH), 32.9 (CH2), 31.6 (CIV), 30.6 (NCH3), 29.9 (CH2), 29.3 (CH2), 28.9 (CH2), 28.6
(CH2), 28.3 (CH2), 25.2 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C29H35N6O 3SCl2 [M+H]+ 617.1868, found 617.1880.

193
N-(2,4-dichlorophenyl)-8-((4-methyl-5-((4-oxo-3-(3-oxopropyl)-3,4-dihydrophthalazin-1-
yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)octanamide (61)

To a solution of the alcohol 60 (100 mg, 0.162 mmol, 1 eq.) in DCM (20 mL) was added Dess
Martin periodinane (DMP) (140 mg, 0.323 mmol, 2 eq.). The resulting white suspension was
allowed to stir at room temperature for 20 h. Incomplete conversion was observed ( 1H NMR), and
an additional portion of DMP (140 mg, 0.323 mmol, 2 eq.) was added and DMSO (20 mL) to
increase solubility. Upon full conversion (40 h), the reaction mixture was quenched with saturated
solutions of Na 2S2O 3 and NaHCO 3. The organic layer was washed with brine and water. The
organic layer was dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure to afford
the corresponding aldehyde 61 as a white solid (74 mg, 0.120 mmol, 74 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
9.81 (t, J = 1.6 Hz, 1H, Hald), 8.48–8.38 (m, 1H, HAr Phthal), 8.33 (d, 3J = 8.9 Hz, 1H, HAr),
8.27–8.18 (m, 1H, HAr Phthal), 7.89–7.73 (m, 2H, 2 x HAr Phthal), 7.61 (s, 1H, NH), 7.37 (d, 4J
= 2.4 Hz, 1H, HAr), 7.28–7.19 (m, 1H, HAr), 4.55 (t, 3J = 6.5 Hz, 3H, NCH2), 4.50 (s, 2H, CH2),
3.52 (s, 3H, NCH3), 3.22 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H, SCH2), 2.94 (td, 3J = 6.5, 4J = 1.6 Hz, 2H,
CH2CHO), 2.41 (t, 3J = 7.5 Hz, 2H, CH2CONH), 1.74 (m, 4H, 2 x CH2), 1.49–1.33 (m, 6H, 3 x
CH2).

C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):

13

200.0 (COH), 171.4 (CONH), 159.3 (CO), 152.2 (CIV-triazole), 151.7 (CIV-triazole), 141.4 (CIV), 133.8
(CHAr Phthal), 133.6 (CIV-COHN), 132.2 (CHAr Phthal), 129.1 (CIV-Cl), 128.9 (CIV), 128.8 (2 x CHAr),
128.0 (CIV), 127.3 (CHAr Phthal), 125.5 (CHAr Phthal), 123.3 (CIV-Cl), 122.6 (CHAr), 45.1 (NCH2),
42.5 (CH2CHO), 37.9 (CH2CONH), 33.1 (SCH2), 30.7 (NCH3), 30.2 (CH2), 29.5 (CH2), 29.0
(CH2), 28.8 (CH2), 28.4 (CH2), 25.4 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C29H33N6O 3SCl2 [M+H]+ 615.1712, found 615.1719.

194
3-(4-((5-((8-((2,4-dichlorophenyl)amino)-8-oxooctyl)thio)-4-methyl-4H-1,2,4-triazol-3-
yl)methyl)-1-oxophthalazin-2(1H)-yl)propanoic acid (62)

To a solution of aldehyde 61 (1 eq, 0.113 mmol, 70 mg) in t-BuOH/THF 1:1 (0.011 mol.L-1) was
added DMSO, 2-methyl-2-buten (1 mL) and water (5 mL). Then an aqueous
solution of NaHPO 4 (15 eq) and NaClO 2 (9 eq, 1.02 mmol, 92.6 mg) were added. The solution
was stirred at room temperature during 16 h and diluted with a saturated aqueous NH4Cl solution
(30 mL), then extracted with DCM. The combined organic layers were washed with brine, water,
dried over Na 2SO 4, filtered, and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by
column chromatography on silical gel (DCM/MeOH, 96:4) to afford the carboxylic acid 62 as a
white powder (27 mg, 0.043 mmol, 37 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.47–8.36 (m, 1H, HAr Phthal), 8.30 (d, 3J = 9.0 Hz, 1H, HAr), 8.16–8.09 (m, 1H, HAr Phthal),
7.84–7.72 (m, 2H, 2 x HAr Phthal), 7.65 (s, 1H, NH), 7.36 (d, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 7.23 (dd, 3J =
8.9, 4J = 2.4 Hz, 1H, HAr), 4.54–4.34 (m, 4H, CH2 and NCH2), 3.52 (s, 3H, NCH3), 3.17 (t, 3J =
7.3 Hz, 2H, SCH2), 2.82 (t, 3J = 6.7 Hz, 2H, CH2COOH), 2.42 (t, 3J = 7.5 Hz, 2H, CH2CONH),
1.70 (m, 4H, 2 x CH2), 1.47–1.30 (m, 6H, 3 x CH2).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
173.9 (COOH), 171.7 (CONH), 159.2 (CO), 152.3 (CIV-C=N), 151.9 (CIV-C=N), 141.1 (CIV-Phthal),
133.7 (CHAr Phthal), 133.5 (CIV), 132.1 (CHAr Phthal), 129.3 (CIV-Cl), 128.9 (CIV), 128.9 (CIV), 128.8
(CHaA), 127.9 (CHAr), 127.4 (CHAr Phthal), 125.1 (CHAr Phthal), 123.5 (CIV-Cl), 122.8 (CHAr), 46.7
(NCH2), 37.8 (CH2CONH), 33.2 (SCH2), 33.0 (CH2COOH), 30.8 (NCH3), 30.5 (CH2), 29.8
(CH2), 29.4 (CH2), 28.9 (CH2), 28.3 (CH2), 25.3 (CH2).

HRMS (ESI-):
m/z calculated for C29H31Cl2N6O 4S [M-H]- 629.1492, found 629.1505.

195
N-(4-benzoylphenyl)-8-iodooctanamide (65)

To a solution of octanoic acid (250 mg, 1.12 mmol, 1 eq.) in DCM (10 mL) was added oxalyl
chloride (0.197 mL, 2.24 mmol, 2 eq.) with some drops of DMF at 0°C. The resulting clear solution
was stirred until completion of the reaction. The mixture was concentrated under reduced pressure
and a solution of 4-amino benzophenone (265 mg, 1.34 mmol, 1.2 eq.), Et3N (0.312 mL, 2.24
mmol, 2 eq.) and DMAP (7 mg, 0.056 mmol, 0.05 eq.) in DCM (5 mL) was added slowly and then
stirred at room temperature. The mixture was diluted with DCM and washed with water and brine.
The organic layer was dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The
crude was purified by column chromatography on silica gel (DCM/AcOEt, 50:50) to afford the
N-(4-benzoylphenyl)-8-bromooctanamide 64 as a white-yellowish solid (327 mg, 0.831
mmol, 74 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
7.85 – 7.79 (m, 2H, 2 x CHAr), 7.79 – 7.71 (m, 2H, 2 x CHAr), 7.68 – 7.62 (m, 2H, 2 x CHAr), 7.62
– 7.53 (m, 1H, CHAr), 7.53 – 7.44 (m, 2H, 2 x CHAr), 7.39 (s, 1H, NH), 3.41 (t, 3J = 6.8 Hz, 2H,
BrCH2), 2.51 – 2.35 (m, 2H, CH2-CONH), 1.92 – 1.81 (m, 2H, CH2), 1.81 – 1.66 (m, 2H, CH2), 1.49
– 1.37 (m, 6H, 3 x CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C21H25NO 2Br [M+H]+ 402.1059, found 402.1069.

NaI (2.18 g, 14.54 mmol, 2.25 eq.) was added to a solution of bromo compound 64 previously
obtained (2.60 g, 6.46 mmol, 1 eq.) in acetone (9 mL). The solution was allowed to reflux during 2
h then concentrated. The residue was solubilized in DCM and NaI/NaBr salts were filtered off.
The organic layer was then concentrated under reduced pressure to afford the expected iodo
compound 65 as a yellow viscous oil (2.90 g, 6.45 mmol, quant.).

196
1
H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm):
8.30 (s, 1H, NH), 7.81 – 7.72 (m, 4H, 4 x CHAr-CO), 7.68 (d, J = 8.8 Hz, 2H, 2 x CHAr), 7.61 – 7.52
(m, 1H, CHAr), 7.50 – 7.37 (m, 2H, 2 x CHAr), 3.14 (t, J = 7.0 Hz, 2H, ICH2), 2.38 (t, J = 7.5 Hz,
2H, CH2-CONH), 1.82 – 1.73 (m, 2H, CH2), 1.70 (m, 2H, CH2), 1.34 (m 6H, 3 x CH2).

C NMR (75 MHz, CDCl3) δ (ppm):

13

196.1 (CO), 172.2 (CONH), 142.5 (CIV-NHCO), 137.8 (CIV-CO), 132.7 (CIV-CO), 132.4 (CHAr), 131.7
(2 x CHAr), 129.9 (2 x CHAr), 128.4 (2 x CHAr), 118.9 (2 x CHAr), 37.7 (CH2-CONH), 33.4 (CH2),
30.3 (CH2), 29.1 (CH2), 28.3 (CH2), 25.4 (CH2), 7.3 (ICH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C21H25NO 2I [M+H]+ 450.0922, found 450.0930.

