Chapitre 5 Cultures Cellulaires

BIOLOGIE 2
1BBM – 1BCH
Année Académique
2023-24
S02E02 : Les transferts de gènes: Take home message
Transfert horizontal de gènes =

Le mouvement de matériel génétique d'un organisme donneur vers un organisme
receveur qui n'est pas sa progéniture
Les 3 principaux types de transfert naturel de gènes chez Chez les eucaryotes, le transfert horizontal des gènes
les procaryotes sont : est extrêmement rare naturellement (il a été courant
- La transformation : une cellule compétente absorbe de au début de l’histoire de la vie).
l’ADN exogène
- La conjugaison : Transfert d’un brin d’un plasmide d’une
bactérie donneuse vers une receveuse via le pilus sexuel
- La transduction : Transfert de matériel génétique par
l’intermédiaire d’un bactériophage Au laboratoire, la transfection (analogue à la
transformation bactérienne) est souvent utilisée pour
introduire des acides nucléiques dans des cellules
Au laboratoire, la transformation est souvent utilisée pour eucaryotes.
introduire un plasmide dans une bactérie. La transduction, à l’aide d’un virus, est également
La transduction est également utilisée. utilisée.
3
Biologie 2
Thème : le vivant, les cellules
Genre: Docu-séries, Intrigues, sciences et nature
Programme: émotions, sensations fortes
Réalisation : Asmar - Duprez
•S02E01: Reproduction, cellules souches, hérédité humaine et hérédité des populations (7h)
•S02E02: Transfert génétique chez les procaryotes et chez les eucaryotes (2h)
•S02E03: Culture cellulaire eucaryote et culture bactérienne (2h)
•S02E04: Identification bactérienne (2h)
•S02E05: Antibiotiques et résistance (2h)
•S02E06: Biotechnologie et applications (5h)
4
S02E03:
La culture cellulaire eucaryote et la culture
bactérienne
Acteurs : J. Duprez et vous

Réalisation : J. Duprez
Salle : AudA
Saison 02
Episode 02
A l’issue de cet épisode, vous devrez être capable de…
❑ Définir la culture cellulaire
❑ Expliquer les étapes de la culture cellulaire
❑ Expliquez les précautions de stérilité à prendre lors de la culture cellulaire
❑ Dessinez la courbe de croissance des cellules + expliquez les différentes phases
❑ Décrire les constituants d’un milieu de culture de cellules eucaryotes
❑ Décrire une hotte à flux laminaire et un incubateur
❑ Expliquez les différents milieux de culture pour les bactéries
❑ Expliquez l’influence des facteurs environnementaux sur la culture des procaryotes
concrètement au laboratoire
❑ Décrire les méthodes de mesure de la croissance cellulaire
AAS2
6
S02E03 : La culture cellulaire, la culture bactérienne et la physiologie
bactérienne : plan de l’épisode
✓ La culture cellulaire : origine et définition

✓ Les différentes étapes de la culture cellulaire
✓ La courbe de croissance des cellules
✓ La culture des cellules eucaryotes
✓ Les milieux
✓ La hotte et les incubateurs
✓ La culture des cellules procaryotes (bactéries)
✓ Les milieux
✓ Les facteurs environnementaux
✓ La mesure de la croissance des cellules
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La culture cellulaire : origine et définition
Premières cultures cellulaires : au début du 20° siècle
La culture cellulaire est un procédé qui permet aux cellules de se reproduire en dehors de
leur milieu de vie naturel ou de l'organisme dont elles proviennent.
Quelles cellules peut-on cultiver?
- Des microorganismes unicellulaires : des bactéries, des levures,…

- Des cellules issues d’organismes pluricellulaires : cellules humaines, cellules de souris,…
En les cultivant au laboratoire, on peut obtenir de grandes quantités de cellules ou d’une

substance produite par la cellule.
8
La culture cellulaire : origine et définition
Mais pourquoi cultiver des cellules?
- Permettre aux chercheurs de mieux comprendre le fonctionnement des cellules

