Universite Joseph Fourier-Grenoble 1

UNIVERSITE JOSEPH FOURIER-GRENOBLE 1
THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ JOSEPH FOURIER
Discipline : Biologie Structurale
Présentée et soutenue publiquement par
Clothilde MANZANO
Le 07 Septembre 2009
Caractérisation structurale et fonctionnelle des

composants du pilus de Streptococcus pneumoniae : vers
une meilleure compréhension de la biogenèse des pili.
Dr. Anne IMBERTY Présidente de jury

Prof. Laurent GUTMANN Rapporteur
Dr. Vincent VILLERET Rapporteur
Dr. Patricia RENESTO Invité
Dr. Andréa DESSEN Directrice de thèse
Thèse préparée au Laboratoire des Protéines Membranaires (LPM) de l’Institut de Biologie

Structurale Jean-Pierre EBEL (IBS) CEA/CNRS/UJF
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier Andréa Dessen pour m’avoir accueillie dans son
laboratoire pendant ces 3 ans. Merci de la confiance que tu m’as accordée, de m’avoir fait
bifurquer de sujet de thèse et ainsi de m’avoir fait découvrir le monde passionnant des pili
pneumococciques!
Un merci particulier à petit biquet ! Thierry, merci, d’avoir été mon souffre-douleur ! Je
suis heureuse de t’avoir rencontrée ; cela aurait été beaucoup moins drôle si tu n’avais pas rejoint
l’équipe. Les moments de discussion, scientifiques ou non d’ailleurs, vont me manquer... Et continue
à bricoler, comme ça je ferais appel à toi pour mes futurs travaux, mais attention, pas de
dédommagements si la malédiction du pouce te poursuit !
Merci à mon autre compère de thèse, PJ, et courage pour la fin de ta thèse et ton
ouverture de boulangerie, je serais première à venir commander de bons gâteaux ! Merci pour les
moments de franches rigolades ! Merci Vivi pour tes conseils, ta disponibilité et ta gentillesse.
Les moments détentes hammam + massages vont me manquer ! Bref sans vous 3, Titi, PJ et Vivi,
la vie au labo aurait été bien plus triste…
Je remercie Patricia Renesto, Anne Imberty, Laurent Gutmann et Vincent Villeret pour
avoir accepté de juger ce travail. Merci du temps que vous y avez consacré.
Merci à tous les membres du labo auprès de qui j’ai passé des années agréables. Manu,
merci pour les réelles discussions d’avenir que nous avons eues. Merci Cécile, ta présence au labo
m’a souvent manquée. Merci David, bonne chance pour ton retour au Brésil. Et merci aux autres
membres du LPM…
Je tiens à remercier également les membres du LIM, venant souvent vous voir et
emprunter du matériel ou vous demander conseil, vous ne m’avez jamais rejetée. Merci en
particulier à Lamya, Cécile, Julien, Laure, je vous souhaite bonheur et réussite.
Merci à Jean-Pierre (Simorre), Thomas et Cécile pour l’étude RMN de la sortase. Même si
ce ne fut que de préliminaires études, cela fut agréable de travailler et de discuter avec vous,
les autres structuralistes ! Merci Guy (Schoehn) et Daphna pour votre gentillesse et votre
disponibilité quant aux études de microscopie électronique
Merci à mes parents pour votre soutien pendant toutes ces (longues ?!) années d’études.
Ma ptite Mamounette, je t’ai bien bassinée avec mes bactéries et mes protéines durant ces 3
années ! Heureusement que tu veux retourner sur les bancs de la fac d’histoire de l’art ou de
langues, sinon pas besoin de postuler pour la fac de bio, tu es déjà au point ! Merci Charlou, même
à distance, tu as été d’un grand soutien pour moi.
Et finalement, merci Bertrand, sans toi rien n’aurait été pareil et je pense que j’aurais eu
bien du mal à finir cette thèse. J’aurais tellement de choses à te dire et à te remercier alors,
simplement, merci pour ton amour.
Table des matières
ABREVIATIONS ......................................................................................................... 1
INTRODUCTION......................................................................................................... 3
I. Streptococcus pneumoniae ....................................................................................................................................4
I.1. Présentation ......................................................................................................................................................4
I.2. Un pathogène pour l’homme ..........................................................................................................................5
I.2.1. Les infections associées ..........................................................................................................................5
I.2.2. Le processus de l’infection .....................................................................................................................5
I.3. Les traitements disponibles.............................................................................................................................7
I.3.1. Les vaccins...............................................................................................................................................7
I.3.2. Les antibiotiques......................................................................................................................................9
II. Les facteurs de virulence du pneumocoque ...................................................................................................10

II.1. Les polysaccharides capsulaires ..................................................................................................................11
II.2. La paroi bactérienne .....................................................................................................................................11
II.3. Les protéines pneumococciques ..................................................................................................................12
II.3.1. La protéine de surface PspA................................................................................................................12
II.3.2. L’adhésine CbpA .................................................................................................................................12
II.3.3. La pneumolysine ..................................................................................................................................13
II.3.4. La neuraminidase .................................................................................................................................13
II.3.5. La hyaluronidase ..................................................................................................................................13
II.3.6. L’autolysine LytA ................................................................................................................................14
II.4. Les pili...........................................................................................................................................................14
III. Les pili, organelles de surface bactériens .....................................................................................................16

III.1. Les pili des bactéries à Gram-négatif ........................................................................................................16
III.2. Les pili des bactéries à Gram-positif .........................................................................................................18
III.2.1. Structure générale ...............................................................................................................................18
III.2.2. Les sortases, enzymes catalysant la formation du pilus ...................................................................19
III.2.3. Les pilines majeures et auxiliaires.....................................................................................................20
III.2.4. Quelques exemples de pili de bactéries à Gram-positif ...................................................................22
III.2.4.1. Corynebacterium diphteriae.......................................................................................................22
III.2.4.2. Streptococcus agalactiae ............................................................................................................23
III.2.4.3. Streptococcus pyogenes .............................................................................................................25
III.2.4.4. Streptococcus pneumoniae.........................................................................................................26
IV. Les sortases et l’art d’accrocher des protéines cibles à la paroi bactérienne .........................................30
IV.1. Classification des sortases..........................................................................................................................32
IV.1.1. Les sortases de classe A (SrtA) .........................................................................................................32
IV.1.2. Les sortases de classe B (SrtB) ..........................................................................................................34
IV.1.3. Les sortases de classe C (SrtC) ..........................................................................................................35
IV.1.4. Les sortases de classe D (SrtD) .........................................................................................................37
IV.2. Informations structurales sur les sortases ancrant des protéines cibles sur la paroi bactérienne...........37
IV.2.1. Le repliement des sortases de classes A et B....................................................................................37
IV.2.2. L’historique controversé du site actif................................................................................................39
IV.2.3. La triade catalytique ...........................................................................................................................42
CONTEXTE ET OBJECTIF DES TRAVAUX............................................................ 44
MATERIEL ET METHODES ..................................................................................... 47

I. Biologie moléculaire ............................................................................................................................................48
I.1. Clonage...........................................................................................................................................................48
I.2. Mutagenèse dirigée........................................................................................................................................48
I.2.1. Construction des mutants SrtC-1C193A, SrtC-1H131D, SrtC-R202E, SrtC-1D58GW60G, SrtC-
1D58GW60GC193A...........................................................................................................................................48
I.2.2. Construction des mutants SrtC-1_lid2 et SrtC-2_lid1.........................................................................49
II. Biochimie .............................................................................................................................................................50

II.1. Surexpression de la protéine d’intérêt.........................................................................................................50
II.2. Purification de la protéine d’intérêt.............................................................................................................50
II.2.1. Chromatographie d’affinité sur colonne HisTrapTMHP .....................................................................50
II.2.2. Coupure de l’étiquette hexahistidine ..................................................................................................51
II.2.3. Chromatographie d’exclusion de taille ...............................................................................................51
II.2.4. Production de SrtC-1 et RrgB séléniées .............................................................................................51
II.3. Formation in vitro des fibres de RrgB ........................................................................................................52
III. Analyses biophysiques .....................................................................................................................................53

III.1. Spectrométrie de masse ..............................................................................................................................53
III.2. Séquençage protéique N-terminal..............................................................................................................54
III.3. Étude de la thermostabilité des protéines par fluorescence : Thermal Shift Assay (TSA) ....................54
III.3.1. Principe................................................................................................................................................54
III.3.2. Acquisition des données.....................................................................................................................55
III.4. Microscopie électronique ...........................................................................................................................56
III.4.1. Principe................................................................................................................................................56
III.4.2. Analyse des fibres de RrgB................................................................................................................56
IV. Études cristallographiques des protéines SrtC-1, SrtC-3 et RrgB ...........................................................58

IV.1. Introduction à la cristallographie des rayons X ........................................................................................58
IV.1.1. Cristallogenèse....................................................................................................................................58
IV.1.2. Le principe de diffraction des rayons X par un cristal de protéine .................................................59
IV.1.2.1. Note préliminaire sur les cristaux de protéines ........................................................................59
IV.1.2.2. Diffraction des rayons X par les protéines du cristal ...............................................................60
IV.1.2.3. Facteur de structure et densité électronique..............................................................................62
IV.1.3. Détermination des intensités de diffraction ......................................................................................63
IV.1.4. Résolution du problème de phase......................................................................................................64
IV.1.4.1. Préambule : la loi de Friedel ......................................................................................................64
IV.1.4.2. La diffusion anomale..................................................................................................................65
IV.1.4.3. Le remplacement moléculaire....................................................................................................68
IV.1.5. Construction du modèle et affinement ..............................................................................................68
IV.1.6. Analyse des structures........................................................................................................................69
IV.2. Cristallogenèse et cristallographie de SrtC-1............................................................................................70
IV.2.1. Cristallogenèse de SrtC-1...................................................................................................................70
IV.2.2. Enregistrement des données de diffraction .......................................................................................70
IV.2.3. Structure de SrtC-1 .............................................................................................................................70
IV.3. Cristallogenèse et cristallographie de SrtC-3............................................................................................71
IV.3.1. Cristallogenèse de SrtC-3...................................................................................................................71
IV.3.2. Structure de SrtC-3 .............................................................................................................................71
IV.4. Cristallogenèse et cristallographie de RrgB..............................................................................................72
IV.4.1. Cristallogenèse de RrgB.....................................................................................................................72
IV.4.2. Enregistrement des données de diffraction .......................................................................................72
RESULTATS ET DISCUSSION................................................................................ 73
I. Etude fonctionnelle des composants du pilus de S. pneumoniae..................................................................74
I.1. Rôle des sortases SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3 dans la polymérisation de RrgB ............................................74
I.1.1. Analyse in vitro......................................................................................................................................74
I.1.2. Analyse in vivo ......................................................................................................................................75
I.2. Caractérisation des fibres de RrgB formées in vitro ...................................................................................77
I.2.1. Purification des fibres............................................................................................................................77
I.2.2. Spectrométrie de masse des fibres........................................................................................................78
I.2.3. Microscopie électronique des fibres.....................................................................................................80
II. Détermination de la structure des sortases SrtC-1 et SrtC-3 .....................................................................83
II.1. Structure de SrtC-1.......................................................................................................................................83
II.1.1. Production de SrtC-1............................................................................................................................83
II.1.2. Cristallogenèse de SrtC-1 ....................................................................................................................83
II.1.3. Production de cristaux de SrtC-1 séléniée..........................................................................................84
II.1.4. Résolution de la structure de SrtC-1 ...................................................................................................84
II.1.4.1. Collecte des données natives et séléniées...................................................................................84
II.1.4.2. Traitement des données ...............................................................................................................85
II.1.5. Analyse de la structure de SrtC-1........................................................................................................86
II.1.5.1. Structure globale de SrtC-1 .........................................................................................................86
II.1.5.2. Site actif de SrtC-1.......................................................................................................................89
II.2. Structure de SrtC-3.......................................................................................................................................91
II.2.1. Production de SrtC-3............................................................................................................................91
II.2.2. Cristallogenèse .....................................................................................................................................91
II.2.3. Résolution de la structure ....................................................................................................................91
II.2.4. Analyse de la structure de SrtC-3........................................................................................................94
II.2.4.1. Structure globale de SrtC-3 .........................................................................................................94
II.2.4.2. Site actif ........................................................................................................................................95
II.3. La structure des sortases formant le pilus se distinguent des structures de sortases classiques..............96
III. Caractérisation de la région du site actif de SrtC-1..................................................................................100

III.1. Étude du couvercle de SrtC-1 ..................................................................................................................100
III.1.1. Activité du mutant du couvercle SrtC-1D58GW60G ....................................................................100
III.1.2. Stabilité thermique des mutants du couvercle SrtC-1D58GW60G et SrtC-1D58GW60G .........101
III.1.3. Analyse des mutants SrtC-1_lid2 et SrtC-2_lid1............................................................................103
III.2. Étude du site actif de SrtC-1 ....................................................................................................................104
III.2.1. Activité des mutants du site actif .....................................................................................................104
III.2.2. Stabilité thermique des mutants .......................................................................................................105
IV. Formation in vitro d’un complexe covalent entre SrtC-1 et RrgB..........................................................108
V. Étude structurale de RrgB..............................................................................................................................111
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES.................................................................... 114
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES................................................................... 120
ANNEXES............................................................................................................... 133
PUBLICATIONS ..................................................................................................... 137

Abréviations
1
Abréviations
Abréviations
A Absorbance
Å Angström
ADN Acide désoxyribonucléique
BET Bromure d’éthidium
CAPS Acide 3-cyclohexylamino-1-propane-sulfonique
CNRP Centre national de référence des pneumocoques
CWSS Cell wall sorting signal
DO Densité optique
DTT 1,4-dithiothréitol
EDTA Acide éthylène diamine tétraacétique
Ig Immunoglobuline
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside
LC MS/MS Liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry
m/z Rapport masse sur charge
MAD Multiwavelength anomalous dispersion
PCR Polymerase chain reaction
PDB Protein Data Bank
PEG Polyéthylène glycol
PMSF Phénylméthylsulfonyl fluoride
Qsp Quantité suffisante pour
Rpm Rotations par minute
Rmsd Root mean square deviation
SAD Single anomalous dispersion
SDS-PAGE Gel d’électrophorèse en conditions dénaturantes
SIDA Syndrome de l'ImmunoDéficience Acquise
TSA Thermal shift assay
U.A. Unité d’absorbance
2
Introduction
3
Streptococcus pneumoniae Introduction
I. Streptococcus pneumoniae
I.1. Présentation
En 1881, Sternberg, aux Etats-Unis, et Pasteur, en France, ont décrit indépendamment

la présence d’une bactérie en forme de lancette, organisée en paire, dans des échantillons de
salive. Alors qu’ils avaient identifié le même organisme, Sternberg le nomma Micrococcus
pasteuri (Sternberg, 1881) et Pasteur, Microbe septicémique de la salive (Pasteur, 1881). Ce
n’est qu’en 1974, après avoir été nommé Pneumococcus, en raison de sa capacité à causer des
infections du système respiratoire, puis Diplococcus pneumoniae, que cette bactérie reçu le
nom que nous lui connaissons aujourd’hui, Streptococcus pneumoniae (Deibel and Seeley,
1974).
S. pneumoniae, communément appelé pneumocoque, est une bactérie à Gram-positif,

existant en cellule isolée, en paires ou sous forme de chaînettes (figure 1).
Figure 1 : Cliché de microscopie électronique de la

souche S. pneumoniae non encapsulée R6 prise au
Laboratoire de Microscopie Electronique de l’ IBS.
Une des caractéristiques importantes du pneumocoque est qu’il peut être encapsulé, et dès
lors, devenir pathogène. Cette capsule est composée de polysaccharides mais également, dans
certains cas, d’acides, de ribitol ou d’arabinitol. La nature chimique de ces polysaccharides
capsulaires peut varier. Ainsi, 91 variétés différentes de capsules sont connues aujourd’hui, ce
qui a permis de caractériser autant de sérotypes (Henrichsen, 1995 ; Park et al., 2007). Ces
sérotypes n’ont pas tous le même pouvoir pathogène. La capsule polysaccharidique constitue
un déterminant antigénique ; les sous-unités glucidiques la composant sont en effet reconnues
par les anticorps humains pouvant ainsi conférer une protection immune.
4
I.2. Un pathogène pour l’homme
En 2005, l’Organisation Mondiale de la Santé a évalué à près de 1,6 million le nombre

de personnes décédant chaque année d’une pneumococcie, parmi lesquelles 0,7 million
d’enfants de moins de 5 ans, dont la plupart vivait dans des pays en voie de développement
(http://www.who.int/).
I.2.1. Les infections associées
S. pneumoniae est présent à l’état commensal dans les voies respiratoires supérieures
dès la prime enfance et est considéré comme un constituant normal de cette flore. Il colonise
généralement le nasopharynx de façon asymptomatique. Toutefois, sous certaines conditions,
le pneumocoque est responsable d’infections locales, sans gravité, mais aussi de pathologies
sévères pouvant être mortelle. Deux types de maladies pneumococciques peuvent être
distinguées : d’une part, les infections mucosales comprenant la majorité des maladies
associées au pneumocoque, comme les otites, les sinusites, les bronchites ou les pneumonies,
et, d’autre part, les maladies invasives. En effet, une partie des infections se limitant aux voies
respiratoires peuvent progresser et causer de graves pathologies telles la méningite, la
bactériémie ou la pneumonie nécrotique. Plusieurs facteurs de l’hôte sont associés à un risque
accru de développer des maladies invasives. Ainsi, les infections se développent
préférentiellement chez les enfants de moins de 2 ans et les personnes âgées de plus de 65 ans.
De plus, les personnes immunodéprimées, atteintes d’un cancer ou du SIDA, sont également
des populations à risque. En France, S. pneumoniae est la première cause de mortalité par
infection bactérienne communautaire avant 2 ans avec 11,8% de mortalité en ce qui concerne
les cas de méningite bactérienne et plus de 30% de séquelles lourdes associées (chiffres de
l’Observatoire national des méningites bactériennes de l’enfant, de janvier 2001 à avril 2003).
I.2.2. Le processus de l’infection
S. pneumoniae pénètre chez l’hôte et colonise l’épithélium de la muqueuse du

nasopharynx. Au sein des collectivités d’enfants, près de 50% des individus sont porteurs de
cette bactérie et le taux de colonisation baisse sensiblement avec l’âge pour atteindre 5 à 10%
5
chez l’adulte (Levy, 1998). L’adhésion au niveau du nasopharynx est médiée par différents
facteurs. Il a été ainsi montré l’importance des glycoconjugués présents à la surface des
cellules pharyngeales mais aussi celle de la phosphorylcholine bactérienne pour l’adhérence
du pneumocoque (Andersson et al., 1983 ; Geelen et al., 1993). Il a été également montré que
les souches les plus adhérentes sont associées à des infections locales, telles la sinusite ou
l’otite, alors que les souches moins adhérentes sont plutôt susceptibles de provoquer des
bactériémies et méningites (Andersson et al., 1981).
Les circonstances permettant ensuite au pneumocoque de migrer du nasopharynx vers
les poumons restent encore mal comprises. Il se peut que l’état immun de l’hôte au moment
de la colonisation, tout autant que la virulence de la souche, déterminent si la bactérie
demeurera au niveau du nasopharynx ou si elle envahira son hôte. Il a été néanmoins décrit
que deux composés bactériens sécrétés, la pneumolysine et la protéase IgA1, facilitaient
l’accès du pathogène aux poumons (Boulnois, 1992 ; Musher, 1992).
L’accès dans le sang est par la suite facilité par les dommages causés par la
pneumolysine et le peroxyde d’hydrogène au niveau du poumon. Du sang, il peut ensuite
migrer aux méninges et, sous l’action des neuraminidases et hyaluronidases dégradant le tissu
conjonctif et permettant ainsi le passage de la barrière hémato-encéphalique, donner lieu à des
méningites (Eberhardt et al., 2003). La figure 2 ci-dessous résume le parcours infectieux du
pneumocoque.
Figure 2 : Illustration schématique de l’infection pneumococcique dans l’hôte humain. La colonisation du

pneumocoque au niveau du nasopharynx peut s’étendre juqu’au nez, aux oreilles ou encore jusqu’aux
poumons et provoquer respectivement des sinusites, des otites ou des pneumonies. Généralement, la
bactériémie se passe tôt dans l’infection via les poumons alors que la méningite se passe après la
bactériémie.
6
I.3. Les traitements disponibles
I.3.1. Les vaccins
La première tentative de vaccination, réalisée au début du 20ème siècle et préparée a

partir d’extrait bruts de pneumocoques, ne présenta qu’un rare effet protecteur et entraîna une
forte réactivité responsable d’infections. Dans les années 1920, il fut montré que les
polysaccharides de la capsule étaient antigéniques, ouvrant ainsi la voie des vaccins
polysaccharidiques (Robbins et al., 1983). Les premiers essais de vaccination furent alors
effectués au début de la Seconde Guerre Mondiale sur des volontaires de l’armée américaine
et aboutirent, en 1945, a un premier vaccin dirigé contre 4 polysaccharides (MacLeod, 1945).
Toutefois, les premiers essais de vaccination furent assez rapidement suspendus en raison de
l’apparition des antibiotiques. Ce ne fut qu’au milieu des années 1960 que les polysaccharides
capsulaires retinrent de nouveau l’attention en tant que candidat pour un vaccin. En effet,
malgré l’antibiothérapie, la gravité et la létalité de l’infection pneumococcique demeuraient
préoccupantes en raison de l’émergence de la résistance aux antibiotiques. Une vaste
campagne de vaccination fut entreprise avec succès en Afrique du Sud à l’aide de vaccins
multivalents. Elle aboutit en 1977 à la création d’un nouveau vaccin à 14 valences (Austrian,
1981 ; Robbins et al., 1983). Ce vaccin fut élargi à 23 valences en 1983 (Pneumovax®23-
Merck, Pneumo®23-Aventis Pasteur et Pnu-Immune®-Wyeth Pharmaceuticals) couvrant
environ 90% des infections causées par S. pneumoniae aux Etats-Unis (Robbins et al., 1983).
Malgré une efficacité certaine chez l’adulte, ce vaccin reste peu efficace chez l’enfant de
moins de 2 ans, la personne âgée et la personne immunodéficiente (Douglas et al., 1983)
(Prevention of pneumococcal disease : recommendations of the Advisory Commitee on
Immunization Practices, 1997). Cette vaccination polysaccharidique ne provoque, en effet,
qu’une faible réponse immunitaire chez l’enfant de bas âge. Seule une réponse B-
lymphocytaire sans coopération cellulaire T est induite avec ce vaccin, or, l’enfant en bas âge
possède des lymphocytes B immatures qui ne peuvent être activés et moduler une réponse
immunitaire.
Une solution vaccinale alternative a alors été développée pour les enfants de moins de
2 ans. Il s’agit d’un vaccin, dit conjugué, qui associe les polysaccharides à une protéine de
couplage, laquelle stimule plus efficacement les lymphocytes T, qui sont, eux, matures dès les
7
premières années de la vie. Le seul vaccin conjugué disponible sur le marché européen depuis
2001 (Prevnar®-Wyeth Pharmaceuticals) contient les sérotypes des 7 souches les plus
couramment répandues dans les infections invasives de l’enfant. Chaque polysaccharide de ce
vaccin heptavalent est couplé à une protéine diphtérique non toxique. Les études menées aux
Etats-Unis ont montré une diminution de 75 % de l’incidence des infections invasives chez les
enfants de moins de 5 ans, 4 années après l’introduction du vaccin heptavalent (Centers for
Disease Control and Prevention, 2005). En France, d’après les données du réseau EPIBAC,
réseau de laboratoires de microbiologie permettant la surveillance des infections invasives
communautaires notamment à pneumocoques, recueillies entre 2001 et 2006, la diminution
était de 25 % pour les méningites et de 20 % pour les bactériémies chez les enfants de moins
de 2 ans. Dans le même temps, l’incidence des méningites et bactériémies à pneumocoques ne
diminuait pas chez les enfants plus âgés et chez les adultes (Lepoutre et al., 2008).
Ce type de vaccin, malgré sa forte immunogénicité, présente néanmoins des

inconvénients. Tout d’abord, la protection est restreinte à un certain nombre de sérotypes. De
plus, la fabrication de vaccins glycoconjugués est très coûteuse et peu remboursée, rendant le
plan de vaccination difficile à mettre en œuvre particulièrement dans les pays en voie de
développement. En outre, même si ce vaccin a dramatiquement réduit l’incidence des
maladies invasives, l’augmentation des bactériémies et méningites dues à des sérotypes non-
inclus dans ce vaccin heptavalent a été reportée (Lepoutre et al., 2008 ; Hicks et al., 2007). À
long terme, la distribution de ce vaccin pourrait donc conduire à l’émergence dangereuse des
sérotypes invasifs non-inclus dans le vaccin. Par conséquent, une alternative est aujourd’hui à
l’étude ; celle d’utiliser des protéines, communes à tous les sérotypes et contribuant à la
virulence du pneumocoque, comme vaccin. Ces protéines seraient plus facilement purifiables
que les polysaccharides ce qui réduirait le coût d’un éventuel vaccin. Plusieurs protéines
candidates ont été identifiées, comme la pneumolysine (la partie non toxique), l’adhésine
CbpA, l’autolysine PspA ou encore la neuramidase NanA. Il a été montré que l’immunisation
avec ces protéines permettait de protéger contre la pneumonie et la bactériémie (Briles et al.,
2003 ; Ogunniyi et al., 2007).
8
I.3.2. Les antibiotiques
Le 3 septembre 1928, Alexander Flemming découvrit qu’une substance secrétée par le

champignon Penicilium notatum inhibe la croissance de souche de staphylocoques ; il
l’appella aussitôt la pénicilline. Suite à la découverte d’une souche plus productrice
(Penicillium chrysogenum), la production de la pénicilline a pu être réalisée à échelle
industrielle en 1945. La pénicilline fut ainsi très vite mise à profit pour guérir les malades
victimes d’infections bactériennes. Les années suivantes ont été considérées comme les
années fastes de l’antibiothérapie (1950-1970) avec l’espoir de voir la fin du règne des
maladies infectieuses.
Les premiers signes de résistance aux antibiotiques chez le pneumocoque apparurent

en 1965 à Boston, puis une souche résistante à la pénicilline fut décrite en 1967 en Australie
et enfin une souche multirésistante fut découverte en 1977 en Afrique du Sud (Jacobs et al.,
1978). La résistance à la pénicilline se propagea alors rapidement à travers le monde dans les
années 1980, particulièrement en Afrique du Sud, en Espagne, en Hongrie et en France, pour
laquelle la diminution de la sensibilité à la pénicilline G est apparue en 1979 (Casal, 1982 ;
Geslin et al., 1992 ; Marton et al., 1991). En France, le Centre National de Référence des
Pneumocoques (CNRP) permet le suivi des sérotypes et de la sensibilité aux antibiotiques du
pneumocoque dans le temps. En 2005, le CNRP a reporté que plus de 30 % des souches
pneumococciques étaient de sensibilité diminuée à la pénicilline et qu’environ 4 % y étaient
résistantes. L’existence de souches ayant une sensibilité moindre à d’autres antibiotiques de la
classe des β-lactamines, comme l’amoxicilline et le céfotaxime, a été également reportée. De
plus, un taux de résistance aux macrolides de plus de 40 % a été observé (CNRP, rapport
d’activité 2006). Le pneumocoque a également acquis des résistances à plusieurs autres
familles d’antibiotiques comme les sulfamides, la tétracycline, le chloramphénicol.
L'émergence et la diffusion de la résistance aux antibiotiques chez Streptococcus

pneumoniae constituent un problème majeur de santé publique. De plus, la couverture et
l’efficacité restreintes des vaccins actuellement disponibles incite à rechercher de nouvelles
cibles thérapeutiques. Ainsi, l’identification de nouveaux déterminants de la virulence peut
faciliter le développement de nouveaux traitements, qu’ils soient au niveau de
l’antibiothérapie ou de la vaccination.
9
Les facteurs de virulence du pneumocoque Introduction
II. Les facteurs de virulence du pneumocoque
La virulence est liée aux

caractéristiques inhérentes de la
bactérie et réside dans la capacité
d’une souche à échapper aux
systèmes de défense de l’hôte et à
se multiplier chez celui-ci. En
revanche, le pouvoir pathogène
d’une souche bactérienne
s’exprime par la création de
lésions tissulaires caractéristiques
suite à la réaction inflammatoire
engendrée par la libération et à
l’activation de différents
composants bactériens.
(AlonsoDeVelasco et al., 1995)
Figure 3 : Représentation schématique des

principaux facteurs de virulence du pneumocoque.
La connaissance des facteurs de virulence de S. pneumoniae et leur action représente

une voie prometteuse pour le développement de nouveaux traitements. Par conséquent, un
effort important a été réalisé ces dernières années pour les identifier et les caractériser. 387
gènes pneumococciques impliqués dans la virulence ont ainsi été récemment mis en avant,
sans pour autant que toutes leurs fonctions soient déterminées (Hava and Camilli, 2002). La
figure 3 représente les facteurs de virulence du pneumocoque dont nous allons discuter le rôle
ci-après.
10
II.1. Les polysaccharides capsulaires
Outre son caractère immunogène qui est à l’origine de la production d’anticorps

protecteurs spécifiques chez l’hôte, la capsule polysaccharidique est un déterminant essentiel
à la virulence du pneumocoque ; sans capsule, la dose létale augmente d'un facteur supérieur à
106 lors d'infections expérimentales (Watson and Musher, 1990). La capsule protège la
bactérie de la phagocytose des macrophages et des neutrophiles, permettant ainsi la
colonisation in vivo. De plus, elle protége certaines protéines de surfaces (telles PspA ou
CbpA) des anticorps circulants de l’hôte, leur évitant ainsi une inhibition fonctionnelle
(Watson and Musher, 1990). L’épaisseur de la capsule ainsi que sa composition déterminent,
à divers degrés, l’habileté d’un sérotype à survivre dans le sang et à causer une infection
invasive (Kelly et al., 1994).
Figure 4 : Vue de la capsule polysacharridique

de la souche TIGR4 de S. pneumoniae. (http://
www.rockefeller.edu).
II.2. La paroi bactérienne
La paroi est composée du peptidoglycane, d’acides teichoïques (polymères contenant de

la phosphorylcholine et liés au peptidoglycane) et d’acides lipoteichoïques (polymères
contenant de la phosphorylcholine mais ancrés à un glycolipide de la membrane
cytoplasmique). Ces deux derniers sont de puissants inducteurs de la réaction inflammatoire
capable de provoquer des dommages tissulaires irréversibles (Varon, 2001). La paroi est
également impliquée dans l’attachement de pneumocoques non encapsulés sur les cellules
endothéliales humaines (Geelen et al., 1993).
11
II.3. Les protéines pneumococciques
Le pneumocoque possède de nombreuses protéines jouant un rôle dans la pathogénie,

que ce soit en permettant l’adhésion, en agissant directement sur les tissus de l’hôte ou encore
en médiant l’inflammation. Ces principales protéines sont la protéine A de surface du
pneumocoque (PspA), l’adhésine CbpA, la pneumolysine, la neuraminidase, la hyaluronidase
et l’autolysine.
II.3.1. La protéine de surface PspA
PspA est une protéine produite par toutes les souches pneumococciques qui inhibe
l’activité du complément de l’hôte. Le pneumocoque évite ainsi les mécanismes de défense
humains via une diminution du mécanisme d’opsonophagocytose (phagocytose par les
macrophages ou neutrophiles facilitée par les anticorps qui recouvrent la cible) (Briles et al.,
1988). De plus, PspA joue un rôle dans l’apport en fer pour la croissance in vivo du
pneumocoque. En effet, elle se lie et inhibe la lactoferrine humaine qui est une protéine ayant
un rôle dans la séquestration du fer (Hammerschmidt et al., 1999). Des souches
pneumococciques, dans laquelle le gène codant pour PspA a été délété, sont significativement
moins virulentes comparées aux souches sauvages (Berry and Paton, 2000).
II.3.2. L’adhésine CbpA
Des souches mutées de S. pneumoniae ne produisant plus la protéine CbpA présentent

une diminution de leur capacité à coloniser le nasopharynx, à provoquer une pneumonie et
une bactériémie dans le modèle murin (Balachandran et al., 2002). Ces observations indiquent
que CbpA est un important facteur de virulence, même si le mécanisme d’action de cette
protéine est encore pauvrement compris. CpbA jouerait le rôle d’une adhésine de surface et
serait impliquée dans l’adhésion au cellules de la muqueuse nasopharyngeale et aux cellules
endothéliales pulmonaires. C’est en interagissant avec le récepteur aux immunoglobulines
IgR, présent à la surface cellulaire de l’hôte, que CbpA interviendrait dans l’adhésion du
pathogène (Zhang et al., 2000).
12
II.3.3. La pneumolysine
La pneumolysine est une cytotoxine initialement présente dans le cytoplasme de toutes

les souches pneumococciques et excrétée lors de leur lyse. Des monomères de pneumolysine
se fixent sur la membrane de la cellule cible par l’intermédiaire du cholestérol, s’insèrent puis
forment des oligomères intra-membranaires qui s’organisent pour former des pores
transmembranaires. Ceci autorise alors l’entrée d’eau dans la cellule qui conduit, le plus
souvent, à la lyse cellulaire (Andrew et al., 1997). La dissémination du pneumocoque se
retrouve ainsi facilitée (Rubins et al., 1992 ; Rayner et al., 1995). En dehors de son activité
toxique, la pneumolysine est également capable d'inhiber la clairance bactérienne des
poumons en supprimant le mouvement ciliaire, augmentant, de cette façon, l’adhérence du
pneumocoque à l'épithélium bronchial (Steinfort et al., 1989). De plus, la pneumolysine
inhibe également les défenses immunes de l’hôte et facilite ainsi la multiplication du
pneumocoque dans les poumons et son invasion dans le sang (Paton and Ferrante, 1983).
II.3.4. La neuraminidase
Cette enzyme, présente chez tous les isolats cliniques du pneumocoque, clive l’acide
sialique contenu dans les glycolipides, les glycoprotéines et les oligosaccharides présents à la
surface des cellules hôtes. Il en résulte alors des dommages cellulaires mais également une
exposition de récepteurs utilisés par le pneumocoque pour son adhésion (Paton and Ferrante,
1983). Une diminution de la colonisation du nasopharynx est observée avec des souches de
pneumocoque déficientes en neuraminidase (Winter et al., 1997).
II.3.5. La hyaluronidase
Cette enzyme est retrouvée dans la majorité des isolats de S.pneumoniae et contribue à
la virulence de celui-ci en dégradant l’acide hyaluronique, composant important de la matrice
extracellulaire. La migration de la bactérie du site de colonisation vers le système sanguin est,
de ce fait, facilitée (Paton and Ferrante, 1983).
13
II.3.6. L’autolysine LytA
LytA est une enzyme intervenant dans la dégénérescence de la paroi bactérienne en

hydrolysant spécifiquement le peptidogycane (Mosser and Tomasz, 1970). Elle est ainsi
impliquée dans l’autolyse cellulaire, à travers laquelle des substances toxiques sont
relarguées, comme la pneumolysine, la neuramidase ou encore des produits de dégradation du
peptidoglycane qui sont de puissants stimulants de la réaction inflammatoire (Berry and
Paton, 2000). LytA joue un rôle important dans la virulence du pneumocoque. En effet, une
souche déficiente en cette protéine possède un sévère défaut de virulence dans le modèle
murin (Berry et al., 1989).
II.4. Les pili