197
N-(4-benzoylphenyl)-8-((4-methyl-5-((3-methyl-4-oxo-3,4-dihydrophthalazin-1-
yl)methyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl)thio)octanamide (63)

In a reactor tube was added K 2CO 3 (59 mg, 0.43 mmol, 2.2 eq.) to a solution of thiol 2 (56 mg,
0.19 mmol, 1 eq.) and iodo compound 65 (114 mg, 0.253 mmol, 1.3 eq.) in DMF (4 mL). The
solution was allowed to stir at 40 °C during 1 h 30, then at room temperature during 12 h. Upon
full conversion the mixture was diluted in AcOEt (15 mL), washed with water and brine, dried
over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The resulting residue was purified
by column chromatography on silica gel (DCM/MeOH, 100:0 to 95:5) to afford the corresponding
compound 63 as white powder (120 mg, 0.197 mmol, 99 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
9.02 (s, 1H, NH), 8.55 – 8.31 (m, 1H, CHAr Phthal), 8.22 – 8.08 (m, 1H, CHAr Phthal), 7.81 –
7.68 (m, 8H, 2 x CHAr Phthal, 3 x CHAr), 7.60 – 7.51 (m, 1H, CHAr), 7.49 – 7.40 (m, 2H, 2 x CHAr),
4.48 (s, 2H, CH2), 3.77 (s, 3H, NCH3-Phthal), 3.58 (s, 3H, NCH3-Triazole), 3.12 (t, 3J = 7.3 Hz, 2H,
SCH2), 2.40 – 2.29 (m, 2H, CH2-CONH), 1.66 (td, 3J = 7.4, 5.1 Hz, 4H, 2 x CH2), 1.36 (m, 2H, CH2),
1.26 (m, 4H, 2 x CH2).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
195.9 (CO-benzo), 172.5 (CONH), 159.5 (CO), 152.2 (CIV), 152.1 (CIV), 142.9 (CIV-NHCO), 140.7 (CIV-
S ), 138.1 (CIV-CO), 133.4 (CHAr Phthal), 132.5 (CHAr Phthal), 132.3 (CIV-CO), 132.1 (CHAr), 131.6 (2
x CHAr), 129.9 (2 x CHAr), 129.0 (CIV), 128.4 (2 x CHAr), 128.0 (CIV), 127.2 (CHAr Phthal), 125.1
(CHAr Phthal), 118.9 (2 x CHAr Phthal), 39.6 (NCH3-Phthal), 37.6 (CH2-CONH), 33.1 (CH2-S), 30.9
(NCH3-Triazole), 30.0 (CH2), 29.3 (CH2), 28.7 (CH2), 28.2 (CH2), 27.9 (CH2), 25.2 (CH2).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C34H37N6O 3S [M+H]+ 609.2650, found 609.2648.

198
Trimethyl((tributylstannyl)ethynyl)silane (69)

Under N2 atmosphere, to a solution of (tert-Butyldimethylsilyl)acetylene (5 g, 51 mmol, 1 eq.) in

fresly distilled THF (40 mL) was added n-BuLi (20 mL, 2.5 M in Hexane, 1 eq.) at -78°C. The
mixture was stirred 30 minutes. Tributyltin chloride (16 g, 51 mmol, 1 eq.) was added to the clear
colorless solution. The resulting solution was stirred 3 h at -78 °C. The reaction mixture was then
quenched with sat. NH4Cl aq. and extracted with cyclohexane (3x). The combined organic layers
were washed with brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure to
give a colorless liquid (20 g, quant.).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
1.61 – 1.47 (m, 6H, 3 x SnCH2CH2), 1.34 (dt, 3J = 14.3, 4J = 7.3 Hz, 6H, 3 x SnCH2CH2CH2),
1.11 – 0.95 (m, 6H, 3 x SnCH2), 0.91 (t, 3J = 7.3 Hz, 9H, 3 x CH2CH3), 0.16 (s, 9H, 3 SiCH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
119.00 (CC), 113.34 (CC), 28.98 (3 x CH2), 27.04 (3 x CH2), 13.79 (3 x CH2), 11.28 (3 x
CH3), 0.41 (3 x SiCH3).

199
Ethyl 4-(tributylstannyl)-5-(trimethylsilyl)isoxazole-3-carboxylate (71b)

To a solution of ethyl chloro hydroxyamino acetate (200 mg, 1.3 mmol, 1 eq.) and TMS-
acetylene tributyltin (511 mg, 1.3 mmol, 1 eq.) in DCM was added K2CO 3 (182 mg, 1.3 mmol, 1
eq.) The mixture was allowed to stir 4 h at room temperature. Water was added and the product
extracted with DCM (3x). The organic layer was washed with brine, dried, filtered and concentrated
under reduced pressure to give the crude as yellow liquid (550 mg).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
4.42 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 1.41 (s, 6H, 3 x CH2), 1.36 – 1.22 (s, 6H, 3 x SnCH2), 1.15 – 1.00
(m, 6H, 3 x CH2), 0.90 (t, 3J = 7.3 Hz, 3H, CH3), 0.86 (s, 9H, 3 x CH3), 0.38 (s, 9H, 3 x SiCH3).

200
Ethyl 4-(tributylstannyl)isoxazole-3-carboxylate (72b)

To a solution of isoxazole 71b, (1 eq.) CsF (1.1 eq.) was added, and the mixture was allowed to
stir 45 minutes at room temperature. Water was added and the product extracted with DCM.
The organic layer was washed with brine, dried, filtered and concentrated under reduced pressure
to give 72b as a yellow liquid (73 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
8.19 (s, 1H, CH), 4.44 (q, 3J = 7.3 Hz, 2H, OCH2), 1.55 – 1.47 (m, 6H, 3 x CH2), 1.34 – 1.24 (m,
6H, 3 x SnCH2), 1.16 – 1.05 (m, 6H, 3 x CH2), 0.92 (t, 3J = 7.3 Hz, 3H, CH3), 0.88 (s, 9H, 3 x
CH3).

201
Ethyl 2-amino-4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylate (66a)

To a suspension of ethyl cyanoacetate (2 g, 17.7 mmol, 1 eq.), cyclohexanone (1.83 mL,

17.7 mmol, 1 eq.) and sulfur powder (566.9 mg, 17.7 mmol, 1 eq.) in water (0.3 mL/mmol) was
added triethylamine (2.46 mL, 17.7 mmol, 1 eq.) at room temperature. The resulting orange
mixture was allowed to stir at room temperature for 5 h. The precipitate was added iced water,
filtered and washed with iced water to give the desired compound 66a as a dark brown solid
(3.83 g, 17 mmol, 96 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
4.26 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 2.77 – 2.63 (m, 2H, CH2), 2.50 (m, 2H, CH2), 1.89 – 1.64 (m,
4H, 2 x CH2), 1.33 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, OCH2CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
166.27 (CO), 161.75 (CIV-NH2), 132.62 (2 x CIV), 117.81 (CIV), 59.50 (OCH2), 27.08 (CH2), 24.67
(CH2), 23.39 (CH2), 22.96 (CH2), 14.60 (OCH2CH3).

HRMS (ES+):
m/z calculated for C11H16NO 2S [M+H]+ 226.0903, found 226.0902

202
Ethyl 2-amino-5,6-dihydro-4H-cyclopenta[b]thiophene-3-carboxylate (66b)

To a suspension of ethyl cyanoacetate (2 g, 17.7 mmol, 1 eq.), cyclopentanone (1.57 mL,

17.7 mmol, 1 eq.) and sulfur powder (566.9 mg, 17.7 mmol, 1 eq.) in water (0.3 mL/mmol) was
added triethylamine (2.46 mL, 17.7 mmol, 1 eq.) at room temperature. The resulting orange mixture
was allowed to stir at room temperature for 5 hours. The precipitate was added iced water, filtered
and washed with iced water to give the desired compound 66b as a dark brown solid (3.2 g, 15.5
mmol, 85.7 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
5.83 (s, 2H, NH2), 4.24 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 2.82 (ddt, 3J = 7.3 Hz, 3J = 6.2 Hz, 4J = 2.0
Hz, 2H, CH2), 2.71 (ddt, 3J = 7.3, 3J = 6.2 Hz, 4J = 2.0 Hz, 2H, CH2), 2.48 – 2.25 (m, 2H, CH2),
1.32 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3)

Litt. Data: M. M. Mojtahedi et al. Synth. Commun. 2010, 40, 2067-2074

1
H NMR (CDCl3):
5.83 (s, 2H), 4.25 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 2.85–2.80 (m, 2H), 2.74–2.69 (m, 2H), 2.36–2.26 (m, 2H),
1.33 (t, 3H, J = 7.1 Hz)

13
C NMR (CDCl3):
166.2, 165.8, 142.7, 121.4, 103.0, 59.4, 30.8, 28.9, 27.2, 14.4

203
Ethyl 2-amino-4,7-dihydro-5H-spiro[benzo[b]thiophene-6,2'-[1,3]dioxolane]-3-
carboxylate (66c)

To a suspension of ethyl cyanoacetate (1.8 g, 15.91 mmol, 1 eq.), 1,4-dioxaspiro[4.5]decan-8-one

(2.24 g, 14.32 mmol, 0.9 eq.) and sulfur powder (510.2 mg, 15.91 mmol, 1 eq.) in EtOH (24 mL)
was added morpholine (1.92 mL, 22.3 mmol, 1.4 eq.). After stirring for 10 hours at 60 °C, the
mixture was filtered and concentrated. The residue was solubilized in AcOEt and washed with
water. The resulting organic layer was dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced
pressure. The crude product was then purified by column chromatography on silica gel to give the
product 66c as a yellowish oil (4 g, 14.12 mmol, 88.7 %).