- Tester des molécules thérapeutiques, des produits de beauté, vérifier la toxicité de certains
produits chimiques et ainsi éviter les tests sur les animaux
- Permettre la production de certains vaccins
- Produire du nouveau tissu comme de la peau pour les grands brulés
- Pour avoir un outil, une sorte d’usine de production vivante, pour des manipulations de
biologie moléculaire
-…
9

✓ Les milieux
✓ Les milieux
10
La culture cellulaire : Les différentes étapes
1 : Obtenir les cellules
2 : Les placer dans un milieu de culture approprié
3 : Reproduire les conditions du milieu de vie d'origine des cellules
Organismes unicellulaires : dans un prélèvement de patient, dans l’environnement, dans la

collection du laboratoire,…
Organismes pluricellulaires : si cellules isolées : prélèvement direct (Ex : cellules du sang)

si cellules liées les unes aux autres : étape de séparation
préliminaire (Ex : cellules β du pancréas)
11
Il existe des organismes spécialisés où des cellules de référence sont stockées et

commercialisées → On peut donc acheter des cellules pour un laboratoire.
Ex : ATCC (American Type Cultures Collection) Important pour

l’assurance qualité dans
Ces cellules sont bien caractérisées (génome, provenance,…) un laboratoire!!!
Ex : ATCC 11775 est la souche de référence pour l’espèce E. coli
12
Une fois prélevée, les cellules doivent être placées dans un milieu de culture qui répond à
leurs besoins.
Un milieu de culture se définit donc comme un milieu dans lequel on trouve tous les
éléments nécessaires à la croissance de cellules mises en culture.
Composition variable selon le milieu.
Eléments principaux : eau, sels minéraux, acides aminés, glucose, gaz,…

13
https://www.alloprof.qc.ca/fr/eleves/bv/sciences/la-culture-cellulaire-s1464 14
Pour la survie et la croissance des cellules, les conditions physico-chimiques du milieu de vie
d’origine des cellules doivent être reproduites.
- La T°
- La pression atmosphérique
- L’humidité
- Le pH
- La composition en nutriments et en minéraux
- La [O2]
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Dans un incubateur :
Toutes les procédures nécessaires à la culture cellulaire nécessitent un travail en milieu

stérile, c'est-à-dire un milieu exempt de tout micro-organisme vivant.
Pour ce faire, de nombreux traitements existent pour stériliser le matériel utile au travail.
Les agents chimiques :

➢Les stérilisants chimiques comme l’H2O2 (qd chaleur et rayonnement pas possible)
➢Les désinfectants : sur objet et surfaces (détruisent pas les spores). Ex : éthanol, incidin
➢Les antiseptiques : sur tissus vivants
➢Les antibiotiques : pour éliminer les pathogènes
17
Toutes les procédures nécessaires à la culture cellulaire nécessitent un travail en milieu stérile, c'est-à-dire un milieu exempt de tout micro-organisme vivant.
Pour ce faire, de nombreux traitements existent pour stériliser le matériel utile au travail.
Les agents physiques :
➢La chaleur humide : l’autoclave (20 min. à 121°C). Ex : milieu de culture
➢La chaleur sèche : le four (2 à 3h à 170-180°C) ou la flamme → moins efficace que la chaleur
humide
➢Le rayonnement :
➢les rayons UV : cassent l’ADN. Ex : pièce de labo
➢Les radiations ionisantes : pénètrent en profondeur dans les objets
➢La filtration : avec un filtre qui contient des pores très étroits (0,02 µm (virus); 0,2 à 0,45 µm
(bactéries)) : Ex : liquide ne pouvant être chauffés
18