Ces fibres protéiques, qui seront décrites plus en détail dans le paragraphe suivant, sont
présentes dans 30% des souches pneumoccocciques et constituent un facteur de virulence qui
n’a été découvert que récemment (Basset et al., 2007 ; Barocchi et al., 2006). La figure 5 met
en avant la présence de ces structures filamenteuses à la surface du pneumocoque.
Figure 5 : Microscopie électronique de

pneumocoques piliés (Hilleringmann et al.,
2008 ; Falker et al., 2008).
Du fait de leur récente découverte, les études concernant leur rôle dans la pathogénie
sont encore restreintes aujourd’hui. Néanmoins, in vitro, il a été montré que les pili participent
au processus d’adhésion du pneumocoque sur les cellules épithéliales pulmonaires (Barocchi
et al., 2006). Il a été également reporté que les pili jouent un rôle dans la colonisation et
l’invasion des poumons dans le modèle murin (Barocchi et al., 2006 ; Rosch et al., 2008).
D’autre part, il a été montré que les pili augmentent la réponse inflammatoire de l’hôte.
En effet, les souches piliées élicitent une réponse immunitaire élevée à cytokines (protéine
14
impliquée dans la communication des cellules immunitaires) comparée aux souches non
piliées (Barocchi et al., 2006). L’utilisation potentielle des pili pneumococciques comme
vaccin candidat a été étudiée par Gianfaldoni et ses collègues qui ont montré que les sous-
unités protéiques du pilus constituent des antigènes protecteurs (Gianfaldoni et al., 2007). Du
fait que les pili ne se retrouvent pas dans l’ensemble des souches pneumococciques, un vaccin
combinant les protéines du pilus avec d’autres antigènes serait souhaitable.
15
Les pili, organelles de surface bactériens Introduction
III. Les pili, organelles de surface bactériens

L’adhésion des bactéries sur les cellules et tissus hôtes, ainsi que sur les composants de
la matrice extracellulaire, constitue une des étapes cruciales dans le processus infectieux. Les
adhésines, protéines localisées à la surface bactérienne, sont responsables de cet attachement.
Du fait de leurs charges nettes négatives, la bactérie et la cellule hôte se répulsent
naturellement rendant difficile l’adhésion du pathogène. Afin de contourner ce problème, ce
dernier a mis en place un système permettant à l’adhésine d’être située à distance de la surface
bactérienne. Il s’agit d’une structure protéique appelée pili ou fimbriae, péritriche, non
flagellaire et filamenteuse, qui s’étend hors de la paroi et sur laquelle l’adhésine est localisée.
Les pili sont composés d’unités protéiques nommées sous-unités pilines. Bien qu’ils
aient été décrits comme des organelles de surface jouant un rôle dans l’adhésion, ils sont
également impliqués dans d’autres fonctions comme le transfert d’ADN, la formation de
biofilm, la motilité de type « twitching » ou encore l’agrégation cellulaire (Koebnik, 2001 ;
Manetti et al., 2007 ; Edwards et al., 2008 ; Mattick, 2002).
Les pili sont présents chez les bactéries à Gram-négatif et à Gram-positif. Cependant,
leurs études chez l’un et l’autre de ces microorganismes ne sont pas équivalentes. En effet, les
pili des bactéries à Gram-négatif ont été découverts les premiers et restent encore aujourd’hui
les mieux décrits et compris. En revanche, peu de choses sont connues sur les pili des
bactéries à Gram-positif du fait de leur récente découverte, bien que leur intérêt suscite, de
nos jours, de nombreuses recherches.
III.1. Les pili des bactéries à Gram-négatif
Les pili des bactéries à Gram-négatif ont été découverts à la fin des années 1940.
Depuis, ces structures ont fait l’objet d’intenses recherches et leurs structures, leurs
assemblages, leurs régulations et leurs rôles dans la pathogénie sont bien compris.
Classés suivant leur voie d’assemblage, 4 groupes distincts de pili existent : les pili
assemblés par la voie « chaperonne/usher », les pili de type IV, les pili curli et les pilis
assemblés par la voie chaperonne/usher » alternative (Soto and Hultgren, 1999). Les pili les
plus étudiés et les mieux compris sont ceux qui sont assemblés par la voie
16
« chaperonne/usher ». Les gènes requis pour l’assemblage des pili par cette voie sont
généralement organisés en opéron. Durant la formation du pilus, les sous-unités pilines sont
tout d’abord secrétées dans le périplasme par la voie générale de sécrétion (système Sec).
Elles sont ensuite prises en charge par une chaperonne spécifique, évitant ainsi l’assemblage
prématuré du pilus dans le périplasme et l’agrégation des sous-unités pilines. Une protéine,
localisée dans la membrane externe bactérienne et appelée « usher », sert ensuite de
transporteur pour mener la sous-unités piline à l’extérieur de la bactérie et constitue ainsi une
plateforme pour l’assemblage du pilus (Sauer et al., 2004). L’assemblage des pili de ce type
est schématisé figure 6.
Figure 6 : Assemblage du pilus par la voie « chaperonne/usher » chez les bactéries à Gram-négatif,
d’après (Sauer et al., 2004). Sec indique le système de sécrétion.
Une des caractéristiques principales de ces pili est qu’ils sont composés de protéines qui
sont liées non-covalemment entre elles. De plus, l’adhésine est retrouvée au sommet du pilus.
L’assemblage du pilus chez les bactéries à Gram-négatif ne nécessite pas d’activité
enzymatique. En effet, la cohésion des sous-unités pilines entre elles se fait par un mécanisme
d’échange de brin donneur. Les sous-unités pilines possèdent une structure apparentée à celle
des immunoglobulines (Ig) mais incomplète car un des brins β est manquant. La chaperonne,
par le biais d’un de ses brins β, vient complémenter le brin manquant de la sous-unité piline.
Ensuite, une autre sous-unités piline vient déplacer le brin donneur de la chaperonne et
compléter le repliement de type Ig en apportant son extension N-terminale (Scott and Zahner,
2006).
17
III.2. Les pili des bactéries à Gram-positif
Les premiers pili des bactéries à Gram-positif, détectés par microscopie électronique,
ont été décrits en 1968 à la surface du pathogène Corynebacterium renale (Yanagawa et al.,
1968). Depuis, la présence de pili a été découverte dans d’autres microorganismes :
Streptococcus sanguis (Fives-Taylor and Thompson, 1985), Actinomyces naelundii (Cisar et
al., 1988), Streptococcus salivarius (Levesque et al., 2001) ou encore Corynebacterium
diphteriae (Ton-That and Schneewind, 2003). Récemment, des pili ont été également
caractérisés chez les 3 principaux streptocoques pathogènes pour l’homme : Streptococcus
pyogenes (Mora et al., 2005), Streptococcus agalactiae (Lauer et al., 2005) et Streptococcus
pneumoniae (Barocchi et al., 2006). Les pili des bactéries à Gram-positif jouent un rôle
majeur dans l’interaction hôte/pathogène mais également dans la colonisation des tissus.
III.2.1. Structure générale
Deux types de pili ont été identifiés par microscopie électronique chez les bactéries à
Gram-positif. Dans un premier cas, de courtes et fines « tiges », de longueur comprise entre
70 et 500 nm et de diamètre de 1 à 2 nm ont été localisées à la surface de S. gordonii, S. oralis
et S. sanguis (McNab et al., 1999 ; Willcox and Drucker, 1989 ; Willcox et al., 1989). En
revanche, des pili plus longs, de 0,3 à 3 µm, flexible, de diamètre compris entre 3 et 10 nm,
ont été décrits chez les corynebactéries et chez les 3 streptocoques S. pyogenes, S. agalactiae
et S. pneumoniae. La figure 7 illustre quelques différences retrouvées entre les pili des
bactéries à Gram-négatif et ceux des bactéries à Gram-positif.
Contrairement aux pili des bactéries à Gram-négatif, ceux des bactéries à Gram-positif
sont composés de sous-unités pilines liées covalemment entre elles (Ton-That and
Schneewind, 2003, 2004). Ces sous-unités ne peuvent donc pas être dissociées les unes des
autres par chauffage ou par l’agent SDS. Cette propriété est notamment utilisée pour
déterminer si une protéine fait partie du pilus. Une simple analyse en gel SDS permet alors
d’étudier la présence de pilus, caractérisée par des bandes protéiques de haut poids
moléculaire.
Le corps du pilus est composé de la polymérisation d’une même sous-unité, appelée
18
piline majeure. Des pilines mineures, ou auxiliaires, sont également présentes sur le corps
du pilus (au sommet, à la base ou de part et d’autre de la structure du pilus) mais ne sont pas
requises pour l’intégrité du pilus (Ton-That and Schneewind, 2003, 2004). Les pili sont ancrés
covalemment au peptidoglycane de la bactérie.
Figure 7 : Types de pili bactériens d’après (Telford et al., 2006). ND signifie non déterminé.
L’immunomodulation réfère à la capacité de la bactérie à modifier l’intensité des réactions
immunitaires de l’hôte.
III.2.2. Les sortases, enzymes catalysant la formation du pilus
Chez les bactéries à Gram-positif, la biogenèse du pilus nécessite une activité

enzymatique qui est réalisée par les sortases et qui va permettre de lier de manière covalente
les sous-unités pilines entre elles. Une ou plusieurs sortases peuvent être impliquées dans la
formation du pilus. Nous discuterons en détail de ces sortases, ainsi que du mécanisme par
lequel elles assemblent le pilus, dans la partie IV de ce manuscrit.
19
III.2.3. Les pilines majeures et auxiliaires
La polymérisation de la piline majeure en pilus est nécessaire pour que s’insèrent dessus
les protéines auxiliaires ; sans polymérisation, ces dernières restent ancrés sur le
peptidoglycane. Toutes ces protéines possèdent un motif bien particulier, appelé motif CWSS
(Cell Wall Sorting Signal) (figure 8A). Ce signal, localisé en C-terminal, comprend :
- une séquence peptidique appelé motif LPXTG
- un domaine hydrophobe, de longueur variable (15 à 30 résidus)
- une queue chargée positivement, de 4 à 9 résidus dont au moins une arginine.
Il a été montré que le motif CWSS d’une protéine est indispensable pour son ancrage sur le
peptidoglycane bactérien (Schneewind et al., 1992). Ainsi, la queue chargée positivement
évite l’excrétion totale de la protéine et le domaine hydrophobe permet l’ancrage de la
protéine à la membrane cytoplasmique (figure 8B). Le motif LPXTG, quant à lui, permet la
reconnaissance de la protéine par les sortases provoquant son attachement sur les autres
protéines du pilus et/ou sur le peptidoglycane. En absence de motif LPXTG, la protéine reste
ancrée sur la membrane (Schneewind et al., 1993).
Les sous-unités pilines possèdent également un peptide signal situé du côté N-terminal
leur permettant d’être exportée via le système Sec. Ce peptide signal est composé de 1 à 3
résidus chargé positivement (domaine N), suivis d’une région hydrophobique de 10 à 15
résidus (domaine H) puis d’une région polaire qui constitue le site de clivage (domaine C). La
sous-unité piline est synthétisée dans le cytoplasme bactérien et va être transloquée à travers
la membrane cytoplasmique grâce à la machinerie cellulaire Sec (figure 8B). Cette dernière
est composée d’un complexe protéique membranaire (SecYEG) et d’une protéine
périphérique (SecA) fournissant l’énergie nécessaire au transport. Une signal-peptidase, liée à
la membrane cytoplasmique, intervient pour cliver le peptide signal de la protéine précurseur
dans le périplasme (Driessen and Nouwenn, 2008).
20
Figure 8 : Les pilines majeures et auxiliaires des pili des bactéries à Gram-positif. A/ Topologie des
protéines majeures et auxiliaires. Le motif CWSS est composé du motif LPXTG, d’un domaine
transmembranaire (TM) et d’une queue chargée positivement (+). B/ Ancrage des protéines portant un
signal CWSS à la membrane bactérienne. La protéine produite dans le cytoplasme (1) va être transloquée
via le système Sec (2) et être ancrée sur la membrane à travers son domaine transmembranaire (3).
Toutefois, deux autres motifs sont également distinguables et importants pour

l’attachement des protéines du pilus entre elles. Il s’agit du motif piline et du motif E-Box
(Ton-That and Schneewind, 2003 ; Ton-That et al., 2004) (figure 8A). Le motif piline,
composé de la séquence peptidique WXXXVXVYPKN, n’est présent et conservé que dans
les protéines majeures. La lysine de ce motif joue un rôle crucial : le remplacement de cette
lysine dans la protéine majeure de C. diphteriae abolit la polymérisation du corps du pilus
(Ton-That et al., 2004). Cette lysine est pontée à la thréonine du motif LPXTG d’une sous-
unité suivante, via l’activité sortasique, et permet ainsi à deux pilines majeures d’être liée
covalemment entre elles et de constituer ainsi, au fur et à mesure, le corps du pilus. Le motif
E-Box, dont la séquence peptidique YXLXETXAPXGY comporte un glutamate hautement
21
conservé, n’est également présent que dans les pilines majeures. Il a été suggéré que ce motif
jouait un rôle dans l’attachement des pilines auxiliaires sur le pilus, bien que le mécanisme
exact reste encore inconnu. La mutation du glutamate du motif E-Box dans la piline majeure
de C. diphteriae abolit effectivement l’incorporation de la piline mineure sur la structure du
pilus (Ton-That et al., 2004). Il est à noter que les sous-unités auxiliaires peuvent
éventuellement se retrouver localisées sur le peptidoglycane et non sur le pilus, comme cela
est le cas chez S. agalactiae (Krishnan et al., 2007). Bien que le rôle des pilines mineures
n’ait pas été entièrement analysé, il semblerait qu’elles puissent jouer le rôle d’adhésine
(Nelson et al., 2007 ; Mandlik et al., 2007 ; Krishnan et al., 2007).
III.2.4. Quelques exemples de pili de bactéries à Gram-positif
III.2.4.1. Corynebacterium diphteriae
C. diphteriae, agent causal de la diphtérie, est un des premiers organismes où la

présence de pili a été décrite (Yanagawa and Honda, 1976). Trois types de pili sont présents à
sa surface : pili SpaA, pili SpaD et pili SpaH (pour Sortases-mediated pili assembly). Ces pili
sont nommés suivant la piline majeure qui les structure. Ainsi, les pili SpaA sont composés de
la protéine SpaA qui est polymérisée pour former le corps du pilus et de pilines auxiliaires
SpaB, localisée à intervalles réguliers le long du pilus, et SpaC, située au sommet du pilus
(Ton-That and Schneewind, 2003). Trois clusters qui incluent les gènes codant pour les sous-
unités pilines et les sortases sont présents chez C. diphteriae (figure 9).
Figure 9 : Opérons groupant les gènes du pilus chez C. diphteriae, d’après (Mandlik et al., 2007). Les
gènes codant pour les sortases sont représentés en noir, ceux codant pour les pilines majeures sont en
rouge et ceux codant pour les pilines mineures sont en bleu. En gris, est représenté un gène non
caractérisé.
22
La présence de multiples sortases pose la question de la spécificité de substrats. Le

rôle de certaines sortases de C. diphteriae a été ainsi investi. La sortase A (SrtA) a été
montrée comme essentielle à l’assemblage des pili de type SpaA ; SrtA polymérise la piline
majeure SpaA en pilus (Ton-That and Schneewind, 2003). Au niveau du second opéron, aussi
bien SrtB que SrtC sont capables de polymériser la piline majeure SpaD en pilus. Cependant,
seule SrtB est requise pour l’incorporation de la piline auxiliaire SpaE sur le pilus (Gaspar and
Ton-That, 2006). Un gène additionnel codant pour la sortase F (ou SrtF) est localisé dans le
génome en dehors des 3 opérons mentionnés ci-dessus. SrtF, quant à elle, est requise pour
l’ancrage du pilus sur le peptidoglycane, mais n’intervient pas dans son assemblage
(Swaminathan et al., 2007).
Les pili de C. diphteriae, et plus précisément les pilines mineures SpaB et SpaC, sont
impliqués dans l’adhérence et la colonisation des cellules humaines pharyngeales (Mandlik et
al., 2007).
III.2.4.2. Streptococcus agalactiae
Ce streptocoque colonise principalement, de façon asymptomatique, les tractus digestif

et génital de l’homme. Cependant, il peut être la cause d’infections invasives, comme la
septicémie ou la méningite, dans trois populations distinctes : les nouveau-nés, les femmes
enceintes et les personnes de plus de 65 ans ou immunosupprimées.
Figure 10 : Ilots de pathogénicité groupant les gènes du pilus chez S. agalactiae, d’après (Mandlik et
al., 2007). Les gènes codant pour les sortases sont représentés en noir, ceux codant pour les pilines
majeures en rouge et ceux codant pour les pilines mineures en bleu. En gris sont représentés les gènes
non caractérisés. Les rectangles bleus se référent à des séquences d’insertions.
23
Deux types de pili, dont les composants sont codés par les îlots PI-1 et PI-2, sont
présents à la surface de S. agalactiae. Suivant les souches, les deux îlots peuvent être
distribués simultanément ou non. L’îlot PI-1, représenté en figure 10, code pour deux sortases
et 3 sous-unités pilines. Le corps du pilus est formé par la polymérisation de la piline majeure
gbs80 tandis que les protéines gbs52 et gbs104 sont localisées de part et d’autre du pilus
(Lauer et al., 2005). En ce qui concerne le second type de pilus, gbs59 est polymérisée pour
former le corps du pilus sur lequel est insérée gbs67 et gbs150 (Rosini et al., 2006).
Chez S. agalactiae également le rôle des sortases dans la formation du pilus a été
étudié. L’une ou l’autre des sortases srt647 et srt648 est requise pour polymériser gbs80.
srt647 est, de plus, impliquée dans l’incorporation de gbs52 sur la structure du pilus alors que
srt648 est, elle, impliquée dans l’incorporation de gbs104. En ce qui concerne le pilus codé
par l’îlot PI-2, les sortases sag1405 et sag1406 sont capables, toutes les deux, de polymériser
gbs59 pour former le corps du pilus. Néanmoins, sag1405 est spécifique de l’incorporation de
gbs67 sur le pilus et sag1406 spécifique de l’incorporation de gbs150 (Rosini et al., 2006).
Il a été montré que les pili de S. agalactiae jouent un rôle dans l’adhérence de la
bactérie ainsi que dans son invasion au niveau du cerveau (Maisey et al., 2007). Gbs52 a été
la première piline mineure d’un pilus d’une bactérie à Gram-positif dont la structure
cristallographique a été résolue (Krishnan et al., 2007). Cette protéine possède deux
domaines, N1 et N2, ayant un repliement type immunoglobuline. Chaque domaine comprend
7 brins β antiparallèles qui s’assemblent pour former un tonneau β (figure 11). Le domaine
N1 est suffisant pour permettre l’adhésion sur les cellules épithéliales pulmonaires.
Domaine
N2 Figure 11 : Structure de la piline mineure gbs52 de S.
agalactiae (code DPB : 2PZ4). Deux domaines, notés N1 et
N2, présentent un repliement similaire à celui des
immunoglobulines.
Domaine
N1
24
III.2.4.3. Streptococcus pyogenes
S. pyogenes est un pathogène strictement humain responsable, dans la majorité des cas,
d’infections bénignes et non invasives comme l’angine ou l’impétigo. Néanmoins, cette
bactérie peut être responsable d’infections invasives graves telles que les infections cutanées
nécrosantes et le syndrome de choc toxique streptococcique.
Le corps du pilus, chez S. pyogenes, est formé par la polymérisation d’une même sous-
unité dont le gène est hautement variable : spy0128 (sérotype M1), Tee6 (sérotype M6),
Orf80 (sérotypes M3, M5, M18,M49) ou Eft LSL.A (sérotype M12). Une protéine auxiliaire,
dont la séquence génomique est également variable, est détectée le long du pilus : spy0130
(sérotype M1), Orf82 (sérotypes M3, M5, M18,M49) ou Orf2 (sérotype M12).
Figure 12 : Opéron regroupant les gènes du pilus chez S. pyogenes, d’après (Mandlik et al., 2007). En
noir est représenté le gène codant pour la sortase, en rouge celui qui code pour la piline majeure et en
bleu les gènes codant pour les pilines mineures. Les gènes non caractérisés sont représentés en gris.
La structure de spy0128, représentée en figure 13A, est la seule structure aujourd’hui

disponible d’une piline majeure de pilus (Kang et al., 2007). Spy0128 possède un repliement
en deux domaines composés de brins β. Deux ponts intramoléculaires ont été reportés dans
cette structure ; ceux ci sont formés entre le groupe amine de la chaîne latérale d’une lysine et
le groupement carboxyle de la chaîne latérale d’une asparagine, et ceci dans un processus
catalytique impliquant un résidu glutamate situé à proximité (figure 13B). Ces ponts sont
supposés jouer un rôle dans la stabilité de la protéine.
Il a été reporté que les pili de S. pyogenes contribuent à l’adhérence du pathogène sur
les cellules pharyngeales de l’hôte mais également à la formation de biofilm (Manetti et al.,
2007).
25
A B
Figure 13 : Structure de la piline majeure spy0128 de S. pyogenes (code PDB : 3B2M). A/ spy0128 est
composée de deux domaines constitués de brins β. B/ Pont intramoléculaire de spy0128.
III.2.4.4. Streptococcus pneumoniae
Figure 14 : Ilot de pathogénicité rlrA de S. pneumoniae d’après (Mandlik et al., 2007). Les gènes codant
pour les sortases sont représentés en noir, ceux codant pour les pilines mineures en bleu et celui codant
pour la piline majeure en rouge. Le gène rlrA code pour un régulateur positif. Les rectangles bleus
indiquent la présence d’éléments d’insertion.
Les gènes requis pour la production des pili chez S. pneumoniae sont localisés dans
l’îlot de pathogénicité rlrA (figure 14), qui comprend 6 gènes codant pour 3 sortases (SrtC-1,
SrtC-2, SrtC-3) et 3 protéines structurales (RrgA, RrgB, RrgC). Le gène rlrA code pour un
régulateur positif des 6 gènes voisins. Cet îlot comporte deux séquences d’insertion indiquant
qu’il est mobile ; cela est en accord avec le fait que les pili ne sont présents que dans 30 % des
26
souches de pneumocoques. Le corps du pilus est formé par la polymérisation de la piline

majeure RrgB. RrgA et RrgC se localisent ponctuellement le long du pilus (Hilleringmann et
al., 2008) (figure 15A). Il a été montré que deux protofilaments s’assemblent en une structure
« coiled-coil » pour former le corps du pilus, comme ceci est montré figure 15.
100 nm
Protofilament Pilus
Figure 15 : Composition des pili de S. pneumoniae. A/ Schéma des pili pneumococciques se composant des
protéines RrgA, RrgB et RrgC. B/ Microscopie électronique de pili du pneumocoque montrant que ceux-ci
sont des structures assemblées en « coiled-coil », (Hilleringmann et al., 2008).
RrgA a été décrite comme une adhésine, capable de lier la fibronectine, la laminine et
le collagène de type I, qui sont des composants de la matrice extracellulaire (Hilleringmann et
al., 2008). De plus, des tests in vitro sur des cellules épithéliales pulmonaires montrent que les
27
souches pneumococciques mutantes, dont le gène codant pour RrgA a été délété, sont moins
adhérentes que les souches sauvages (Nelson et al., 2007). Aucun rôle n’a encore été suggéré
pour RrgC à ce jour.
Ce n’est que récemment que le rôle des sortases du pneumocoque dans l’assemblage
du pilus a été étudié. C’est par des expérience réalisées in vivo, en délétant des souches
pneumococciques de un ou plusieurs gènes de sortases et en analysant les phénotypes par
microscopie électronique et par gel SDS que LeMieux ainsi que Falker et leurs collègues ont
décrit le rôle de SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3. L’absence des gènes codant pour ces trois sortases
abolit la polymérisation de RrgB, indiquant que une ou plusieurs sortases sont requises pour
polymériser RrgB en fibres (LeMieux et al., 2008). En construisant de simples mutants de
SrtC-1, SrtC-2 ou SrtC-3, Le Mieux et ses collègues conclurent que la polymérisation de
RrgB ne dépend pas que d’une sortase et qu’une certaine redondance d’activité est retrouvée.
Cependant, une spécificité concernant l’incorporation des protéines auxiliaires sur le pilus par
les différentes sortases a été montrée. Ainsi, SrtC-2 n’est pas requise pour l’incorporation de
RrgA ou RrgC sur le pilus alors que SrtC-1 et SrtC-3 sont capables d’incorporer ces deux
protéines sur le pilus (LeMieux et al., 2008). Au contraire, Falker et ses collègues ont montré
que SrtC-1 et SrtC-2 étaient capables d’incorporer RrgA sur le corps du pilus mais que seule
SrtC-1 incorporait RrgC sur le pilus. De plus, ils montrèrent que SrtC-1 étaient la principale
enzyme polymérisant RrgB en fibre (SrtC-2 étant capable, mais dans une moindre mesure, de
catalyser la formation de la fibre) (Falker et al., 2008). Les divergences retrouvées entre les
travaux de LeMieux et Falker évoquent certainement la complexité du processus de formation
du pilus chez S. pneumoniae.
Toutes les souches de pneumocoque possèdent un gène codant pour la sortase A

(SrtA), localisé en dehors de l’îlot rlrA. Cette sortase ancre des protéines possédant un motif
LPXTG sur le peptidoglycane. De premiers travaux ont montré que SrtA n’intervenait ni dans
l’assemblage, ni dans l’accrochage du pilus sur le peptidoglycane (LeMieux et al., 2008).
Récemment, la présence d’un pilus additionnel a été mise en évidence dans 16 % des
souches pneumococciques (Bagnoli et al., 2008). L’îlot PI-2, qui réfère à ce pilus, est
distribué ou non avec l’îlot rlrA et code pour deux protéines structurales (PitA et PitB), une
protéine (SipA) ayant une homologie avec les protéines « signal-peptidases » et deux sortases
(SrtG-1 et SrtG-3) (figure 16). La polymérisation du pilus requiert la protéine majeure PitB
28
aussi bien que la sortase SrtG-1 et la protéine SipA (Bagnoli et al., 2008). SipA jouerait le
rôle d’une chaperonne prévenant une agrégation prématurée de la sous-unité piline (Zahner
and Scott, 2008). D’autre part, il a été montré que le pilus PI-2 est impliqué dans l’adhérence
du pneumocoque sur les cellules bronchiales et nasopharyngeales de l’hôte (Bagnoli et al.,
2008).
Figure 16 : Ilot PI-2 codant pour un second type de pilus chez S. pneumoniae. Les gènes codant pour
les sortases sont en noir, le gène codant pour la piline majeure en rouge et celui codant pour la piline
mineure en bleu. En orange est indiqué le gène codant pour une protéine ayant une homologie avec les
signal-peptidases.
29
Les sortases et l’art d’accrocher des protéines cibles à la paroi bactérienne Introduction
IV. Les sortases et l’art d’accrocher des

protéines cibles à la paroi bactérienne
Comme énoncé précédemment, les pili des bactéries à Gram-positif sont assemblés et
ancrés sur le peptidoglycane grâce à l’action d’enzymes spécifiques, les sortases. Les sortases
ont également la fonction d’ancrer sur la paroi bactérienne des protéines de surface portant un
motif LPXTG qui sont des protéines impliquées notamment dans des interactions avec l’hôte
et l’environnement.
Les sortases sont des enzymes reconnaissant un motif bien spécifique porté par les
protéines cibles et catalysant une réaction de transpeptidation. Les sortases sont des
transpeptidases à cystéines. En effet, elles possèdent un mécanisme catalytique impliquant un
acide aminé cystéine présent dans leur site catalytique.
La sortase A de Staphylococcus aureus, dont la fonction est d’ancrer des protéines

cibles sur le peptidoglycane bactérien, a été la première sortase décrite et reste, à ce jour, la
sortase la mieux caractérisée biochimiquement et structuralement. Par homologie de
séquences, plusieurs homologues ont ensuite été identifiés chez les bactéries à Gram-positif.
Une récente étude a permis de classer les sortases en 4 groupes suivant leurs homologies de
séquences et leurs fonctions distinctes dans les bactéries à Gram-positif (Dramsi et al., 2005).
Plus d’un gène codant pour une sortase par génome est souvent retrouvé (Pallen et al., 2001)
(figure 17).
30
Figure 17 : Classes de sortases de diverses bactéries à Gram-positif, d'après (Mandlik et al., 2007) et
(Dramsi et al., 2005).
31
IV.1. Classification des sortases
IV.1.1. Les sortases de classe A (SrtA)
Depuis ces dernières années, plusieurs études ont vu le jour concernant le rôle des
sortases de classe A chez différents organismes à Gram-positif, comme L. monocytogenes
(Bierne et al., 2002), S. pyogenes (Barnett and Scott, 2002), S. pneumoniae (Kharat and
Tomasz, 2003), S. suis (Osaki et al., 2002), S.gordonii (Bolken et al., 2001), S. mutans
(Cossart and Jonquieres, 2000) et S. agalactiae (Lalioui et al., 2005). Chaque bactérie ne
possède qu’un unique gène codant pour une SrtA dans son génome. Toutes les sortases de
classe A possèdent, en N-terminal, un peptide signal hydrophobe qui permet leur sécrétion à
travers la membrane cytoplasmique et leur ancrage à la membrane. De plus, en C-terminal, se
trouve la séquence consensus TLXTC contenant la cystéine catalytique, dans laquelle X est
souvent une valine, une isoleucine ou une thréonine.
Les sortases de classe A ancrent sur le peptidoglycane des protéines cibles portant la
séquence peptidique LPXTG (Bierne et al., 2002, 2004 ; Mazmanian et al., 2002 ; Osaki et
al., 2002). Comme le montre la figure 18, SrtA reconnaît le motif LPXTG de la protéine à
ancrer et clive, via sa cystéine nucléophile, la liaison peptidique entre la thréonine et la
glycine. Il en résulte alors un intermédiaire acyl-enzyme dans lequel la thréonine du motif
LPXTG se retrouve liée à la cystéine de la sortase. L’attaque nucléophile d’un groupement
amine de la chaîne peptidique du lipide II permet ensuite de libérer l’enzyme. Le lipide II est
le précurseur de la synthèse du peptidoglycane constitué d’un disaccharide (N-acétyl-
glucosamine et acide N- acétyl-muramique) sur lequel est fixé une chaîne peptidique et sur
laquelle peut également se brancher une chaîne peptidique additionnelle. La protéine cible se
retrouve alors branchée sur le lipide II. Ce lipide II va ensuite être utilisé par les Penicillin
Binding Proteins pour élaborer le peptidoglycane. De ce fait, la protéine cible se retrouve
ancrée sur le peptidoglycane (Schneewind et al., 1995 ; Ton-That et al., 1997 ; Navarre and
Schneewind, 1999). Les sortases de classe A sont également appelées sortases
« housekeeping ».
32
B
A
Figure 18 : Mécanisme d’ancrage de protéines possédant un motif LPXTG sur le peptidoglycane bactérien.
A/ Le motif LPXTG de la protéine ancrée à la membrane cytoplasmique est reconnu puis clivé par la sortase
de classe A au niveau de la thréonine. B/ L’intermédiaire acyl-enzyme est ensuite résolu par l’attaque
nucléophile du groupement amine de la chaîne polypeptidique du lipide II. Ceci permet de régénérer
l’enzyme et de lier covalemment la protéine sur le lipide II. C/ Le lipide II est utilisé dans la synthèse du
peptidoglycane par les Penicillin Binding Protein permettant ainsi à la protéine d’être localisée sur le
peptidoglycane.
33
Les sortases de classe A sont responsables de l’ancrage de protéines impliquées dans

l’adhésion sur des tissus spécifiques, dans l’invasion des cellules hôtes ou encore dans la
résistance à la phagocytose. Une inactivation de SrtA affecte la capacité du pathogène à
établir une infection, comme c’est le cas chez S. aureus (Mazmanian et al., 2002) ou L.
monocytogenes (Bierne et al., 2002). Les sortases de classes A ont donc été décrites comme
des cibles attractives pour le développement de nouveaux traitements contre les infections
bactériennes.
IV.1.2. Les sortases de classe B (SrtB)
Cette classe de sortases est celle qui contient le moins de membres. Elles ont été
notamment étudiées chez S. aureus (Mazmanian et al., 2002), B. anthracis (Maresso et al.,
2006) et L. monocytogenes (Bierne et al., 2004). Toutes les sortases de classes B possèdent un
peptide signal en N-terminal, 3 domaines (B1, B2 et B3) non présents chez les autres types de
sortases, et le motif TLXTC en C-terminal dans lequel X est généralement une sérine.
Contrairement aux sortases de classe A, les gènes codant pour SrtB et ses potentiels substrats
sont localisés dans un même locus.
Les sortases de classe B ancrent sur le peptidoglycane des protéines cibles portant non
pas la séquence LPXTG, comme c’est le cas pour les sortases de classe A, mais des protéines
possédant le motif NPQTN (Mazmanian et al., 2002). Après reconnaissance du motif NPQTN
de la protéine cible, SrtB clive la liaison peptidique entre la thréonine et l’asparagine. La
protéine cible se retrouve ensuite accrochée au peptidoglycane via une liaison amide entre la
thréonine du motif NPQTN et la chaîne peptidique du lipide II. Le mécanisme par lequel
l’ancrage à la paroi bactérienne se fait est le même que celui des sortases de classe A (figure
18).
Les sortases de classe B sont impliquées dans l’ancrage au peptidoglycane de

protéines participant à l’acquisition de fer. Le gène codant pour SrtB se localise dans un
opéron contenant des protéines ayant un rôle dans l’obtention de ce métal. De plus, les
protéines cibles de SrtB possèdent plusieurs domaine répétitifs, appelés NEAR (Near
Transporter), supposés jouer un rôle dans la capture du fer (Andrade et al., 2002). A ce jour,
le rôle de SrtB a été démontré chez S. aureus, L. monocytogenes et B. anthracis (Mazmanian
34
et al., 2003 ; Bierne et al., 2004 ; Maresso and Schneewind, 2006 ; Maresso et al., 2006). Des
souches, dans lesquelles le gène codant pour SrtB a été délété, possèdent, notamment, un
défaut dans leur virulence (Mazmanian et al., 2002 ; Jonsson et al., 2003 ; Weiss et al., 2004).
IV.1.3. Les sortases de classe C (SrtC)
C’est le groupe contenant le plus de membres. Les gènes codant pour les sortases de
classe C sont souvent présents en plusieurs copies dans le génome. Ces sortases sont les
seules qui possèdent, en C-terminal, un domaine hydrophobe servant d’ancrage
transmembranaire et une proline conservée après la séquence consensus TLXTC. Le peptide
signal est toujours présent en N-terminal (Dramsi et al., 2005).
Des premiers travaux réalisés sur A. naeslundii et C. diphteriae ont montré que ce type
de sortases serait impliqué dans la formation de pilus (Yeung and Ragsdale, 1997 ; Yeung et
al., 1998 ; Ton-That and Schneewind, 2003). La présence de pili découverts à la surface de
nombreuses bactéries à Gram-positif possédant des sortases de classe C, ainsi que
l’augmentation des études concernant le rôle de ces sortases, ont confirmé l’implication des
sortases de classe C dans la biogenèse des pili.
Lors du processus de biogenèse du pilus, trois grandes étapes sont à distinguer : la

polymérisation de la piline majeure pour former le corps du pilus, l’ancrage du pilus sur le
peptidoglycane et l’incorporation des sous-unités auxiliaires sur le corps du pilus.
Afin de polymériser la sous-unité piline majeure en fibre, SrtC reconnaît le motif LPXTG de
cette dernière et clive entre la thréonine et la glycine (via sa cystéine nucléophile) (figure
19A). L’intermédiaire acyl-enzyme qui en résulte est résolu par attaque nucléophile du groupe
amine de la lysine du motif piline d’une autre piline majeure (figure 19B). Deux pilines
majeures sont ainsi pontées covalemment entre elles. Il en va de même pour construire le
corps du pilus (figure 19C). L’ancrage du pilus sur le peptidoglycane serait réalisé par une
sortases de classe A. En effet, même si cela a été démontré chez C. diphteriae (Swaminathan
et al., 2007), l’acteur sortasique attachant le pilus à la paroi bactérienne reste encore à
confirmer. Le mécanisme par lequel une sous-unité mineure est incorporée sur la structure du
pilus demeure à ce jour obscur.
35
A B
Figure 19 : Biogenèse du pilus chez les bactéries à Gram-positif. A/ La sortase formant le pilus (sortase
de classe C) clive le motif LPXTG d’une piline majeure au niveau de la thréonine, générant ainsi un
intermédiaire acyl-enzyme. B/ Attaque nucléophile du groupement amine de la chaîne latérale de la
lysine du motif piline permettant ainsi de lier covalemment deux pilines entre elles. C/ Formation du
pilus.
36
Curieusement, les sortases de classe C sont plus hétérogènes dans leur séquence que
les autres et ne sont présentes que dans certaines souches bactériennes parmi une espèce
donnée. Ces observations peuvent suggérer que les régions contenant les gènes des SrtC sont
soumises au transfert latéral de gènes et doivent être requises pour une adaptation à une niche
spécifique. SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3 de S. pneumoniae sur lesquelles nous travaillons font
partie de cette classe de sortases.
IV.1.4. Les sortases de classe D (SrtD)
Les sortases de cette classe appartiennent à trois espèces possédant des cycles de
différentions morphologiques: les bacilles, les clostridia et les actinomycetales. Seule SrtD de
B. anthracis a été caractérisée à ce jour. Le gène codant pour cette sortase est localisé dans un
opéron contenant deux protéines régulatrices (SctR et SctS) et une protéine portant le motif
LPNTA (BasI). Il a été montré que SrtD n’est exprimée que lors de la sporulation et ne
reconnaît que le motif LPNTA de la protéine BasI. SrtD ancre ainsi la protéine BasI sur le
peptidoglycane de la cellule mère et sur celui de la spore (Marraffini and Schneewind, 2006).
Les sortases de classe D seraient alors impliquées dans l’ancrage de protéines ayant des rôles
spécifiques liés à des situations environnementales particulières (comme la sporulation) sur la
paroi bactérienne.
IV.2. Informations structurales sur les sortases ancrant des

protéines cibles sur la paroi bactérienne
Seules les structures de sortases de classes A et B étaient disponibles au début de ce

projet. Nous nous référerons donc, dans cette partie, au repliement et au mécanisme
catalytique de ces enzymes.
IV.2.1. Le repliement des sortases de classes A et B
La première structure résolue par cristallographie aux rayons X a été celle de SrtA de
S. aureus (Zong et al., 2004a; Zong et al., 2004b). SrtA présente un repliement unique,
37
constitué d’un tonneau central formé de 8 brins β, d’une hélices α et de 3 hélices 310 (figure
20A). Les sortases de classe B dont les structures ont été résolues à ce jour (SrtB de S. aureus
et B. anthracis) adoptent également une structure en tonneau composé de 8 brins β (Zhang et
al., 2004), comme le montre la figure ci-dessous.
A B
Figure 20 : Structure tridimensionnelle de sortases de classes A et B. A/ Structure de SrtA de S. aureus