H NMR (400 MHz in CDCl 3)  (ppm):

1

7.26 (s, 1H, NH2), 4.25 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 4.01 (s, 4H, 2 x CH2 diox ), 2.92 (tt, 3J = 6.6
Hz, 4J = 1.8 Hz, 2H, CH2), 2.73 (s, 2H, CH2), 2.02 – 1.78 (m, 2H, CH2), 1.33 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H,
CH3).

204
6-(tert-butyl) 3-ethyl 2-amino-4,7-dihydrothieno[2,3-c]pyridine-3,6(5H)-dicarboxylate
(66d)

To a yellow suspension of ethyl cyanoacetate (1 g, 8.84 mmol, 1 eq.), tert-butyl 4-oxopiperidine-1-

carboxylate (1.76 g, 8.84 mmol, 1 eq.) and sulfur powder (283 mg, 8.84 mmol, 1 eq.) in water (0.3
mL/mmol) was added triethylamine (1.23 mL, 8.84 mmol,1 eq.). The resulting dark orange mixture
was allowed to stir 16 h at room temperature. The precipitate was added iced water, filtered and
washed with iced water. The resulting solid was solubilized in AcOEt and washed with water and
brine. The organic layer was then dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced
pressure to give the desired compound 66d as a yellow solid (2.5 g, 7.66 mmol, 86 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
5.99 (s, 2H, NH2), 4.35 (s, 2H, NCH2), 4.27 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 3.61 (t, 3J = 5.8 Hz, 2H,
NCH2CH2), 2.80 (m, 2H, NCH2CH2), 1.48 (s, 9H, 3 x CH3), 1.34 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, OCH2CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
165.96 (CO2Et), 162.46 (CIVNH2), 154.78 (CO2tBu), 131.30 (2 x CIV), 105.27 (CIVCO2Et), 80.09
(OCIVtBu), 59.72 (OCH2), 42.59 (NCH2), 41.75 (NCH2CH2), 28.57 (3 x CH3), 27.24
(NCH2CH2), 14.57 (CH3).

HRMS (ES+):
m/z calculated for C15H22N2O 4S [M+H]+ 327.1381, found 327.1379

205
Ethyl 2-(2-bromoacetamido)-4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylate (67a)

To a solution of bromoacetyl chloride (0.19 mL, 2.26 mmol, 1.5 eq.) in DCM was slowly
added 2-aminothiophene 66a (340 mg, 1.51 mmol, 1 eq.) and triethylamine (0.320 mL, 2.26
mmol, 1.5 eq.) at 0 °C. Upon complete addition, the mixture was allowed to warm up to room
temperature and stirred overnight. The solution was then concentrated under reduced pressure.
The resulting residue was solubilized in AcOEt and washed with water then brine. The organic
layer was dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure . The crude
product was then purified by column chromatography on silica gel to give the product 67a as a
yellow solid (576 mg, 1.66 mmol, 97 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
12.08 (s, 1H, NH), 4.37 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 4.16 (s, 2H, BrCH2), 2.92 – 2.70 (m, 2H,
CH2), 2.67 (m, 2H, CH2), 1.80 (m, 4H, 2 x CH2), 1.39 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
166.25 (CO2Et), 163.51 (NHCO), 145.99 (CIVNH), 131.49 (CIV), 127.79 (CIV), 113.22
(CIVCO2Et), 60.85 (OCH2), 42.40 (BrCH2), 26.47 (CH2), 24.56 (CH2), 23.08 (CH2), 22.92 (CH2),
14.50 (CH3).

HRMS (ES+):
m/z calculated for C13H16NO 3SBrNa [M+Na]+ 367.9928, found 367.9932

206
Ethyl 2-(2-bromoacetamido)-5,6-dihydro-4H-cyclopenta[b]thiophene-3-carboxylate (67b)

To a solution of bromoacetyl chloride (0.450 mL, 5.21 mmol, 1.1 eq.) in DCM was slowly
added 2-aminothiophene 66b (1 g, 4.73 mmol, 1 eq.) and triethylamine (1 mL, 7.10 mmol, 1.5
eq.) at 0 °C. Upon complete addition, the mixture was allowed to warm up to room temperature
and stirred overnight. The solution was then concentrated under reduced pressure. The resulting
residue was solubilized in AcOEt and washed with water then brine. The organic layer was dried
over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure . The crude product was then
purified by column chromatography on silica gel to give the product 67b as a yellow solid (1.46 g,
4.396 mmol, 92.9 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
11.76 (s, 1H, NH), 4.35 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 4.07 (s, 2H, BrCH2), 2.99 – 2.88 (m, 2H,
CH2), 2.86 (m, 2H, CH2), 2.39 (m, 2H, CH2), 1.38 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
165.95 (CO2Et), 162.94 (NHCO), 150.30 (CIVNH), 141.88 (CIV), 133.27 (CIV), 109.80
(CIVCO2Et), 60.83 (OCH2), 30.41 (CH2), 29.04 (CH2), 28.20 (CH2), 28.10 (BrCH2), 14.47 (CH3).

HRMS (ES-):
m/z calculated for C12H13NO 3SBr [M-H]- 331.9960, found 331.9956

207
Ethyl 2-(2-bromoacetamido)-4,7-dihydro-5H-spiro[benzo[b]thiophene-6,2'-
[1,3]dioxolane]-3-carboxylate (67c)

To a solution of bromoacetyl bromide (0.350 mL, 4.1 mmol, 1.5 eq.) in DCM was slowly added
2-aminothiophene 66c (1 g, 2.72 mmol, 1 eq.) and triethylamine (0.440 mL, 5.44 mmol, 2 eq.) at 0
°C. Upon complete addition, the mixture was allowed to warm up to room temperature and
stirred 4 hours. The solution was then concentrated under reduced pressure. The resulting
residue was solubilized in AcOEt and washed with water then brine. The organic layer was dried
over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure . The crude product was then
purified by column chromatography on silica gel to give the product 67c as a yellow solid (0.720
mg, 1.78 mmol, 65.5 %).

H NMR (400 MHz in CDCl 3)  (ppm):

1

7.26 (s, 1H, NH), 4.37 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 4.06 (s, 2H, BrCH2), 4.01 (s, 4H, 2 x CH2
diox ), 2.92 (tt, 3J = 6.6 Hz, 4J = 1.8 Hz, 2H, CH2), 2.73 (s, 2H, CH2), 2.02 – 1.78 (m, 2H, CH2),
1.33 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

HRMS (ASAP+):
m/z calculated for C15H19NO 5BrS [M+H]+ 404.0163, found 404.0167

208
6-(tert-butyl) 3-ethyl 2-(2-chloroacetamido)-4,7-dihydrothieno[2,3-c]pyridine-3,6(5H)-
dicarboxylate (67d)

To a solution of 2-aminothiophene 66d (1 g, 3.06 mmol, 1 eq.) and triethylamine (0.855 mL, 6.12
mmol, 2 eq.) in DCM was slowly added a solution of bromo-acetylchloride (1.5 eq., 4.6 mmol,
0.380 mL). in DCM at 0 °C. Upon complete addition, the mixture was allowed to warm up to room
temperature and stirred until completion. The solution was concentrated under reduced pressure.
The resulting residue was solubilized in AcOEt and washed with water then brine. The organic
layer was dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure . The crude product
was then purified by column chromatography on silica gel to give the product 67d as yellow solid
(630 mg, 1.56 mmol, 51 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
12.10 (s, 1H, NH), 4.51 (s, 2H, NH2), 4.38 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 4.26 (s, 2H, ClCH2), 3.66
(t, 3J = 5.8 Hz, 2H, NCH2CH2), 2.90 (d, 3J = 5.7 Hz, 2H, NCH2CH2), 1.48 (s, 9H, 3 x CH3), 1.40
(t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
170.40 (NHCO), 165.86 (CO2Et1), 163.76 (CO2tBu), 154.76 (CIVNH), 146.91 (CIV), 130.47 (CIV),
112.81 (CIVCO2Et), 80.34 (OCIVtBu), 61.14 (OCH2), 42.32 (NCH2), 42.22 (ClCH2), 28.59 (3 x
CH3), 27.07 (NCH2CH2), 26.65 (NCH2CH2), 14.48 (CH3).

HRMS (ES-):
m/z calculated for C17H22N2O 5SCl [M-H]- 401.0946, found 401.0938

209
Ethyl 2-(2-iodoacetamido)-4,5,6,7-tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylate (68a)

To a solution of 67a (845 mg, 2.44 mmol, 1 eq.) in acetone (15 mL) was added NaI (1.83 g, 12.20
mmol, 5 eq.). After strirring for 4 hours at room temperature, the resulting solution was
concentrated. The residue was solubilized with DCM (15 mL) and the remaining NaI and NaBr
salts were filtered off. The filtrate was finally concentrated under reduced pressure t o afford the
product 68a as a yellow solid (960 mg, quant.).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
11.70 (s, 1H, NH), 4.36 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 3.92 (s, 2H, ICH2), 2.77 (tt, 3J = 4.6 Hz, 4J =
1.9 Hz, 2H, CH2), 2.69 – 2.62 (m, 2H, CH2), 1.79 (m, 4H, 2 x CH2), 1.39 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
166.62 (CO2Et), 164.34 (NHCO), 147.05 (CIVN H), 131.30 (CIV), 127.76 (CIV), 112.61 (CIVCO2Et),
60.82 (OCH2), 26.51 (CH2), 24.56 (CH2), 23.10 (CH2), 22.95 (CH2), 14.48 (CH3), -2.01 (ICH2).