✓ Les milieux
✓ Les milieux
19
La courbe de croissance des cellules
Phase de latence/d’adaptation : Il n'y a pratiquement pas
de croissance cellulaire puisque les cellules s'adaptent à
leur nouvel environnement et s'y installent.
Phase exponentielle/de croissance: Les cellules se divisent

rapidement, car elles consomment la majeure partie des
nutriments contenus dans le milieu de culture. C’est la
phase à laquelle on étudie les cellules.
Phase stationnaire: Le nombre de cellules est constant

puisqu'il y a autant de cellules qui meurent que de
nouvelles qui sont produites. Cela s'explique par un
épuisement des nutriments, une accumulation de
déchets et un manque d'espace disponible.
Phase de mortalité/de déclin: La carence en nutriments
et l’accumulation de déchets toxiques entraine une
C’est à cette phase que l’on diminution du nombre de cellules viables
étudie les cellules
« Microbiologie », Prescott, de Boeck

20
La courbe de croissance des cellules
A ce stade : 2 possibilités si on veut
conserver les cellules :
- Les congeler
- Les repiquer, càd les transférer dans
un milieu de culture frais
« Microbiologie », Prescott, de Boeck

21

✓ Les milieux
✓ Les milieux
22
La culture des cellules eucaryotes
Les cellules eucaryotes en culture peuvent être :
- adhérentes : La plupart des cellules dérivées des tissus de l’organisme ont besoin d’une surface
ou d’une matrice extracellulaire pour assurer leur croissance et leur prolifération normale :
!!! Plastique traité avec capacité d’adhérence!!!
- en suspension : certaines cellules n’ont pas besoin d’adhérer à une surface pour se multiplier.
Les cultures peuvent être :
- des cultures primaires : prélevées fraîchement de l’organisme
- des lignées cellulaires : cellules ayant la capacité de division non limitée : cellules cancéreuses
ou cellules saines rendues immortelles artificiellement
23
Les milieux de culture des cellules eucaryotes : 2 types d’éléments
1 : Une base dont la composition chimique est connue : nutriments + électrolytes ajustés à
un pH défini
→ Les nutriments (macro et micro) assurent la survie cellulaire en fournissant les molécules
requises comme éléments structuraux pour la biosynthèse de certaines molécules et pour le
métabolisme énergétique
2 : Des suppléments (sérum d’animaux,…)
→ Permettent la différenciation et la prolifération cellulaire.
24
Les éléments de base d’un milieu de culture pour les cellules eucaryotes :
- De l’eau (95%) : indispensable à la vie

- Des acides aminés : pour la synthèse des protéines
- Les minéraux et les électrolytes (Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42-, PO43-, CO32-,…) : maintien de
l’équilibre hydrique et électrique
- Un tampon (HEPES ou NaHCO3) : maintien du pH
- Les vitamines : coenzymes essentiels à la croissance et au développement des cellule +
antioxydants
- Une source de carbone (glucose,…) : rôle énergétique + précurseur pour la synthèse des
acides nucléiques
- Des lipides : formation des membranes cellulaires
- Des protéines : croissance optimale des cellules
- Des hormones et des facteurs de croissance : prolifération et différenciation cellulaire
25
Les éléments facultatifs d’un milieu de culture pour les cellules eucaryotes :
Des éléments peuvent être ajoutés aux milieux de culture, même s’ils ne sont pas essentiels à la survie et à la
croissance des cellules.
- Rouge de phénol : indication du pH

- Des macromolécules (thymidine, adénosine, hypoxanthine) et des micronutriments (fer, le
zinc, le cuivre et le sélénium) : pour optimiser la croissance cellulaire
- Des antibiotiques et antifongiques : pour éviter la contamination bactérienne et des
champignons
26
Le sérum (plasma sans les éléments coagulants du sang) :
- Source importante de facteurs de croissance, de facteurs d’adhérence ainsi que de