(code PDB : 1T2P). B/ Structure de SrtB de S. aureus (code PDB : 1NG5). C/ Structure de SrtB de B.
anthracis (code PDB : 1RZ2). Ces trois sortases possèdent un repliement unique composé de 8 brins β
organisés en un tonneau β .
38
La présence de calcium dans la structure de SrtA de S. aureus a été rapportée. Le

calcium est impliqué dans le réarrangement structural d’une boucle désordonnée (boucle entre
β6 et β7), facilitant ainsi la liaison au substrat. L’activité catalytique de SrtA se retrouve ainsi
renforcée en présence de cet ion (Naik et al., 2006).
IV.2.2. L’historique controversé du site actif
Des études biochimiques, réalisées avant la résolution de la structure de SrtA, avaient

montré l’importance de la cystéine pour l’activité catalytique ; un remplacement de la cystéine
en alanine abolissait, en effet, complètement l’activité enzymatique in vitro et in vivo, mettant
ainsi en exergue la similarité de réaction catalysée par les protéases à cystéines (Ton-That et
al., 1999, 2002). L’hypothèse alors émise est que les sortases catalysent le clivage de la
séquence peptidique LPXTG avec un mécanisme qui s’apparente à celui de la famille des
protéases à cystéines type papaïne. Il est connu que ces dernières possèdent un site actif
contenant 3 résidus conservés : une cystéine, une histidine et une asparagine (figure 21).
Avant la liaison au substrat, la cystéine est tenue dans un état inactif à travers une interaction
ion thiolate/imidazolium avec l’histidine. L’asparagine, par une interaction avec l’histidine,
stabilise cette paire d’ion (Vernet et al., 1995).
A B
Figure 21 : Site actif des protéases à cystéines. A/ Triade catalytique de la papaïne (code PDB : 1PPN) . B/
Triade catalytique de la staphopaïne (code PDB : 1CV8).
39
De ce fait, il a été stipulé que les sortases contenaient probablement une triade
catalytique similaire. La recherche de résidus conservés, histidine et asparagine, parmi
plusieurs sortases révéla qu’aucun résidu asparagine n’était conservé mais qu’une histidine
conservée pourrait faire partie de cette triade. Des études biochimiques sur SrtA de S. aureus,
dans laquelle l’histidine (His120) a été mutée, ont conforté l’idée que le site actif des sortases
contenait une histidine. En effet, cette mutation réduit dramatiquement l’activité catalytique
de SrtA in vivo et in vitro (Ton-That et al., 2002).
La résolution de la structure de SrtA et SrtB en forme apo de S. aureus a révélé que la

cystéine catalytique et l’histidine conservée occupaient des positions analogues à celles de ces
mêmes résidus dans les protéases à cystéine comme la papaïne ou la staphopaïne (Zhang et
al., 2004). Cependant, il s’avéra que l’histidine était trop loin de la cystéine catalytique pour
jouer un rôle de paire thiolate/ion imidazolium, et déprotoner le thiol de la cystéine du site
actif (figure 22). Des études d’enzymologie, avec la mesure des pka, ont également conforté
le fait que l’histidine ne pouvait former une paire thiolate/ion imidazolium avec la cystéine.
Ainsi, l’histidine apparaît comme un acide aminé clé dans l’activité catalytique de la sortase
mais son rôle reste à déterminer.
A B
Figure 22 : Sites actifs des sortases A et B de S. aureus révélant l’impossibilité de l’histidine de

participer à une paire d’ion imadazolium/thiolate. A/ SrtA de S. aureus. B/ SrtB de S. aureus.
40
C’est avec la résolution de la structure de SrtA en complexe avec le peptide mimant le

motif LPXTG que la compréhension du site actif s’est améliorée. L’existence d’une triade
catalytique composée d’une cystéine, d’une histidine et d’une arginine (Cys184, His120 et
Arg197 dans SrtA de S. aureus) a ainsi pu être mis en évidence (Zong et al., 2004a). Arg197
est en effet le seul résidu conservé ionisable qui pourrait bouger à proximité de Cys184 pour
former un couple d’ion catalytique. De plus, cette Arg197 est localisée a proximité de la
liaison scissile entre la thréonine et la glycine du peptide (figure 23).
His120
Figure 23 : Structure de SrtA de S. aureus complexée avec le peptide LPETG (code PDB : 1T2P). A/ Zoom
sur le site actif de SrtA où l’Arg197 se localise près du substrat LPETG. La structure résolue est celle dans
laquelle la cystéine catalytique est mutée en alanine, cependant, pour plus de clarté, c’est la cystéine qui est
représentée. B/ Représentation de la surface de SrtA ; le peptide LPETG, en vert, se situe dans une poche
catalytique, montrée en jaune.
41
Des études de mutagenèse ont confirmé le rôle important de cet Arg197 puisque le
remplacement de cet acide aminé en alanine réduit considérablement l’activité catalytique de
SrtA (Marraffini et al., 2004). Par conséquent, il est maintenant admis que le site actif des
sortases est composé d’une triade catalytique Cys-His-Arg même si le rôle exact de chacun
des deux derniers résidus n’est pas totalement compris.
IV.2.3. La triade catalytique
Le site actif, composé de la triade catalytique Cys-His-Arg, se trouve dans une poche
allongée plutôt hydrophobe, comme l’indiquent les figures 23 et 24.
Figure 24 : Représentation de la surface électrostatique

de SrtA de S. aureus (code PDB : 1T2P). Le peptide
LPETG, montré en vert, se localise dans une gorge
catalytique plutôt hydrophobe. En rouge sont
représentées les zones acides, en bleu, les zones
basiques et en blanc, les zones hydrophobes.
His120
Des controverses existent encore aujourd’hui quant au rôle joué par His120 et Arg197.
La liaison scissile du peptide, entre la thréonine et la glycine, est située entre les chaînes
latérales de Cys184 et Arg197, pointant le fait que Arg197 doit agir comme base pour
l’ionisation du groupement thiol de Cys184 durant la catalyse (Zhang et al., 2004 ; Zong et
al., 2004a). Une autre hypothèse a cependant ensuite émergé en raison du désaccord existant
entre les études de cinétiques et de mutagenèse, qui prédisent un rôle critique pour His120
dans le mécanisme catalytique, et les études structurales qui montre His120 trop éloignée de
Cys184 pour former une paire d’ions catalytiques. Arg197 n’agirait ainsi non pas comme une
base générale mais stabiliserait l’intermédiaire oxyanion transitoire et/ou serait impliquée
dans la liaison et l’orientation du substrat (Frankel et al., 2007 ; Bentley et al., 2008). His120,
quant à elle, jouerait un rôle dans la protonation du groupe partant (figure 25).
42
2 4
3
Intermédiaire Acyl-enzyme
tetrahédrique oxyanion
Figure 25 : Modèle suggéré pour la catalyse de SrtA de S. aureus (Frankel et al., 2007). Le thiolate de la
cystéine nucléophile attaque le groupement carbonyle de la liaison scissile du peptide entre la thréonine et
la glycine (1 ). Un intermédiaire tetrahédrique oxyanion est alors formé et est stabilisé par interaction avec
la charge positive de la chaîne latérale de l’arginine (2 ). La protonation du groupe partant par l’histidine
(3 ) facilite la résolution de l’intermédiaire et la formation de l’acyl-enzyme (4 ) ;
43
Contexte et objectif des
travaux
44
Contexte et objectif des travaux
Du fait de l’émergence de la résistance aux antibiotiques et de la couverture vaccinale

restreinte, des efforts importants de la communauté scientifique sont réalisés afin de découvrir
et caractériser de nouvelles cibles thérapeutiques et lutter ainsi contre le pneumocoque. Les
facteurs de virulence de celui-ci constituent des cibles attractives pour le développement de
nouveaux traitements. La découverte des pili comme étant des acteurs impliqués dans sa
pathogénie incite à étudier ce système plus en profondeur.
L’objectif de la thèse consistait en la caractérisation structurale mais aussi fonctionnelle

des divers composants du pilus de Streptococcus pneumoniae. Anne-Marie Di-Guilmi, qui a
initié le projet, aidée de Lamya El Mortaji du Laboratoire d’Ingénierie Macromoléculaire, ont
réalisé les constructions de toutes les protéines du pilus (RrgA, RrgB, RrgC, SrtC-1, SrtC-2 et
SrtC-3) avant mon arrivée sur le projet. J’ai rejoint le projet « pilus » 6 mois après mon
arrivée au Laboratoire des Protéines Membranaires du fait d’un remaniement de mon sujet de
thèse initial, suite à des publications de nos concurrents dans des journaux de renommée
internationale. Peu de choses étaient connues sur le pilus de S. pneumoniae lors de notre début
d’étude. Seules des études de microbiologie génétique, révélant la présence de pili à la surface
pneumococcique et la composition de celui-ci, étaient disponibles. De plus, aucune
information structurale sur les différentes protéines de l’îlot rlrA existait. Notre objectif,
s’inscrivant dans une logique de caractérisation de nouvelles cibles thérapeutiques, était d’une
part, d’étudier structuralement les diverses protéines du pilus et, d’autre part, d’étudier la
formation du pilus par les sortases.
Une piste prometteuse concernant la structure de SrtC-1 était disponible et un jeu de

donnée cristallographique natif avait été collecté lors de mon arrivée sur le projet. Mon
premier objectif de thèse consistait à travailler sur SrtC-1 et à résoudre sa structure par
cristallographie aux rayons X. Parallèlement à la résolution de sa structure, nous nous sommes
intéressés à sa fonction dans la biogenèse du corps du pilus, ainsi qu’à celle des autres
sortases. En effet, déterminer le ou les acteurs permettant la polymérisation du pilus ouvrait la
voie dans la caractérisation de cibles thérapeutiques potentielles. C’est vers une approche
biochimique avec l’utilisation des protéines recombinantes du pilus (approche originale du
fait qu’aucune étude de ce genre n’est encore utilisée pour étudier la formation de pili) que
nous nous sommes tournés pour étudier le rôle des trois sortases de l’îlot rlrA de S.
pneumoniae. L’ensemble de ces résultats, ont été décrits dans un article publié dans Structure
(Déc 2008).
45
Contexte et objectif des travaux
La deuxième partie de ce travail consistait à mieux caractériser SrtC-1 afin d’améliorer

nos connaissances sur le fonctionnement de sortases impliquées dans la formation de pili. Ces
analyses ont été décrites dans un second article qui est actuellement en préparation.
46
Matériel et Méthodes
47
Biologie moléculaire Matériel et Méthodes
I. Biologie moléculaire
I.1. Clonage
Le clonage de RrgA, RrgB, RrgC, SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3 a été réalisé par Anne-
Marie Di-Guilmi au Laboratoire d’Ingénierie des Macromolécules à l’IBS. L’ADN
génomique de la souche de S pneumoniae encapsulé TIGR4 a été utilisé comme matrice
d’amplification au cours d’une réaction de PCR (« Polymerase Chain Reaction »). Les régions
génomiques contenues dans l’îlot de pathogénicité rlrA et correspondant aux protéines RrgA
(acides aminés 38-869), RrgB (acides aminés 30-633), RrgC (acides aminés 21-368), SrtC-1
(acides aminés 17-228), SrtC-2 (acides aminés 9-220), SrtC-3 (acides aminés 32-254) ont été
ainsi amplifiées puis clonées dans le vecteur d’expression pLim (Protein Expert, Grenoble).
Ce plasmide, portant la résistance à l’ampicilline, possède une séquence codante pour une
étiquette hexahistidine en N-terminal clivable par la protéase Tev. Des cellules E.coli
BL21(DE3)-RIL (Invitrogen), portant la résistance au chloramphénicol, ont été ensuite
transformées avec les différents vecteurs pour l’expression des protéines.
I.2. Mutagenèse dirigée
I.2.1. Construction des mutants SrtC-1C193A, SrtC-1H131D, SrtC-

R202E, SrtC-1D58GW60G, SrtC-1D58GW60GC193A
Les mutants de SrtC-1 ont été construits en utilisant le kit de mutagenèse dirigée
« Quick Change Mutagenesis kit » (Stratagène). Le plasmide pLim double brin contenant le
gène d’intérêt a été utilisé comme matrice d’ADN parentale. 40 ng d’ADN parental, 125 ng
de chaque amorce, 10 mM dNTP, 2,5 unités de polymérase Pfu Turbo et le tampon de la
polymérase sont utilisés pour la réaction. Une PCR est effectuée pour introduire la mutation.
Une digestion subséquente de 2 heures à 37°C avec l’enzyme DpnI, spécifique de l’ADN
méthylé et semi méthylé, élimine l’ADN parental et sélectionne l’ADN contenant la mutation.
Après transformation dans des cellules compétentes d’E.coli (Top10 ou NEB5α, (BioLabs)),
l’ADN plasmidique est extrait grâce au kit « Nucleospin Plasmid » (MACHEREY NAGEL)
48
Biologie moléculaire Matériel et Méthodes
et séquencés par Cogenics afin de vérifier la présence de la mutation. Les diverses amorces
nucléotidiques utilisées ainsi que les cycles de PCR effectués sont détaillés en annexe A. Il est
à noter que pour réaliser le triple mutant SrtC-1D58GW60GC193A, nous avons utilisé,
comme matrice d’ADN, le plasmide pLim/SrtC-1.
I.2.2. Construction des mutants SrtC-1_lid2 et SrtC-2_lid1
Notre but ici était d’inverser les couvercles de SrtC-1 et SrtC-2. Nous appelons
mutant SrtC-1_lid2, la sortase SrtC-1 dont le couvercle (acides aminés 52 à 78) a été remplacé
par celui que possède SrtC-2. À l’inverse, Nous appelons mutant SrtC-2_lid1, la sortase SrtC-
2 dont le couvercle (acides aminés 44 à 70) a été remplacé par celui de la SrtC-1. Les amorces
nucléotidiques ainsi que les cycles PCR utilisées sont décrits en annexe A.
Dans un premier temps, une PCR a été effectuée avec des amorces oligonucléotidiques
pour amplifier la région génomique correspondant aux couvercles et contenant les régions
flanquantes du gène cible opposé. Cette première étape a servi à générer les amorces pour la
seconde PCR. Le plasmide pLim double brin contenant le gène d’intérêt (SrtC-1 ou SrtC-2)
est utilisé comme matrice d’ADN parentale. La réaction contient 5 ng d’ADN parental, 20 ng
de chaque amorce, 10 mM dNTP, 2,5 unités de polymérase Pfu Turbo et le tampon de la
polymérase. Une étape de purification du produit PCR est ensuite effectuée. Pour ce faire, les
produits PCR sont chargés sur gel agarose, coloré au BET pendant 5 minutes puis les bandes
correspondantes sont coupées. Le kit « Qiaquick Gel» (Qiagen) est utilisé pour purifier les
produits PCR. Dans un second temps, l’étape de mutagenèse dirigée est réalisée grâce au kit
« Quick Change XL Site Directed Mutagenesis » (Stratagène). Le plasmide pLim double brin
contenant le gène d’intérêt (SrtC-1 ou SrtC-2) est utilisé comme matrice d’ADN parentale. La
réaction contient 100 ng d’ADN parental, 120 ng d’amorces précédemment réalisées (produits
PCR), 10 mM dNTP, 2,5 unités de polymérase Pfu Turbo et le tampon de la polymérase.
Après PCR, une digestion de 3 heures à 37°C avec l’enzyme DpnI est par la suite effectuée.
Après transformation dans des cellules compétentes E. coli NEB5α (BioLabs), l’ADN
plasmidique est extrait grâce au kit « Nucleospin Plasmid » (MACHEREY NAGEL). La
présence de l’insert est vérifiée par contrôle de la taille de ce dernier en réalisant une digestion
avec les enzymes de restriction, PstI et NcoI, qui correspondent au site de clivage du gène
d’intérêt. Les plasmides positifs sont alors séquencés par Cogenics afin de vérifier la présence
des séquences attendues.
49
Biochimie Matériel et Méthodes
II. Biochimie
II.1. Surexpression de la protéine d’intérêt
Les protéines RrgA, RrgB, RrgC, SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3 ainsi que l’ensemble des
mutants ont été exprimées et purifiées selon le protocole suivant.
Une culture de cellules BL21(DE3)-RIL en milieu TB (Terrific Broth), supplémenté

de 100 µg/mL d’ampicilline (Euromedex) et de 34 µg/mL de chloramphénicol (Euromedex),
est préparée en diluant une préculture à saturation au 1/20ème. Les cellules sont laissées à
37°C, sous agitation (200 rpm), jusqu’à ce qu’elles atteignent une DO600nm=0,6 U.A.
L’expression des protéines est alors induite par l’ajout de 1mM d’IPTG (Euromedex). Après 3
heures d’agitation et d’induction à 37°C, les cellules sont centrifugées à 5500 rpm pendant 12
minutes. Le culot bactérien est repris dans le tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200
mM NaCl, 20 mM Imidazole). Après ajout de 1 mM de PMSF, 1 µM de pepstatine et 0,2 µM
d’aprotinine, les cellules sont lysées par sonication (2 minutes de sonication totales par pulses
de 2 secondes espacés de 10 secondes). Le lysat est ensuite centrifugé à 18000 rpm pendant
30 minutes afin de séparer les protéines solubles du matériel insoluble.
II.2. Purification de la protéine d’intérêt
II.2.1. Chromatographie d’affinité sur colonne HisTrapTMHP
Le surnageant, contenant les protéines solubles, est déposé sur une colonne d’affinité
HisTrapTMHP (Amersham Biosciences) préalablement équilibrée avec le tampon de lyse.
Après un lavage équivalant à 20 volumes de la colonne avec le tampon de lyse, les protéines
sont éluées par un gradient linéaire de 20 à 500 mM Imidazole, sur 20 volumes de colonne.
Les fractions sont ensuite analysées sur gel SDS.
50
II.2.2. Coupure de l’étiquette hexahistidine
L’étiquette histidine est clivable grâce à la présence du site de reconnaissance de la

protéase Tev (ENLYFQG) situé entre le His6 et la protéine d’intérêt.
Les fractions contenant la protéine d’intérêt sont incubées avec la Tev (rapport
massique Tev/protéine de 1 :10) et dialysées sur la nuit à 4°C dans le tampon de lyse.
L’activité de la protéase est ensuite inhibée par l’ajout de 1 mM de PMSF. L’échantillon clivé
est de nouveau chargé sur colonne HisTrapTMHP afin de ne récupérer que la protéine non
étiquettée et d’éliminer la Tev (en effet, celle-ci, possédant une étiquette histidine, se fixera
sur la colonne).
II.2.3. Chromatographie d’exclusion de taille
Les fractions contenant la protéine d’intérêt non étiquettée sont chargées sur une
colonne d’exclusion de taille, préalablement équilibrée dans le tampon 50 mM Hepes-HCl pH
7,5, 150 mM NaCl. Suivant la quantité de protéine obtenue, une colonne d’exclusion
Superdex 200 HR 10/30 (Amersham Biosciences) ou une colonne d’exclusion HiLoad 16/60
Superdex 200 (Amersham Biosciences) est utilisée.
II.2.4. Production de SrtC-1 et RrgB séléniées
La même souche bactérienne BL21(DE3)-RIL est utilisée pour la production des

protéines SrtC-1 et RrgB séléniées. Les cellules de la préculture sont dans un premier temps
centrifugées pendant 15 minutes à 3500 rpm, lavées dans du milieu minimum M9 (Annexe
B), puis utilisées pour inoculer 400 mL de milieu minimum M9 au 1/5ème. La culture est
laissée à 37°C sous agitation jusqu’à atteindre une DO600nm=0,7 U.A. Cette culture est ensuite
utilisée pour inoculer, au 1/5ème, 2L de milieu minimum M9, supplémenté de 20 mL de
solution d’acides aminés 50x (Annexe B). À une DO600nm=0,6 U.A, 120 mg des acides aminés
L-Lysine, L-Phénylalanine, L-Thréonine, 60 mg des acides aminés L-Isoleucine, L-Leucine,
L-Valine et 70 mg de Sélénométhionine sont ajoutés. L’incubation à 37°C et sous agitation se
poursuit alors durant 25 minutes. L’induction de l’expression des protéines se réalise ensuite
par l’ajout de 1 mM IPTG pendant une nuit à 16°C, sous agitation.
51
II.3. Formation in vitro des fibres de RrgB
Les protéines purifiées RrgB et SrtC-1 sont mélangées à un ratio massique respectif de
1:2 et incubées à 37°C pendant une nuit dans un thermobloc. Un protocole similaire est utilisé
avec SrtC-2, SrtC-3 et les mutants de SrtC-1. Un volume constant est à chaque fois effectué.
Après incubation, les échantillons sont chauffés à 100°C pendant 10 minutes en présence de
bleu de Coomassie et de 1% SDS. La présence ou non de fibres de RrgB est analysée par
Western Blot. Pour ce faire, après migration des échantillons sur un gel de gradient 4-12%
SDS (gel fabriqué au laboratoire ou gel commercial (BioRad)), un transfert sur membrane
(Transfer-BlotR Medium, Bio-Rad) est réalisé pendant 1h10 à 300 mA. La membrane est
ensuite incubée pendant 1h dans du tampon PBS Tween 0,3% additionné de 5% de lait en
poudre (Régilait). Les anticorps polyclonaux de souris (anti-RrgB, anti-SrtC-1, anti-SrtC-2 ou
anti-SrtC-3) sont subséquemment ajoutés à une dilution de 1/5000. Après 1h30 d’incubation,
3 lavages successifs de 10 minutes chacun dans du PBS Tween 0,3% sont réalisés. La
membrane est ensuite incubée avec des anticorps secondaires anti-souris couplés à la HRP
(Sigma, 1/10000) pendant 1 nuit à 4°C. Après 3 lavages successifs de 10 minutes dans du
PBS Tween 0,3%, la membrane est révélée par chimiluminescence, soit directement sur la
membrane à l’aide de tablette SIGMA-FASTTM 3,3′-Diaminobenzidine (SIGMA), soit avec le
réactif ECL (Bio-Rad).
52
Analyses biophysiques Matériel et Méthodes
III. Analyses biophysiques
III.1. Spectrométrie de masse
Les analyses de spectrométrie de masse ont été réalisées au Laboratoire de

Spectrométrie de Masse des Protéines à l’IBS afin de vérifier le poids moléculaire des
mutants et de mettre en évidence le complexe SrtC-1/RrgB. C’est une méthode d’analyse
permettant de mesurer le rapport masse/charge (m/z) de particules ionisées en phase gazeuse,
et ainsi d’obtenir le poids moléculaire de protéines ou de peptides. Les sources d’ionisations
MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption) et ESI (ElectroSpray Ionisation), ainsi qu’un
analyseur TOF (Time Of Flight) ont été utilisées dans notre cas. Ce dernier mesure le temps
que met un ion, soumis à une tension préalable, à parcourir une distance donnée. La
séparation des ions de ce type d’analyseur est fondée sur leur différence de vitesse. À la sortie
de la source d’ionisation, tous les ions possèdent la même énergie cinétique, par conséquent,
les ions les plus légers ont une vitesse plus grande que les ions les plus lourds. Le temps
nécessaire pour que l’ion atteigne le détecteur est ainsi uniquement dépendant du rapport m/z.
L’analyse de la nature des fibres a été effectuée par nanoLC-MS/MS au Laboratoire

d’Etude de la Dynamique des Protéomes au CEA, grâce à la plate-forme « EDyP-Service »
disponible au Laboratoire d’Etude de la Dynamique des Protéomes du CEA Grenoble. Cette
technique permet l'analyse d'échantillons biologiques à partir d’un gel d'électrophorèse. Après
découpe des bandes protéiques souhaitant être analysées, les protéines sont soumises à une
digestion enzymatique. Les peptides issus de cette hydrolyse enzymatique vont ensuite être
séparés par chromatographie liquide en phase inverse suivant leur hydrophobicité. Après
avoir été ainsi séparés, les peptides sont introduits séquentiellement dans le spectromètre de
masse afin d’être ionisés et fragmentés. L’analyse du rapport m/z de chaque peptide
fragmenté permet d’accéder à la séquence des peptides issus de la digestion trypsique et ainsi
de caractériser les bandes protéiques découpées sur gel.
53
III.2. Séquençage protéique N-terminal
Le séquençage protéique N-terminal, réalisé au Laboratoire d’Enzymologie

Moléculaire de l’IBS, est effectué selon le principe de la dégradation d’Edman grâce à un
séquenceur en phase gazeuse modèle 492 (Applied Biosystems). Une électrophorèse en gel de
polyacrylamide en condition dénaturante est réalisée avec 10 µg de protéine purifiée. Le gel
est ensuite lavé dans 10 mM CAPS pH 11.0 (Sigma), 10 % méthanol. La membrane PVDF
Immun-BlotTM (Bio-Rad), préalablement lavée dans du méthanol, est imbibée dans ce même
tampon et déposée sur le gel de polyacrylamide. Les protéines sont alors transférées du gel
vers la membrane après application d’un courant de 300 mA pendant 1 heure à l’aide d’un
appareil à transfert (Bio-Rad). La membrane est ensuite colorée dans du bleu de Coomassie
dans 50 % méthanol, 1 % acide acétique pendant 5 minutes puis décolorée dans 50 %
méthanol (2 lavages de 10 minutes chacun). Les bandes souhaitant être analysées sont
découpées et soumises au séquençage N-terminal. Ce type d’analyse a permis de confirmer
l’identité de SrtC-1 et de RrgB, notamment pour les deux bandes présentes sur gel SDS et qui
s’avèrent être toute deux RrgB.
III.3. Étude de la thermostabilité des protéines par

fluorescence : Thermal Shift Assay (TSA)
III.3.1. Principe
Le Thermal Shift Assay est une technique qui permet de mesurer la dénaturation des
protéines induite par un gradient de températures. C’est grâce à des colorants fluorescents
sensibles à leur environnement, comme le Sypro Orange (Molecular Probes), que la
dénaturation d’une structure protéique peut être suivie. En effet, lorsqu’un tel colorant est
ajouté à une protéine native en solution, il est exposé à un environnement aqueux et
l’émission de fluorescence est faible. En revanche, lorsque la température augmente, la
protéine se déstructure et expose ses régions hydrophobes ; le colorant se lie à ces régions
hydrophobes, désormais accessibles, et devient alors fortement fluorescent. Cela se traduit
donc par une augmentation du signal de fluorescence du colorant indiquant une dénaturation
de la protéine.
54
La courbe de fluorescence typique obtenue au cours de la cinétique de dénaturation

thermique d’une protéine est représentée figure 26. La température de transition thermique,
appelée Tm, correspond au point d’inflection de la courbe de fluorescence. Afin de la
déterminer plus aisément, la dérivée première des données brutes est calculée. La Tm
correspond alors au maximum de la courbe obtenue. Les variations de la valeur de la Tm sont
indicatives d’un changement dans la stabilité de la protéine. Un déplacement de Tm vers les
températures élevées indique une stabilisation de la protéine par augmentation de sa
structuration, concomitante à une réduction de sa flexibilité conformationnelle. En revanche,
une diminution de la Tm caractérise une déstabilisation conformationnelle de la protéine.
(Pantoliano et al., 2001 ; Geerlof et al., 2006).
Figure 26 : Principe du Thermal Shift Assay. La fluorescence est exprimée en unité arbitraire (RFU). Le
calcul des dérivées premières de chaque point de la courbe de fluorescence (à gauche) permet de déterminer
plus facilement la Tm. Ceci est représenté à droite.
III.3.2. Acquisition des données
Le TSA a été utilisé pour étudier l’influence des mutations sur la thermostabilité des
protéines. Il a été également utilisé pour analyser l’effet des peptides sur SrtC-1 et ses
mutants. Les expériences de TSA ont été réalisées sur un appareil à PCR en temps réel
Thermocycler iQ5 (Bio-Rad) disponible au Laboratoire d’Ingénierie des Macromolécules de
55
l’IBS. Le colorant utilisé est le Sypro Orange. Les tests sont effectués dans des microplaques
96 puits sur un volume de 25 µl (23 µl de protéines à 5 mg/ml minimum + 2 µl de Sypro
Orange 50X). Les cinétiques de dénaturation sont réalisées de 20 °C à 100 °C, avec un pas de
1°C par minute sauf pour le triple mutant SrtC-1CD58GW60G193A où les échantillons sont
chauffés de 20°C à 79°C avec un pas de 0,5°C par minute. L’excitation du Sypro Orange est
faite à 470 nm alors que son émission est mesurée à 570 nm. Les données brutes (la courbe de
fluorescence) sont enregistrées et un programme permet ensuite de calculer la dérivée
première de chaque point de cette courbe.
III.4. Microscopie électronique
III.4.1. Principe
Les études de microscopie électronique ont été réalisée au Laboratoire de Microscopie

Electronique et Structurale à l’IBS, en collaboration avec l’équipe de Guy Schoehn. C’est une
technique utilisant des électrons comme rayonnement, et non des photons comme c’est le cas
pour la microscopie optique. Ce faisceau d’électrons est focalisé sur l’échantillon par un
système de lentilles magnétiques. Il interagit alors avec l’échantillon suivant l’épaisseur, la
densité ou la nature chimique de celui-ci. L’image obtenue est ensuite transformée en image
photonique. Tout comme en microscopie optique où des colorants sont utilisés pour
augmenter le contraste des images d’échantillons, en microscopie électronique, ce sont des
métaux lourds qui sont utilisés. Le sel d’atome lourd va se fixer préférentiellement à la
surface des particules biologiques adsorbées. Un fort contraste est ainsi généré entre les zones
riches en métaux lourds (qui vont dévier les électrons) et les autres régions ; l’échantillon
biologique apparaîtra alors plus clair que ce qui l’entoure. Cette technique, appelée coloration
négative, a été utilisée pour visualiser les fibres de RrgB formées in vitro.
III.4.2. Analyse des fibres de RrgB
Après une nuit d’incubation à 37°C, le mélange SrtC-1+RrgB est chargé sur une
colonne d’exclusion de taille Superdex 200 (Amersham Biosciences). Les fractions sont
ensuite analysées par Western Blot avec les anticorps anti-RrgB ; celles correspondant aux
bandes de haut poids moléculaires sont soumises à l’analyse de microscopie électronique.
56
4 µl de l’échantillon protéique, à une concentration approximative de 0,05 mg/ml, sont

adsorbés à l’interface carbone/mica puis colorés négativement avec 2% de silicotungstate de
sodium. La surface carbone/échantillon, débarrassée de la surface de mica, est ensuite déposée
sur une grille de cuivre. Les micrographes sont enregistrés à faible dose avec un microscope
Phillips CM12 Lab6 à 120kV et avec un grossissement de 45 000 x. Ils sont numérisés en
utilisant un scanneur Zeiss avec une taille de pixel de 7 nm.
Les masses des fibres de RrgB peuvent être évaluées à partir des clichés de
microscopie, où 1 pixel = 1,17 Å. Si on considère la fibre comme étant un cylindre, le volume
de celle-ci correspond à la longueur multipliée par la surface de section (π r2, où r représente
la moitié du diamètre de la fibre). Par exemple, pour la fibre représentée sur la figure 36,
image d, sa longueur mesurée est de 120 Å et sa hauteur de 42 Å. Son volume est donc de 120
x π x 212 soit d’approximativement 166 253 Å3. Si on suppose que la densité moyenne d’une
protéine est de 0,86 Da/ Å3, cette fibre a une masse d’environ 143 kDa
.
57
Études cristallographiques des protéines SrtC-1, SrtC-3 et RrgB Matériel et Méthodes
IV. Études cristallographiques des protéines