HRMS (ASAP+):
m/z calculated for C13H17NO 3SI [M+H]+ 393.9971, found 393.9974

210
Ethyl 2-(2-iodoacetamido)-5,6-dihydro-4H-cyclopenta[b]thiophene-3-carboxylate (68b)

To a solution of 67b (1.46 g, 4.39 mmol, 1 eq.) in acetone (15 mL) was added NaI (2.64 g, 17.6
mmol, 4 eq.). After strirring for 4 hours at room temperature, the resulting solution was
concentrated. The residue was solubilized with DCM (15 mL) and the remaining NaI and NaBr
salts were filtered off. The filtrate was finally concentrated under reduced pressure t o afford the
product 68b as a yellow solid (1.67 g, quant.)

1
H NMR (400 MHz in CDCl3):  (ppm):
11.42 (s, 1H, NH), 4.34 (q, 3J = 7.1 Hz, OCH2), 3.92 (s, 2H, ICH2), 2.97 – 2.69 (m, 4H, 2 x CH2),
2.38 (m, 2H, CH2), 1.38 (t, 3J = 7.1 Hz, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
166.12 (CO2Et), 164.17 (NHCO), 150.89 (CIVNH), 141.75 (CIV), 133.21 (CIV), 109.34
(CIVCO2Et), 60.79 (OCH2), 30.41 (CH2), 29.04 (CH2), 28.10 (CH2), 14.45 (CH3), -2.17 (ICH2).

HRMS (ES+):
m/z calculated for C12H15NO 3SI [M+H]+ 379.9814, found 379.9817

211
Ethyl 2-(2-iodoacetamido)-4,7-dihydro-5H-spiro[benzo[b]thiophene-6,2'-[1,3]dioxolane]-
3-carboxylate (68c)

To a solution of 67c (3.3 g , 8.2 mmol, 1 eq.) in acetone (20 mL) was added NaI (6.14 g, 41 mmol,
5 eq.). After strirring for 5 hours at room temperature, the resulting solution was concentrated. The
residue was solubilized with DCM (20 mL) and the remaining NaI and NaBr salts were filtered off.
The filtrate was finally concentrated under reduced pressure to afford the product 68c as a brown
liquid (3.7 g, quant.)

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
11.70 (s, 1H, NH), 4.35 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 4.03 (s, 4H, 2 x CH2 diox ), 3.92 (s, 2H, ICH2),
3.14 – 2.93 (m, 2H, CH2), 2.87 (s, 2H, CH2), 1.94 (t, 3J = 6.6 Hz, 2H, CH2), 1.39 (t, 3J = 7.1 Hz,
3H, CH3).

HRMS (ES+):
m/z calculated for C15H19NO 5SI [M+H]+ 452.0023, found 452.0029

212
6-(tert-butyl) 3-ethyl 2-(2-iodoacetamido)-4,7-dihydrothieno[2,3-c]pyridine-3,6(5H)-
dicarboxylate (68d)

To a solution of 67d (850 mg, 1.90 mmol, 1eq.) in acetone (10 mL) was added NaI (1.14 g, 7.6
mmol, 4 eq.). After strirring for 4 hours at 60 °C, the solution was concentrated. The residue was
solubilized with DCM (15 mL) and the remaining NaI and NaBr salts were filtered off. The filtrate
was finally concentrated under reduced pressure to afford the product 68d as a yellow liquid (950
mg, quant.)

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
11.68 (s, 1H, NH), 4.51 (s, 2H, NCH2), 4.37 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2), 3.93 (s, 2H, ICH2), 3.65
(t, 3J = 5.8 Hz, 2H, NCH2CH2), 2.88 (s, 2H, NCH2CH2), 1.48 (s, 9H, 3 x CH3), 1.40 (t, 3J = 7.1
Hz, 3H, CH3).

HRMS (ASAP-):
m/z calculated for C17H22N2O 5SI [M-H]- 493.0298, found 493.0294

213
Ethyl 5-(4-fluorophenyl)isoxazole-3-carboxylate (74a)

To a solution of ethyl chlorohydroxyamino acetate (1.14 g, 7.52 mmol, 1 eq.) and fluoro phenyl
acetylene (903.6 mg, 7.52 mmol, 1 eq.) in DCM was added triethylamine (1.05 mL, 7.52 mmol, 1
eq.). The mixture was allowed to stir 3h at room temperature. Water was added and the product
extracted with DCM. The organic layer was washed with brine, dried, filtered and concentrated
under reduced pressure to give 74a as a white powder (726 mg, 3.09 mmol, 41 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
8.40 – 7.61 (m, 2H, 2 x HAr), 7.18 (m, 2H, 2 x HAr), 6.87 (s, 1H, CH), 4.47 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H,
OCH2), 1.44 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
170.87 (CON), 165.52-163.01 (d, 1J = 252 Hz, C-F), 160.08 (CO), 157.20 (CNO), 128.29 (CAr),
128.21 (CAr), 123.21 (CIV), 116.69 (CAr), 116.47 (CAr), 99.87 (CH), 62.41 (CH2CH3), 14.30 (CH3).

HRMS (ASAP+):
m/z calculated for C12H11NO 3F [M+H]+ 236.0732, found 236.0723

214
Ethyl 5-phenylisoxazole-3-carboxylate (74b)

To a solution of ethyl chloro hydroxyamino acetate (300 mg, 1.98 mmol, 1 eq.) and phenylacetylene
(202 mg, 1.98 mmol,1 eq.) in DCM was added triethylamine (0.550 mL, 3.96 mmol, 2 eq.). The
mixture was allowed to stir 4 hours at room temperature. Water was then added, and the product
extracted with DCM. The organic layer was washed with brine, dried, filtered and concentrated
under reduced pressure to give 74b as a yellow liquid (150 mg, 0,693 mmol, 35 %). The crude
mixture was directly used in the next step without purification.

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
7.82 (m, 2H, 2 x HAr), 7.6 (m, 1H, HAr), 7.49 (m, 2H, 2 x HAr), 6.93 (s, 1H, CH), 4.48 (m, 2H,
OCH2), 1.43 (m, 3H, CH3).

Litt. Data: J. Med. Chem. 2008, 51, 4370–4373

215
Ethyl 5-(4-methoxyphenyl)isoxazole-3-carboxylate (74c)

To a solution of acetylene (470 µL, 3.6 mmol, 1.1 eq.) and Et3N (553 mg, 4.0 mmol, 1.2 eq.) in
anhydrous THF (10 mL), a solution of hydroxyiminoacetate (500 mg, 3.3 mmol, 1 eq.) in anhydrous
THF (20 mL) was added dropwise (5 minutes). The reaction was protected from light and stirred
at room temperature overnight. The reaction was incomplete, one equivalent of
hydroxyiminoacetate and one equivalent of triethylamine were added. The mixture was stirred for
24 h, quenched with water and extracted with AcOEt. The organic layers were washed with
saturated NaCl solution, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. The
resulting crude was purified by column chromatography on silica gel (Cyclohexane/AcOEt, 100 :0
to 90:10). The desired product 74c was obtained as a white solid (290 mg, 1.17 mmol, 36 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3) δ (ppm):
7.76-7.73 (m, 2H, 2 x HAr), 7.01-6.97 (m, 2H, 2 x HAr), 6.80 (s, 1H, Hisox), 4.47 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H,
OCH2), 3.87 (s, 3H, OCH3), 1.44 (t, 3J =7.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3) δ (ppm):
171.9 (CIV-isox ), 161.7 (CO), 160.3 (CIV-Ar), 157.1 (CIV-isox ), 127.7 (CHAr), 119.6 (CIV-Ar), 114.7 (CHAr),
98.7 (CHisox ), 62.3 (CH2), 55.6 (OCH3), 14.3 (CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C13H14N1O 4 [M+H]+ 248.0923, found 248.0929

216
Ethyl 5-(4-nitrophenyl)isoxazole-3-carboxylate (74d)

To a solution of 1-ethynyl-4-nitrobenzene (500 mg, 3.4 mmol, 1 eq.) in dry THF, was added ethyl-
2-chloro-2-(hydroxyamino)acetate (1.29 mg, 8.5 mmol, 2.5 eq.) and Amberlyst A-21 resin (6.6 mL
of a 1.3 meq/mL loaded resin, 8.5 eq.). The reaction became brown and was gently stirred at room
temperature for 24 hours. The resin was filtered, the crude concentrated to dryness and
subsequently purified by flash column chromatography on silica gel (eluent: Cyclohexane/AcOEt,
90:10) to afford the expected product 74d as a colorless paste (642 mg, 2.45 mmol, 72 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
8.36 (d, 3J = 9 Hz, 2 H, 2 x HAr), 7.95 (d, 3J = 9 Hz, 2 H, 2 x HAr), 7.11 (s, 1H, Hisox ), 4.49 (q, 3J =
7.2 Hz, 2H, OCH2), 1.46 (t, 3J = 7.2 Hz, 3H, CH3).