protéines et de lipides + protège les cellules contre les variations de pH, les métaux lourds,
les protéases et les endotoxines.
- Il existe plusieurs types de sérums sur le marché, provenant de différentes espèces
(bovine, équine, humaine) et de différents stades de développement (fœtus, jeune, adulte).
Le sérum le plus utilisé est le sérum de fœtus de veau, désigné par FBS (fetal bovine serum).
- Le sérum est généralement ajouté au milieu de culture à une concentration variant de 5 %
à 10 %.
- contient beaucoup d’albumine : rôle dans la pression osmotique, de transport,…
MAIS… la composition du sérum reste variable d’un lot à l’autre…
27
→ Une fois les cellules eucaryotes obtenues, les différentes étapes de la culture des cellules
eucaryotes se réalisent sous une hotte.
!!! Les hottes pour la culture des cellules sont différentes des hottes utilisées en chimie!!!
En Chimie : les hottes aspirent l’air à l’intérieur et le rejettent à l’extérieur

En Biologie : les hottes à flux laminaire puisent l’air environnant et le filtrent avant de le
pousser vers l’intérieur de la hotte. L’air stérile est ainsi projeté sur le matériel, réduisant les
risques de contamination.
28
En Biologie : les hottes
à flux laminaire puisent
l’air environnant et le
filtrent avant de le
pousser vers l’intérieur
de la hotte. L’air stérile
est ainsi projeté sur le
matériel, réduisant les
risques de
contamination.
Culture cellulaire animale et végétale, Antoine Campeau-Péloquin 29

Sophie Roy, 2017, Centre collégial de développement de matériel didactique
En Biologie : les hottes
à flux laminaire puisent
l’air environnant et le
filtrent avant de le
pousser vers l’intérieur
de la hotte. L’air stérile
est ainsi projeté sur le
matériel, réduisant les
risques de
contamination.
Une fois mise en contact avec le milieu de culture, les cellules sont placées dans un incubateur.
Incubateur = enceinte fermée qui maintient :
- une température constante et homogène (souvent 37°C)

- un taux d’humidité à 90-95%
- une pression partielle en oxygène proche des conditions naturelles
- une teneur en CO2 (5%) suffisante pour maintenir le pH constant
31
Vidéo : les cultures cellulaires
32

✓ Les milieux
✓ Les milieux
33
Un milieu de culture de base
➢Un bouillon de base (Tryptic Soy Broth) :
➢Digestion pancréatique de caséine (riche en peptides à chaines courtes et aa) Acides aminés et composés
➢Digestion enzymatique de farine de soja (aussi peptones) azotés complexes
➢Glucose → Source d’énergie et de C
➢Chlorure de sodium (0,5%) → équilibre osmotique
➢Phosphate dipotassique → Tampon
➢Eau distillée stérile
34
Extrait de la fiche
technique du TSB
de la firme Becton
Dickinson
https://www.bd.com/europe/
regulatory/Assets/IFU/HB/CE/
BA/FR-BA-257107.pdf
35
Milieu liquide vs. Milieu solide
➢Milieu liquide = bouillon

➢Milieu solide = gélose
Comment obtenir cette consistance de gélose?
➢Avant : gélatinase mais…
Milieu solide : + 15 g/l (=1,5%) d’Agar-agar

Milieu semi-solide : + 3 g/l (=0,3%) d’Agar-agar
➢Depuis le XXème siècle : Agar-agar
➢Extrait de certaines algues % = g/100ml
➢Solide < 45°C
36
Bactérie vs. colonie
➢Une bactérie est invisible (µm) à l’œil nu!
➢Après culture dans des conditions favorables, les bactéries se développent, il y en a beaucoup
et des colonies deviennent visibles
Technique de l’isolement!
VOUS NE POUVEZ PLUS