SrtC-1, SrtC-3 et RrgB
IV.1. Introduction à la cristallographie des rayons X
Pour observer l’arrangement des atomes constituant les macromolécules que nous
voulons étudier, il est nécessaire d’utiliser un rayonnement dont la longueur d’onde est de
l’ordre de grandeur de l’objet à observer. Les distances inter-atomiques dans une molécule
étant de l’ordre de l’Angström (10-10m), les rayons X, ondes électromagnétiques de longueur
d’onde de l’ordre de l’Angström, sont donc propices à l’étude des protéines par
cristallographie. L’interaction entre ces rayons et une molécule génère cependant une
diffusion de trop faible intensité pour être mesurée. Il s’avère donc nécessaire d’utiliser un
cristal de protéines, dans lequel ces dernières sont empilées de manière ordonnée, qui va
permettre aux ondes diffractées d’être cohérentes et à la somme de leurs intensités d’être ainsi
observables.
IV.1.1. Cristallogenèse
La cristallisation est un processus d’ordination qui implique un rapprochement des

macromolécules en augmentant les interactions entre ces dernières et en excluant une partie
du solvant. La méthode utilisée est celle de la diffusion de vapeur en goutte suspendue
(McPherson et al., 1995) dans laquelle une goutte formée du mélange de la protéine avec une
solution de cristallisation (contenant des agents précipitants et/ou solubilisants) est placée sur
un bouchon de plastique. Ce dernier est ensuite scellé au-dessus d’un réservoir contenant un
grand volume de la solution de cristallisation (figure 27A). L’équilibre des concentrations
s’établit entre la goutte et le réservoir par diffusion des espèces volatiles entraînant ainsi une
diminution du volume de la goutte. En résulte donc une augmentation de la concentration de
la protéine et de l’agent précipitant dans la goutte.
Le diagramme de phase d’une protéine, présenté dans la figure 27B, montre que lors des
étapes de concentration de la protéine et de l’agent précipitant, la solubilité de la protéine
diminue jusqu’à atteindre une zone de sursaturation favorable à l’obtention de cristaux.
58
Figure 27 : A/ Mise en oeuvre expérimentale

de la technique de diffusion de vapeur par B
goutte suspendue. B/ Diagramme de phase
décrivant le processus de cristallisation
d’une protéine par diffusion de vapeur
Les cristaux formés sont soumis à un rayonnement X provenant d’un générateur de

laboratoire ou d’un synchrotron. Cependant, avant de soumettre les cristaux aux rayons X,
ceux-ci sont refroidis dans l’azote liquide afin de limiter les effets dus aux radiations. En effet,
le faisceau de rayons X provoque l’échauffement local du cristal et engendre la formation de
radicaux libres qui, à leur tour, endommagent les molécules du cristal. La propagation des
radicaux libres dans le cristal est ainsi ralentie par le refroidissement de ce dernier dans
l’azote liquide. Préalablement à leur refroidissement dans l’azote liquide, les cristaux sont
plongés dans une solution dite cryoprotectrice afin de prévenir la formation de cristaux de
glace qui les dégraderaient.
IV.1.2. Le principe de diffraction des rayons X par un cristal de protéine
IV.1.2.1. Note préliminaire sur les cristaux de protéines
Un cristal est la répétition périodique d’un motif géométrique dans les trois directions
de l’espace (figure 28 A et B). Le plus petit volume translaté dans ces directions, qui permet
r
de générer un cristal entier, est appelé maille élémentaire. Elle est définie par trois vecteurs a ,
r r
b et c non colinéaires et trois angles notés α, β, γ, (figure 28C). L’ensemble des translations
59
permettant de reconstituer le cristal à partir de la maille constitue le réseau. La périodicité de

la structure d'un cristal est donc représentée par un ensemble de points régulièrement
disposés. Cet ensemble est appelé réseau cristallin et les points le constituant sont appelés
nœuds du réseau.
A B C
Figure 28 : A/ Modèle d’un cristal à trois dimensions. B/ Représentation mathématique d’un cristal. C/
Maille élémentaire et paramètres à trois dimensions.
Il existe 14 types différents de maille élémentaires pour décrire l’arrangement de

points en 3 dimensions qui créent 14 réseaux appelés réseaux de Bravais. Des opérations de
symétries (rotation au tour d’un axe, inversion et réflexion) peuvent être appliquées ensuite
dans la maille. Elles appartiennent à un des 32 groupes symétriques qui combinés aux 14
réseaux de Bravais forment les 230 groupes d’espace qui représentent toutes les combinaisons
d’opérations de symétrie applicables au motif cristallin. Les protéines étant des molécules
chirales, les opérations de symétrie de type réflexion et inversion ne peuvent exister dans leurs
cristaux, ce qui réduit à 65 le nombre de groupes d’espace possibles en cristallographie des
protéines. On définit ainsi l’unité asymétrique qui est le plus petit volume permettant de
reconstituer la maille par symétrie.
IV.1.2.2. Diffraction des rayons X par les protéines du cristal
L’interaction entre le rayonnement X et les électrons des protéines dans le cristal se

traduit par la diffusion de ce rayonnement dans certaines directions privilégiées. Ceci est
60
appelé le phénomène de diffraction. Du fait de l'organisation régulière du cristal, dans certains

endroits de l'espace, les ondes s'annulent (interférences destructives), et dans d'autres, les
ondes s'additionnent et l'on a une intensité positive. L'enregistrement des faisceaux diffractés
permet d'obtenir un diagramme de diffraction qui permet, par une interprétation
mathématique, de déterminer la symétrie du cristal, les paramètres de maille et la structure du
cristal, c'est à dire connaître la position et la nature de tous les atomes du motif.
Les bases mathématiques qui caractérisent le processus de diffraction ont été

formulées principalement par Laue, Bragg et Eswald au début du XXème siècle. Bragg a
montré que le phénomène de diffraction observé dans un cristal pouvait être considéré comme
la réflexion du faisceau incident par une série de plans parallèles (les plans réticulaires du
cristal), comme le ferait une série de miroirs. Une infinité de plans réticulaires, parallèles,
contient l'ensemble des nœuds du réseau du réseau cristallin. Chaque ensemble de ces plans
est identifié par les indices de Miller hkl. Les rayons X réfléchis par des plans adjacents
parcourent des distances différentes et Bragg a montré qu’un faisceau primaire de longueur
d’onde λ, frappant l’ensemble de plans parallèles d’indice hkl et de distance d’espacement dhkl
avec un angle θ, sera réfléchi et repartira selon le même angle θ (figure 29) seulement si la
condition géométrique suivante est rencontrée :
2d sin θ = nλ,
où (n) est un entier. Ainsi, si les rayons X frappent les plans parallèles avec un angle qui ne
satisfait pas cette équation, les rayons adjacents seront diffractés avec des phases différentes
donnant lieu à des interférences destructrices. Seulement lorsque cette équation est satisfaite,
des interférences constructives se produisent et s’additionnent pour être observées sur le
cliché de diffraction sous forme de tache de diffraction ou réflexion. La position de chaque
tache se rapporte à une famille de plans réticulaires et est définie par ses indices de Miller.
Figure 29 : Principe de la diffraction selon Bragg.

Les faisceaux de rayons X incidents sont représentés
en jaune, ceux qui sont diffractés en bleu.
61
IV.1.2.3. Facteur de structure et densité électronique
Chaque tache hkl du cliché de diffraction représente une onde résultante de la somme
des diffractions contributives de tous les électrons appartenant à la famille de plans
réticulaires qu’elle représente. La fonction mathématique décrivant cette onde est appelée le
Facteur de structure Fhkl. Il fait intervenir le pouvoir diffusant de chaque atome (fj) de la
molécule de la maille de coordonnées réduites xj, yj, zj ainsi que sa position dans l’espace par
rapport à un atome de base choisi comme origine :
(1)
Ce facteur de structure rassemble l’information sur l’amplitude |Fhkl|, qui est

proportionnelle à la racine carrée de l’intensité mesurée, et la phase φhk l de l’onde diffusée
suivant la relation:
En outre, le facteur de structure Fhkl correspond à la transformée de Fourier de la

densité électronique ρ(x,y,z). On peut ainsi avoir accès à la densité électronique en tout point
du cristal par l’équation suivante, V étant le volume de la maille :
Lors d’une expérience de diffraction, les clichés obtenus permettent de déterminer les
intensités de chaque réflexion hkl. Chaque intensité mesurée est proportionnelle au carré du
module du facteur de structure |Fhkl| (correspondant à l’amplitude). Afin de déterminer le
facteur de structure et ainsi remonter à la densité électronique, il nous manque donc
l’information concernant la phase qui ne peut être connue lors d’une simple expérience de
diffraction. Par conséquent, la densité électronique ne peut pas être calculée directement à
partir des clichés de diffraction..
62
IV.1.3. Détermination des intensités de diffraction
Lors de l’enregistrement des clichés de diffraction d’un cristal, nous observons sur le
détecteur des taches de diffraction : il s’agit des pixels du détecteur qui ont été excités par des
rayons diffractés. Le nombre de photons reçus par l’ensemble des pixels formant la tache
permet de déterminer l’intensité de cette dernière. Les clichés de diffraction obtenus sont
donc traités afin d’extraire les valeurs d’intensité associées à chaque indice de Miller hkl. Ceci
est effectué avec le groupe de programmes XDS (Kabsch, 1993).
La première étape du traitement des données de diffraction est l’indexation. Durant
cette étape, la répartition des taches de diffraction est analysée ; des vecteurs entre les taches
de diffraction sont mesurés ce qui permet de déterminer la maille du cristal.
L’étape d’intégration permet, quant à elle, de déterminer l’intensité des réflexions.
Pour ce faire, un masque est défini autour de chaque tache de diffraction. La partie intérieure
de celui-ci correspond à la partie à intégrer tandis que la partie extérieure correspond au bruit
de fond qui sera retranché à l’intensité de la réflexion.
De par la présence d’opérations de symétrie dans le cristal, certaines réflexions sont
reliées entre elles par symétrie et sont équivalentes. Elles devraient donc avoir la même
intensité. L’étape de mise à l’échelle des données permet de moyenner les intensités de ces
taches.
Au cours du traitement des clichés de diffraction, les programmes donnent différents

facteurs statistiques permettant de contrôler la qualité de diffraction du cristal. La qualité du
jeu de données peut être estimée par une valeur du facteur Rsym qui permet de comparer
l’intensité de chaque réflexion équivalente par la symétrie du cristal à la valeur moyenne de
ces réflexions :
Ainsi, le Rsym représente le désaccord entre les intensités des réflexions équivalentes par
symétrie : plus il est bas, meilleur est l’accord. Si un jeu de données est indexé dans le
mauvais groupe d’espace, les opérateurs de symétrie appliqués ne sont pas les bons, le facteur
Rsym augmente très sensiblement car les réflexions considérées comme équivalentes par
symétrie ne le sont pas. Au cours de l’enregistrement, lorsque le cristal se dégrade, l’intensité
63
diffractée diminue et la valeur du facteur Rsym augmente. On définit également un rapport

signal sur bruit : I/σ(I) qui permet de donner une estimation de l’intensité moyenne des
réflexions mesurées en fonction de la résolution, où I est l’intensité des réflexions et σ(I),
l’écart type des intensités des réflexions (bruit de fond). Ainsi, plus le signal est élevé par
rapport au bruit de fond, meilleures sont les estimations des intensités et donc des facteurs de
structure.
A ce stade, seules les modules du facteur de structure des réflexions hkl sont connues.
Pour remonter à la densité électronique, il nous faut donc déterminer les phases.
IV.1.4. Résolution du problème de phase
Pour calculer la carte de densité électronique de la macromolécule, deux éléments

essentiels doivent être déterminés : les modules du facteur de structure des réflexions hkl et
les phases. Cependant lors d’une expérience de cristallographie, seules les intensités (et donc
les modules des facteurs de structure) des faisceaux diffractés sont enregistrés et l’information
concernant chacune des phases des ondes diffractées est perdue. Les deux techniques utilisées
pour déterminer ces phases et que je présenterai dans ce manuscrit sont la diffusion anomale
et le remplacement moléculaire.
Dans le cas de la diffusion anomale, les propriétés particulières d’un atome lourd
excité dans son seuil d’absorption sont utilisées pour déterminer sa position possible au sein
de la structure cristalline, puis pour déterminer les phases globales du cristal.
Le remplacement moléculaire peut être utilisé dans le cas d’un cristal constitué d’une
protéine dont la structure est proche d’une molécule de structure connue. On utilise cette
structure comme modèle pour la détermination des phases.
IV.1.4.1. Préambule : la loi de Friedel
Dans un cristal natif, les intensités des réflexions (h, k, l) et (-h, -k,-l) sont égales et
leurs phases sont opposées. On appelle paires de Friedel, les facteurs de structure des deux
réflexions h, k, l et –h, -k, -l. Ceci peut être représenté graphiquement sur le diagramme
d’Argand de la figure 30. Si on considère les facteurs de structure de la protéine Fp, du
diffuseur anomal Fa et de la structure totale F ainsi que les paires de Friedel de chaque facteur
64
de structure appelées F+, correspondant à F(h, k, l), et F-, correspondant à F(-h, -k, -l), le cas
d’une structure dérivée lors de la diffraction classique peut être représenté dans le diagramme
suivant:
Figure 30 : Diagramme d’Argand montrant la loi de

Friedel. Les facteurs de structure de la protéine Fp,
du diffuseur anomal Fa et de la structure totale F
sont représentés. ρ + et ρ - correspondent aux phases
de F+ et F- respectivement.
IV.1.4.2. La diffusion anomale
Généralités
Lorsque la longueur d’onde utilisée correspond au seuil d’absorption d’un atome lourd
dans le cristal, il y a alors absorption du rayonnement incident par les électrons des couches
profondes de l’atome lourd. Ces électrons se retrouvent excités. Le rayonnement diffracté par
le diffuseur anomal (l’atome lourd) est déphasé par rapport aux autres rayonnements
diffractés par les atomes « légers ». Pour tenir compte du déphasage, le facteur de structure de
l’atome lourd ne vaut plus f0 mais s’écrit :
f = f0 + f’(λ) + if’’(λ)
f0 est indépendant de la longueur d’onde contrairement à f’ et f’’. Lorsque le rayonnement

incident est loin du seuil d’absorption de l’atome lourd, f’ et f’’ sont négligeables. En
revanche, si la longueur d’onde est proche du seuil d’absorption d’un atome lourd, f’ et f’’
prennent des valeurs significatives. f’ et f’’ sont composées d’une partie réelle et d’une partie
imaginaire.
65
En présence de diffusion anomale, la loi de Friedel, selon laquelle les modules des
facteurs de structure F(h, k, l) et F(-h, -k, -l) sont égaux, est violée. En effet, dans le cas de la
diffraction anomale, la structure complète du facteur de structure du diffuseur anomal possède
trois composantes dont la partie imaginaire possède un déphasage de π/2. Les paires de
Friedel F(h, k, l) et F(-h, -k, -l) ne sont donc plus équivalentes; leur intensité est en particulier
différente.
Détermination des sous-structures des diffuseurs anomaux
En présence de diffuseurs anomaux, les deux réflexions symétriques ne sont plus

équivalentes (du fait des contributions anomales f' et f"), et notamment, leurs intensités sont
différentes. Cette différence d'intensité est plus généralement présente sur les paires de
Bijvoet : ce sont les paires de réflexions symétriques dont les phases des facteurs de structure
sont opposées. Les diffuseurs anomaux permettent de différencier ces réflexions symétriques,
et apportent ainsi une information sur la phase du facteur de structure F(hkl).
La différence entre les modules des facteurs de structure peut être calculée pour
chaque paire de Bijvoet, appelée la différence de Bijvoet ΔF = │F+│- │F-│. Cette différence
est généralement relevée à la longueur d’onde correspondant au maximum de f’’, là où la
différence est la plus grande. On peut alors calculer une carte de Patterson avec ΔF2 comme
coefficient. Cette carte correspond approximativement à une fonction d’auto-corrélation des
diffuseurs anomaux qui présentent des maxima aux points correspondant aux distances
interatomiques, permettant de déterminer la position des atomes lourds dans la structure.
Détermination graphique de la phase
Lorsque l'unité asymétrique contient un atome nettement plus lourd que les autres, la
contribution de cet atome au facteur de structure est importante et souvent déterminante. Afin
de rendre compte de la contribution de l’atome lourd, le facteur de structure total (FT) peut
s’écrire :
FT (hkl) = FP (hkl) + FA (hkl)
avec FP correspondant au facteur de structure de la protéine et FA à celui de l’atome lourd.
66
Le facteur de structure de la protéine FP recherché peut ainsi s’écrire :
FP (hkl) = FT (hkl) - FA (hkl) (2)
avec FA (hkl) préalablement déterminé en module et en phase.
Lors d’une expérience de diffusion anomale, un même cristal est utilisé sur lequel on
enregistre plusieurs jeux de données à plusieurs longueurs d’onde différentes (méthode
MAD). Trois ou quatre longueurs d’onde sont souvent choisies ; une correspondant au
maximum de f’’ pour laquelle la différence entre les F+ et les F- est la plus grande, une
correspondant au longueur d’onde au minimum de f’, et une ou deux longueurs d’ondes loin
du seuil d’absorption du diffuseur qui permet de déterminer le module du facteur de structure
de la protéine native. On peut considérer qu’aux deux premières longueurs d’onde, le
diffuseur anomal se comporte comme deux dérivés différents.
L’équation (2) peut être représentée sur le diagramme d’Argand suivant :
Figure 31 : Diagramme d’Argand

montrant la détermination graphique de la
phase par la méthode MAD. Fp correspond
au facteur de structure de la protéine, FA à
celui du diffuseur anomal et FT à celui de
la structure totale.
Le module du facteur de structure Fp correspondant à la protéine est connu par la mesure

des intensités de diffraction à la longueur d’onde loin du seuil d’absorption du diffuseur
anomal. Un cercle de rayon correspondant au module de Fp (cercle bleu) peut donc être tracé.
La fonction de Patterson permet de déterminer précisément la position des diffuseurs
anomaux, nous permettant d’avoir accès au module et à la phase de FA (en rouge). A une
longueur d’onde de l’expérience, on connaît la valeur du module du facteur de structure de la
protéine en complexe avec le diffuseur anomal FT1 (cercle rouge). L’intersection entre les
67
cercles bleus et rouges donnent deux solutions pour la phase de Fp. L’utilisation de la seconde
longueur d’onde permet de déterminer la valeur du module de FT2 (cercle vert), et de lever
l’ambiguïté en ce qui concerne la phase de Fp (à l’intersection des cercles bleu, rouge et
vert).
IV.1.4.3. Le remplacement moléculaire
La méthode de phasage par remplacement moléculaire est employée lorsqu’on dispose

d’une structure cristallographique d’une protéine possédant typiquement plus de 25 %
d’identité de séquence avec la protéine d’intérêt. L’homologie de séquence n’est pas le seul
critère pour résoudre une structure par remplacement moléculaire; c’est surtout l’homologie
structurale qui permet d’utiliser les phases de la protéine modèle pour résoudre la structure de
la protéine inconnue.
La méthode du remplacement moléculaire consiste à calculer les fonctions de Patterson,

représentant l’ensemble des vecteurs interatomiques d’une molécule, pour le modèle
cristallographique et pour la structure recherchée. La première étape consiste à déterminer les
trois angles d’Euler, pour lesquels la fonction de corrélation entre la fonction de Patterson du
modèle orienté et celle issue de la structure inconnue est maximale : c’est la fonction de
rotation. Après avoir déterminé l’orientation du modèle, la deuxième étape consiste à
repositionner le modèle par translation pour donner le meilleur accord entre les facteurs de
structure calculés et mesurés. Les phases sont ainsi extraites. Le modèle obtenu de la protéine
est néanmoins biaisé par le modèle de départ. Le modèle doit ensuite être affiné.
IV.1.5. Construction du modèle et affinement
À partir des phases expérimentales, déterminées soit par la méthode MAD, soit par
remplacement moléculaire, on dispose d’une carte de densité électronique dans laquelle on
peut construire un modèle de la structure recherchée. Des programmes, comme ARP/WARP
(Morris et al., 2003), permettent une construction automatique si les phases et la résolution
sont de bonne qualité (résolution d’au moins 2,5 Å). La procédure d’affinement permet de
corriger le modèle initial afin d’obtenir un accord optimal entre les modules des facteurs de
structure observés et ceux calculés à partir du modèle construit. En pratique, on procède en
alternant des étapes de reconstitution manuelle du modèle avec des étapes d’affinement
68
numérique réalisé avec le logiciel REFMAC5 (Murshudov et al., 1997). Ce dernier affine les
paramètres x, y, z et le facteur d’agitation thermique de chaque atome, tout en imposant
certaines contraintes géométriques et stéréochimiques, comme les distances et les angles de
liaison.
Afin de suivre l’affinement du modèle, deux grandeurs caractéristiques de l’état
d’avancement de l’affinement sont utilisées, les facteurs R et Rfree que l’on essaie de
minimiser.
Le facteur R, faisant partie de la fonction à minimiser, n’est pas complètement objectif

et diminue nécessairement au cours de l’affinement puisque l’on optimise l’accord entre
facteur de structure observé et calculé. C’est donc le facteur Rfree, moins biaisé, qui est utilisé
puisqu’il est calculé sur un ensemble de réflexions exclues de la procédure d’affinement. Ces
réflexions sont choisies de manière aléatoire et représentent le plus souvent 5 % des réflexions
totales. Une diminution du facteur R sans diminution corrélée du facteur Rfree indique un
affinement inefficace qui consiste à faire entrer artificiellement dans le modèle le bruit des
cartes de densité électronique.
IV.1.6. Analyse des structures
Afin d’évaluer et de valider un modèle, plusieurs critères doivent être surveillés :

− Lors du traitement des données : la résolution, Rsym (ou Rmerge), le rapport signal sur bruit
I/σ(I) et la complétude.
− Lors de la construction et de l’affinement du modèle : les statistiques d’affinement R et
Rfree, les déviations moyennes des distances et les angles entre les liaisons.
− pour le modèle final, une structure est estimée correcte quand les écarts moyens n’excèdent
pas 2° pour les angles et 0,02 Å pour les distances. La stéréochimie de la chaîne
polypeptidique est estimée par le diagramme de Ramachandran.
69
IV.2. Cristallogenèse et cristallographie de SrtC-1
IV.2.1. Cristallogenèse de SrtC-1
La méthode utilisée est celle de la diffusion de vapeur en goutte suspendue réalisée à

20°C. En utilisant la plateforme de cristallisation à haut débit disponible à l’EMBL, des
cristaux ont été obtenus dans une condition du kit Crystal Screen I de Hampton (0,1 M Tris
pH 8,5, 0,2 M MgCl2 hexahydrate, 30% PEG4000). La condition a alors été reproduite à la
main en mixant 1 µl de protéine purifiée (à environ 10 mg/ml) avec 1 µl de solution A
contenant 0,1 M Tris pH 8,5, 0,2 M MgCl2 hexahydrate, 30 % PEG4000. Les cristaux obtenus
sont ensuite plongés successivement dans une solution cryoprotectrice contenant la solution A
supplémentée de concentration croissante de glycérol (2%, 5%, 10%, 15%) avant d’être
refroidis dans l’azote liquide. Les cristaux de SrtC-1 séléniée ont également été obtenus dans
la même condition.
IV.2.2. Enregistrement des données de diffraction
Un premier jeu de données natif a été enregistré sur la ligne de lumière ID14-EH3 de
l’ESRF. Un jeu de données MAD fut ensuite enregistré sur la ligne de lumière ID23-EH1 de
l’ESRF, permettant de modifier les longueurs d’onde pendant l’expérience. Un spectre de
fluorescence, au seuil d’absorption du sélénium, a été enregistré sur un cristal de SrtC-1
séléniée. L’analyse de ce spectre permet de déterminer les variations des coefficients f et f’’
en fonction des variations de l’énergie des photons incidents. La longueur d’onde
correspondant au seuil d’absorption du sélénium pour lequel la valeur de f’’ est maximale a
été choisie comme longueur d’onde du pic à 0,98055 Å. La seconde longueur d’onde utilisée
correspond au minimum de f’ (inflection) à 0,980750 Å. Une troisième ainsi qu’une
quatrième longueur d’onde de références ont été choisies à 0,982450 Å et 0,978550 Å.
IV.2.3. Structure de SrtC-1
Les différents jeux de données ont été traités avec le groupe de programmes XDS
(Kabsch, 1993). Les données correspondant aux 4 longueurs d’ondes enregistrées sur SrtC-1
70
séléniée ont été mises ensemble en utilisant le programme CAD de CCP4 (Collaborative
Computational Project, 1994). Le phasage a été réalisé par la méthode de dispersion anomale
MAD en utilisant le signal du sélénium. 14 sites de fixation de sélénium ont été localisés dans
l’unité asymétrique par le programme AutoSHARP (Bricogne et al., 2003). Après une étape
d’aplatissement de solvant, ARP/wARP (Perrakis et al., 1999) a construit automatiquement
dans la carte de densité électronique 338 résidus sur les 426 résidus attendus.
Afin d’améliorer la précision du modèle et étant donné que nous disposons d’un jeu de
données natif à une meilleure résolution (1,24 Å), nous avons effectué un remplacement
moléculaire. Pour cela, nous avons injecté les phases du modèle construit précédemment dans
le jeu de données collectées à 1,24 Å. Le modèle obtenu a été ensuite affiné par alternance de
modélisation manuelle avec le programme COOT (Emsley and Cowtan, 2004) et de cycles
d’affinement numérique grâce au programme REFMAC5 (Murshudov et al., 1997).
L’affinement s’est poursuivi jusqu’à obtenir des paramètres stéréochimiques corrects en terme
d’angles et de longueurs de liaisons atomiques, ainsi que des données statistiques
satisfaisantes en terme de facteur R.
IV.3. Cristallogenèse et cristallographie de SrtC-3
IV.3.1. Cristallogenèse de SrtC-3
L’approche utilisée pour obtenir des cristaux de SrtC-3 est celle de la méthode de
criblage manuel grâce aux différents kits Hampton disponibles au laboratoire. La méthode de
diffusion de vapeur en goutte suspendue a été effectuée. Après avoir tester 144 conditions,
une seulement a permis de mettre en évidence une piste prometteuse pour l’obtention de
cristaux. Cette condition a été légèrement modifiée et un cristal a été obtenu dans 0,1 M Mes
pH 5, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 M LiSO4 à 20°C. Étant donné la haute concentration en lithium
présente dans la solution de cristallogenèse, nous n’avons effectué aucune cryoprotection
préalable du cristal. Le cristal a été refroidi directement dans l’azote liquide.
IV.3.2. Structure de SrtC-3
Après avoir enregistré un jeu de données au Laboratoire de Cristallogenèse et de

Cristallographie des Protéines à l’IBS sur un générateur à anode tournante, ces données ont
71
été indexées et intégrées à l’aide du groupe de programmes XDS (Kabsch, 1993). La structure
de SrtC-3 a été résolue par la méthode de remplacement moléculaire en utilisant le
programme PHASER (McCoy et al., 2005; Storoni et al., 2004). Le modèle utilisé pour le
remplacement moléculaire est celui qui correspond au cœur de la structure de SrtC-1, c’est-à-
dire des résidus 82 à 209, dans lesquels les acides aminés qui diffèrent entre SrtC-1 et SrtC-3
ont été remplacés par des alanines. La construction automatique du modèle ainsi que
l’affinement ont été réalisés comme décrit précédemment avec SrtC-1.
IV.4. Cristallogenèse et cristallographie de RrgB
IV.4.1. Cristallogenèse de RrgB
Les essais de cristallogenèse de RrgB ont débuté par un criblage manuel de 192
conditions avec les différents kits Hampton disponibles au laboratoire, en utilisant la méthode
de diffusion de vapeur en goutte suspendue. 1 µl de protéine purifiée à environ 10 mg/ml et 1
µl de solution de cristallisation sont mélangées. Après plus d’un mois, une piste prometteuse
pour l’obtention de cristaux a été décelée et, après affinement des conditions de cristallisation,
des cristaux sont apparus dans: 0,1 M Tris pH 7,5, 18% PEG12000. Ces cristaux poussent en
un peu moins de deux mois. Des cristaux de RrgB séléniée ont été obtenus dans 0,1 M Tris
pH 7,5, 23% PEG8000.
IV.4.2. Enregistrement des données de diffraction
Un jeu de données à 3,7 Å a été enregistré sur la ligne de lumière ID14-EH1 de

l’ESRF, avec un pas d’oscillation de 0,5°. Ce jeu a été indexé et intégré par le groupe de
programmes XDS (Kabsch, 1993).
Des données de diffraction sur un cristal de protéine séléniée ont été enregistrées à la
longueur d’onde correspond au pic du sélénium (0,97950 Å) à 3,1 Å. Un pas d’oscillation de
0,1° a été effectué pour éviter le recouvrement des taches de diffraction. Ce jeu a été indexé et
intégré par le groupe de programmes XDS (Kabsch, 1993).
72
Résultats et Discussion
73
Etude fonctionnelle des composants du pilus de S. pneumoniae Résultats et Discussion
I. Etude fonctionnelle des composants du pilus

de S. pneumoniae
L’ensemble des résultats de cette partie a fait l’objet d’un article (Manzano et al., 2008).
I.1. Rôle des sortases SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3 dans la

polymérisation de RrgB
I.1.1. Analyse in vitro
Chez S. pneumoniae, le corps du pilus est composé de monomères de RrgB qui sont
liés covalemment entre eux. Des études précédentes, réalisées in vivo, ont montré qu’il était
possible de visualiser les pili, issus de la surface du pneumocoque, sur un gel dénaturant SDS
par la présence de plusieurs bandes de haut poids moléculaires. Ceci est en effet rendu
possible puisque les sous-unités de RrgB sont liées les unes aux autres par des liaisons
covalentes et ne sont donc pas brisées par l’action du chauffage et du SDS (Barocchi et al.,
2006 ; Hilleringmann et al., 2008). Nous sommes alors partis de ce principe pour initier notre
étude sur le processus de formation du corps du pilus et tester la capacité de chaque sortase à
polymériser RrgB. Après expression et purification simultanées de SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3 et
RrgB, chaque sortase est incubée avec RrgB à 37°C pendant une nuit. La capacité de former
des fibres de RrgB in vitro est ensuite analysée en recherchant des bandes de plus haut poids
moléculaire sur un gel de gradient SDS. Pour plus de précision, un Western blot est réalisé
avec les anticorps dirigés contre RrgB.
Plusieurs bandes de haut poids moléculaire sont détectées quand RrgB est incubée
avec SrtC-1 (figure 32, piste 2). En revanche, lorsque RrgB est incubée en présence de SrtC-2,
aucune polymérisation de RrgB n’est identifiée (figure 32, piste 3). Il est cependant à noter
que deux faibles bandes reconnues par les anticorps anti-RrgB sont visibles avec SrtC-3
(figure 32, piste 4, indiquées par des étoiles). Ces résultats suggèrent donc que, in vitro, SrtC-
1 est la sortase la plus efficace pour polymériser RrgB, bien que SrtC-3 soit capable de
polymériser RrgB, mais de façon modérée.
74
Afin de vérifier que la polymérisation de RrgB détectée sur gel SDS est bien le fruit
d’une activité sortasique, nous avons testé la capacité du mutant SrtC-1C193A, dans lequel la
cystéine catalytique a été remplacée par une alanine, à former les fibres de RrgB. Les sortases
étant des enzymes qui utilisent leur cystéine pour catalyser la réaction de transpeptidation, une
perte de ce résidu entraînerait donc une perte de leur activité, comme ce fut montré pour SrtA
de S. aureus (Ton-That et al., 2000, 2002). Après incubation avec SrtC-1C193A, RrgB reste
monomérique et aucune bande de haut poids moléculaire n’est présente (figure 32, piste5). En
conclusion, la polymérisation de RrgB in vitro est bien le résultat de l’activité de SrtC-1.
Figure 32 : Analyse in vitro de la formation de fibres de RrgB catalysée par les sortases
pneumococciques (Manzano et al., 2008). Western Blot révélé avec des anticorps anti-RrgB. (1) RrgB
monomérique. (2) RrgB + SrtC-1. (3) RrgB + SrtC-2. (4) RrgB + SrtC-3. (5) RrgB + SrtC-1C193A.
Les étoiles indiquent la présence de deux faibles bandes protéiques.
I.1.2. Analyse in vivo
Afin de confirmer les résultats obtenus in vitro, nous avons étudié, in vivo, l’effet de la
perte d’activité de SrtC-1. Pour cela, dans la souche pneumococcique TIGR4, le gène codant
pour SrtC-1 (gène sp0466 de l’îlot rlrA) a été délété et le phénotype analysé. Cette étude a été
réalisée par Anne-Marie Di-Guilmi et Lamya El Mortaji à l’IBS. Afin de récupérer les pili
ancrés au peptidoglycane, les bactéries mutantes TIGR4∆sp0466 et celles sauvages ont été
traitées au lysozyme et à la mutanolysine, agents qui hydrolysent le peptidoglycane. Une
centrifugation subséquente a permis de se débarrasser des agrégats cellulaires et de ne garder
75
que les composants ancrés au peptidoglycane, dont les pili. Les extraits totaux (c’est-à-dire
avant centrifugation) ainsi que les surnageants ont été alors chargés sur gel SDS et la présence
de pili a été analysée par western blot avec les anticorps anti-RrgB.
La souche sauvage TIGR4 possède des pili à sa surface comme en témoigne la
présence de bandes de haut poids moléculaire sur gel SDS (figure 33, pistes 1 et 2). La souche
mutante, n’exprimant plus la sortase SrtC-1, possède quant à elle une quantité plus faible de
pili à sa surface, ce qui est en accord avec l’augmentation de la quantité de RrgB
monomérique (figure 33, pistes 3 et 4). SrtC-1 apparaît donc bien être la sortase principale
polymérisant le pilus, bien que sont absence puisse être partiellement compensée par
d’autre(s) sortase(s) comme en témoigne la présence d’une faible quantité de pili détectée à la
surface du mutant TIGR4∆sp0466.
Il est à noter que les pili, obtenus in vivo et observés sur gel, possèdent une taille
supérieure à celle des fibres que nous sommes capables de former in vitro. Cela peut
s’expliquer par le fait que les pili extraits du pneumocoque sont additionnées de fragments de
peptidoglycane, rendant ainsi leur masse plus grande. De plus, il se peut également que des
protéines se retrouvent ancrées sur le peptidoglycane. La masse des pili observée in vivo
reflète donc, en réalité, la masse des pili additionnée de celle des fragments de peptidoglycane
sur lesquels peuvent se localiser des protéines.
1 2 3 4
RrgB
monomérique
Figure 33 : Analyse de la délétion du gène sp0466 codant pour SrtC-1 dans la souche pneumococcique
TIGR4 (Manzano et al., 2008). Western Blot développé avec des anticorps dirigés contre RrgB. Après
traitement à la mutanolysine et au lysozyme, les échantillons avant et après centrifugation sont déposés.
(1) extrait total de TIGR4. (2) surnageant de TIGR4. (3) extrait total de TIGR4Δsp0466. (4) surnageant de
TIGR4Δsp0466.
76
En conclusion, ces résultats in vivo confirment ce qui a été obtenu in vitro à savoir que
SrtC-1 joue un rôle clé dans le processus de polymérisation du pilus. L’absence de cette
enzyme peut être toutefois compensée par une activité de polymérisation de RrgB réalisée par
l’une ou l’autre des sortases (ou encore les deux), ce qui a été également établi par les travaux
de LeMieux et ses collègues. En effet, ceux-ci ont montré que des souches pneumococciques,
dans lesquelles une des sortases est manquante, est toujours capable d’exprimer des pili à sa
surface mais en quantité inférieure (LeMieux et al., 2008).
I.2. Caractérisation des fibres de RrgB formées in vitro
I.2.1. Purification des fibres
Après incubation à 37°C pendant une nuit, le mélange SrtC-1/RrgB, réalisé à grande
échelle, est chargé sur une colonne d’exclusion de taille afin de séparer les fibres des
monomères de SrtC-1 et RrgB. Le profil d’élution obtenu est montré ci-dessous.
A B
Fibres
Figure 34 : Caractérisation des fibres de RrgB synthétisées in vitro (Manzano et al., 2008). (A) Profil
d'élution de la chromatographie d'exclusion du mélange SrtC-1/RrgB après incubation d'une nuit à
37°C. (B) Analyse par Western Blot, avec les anticorps anti-RrgB, de la fraction de la gel filtration
correspondant au fibres. Cet échantillon sera ensuite analysé par microscopie électronique et par
spectrométrie de masse.
77
Les fractions correspondant aux différents pics ont été analysées sur gel SDS. La
fraction qui contient les fibres, montré en figure 34B, a été concentrée puis analysée par
microscopie électronique. D’autre part, afin d’établir l’authenticité des bandes de haut poids
moléculaire visualisées sur gel, celles-ci ont été analysées par spectrométrie de masse.
I.2.2. Spectrométrie de masse des fibres
Une partie de l’échantillon provenant de la gel filtration et contenant les fibres

purifiées a été chargé sur gel SDS. Après coloration des bandes protéiques, celles-ci ont été
découpées et analysées séparément par chromatographie liquide nano-débit couplée à un
spectromètre de masse en tandem (nanoLC-MS/MS). Ces études ont été réalisées par la plate-
forme "EDyP-Service" disponible au CEA de Grenoble par l’équipe de Jérôme Garin.
Après digestion trypsique de chacune des bandes, les peptides issus de l'hydrolyse
enzymatique des protéines vont dans un premier temps être séparés par chromatographie
suivant leur hydrophobicité. Les peptides sont ensuite injectés séquentiellement dans la source
du spectromètre de masse où ils sont ionisés et fragmentés. L’analyse des spectres MS/MS
expérimentaux, résultants de la fragmentation des peptides, permettent ainsi l’identification
des peptides issues de la digestion trypsique.
Les peptides issus de la digestion trypsique des différentes bandes protéiques
appartiennent à RrgB, confirmant ainsi l’identité des bandes visualisées sur gel SDS (figure
35)
Masse Masse Masse Protéine

observée expt calc Δ AA1 AAx Séquence identifiée
513,7 1025,43 1025,48 -0,05 243 251 MTEGLAFNK RrgB
523,74 1045,47 1045,56 -0,08 129 138 FNTANLPAAK RrgB
563,24 1124,46 1124,57 -0,11 300 309 ITYSATLNDK RrgB
588,79 1175,57 1175,62 -0,05 580 590 QPAGYALLTSR RrgB
602,81 1203,61 1203,67 -0,06 377 387 VVQTVTLTTDK RrgB
714,33 1426,65 1426,71 -0,06 243 255 MTEGLAFNKGTVK RrgB
958,42 1914,84 1914,92 -0,08 410 427 GYSADYQEITTAGEIAVK RrgB