HRMS (ASAP+):
m/z calculated for C12H11N2O 5 [M+H]+ 263.0668, found 263.0664

Litt. Data : ACS Med. Chem. Lett. 2020, 11, 605-610

217
Ethyl 5-(3-nitrophenyl)isoxazole-3-carboxylate (74g)

To a solution of 1-ethynyl-3-nitrobenzene (500 mg, 3.4 mmol, 1 eq.) in dry THF, was added ethyl-
2-chloro-2-(hydroxyamino)acetate (1.29 mg, 8.5 mmol, 2.5 eq.) and Amberlyst A-21 resin (6.6 mL
of a 1.3meq/mL loaded resin, 8.5 eq.). The reaction was gently stirred at room temperature for 24
hours. The resin was filtered, the crude concentrated to dryness and subsequently purified by flash
column chromatography on silica gel (eluent: Cyclohexane/AcOEt, 90:10) to afford the product
74g as a colorless paste (508 mg, 1.9 mmol, 57 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
8.66 (m, 1H, HAr), 8.37-8.32 (m, 1H, HAr), 8.18-8.13 (m, 1H, Har), 7.76–7.69 (m, 1H, Har), 7.10 (s,
1H, Hisox ), 4.50 (q, 3J = 6 Hz, 2H, CH2), 1.46 (t, 3J = 6 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3)  (ppm):
169.18 (CIV), 159.67 (CO), 157.43 (CIV), 148.87 (CIV), 131.53 (CHAr), 130.64 (CHAr), 128.23 (CIV),
125.35 (CHAr), 121.06 (CHAr), 101.82 (CHisox), 62.69 (OCH2), 14.31 (CH3).

HRMS (ASAP+):
m/z calculated for C12H11N2O 5 [M+H]+ 263.0668, found 263.0664

218
(5-(4-fluorophenyl)isoxazol-3-yl)methanol (76a)

To a stirred solution of 74a (2.7 g, 11.48 mmol, 1 eq.) in THF/EtOH (2:1) at 0 °C was slowly
added NaBH4 (2.17 g, 57.40 mmol, 5 eq.). The resulting mixture was allowed to warm up to
room temperature overnight. A solution of NH4Cl was then added, the aqueous layer was
extracted with DCM, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure to
afford the product as a white powder (1.88 g, 9.73 mmol, 84.8 %)

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
8.11 – 7.52 (m, 2H, 2 x HAr), 7.15 (m, 2 x HAr), 6.53 (s, 1H, CH), 4.81 (s, 2H, CH2OH).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
169.58 (CON), 165.23-162.74 (d, 1J = 250 Hz, C-F), 164.35 (CNO), 128.12 (CAr), 128.04 (CAr),
123.86 (CIV), 116.50 (CAr), 116.28 (CAr), 98.17 (CH), 57.27 (CH2OH)

HRMS (ASAP+):
m/z calculated for C10H9NO 2F [M+H]+ 194.0624, found 194.0617.

219
(5-phenylisoxazol-3-yl)methanol (76b)

To a stirred solution of 74b (1 g, 4.6 mmol, 1 eq.) in THF/EtOH (2:1) at 0 °C was slowly added
NaBH4 (870.8 mg, 23.02 mmol, 5 eq.). The resulting mixture was allowed to warm up to room
temperature for 6 h. A solution of NH4Cl was then added, the aqueous layer was extracted with
DCM, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure to afford the
product 76b as a white powder (584 mg, 3.33 mmol, 74.4 %)

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
7.86 – 7.72 (m, 2H, HAr), 7.50 – 7.40 (m, 3H, HAr), 6.59 (s, 1H, CH), 4.82 (d, 3J = 6.3 Hz, 2H,
OCH2), 2.09 (t, 3J = 6.3 Hz, 1H, OH)

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
170.54 (CON), 164.19 (CN), 130.45 (CAr) 129.16 (2 x CAr) 127.42 (CAr), 125.98 (2 x CAr), 98.33
(CH), 57.38 (OCH2)

HRMS (ASAP+):
m/z calculated for C10H10NO 2 [M+H]+ 176.0719, found 176.0712

220
(5-(4-methoxyphenyl)isoxazol-3-yl)methanol (76c)

To a cooled solution of ester (260 mg, 1.05 mmol, 1 eq.) in anhydrous mix of DCM and MeOH
was added NaBH4 (118 mg, 3.1 mmol, 3 eq.) portionwise at 0 °C. After completion of the addition,
the reaction mixture was allowed to warm to room temperature and the stirred for 4 h. The reaction
mixture was again cooled to 0 °C, and the excess sodium borohydride was quenched with a
saturated aqueous NH4Cl solution. This mixture was diluted with of ethyl acetate, washed with
saturated aqueous NH4Cl solution, water, brine, dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated
under reduced pressure. Purification of the crude reaction mixture by flash column
chromatography (DCM/MeOH, 100:0 to 97:3) gave the desired compound 76c as a white solid
(150 mg, 0.73 mmol, 70 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3) δ (ppm):
7.74 – 7.66 (m, 2H, 2 x HAr), 7.01 – 6.92 (m, 2H, 2 x HAr), 6.46 (s, 1H, Hisox ), 4.79 (s, 2H, CH2),
3.86 (s, 3H, OCH3), 2.17 (s, 1H, OH).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3) δ (ppm):
170.5 (CIV-isox ), 164.2 (CIV-Ar), 161.3 (CIV-isox ), 127.6 (CHAr), 120.3 (CIV-Ar), 114.5 (CHAr), 97.0
(CHisox ), 57.3 (CH2), 55.6 (OCH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C11H12N1O 3 [M+H]+ 206.0817, found 206.0818.

221
(5-(3-nitrophenyl)isoxazol-3-yl)methanol (76d)

To a solution of isoxazole 74d (450 mg, 1.72 mmol, 1 eq.) in a mixture of DCM/EtOH (1:1, 40
mL) was added NaBH4 (389 mg, 10.3 mmol, 6 eq.). After 18h of reaction, the mixture was
concentrated. The crude was diluted in AcOEt, quenched with HCl (1 N) at 0 °C. After further
extraction with AcOEt and washing with brine, the organic layer was dried over Na 2SO 4, filtered
then concentrated under reduced pressure. Purification by flash column chromatography on silica
gel (eluent: DCM/MeOH, 98:2) afforded the expected product 76d as a crystalline solid (320 mg,
1.46 mmol, 85 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
8.33 (m, 2H, 2 x Har), 7.94 (m, 2H, 2 x Har), 6.78 (s, 1H, Hisox ), 4.82 (s, 2H, CH2OH).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C10H8N2O 4Na [M+Na]+ 243.0382, found 243.0374.

222
(5-(3-fluorophenyl)isoxazol-3-yl)methanol (76e)

To a cooled solution of ester 74e (3.25 g, 13.8 mmol, 1 eq., in mixture with 75e) in anhydrous mix
of THF and EtOH was added NaBH4 (4.18 g, 110 mmol, 8 eq.) portionwise at 0 °C. After
completion of the addition, the reaction mixture was allowed to warm to room temperature and
then stirred for 4 h. The reaction mixture was again cooled to 0 °C, and the excess sodium
borohydride was quenched with a saturated aqueous NH 4Cl solution. This mixture was diluted
with of ethyl acetate, washed with saturated aqueous NH 4Cl solution, water, brine, dried over
Na 2SO 4, filtered and concentrated under reduced pressure. Purification of the crude reaction
mixture by flash column chromatography (DCM/MeOH, 100:0 to 97:3) afforded the desired
compound 76e as a white solid (1.56 mg, 8.1 mmol, 59 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3) δ (ppm):
7.57 – 7.40 (m, 3H, HAr), 7.14 (m, 1H, HAr), 6.61 (s, 1H, Hisox ), 4.82 (s, 2H, CH2).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3) δ (ppm):
169.1 (CIV-isox ), 164.5 (CIV-isox ), 163.0 (CIV-Ar), 130.8 (CIV-Ar), 129.2 (CHAr), 121.6 (CHAr), 117.3
(CHAr), 112.9 (CHAr), 99.3 (CHisox ).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C10H9N1O 219F1 [M+H]+ 194.0617, found 194.0620.

223
5-(2-methoxyphenyl)isoxazol-3-yl)methanol (76f)

To a cooled solution of ester 74f (417 mg, 1.68 mmol, 1 eq., in mixture with 75f) in anhydrous mix
of THF and EtOH was added NaBH4 (508 mg, 13.5 mmol, 8 eq.) portionwise at 0 °C. After
completion of the addition, the reaction mixture was allowed to warm to room temperature and
the stirred for 4 h. The reaction mixture was again cooled to 0 °C, and the excess sodium
borohydride was quenched with a saturated aqueous NH4Cl solution. This mixture was diluted
with ethyl acetate, washed with saturated aqueous NH 4Cl solution, water, brine, dried over Na 2SO 4,
filtered and concentrated under reduced pressure. Purification of the crude reaction mixture by
flash column chromatography (DCM/MeOH, 100:0 to 97:3) was difficult, the desired compound
was obtained impure as a white oil (180 mg, 0.88 mmol, 44 % calculated from 1H NMR).