CONFONDRE
BACTERIE ET COLONIE!!
37
Milieu naturel vs. Milieu synthétique
➢Milieu naturel = milieu préparé à partir d’un extrait naturel (caséine, soja,…) ayant subi une
digestion enzymatique.
→On ne connait pas exactement les concentrations précises des différents composés
→Très utilisé quand on ne sait pas exactement quelle bactérie on cultive (ex : échantillons biologiques)
➢Milieu synthétique = milieu dont la composition est parfaitement définie
➢Utilisé quand on connaît la bactérie à cultiver (ex : recherche d’une bactérie pathogène spécifique)
38
Milieux riches
➢Pq? Certaines bactéries sont plus exigeantes et ont besoin de certains facteurs pour pousser.
➢Un exemple : Columbia sang = milieu de base + sang (de mouton, de cheval,…)
39
Milieux sélectifs
➢C’est quoi? Milieux qui permettent la croissance de certaines espèces bactériennes à l’exclusion
d’autres espèces.
➢Agents sélectifs : Antibiotiques, cristal violet, sels biliaires,…
➢Exemple :
Mac Conkey ANC

Agents sélectifs Cristal violet + sels biliaires Acide nalidixique +
colistine
Qui poussent? Gram - Gram +
Qui est inhibé? Gram + Gram -
40
Milieux différentiels
➢C’est quoi? Milieux qui permettent de distinguer différentes bactéries en mettant en évidence un
caractère biochimiques. La distinction se fait de manière visuelle par la couleur de la colonie ou du milieu
autour de la colonie.
➢Exemple : Le Mac Conkey :
Il met en évidence le caractère : fermentation du lactose par la présence de lactose dans le milieu et d’un
indicateur de pH (rouge neutre).
Fermentation du lactose → Acidification du milieu → virage de de l’indicateur au Rose
Colonies composées de Colonies composées de bactéries qui

bactéries qui fermentent le ne fermentent pas le lactose
lactose
https://microbeonline.com/macconkey-agar-mac-composition-preparation-uses-and-colony-characteristics/ 41
Extrait de la fiche technique du Mac Conkey de la firme BioRad
42
Extrait de la fiche technique du Mac Conkey de la firme BioRad
Le milieu Mac Conkey est donc un milieu sélectif ET différentiel
43
Milieux chromogènes
➢C’est quoi? Milieux contenant un substrat chromogène
Suite à la dégradation par des enzymes bactériennes, le substrat libère un composé coloré
Les colonies sont colorées
http://bio-rad.com44
45
https://www.chromagar.com/notre-societe/technologie-chromogene/
Extrait de la fiche
technique du MRSA
Select II de la firme
BioRad
Le milieu MRSA Select est donc un milieu sélectif ET chromogène

46
http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/inserts/CDG/en/63757_2016_03_EN.pdf
Milieux d’enrichissement
➢C’est quoi? Milieu qui permet d’enrichir un échantillon en une espèce bactérienne précise
présente en faible quantité à la base
➢Comment? Contient des éléments inhibiteurs pour les bactéries « non voulues » et des
éléments favorables pour les espèces « voulues »
Extrait de la fiche
technique du
Selenite Cystine
Broth de la firme
BD
47
Les milieux de culture
➢Les milieux liquides de base
➢Les milieux solides de base
➢Les milieux riches
➢Les milieux sélectifs
➢Les milieux différentiels
➢Les milieux chromogènes
➢Les milieux d’enrichissement
Sont tous utilisés quotidiennement dans un laboratoire de microbiologie médicale.
Selon le type de prélèvement (et donc le type de pathogène recherché), on choisit les milieux
à ensemencer
48
La croissance en fermenteur
Un fermenteur est un appareil dans
lequel on multiplie des micro-
organismes (bactéries, levures,
champignons microscopiques,…) pour
la production de biomasse (masse
totale d’organismes vivants dans un
lieu déterminé) ou pour la production
d’un métabolite ou encore la
bioconversion d'une molécule
d'intérêt.
49
La croissance en fermenteur
En industrie : afin d’augmenter le rendement en industrie, on utilise des fermenteurs : un système de culture en masse.
➢Taille : 3l. À 100 000l.
➢Permet la production d’une biomasse. En + : Ajustement du pH, de la t°, stérilisation du milieu,… s’effectuent dans des
conditions rigoureusement contrôlées. Les ordinateurs permettent de suivre les informations fournies par les sondes : mesure de
la biomasse, concentrations de produits métaboliques,…
➢Fréquemment on ajoute un composant essentiel du milieu (ex : glucose), de façon continue : alimentation continue : permet de
maintenir les microorganismes en phase logarithmique.
Ex : - Industries de fermentation (éthanol) ;
- Production de vaccins.
- Production d’antibiotiques
50
Les facteurs environnementaux
La croissance des micro-organismes est considérablement influencée par la nature chimique et physique de
l’environnement. Une compréhension de l’influence du milieu aide à contrôler la croissance microbienne et à étudier la
distribution écologique des micro-organismes.
➢La pression osmotique