523,84 1045,67 1045,56 0,11 129 138 FNTANLPAAK RrgB
563,35 1124,69 1124,57 0,12 300 309 ITYSATLNDK RrgB
832,01 1662,01 1661,82 0,19 228 242 IPALANYATANWSDR RrgB
566,01 1695,02 1694,85 0,17 388 402 NTVTVNGLDKNTEYK RrgB
639,39 1915,14 1914,92 0,22 410 427 GYSADYQEITTAGEIAVK RrgB
78
688,76 2063,25 2063,04 0,21 461 480 LAGAEFVIANADNAGQYLAR RrgB

714,77 2141,30 2141,06 0,23 209 227 DTPVNHQVGDVVEYEIVTK RrgB
749,49 2245,45 2245,22 0,24 377 397 VVQTVTLTTDKNTVTVNGLDK RrgB
781,14 2340,39 2340,15 0,24 141 162 IYEIHSLSTYVGEDGATLTGSK RrgB
828,85 2483,54 2483,25 0,28 206 227 VDKDTPVNHQVGDVVEYEIVTK RrgB

588,87 1175,72 1175,63 0,09 580 590 QPAGYALLTSR RrgB
832,01 1662,01 1661,82 0,20 228 242 IPALANYATANWSDR RrgB
621,88 2483,51 2483,25 0,25 206 227 VDKDTPVNHQVGDVVEYEIVTK RrgB

857,17 2568,49 2568,20 0,29 42 65 LLATDGDMDKIANELETGNYAGNK RrgB


861,18 2580,51 2580,23 0,28 591 615 QKFEVTATSYSATGQGIEYTAGSGK RrgB

523,82 1045,62 1045,56 0,06 129 138 FNTANLPAAK RrgB
563,33 1124,65 1124,57 0,08 300 309 ITYSATLNDK RrgB
714,43 1426,85 1426,71 0,14 243 255 MTEGLAFNKGTVK RrgB
Figure 35 : Analyse des spectres expérimentaux MS/MS obtenus après digestion trypsique des bandes
protéiques visualisées sur gel SDS à haut poids moléculaire (Manzano et al., 2008).
Masse observée : masse du peptide sélectionné (ratio m/z).
Masse expt : Masse moléculaire expérimentale (Da) du peptide sélectionné.
Masse calc : Masse moléculaire calculée (Da) du peptide sélectionné.
Δ: Différence de masse (Da) entre Masse expt et Masse calc.
AA1: Position du premier acide aminé du peptide sur la protéine identifiée.
AAx: Position du dernier acide aminé du peptide sur la protéine identifiée.
Séquence: Séquence du peptide identifié.
79
I.2.3. Microscopie électronique des fibres
Après purification des fibres sur gel filtration, celles-ci ont été également étudiées en
microscopie électronique à coloration négative par le groupe de Guy Schoehn à l’IBS. Deux
populations de fibres, avec deux diamètres différents, sont présentes (figure 36). La première,
majoritaire, présente un diamètre de 3,5 nm environ. Le second type de fibres a un diamètre
plus grand, d’approximativement 7 nm. Ces dernières semblent être potentiellement formées
par l’association latérale de deux fibres plus fines (figure 36, d et g). De plus, les fibres
observées sont « coudées », suggérant ainsi une certaine flexibilité de ces structures (figure
36, i et j).
Le poids moléculaire des fibres observées peut être approximativement calculé,
comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Ainsi, le poids moléculaire de la plus
grande fibre a été estimé à 480 kDa et celui de la plus petite à 140 kDa environ.
Figure 36 : Analyse de microscopie électronique en

coloration négative des fibres de RrgB formées in
vitro (Manzano et al., 2008). Les flèches montrent
les fibres dont le diamètre est d'environ 3,5 ou 7
nm. L’échelle représentée est de 20 X 5 nm. b-j :
galerie de fibres.
In vivo, les pili de S. pneumoniae ont été décrits comme des structures flexibles
formées par de fins protofilaments arrangés en une superstructure « coiled-coil »
(Hilleringmann et al., 2008) (figure 37A). Ainsi, deux protofilaments de 3,5 nm de diamètre
se croisent étroitement pour former des pili de diamètre 6,8 nm. Des zones, dans lesquelles
80
l’intersection entre les deux protofilaments est plus relachée, se retrouvent également sur le
pilus produisant alors un diamètre de 9,5 nm (Hilleringmann et al., 2008) (figure 37B).
A B
Figure 37 : Structure des pili de S. pneumoniae. A/ Modèle du pilus de S. pneumoniae. Deux

protofilaments, composés de RrgB polymérisée, s’assemblent en une structure coiled-coil sur laquelle sont
localisés les protéines RrgA et RrgC (Hilleringmann et al., 2008). B/ Images de cryomicroscopie
électronique d’un pilus pneumococcique. Le diamètre du protofilament est de 3,5 nm, celui du pilus de 6.8
nm (et peut atteindre 9.5 nm de diamètre) (Hilleringmann et al., 2008).
Par conséquent, les fibres que nous sommes capables de produire in vitro ont
approximativement le même diamètre que les protofilaments de 3,5 nm et les filaments de 6,8
nm identifiés à la surface du pneumocoque.
L’assemblage formé in vitro, d’une longueur moyenne de 35 nm, est cependant plus
petit que les pili visualisés in vivo qui ont une longueur de 500 µm à plus de 1 µm, comme le
montre la figure 38. Il a été montré que les pili présents à la surface de diverses bactéries à
Gram-positif possèdent des longueurs variables. Ainsi, des formes assez courtes de pili ont pu
être identifiées chez S. salivarius, S. agalactiae, E. faecalis ou encore S. pneumoniae. Il est
donc tout à fait possible que les structures que nous formons in vitro représentent ces
« formes » minimales.
81
A B
100 nm
Figure 38 : Le pneumocoque et ses pili. A/ Souche pneumococcique TIGR4 possédant des pili à sa surface
observée par microscopie à force atomique (Falker et al., 2008). B/ Image de cryo-microscopie
électronique de pili purifiés de la surface du pneumocoque. Les fléches ouvertes et fermées indiquent la
présence de différentes tailles de pili (Hilleringmann et al., 2008).
Une autre hypothèse peut cependant être envisagée. Il est effectivement possible que
les fibres formées in vitro soient courtes car SrtC-1 ne polymérise qu’inefficacement RrgB (ce
qui est démontré par le nombre fini de bandes présentes sur gel SDS) et que cette enzyme a
besoin d’autres composants du pilus pour former une fibre entière, telles que les autres
sortases. Cette possibilité a été testée in vitro en incubant RrgB avec les trois sortases SrtC-1,
SrtC-2 et SrtC-3 mais aucune différence n’a été observée. Par conséquent, la formation in vivo
des pili doit probablement être un processus très bien orchestré qui requiert l’ensemble des
composants impliqués dans la formation du pilus et associés à la membrane (aussi bien les
sortases que les protéines Rrg) afin d’optimiser la reconnaissance des partenaires mais aussi la
catalyse. Il est ainsi concevable qu’une telle organisation ne peut être reproduite in vitro, ce
qui expliquerait la présence de courtes fibres dans notre cas.
Il est intéressant à noter que, pour la première fois, le rôle des sortases dans le
processus de polymérisation du pilus a pu être mis en évidence in vitro en utilisant les
protéines substrats.
82
Détermination de la structure des sortases SrtC-1 et SrtC-3 Résultats et Discussion
II. Détermination de la structure des sortases

SrtC-1 et SrtC-3
Le traitement des jeux de données ainsi que la résolution des deux structures des sortases
SrtC-1 et SrtC-3 ont été réalisés avec l’aide de Carlos Contreras-Martel. Les deux structures
ont été déposés dans la PDB sous le code de 2W1J pour SrtC-1 et 2W1K pour SrtC-3 et ont
été publiées dans Manzano et al., 2008.
II.1. Structure de SrtC-1
II.1.1. Production de SrtC-1
Seule la région du génome de S. pneumoniae TIGR4 codant pour les acides aminés 17
à 228 a été clonée (clonage réalisé par Anne-Marie Di-Guilmi). En effet, la partie N-
terminale, assez hydrophobe, et la partie C-terminale, prédite comme un ancrage
transmembranaire par le logiciel SMART (http://smart.embl-heidelberg.de), ont été délétées
afin de s’affranchir d’éventuels problèmes de solubilité.
La protéine SrtC-1 est exprimée de façon recombinante chez E. coli et purifiée
relativement facilement avec un rendement de bonne qualité (20 à 30 mg/L de culture).
II.1.2. Cristallogenèse de SrtC-1
Des premiers cristaux ont été obtenus avec le robot Cartésian de l’EMBL dans 0,1 M
Tris pH 8,5, 0,2 M MgCl2 hexahydrate, 30% PEG4000. Ces cristaux, étaient trop petits pour
poursuivre des études de cristallographie aux rayons X. Ils ont été reproduits manuellement et
apparaissent entre 48 et 72 heures dans le tampon cité précédemment (figure 39).
Figure 39 : Cristaux de SrtC-1 dans 0.1 M Tris

pH 8.5, 0.2 M MgCl2 hexahydrate, 30%
PEG4000.
83
Ces cristaux sont ensuite plongés successivement dans des solutions cryoprotectrices
contenant une concentration croissante de glycérol (jusqu’à 15%) puis congelés par
immersion dans l’azote liquide.
II.1.3. Production de cristaux de SrtC-1 séléniée
Le remplacement moléculaire, en utilisant la structure de SrtA de S. aureus comme

modèle, n’a pas permis de résoudre la structure de SrtC-1. Nous avons alors décidé
d’exprimer la protéine séléniée, dans laquelle les résidus méthionines sont remplacés par des
sélénométhionines, et d’utiliser la méthode MAD comme méthode de phasage. Un protocole
similaire à celui de SrtC-1 native a été utilisé pour purifier SrtC-1 séléniée. Cependant, 10
mM de DTT a été ajoutés dans le tampon de gel filtration. Les cristaux de SrtC-1 séléniée
sont obtenus également dans 0,1 M Tris pH 8,5, 0,2 M MgCl2 hexahydrate, 30% PEG4000.
La cryprotection est la même que pour les cristaux natifs de SrtC-1.
II.1.4. Résolution de la structure de SrtC-1
II.1.4.1. Collecte des données natives et séléniées
La collecte des données de diffraction sur un cristal de SrtC-1 native a été réalisée sur
la ligne de lumière ID14-EH3 de l’ESRF, à une longueur d’onde de 0,93100 Å. La collecte
des données de diffraction sur un cristal de SrtC-1 séléniée a été effectuée sur la ligne ID23-
EH1 de l’ESRF. Les longueurs d’onde ont été choisies à l’aide des spectres de fluorescence
expérimentaux (figure 40). Nous avons ainsi réalisé 4 collectes aux longueurs d’onde du pic
(maximum de f”) : 0,98055 Å, de l’inflexion (minimum de f’) : 0,980750 Å, et des références
: 0,982450 Å et 0,978550 Å.
Pour chacun des jeux de données, 180 images, par incrémentation de 1°C, ont été
enregistrées, permettant ainsi une bonne redondance des pics de diffraction et une bonne
complétude (tableau 1).
84
Figure 40 : Calcul des longueurs

d’onde correspondant au pic
d’absorption du sélénium dans
la structure de SrtC-1.
II.1.4.2. Traitement des données
L’indexation et la mise à l’échelle des 4 jeux de données de SrtC-1 séléniée ainsi que
du jeu de données de SrtC-1 native ont été faites avec le groupe de programmes XDS
(Kabsch, 1993). Les statistiques sont rassemblées dans le tableau 1.
Collecte SrtC-1-SeMet SrtC-1- SrtC-1- SrtC-1- SrtC-1

(pic) SeMet SeMet SeMet native
(inflexion) (référence1) (référence2)
Longueur d’onde (Å) 0,98055 0,980750 0.982450 0,978550 0,93100
Groupe d’espace P212121 P212121 P212121 P212121 P212121

Paramètres de maille (Å) a=68,3 b=70,1 a=68,6 a=68,8 a=68,7 a=68,1
c=86,2 b=70,4 b=70,5 b=70,3 b=70,2
α=β=γ=90° c=86,6 c=86,8 c=86,7 c=86,5
α=β=γ=90° α=β=γ=90° α=β=γ=90° α=β=γ=90°
Résolution (Å) 1,7 1,8 1,8 1,8 1,2
Nombre de réflexions 80448/ 297168 65317/ 65393/ 64343/ 101238/
uniques/totales 240375 240388 236792 1264828
Complétude (%) 96,3 (88.0) 96,7 (89.3) 95,6(84.8) 95,1(83.5) 98,3(93.9)
I/σI 13,4 (3,6) 13,7 (3,2) 12,1 (2,3) 10,1 (1,8) 33,5 (5,1)
Rsym (%) 5,9 (37,4) 5,7 (44,6) 6,1 (63,6) 7,5 (83,4) 4,7 (50,7)
Phasage
Figure de mérite 0,3/0,4
(avant/après aplatissement
de solvant)
Tableau 1 : Statistiques du traitement des jeux de données de SrtC-1 native et séléniée. Les chiffres entre
parenthèses représentent les valeurs de la dernière tranche de résolution.
85
Deux molécules sont présentes dans l’unité asymétrique. Le pourcentage de solvant est
de 43% et le coefficient de Matthews de 2,17 Å3. Le phasage de SrtC-1 a été réalisé à partir
des jeux de données de la protéine séléniée à une résolution de 1,73 Å. Le programme
AutoSHARP (Bricogne et al., 2003) nous a permis de localiser les 14 méthionines séléniées
de la protéine. Le programme ARP/wARP (Perrakis et al., 1999), après aplatissement de
solvant, a été capable de construire automatiquement 79 % de la chaîne peptidique.
Nous avons ensuite effectué un remplacement moléculaire des données natives à 1,24
Å pour améliorer la précision du modèle. L’affinement, dont les statistiques sont représentées
tableau 2, a été réalisé manuellement à l’aide de COOT (Emsley and Cowtan, 2004) et du
programme REFMAC5 (Collaborative Computational Project, 1994).
Affinement SrtC-1
Nombre de résidus 390
Nombre de molécules d’eau 451
Nombre de molécules de glycérol 6
Rwork (%) 17,1
Rfree (%) 18,5
2
Facteur B moyen (Å ): 11,9
Déviation r.m.s pour les liaisons (Å) 0,007
Déviation r.m.s pour les angles (°) 1,2
Tableau 2 : Statistiques d’affinement pour SrtC-1.
II.1.5. Analyse de la structure de SrtC-1
II.1.5.1. Structure globale de SrtC-1
Nous avons pu tracer dans la carte de densité électronique les résidus 19 à 214. SrtC-1
est composée de 8 brins β centraux, principalement antiparallèles, qui s’associent pour former
un tonneau, lequel est entouré de 4 hélices α majeures et de 4 hélices de type 310 (figure 41).
Ce type de structure en tonneau β est caractéristique du repliement des sortases de classe A et
de classe B (Zhang et al., 2004; Zong et al., 2004a).
86
couvercle
Site actif
Figure 41 : Structure de SrtC-1 (Manzano et al., 2008). La région centrale est composée d’un tonneau β.
En rose est représenté le couvercle qui recouvre la région du site actif.
La région incluant l’hélice α3, colorée en rose sur la structure, forme une sorte de
couvercle qui recouvre la région du site actif. Cette région semble être flexible comme en
témoignent les facteurs de température qui sont plus élevés au niveau de cette région (figure
42).
Figure 42 : Structure de SrtC-1 colorée par facteurs de température. Plus les facteurs de température sont
élevés, plus la coloration est rouge. À l’inverse, plus les facteurs de température sont faibles, plus la
coloration est bleue. Le couvercle semble donc être une zone potentiellement flexible comme l’indiquent
les facteurs de température plus élevés des bords du couvercle (indiqués par des flèches). Il est également
à noter que l’hélice en N-terminal possède des facteurs de température élevés, probablement à cause des
faibles contacts qu’elle a dans l’empilement cristallin.
87
Alors que la région centrale de SrtC-1, englobant le tonneau β, est présente chez les
sortases de classes A et B, l’arrangement des hélices α est différent. De plus, le couvercle,
présent chez SrtC-1, est absent chez toutes les autres sortases dont la structure a été résolue de
nos jours, aussi bien de classe A que de classe B (figure 43).
A B
C D
Figure 43 : SrtC-1 possède un couvercle qui recouvre la région du site actif et qui est absent chez les sortases
de classe A et B. A/ Structure de SrtC-1. Le couvercle est coloré en rose. B/ Structure de Srt-A de S. aureus. C/
Structure de Srt-B de S. aureus. D/ Structure de Srt-A de S. pyogenes. Pour l’ensemble de ces structures, la
triade catlytique, composée d’une histidine, d’une cystéine, et d’une arginine est représentée.
88
II.1.5.2. Site actif de SrtC-1
Le site actif des sortases de classes A et B est composé de trois résidus : une cystéine,
une histidine et une arginine. SrtC-1 possède également cette triade catalytique à une position
analogue de ces mêmes résidus chez les sortases de classes A et B (figure 43). On peut ainsi
identifier les résidus Cys-193 (situé en C-terminal du brin β7), His-131 (localisé dans la
boucle qui suit le brin β4) et l’Arg-202 (positionné du coté N-terminal du β8) comme faisant
partie du site actif (figure 43). Ces trois résidus sont localisés dans une gorge que l’on pourrait
nommer la gorge catalytique (figure 44).
Figure 44 : Représentation en surface de SrtC-1. Les

résidus du site actif (His-131, Cys-193 et Arg-202)
sont localisés dans une gorge catalytique.
La chaîne latérale de Cys-193 est présente en deux conformations dans les deux
monomères de l’unité asymétrique et a été représentée avec une occupation de 0,5 dans
chaque cas. Dans une conformation, cette chaîne latérale pointe en dehors du site actif et fait
une liaison hydrogène de 3,1 Å avec l’atome Oδ1 du résidu Asn-199, lui-même localisé sur la
boucle reliant β7 à β8. Dans la seconde conformation, au contraire, la chaîne latérale de la
Cys-193 pointe directement dans le site actif et interagit faiblement avec l’atome N de l’Arg-
202 (liaison hydrogène de 3,4 Å) (figure 45A).
A B
Figure 45 : Comparaison des régions du site actif de SrtC-1 de S. pneumoniae et SrtA de S. aureus
(Manzano et al., 2008). A/ Deux résidus, Asp58 et Trp60, permettent d’ancrer le couvercle dans le site actif
de SrtC-1. B/ Le site actif de SrtA n’est pas recouvert d’un couvercle et se retrouve plus exposé au
solvant. 89
Il est important de noter que l’His-131 n’interagit pas directement avec la Cys-193,
étant donné la distance, trop importante, qu’il existe entre ces deux résidus (5,4 Å). Cette
observation est en accord avec les structures d’autres sortases résolues où aucune interaction
His-Cys n’a été décrite, rejetant ainsi la proposition de formation d’une paire thiolate/ion
imidazolium (Zong et al., 2004a; Zong et al., 2004b).
Deux autres résidus, Asp-58 et Trp-60 qui appartiennent au couvercle, sont ancrés
dans le site actif (figure 45A). Trp-60 augmente la nature hydrophobique de la gorge
catalytique. Asp-58 interagit avec Arg-202 permettant ainsi à ce dernier résidu de pointer
directement vers la cystéine catalytique. A l’inverse, la structure de SrtA de S. aureus montre
que, d’une part, l’arginine du site actif n’est pas dans une position contrainte et que, d’autre
part, elle pointe de l’autre côté de la cystéine catalytique (figure 45B).
Pour résumer, nous avons observé :

- la présence d’un couvercle, potentiellement flexible, recouvrant la région du site actif.
- l’absence de ce couvercle chez les sortases de classes A et B.
- l’ancrage du couvercle dans le site actif par le biais de deux résidus du couvercle, un
tryptophane et un aspartate.
- une interaction entre l’aspartate du couvercle et l’arginine du site actif garantissant à
cette dernière de pointer vers la cystéine catalytique.
L’ensemble de ces observations suggèrent que la présence d’un couvercle qui est ancré dans
le site actif préviendrait la reconnaissance de substrats inappropriés. De plus, il apparaît que
l’interaction entre Arg-202 et Asp-58, n’ai pas seulement pour fonction de fermer le couvercle
en absence de substrat, mais d’assurait aussi que Arg-202 soit dans une position optimale pour
la catalyse, notamment pour stabiliser l’intermédiaire réactionnelle oxyanion (Frankel et al.,
2007) une fois le couvercle ouvert et le substrat lié.
90
II.2. Structure de SrtC-3
La production et la cristallogenèse de SrtC-3 ont été effectuées avec l’aide d’un étudiant
de Master II, Thierry Izoré, que j’ai encadré.
II.2.1. Production de SrtC-3
La partie N-terminale étant prédite comme un peptide signal d’export et la partie C-

terminale correspondant à un domaine transmembranaire (prédits par le logiciel SMART),
seule la région incluant les acides aminés 32 à 254 de SrtC-3 a été clonée (clonage effectué
par Anne-Marie Di-Guilmi). Un protocole d’expression et de purification similaire à celui de
SrtC-1 a été réalisé ; SrtC-3 s’exprime avec un aussi bon rendement que celui de SrtC-1.
II.2.2. Cristallogenèse
Un criblage manuel de 168 conditions avec des kits Hampton a été effectué et a permis
de révéler une condition prometteuse. Après amélioration de cette condition, un cristal est
apparu en 7 jours dans 0,1 M Mes pH 5, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 M LiSO4 à 20°C.
110 µm
Figure 46 : Cristal de SrtC-3 dans 0,1 M Mes

pH 5, 0,5 M (NH4)2SO4, 1 M LiSO4.
Étant donné la haute concentration en lithium présente dans la solution de

cristallogenèse, nous n’avons effectué aucune cryoprotection préalable du cristal. Le cristal a
été congelé directement dans le flux d’azote liquide du générateur.
II.2.3. Résolution de la structure
Un jeu de données a été enregistré sur le générateur à rayons X du Laboratoire de

Cristallogenèse et Cristallographie des Protéines de l’IBS. L’indexation et la mise à l’échelle
91
ont été réalisées avec le groupe de programme XDS (Kabsch, 1993). Les statistiques
correspondant à ce jeu de données sont présentées dans le tableau 3.
La structure de SrtC-3 a été résolue par remplacement moléculaire à l’aide du

programme PHASER (McCoy et al., 2005) en prenant pour modèle la structure de SrtC-1. Le
remplacement moléculaire ne fonctionnant pas avec le modèle entier de SrtC-1, nous avons
choisi comme autre modèle le cœur en tonneau β de SrtC-1 qui correspond au repliement
typique des sortases. Dans ce nouveau modèle (qui comprend les résidus 82 à 209), nous
avons remplacé les acides aminés différents entre SrtC-1 et SrtC-3 par des alanines. La
solution nous a donné 2 molécules dans l’unité asymétrique que nous avons affinées
manuellement, à l’aide de COOT (Emsley and Cowtan, 2004), ainsi qu’avec le programme
REFMAC5 (Murshudov et al., 1997). Les paramètres d’affinement de la structure sont
rassemblés dans le tableau 3.
Collecte SrtC-3
Longueur d’onde (Å) 1,5418
Groupe d’espace P23
Paramètres de maille (Å) a=b=c=122,6
α=β=γ=90°
Résolution (Å) 2,14
Nombre de réflexions uniques/totales 28482/ 75646
Complétude (%) 90,7 (75,8)

I/σI 15,3 (4,4)
Rsym (%) 10 (51)
Affinement
Nombre de résidus 418
Nombre de molécules d’eau 505
Nombre de molécules de MES 2
Rwork (%) 18,1
Rfree (%) 24,1
Facteur B moyen (Å2 ): 37,68
Déviation r.m.s pour les liaisons (Å) 0,03
Déviation r.m.s pour les angles (°) 2,30
Tableau 3 : Statistiques du traitement de jeu de données de SrtC-3 et de son affinement. Les valeurs entre
parenthèse sont celles de la dernière tranche de résolution.
92
Figure 47 : Alignement de séquences des sortases de S. pneumoniae. Les résidus identiques sont sur fond
rouge, les résidus similaires sont inscrits en rouge. Les résidues de la triade catalytique sont sur fond vert, ceux
qui ancrent le couvercle dans le site actif sont sur fond rose. Le résidu Asn-199 qui interagit avec la Cys-193
est sur fond orange. La région correspond au couvercle est montrée en rose au-dessus des séquences. Les
régions transmembranaires (TM) et le peptide signal (SP) ont été prédits avec le logiciel SMART
(www.smart.embl-heidelberg.de). En dessus et en dessous des trois séquences se trouvent les éléments de
structures secondaires de SrtC-1 et SrtC-3 respectivement.
93
II.2.4. Analyse de la structure de SrtC-3
II.2.4.1. Structure globale de SrtC-3
Malgré la faible identité de séquence qu’il existe entre SrtC-1 et SrtC-3 (26,4%), SrtC-
3 possède un repliement très similaire à celui de SrtC-1 (se reporter à l’alignement de
séquences, figure 47). Ces deux structures se superposent très bien ; la valeur du rmsd est de
1.3 Å sur 138 atomes C de la chaîne principale. Le repliement en tonneau β caractéristique
aux sortases est conservé (figure 48). La principale différence structurale avec SrtC-1 réside
dans la présence d’une hélice α additionnelle du côté C-terminal.
Figure 48 : Structure de SrtC-3 (Manzano et al., 2008). La région du site actif recouverte d’un
couvercle est montrée en rose.
Comme le montre la figure ci-dessus, SrtC-3 possède, tout comme SrtC-1, un

couvercle qui recouvre la région de son site actif. Celui-ci semble être plus flexible que celui
de SrtC-1, comme l’indiquent les valeurs plus élevées des facteurs de température de cette
région (figure 49). Les régions comportant les résidus 68 à 71 et les résidus 78 à 82 ont,
respectivement, un facteur de température de 47,4 Å2 et 44,8 Å2 alors que ceux de la région
intérieure (résidus 73 à 76) sont plus faibles (20,2 Å2). Ces observations suggèrent que les
résidus des bords du couvercle, indiqués par les flèches sur la figure 49, pourraient jouer le
94
rôle de « charnières » dans un potentiel mécanisme d’ouverture (telles les charnières d’un
pont-levis qui permet son ouverture et sa fermeture). Cette supposition peut être extrapolée à
SrtC-1 même si la différence de valeurs des facteurs de température entre la zone charnière du
couvercle et la région interne ne sont pas aussi flagrantes que pour SrtC-3.
Figure 49 : Structure de SrtC-3 colorée par facteurs de température. Plus la couleur est chaude (rouge),
plus le facteur de température est élevé. A contrario, plus la couleur est froide (bleue), plus le facteur de
température est faible. Les flèches indiquent les « charnières » du couvercle.
II.2.4.2. Site actif
Le site actif de SrtC-3 montre des similarités avec celui de SrtC-1. En effet, les 3
résidus du site actif, Cys-206, His-144 et Arg-215 occupent des positions analogues aux
résidus Cys-193, His-131 et Arg-202 de SrtC-1. Néanmoins, une seule conformation de Cys-
206 est observée ; sa chaîne latérale pointe dans le site actif en direction de l’Arg-215 (figure
50). Dans la structure de SrtC-1, Asn-199 qui interagit avec Cys-193 expliquait la présence de
la seconde conformation. Or, SrtC-3 ne possède pas une asparagine mais une phénylalanine
(Phe-212), qui empêche ainsi toute interaction polaire. Ceci peut donc expliquer pourquoi une
seule conformation de Cys-206 est présente dans la structure de SrtC-3. Tout comme dans
SrtC-1, l’arginine du site actif de SrtC-3, Arg-215, interagit avec le résidu aspartate du
couvercle (Asp-73), la maintenant de cette façon à proximité de la cystéine nucléophile. Phe-
75 pointe dans la gorge catalytique lui augmentant sa nature hydrophobique (figure 50).
95
Figure 50 : Site actif de SrtC-3. Les résidus Asp73 et Phe75 appartiennent au couvercle et l’ancrent
dans le site actif où les résidus de la triade catalytique sont représentés en vert.
Comme nous l’avons stipulé pour SrtC-1, SrtC-3 possèderait un couvercle permettant
à l’enzyme d’être dans une conformation fermée, avec le site actif inaccessible au substrat, et
garantissant que les résidus catalytiques soient positionnés de façon appropriée pour la
catalyse.
II.3. La structure des sortases formant le pilus se distinguent

des structures de sortases classiques
Comme décrit précédemment, SrtC-1 et SrtC-3 possèdent une région, que l’on nomme
couvercle, qui recouvre leur site actif et qui est absent chez les sortases de classes A et B dont
les structures ont été résolues à ce jour. Ce couvercle aurait, potentiellement, deux fonctions :
celle de maintenir les résidus du site actif, notamment l’arginine, dans une position appropriée
pour la catalyse et celle de restreindre l’accès du site actif afin de ne sélectionner que les
substrats adéquats.
Pour étayer cette hypothèse, nous avons comparé les structures de SrtC-1 et SrtC-3
avec la structure de SrtA de S. aureus complexée avec le peptide mimant le motif LPXTG. Il
en résulte que, de façon intéressante, le couvercle prend une position similaire à celle du
peptide LPETG (figure 51). Ce peptide, dans SrtA, est localisé dans une gorge allongée, à
proximité des résidus Thr-180, Leu-181, Ile-182 et Thr-183 (en jaune sur la figure 51B). Ces
résidus appartiennent à la séquence consensus TLXTC, motif hautement conservé parmi
96
toutes les sortases et contenant la cystéine nucléophile. Il a été montré que cette région
TLXTC joue un rôle dans la reconnaissance du substrat (Frankel et al., 2007). Nous pouvons
donc supposer que cette région, qui est aussi présente dans SrtC-1 et SrtC-3, joue un rôle dans
la reconnaissance du substrat pour ces deux enzymes. Cette région, comme le montre la figure
51A, est néanmoins recouverte par une partie du couvercle et est donc inaccessible dans cet
état. Une ouverture du couvercle pourrait ainsi rendre accessible cette région ainsi que le site
actif. La catalyse pourrait alors se faire. Ces observations suggèrent qu’un couvercle fermé
(comme observé dans les structures) prévient potentiellement la reconnaissance de la
séquence LPXTG du substrat, nécessitant alors un mécanisme d’ouverture du couvercle afin
que la catalyse puisse se faire.
A B
Figure 51 : Conservation de la gorge de liaison au substrat. A/ Surface de SrtC-1. Les résidus du site actif
sont en rouge. La région conservée TLXT précédant la cystéine nucléophile est montré en jaune. B/
Surface de SrtA de S. aureus dans laquelle les résidus du site actif et la région TLXT ont le code couleur
cité précédemment. Le couvercle des sortases formant le pilus (en rose) est dans une position analogue au
peptide LPETG (en vert) dans la structure de SrtA, suggérant que la gorge catalytique des sortases
formant le pilus est physiquement bloquée par le couvercle.
L’ouverture du couvercle pourrait être initié par une reconnaissance initiale entre le
substrat (RrgB par exemple) et la sortase se trouvant en conformation fermée. Ainsi, seule une
interaction avec le substrat approprié conduirait à l’ouverture du couvercle et à l’activation de
l’enzyme. Ce modèle serait en accord avec celui proposé par Mandlik et ses collègues
(Mandlik et al., 2008) dans lequel ils suggèrent que pour un assemblage approprié du pilus,
deux types distincts de sortases doivent interagir séquentiellement : la (ou les) sortase(s)
97
formant le pilus et la sortase « housekeeping ». Cette dernière reconnaîtrait le lipide II en tant

que substrat et ancrerait les pili sur le peptidoglycane. Afin qu’une bonne orchestration des
étapes de polymérisation et d’attachement à la paroi soit possible, il est nécessaire que le
sortases formant le pilus ne reconnaissent pas le lipide II, ni les protéines substrats de SrtA.
Toutefois, le site actif de ce type de sortases est assez similaire à celui des sortases de classe
A, hormis la présence du couvercle recouvrant le site actif chez les sortases impliquées dans
la biogenèse du pilus. De ce fait, ce couvercle, qui pourrait seulement être ouvert par une
sous-unité piline appropriée, garantirait que le lipide II ne soit pas reconnu. Toutefois,
Lemieux et ses collègues ont montré que SrtA de S. pneumoniae n’était impliquée ni dans
l’assemblage et ni dans l’ancrage du pilus sur le peptidoglycane, laissant supposer que les
sortases de classe C du pneumocoque seraient également capables de lier les pili à la paroi
bactérienne, et donc de reconnaître le lipide II en tant que substrat. Aucune étude
additionnelle concernant le rôle de SrtA n’est encore disponible et, étant donné les
controverses existantes quant aux rôles joués par les différentes sortases du pneumocoque, il
serait intéressant de confirmer l’action de SrtA. Il faut également soulever qu’à la surface du
pneumocoque plusieurs protéines, autres que les protéines Rrg du pilus, possèdent un motif
LPXTG. Ces protéines sont destinées à être ancré sur le peptidoglycane. Une étude réalisée
par Cécile Frolet du LIM montre que 15 protéines, excluant les trois protéines Rrg, chez la
souche TIGR4 possèdent ce motif de reconnaissance des sortases. Ces protéines sont
également présentes chez la souche R6, souche qui ne possèdent pas de pili. Ceci suggère
ainsi que ces protéines sont ancrées au peptidoglycane par SrtA. Il est ainsi concevable de
penser que ces protéines LPXTG ne doivent pas être reconnu par les sortases impliquées dans
la biogenèse du pilus. La présence du couvercle sur ces dernières préviendrait ainsi la
reconnaissance de ces protéines LPXTG.
En conclusion, le couvercle jouerait un rôle important pour l’activité sortasique et ne

semblerait pas être simplement une région qui recouvre le site actif. De ce fait, le couvercle
devrait être alors présent chez d’autres sortases de classe C. Comme aucune structure de
celles-ci n’est disponible, après avoir recherché les sortases de diverses bactéries à Gram-
positif ayant été étudiées et ayant un rôle dans la formation des pili, nous avons réalisé un
alignement de séquences de ces différentes sortases afin de vérifier la présence du couvercle.
Il semble ainsi que le couvercle, et notamment les deux résidus ancrant le couvercle dans le
site actif (Asp-Trp/Phe/Tyr), soient conservés (figure 52).
98
---------------------
-------
Figure 52 : Alignement de séquences de sortases formant le pilus. Séquences de S. pneumoniae, S. agalactiae, E.