1
H NMR (300 MHz in CDCl3) δ (ppm):
7.97 (dd, 3J = 7.9 Hz, 4J = 1.8 Hz, 1H, HAr), 7.44-7.39 (m, 1H, HAr), 7.10-7.00 (m, 2H, H1, HAr),
6.86 (s,1H, Hisox), 4.83 (d, 3J = 5.9 Hz, 2H, CH2OH), 3.96 (s, 3H, OCH3), 2.19 (t, 3J = 5.9 Hz, 1H,
OH).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C11H1N1O 3Na 1 [M+Na]+ 228.0637, found 228.0642.

224
(5-(3-nitrophenyl)isoxazol-3-yl)methanol (76g)

To a solution of isoxazole 74g (444 mg, 1.69 mmol, 1 eq.) in a mixture of DCM/EtOH (1:1, 40mL)
was added NaBH4 (284 mg, 10.2 mmol, 6 eq.). After 8 h of reaction, the mixture was concentrated
to dryness. The crude was diluted in AcOEt, and quenched with HCl (1 N) at 0°C. After further
extraction with AcOEt and washing with brine, the organic layer was dried over Na 2SO 4, filtered
then concentrated to dryness. Purification by flash column chromatography on silica gel (eluent:
DCM/MeOH, 98:2) afforded the expected product 76g as a crystalline solid (281 mg, 1.26 mmol,
75 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
8.62 (m, 1H, HAr), 8.30 (m, 1H, HAr), 8.12 (m, 1H, HAr), 7.69 (m, 1H, HAr), 6.77 (s, 1H, Hisox), 4.86
(s, 2H, CH2OH), 2.14 (s, 1H, OH).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3)  (ppm):
168.86 (CIV), 164.58 (CIV), 148.82 (CIV), 131.46 (CHAr), 130.46 (CHAr), 128.91 (CIV), 124.84 (CHAr),
120.94 (CHAr), 100.20 (CHisox), 57.19 (CH2).

HRMS (ASAP+):
m/z calculated for C10H9N2O 4 [M+H]+ 221.0562, found 221.0562.

225
Ethyl 2-(2-((5-(4-fluorophenyl)isoxazol-3-yl)methoxy)acetamido)-4,5,6,7-
tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylate (77a)

To a solution of alcohol 76a (320 mg, 1.83 mmol,1 eq.) in DMF was added NaH 60 % dispersed
in mineral oil (200 mg, 1.04 mmol, 2 eq.). The mixture was allowed to stir 15 minutes at 0 °C.
Compound 68a (203.4 mg, 0.517 mmol, 1 eq.) was then added to the mixture. The solution was
allowed to stir 1 h from 0 °C to room temperature. Water was added and the product extracted
with DCM. The organic layer was washed with brine, dried, filtered and concentrated under
reduced pressure. The residue was purified by chromatography on silica gel to give the product 77a
as a white solid (120 mg, 0.262 mmol, 50 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
11.96 (s, 1H, NH), 7.87 – 7.74 (m, 2H, 2 HAr), 7.21 – 7.10 (m, 2H, 2 HAr), 6.91 (s, 1H, CH), 4.82
(s, 2H, CH2O), 4.36 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2CH3), 4.28 (s, 2H, CH2CONH), 2.87 – 2.73 (m,
2H, CH2), 2.70 – 2.54 (m, 2H, CH2), 2.01 – 1.74 (m, 4H, 2 CH2), 1.39 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
169.77 (CON), 166.30 (CONH), 166.21 (CO2Et), 165.24-162.74 (d, 1J = 250 Hz, C-F), 161.47
(CNO), 146.22 (CNH), 131.27 (CIV), 128.13 (CAr), 128.04 (CAr), 127.39 (CIV), 123.94 (CIV), 116.44
(CAr), 116.22 (CAr), 112.73 (CIV), 99.03 (CH), 69.79 (CH2CONH), 65.27 (OCH2), 60.55
(OCH2CH3), 26.55 (CH2), 24.59 (CH2), 23.12 (CH2), 22.99 (CH2), 14.53 (CH3).

HRMS (ASAP+):
m/z calculated for C23H24N2O 5SF [M+H]+ 459.1392, found 459.1390.

226
Ethyl 2-(2-((5-phenylisoxazol-3-yl)methoxy)acetamido)-4,5,6,7-
tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylate (77b)

To a solution of alcohol 76b (320 mg, 1.83 mmol, 1 eq.) in DMF was added NaH 60 % dispersed
in mineral oil (87.7 mg, 3.66 mmol, 2 eq.). The mixture was allowed to stir 10 minutes at 0 °C.
Compound 68a (718 mg, 1.83 mmol, 1 eq.) was then added to the mixture. The solution was
allowed to stir 6 h from 0 °C to romm temperature. Water was added and the product extracted
with DCM. The organic layer was washed with brine, dried, filtered and concentrated under
reduced pressure. The residue was purified by chromatography on silica gel to give the product
77b as a white solid (500 mg, 1.14 mmol, 62 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
11.99 (s, 1H, NH), 7.96 – 7.75 (m, 2H, HAr), 7.46 (m, 3H, HAr), 6.98 (s, 1H, CH), 4.83 (s, 2H,
CH2O), 4.37 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2CH3), 4.29 (s, 2H, CH2CONH), 3.24 – 2.73 (m, 2H,
CH2), 2.73 – 2.54 (m, 2H, CH2), 1.79 (t, 3J = 3.1 Hz, 4H, 2 CH2), 1.38 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
170.71 (CON), 166.26 (2 x CO), 161.37 (CNO), 146.14 (CNH), 131.25 (CAr), 130.43 (CAr), 129.08
(2 x CAr), 127.51 (CIV), 127.33 (CIV), 125.99 (2 x CAr), 112.71 (CIV), 99.22 (CIV), 69.74 (CH2CONH),
65.29 (OCH2), 60.59 (CH3CH2O), 26.52 (CH2), 24.56 (CH2), 23.09 (CH2), 22.96 (CH2), 14.52
(CH3CH2O).

HRMS (ES+):
m/z calculated for C23H14N2O 5SNa [M+Na]+ 463.1291, found 463.1304

227
Ethyl 2-(2-((5-(4-methoxyphenyl)isoxazol-3-yl)methoxy)acetamido)-4,5,6,7-
tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylate (77c)

To a solution of the alcohol 76c (115 mg, 0.56 mmol, 1 eq.) in dry DMF was added NaH 60 %
dispersed in mineral oil (34 mg eq, 0.84 mmol, 1.5 eq.). After 10 minutes, the iodo compound 68a
(240 mg, 0.62 mmol, 1.1 eq.) was added to the mixture. The reaction was stopped after completion
of the reaction (1 h), diluted with AcOEt, washed with NH4Cl, brine, dried over Na 2SO 4, filtered
and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash column chromatography
on silica gel (eluent: CyclohexaneAcOEt, 80:20) to afford the expected product 77c as a brown oil
(106 mg, 0.23 mmol, 41 %).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):
11.95 (s, 1H, NH), 7.79 – 7.71 (m, 2H, 2 x Har), 7.01 – 6.93 (m, 2H, 2 x HAr), 6.80 (s, 1H, Hisox),
4.81 (s, 2H, CH2O), 4.36 (q, 3J = 7.2 Hz, 2H, CH2CH3), 4.27 (s, 2H, CH2CO), 3.87 (s, 3H, OCH3),
2.83 – 2.75 (m, 2H, CH2-cyclo), 2.70 – 2.62 (m, 2H, CH2-cyclo), 1.86 – 1.75 (m, 4H, 2 x CH2-cyclo), 1.38
(t, 3J = 7.2 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):
170.7 (C-S), 166.3 (CIV-isox ), 166.2 (CO), 161.4 (CIV), 161.3 (CIV), 146.2 (CO), 131.3 (CS), 127.6
(CIV), 127.3 (CIV), 120.4 (CIV), 114.5 (2 x CHAr), 112.7 (CIV), 97.8 (CHisox ), 69.7 (OCH2), 65.3
(OCH2), 60.6 (CH2CH3), 55.6 (OCH3), 26.5 (CH2-cyclo), 24.6 (CH2-cyclo), 23.1 (CH2-cyclo), 23.0
(CH2-cyclo), 14.4 (CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C24H26N2O 6SNa [M+Na]+ 493.1409, found 493.1407

228
Ethyl 2-(2-((5-(4-nitrophenyl)isoxazol-3-yl)methoxy)acetamido)-4,5,6,7-
tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylate (77d)

To a solution of the alcohol 76d (70 mg, 0.31 mmol, 1 eq.) in dry DMF was added NaH 60 %
dispersed in mineral oil (16.8 mg, 0.7 mmol, 2.2 eq.). After 30 minutes, the iodo compound 68a
(137.5 mg, 0.35 mmol, 1.1 eq.) was added to the mixture. The reaction was stopped after 1 h 30
due to dark color of the solution, washed with NH 4Cl then brine, dried over Na2SO4 filtered and
concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash column chromatography on
silicagel (eluent: Cyclohexane/AcOEt, 80:20) to afford the expected product 77d as a yellow
powder (30 mg, 0.062 mmol, 20 %).