➢Le pH
➢La température
➢L’oxygène !!!! Va servir au technologue pour connaître les
conditions d’incubation des bactéries!!!
51
➢La pression osmotique
Selon les micro-organismes, les capacités
Rappel : d’adaptation diffèrent
Membrane cytoplasmique perméable sélective
Solution hypertonique S.Aureus =

halotolérant
Vibrio sp.=
halophile
Solution hypotonique
H2O
BACTERIES PLUS RESISTANTES QUE physiologique
CELLULES EUCARYOTES!!
http://s3.e-monsite.com/2011/01/26/10/pression-osmotique.jpg 52
➢Le pH
0 5,5 8 14
acidophiles NEUTROPHILES Alcalophiles (extrêmes)
(6,5-7,5)
La majorité des bactéries
53
➢La température
Elle influence particulièrement les réactions catalysées par les enzymes et aussi les membranes.
Optimale
Vitesse de croissance
Maximale
Minimale
Température
« Microbiologie », Prescott,
54 de Boeck
➢La température
Elle influence particulièrement les réactions catalysées par les enzymes et aussi les membranes.
5 classes de micro-organismes suivant

leurs T° de croissance
Les micro-organismes mésophiles : se
développent entre 20°C et 45°C mais T°
optimale de croissance : 35-37°C.
Presque tous les agents pathogènes
humains sont mésophiles vu que le
corps humain a une t° assez constante
de 37°C!!!
« Microbiologie », Prescott,
55 de Boeck
➢L’oxygène
→ L’importance de l’oxygène pour la croissance d’un organisme est corrélée à son métabolisme.
Les aérobies strictes : exigent de l’oxygène (21%) pour leur développement. Ex : Pseudomonas sp.
Les microaérophiles : ne se développent qu’en présence d’une faible concentration en oxygène (2 à
10%). Ex : Campylobacter sp.
Les ana/aérobies facultatifs : n’ont pas besoin d’oxygène pour croître mais se développent mieux en
sa présence et utiliseront alors la respiration aérobie. Ex : Streptococcus sp.
Les anaérobies aérotolérants : peuvent se développer en présence d’oxygène mais ne l’utilisent
pas, ils pratiquent la fermentation. Ex : Enterococcus sp.
Les anaérobies strictes : sont inhibés ou tués en présence d’oxygène. Ex : Clostridium sp.
56
➢L’oxygène
Les aérobies stricts 1
Concentration en O2
Les microaérophiles 4
Les ana/aérobies facultatifs 3
Les anaérobies aérotolérants 5
Les anaérobies stricts 2
57
Bio 2 - 2
58
➢L’oxygène : Au labo
Les microaérophiles
Les aérobies stricts
Les anaérobies stricts
Les ana/aérobies facultatifs
Les anaérobies aérotolérants
Une jarre (qui

sera placée
Un dans
incubateur/une l’incubateur)
étuve
59
La croissance des micro-organismes est considérablement influencée par la nature chimique et physique de l’environnement.
Une compréhension de l’influence du milieu aide à contrôler la croissance microbienne et à étudier la distribution écologique
des micro-organismes.
➢La pression osmotique → quantité adéquate de sel dans le milieu de culture