faecalis, A. naeslundii, C. diphtheriae, S. pyogenes, B. cereus, et la sortase « housekeeping » SrtA de S. aureus
(dernière ligne). Un alignement de séquences a été effectué avec la séquence de SrtC-1 Les sortases formant le
pilus possèdent un couvercle qui est absent chez les sortases non impliquées dans la biogenèse du pilus. La région
correspondant au couvercle de SrtC-1 est représentée en pointillés magenta au-dessus des séquences. Les résidus
conservés d’ancrage du couvercle (Asp - Pro/Ala - Trp/Tyr/Phe) sont sur fond magenta. Les résidus du site actif
sont montrés en vert.
99
Caractérisation de la région du site actif de SrtC-1 Résultats et Discussion
III. Caractérisation de la région du site actif de

SrtC-1
Cette étude comprend l’analyse des résidus ancrant le couvercle dans la région du site
actif d’une part et, d’autre part, l’analyse de la triade catalytique du site actif. Elle fait l’objet
d’un second papier qui est actuellement en préparation.
III.1. Étude du couvercle de SrtC-1
La résolution de la structure de SrtC-1 (et SrtC-3) a révélé que le site actif est
recouvert d’un couvercle, supposé être mobile comme l’indiquent les facteurs de température.
Dans la structure de SrtC-1, ce couvercle semble être en position fermée, ancré dans le site
actif par deux résidus : Asp-58 et Trp-60. Comme mentionné précédemment, nous pensons
que ce couvercle constitue une région importante pour la protéine en ne restreignant, d’une
part, le site actif qu’aux substrats appropriés et, d’autre part, en maintenant les résidus du site
actif dans une conformation adéquate pour la catalyse. Afin d’obtenir de plus amples
informations sur le rôle du couvercle, nous avons réalisé deux mutants dans lesquels les deux
résidus Asp58 et Trp60 sont simultanément mutés: le double mutant SrtC-1D58GW60G et le
triple mutant SrtC-1D58GW60GC193A. Nous avons décidé de faire ces mutations afin
d’abolir les interactions existantes entre le couvercle et le site actif.
III.1.1. Activité du mutant du couvercle SrtC-1D58GW60G
Nous avons testé la capacité du double mutant SrtC-1D58GW60G de polymériser

RrgB en fibre. Pour cela, comme pour les analyses in vitro précédemment citées, après une
incubation d’une nuit à 37°C de chaque sortase (SrtC-1 sauvage et le double mutant) avec
RrgB, les échantillons sont chargés sur un gel de gradient SDS. La présence de bandes de haut
poids moléculaire, indiquant la présence de fibres de RrgB, est révélée par Western Blot avec
les anticorps anti-RrgB. Lorsque RrgB est incubée en présence du double mutant, une faible
activité de polymérisation peut être détectée, comme en témoigne le nombre restreint de
bandes protéiques observées sur gel SDS (figure 53, piste 3). SrtC-1D58GW60G est donc
100
capable de catalyser la formation de fibres de RrgB mais moins efficacement que la protéine
sauvage SrtC-1.
Figure 53 : Western Blot révélé avec les anticorps anti-

RrgB. (1) RrgB monomérique. (2) RrgB + SrtC-1. (3)
RrgB + SrtC-1D58GW60G. L’échelle de poids
moléculaire est indiquée sur la gauche.
La triade catalytique (His-131, Cys-193, Arg-202) étant présente et intacte, on peut en

conclure que l’abolition des interactions entre le couvercle et le site actif entraîne une
diminution de l’activité catalytique ; le couvercle apparaît donc être important pour une
activité réactionnelle maximale. On peut supposer que, comme l’interaction entre Asp-58 et
Arg-202 n’existe plus, la conformation du résidu Arg-202 devient plus aléatoire, plus flexible
et que ce résidu n’est plus maintenu dans une position optimale vers Cys-193 pour assurer son
rôle dans la réaction catalytique. La même supposition peut être faite avec l’His-131 qui ne se
retrouve, elle aussi, plus dans une conformation idéale pour la catalyse. Ainsi, un simple
mutant, dans lequel soit Asp-58 soit Trp-60 serait muté, serait pertinent à tester. Néanmoins,
la diminution de polymérisation de RrgB observée peu être imputée à une sortase qui serait
moins stable donc moins efficace. Pour vérifier cela, des expériences de TSA ont été réalisées.
III.1.2. Stabilité thermique des mutants du couvercle SrtC-1D58GW60G

et SrtC-1D58GW60G
Afin d’explorer l’effet des mutations glycines sur la stabilité de SrtC-1, nous avons
comparé la stabilité thermique du mutant par rapport à celle du sauvage. La méthode qui a été
choisie est celle de l’analyse des variations d’intensité de fluorescence en fonction de la
température (Fluorescence Based-Thermal Shift Assay ou TSA). Cette technique permet de
mesurer la dénaturation des protéines induite par un gradient de température et de déterminer
une température de transition de dénaturation (Tm). Les résultats, présentés en figure 54,
101
montrent que le double mutant possède une Tm de 8°C plus basse que celle du sauvage (38°C
contre 46°C). La stabilité globale de la protéine est donc affectée par les deux mutations que
nous avons incorporées dans SrtC-1, pointant le fait que la chaîne latérale de Asp-58 et celle
de Trp-60 sont requises pour la stabilité de la protéine. Si nous nous référons à la structure du
site actif de SrtC-1, nous observons que Arg-202 est impliquée dans deux interactions avec
Asp-58, résidu appartenant au couvercle. Les résultats obtenus suggère donc que le mutant,
qui ne peut générer ces interactions, possède un couvercle qui tend à être ouvert et
potentiellement flexible. Si cela est vrai, cette forme de mutant pourrait être stabilisée par
l’ajout d’un substrat dans la région de son site actif.
Pour tester cette possibilité, nous avons réalisé une expérience de TSA avec le peptide
synthétique IPQTG (motif LPXTG de RrgB). Afin de favoriser l’interaction entre le peptide
et la protéine, nous avons travaillé avec le triple mutant SrtC-1D58GW60GC193A dans
lequel la cystéine catalytique est mutée : l’interaction est ainsi soupçonnée se réaliser mais
non la catalyse. La Tm du triple mutant est avant tout vérifiée et il s’avère que le triple mutant
possède la même Tm que le double mutant. Le peptide IPQTG est additionné à la solution
protéique à deux ratios molaires différents (peptide/protéine : 10/1 et 20 /1) avant l’analyse.
Comme le montre la figure 54, il y a une augmentation de la Tm lorsque le triple mutant se
trouve en présence du peptide, suggérant ainsi que ce dernier est capable d’interagir avec la
protéine et de la stabiliser. De façon intéressante, plus le rapport molaire
peptide/protéine augmente, plus la stabilisation se trouve renforcée.
A B
Figure 54 : Le mutant SrtC-1D58GW60GC193A est stabilisé par le peptide mimant le motif LPXTG de
RrgB. Etude réalisée en Thermal Shift Assay avec 2 ratios molaires de peptides IPQTG (peptide/protéine
= 10/1 et 20/1). A/ Courbes de données brutes. B/ Représentation de la dérivée première de chaque point
de la courbe de fluorescence, permettant une meilleure la détermination de la Tm.
102
La même expérience réalisée avec la protéine sauvage SrtC-1 montre aucune

amélioration de la Tm lorsque le peptide IPQTG est additionné. Le couvercle semble donc
bien se retrouver ouvert lorsque les interactions entre Asp-58 et Arg-202 sont abolies, laissant
ainsi le site actif accessible au ligand (ici le peptide IPQTG).
L’ensemble de ces données indiquent donc un double rôle pour la région du couvercle
dans les sortases formant le pilus : (1) couvrir le site actif en absence de substrat et assurer la
stabilité protéique. (2) maintenir l’Arg-202 en position optimale en direction de la Cys-193
permettant ainsi de participer à la catalyse.
III.1.3. Analyse des mutants SrtC-1_lid2 et SrtC-2_lid1
Nous avons remarqué que SrtC-2 , contrairement à SrtC-1, n’était pas capable de former
des fibres de RrgB in vitro (se reporter à la figure 32). Afin d’étudier le rôle du couvercle et
son implication dans la reconnaissance du substrat, nous avons inversé le couvercle de ces
deux sortases et étudier si elle était toujours capable de polymériser RrgB. Deux mutants ont
été ainsi construits : le mutant SrtC-1 qui possède le couvercle de SrtC-2 (appelé SrtC-1_lid2)
et le mutant SrtC-2 ayant le couvercle de SrtC-1 (appelé SrtC-2_lid1). Ces mutants ont été
testés dans leur capacité à polymériser RrgB en fibre in vitro. Contrairement à SrtC-1, le
mutant SrtC-1_lid2 ne polymérise pas RrgB. Tout comme SrtC-2, le mutant SrtC-2_lid1 est
incapable de former des fibres de RrgB. Ces résultats peuvent ainsi suggérer que le couvercle
est une zone importante pour la reconnaissance du substrat (puisque RrgB n’est plus reconnu
par SrtC-1_lid2 comme substrat) mais pas exclusivement. En effet, la surface de SrtC-1 doit
également être importante pour la reconnaissance du substrat car SrtC-2_lid1 n’est toujours
pas capable de polymériser RrgB.
Ces résultats restent néanmoins préliminaires et restent à reproduire. De plus, il serait

intéressant de comparer la stabilité des deux mutants à celle des deux sortases sauvages. En
effet, on peut penser qu’une perte de l’activité du mutant SrtC-1_lid2 est la conséquence
d’une protéine moins stable.
103
III.2. Étude du site actif de SrtC-1
Les sortases « housekeeping » catalysent l’attachement de protéines cibles à la surface

de la bactérie grâce à un mécanisme qui fait intervenir 3 résidus conservés et essentiels dans
toutes les sortases: une Cystéine, une Histidine et une Arginine. Il est ainsi question de triade
catalytique pour désigner le site actif.
Aucune information concernant un éventuel rôle de l’arginine et de l’histidine du site

actif des sortases impliquées dans la formation du pilus n’est disponible à ce jour, pouvant
ainsi émettre un doute sur la conservation ou non de ces résidus dans le mécanisme
catalytique. La résolution de la structure de SrtC-1 a révélé que His-131 et Arg-202 étaient
ancrées dans le site actif à des positions analogues à celles de His-120 et Arg-197 de SrtA de
S. aureus, résidus clé du mécanisme catalytique. Afin de vérifier si ces résidus His-131 et
Arg-202 sont importants pour l’activité de SrtC-1 (et donc la formation du pilus), deux
mutants du site actif ont été construits : SrtC-1H131D et SrtC-1R202E. Nous avons décidé de
muter l’histidine en aspartate et l’arginine en glutamate afin de modifier la charge tout en
gardant une longueur à peu près analogue de la chaîne latérale. Ces deux mutants ont été
étudiés dans leur capacité à polymériser RrgB en fibre afin de déterminer si les résidus His-
131 et Arg-202 jouent un rôle dans l’activité enzymatique de SrtC-1. Une étude de leur
stabilité thermique a été également effectuée. De plus, la structure d’un des deux mutants a pu
être obtenue par cristallographie aux rayons X.
III.2.1. Activité des mutants du site actif
Après expression et purification simultanée de SrtC-1, SrtC-1H131D, SrtC-1R202E et

RrgB, la capacité de chaque mutant à polymériser le monomère RrgB est analysée par le
même protocole qu’avec le mutant du couvercle.
Aucune bande de haut poids moléculaire, relative à une éventuelle polymérisation de
RrgB, n’est détectée lorsque RrgB est mise en présence de l’un des deux mutants SrtC-
1H131D ou SrtC-1R202E (figure 55, pistes 3 et 4). Cela suggère que les résidus His-131 et
Arg-202 jouent un rôle clé dans le processus de polymérisation du pilus. Il s’avère, par
conséquent, que SrtC-1, tout comme les sortases de classes A et B, possède bien une triade
catalytique composée de Cys-193, His-131 et Arg-202. Les résidus impliqués dans le
104
mécanisme catalytique des sortases de classe C semble donc être les mêmes que ceux des
sortases impliquées dans l’ancrage de protéines cibles sur le peptidoglycane.
RrgB monomérique
Figure 55 : Western Blot révélé avec des anticorps dirigés contre RrgB. (1) RrgB monomérique. (2)
RrgB + SrtC1. (3) RrgB + SrtC-1H131D. (4) RrgB + SrtC-1R202E. L’échelle de poids moléculaire est
montrée sur la gauche.
Si nous réalisons un alignement de séquences de plusieurs sortases de divers

organismes impliquées dans la formation de pilus, nous pouvons également observer que les
résidus Cystéine, Histidine et Arginine sont conservés, suggérant ainsi leur conservation dans
le mécanisme catalytique chez les bactéries à Gram-positif (figure 52).
III.2.2. Stabilité thermique des mutants
Afin d’étudier si les mutations que nous avons introduites engendraient des
perturbations conformationnelles, des expériences de TSA ont été initiées. Les profils de
dénaturation de SrtC-1, SrtC-1H131D et SrtC-1R202E, montrés ci-dessous, révèlent que
SrtC-1 et le mutant SrtC-1H131D possèdent une Tm d’environ 46°C alors que la Tm du mutant
SrtC-1R202E est plus faible (environ 39°C). La mutation de l’histidine en aspartate ne semble
donc pas affecter la stabilité thermique (et donc la structure globale) de la protéine alors que
la mutation de l’arginine en glutamate conduit à une déstabilisation conformationnelle de la
protéine. Le mutant SrtC-1R202E se conduit de la même façon que le double mutant SrtC-
1D58GW60 en TSA, mais non en activité puisqu’il est totalement inactif. Ces observations
105
suggèrent ainsi, que la perte d’activité du mutant SrtC-1R202E est la conséquence de la perte
du résidu catalytique Arg-202 et non de l’instabilité de la protéine.
Figure 56 : Stabilité thermique de SrtC-1 et des mutants du site actif évaluée par Thermal Shift
Assay. La dérivée première de la fluorescence permet la détermination de la Tm.
Arg-202 interagit avec Asp-58, résidu appartenant au couvercle. Il apparaît ainsi que,
au moins en absence de substrat, l’interaction entre Asp-58 et Arg-202 est essentielle pour le
couvercle et la stabilité globale de la protéine. Il est ainsi tentant de supposer que lorsqu’on
supprime ces interactions, le couvercle n’est plus maintenu dans une conformation fermée. La
conformation de la protéine ayant son couvercle ouvert serait alors moins stable, ce qui
expliquerait les observations obtenues en TSA. En outre, aucun cristal de SrtC-1R202E n’a pu
être obtenu confortant l’idée de la présence d’un couvercle trop flexible pour permettre la
cristallisation. Le mutant SrtC-1H131D, quant à lui, est cristallisé dans 0,1 M Tris pH 8,5, 0,2
M MgCl2 hexahydrate, 30 % PEG4000. Afin d’obtenir une vue du site actif au niveau
atomique, la structure de SrtC-1H131D a été déterminée à haute résolution (1,3 Å) par
cristallographie aux rayons X. Cette structure a été obtenue par remplacement moléculaire
avec la structure native. SrtC-1H131D est dotée d’un repliement similaire à celui de la
protéine native (rms deviation = 0,110 Å sur 184 atomes). L’analyse du site actif révèle que
Asp-131 interagit avec l’atome N du Trp-60 (figure 57). Le couvercle se trouve toujours dans
la même position, ce qui peut expliquer pourquoi la stabilité thermique de la protéine n’est
pas affectée.
106
Figure 57 : Structure du site actif du mutant SrtC-1His131Asp. Le résidu muté, Asp-131 interagit avec
Trp-60.
L’ensemble de ces études suggèrent donc que la formation des fibres de RrgB par
SrtC-1 requière une triade catalytique composé de His-131, Cys-193 et Arg-202.
107
Formation in vitro d’un complexe covalent entre SrtC-1 et RrgB Résultats et Discussion
IV. Formation in vitro d’un complexe covalent

entre SrtC-1 et RrgB
Il était, certes, cohérent de révéler les Westerns-Blot avec les anticorps dirigés contre
RrgB pour analyser la formation de fibres, mais il était également intéressant d’utiliser les
anticorps dirigés contre SrtC-1. Premièrement, la présence d’une seconde bande protéique
migrant aux alentours de 60 kDa est allumée avec les anticorps anti-SrtC-1 après que SrtC-1,
seule ou en présence de RrgB, soit incubée une nuit à 37°C (figure 58). Cette observation
suggère que SrtC-1 à tendance à s’oligomériser. Il est supposé que ce soit le dimère que nous
voyons sur gel étant donné que SrtC-1 monomérique migre aux alentours de 30 kDa. Il a été
montré que SrtA de S. aureus, en solution, s’oligomérise et peut se trouver sous forme
monomère, dimère, trimère ou encore quadrimère, les deux dernières formes étant largement
minoritaires (Lu et al., 2007). Il n’est donc peut-être pas si surprenant de voir SrtC-1
dimériser également. D’autre part, de façon très intéressante, une bande migrant vers 85 kDa
(indiquée par une étoile sur le gel de la figure 58) est révélée à la fois avec les anticorps anti-
SrtC-1 et anti-RrgB lorsque RrgB est incubée avec SrtC-1 à 37°C durant une nuit. Ceci
pourrait indiquer la présence d’un complexe covalent (car non dissocié par chauffage et par le
SDS) entre SrtC-1 et RrgB.
Figure 58 : A/ Western Blot révélé avec les anticorps

dirigés contre SrtC-1. (1) SrtC-1. (2) SrtC-1 + RrgB.
L'étoile révèle la bande à la fois allumé par les anticorps
anti-SrtC-1 et anti-RrgB.
Afin de confirmer cela, des analyses de masse ont été réalisées. Tout d’abord,
l’échantillon SrtC-1+RrgB, après incubation à 37°C pendant une nuit, est analysé en
spectrométrie de masse MALDI-TOF au Laboratoire de Spectrométrie de Masse des Protéines
de l’IBS. Une espèce protéique de 88,3 kDa est détectée, poids moléculaire correspondant à
un complexe 1/1 SrtC-1/RrgB (Figure 59A). Une masse correspondant à un dimère RrgB est
108
également observée, cependant, les espèces de poids moléculaires supérieurs ne sont pas
détectées en raison de leur faible concentration dans l’échantillon. Une analyse de
spectrométrie de masse en tandem couplée à une chromatographie en phase liquide (nanoLC-
MS/MS) est de plus effectué au CEA grâce à la plateforme « EDyP-Service ». Pour ce faire,
la bande supposée être le complexe SrtC-1/RrgB est découpée du gel SDS, soumis à une
digestion trypsique et les fragments générés, après avoir été séparés par chromatographie
d’exclusion de taille, sont analysés. Deux séquences qui correspondent à SrtC-1 et RrgB sont
retrouvées dans cette bande (figure 59B). La bande présente sur gel SDS, allumée à la fois par
les anticorps anti-SrtC-1 et anti-RrgB, contient donc bien un complexe covalent SrtC-1/RrgB.
Figure 59 : Etude du complexe covalent SrtC-1/RrgB par spectrométrie de masse. A/ Analyse du

mélange SrtC-1 + RrgB après un nuit d’incubation à 37°C par spectrométrie de masse MALDI. B/
Analyse par nanoLC-MS/MS de la bande sur gel correspondant au complexe SrtC-1/ RrgB. AA signifie
acide aminé.
109
En outre, ce complexe covalent peut être détecté avec le mutant SrtC-1D58GW60G

mais non avec les mutants SrtC-1H131D et SrtC-1R202E. Ces résultats indiquent que la
polymérisation de RrgB se réalise à travers la formation d’un intermédiaire acyl-enzyme dont
l’élaboration est dépendante d’une triade catalytique intacte. Le fait que le complexe SrtC-
1/RrgB peut être observé avec le mutant SrtC-1D58GW60G indique que la mutation des
résidus ancrant le couvercle ne bloque ni la reconnaissance du substrat, ni la formation d’un
intermédiaire acyl-enzyme mais affecte la procession de la réaction. En revanche, l’absence
de complexe SrtC-1/RrgB et de fibres détectées avec les mutants SrtC-1H131D et SrtC-
1R202E suggèrent que les deux résidus His-131 et Arg-202 participent à une étape
réactionnelle qui a lieu avant la formation d’un intermédiaire acyl-enzyme. Dans SrtA de S.
aureus, le résidu His est supposé jouer un rôle dans la protonation du groupe partant et le
résidu Arg stabiliserait la charge négative de l’état de transition (l’oxyanion) ; ces deux
événements facilitant ainsi la formation d’un intermédiaire acyl-enzyme (Frankel et al., 2005 ;
Frankel et al., 2007). Nos résultats paraissent donc en accord avec cela.
Il serait intéressant d’isoler ce complexe dans le but d’effectuer une étude structurale
par cristallographie aux rayons X. Dans ce cas, une incubation a large échelle de SrtC-1 avec
RrgB pourrait être faite à 37°C pendant une nuit suivie d’une gel filtration afin d’éliminer les
monomères de SrtC-1 et de RrgB. Une autre alternative pourrait être envisagée afin de bien
séparer le complexe du monomère RrgB (en effet, en gel filtration, le complexe est toujours
contaminé par du RrgB monomérique. Ainsi, la protéine SrtC-1 étiquettée pourrait être
utilisée pour réaliser l’incubation à 37°C sur la nuit avec RrgB, le mélange pourrait être
chargé ensuite sur colonne d’affinité HisTrapTMHP. Après élution, les protéines éluées
seraient chargées sur une gel filtration afin de séparer le monomère SrtC-1 du complexe SrtC-
1/RrgB. Des cribles à l’aide du robot de cristallisation disponible à l’EMBL pourraient être
ensuite effectués. L’obtention de la structure d’un tel complexe permettrait ainsi de
comprendre un peu mieux le mécanisme catalytique des sortases impliquées dans la formation
du pilus.
110
Étude structurale de RrgB Résultats et Discussion
V. Étude structurale de RrgB

Des études de cristallogenèse avec la protéine RrgB ont été initiées. Des cribles
effectués de façon manuelle ont été réalisés avec les kits Hampton. Une piste prometteuse a
été obtenue dans 0,1 M Hepes pH 7,5, 20% PEG10000 avec une concentration protéique de
10 mg/ml. Cette condition a été améliorée et des cristaux ont été obtenus dans 0,1 M Tris pH
7,5, 18% PEG12000 (figure 60).
Figure 60 : Cristaux de RrgB obtenus dans 0,1 M

Tris pH 7,5 et 18% PEG12000.
Ces cristaux poussent en un peu moins de deux mois. Après cryoprotection des
cristaux dans une solution-mère supplémentée en 20% glycérol, ceux-ci ont été refroidis dans
l’azote liquide. Un jeu de données à 3,7 Å a été enregistrés sur la ligne de lumière ID14-EH1
de l’ESRF, avec un pas d’oscillation de 0,5°, pour éviter le recouvrement des taches (figure
61). Ce jeu de données a été traité avec le groupe de programmes XDS. Les statistiques de ce
jeu sont décrites dans le tableau.
Figure 61 : Clichés de diffraction d'un cristal de RrgB native diffractant à 3.7 Å pris à 90°. Un zoom est effectué
sur la droite permettant de voir que les taches de diffraction sont assez rapprochées mais séparées les unes des
autres.
111
Après purification de RrgB en milieu sélénié, des cristaux de RrgB séléniée ont été
obtenus dans 0,1 M Tris pH 7,5, 23% PEG8000. Après une cryoprotection similaire à celle
des cristaux de RrgB native, un jeu de données a été collecté à 3 Å avec un pas d’oscillation
de 0,1°, permettant ainsi de bien séparer les taches de diffraction (figure 62).
Figure 62 : Cliché de diffraction d'un cristal de RrgB séléniée diffractant à 3 Å, pris à 90°.
Nous avons collecté un jeu de données au seuil du sélénium à la longueur d’onde

correspondant au pic. Ce jeu a été indexé et mis à l’échelle grâce au groupe de programme
XDS. Les paramètres de maille du cristal de RrgB séléniée sont différents de ceux du cristal
de RrgB natif, 12 molécules par unité asymétrique sont ainsi présentes (se reporter au
tableau). Nous avons tenté d’obtenir les phases par SAD. Malheureusement, le signal anomal
était trop pauvre pour pouvoir résoudre la structure par SAD. Nous projetons de tester
d’autres cristaux de RrgB native afin d’une part d’améliorer la résolution et, d’autre part, de
trouver des paramètres de maille similaire à ceux du cristal de RrgB séléniée. Nous
envisageons également de refaire des cristaux de RrgB séléniée afin de collecter un jeu de
données avec des paramètres de maille similaires à ceux du cristal de RrgB native, où seules 3
molécules par unité asymétrique sont présentes.
112
Collecte RrgB RrgB SeMet

native (pic)
Longueur d’onde (Å) 0,933400 0,97950
Groupe d’espace P321 P32
Paramètres de maille a=72,5 a=140,3
(Å) b=72,5 b=140,3
c=340,1 c=341,2
α=β=90° α=β=90°
γ=120° γ=120°
Résolution (Å) 3,7 3,1
Nombre de réflexions 11675/243901 276029/
uniques/totales 767713
Complétude (%) 97,3 (91,6) 90,7 (86,8)
I/σI 17,9 (8,0) 7,2 (2,8)
Rsym (%) 21,2 (51,4) 12,2 (42,0)
Tableau 4 : Statistiques du traitement des jeux de données de RrgB native et séléniée. Les valeurs entre
parenthèse sont celles de la dernière tranche de résolution.
113
Conclusion et Perspectives
Conclusions et
Perspectives
114
Quelques bactéries à Gram-positif, dont certaines souches sont virulentes pour

l’homme, ont développé des systèmes de pathogénie, les pili, qui leur permettent d’adhérer
aux cellules hôtes. Ces pili, qui sont des structures protéiques filamenteuses, sont assemblés
par des enzymes spéciales, les sortases. Chez S. pneumoniae, la présence de pili est corrélée
avec la présence d’un îlot de pathogénicité rlrA. Celui-ci se compose de trois gènes codant
pour des protéines qui structurent le pilus (RrgA, RrgB et RrgC) mais également de trois
gènes codant pour des sortases de classe C (SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3).
Rôle des sortases dans la polymérisation de RrgB.
Découvrir le ou les acteur(s) sortasique(s) formant le corps du pilus est une question
essentielle sur laquelle nous nous sommes penchés. En effet, des travaux antérieurs ont
montré que sans polymérisation de RrgB, les souches pneumococciques sont déficientes en
pili et sont, dès lors, moins adhérentes sur les cellules hôtes et moins virulentes. Ainsi, le rôle
que joue la (ou les) sortase(s) qui polymérise RrgB en fait d’elle(s) une cible attrayante pour
le développement d’inhibiteurs. C’est une approche biochimique, en travaillant avec les
protéines recombinantes, que nous avons utilisé afin de déterminer l’implication des trois
sortases, SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3, dans la polymérisation de RrgB en pilus.
De nombreux efforts ont été fournis en terme de purification de protéines et de tests
pour mettre au point le système de fabrication de fibres in vitro et démontrer ainsi le rôle de
chacune des trois sortases dans la polymérisation de RrgB. Il a été ainsi montré que SrtC-1 est
la principale sortase impliquée dans la polymérisation de RrgB en fibre bien que SrtC-3
montre également une faible activité de polymérisation. C’est la première fois que l’activité
de sortases de classe C a pu être mise en évidence d’une manière réalisée in vitro. En effet,
seules des études réalisées in vivo, sur des souches délétées de gènes de sortases, étaient
disponibles. Ainsi, disposer d’un test reproductible, facile à mettre en œuvre, peut constituer
un atout dans des essais d’inhibition d’activité sortasique. Nous avons été également capables
d’observer les fibres formées in vitro par microscopie électronique. Ceci nous a permis de
mieux caractériser les fibres et de réaliser que les « objets » formés in vitro avaient un sens :
nos fibres sont flexibles, d’un diamètre de 3,5 à 7 nm ce qui corrèle avec les mesures prises in
vivo.
Notre étude montre que SrtC-1 est la sortase principale impliquée dans la formation de
RrgB en fibres et qu’elle pourrait être ainsi une cible thérapeutique potentielle. Il est toutefois
important de noter que l’activité de formation du corps de pilus peut être réalisée
115
potentiellement par une autre sortase : dans nos travaux, nous montrons que, même en
absence de SrtC-1, la présence de pili est retrouvée à la surface pneumococcique, ce qui est
également confirmé par les travaux de LeMieux et ses collègues ainsi que de Falker et ses
collègues. De ce fait, cibler les trois sortases formant le pilus se révèlerait être plus pertinent
pour inhiber la polymérisation du pilus.
Les sortases impliquées dans la formation du pilus chez S. pneumoniae possèdent un

couvercle qui est absent chez les sortases de classes A et B.
Des essais de cristallogenèse ont été initiés avec les trois sortases et deux structures de
sortases formant le pilus, SrtC-1 et SrtC-3, ont été pour la première fois résolues. Ces
structures révèlent une organisation similaire aux sortases impliquées dans l’ancrage de
protéine au peptidoglycane. Elles possèdent effectivement un cœur en tonneau β. Un des
résultats les plus étonnants et intéressants de ces structures a été la découverte d’un couvercle
situé au-dessus de la région du site actif. Ce couvercle étant absent chez les sortases de classes
A et B, nous avons émis l’hypothèse que seules les sortases impliquées dans la formation de
pili possédaient un couvercle. La résolution d’autres structure de sortases de classe A, B, C ou
D permettraient de confirmer cela car, à l’heure actuelle, seules 2 structures de sortases de
classe A, 2 de classe B et 3 de classe C sont disponibles.
Deux « parties » peuvent être distinguées dans ce couvercle : la partie centrale,

composée de deux acides aminés (un tryptophane et un aspartate) qui viennent s’ancrer
directement dans le site actif où se localisent la triade catalytique histidine-cystéine-arginine,
puis les bords du couvercle, de part et d’autre de la partie centrale, dont les facteurs de
température indiquent une certaine flexibilité de ces zones. De cette étude, nous avons
proposé que ce couvercle n’était pas simplement une région recouvrant le site actif mais avait
probablement un rôle plus important. En effet, l’aspartate du couvercle interagit avec
l’arginine du site actif, l’orientant vers la cystéine catalytique. De plus, l’aspartate, aidé du
tryptophane, ancre le couvercle dans le site actif. D’autre part, curieusement, ce couvercle se
retrouve positionné au même endroit que le peptide LPXTG dans la structure de SrtA de S.
aureus, bloquant ainsi l’accessibilité de cette région. Nous suggérons alors que le couvercle
aurait un rôle dans le maintien des résidus catalytiques dans une position optimale pour la
catalyse mais également un rôle de prévention, empêchant tous substrats inappropriés d’être
catalysés ; seul le bon substrat serait capable de déplacer ce couvercle, de rendre ainsi
116
accessible la région du site actif, et de subir la catalyse enzymatique. En effet, la surface

bactérienne est le lieu de présence d’une quantité importante de protéines de virulence portant
le motif LPXTG et destinées à être accrochées sur le peptidoglycane par la sortase A. Il est
ainsi concevable de penser que les sortases de classe C de S. pneumoniae ne doivent pas
interagir avec ces dernières mais avec les protéines du pilus qui sont également présentes sur
la membrane bactérienne. Le couvercle pourrait alors être une « stratégie » pour éviter aux
sortases impliquées dans la formation du pilus d’être détournées de leur fonction et d’interagir
avec les protéines de virulence portant un motif LPXTG. La présence d’un couvercle couvrant
le site actif existe également chez d’autres transpeptidases. C’est le cas chez les Penicillin
Binding Proteins (PBP), enzymes intervenant dans les dernières étapes de la synthèse du
peptidoglycane. Le domaine transpeptidase des PBP reconnaît un peptide au niveau de la
cavité du site actif et catalyse la formation de ponts peptidiques. Une région, flexible, est
notamment présente à proximité du site actif et intervient dans un phénomène de
réorganisation structurale lors d’une interaction de la protéine avec un pseudo-substrat de la
réaction. En effet, cette boucle flexible maintient le site actif dans une conformation fermée
en absence de ligand (grâce à un résidu asparagine), mais s’ouvre en présence d’un pseudo-
substrat, permettant alors la formation d’un acyl-enzyme. Les PBP et les sortases étant
similaires en termes de réaction catalysée ainsi qu’en substrat reconnu, on pourrait proposer
un mécanisme commun de régulation d’accès à leur site actif : en absence de substrats (chaîne
peptidique pour les PBP et peptide LPXTG pour les sortases), la gorge catalytique est
maintenue dans une conformation fermée à travers des interactions spécifiques générées par
les résidus du couvercle. Néanmoins, lorsque le substrat devient disponible (c’est-à-dire
lorsque la biosynthèse du peptidoglycane est requise pour les PBP ou lorsque la formation de
pilus est requise pour les sortases), le couvercle s’ouvre, potentiellement à travers des
interactions avec les substrats. Ces observations supportant l’idée d’un changement
conformationnel induite par liaison au substrat devraient par conséquent être pris en compte
lors de la conception d’inhibiteurs de ces enzymes.
L’étude de la région du site actif (couvercle + triade catalytique) a pu être approfondie