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
11.97 (s, 1H, NH), 8.32 (d, J = 6.9 Hz, 2H, HAr), 8.99 (d, 3J = 6.9 Hz, 2H, Har), 7.20 (s, 1H, Hiso),
4.85 (s, 2H, OCH2), 4.37 (q, 3J = 5.4 Hz 2H, CH2CH3), 4.30 (s, 2H, CH2CO), 2.78 (m, 2H, CH2),
2.66 (m, 2H, CH2), 1.79 (m, 4H, 2 x CH2), 1.40 (t, 3J = 5.4 Hz, 3H, CH2CH3).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3)  (ppm):
167.90 (CIV-isox ), 166.31 (CO2 or CONH or CIV-isox ), 165.86 (CONH or CO2 or CIV-isox ), 161.75
(CO2 or CONH or CIV-isox ), 148.57 (CIV-Ar), 146.11 (CIV-thiophen), 132.77 (CIV), 131.10 (CIV-thiophen),
127.33 (CIV-thiophen), 126.58 (2 x CAr), 124.35 (2 x CAr), 121.56 (CIV), 112.58 (CIV-thiophen), 101.85 (CH
-isox ), 69.75 (CH2CO), 64.98 (CH2O), 60.41 (CH2CH3), 26.42 (CH2), 24.44 (CH2), 22.94 (CH2),
22.82 (CH2), 14.40 (CH2CH3).

HRMS (ESI+):
m/z calculated for C23H23N3O 7SNa [M+Na]+ 508.1154, found 508.1158

229
Ethyl 2-(2-((5-(3-fluorophenyl)isoxazol-3-yl)methoxy)acetamido)-4,5,6,7-
tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylate (77e)

To a solution of the alcohol 76e (70 mg, 0.31 mmol, 1 eq.) in dry DMF was added NaH 60 %
dispersed in mineral oil (16.8 mg, 0.7 mmol, 2.2 eq.). After 30 minutes, the iodo compound 68a
(137.5 mg, 0.35 mmol, 1.1 eq.) was added to the mixture. The reaction was stopped after 1 h 30
due to dark color of the solution, washed with NH 4Cl, then brine, dried over Na 2SO 4, filtered and
concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash column chromatography on
silica gel (eluent: Cyclohexane/AcOEt, 80:20) to afford the expected product 77e as a yellow
powder (30 mg, 0.062 mmol, 20 %).

1
H NMR (300 MHz in CDCl3)  (ppm):

11.97 (s, 1H, NH), 8.32 (d, 3J = 6.9 Hz, 2H, Har), 8.99 (d, 3J = 6.9 Hz, 2H, Har), 7.20 (s, 1H, Hiso),
4.85 (s, 2H, CH2O), 4.37 (q, 3J = 5.4 Hz, 2H, CH2CH3), 4.30 (s, 2H, CH2CO), 2.78 (m, 2H, CH2),
2.66 (m, 2H, CH2), 1.79 (m, 4H, 2 x CH2), 1.40 (t, 3J = 5.4 Hz, 3H, CH2CH3).

13
C NMR (75 MHz in CDCl3)  (ppm):

167.90 (CIV-isox ), 166.31 (CO2Et or CONH or CIV-isox ), 165.86 (CONH or CO2Et or CIV-isox),
161.75 (CO2Et or CONH or CIV-isox ), 148.57 (CIV-Ar), 146.11 (CIV-thiophen), 132.77 (CIV), 131.10 (CIV-
thiophen ), 127.33 (CIV-thiophen), 126.58 (2 x CAr), 124.35 (2 x CAr), 121.56 (CIV), 112.58 (CIV-thiophen),
101.85 (CH-isox ), 69.75 (CH2CO), 64.98 (CH2O), 60.41 (CH2CH3), 26.42 (CH2), 24.44 (CH2),
22.94 (CH2), 22.82 (CH2), 14.40 (CH2CH3).

HRMS (ESI+):

m/z calculated for C23H23N3O 7SNa [M+Na]+ 508.1154, found 508.1158

230
Ethyl 2-(2-((5-(3-nitrophenyl)isoxazol-3-yl)methoxy)acetamido)-4,5,6,7-
tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylate (77g)

To a solution of the alcohol 76g (320 mg, 1.45 mmol, 2 eq.) in dry DMF was added NaH 60 %
dispersed in mineral oil (44 mg, 1.81 mmol, 2 eq.). After 30 minutes, the iodo compound 68a (285
mg, 0.75 mmol, 1 eq.) was added to the mixture. After 3 h, AcOEt was added to the mixture. The
solution was washed with NaCl, the organic layer was dried over Na 2SO 4, filtered and concentrated
under reduced pressure. The crude was purified by flash column chromatography on silica gel
(eluent: Cyclohexane/AcOEt, 80:20) to afford the expected product 77g as a yellow powder (46
mg, 0.98 mmol, 13 %).

1
H NMR of crude let us expect around 50 % of conversion.

1
H NMR (300 MHz, CDCl3)  (ppm):
12.06 (s, 1H, NH), 8.63 (m, 1H, HAr), 8.31 (m, 1H, HAr), 8.18 (m, 1H, HAr), 7.69 (m, 1H, HAr),
7.25 (s, 1H, Hisox ), 4.85 (s, 2H, OCH2), 4.40 (q, 3J = 7.5 Hz, 2H, OCH2CH3), 4.31 (s, 2H, CH2CO),
2.79 (m, 2H, CH2), 2.66 (m, 2H, CH2), 1.79 (m, 4H, 2 x CH2), 1.40 (t, 3J = 7.5 Hz, 3H, OCH2CH3).

13
C NMR (75 MHz, CDCl3)  (ppm):
167.96 (CIV), 166.53 (CO), 166.06 (CO), 161.86 (CIV), 148.79 (CIV), 146.13 (CIV), 131.41 (CHAr),
130.42 (CHAr), 129.02 (CIV), 127.40 (CIV), 124.81 (CHAr), 120.85 (CHAr), 112.75 (CIV), 101.05
(CHisox ), 69.89 (CH2), 65.16 (CH2), 60.80 (CH2CH3), 26.53 (CH2), 24.57 (CH2), 23.06 (CH2),
22.94 (CH2), 14.43 (CH2CH3).

HRMS (ASAP+):
m/z calculated C23H24N3O 7S [M+H]+ 486.1335, found 486.1335.

231
Ethyl 2-(2-((5-(4-fluorophenyl)isoxazol-3-yl)methoxy)acetamido)-5,6-dihydro-4H-
cyclopenta[b]thiophene-3-carboxylate (83)

To a solution of alcohol 76a (407.5 mg, 2.11 mmol, 2 eq.) in DMF (5 mL) was added NaH 60 %
dispersed in mineral oil (38 mg, 1.58 mmol, 1.5 eq.). The mixture was allowed to stir 20 minutes at
0 °C. Compound 68b (400 mg, 1.05 mmol, 1 eq.) was then added to the mixture. The solution was
allowed to stir 45 minutes from 0 °C to room temperature. Water was added and the product
extracted with DCM. The organic layer was washed with brine, dried, filtered and concentrated
under reduced pressure. The residue was purified by chromatography on silica gel to give the
product 79 as a white solid (70 mg, 0.157 mmol, 15 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
11.72 (s, 1H, NH), 7.94 – 7.70 (m, 2H, 2 x HAr), 7.23 – 7.07 (m, 2H, 2 x HAr), 6.94 (s, 1H, CH),
4.82 (s, 2H, CH2O), 4.34 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, OCH2CH3), 4.28 (s, 2H, CH2CONH), 2.95 – 2.88
(m, 2H, CH2), 2.88 – 2.81 (m, 2H, CH2), 2.38 (m, 2H, CH2), 1.38 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH3).

3
C NMR (100 MHz in CDCl3)  (ppm):
169.74 (CON), 166.07 (CONH), 165.81 (CO2Et), 163.97 (d, 1J = 251.3 Hz, CF), 161.48 (CNO),
150.18 (CIV), 141.71 (CNH), 132.78 (CIV), 128.12 (CAr), 128.03 (CAr), 123.97 (CIV), 116.41 (CAr),
116.19 (CAr), 109.38 (CIV), 99.04 (CH), 69.71 (CH2CONH), 65.27 (OCH2), 60.51 (CH2CH3),
30.46 (CH2), 29.02 (CH2), 28.07 (CH2), 14.49 (CH3).

HRMS (ES+):
m/z calculated C22H21N2O 5SFNa [M+Na]+ 467.1058, found 457.1053

232
Ethyl 2-(2-((5-(4-fluorophenyl)isoxazol-3-yl)methoxy)acetamido)-4,7-dihydro-5H-
spiro[benzo[b]thiophene-6,2'-[1,3]dioxolane]-3-carboxylate (84)

To a solution of alcohol 76a (107 mg, 0.554 mmol, 2 eq.) in DMF (10 mL) was added NaH 60 %
dispersed in mineral oil (14 mg, 0.554 mmol, 2 eq.). The mixture was allowed to stir 10 minutes at
0 °C. Compound 68d (125 mg, 0.277 mmol, 1 eq.) was then added to the mixture. The solution
was allowed to stir 45 minutes from 0 °C to room temperature. Water was added and the product
extracted with DCM. The organic layer was washed with brine, dried, filtered and concentrated
under reduced pressure. The residue was purified by chromatography on silica gel to give the
product 84 as a white solid (70 mg, 0.135 mmol, 49 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
11.94 (s, 1H, NH), 7.85 – 7.71 (m, 2H, 2 x HAr), 7.20 – 7.08 (m, 2H, 2 x HAr), 6.89 (s, 1H, CH),
4.81 (s, 2H, OCH2), 4.34 (q, 3J = 7.1 Hz, 2H, CH2), 4.27 (s, 2H, CH2CONH), 4.02 (s, 4H, 2 x
CH2), 3.00 (t, 3J = 6.6 Hz, 2H, CH2), 2.87 (s, 2H, CH2), 1.93 (t, 3J = 6.6 Hz, 2H, CH2), 1.37 (t, 3J
= 7.2 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3):
169.73 (NHCO), 169.3 (CON), 165.76 (CO2Et), 163 (C-F), 164.5 (CNO), 157.8 (CIVNH), 132.3

(2 x CIV), 128.12 (CAr), 128.04 (CAr), 123.86 (CIV), 120.5 (CHIV(OCH2)2), 116.50 (CAr), 116.28 (CAr),

103.7 (CIVCO2Et), 98.17 (CH), 69.4 (CH2CONH), 67.5 (OCH2), 64.4 (2 x CH2-diox ), 60.85

(OCH2CH3), 39.34 (CH2), 32.4 (CH2CH2), 14.72 (CH2CH3), 12.02 (CH2CH2).