➢Le pH → Ajuster le pH du milieu de culture et additionner d’un tampon
➢La température → Etuve à température adéquate
➢L’oxygène → Etuve ou jarre?
Mais aussi…
ATTENTION AUX MILIEUX DE CULTURE ET
AUX CONDITIONS D’INCUBATION DES
➢La pression
BACTERIES!!!!
➢Les radiations
60

✓ Les milieux
✓ Les milieux
61
La mesure de la croissance des cellules
➢Mesure directe du nombre de cellules totales
➢Mesure directe du nombre de cellules viables
➢Mesure de la masse cellulaire
62
➢Mesure directe du nombre de cellules totales :
1. Au moyen d’une chambre de comptage
Matériel : un microscope + une cellule de comptage (type Burker, Thoma, de Petroff-Hausser,..)
Nbre total de micro-organismes dans un échantillon dépend :

- volume appliqué ds la chambre
- dilution de l’échantillon
→ On utilise des colorants fluorescents (DAPI, SYBR Green) qui colore l’ADN et le comptage se fait alors
sous un microscope à fluorescence
63

2. La cytométrie de flux
Comment ça marche?
▪Faire défiler les cellules (en milieu liquide) dans un capillaire
▪Le capillaire très petit ne laisse passer que 1 cellule à la fois
▪Un laser compte les cellules lors de leur passage
64
Daniel Vaulot, CNRS, Station Biologique de Roscoff
http://www.cours-examens.org/images/An_2013_2/Etude_superieure/Medecine/Cytologie/Mosta/COURS%20-%2013%20-%20Cytom%C3%A9trie%20en%20flux.pdf65
Problèmes de ces 2 techniques?
On compte toutes les cellules (les vivantes ET les mortes)!!!
66
67
Culture en milieu solide : seules les cellules viables vont se reproduire
Par étalement
On exprime les résultats en UFC (Unités formatrices de colonies)/ml : car on ne peut affirmer que chaque
colonie a pour origine une seule cellule!!
« Mini Manuel de Microbiologie68», Prieur, Dunod
Culture en milieu solide : seules les cellules viables vont se reproduire : Par inclusion
Pas utilisé en microbiologie

humaine mais beaucoup en
microbiologie alimentaire!!
On exprime les résultats en

UFC (Unités formatrices de
colonies)/ml
in Perry et al., 2004 Edition fr.
69
➢Mesure directe du nombre de cellules totales (cellules de comptage, cytométrie en flux)
➢Mesure directe du nombre de cellules viables (croissance sur boite de Petri)
70
+++ cellules → +++ suspension trouble → +++ lumière dispersée → +++ Absorbance (ou Densité Optique)
spectrophotomètre
71
En 1907, Mc Farland a mis au point une série
de solutions de sulfate de baryum permettant
d’estimer le nombre de bactéries présentes
➢Mesure de la masse cellulaire : l’échelle de Mc Farland dans des solutions de turbidité équivalente.
= standards de turbidité : très utilisé pour tester l’effet des antibiotiques sur les bactéries!
Les standards de turbidité se préparent en

mélangeant des produits chimiques qui
précipitent pour former une solution de
turbidité reproductible. Les standards
McFarland sont préparés par l’ajout d’acide
sulfurique à une solution aqueuse de chlorure
de baryum, ce qui entraîne la formation d’un
précipité de sulfate de baryum en suspension.
0,5 1 2 Mc Farland
Lecteur Mc Farland Le standard McFarland 0,5 correspond approximativement à une

suspension homogène d’E.coli de 1,5*108 cellules/ml.
72
On peut aussi mesurer la quantité d’une substance cellulaire.