grâce à l’étude de mutants de SrtC-1. Nous avons ainsi pu montrer que l’interaction entre
l’aspartate du couvercle et l’arginine du site actif était importante pour stabiliser l’enzyme. En
outre, nous avons montré que les résidus histidine et arginine du site actif sont essentiels pour
que la catalyse enzymatique puisse se faire. Des études RMN ou de modélisation moléculaire
seraient intéressantes à mener afin de confirmer la flexibilité du couvercle. Dans cette
117
perspective, une collaboration avec Emmanuel Giudice de l’Unversité de Rennes a été initiée.
Les sortases formant les pili : une cible thérapeutique potentielle ?
Nos études ainsi que les analyses de Lemieux et Falker (Lemieux et al., 2008 ; Falker et
al., 2008) montrent une redondance d’activité de nos trois sortases ce qui laisse supposer que
cibler les trois sortases, et non qu’une, serait plus judicieux. De plus, la présence d’un
couvercle recouvrant et bloquant physiquement l’accès au site actif soulève la question d’un
bon candidat pour le développement d’antibiotiques. En effet, d’après nos résultats ce
couvercle serait fermé chez les sortases en absence de substrat et s’ouvrirait lors de la
reconnaissance de celui-ci. Une molécule devrait ainsi mimer cette ouverture du couvercle
pour pouvoir accéder au site actif et inhiber l’enzyme. Une quantité importante d’essais de
cocristallisation et de trempage avec des peptides mimant le LPXTG mais aussi avec un
inhibiteur de protéase à cystéine (E64) ont été réalisés durant cette thèse afin d’obtenir une
structure de sortase complexée avec un ligand. Cependant, le site actif était toujours fermé.
Ces observations confirmeraient l’hypothèse d’un site actif inaccessible à un inhibiteur
potentiel. Toutefois, nous avons obtenu récemment une structure complexée avec la
leupeptine, inhibiteur connu de protéases à cystéine. Cette molécule, plus petite que les
peptides, est donc capable de « s’engouffrer » dans le site actif, sans déplacer le couvercle.
Ces résultats indiqueraient finalement qu’une petite molécule synthétique pourrait inhiber
l’activité sortasique et que le développement d’antibiotiques dirigés contre les sortases serait
potentiellement une piste à creuser. Il faut néanmoins noter que, même si les pili ont été
montrés comme des facteurs de virulence chez le pneumocoque, ils ne se sont présents que
chez 30% des souches. Cibler les sortases viendrait donc en complément de médicaments
dirigés contre d’autres facteurs de virulence.
Protéine RrgB et complexe SrtC-1/RrgB, vers une structure ?
Des nombreux essais ont été menés dans l’optique de résoudre la structure de RrgB, tant
en termes de criblage et optimisation de conditions de cristallisations, qu’en terme de collecte
de jeux de données. En effet, les cristaux de RrgB diffractent assez mal et il est difficile de
trouver un cristal diffractant à une résolution correcte. D’autre part, du fait de paramètres de
maille assez grand, une collecte avec un pas d’oscillation de maximum 0,5° doit se faire,
demandant ainsi un temps de collecte conséquent. Néanmoins, deux jeux (un natif et un
118
sélénié à 3.7 Å et 3 Å respectivement) ont été enregistrés mais ne permettent encore pas de
résoudre la structure. La recherche de cristaux diffractant à une meilleure résolution se
poursuit. RrgB étant facilement protéolysée et instable dans le temps, il serait aussi intéressant
de faire une protéolyse ménagée de RrgB afin d’isoler une partie stable de la protéine, propice
à une meilleure cristallisation. Obtenir la structure de RrgB permettrait ainsi de mieux
comprendre l’arrangement du pilus si tenté est que l’empilement cristallin mime la fibre.
De récentes études ont montré que la polymérisation du pilus se réalise à travers la
formation d’un intermédiaire acyl-enzyme entre la piline et la sortase confortant ainsi nos
travaux préliminaires sur le complexe SrtC-1/RrgB. Des études structurales sur un tel
complexe seraient intéressantes à poursuivre. Obtenir sa structure tridimensionnelle
permettrait effectivement, d’une part, de soulever des doutes concernant le mécanisme
catalytique des sortases et, d’autre part, d’observer le comportement de ce fameux couvercle.
Vers encore une meilleure compréhension de la biogenèse des pili ?
La technique originale de formation de fibres in vitro que nous avons développée au

laboratoire pourrait être appliquée à l’étude du pili dans son ensemble. En effet, pour le
moment, aucun modèle sur l’assemblage des pili pneumococciques a été suggéré. En
particulier, le mécanisme d’ancrage des pilines mineures RrgA et RrgC n’a pas été élucidé
ainsi que le mécanisme d’ancrage du pilus sur le peptidoglycane. De même, l’implication des
trois sortases dans l’assemblage en entier du pilus est encore mal analysée. Nous pourrions,
par exemple, analyser l’ancrage des fibres de RrgB sur le lipide II afin de nous donner une
idée des sortases (SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3 ou SrtA) impliquées dans l’attachement du pilus sur
le peptidoglycane. De plus, il serait intéressant de réussir à greffer RrgA et/ou RrgC sur les
fibres de RrgB par le biais des sortases : d’une part cela permettrait d’analyser le ou les
sortases responsables de l’attachement des protéines mineures sur le pilus et d’autre part, en
fonction des mélanges réalisés, regarder si il serait possible de mettre en évidence une
chronologie d’assemblage.
Les mécanismes de formation des pilus chez les bactéries à Gram-positif n’en sont
qu’à leur début. De réels progrès ont d’or et déjà été réalisés, mais tout n’est pas encore
expliqué. De nombreux travaux sont encore nécessaires avant l’élaboration d’un traitement
efficace dirigé contre les pili. Cette course à l’armement initiée entre l’homme et la bactérie
pousse la communauté scientifique à faire preuve d’ingéniosité dans la compréhension de la
biogenèse de ces organelles.
119
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131
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aureus and Bacillus anthracis reveal catalytic amino acid triad in the active site. Structure 12,
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sortase B, a cysteine transpeptidase that tethers surface protein to the Staphylococcus aureus
cell wall. Structure 12, 105-112.
132
Annexes
Annexes
133
Annexes
Annexe A
Mutants de SrtC-1
Mutations Séquences des amorces 5’→ 3’
C193A GACCTTGCTGACTGCTACGCCATACATG
CATGTATGGCGTAGCAGTCAGCAAGGTC
H131D GGTGATTACGGCAGATACAGGTTTGCC
GGCAAACCTGTATCTGCCGTATCACC
R202E GATCAATACCCATGAGCTATTGGTTCGGGG
CCCCGAACCAATAGCTCATGGGTATTGATC
D58GW60G AATGTAGTGAGTGGCGGTCCTGGGTCGGAAGAAATGAAG
CTTCATTTCTTCCGACCCAGGACCGCCACTCACTACATT
Tableau 5 : Amorces nucléotidiques utilisées pour réaliser les mutants de SrtC-1. Les bases soulignées sont
celles qui sont mutées.
Figure 52 : Cycles de PCR effectués pour construire les mutants de SrtC-1 et RrgB.
134
Annexes
Mutant SrtC-1 avec le couvercle de SrtC-2

SrtC-1_lid2 GGCTCAAGCCTTCAATGCGACCTTGAATAATGTAGTGAGTGGCGATCCTTG
GAATTTCCACATAGCCAATCCGCTCATGGATTTCTAACATACGTGCATACTCTGC
Mutant SrtC-2 avec le couvercle de SrtC-1

SrtC-2_lid1 GGCACAAGCCTTCAATGACTCTTTGAAACCATCTGAAATTCTTGATCCTTTTAC
GATTTCCACATGCCCCATCCGCTCATGGACCTTTAGCATATTGGCATATTCTG
Tableau 6 : Amorces nucléotidiques utilisées pour construire les mutants SrtC-1_lid2 et SrtC-2_lid1. Ce
qui est écrit et surligné en rose correspond à SrtC-2 alors que ce qui est écrit et surligné en cyan
correspond à SrtC-1
A B
Figure 53 : Cycles de PCR effectués pour construire les mutant SrtC-1_lid2 et SrtC-2_lid1. A/
Première PCR réalisée pour générer la région génomique correspondant aux couvercles de SrtC-1
et SrtC-2. B/ Seconde PCR effectuée pour construire les deux mutants.
135
Annexes
Annexe B
Milieu de culture minimum M9 (1L)
Milieu minimum
750 mL H2O stérile
200 mL tampon sels 5x
2 mL MgSO4 1 M
10 mL glucose 20 %
0.1 mL CaCl2 1 M
2 mL thiamine 10 %
qsp 1 L H2O
Tampon sels 5x (500 mL)

15 g Na2HPO4 anhydre
7.5 g KH2PO4
2.5 g NH4Cl
1.25 g NaCl
qsp 500 mL H2O
136
Publications
Publications
137
Publications
Les travaux décrits dans ce manuscrit ont fait l’objet de deux publications :
Sortase-mediated pilus fiber biogenesis in Streptococcus pneumoniae. Manzano C.,

Contreras-Martel C., El Mortaji L., Izoré T., Fenel D., Vernet T., Schoehn G., Di Guilmi
A.M., Dessen A. (2008) Structure 16(12):1838-48.
Sortase activity is controlled by a flexible lid in the pilus biogenesis mechanism of Gram-
positive pathogens. Manzano C., Di Guilmi A.M., Dessen A. (Soumis).
Un article additionnel a été également accepté dans J. Mol. Biol. avec la

collaboration de Birgitta Henriques-Normark (Karolinska Institutet, Sweden) :
The crystal structure of Streptococcus pneumoniae Sortase C provides novel insights into
catalysis as well as pilin substrate specificity. Neiers F., Madhurantakam C., Fälker S.,
Manzano C., Dessen A., Normark S., Henriques-Normark B., Achour A.
Un autre article, référant au travail de Thierry Izoré, Master II que j’ai encadré et
concernant la protéine RrgA, a été soumis.
138
Structure
Article
Sortase-Mediated Pilus Fiber Biogenesis

in Streptococcus pneumoniae
Clothilde Manzano,1 Carlos Contreras-Martel,1 Lamya El Mortaji,2 Thierry Izoré,1 Daphna Fenel,3 Thierry Vernet,2
Guy Schoehn,4 Anne Marie Di Guilmi,2,* and Andréa Dessen1,*
1Laboratoire des Protéines Membranaires
2Laboratoire d’Ingénierie des Macromolécules
3Laboratoire de Microscopie Electronique et Structurale
Institut de Biologie Structurale Jean-Pierre Ebel, UMR 5075 (CEA, CNRS, UJF, PSB), 41 rue Jules Horowitz, F-38027 Grenoble, France
4Unit for Virus Host Cell Interactions, UMR5233 UJF-EMBL-CNRS, CIBB, 6 rue Jules Horowitz, BP181, 38042 Grenoble Cedex 9, France
*Correspondence: [email protected] (A.M.D.G.), [email protected] (A.D.)

DOI 10.1016/j.str.2008.10.007
SUMMARY in adhesion, biofilm formation, competence for DNA transforma-

tion, and motility, and are thus key elements of a bacterium’s
Streptococcus pneumoniae is a piliated pathogen pathogenicity arsenal (Burrows, 2005; Manetti et al., 2007; Mat-
whose ability to circumvent vaccination and antibi- tick, 2002). Pili expressed by Gram-negative pathogens have
otic treatment strategies is a cause of mortality been the targets of multiple studies that have revealed that these
worldwide. Pili play important roles in pneumococcal filaments are composed of non-covalently associated subunits;
infection, but little is known about their biogenesis coordination of subunit association involves, in many cases,
strand exchange mechanisms orchestrated by periplasmic
mechanism or the relationship between components
chaperones (Sauer et al., 2002; Vetsch et al., 2004). The pilus for-
of the pilus-forming machinery, which includes the fi-
mation process in Gram-positive bacteria, however, is still poorly
ber pilin (RrgB), two minor pilins (RrgA, RrgC), and understood. It is widely accepted that in pathogens such as Co-
three sortases (SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3). Here we rynebacterium diphtheriae, the causative agent of diphtheria,
show that SrtC-1 is the main pilus-polymerizing Streptococcus pyogenes, which causes toxic shock syndrome,
transpeptidase, and electron microscopy analyses and S. pneumoniae, pili are formed through the covalent associ-
of RrgB fibers reconstituted in vitro reveal that they ation of subunits by sortases that are encoded within pilus-
structurally mimic the pneumococcal pilus back- specific pathogenicity islands (Budzik et al., 2008; LeMieux
bone. Crystal structures of both SrtC-1 and SrtC-3 et al., 2006; Mandlik et al., 2008; Mora et al., 2005; Ton-That
reveal active sites whose access is controlled by et al., 2004; Ton-That and Schneewind, 2003). Notably, sortases
flexible lids, unlike in non-pilus sortases, and suggest are membrane-associated transpeptidases that play roles in
functions ranging from iron acquisition to sporulation (Marraffini
that substrate specificity is dictated by surface rec-
and Schneewind, 2006; Mazmanian et al., 2003). The quintes-
ognition coupled to lid opening. The distinct struc- sential, best-studied sortase, SrtA, catalyzes the covalent at-
tural features of pilus-forming sortases suggest tachment of surface-exposed proteins, such as virulence fac-
a common pilus biogenesis mechanism that could tors, to the Staphylococcus aureus peptidoglycan (Schneewind
be exploited for the development of broad-spectrum et al., 1992). Its catalytic mechanism involves recognition of an
antibacterials. LPXTG-like motif on the target protein followed by nucleophilic
attack of the Thr-Gly covalent bond by a catalytic Cys residue.
INTRODUCTION The ensuing acyl-enzyme intermediate can only be resolved by
attack from a free 3-amino group from the secondary substrate
Streptococcus pneumoniae, the causative agent of pneumonia, that, in the case of SrtA, is the bridging residue of the stem pep-
bacteremia, otitis, and meningitis, is a major cause of commu- tide of the peptidoglycan (Marraffini et al., 2006; Ton-That et al.,
nity-acquired illnesses, especially in the very young and the el- 2002). Pilus formation, however, requires dedicated sortases,
derly, and causes over 1.6 million deaths worldwide each year and the precise roles these molecules play in the pilus biogene-
(Levine et al., 2006). The spread of antibiotic-resistant strains sis process are still poorly understood. It is of interest that the
(Bronzwaer et al., 2002), coupled to the limited efficiency and/ recent structure of the pilus-forming subunit of S. pyogenes re-
or the restricted strain coverage of currently commercialized vealed that intramolecular isopeptide bonds are used to stabilize
vaccines (Bogaert et al., 2004; Spratt and Greenwood, 2000), un- the pilus building block, with one bond located in the vicinity of
derline the need for the study of novel therapeutic targets for the sortase recognition site (Kang et al., 2007), although the pre-
pneumococcal infection. cise role played by this specific arrangement in the pilus-forming
Secreted virulence factors and extracellular appendages are process is still unclear.
not only key factors in the initiation of bacterial infection, but In S. pneumoniae the entire macromolecular machinery re-
also noteworthy vaccine antigens (Gianfaldoni et al., 2007; sponsible for pilus formation is encoded on a mobile pathogenic-
Maione et al., 2005; Mora et al., 2005). Pili, hair-like, elongated ity islet (rlrA). Strains that lack the rlrA islet display less adherence
fibers associated to the bacterial cell wall, play important roles to lung epithelial cells and are less virulent in murine models of
1838 Structure 16, 1838–1848, December 10, 2008 ª2008 Elsevier Ltd All rights reserved
Structure
Sortase-Catalyzed Pilus Fiber Formation
pneumonia and bacteremia, revealing that the pilus plays an im- rrgC), as well as three sortases (SP0466, SP0467, SP0468,
portant role in infection (Barocchi et al., 2006; Hava and Camilli, whose protein products are SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3) (Barocchi
2002). The rlrA islet harbors seven genes, three of which encode et al., 2006; Hava and Camilli, 2002; LeMieux et al., 2008). To ini-
structural proteins (RrgA, RrgB, and RrgC) and three of which en- tiate our study of the pilus fiber formation process, we expressed
code sortases (SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3). Transmission electron the soluble forms of SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3, and RrgB from the
microscopy images of infectious S. pneumoniae strains have re- highly infectious S. pneumoniae serotype strain T4 (TIGR4) and
vealed that the pilus shaft is composed of a RrgB polymer, with tested the ability of each sortase to polymerize RrgB monomers.
the minor pilins RrgA and RrgC associated to it in patches (Hill- The presence of pili on the pneumococcal surface is character-
eringmann et al., 2008; LeMieux et al., 2006); in the case of ized by a pattern of high-molecular-weight bands on sodium do-
RrgA, association has also been shown directly onto the cell decyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
wall (Barocchi et al., 2006). All six proteins are potentially linked upon analysis of surface preparations, which provide evidence
to the cell membrane through a single, predicted transmem- of the covalent nature of the RrgB pilus backbone (Barocchi
brane (TM) region. Notably, the three structural proteins carry et al., 2006; Hilleringmann et al., 2008). Hence, the ability to
an LPXTG-like motif immediately upstream of the TM region, form RrgB fibers in vitro was tested by searching for a pattern
which potentially enables them to be acted upon by the dedi- of high-molecular-weight bands on gradient SDS-PAGE upon
cated sortases. In addition, RrgB also displays a conserved incubation of RrgB monomers at 37 C with SrtC-1, SrtC-2, or
Lys residue within a ‘‘pilin’’ motif that is present within most SrtC-3. A ladder of bands with molecular weights above
pilus-forming subunits from Gram-positive organisms. Thus, 100 kDa, which was recognized by antibodies raised against
RrgB polymerization could proceed via a mechanism in which RrgB, could be generated when monomeric RrgB was incubated
the LPXTG-like motif serves as a donor substrate, whereas with SrtC-1 (Figure 1A, lane 2). In light of the fact that sortases
a conserved Lys residue within a ‘‘pilin’’ motif potentially acts catalyze transpeptidation reactions by employing a Cys nucleo-
as the acceptor during a sortase-catalyzed transpeptidation re- phile, we mutated the unique Cys residue within SrtC-1, Cys 193,
action, in a process that would ensure stepwise, covalent incor- into Ala, and tested this mutant protein for its ability to generate
poration of RrgB subunits into the growing fiber (Marraffini et al., the RrgB high-molecular-weight ladder. Upon incubation with
2006; Scott and Zahner, 2006; Telford et al., 2006). Participation SrtC-1-Cys193Ala, RrgB remained monomeric, and no higher-
of the 3-amino group of a conserved lysine residue in a nucleo- molecular-weight bands could be detected (Figure 1A, lane 5),
philic pilus-forming reaction has now been shown for Bacillus ce- pointing to the fact that in vitro RrgB polymerization is a product
reus (Budzik et al., 2008) and Corynebacterium diphtheriae of SrtC-1-related activity.
(Mandlik et al., 2008), suggesting that this might be a conserved No evidence of RrgB polymerization could be identified upon
mechanism in Gram-positive bacteria. incubation of RrgB with SrtC-2 (Figure 1A, lane 3); however, in
The equal number of structural and sortase-encoding genes in the presence of SrtC-3, two faint bands could be reproducibly
pneumococci has prompted the ‘‘one protein, one sortase’’ detected in the vicinity of the 117 kDa marker (Figure 1A,
proposition (Hilleringmann et al., 2008; LeMieux et al., 2006), in lane 4, indicated with stars), suggesting that SrtC-3 can catalyze
which one sortase protein would be responsible for the polymer- the formation of higher-molecular-weight forms of RrgB, albeit
ization of the RrgB fiber, whereas the two others could play roles much less efficiently than SrtC-1. These results suggest that al-
in associating RrgA and RrgC (to RrgB and potentially to each though SrtC-1 is the most efficient transpeptidase in the RrgB
other). In this work, we show that SrtC-1 is the main fiber-forming polymerization process, SrtC-3 also displays a modest capabil-
transpeptidase, and SrtC-3 has a modest capability of forming ity to form polymerized forms of RrgB.
RrgB oligomers. Purified RrgB fibers produced in vitro by SrtC-1 To confirm these results, we deleted the gene encoding SrtC-1
activity are structural mimics of the pneumococcal pilus back- (SP0466) from the rlrA islet in strain TIGR4. Total extracts of mu-
bone. In addition, the high-resolution crystal structures of the tant TIGR4 as well as of the wild-type strain were treated with
two sortases that display in vitro reactivity toward RrgB, SrtC-1 mutanolysin, loaded onto gradient polyacrylamide gels, and im-
and SrtC-3, reveal substrate-recognition regions that are cov- munoblotted with antibodies specific for RrgB (Figure 1A, lanes
ered by a lid that maintains the active sites in closed conforma- 6–9). Wild-type TIGR4 presented high-molecular-weight bands
tion, suggesting that pilus formation is regulated by a mechanism characteristic of the presence of a polymerized pilus (Figure 1A,
that involves activation of sortase-mediated catalysis. The iden- lanes 6 and 7), whereas the SP0466 deletion mutant presented
tification of sequences corresponding to lid regions in sortases a smaller quantity of fully polymerized pilus that was concomitant
from a variety of piliated Gram-positive bacteria, as well as the with an increase in monomeric RrgB. These results confirm that
important role played by pili in infection, suggest that pilus- SrtC-1 plays a key role in the pilus polymerization process, and
forming sortases could represent tractable targets for antibiotic that its absence can be partly compensated by a ‘‘background’’
development for a wide spectrum of bacterial pathogens. polymerization activity of other sortases.
RESULTS In Vitro Reconstitution of the Pneumococcal Pilus

Backbone
RrgB Fiber Can Be Assembled In Vitro To obtain structural insight into the RrgB fibers prepared in vitro,
by a Pilus-Polymerizing Transpeptidase we performed a large-scale incubation of SrtC-1 and RrgB and
The pneumococcal rlrA pathogenicity islet encodes all of the gel filtered the mix. The RrgB fiber eluted early in the gel-filtration
genes required for formation of the pilus-forming machinery, experiment, whereas SrtC-1 and unpolymerized RrgB both
namely backbone fiber (rrgB) and ancillary proteins (rrgA, eluted in volumes indicative of monomers (see Figure S1
Structure 16, 1838–1848, December 10, 2008 ª2008 Elsevier Ltd All rights reserved 1839
Structure
available online). The high-molecular-weight sample (Figure 1,

lane 10) was submitted to mass spectrometry (LCMS/MS) ex-
perimentation, which confirmed that the bands consisted of
RrgB (Table S1); subsequently, it was analyzed by negative
staining electron microscopy with a Philips CM12 microscope
employing 2% sodium silicotungstate at pH 7.5. Electron micro-
graphs show populations of fibers (Figure 1B, panel a) with
roughly two distinct diameters: the most prevalent types resem-
ble ‘‘beads on a string’’ and have diameters in the range of
3.5 nm, whereas the less common types of fibers have diameters
of approximately 7.0 nm, thus being potentially representative of
lateral associations of the thinner filaments (compare panels
d and g in Figure 1B). Assuming that 1 image pixel = 1.17 Å,
we estimate that the longest fibers have an approximate molec-
ular weight of 480 kDa, whereas the shortest, of 140 kDa (see Ex-
perimental Procedures for precise calculations). In addition, sev-
eral fibers display a ‘‘kink’’ (Figure 1B panels c, g, h, and i), giving
evidence of flexibility. Notably, electron microscopy analyses of
pili on the surface of S. pneumoniae have shown them to be flex-
ible structures formed by 3.5-nm-thick protofilaments that inter-
sect laterally to form pili with diameters of 6.8 nm or, in areas of
more relaxed intersection, 9.5 nm (Hilleringmann et al., 2008).
Our observations suggest that the fibers formed in vitro through
the covalent association of RrgB monomers by SrtC-1 are struc-
tural mimics of the 3.5 nm and 6.8 nm filaments formed on the
pneumococcal surface.
A Closed Substrate-Recognition Channel

within Pilus-Forming Sortases
To gain insight into the catalytic aspects of the pilus-forming ma-
chinery at an atomic level, we crystallized and solved the high-
resolution structures of SrtC-1 and SrtC-3. Both enzymes elute
in volumes indicative of monomers in gel filtration, but crystallize
as dimers in the asymmetric unit of a P212121 (SrtC-1) or P23
(SrtC-3) cell. The structure of SrtC-1 was solved by performing
a 4 wavelength MAD experiment on a selenomethionylated
SrtC-1 crystal at the ESRF synchrotron in Grenoble; this model
was subsequently used to phase native data to 1.24 Å. SrtC-3
data were collected to 2.2 Å on an in-house X-ray generator and
the structure was solved by employing the refined structure of
SrtC-1 (with modifications; see Experimental Procedure) as a
search model in a molecular replacement experiment. Data col-
lection and refinement statistics can be found in Tables 1 and 2.
SrtC-1 (residues 21–214; Figure 2A) is composed of eight
central, mostly anti-parallel b-strands that associate to form
a b barrel that is surrounded by three major a helices and three
310 helices. Helices a1, a2, and a3 form the roof of the SrtC-1
b-barrel, with the region that includes a3 forming a ‘‘lid’’ that
covers the active site (pink in Figures 2A and 2C). SrtC-3 (resi-
dues 39–241; Figures 2B and 2C), despite sharing 26.4% se-
quence identity with SrtC-1, displays a very similar fold to the
latter enzyme (rms deviation of 1.3 Å over 138 Ca atoms), with
Figure 1. SrtC-1 Is a Pilus-Polymerizing Transpeptidase
(A) Western blots using polyacrylamide gradient gels developed with RrgB
antiserum. Lanes: (1), monomeric RrgB; (2), RrgB + SrtC-1; (3), RrgB + SrtC- fragments. (10) Gel-filtered sample analyzed by electron microscopy and
2; (4), RrgB + SrtC-3; (5) RrgB + SrtC-1Cys193Ala; (6) total extract from muta- LCMS/MS.
nolysed TIGR4; (7) supernatant from mutanolysed TIGR4; (8) total extract (B) Top, negative staining electron microscopy images of the RrgB fibers gen-
from mutanolysed TIGR4DSP0466; (9) supernatant from mutanolysed erated by SrtC-1 activity. Black arrows point to fibers whose diameters are in
TIGR4DSP0466. Mutanolysed samples display pili that harbor not only poly- the range of 3.5 nm or 7.0 nm. Bottom, a gallery of typical fibers seen on grids.
merized RrgB, but also associated RrgA and RrgC, as well as peptidoglycan Scale bar, 20 3 5 nm.
Structure
Table 1. Data Collection and Phasing Statistics for SrtC-1 and SrtC-3
Data Collection
Data set Peak Inflection Point High Remote Low Remote SrtC-1 Native SrtC-3 Native
Wavelength (Å) 0.98055 0.980750 0.982450 0.978550 0.93100 1.5418
Space Group P212121 P212121 P212121 P212121 P212121 P23
a (Å) 68.286 68.619 68.757 68.662 68.091 122.638
b (Å) 70.070 70.366 70.469 70.337 70.189 122.638
c (Å) 86.187 86.647 86.807 86.673 86.542 122.638
Resolution (Å) 1.73 (1.831.73) 1.86 (1.981.86) 1.86 (1.981.86) 1.86 (1.981.86) 1.24 (1.321.24) 2.14 (2.272.14)
No. obs/unique ref. 297168/80448 240375/65317 240388/65393 236792/64343 1493780/114617 205227/30999
Completeness (%) 96.3 (88.0) 96.7 (89.3) 95.6 (84.8) 95.1 (83.5) 98.3 (93.9) 90.7 (75.8)
Rsym (last shell) 5.9 (37.4) 5.7 (44.6) 6.1 (63.6) 7.5 (83.4) 4.7 (50.7) 10.0 (51.0)
I/s(I) (last shell) 13.4 (3.6) 13.7 (3.2) 12.1 (2.3) 10.1 (1.8) 33.5 (5.1) 15.3 (4.4)
SrtC-1 Phasing
SHARP FOM 0.43849/0.14854 0.43849/0.14854 0.43849/0.14854 0.43849/0.14854
(acentric/centric)
Phasing power ISO 0.253/0.208 0.844/0.879 0.170/0.160
(acentric/centric)
Phasing power ANO 1.807 1.110 0.102 0.643
the major difference being the presence of an additional a-helix forming sortases related here is absent from all other sortases
at the C terminus of SrtC-3. SrtC-3 also displays a ‘‘lid’’ over the whose structures have been solved to date (Figure S3). In addi-
active site region; however, in both SrtC-1 and SrtC-3, the lid re- tion, biochemical studies performed on SrtA from S. aureus
gions display the highest temperature factors in the structures, have revealed that its b6/b7 loop is a potential substrate spec-
suggesting that they could be flexible or mobile elements. Anal- ificity determinant (Bentley et al., 2007), and it is affected by the
ysis of the SrtC-3 structure reveals that residues 68–71 and 78– presence of Ca2+ (Naik et al., 2006). Although the specificity of
82, located on the SrtC-3 lid, display B-factors of 47.4 Å2 and the b6/b7 region of SrtC-1/SrtC-3 was not studied here, we did
44.8 Å2, respectively; these values are higher than for those of not observe any effect of Ca2+ on RrgB fiber-forming activity
the intervening region (residues 73–76, B-factor = 20.2 Å2) as (not shown).
well as for the overall structure B-factor (23.8 Å2; Figure S2). All sortases recognize the LPXTG motif of a target protein,
These observations suggest these residues could play the roles employ their catalytic cysteine in the nucleophilic attack of the
of hinges in a potential lid opening mechanism (see below). The Thr-Gly peptidic bond, and subsequently catalyze a transpepti-
central section of SrtC-1 and SrtC-3, which encompasses the dation reaction by employing the free amino group from an ac-
b-barrel, is reminiscent of that seen in the structure of sortases ceptor substrate (Ton-That et al., 2002; Zong et al., 2004a). The
involved in association of proteins to the peptidoglycan (SrtA) or SrtC-1 active site includes a Cys-His-Arg triad that has been im-
iron-heme transport (Ilangovan et al., 2001; Zhang et al., 2004). plicated in catalysis in other surface-attachment sortases: Cys
However, the arrangement of a helices in the surrounding re- 193, at the C terminus of b7; Arg 202, at the N-terminus of b8;
gions is distinct, and the lid seen in the structures of the pilus- and His 131, within the loop that follows b4 (Figure 3A). The
side chain of Cys 193 is present in two conformations (in both
monomers of the asymmetric unit) and was modeled with 0.5
Table 2. Refinement Statistics for SrtC-1 and SrtC-3
occupancy in each case. In one of the conformations, it points
Refinement SrtC-1 SrtC-3
away from the center of the active site and makes a unique,
Resolution (Å) 1.24 2.14 3.1 Å hydrogen bond with the Od1 atom of Asn 199, itself lo-
Rwork (%) 17.31 18.05 cated on the loop between b7 and b8. In the second conforma-
Rfree (%) 19.31 24.14 tion, the Sg moiety of Cys 193 points directly into the active site,
No. of protein atoms 3076 3340 and makes a weak 3.4 Å hydrogen bond with the NH1 atom of
No. of solvent atoms 471 505 Arg 202. Notably, as is the case for other sortases whose struc-
tures have been solved to date (Ilangovan et al., 2001; Zhang
No. of glycerol molecule 1 0
et al., 2004; Zong et al., 2004b), the nucleophilic cysteine does
RMS deviation, 0.007 0.028
not interact directly with His 131 (the closest distance is 5.4 Å).
bond lengths (Å)
However, it is of note that the lid contributes two residues that
RMS deviation, 1.250 2.296
are anchored within the active site: Asp 58 and Trp 60. Asp 58
bond angles ( )
guarantees that the Arg 202 faces the Cys nucleophile by inter-
Mean B-factor (Å2) 16.66 37.70
acting with both NH2 and N3 atoms, whereas Trp 60, in addition
Res. most favored/allowed 100 100 to considerably increasing the hydrophobic nature of the cleft,
regions of Ramachandran (%)
interacts with the Nd1 moiety of His 131 through its N31 atom.
Structure
Figure 2. Sortases of the Pilus-Formation Machinery Display Similar Folds