233
6-(tert-butyl) 3-ethyl 2-(2-((5-(4-fluorophenyl)isoxazol-3-yl)methoxy)acetamido)-4,7-
dihydrothieno[2,3-c]pyridine-3,6(5H)-dicarboxylate (85)

To a solution of alcohol 76a (250 mg, 1.29 mmol, 2 eq.) in DMF (15 mL) was added NaH 60 %
dispersed in mineral oil (31.1 mg, 1.29 mmol, 2 eq.). The mixture was allowed to stir 10 minutes at
0 °C. Compound 68e (320 mg, 0.647 mmol, 1 eq.) was then added to the mixture. The solution
was allowed to stir 3 h from 0 °C to room temperature. Water was added and the product extracted
with DCM. The organic layer was washed with brine, dried, filtered and concentrated under
reduced pressure. The residue was purified by chromatography on silica gel to give the product 85
as a white solid (317 mg, 0.566 mmol, 87.5 %).

1
H NMR (400 MHz in CDCl3)  (ppm):
11.93 (s, 1H, NH), 7.79 (m, 2H, 2 x CHAr), 7.08 (m, 2H, 2 x CHAr), 6.81 (s, 1H, CH), 4.50 (s, 2H
NCH2), 4.36 (d, 3J = 8.1 Hz, 2H, OCH2), 4.27 (s, 2H COCH2OCH2), 4.29 (s, 2H
COCH2OCH2),3.66 (d, 3J = 7.2 Hz, 2H, NCH2CH2), 2.89 (d, 3J = 7.2 Hz, 2H, NCH2CH2), 1.48
(s, 9H, 3 x CH3), 1.39 (t, 3J = 8.1 Hz, 3H, CH3).

13
C NMR (100 MHz in CDCl3):
171.33 (NHCO), 169.3 (CON), 166.6 (CO2Et), 162.9 (C-F), 164.35 (CNO), 162.8 (CO2tBu),
157.6 (CIVNH), 153.4 (NCO2tBu), 131.49 (CIV), 128.12 (CAr), 128.04 (CAr), 123.86 (CIV), 116.50
(CAr), 116.28 (CAr), 103.7 (CIVCO2Et), 98.17 (CH), 79.43 (OCIVtBu), 69.1 (CH2CONH), 67.47
(OCH2), 60.58 (OCH2CH3), 44.32 (NCH2), 27.77 (NCH2CH2), 28.43 (3 x CH3), 26.51
(NCH2CH2), 14.6 (CH2CH3).

HRMS (ASAP-):
m/z calculated C27H29N3O 7SF [M-H]- 558.1717, found 558.1710

234
Ethyl 2-(3-cyano-4-(3-fluorophenyl)-4-oxobutanamido)-4,5,6,7-
tetrahydrobenzo[b]thiophene-3-carboxylate (82)

To a solution of the alcohol 76e (193 mg, 1 mmol, 2 eq.) in dry DMF was added NaH 60 %
dispersed in mineral oil (53 mg, 1.1 mmol, 2.2 eq.). After 60 minutes, the iodo compound 68a (196
mg, 0.5 mmol, 1 eq.) was added to the mixture. After 45 minutes, AcOEt (40 mL) were added to
the mixture. The solution was washed with NaCl, the organic layer was dried over Na 2SO 4, filtered
and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash column chromatography
on silica gel (eluent: Cyclohexane/AcOEt, 80:20) to afford the product 82 as a pale-yellow powder
(214 mg, quant.).

1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm):

11.55 (s, 1H, NH), 7.89 – 7.82 (m, 1H, HAr), 7.76 – 7.68 (m, 1H, HAr), 7.57 – 7.47 (m, 1H, HAr),
7.41 – 7.31 (m, 1H, HAr), 4.96 (dd, 3J HaCH2CO = 8.9 Hz, 3J HbCH2CO = 4.8 Hz, 1H, CHCN), 4.34
(q, 3J = 7.2 Hz, 2H, CH2CH3), 3.46 (dd, 3J CHCN = 8.9 Hz, 2J = 16.3 Hz, 1H, HaCH2CO), 3.10
(dd, 3J CHCN = 4.8 Hz, 2J = 16.3 Hz, 1H, HbCH2CO), 2.79 – 2.71 (m, 2H, CH2-cyclo), 2.63 – 2.57
(m, 2H, CH2-cyclo), 1.77 (t, 3J = 3.2 Hz, 4H, 2 x CH2-cyclo), 1.39 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, CH2CH3).

13
C NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm):

187.7 (CO), 166.7 (NHCS), 165.0 (CONH), 163.0 (CIV-Ar), 146.5 (CO2Et), 135.8 (CIV-Ar), 131.1
(CIV-thiophen), 131.0 (CHAr), 127.4 (CIV-thiophen), 124.9 (CHAr), 122.0 (CHAr), 116.2 (CHAr), 115.9
(CN), 112.4 (CIV-thiophen), 60.9 (CH2CH3), 34.8 (CH2CO), 34.3 (CH-CN), 26.4 (CH2-cyclo), 24.4
(CH2-cyclo), 23.0 (CH2-cyclo), 22.9 (CH2-cyclo), 14.4 (CH2CH3).

HRMS (ESI+):

m/z calculated C22H21N2O 4S19FNa [M+Na]+ 451.1104, found 451.1094.

235
236
Titre: Conception, Synthèse et Evaluation de Molécules de Faible Poids Moléculaire Inhibitrices du
Système Interleukine (IL)-15.

Mots clés: Interleukine-15, interactions protéine-protéine, inhibiteur IL-15, petites molécules,

criblage virtuel

Résumé: L'interleukine (IL)-15 est une cytokine En s’appuyant sur nos précédents nos travaux, de
pléiotrope structurellement proche de l'IL-2, nouvelles modif ications ont été apportées à notre
partageant toutes deux les sous-unités des première série labellisée IBI. Dans un deuxième
récepteurs IL-2Rβ et γc. L'IL-15 joue un rôle temps, nous avons réalisé un docking à partir du
important dans l'immunité innée et adaptative, criblage virtuel de bibliothèques de composés sur
soutenant l'activation et la prolif ération des un pharmacophore af f iné basé sur des résidus
cellules NK, NK-T et CD8+ T. En cas de spécif iques de l'IL-15, identif iés sur le site de
dérèglement, des niveaux élevés d'IL-15 ont été liaison de l'IL-15 avec l'IL-2R donnant ainsi notre
détectés, entraînant des réponses immunitaires deuxième f amille labellisée IBIS Ces séries de
anormales et des maladies auto -immunes ou composés ont été évaluées pour leur capacité à
inf lammatoires telles que la polyarthrite inhiber la liaison entre l'IL-15 et son récepteur,
rhumatoïde ou le psoriasis. Ainsi, notre objectif ainsi que la cascade de signalisation en aval des
est de synthétiser des petites molécules cellules dépendantes de l'IL-15 et leur
inhibitrices qui se lient spécif iquement à l'IL15 prolif ération.
sur l'interf ace IL-2R. Nous décrivons ici deux
nouvelles f amilles d'inhibiteurs de l'IL-15.

Title: Design, Synthesis and Evaluation of Small Molecule Inhibitors of the Interleukin (IL)-15
System.

Keywords: Interleukin-15, protein-protein interactions, IL-15 inhibitor, small molecules, virtual

screening

Abstract: Interleukin (IL)-15, is a pleiotropic Taking advantage of our previous work, extending
cytokine structurally close to IL-2, both sharing modif ications were done on our f irst series called
the IL-2Rβ and γc receptor subunits. IL-15 plays IBI. On a second time, we applied a similar
important roles in innate and adaptative docking-based virtual screening of compounds
immunity, supporting the activation and libraries on a ref ined pharmacophore-based on IL-
prolif eration of NK, NK-T, and CD8+ T cells. In 15 specif ic residues identif ied on the binding site
case of dysregulation, high levels of IL-15 have of IL-15 with IL- 2R giving so our second f amily
been detected, leading to abnormal immune named IBIS These series of compounds were
responses and autoimmune or inf lammatory evaluated f or their capacity to inhibit the binding
diseases such as polyarthritis rheumatoid or to IL-15 to its cognate receptor, as well as the
psoriasis. Hence, our goal is to synthesize small down-stream signaling of IL-15-dependent cells
molecule inhibitors that bind specif ically to IL15 and their prolif eration.
on the IL-2R interf ace. Herein, we describe two
new f amilies of IL-15 inhibitors.