Exemples :
-Du contenu total en protéines
-De l’ATP
Ou la consommation d’un substrat.
- O2
73
bactérienne : Take home message
➢ La culture cellulaire est un procédé qui permet aux cellules de se
reproduire en dehors de leur milieu de vie naturel ou de l'organisme
dont elles proviennent.
➢ Elle nécessite l’obtention des cellules, le choix d’un milieu de culture
approprié, l’incubation dans un environnement approprié et le respect
de la stérilité
➢ Un milieu de culture contient les éléments essentiels à la survie et la
croissance des cellules, il existe de nombreux milieux de culture
différents en fonction de l’utilisation voulue
➢ La phase exponentielle de croissance des cellules est la phase où l’on
étudie les cellules
➢ Diverses méthodes permettent de compter les cellules
74
S02 E04:
L’identification bactérienne
Acteurs : J. Duprez et vous

Séance : Jeudi 21/03 à 10h45
Salle : Aud A
Rendez-vous au
4ème épisode…

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BIOLOGIE 2

Transfert horizontal de gènes =

Acteurs : J. Duprez et vous

✓ La culture cellulaire : origine et définition

Premières cultures cellulaires : au début du 20° siècle

Quelles cellules peut-on cultiver?

- Des microorganismes unicellulaires : des bactéries, des levures,…

En les cultivant au laboratoire, on peut obtenir de grandes quantités de cellules ou d’une

- Permettre aux chercheurs de mieux comprendre le fonctionnement des cellules

✓ La culture cellulaire : origine et définition

1 : Obtenir les cellules

Organismes unicellulaires : dans un prélèvement de patient, dans l’environnement, dans la

Organismes pluricellulaires : si cellules isolées : prélèvement direct (Ex : cellules du sang)

1 : Obtenir les cellules

Il existe des organismes spécialisés où des cellules de référence sont stockées et

Ex : ATCC (American Type Cultures Collection) Important pour

Ex : ATCC 11775 est la souche de référence pour l’espèce E. coli

2 : Les placer dans un milieu de culture approprié

Composition variable selon le milieu.

Eléments principaux : eau, sels minéraux, acides aminés, glucose, gaz,…

2 : Les placer dans un milieu de culture approprié

3 : Reproduire les conditions du milieu de vie d'origine des cellules

3 : Reproduire les conditions du milieu de vie d'origine des cellules

Toutes les procédures nécessaires à la culture cellulaire nécessitent un travail en milieu

Les agents chimiques :

✓ La culture cellulaire : origine et définition

Phase exponentielle/de croissance: Les cellules se divisent

Phase stationnaire: Le nombre de cellules est constant

« Microbiologie », Prescott, de Boeck

« Microbiologie », Prescott, de Boeck

✓ La culture cellulaire : origine et définition

Les cultures peuvent être :

- des cultures primaires : prélevées fraîchement de l’organisme

2 : Des suppléments (sérum d’animaux,…)

→ Permettent la différenciation et la prolifération cellulaire.

- De l’eau (95%) : indispensable à la vie

- Rouge de phénol : indication du pH

- Source importante de facteurs de croissance, de facteurs d’adhérence ainsi que de

MAIS… la composition du sérum reste variable d’un lot à l’autre…

En Chimie : les hottes aspirent l’air à l’intérieur et le rejettent à l’extérieur

Culture cellulaire animale et végétale, Antoine Campeau-Péloquin 29

Incubateur = enceinte fermée qui maintient :

- une température constante et homogène (souvent 37°C)

✓ La culture cellulaire : origine et définition

➢Un bouillon de base (Tryptic Soy Broth) :

➢Milieu liquide = bouillon

Milieu solide : + 15 g/l (=1,5%) d’Agar-agar

VOUS NE POUVEZ PLUS

➢Milieu synthétique = milieu dont la composition est parfaitement définie

Mac Conkey ANC

Colonies composées de Colonies composées de bactéries qui

Le milieu Mac Conkey est donc un milieu sélectif ET différentiel

Les colonies sont colorées

Le milieu MRSA Select est donc un milieu sélectif ET chromogène

➢Taille : 3l. À 100 000l.

➢La pression osmotique

Solution hypertonique S.Aureus =

La majorité des bactéries

5 classes de micro-organismes suivant

Les aérobies stricts 1