(A and B) SrtC-1 (A) and SrtC-3 (B) fold into b-barrels surrounded by helices; their active sites, centered on the region surrounding the C terminus of b7 and the N
terminus of b8, are covered by a lid (shown in pink).
(C) Structure-based sequence alignment of the three pilus-forming sortases of S. pneumoniae. Identical residues are shown with a red background, whereas
similar residues are shown in red and highlighted with blue boxes. Residues located within the active site cleft of SrtC-1/SrtC-3 are highlighted in green, whereas
the Asn residue on b7/b8 that contacts the nucleophilic Cys in SrtC-1 is shown with an orange background. The lid region is shown in magenta. The TM (trans-
membrane) region was predicted with the SMART server (www.smart.embl-heidelberg.de).
The active site of SrtC-3 shows clear similarities with that of points within the active site, toward Arg 215 (Figure 3B). This
SrtC-1; Cys 206, Arg 215, and His 144 occupy analogous posi- difference could be caused by the fact that Asn 199 of SrtC-1
tions to their counterparts in SrtC-1. In this case, however, a sin- is has been substituted by a Phe side chain in SrtC-3, and thus
gle conformation of the Cys 206 side chain was detected, and it the Cys-Asn polar interaction observed in SrtC-1 is not possible
Structure
here. In addition, the SrtC-3 lid gives evidence of being more have approximately the same diameters as the single-coiled
flexible than that of SrtC-1, with only the region encompassing (3.5 nm) or double-coiled coil (6.8 nm) protofilaments identified
the anchor residues being clearly traceable in the electron den- and measured on the surface of pneumococci (Hilleringmann
sity map. These residues include Asp 73, which, as is the case et al., 2008). Nevertheless, the assemblies produced in vitro (av-
in SrtC-1, interacts directly with Arg 215, and Phe 75, which erage length 35 nm) are shorter than the longest pili yet visual-
points snugly into the pocket and guarantees its hydrophobic ized in vivo, which have been reported as having lengths of up
nature (much like Trp 60 in SrtC-1). It is of note that in both struc- to 1 mm (Hilleringmann et al., 2008). It is of interest, however,
tures, the Asp residue located at the edge of the lid locks the Arg that surface-associated pili are often heterogeneous in length,
side chain in place, positioning it in close proximity to the nucle- with short forms also being visible in several instances (Barocchi
ophilic Cys. Interestingly, the structures of surface-attachment et al., 2006; Hilleringmann et al., 2008; Nallapareddy et al., 2006;
sortases have revealed active sites that are not covered by lids Rosini et al., 2006; Weerkamp et al., 1986). It is thus possible
and are much more solvent-exposed than those observed here that the structures isolated and visualized in this work could rep-
(Figure 3C). In addition, these exposed active clefts display cat- resent the minimal building blocks of the pilus fiber. However, it
alytic residues whose side-chain positions are not constrained; is also possible that the RrgB fibers formed in vitro are shorter
in SrtA from S. aureus, even in the presence of substrate, the than their wild-type counterparts because SrtC-1 polymerizes
side chain of the catalytic Arg residue points away from the RrgB inefficiently (as shown by the finite number of high-molec-
nucleophilic Cys (Zong et al., 2004a). This observation underlines ular-weight bands on Figure 1A, lane 2). This could indicate that
the possibility that the role of the interaction between the cata- efficient fiber formation requires the concomitant participation
lytic Arg and the Asp side chain located on the SrtC-1/SrtC-3 of other members of the pilus-forming machinery, such as the
lid is not only to ‘‘lock’’ the lid in place in the absence of sub- other sortases. However, when this possibility was tested
strate, but also to guarantee that the Arg side chain will be appro- in vitro by incubation of RrgB with SrtC-1, SrtC-2, and SrtC-3
priately positioned, potentially for oxyanion transition state stabi- in different combinations, the pattern of formed fibers was iden-
lization (Frankel et al., 2007), once the lid is removed and tical to that observed with SrtC-1 only (not shown). It is thus con-
substrate is bound. Thus, pilus-forming sortases present tightly ceivable that, in vivo, fiber formation is a well-orchestrated event
knit active sites whose access is restricted by the presence of that requires that the entire pilus-forming macromolecular ma-
a potentially flexible lid, and whose residues are pre-positioned chinery be associated to the bacterial outer membrane in order
for catalysis. to optimize partner recognition events and catalysis, an organi-
zation that cannot easily be emulated in vitro.
DISCUSSION Our results also reflect the potential requirement that SrtC-1
be maintained in an ‘‘activated’’ state through the entire fiber-
Although pili have been identified on the surface of approxi- formation process. Evidence for this possibility comes from the
mately 30% of the strains of the major human pathogen S. pneu- mapping of conserved/identical residues between sortases on
moniae and shown to be involved in pathogenicity, little is known the surface of SrtC-1, and comparison with the surface diagram
about the complex macromolecular machinery that regulates of a well-studied sortase, SrtA from S. aureus (Figures 2C and 4).
their biogenesis. In this work, we have identified that formation All sortase isoforms studied to date possess a highly conserved
of the pilus backbone in the pneumococcus, known to be com- Thr-Leu-X-Thr motif that precedes the Cys nucleophile, and is lo-
posed of the covalently linked subunits of RrgB, is catalyzed by cated along b7 (shown in orange and red in Figure 4). Modifica-
a pilus-polymerizing enzyme, SrtC-1, the first sortase within the tions within this sequence in SrtA suggest that it plays a role in
rlrA pathogenicity islet. We show that SrtC-1 is able to polymer- substrate recognition (Frankel et al., 2007), a conclusion that is
ize monomeric RrgB in vitro, whereas the third sortase encoded supported by the crystal structure of SrtA in complex with the
by the islet, SrtC-3, displays a modest capacity to associate LPETG peptide, which reveals that the substrate is located in
RrgB monomers. A pneumococcal strain in which the SP0466 proximity to this sequence (Zong et al., 2004a) (Figure 4B).
gene was knocked out displays a clearly diminished capacity Both SrtC-1 and SrtC-3 also possess this highly conserved re-
of producing polymerized pili on its surface as well as an in- gion within an elongated cleft; however, in the pilus-forming sor-
creased amount of RrgB monomers associated to the bacterial tases, this zone is covered by the lid, whose function also
cell wall. Interestingly, a small amount of pili can still be detected involves providing an anchor for the active site (shown in dark
on the surface of the TIGR4DSP0466 strain, suggesting that the blue). These observations suggest that, in SrtC-1/SrtC-3,
absence of this pilus-polymerizing transpeptidase can be partly a closed lid (as seen in the structure) potentially prevents recog-
compensated by another sortase. These observations are nition of LPXTG-like sequences, necessitating a mechanism of
corroborated by those of LeMieux and coworkers (LeMieux lid opening in order for catalysis to occur. This process could
et al., 2008), who show that pneumococcal strains lacking indi- be initiated by an initial recognition between the Rrg-substrate
vidual pilus-forming sortases can still express pili, although the and the closed sortase; only binding of the appropriate substrate
amount of surface-associated pili formed was not explored in would lead to lid opening and enzyme activation. This model
their study. would be in agreement with the one recently put forward by Man-
In addition, we show that the RrgB fibers can be reconstituted dlik and coworkers (Mandlik et al., 2008), who suggest that, in or-
in vitro from purified RrgB monomers and SrtC-1. In this sense, der for proper pilus assembly to occur, two distinct sortases
SrtC-1 acts as a catalyst to promote the covalent association of must act sequentially: the pilus-forming and the housekeeping
RrgB monomers independent of cellular energy. Pilus fibers pro- enzymes, the latter of which will recognize lipid II as a substrate
duced in vitro and visualized in this work by electron microscopy and anchor the formed polymers to the cell wall. Because, as
Structure
Figure 3. The Active Site of Pilus-Forming Sortases Is Anchored by

a Lid
(A) The nucleophilic Cys 193 in SrtC-1 displays two conformations, but only
one is shown for clarity.
(B) The active site of SrtC-3, like SrtC-1, displays a catalytic Arg residue whose
side chain is stably anchored by an Asp residue on the lid ‘‘anchor’’ region. In
both active sites, the conserved His residue is approximately 5.4 Å away from
the Cys nucleophile.
(C) The active site of SrtA from S. aureus (Protein Data Bank code 1T2P) is
mostly solvent-exposed and does not harbor a lid.
shown in this work, the active sites of both sortase types are very
similar, encapsulation of the catalytic cleft of the pilus-forming
enzyme by a lid that can only be opened by the appropriate pilin
subunit would ensure that lipid II is not recognized, thus guaran-
teeing proper orchestration of polymerization and cell wall at-
tachment steps.
All three structural proteins that compose the pneumococcal
pilus carry LPXTG-like motifs on their C termini, albeit with slightly
distinct sequences (RrgA: YPRTG; RrgB: IPQTG; RrgC: VPDTG),
which in principle are the substrates of a comparable transpepti-
dation reaction. Their exquisite specificity was illustrated by the
elegant work performed by LeMieux and coworkers (LeMieux
et al., 2006), who showed that exchange of the YPRTG motif of
RrgA into the analogous motifs of RrgB or RrgC abrogated asso-
ciation of RrgA onto the RrgB fiber. Hence, slight modifications
within the LPXTG-like sequences might have profound conse-
quences for catalysis. To gain insight into the question of speci-
ficity of pilus-forming sortases, we compared surface potentials
of all three enzymes after generating a model of SrtC-2 based
on the structure of SrtC-1 (with which it shares 55.7% sequence
identity; Figure 2C). This analysis (Figure 5) reveals clear differ-
ences within the active sites of SrtC-1, SrtC-2, and SrtC-3, as
well as the regions that surround them. Most striking is the vast
acidic region on the surface of SrtC-3, which contrasts sharply
with the much smaller acidic region on the surfaces of SrtC-1
and SrtC-2, centered on Glu 103 and Glu 94, respectively; these
differences are located on the closed lid regions. In addition, the
catalytic clefts themselves also show differences, with that of
SrtC-1 being more basic than that of SrtC-2, whereas that of
SrtC-3 displays a clear negative charge. Thus, sortase specificity
and differential recognition of RrgA, RrgB, and/or RrgC poten-
tially involve interactions not only within the active site, but also
with the surrounding region, which includes the flexible lid, as
suggested above. It is of interest, thus, that our experiments
show that both SrtC-1 and SrtC-3 can associate RrgB mono-
mers, confirming that a certain level of ‘‘cross-specificity’’ exists
among pilus-forming sortases. In light of our results, we suggest
that this might arise as a consequence of the considerable flexi-
bility observed for the lid region, coupled to the conservation of
active site residues and the nature of the transpeptidation reac-
tion catalyzed. These observations give the sortase lid region
a key role in the processes of pilin substrate recognition and
initiation of catalysis.
To verify if these observations could be extended to the pilus
biogenesis process in other Gram-positive organisms, we
performed a BLAST analysis using the pneumococcal SrtC-1
sequence and searched for the telltale lid anchor residues
Structure
Figure 4. The Substrate-Binding Cleft of Sortases Is Conserved

(A) Surface of SrtC-1, onto which residues that are conserved (orange) and identical (red) among the three pilus-forming sortases and have been mapped. The
analogous residues were mapped onto the surface of S. aureus SrtA (B). This analysis identifies that the lid of pilus-forming sortases (shown in green) is positioned
analogously to the LPETG substrate peptide (shown in cyan) in the structure of SrtA, suggesting that the substrate-recognition cleft in pilus-forming sortases is
sterically blocked by the lid. Active site residues are shown in dark blue.
(Asp-Pro-Hyd) located approximately 125 amino acids N termi- arsenal during infection could be an alternative approach toward
nal to the nucleophilic Cys (magenta in Figure 2C). Interestingly, antibiotic development (Walsh, 2003). The absolute requirement
we were able to identify this sequence in pilus-forming sortases for sortases for pilus formation in Gram-positive pathogens,
from a variety of other piliated species, including Streptococcus coupled to active site features that clearly distinguish them
agalactiae, Streptococcus pyogenes, Bacillus cereus, Entero- from classic sortases and to the fact that they are surface-
coccus faecium, Actinomyces naeslundii, and the well-studied exposed and thus potentially ligand-accessible, suggests that
Corynebacterium diphtheriae (Figure S4). These observations these enzymes are tractable, potential targets for novel antibio-
suggest that Gram-positive organisms could employ a universal therapy development for a variety of Gram-positive species.
mechanism for pilus biogenesis, where sortases encoded by the
pilus-related pathogenicity islets harbor encapsulated active EXPERIMENTAL PROCEDURES
sites, thus necessitating substrate-induced activation for pilus
formation. Cloning, Expression, and Purification of RrgB, SrtC-1, SrtC-2,
The targeting of pathways essential for bacterial survival by an- and SrtC-3
tibiotics has a strong link to the development of drug resistance. The regions of the S. pneumoniae TIGR4 coding for amino acids 30–633
(RrgB), 17–228 (SrtC-1), 9–220 (SrtC-2), and 32–254 (SrtC-3) were amplified
Sortases are not essential for bacterial survival, but they allow
using conventional PCR methodologies and cloned into vector pLIM (Protein
bacteria to express surface-associated proteins that play impor- Expert, Grenoble). Resulting vectors were transformed into E. coli RIL cells
tant roles in virulence. Developing molecules that challenge (Invitrogen). In all four cases, protein expression was induced in Terrific Broth
a bacterium’s capability to successfully employ its pathogenicity with 1 mM IPTG at 37 C during 3 hr. Cells were harvested by centrifugation
Figure 5. Surface Potential Representations of All Three Pilus-Forming Sortases, with a Direct View onto the Active Site
The structure of SrtC-2 was generated by building a model based on the structure of SrtC-1, with which it shares 55.7% sequence identity. Striking features
include the highly basic character of the SrtC-1 cleft and the vast acidic region in the vicinity of the SrtC-3 active site (same orientation as in Figure 3).
Structure
and lysed by sonication in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 20 mM was treated with 200 U/ml mutanolysin (Sigma), 1 mg/ml lysozyme (Sigma),
imidazole, 1 mM PMSF, 0.1 mM aprotinin, and 1 mM pepstatin. The lysates and a protease inhibitor cocktail (Complete, Roche) for 3 hr at 37 C. Cellular
were clarified by centrifugation and applied onto HisTrapHP columns debris were removed by centrifugation at 11 000 rpm for 15 min.
(Amersham Biosciences) pre-equilibrated in lysis buffer. Protein elution was Thirty microliters of each sample was mixed with XT Sample Buffer and XT
performed using linear gradients of 20–500 mM imidazole over 20 ml. Pro- Reducing Agent (Bio-Rad), boiled at 100 C for 10 min and loaded onto 4%–
tein-containing fractions were dialyzed 2 hr into 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 12% Criterion XT Precast gels (Bio-Rad). Gels were run for approximately
200 mM NaCl, and 20 mM imidazole at 4 C and subsequently incubated 3 hr and subsequently electrotransferred in Trans-Blot Transfer Medium
with 1:10 (w/w) Tev protease overnight at 15 C. The proteins were reloaded (Bio-Rad). Incubation times of 1 hr were successively performed using anti-
onto HisTrapHP columns and the eluted, cleaved products were loaded RrgB polyclonal mouse antibodies (diluted 1:5000) and anti-mouse HRP
onto HiLoad 16/60 Superdex 200 (Amersham Biosciences) in 50 mM HEPES conjugate antibodies (Sigma, diluted 1:120,000) before detection with a chemi-
(pH 7.5) and 150 mM NaCl. Pooled, concentrated fractions were employed in luminescent substrate (Pierce).
crystallization trials and RrgB fiber formation experiments as described below.
Selenomethionylated SrtC-1 was overexpressed in E. coli RIL cells in mini- Crystallization, Data Collection, Structure Solution,
mal medium supplemented with thiamine (0.2 mg/ml), leucine (50 mg/l), valine and SrtC-2 Modeling
(50 mg/l), isoleucine (50 mg/l), lysine (100 mg/l), phenylalanine (100 mg/l), thre- Crystals of native SrtC-1 were obtained by the hanging-drop vapor diffusion
onine (100 mg/l), and selenomethionine (60 mg/l). Expression and purification method in 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), 200 mM MgCl2 hexahydrate, and 30%
was performed as described above for the native SrtC-1. w/v polyethylene glycol 4000 at 20 C. Crystals were cryoprotected by brief in-
cubation in mother liquor containing increasing concentrations of glycerol (up
In Vitro RrgB Fiber Formation and Electron Microscopy Analyses to 15%), and subsequently were flash-cooled in the nitrogen stream. A first na-
Recombinant, purified RrgB and SrtC-1 were mixed at a ratio of 1:2 (w/w) and tive data set (1.24 Å) was collected at the European Synchrotron Radiation Fa-
incubated overnight at 37 C. RrgB was also incubated with SrtC-2 and SrtC-3 cility (ESRF) beamline ID14-EH3 (Grenoble, France). A four-wavelength MAD
at the same ratio and under the same conditions, in a total volume of 40 ml. Re- experiment was performed on the Se edge on the ESRF ID23-EH1 beamline.
actions were stopped by boiling for 10 min in the presence of Coomassie blue Diffraction images were indexed and scaled with XDS (Kabsch, 1993) and
dye and 1% SDS. Aliquots of the mixtures were subsequently analyzed on merged with the CCP4 6.0.2 program suite (CCP4, 1994). Identification of
4%–12% SDS-PAGE gradients and then subjected to immunobloting using selenium atom positions, refinement, and phasing were performed with
a 1:5000 dilution of mouse antibodies raised against RrgB. After washing, AutoSHARP (Bricogne et al., 2003; de la Fortelle and Bricogne, 1997) and
membranes were incubated with an anti-mouse antibody conjugated to horse- automatic model building was performed with ARP/wARP 7.0.1 (Perrakis
radish peroxidase at a 1:10,000 dilution. An immunoreactive signal was et al., 1999). PHASER (Storoni et al., 2004) was subsequently used to perform
detected by chemiluminescence (ECL, Biorad). molecular replacement using the model generated by the MAD experiment in
Samples destined to electron microscopy analyses were prepared as order to phase data collected to 1.24 Å, and the model was automatically com-
described above and subsequently loaded onto a Superdex 200 gel filtration pleted and refined using Lafire 2.6 (Yao et al., 2006). Cycles of manual model
column (GE Healthcare). All eluted fractions were tested by immunoblotting building were performed with COOT 0.4.1 (Emsley and Cowtan, 2004),
with anti-RrgB antibodies, and those that corresponded to the high-molecular- whereas cycles of restrained refinement employing TLS motion determination
weight forms (Figure 1A) were submitted to negative staining electron (Painter and Merritt, 2006) were performed with REFMAC 5.4 (Murshudov
microscopy analyses. et al., 1997) as implemented in the CCP4 program suite. Data collection and
Four microliters of the protein sample at approximately 0.05 mg/ml were ad- refinement statistics are shown in Tables 1 and 2. Residues 20–213 of SrtC-1
sorbed onto the clean face of a carbon film on a mica sheet (carbon/mica in- are included in the final model. There is an rmsd value of 0.211 Å between the
terface) and negatively stained with 2% (w/v) neutral sodium silicotungstate. two monomers that form the asymmetric unit dimer.
Micrographs were taken under low-dose conditions with a CM12 LaB6 elec- SrtC-3 crystals were obtained in 100 mM MES (pH 5.0), 0.5 M (NH4)2SO4, and
tron microscope working at 120 kV and with a nominal magnification of 1.0 M LiSO4, and cryocooled directly on the nitrogen stream. A native data set
60,000X. Electron micrographs were digitized using a Zeiss scanner with was collected to 2.14 Å using an in-house Rigaku rotating anode generator
a pixel size of 7 nm (1.17 Å at the sample scale). equipped with osmic multilayer mirrors and a R-AXIS IV2+ detector. The struc-
Volumes of individual protein fibers were calculated by assuming that ture was solved by molecular replacement using the program PHASER (Storoni
1 pixel = 1.17 Å (and thus 50 Å = 43 pixels), and that the average density of et al., 2004) and employing a search model consisting of the core of SrtC-1 (res-
a protein is 0.86 Da/Å3. The calculated volume will thus correspond to the idues 82–209) in which all amino acids that differed between SrtC-1/SrtC-3 were
length of each individual fiber (L) multiplied by the surface of the section (p replaced by alanines. Manual model building and refinement were performed as
3 r 3 r, where r represents the fiber at half-height). Thus: for SrtC-1, as described above. For both structures, stereochemical verification
was performed by PROCHECK (Laskowski et al., 1993) and secondary struc-
for panel ðaÞ; 290
A 3 50
A; L = 290
A; r = 25
A/480 kDa ture assignment was performed by DSSP (Kabsch and Sander, 1983) an
STRIDE (Heinig and Frishman, 2004). The final SrtC-3 model includes residues
for panel ðdÞ; 140
A 3 54
A; L = 140
A; r = 27
A/275 kDa 35–242, and there is an rmsd of 0.045 Å between the two monomers that gen-
erate the dimer seen in the asymmetric unit. Data collection and structure refine-
for panel ðh; bottomÞ; 120
A 3 42
A; L = 120
A; r = 21
A/140 kDa ment statistics are shown in Tables 1 and 2. The SrtC-2 model was generated
through homology modeling based on the structure of SrtC-1 followed by refine-
The fibers shown in the EM images thus have masses that range from 140 kDa ment, using the Modeler 9.3 program (Sali and Blundell, 1993) as implemented
to approximately 480 kDa. in CCP4. Figures were generated with PyMol (http://www.pymol.org).
Construction and Analysis of the SP0466 Deletion Mutant

ACCESSION NUMBERS
The SP0466-inactivated TIGR4 strain was constructed by PCR insertion of the
cat cassette directly into the genome. The PCR product was transformed into
The coordinates of SrtC-1 and SrtC-3 have been deposited in the Protein Data
the wild-type TIGR4 strain, as previously described (Bricker and Camilli, 1999)
Bank under the ID codes 2w1j and 2w1k, respectively.
and then plated onto Columbia blood agar plates containing chloramphenicol
(4 mg/ml). Transcription of the downstream genes (SP0467, SP0468) was ver-
ified by analysis of the total RNA of the mutant, demonstrating no polar effect SUPPLEMENTAL DATA
as a consequence of the SP0466 deletion (data not shown). Wild-type TIGR4
and deletion strains were grown in Todd-Hewitt broth (BD) supplemented by Supplemental Data include four figures, one table, Supplemental Methods,
0.5% yeast extract (Sigma) at 37 C, 5% CO2, until an OD600nm of 0.45 A.U. Cul- and Supplemental References and can be found with this article online at
tures were centrifuged and the bacterial pellet, after being washed with PBS, http://www.cell.com/structure/supplemental/S0969-2126(08)00385-7.
Structure
ACKNOWLEDGMENTS Hilleringmann, M., Giusti, F., Baudner, B.C., Masignani, V., Covacci, A.,
Rappuoli, R., Barocchi, M.A., and Ferlenghi, I. (2008). Pneumococcal pili are
The authors thank Xavier Vernede (LCCP, IBS) and the ESRF ID14-EH3 beam- composed of protofilaments exposing adhesive clusters of RrgA. PLoS
line staff for help with data collection, the IBS mass spectroscopy facility Pathog. 4, e1000026.
(LSMP, IBS) for analyses, Alexandra Kraut (Lab. d’Etude de la Dynamique Ilangovan, U., Ton-That, H., Iwajara, J., Schneewind, O., and Clubb, R.T.
des Protéomes, iRTSV Grenoble) for LCMS/MS experiments, Jean-Pierre An- (2001). Structure of sortase, the transpeptidase that anchors proteins to the
drieu (LBM, IBS) for N-terminal sequencing, Claire Durmort (LIM, IBS) for help cell wall of Staphylococcus aureus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6056–6061.
with RNA analysis, Véronique Frachet and the RioBioMol facility (LIM, IBS) for
Kabsch, W. (1993). Automatic processing of rotation diffraction data from crys-
gene cloning, and J. Marquez and the HTX Lab team (Partnership for Structural
tals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Cryst. 26,
Biology) for access to and help with high-throughput crystallization. This work
795–800.
was partly supported by Young Investigator (ANR Jeunes Chercheurs) grants
to A.M.D.G. (n0 05-JCJC-0049) and G.S. (n0 06-JCJC-0126), as well as Euro- Kabsch, W., and Sander, C. (1983). Dictionary of protein secondary structure:
pean Commission grant LSHM-CT-2004-512138 (to A.D. and T.V.). pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. Biopoly-
mers 22, 2577–2637.
Received: July 11, 2008 Kang, H.J., Coulibaly, F., Clow, F., Proft, T., and Baker, E.N. (2007). Stabilizing
Revised: October 3, 2008 isopeptide bonds revealed in Gram-positive bacterial pilus structure. Science
Accepted: October 9, 2008 318, 1625–1628.
Published: December 9, 2008 Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S., and Thornton, J.M. (1993).
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Barocchi, M.A., Ries, J., Zogaj, X., Hemsley, C., Albiger, B., Kanth, A., components of a multisubunit pilus encoded by the Streptococcus pneumo-
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Biochemistry
Sortase activity is controlled by a flexible lid in the pilus

biogenesis mechanism of Gram-positive pathogens
Journal: Biochemistry
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Complete List of Authors: Manzano, C; Institut de Biologie Structurale

Di Guilmi, Anne Marie; Institut de Biologie Structurale
Dessen, Andrea; Institut de Biologie Structurale
ACS Paragon Plus Environment

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11 Sortase activity is controlled by a flexible lid in the pilus
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biogenesis mechanism of Gram-positive pathogens
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23 C. Manzano, A M. Di Guilmi, and A. Dessen*
24
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26
27 Institut de Biologie Structurale Jean-Pierre Ebel, UMR 5075
28
29 (CEA, CNRS, UJF); 41 rue Jules Horowitz, F-38027 Grenoble, France
30
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32
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34 * to whom correspondence should be addressed
35
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37 email: [email protected]
38
39 phone: (33)4-38-78-95-90
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42 fax: (33)4-38-78-54-94
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3 ABBREVIATIONS
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8 TSA, thermal shift assay; LC-MS, liquid chromatography/mass spectrometry
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ABSTRACT
6
7
8 Pili are surface-linked virulence factors that play key roles in infection establishment
9
10
11 in a variety of pathogenic species. In Gram-positive pathogens, pilus formation
12
13 requires the action of sortases, dedicated transpeptidases that covalently associate
14
15
16 pilus building blocks. In Streptococcus pneumoniae, a major human pathogen, all genes
17
18 required for pilus formation are harbored in a single pathogenicity islet which
19
20
21 encodes three structural proteins (RrgA, RrgB, RrgC) and three sortases (SrtC-1,
22
23 SrtC-2, SrtC-3). RrgB forms the backbone of the streptococcal pilus, to which minor
24
25
26 pilins RrgA and RrgC are covalently associated. SrtC-1 is the main sortase involved
27
28 in polymerization of the RrgB fiber and displays a lid which encapsulates the active
29
30
31 site, a feature present in all pilus-related sortases. In this work, we show that
32
33 catalysis by SrtC-1 proceeds through a catalytic triad constituted of His, Arg, and
34
35
36 Cys, and that lid instability affects protein fold and catalysis. In addition, we show by
37
38 thermal shift analysis that lid flexibility can be stabilized by the addition of substrate-
39
40
41 like peptides, a feature shared by other periplasmic transpeptidases. We also report
42
43 the characterization of a trapped acyl-enzyme intermediate formed between SrtC-1
44
45
46 and RrgB. The presence of lid-encapsulated sortases in the pilus biogenesis systems
47
48 in many Gram-positive pathogens points to a common mechanism of substrate
49
50
51
recognition and catalysis that should be taken into consideration in the development
52
53 of sortase inhibitors.
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INTRODUCTION
6
7
8 Pili are extracellular flexible fibers that are directly associated to the bacterial
9
10
11 cell wall and play key roles in initiation of bacterial infection. These important
12
13 virulence factors are essential for adhesion to target host cells, motility, and DNA
14
15
16 transformation, and have been shown to considerably enhance bacterial ability to
17
1; 2
18 attach to host tissue and initiate colonization . In contrast to pili located on the
19
20
21 surface of Gram-negative bacteria, which are formed by the non-covalent association
22
3; 4
23 of subunits , Gram-positive pili have been shown to be formed by covalently
24
25
26 associated building blocks. Pathogens such as Corynebacterium diphtheriae,
27
28 Streptococcus pyogenes, and Streptococcus pneumoniae carry all of the genes required for
29
30
31 generation of the entire pilus-forming machinery within a single pathogenicity islet 5;
32
6; 7; 8
33 . Thirty percent of pathogenic strains of S. pneumoniae, the causative agent of
34
35
36 pneumonia, septicemia and meningitis, carry the rlrA pathogenicity region, which
37
38 codes for a transcriptional regulator (RlrA), three structural proteins (RrgA, RrgB
39
40
41 and RrgC) and three sortases (SrtC-1, SrtC-2 and SrtC-3). Electron microscopy and
42
43 genetic studies of infectious pneumococcal strains have shown the pilus backbone
44
45
46 fiber to be formed by RrgB subunits, while RrgA and RrgC are minor pilins that are
47
5; 8; 9
48 directly associated to the polymerized RrgB fiber . Both RrgA and RrgC play
49
50 9; 10
51
important roles in infectivity and target cell recognition , while SrtC-1, SrtC-2 and
52
53 SrtC-3 catalyze the intramolecular association of Rrg molecules 11; 12; 13.
54
55
56
57 Sortases are cysteine transpeptidases that participate in a variety of processes,
58
59 including surface attachment of virulence factors, sporulation, and iron acquisition 14;
60
15
. SrtA and SrtB from Staphylococcus aureus represent the best-studied sortases to
4
1
2
3 date. These enzymes recognize an LPXTG-like motif within the sequence of secreted
4
5
6 virulence factors, catalyze the nucleophilic attack of the Thr-Gly bond, and finally
7
8 associate the target proteins carrying the LPXT- sequence directly to the
9
10 16; 17; 18
11 peptidoglycan stem peptide . The structures of SrtA and SrtB reveal a beta-barrel
12
13 fold displaying a triad of catalytic residues (Cys, His, Arg) on exposed extremities of
14
15 19; 20
16 three adjacent strands ; the identification of Cys as the catalytic residue
17
18 responsible for nucleophilic attack was shown not only by mutagenesis studies, in
19
20
21 which introduction of an Ala at this site abolishes catalysis, but also by crystallization
22
23 of covalent complexes between sortases and ligands which are covalently associated
24
25
26 to the Cys residue 21; 22; 23. In addition, the structure of SrtA in complex with a LPXTG-
27
28 like peptidyl-sulfhydryl compound reveals a covalent interaction between the
29
30
31 peptide and the catalytic Cys 24. Notably, while mutagenesis of His or Arg side chains
32
33 dramatically affects catalytic efficiency in SrtA, the precise role played by these
34
35
36 residues is still a matter of controversy 17; 25; 26; 27.
37
38
39 Within the pneumococal pilus system, RrgA, RrgB, and RrgC all carry LPXTG-
40
41
42 like motifs on their C-termini, suggesting that these regions are targeted by sortases 5;
43
44 28; 29
. Although the equal number of structural and sortase-encoding genes in
45
46
47 pneumococci originally implied that each sortase could be exclusively dedicated to
48
49 one Rrg molecule 5, recent work has shown that pilus sortases have interchangeable
50
51 11; 30
52 specificities to a certain extent . Nevertheless, SrtC-1 was shown to be the main
53
54 30
sortase involved in polymerization of the RrgB fiber while the other two sortases
55
56 5; 11; 12
57 also recognize the coadjuvant adhesin molecules . The recent structures of two
58
59 pilus-related sortases (SrtC-1 and SrtC-3 from S. pneumoniae) revealed that these
60
enzymes, like their non-pilus-associated counterparts, also fold into beta-barrels and
5
1
2
3 carry Cys, His, and Arg side chains within the active site cleft. Cys193 was shown to
4
5
6 be essential for RrgB fiber formation by SrtC-1; the wild type enzyme could generate
7
8 30
elongated RrgB fibers in vitro, while a Cys193Ala mutant showed no activity .
9
10
11 Additionally, a noteworthy feature of both pilus-related sortases involves the
12
13 presence of a lid that not only blocks active site access but also carries two key
14
15
16 residues, which are invariably an Asp and a hydrophobic amino acid, that make
17
18 interactions within the catalytic cleft itself, serving as ‘anchors’. Although sequences
19
20
21 corresponding to lid regions can be identified in all pilus-related sortases
22
23 characterized to date 30, the function of this feature, as well as the roles played by the
24
25
26 two other residues in catalysis, have remained obscure.
27
28
29
In this work, we investigate the functions of both the lid and catalytic triad
30
31
32 regions in the pilus fiber-formation activity of SrtC-1. We employ thermal shift assay
33
34
techniques to show that the lid region of SrtC-1 plays roles both in stabilizing the
35
36
37 enzyme and allowing substrate access to the active site. In addition, we show that
38
39
amino acids His131 and Arg202 are essential for RrgB fiber formation, and that
40
41
42 Arg202, in particular, also plays a structural stabilization role through interaction
43
44 with lid anchors. Lastly, we describe the ‘trapping’ of a covalent complex between
45
46
47 RrgB and SrtC-1, which can be observed by SDS gel and LC-MS/MS spectrometry
48
49 analysis. The absolute requirement for sortases in the pilus-formation processes of all
50
51
52 Gram-positive pathogens, coupled to the presence of lid regions with similar anchor
53
54 residues in these enzymes, suggest that these data will contribute to the
55
56
57 understanding of the pilus-formation mechanism in a variety of infectious
58
59 organisms.
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3 MATERIALS AND METHODS
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8 Generation of mutants SrtC-1-H131D, SrtC-1-R202E, SrtC-1-D58GW60G, and SrtC-
9
10
11 1-C193AD58GW60G
12
13
14
15
16 The expression plasmid pLIMSrtC-1 encoding wild-type His6-SrtC-1 (or
17
18 HisSrtC-1Cys193Ala) served as a template for the introduction of single amino acid
19
20
21 substitutions by PCR using the QuickChange XL Site Directed Mutagenesis
22
23 (Stratagene). All mutant constructs were subsequently sequenced; the results showed
24
25
26 that only expected mutations were introduced during PCR.
27
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31 Expression and purification of recombinant proteins
32
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36
Protein expression in E. coli BL21 (DE3)-RIL was similar in all cases and was
37
38 induced in Terrific broth with 1 mM IPTG at 37 °C for 3 h. Cells were harvested by
39
40
41
centrifugation and lysed by sonication in buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.2 M
42
43 NaCl, 20 mM imidazole). Supernatants were cleared by centrifugation and applied to
44
45
46
a HisTrap column (Amersham Biosciences), pre-equilibrated in buffer A. Proteins
47
48 were eluted with a imidazole gradient and were subsequently cleaved by Tev
49
50
protease overnight at 4°C. Recombinant proteins were then submitted to further
51
52
53 purification on a gel filtration column in 50 mM HEPES pH 7.0, 0.15 M NaCl. All
54
55
mutant proteins were verified by mass spectrometry analysis.
56
57
58
59
60 In vitro RrgB fiber formation
7
1
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5
6 Recombinant purified RrgB was incubated with SrtC-1, SrtC-1-H131D or SrtC-1-
7
8
R202E at a 1:4 (w/w) ratio in a total volume of 15 µl and subsequently incubated
9
10
11 overnight at 37°C. Each aliquot was mixed with XT Sample Buffer and XT Reducing
12
13
Agent (Bio-Rad), boiled for 10 min and loaded onto 4-12% Criterion XT Precast gels
14
15
16 (Bio-Rad). Gels were subsequently electro-transferred into Trans-Blot Transfer
17
18 Medium (Biorad). Membranes were blocked with 5% nonfat milk in PBS with 0.3%
19
20
21 Tween (PBS-T) for 1h at room temperature. Membranes were left in primary
22
23 antiserum (anti-RrgB or anti-SrtC-1 polyclonal mouse antibodies diluted to 1:5,000)
24
25
26 during 1.5 hours at RT. After 3 successive washes in PBS-T, the membranes were
27
28 incubated with secondary anti-mouse HRP-conjugate antibodies (Sigma, diluted
29
30
31 1:10,000) overnight at 4°C. Proteins were detected directly on the membranes with
32
33 SIGMAFAST™ DAB Tablets (Sigma).
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38 Fluorescence-based protein thermal stability assays
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40
41
42
43 Assays were conducted in an IQ5 96-well format real-time PCR instrument (Bio-
44
45
46 Rad) in the presence of a Sypro Orange (Molecular Probes) probe. The total volume
47
48 was 25 µL. Samples were heat-denatured from 20°C to 100°C at a rate of 1°C per
49
50
51 minute for SrtC-1-H131D and SrtC-1-R202E mutants and from 20°C to 80°C at a rate
52
53 of 0.5°C per minute for SrtC-1-D8GW60G and SrtC-1-C193AD58GW60G mutants. At
54
55
56 each step, excitation was performed at 470 nm, while emission of Sypro Orange
57
58 fluorescence was monitored at 570 nm. Plotting of the fluorescence vs temperature
59
60
curves, followed by the calculation of the first derivative at each point allowed the
8
1
2
3 identification of each inflection point; the minima were referred to as the melting
4
5
6 temperatures (Tm). The SrtC-1-C193AD58GW60G variant was employed for
7
8 experiments with the IPQTG and YPRTG peptides (PSL GmbH), in order to avoid
9
10
11 the potential catalytic reaction of the substrates with the active site Cys193. Prior to
12
13 experimentation with peptides, SrtC-1-C193AD58GW60G and SrtC-1-D58GW60G
14
15
16 variants were shown to display identical purification profiles and TSA Tm values (not
17
18 shown). Peptides were added to the experiment in a final molar ratio of 1:10 and 1:20
19
20
21 (protein:peptide). Each result is representative of three independent experiments.
22
23
24
25
26 Crystallization, data collection and structure solution
27
28
29
30
31 SrtC-1-H131D crystals crystals were obtained in hanging drops in 0.1 M Tris pH 8.5,
32
33 0.2M MgCl2 hexahydrate, 30% PEG4000 at room temperature and were cryoprotected
34
35
36 by gradual incubation in increasing amounts of glycerol to a final concentration of
37
38 20%. Diffraction data were collected at the European Synchrotron Radiation Facility
39
40
41 (ESRF) beamline ID29 (Grenoble, France). Diffraction images were indexed and
42
43 scaled with XDS 31. The structure was solved by molecular replacement using the
44
45 32
46 program PHASER employing the structure of wild type SrtC-1 as a search model.
47
48 Model building and refinement steps were performed with Coot and REFMAC 5.4 33;
49
50 34
51 . Data collection and structural refinement statistics are shown in Table I. Figures
52
53 were generated with PyMol (http://www.pymol.org).
54
55
56
57
58 Mass Spectrometry analysis
59
60
9
1
2
3 The band identified in Fig. 4a with a star was excised from the gel and subsequently
4
5
6 washed with 50 mM acetonitrile/ammonium bicarbonate 50/50 (v/v) for 30 min,
7
8 before dehydratation with acetonitrile. Subsequently, the sample was treated with
9
10
11 7% H2O2. After drying was complete, the band was rehydrated in 15 µL digestion
12
13 buffer (50 mM ammonium bicarbonate pH 8.1) containing 150 ng of trypsin and
14
15
16 incubated at 4°C for 15 mins. 30µL of digestion buffer were then added and the
17
18 digestion reaction was carried out at 37°C overnight. Peptides were extracted from
19
20
21 the gel by diffusion for 15 min with agitation, followed by three sequential 5 min
22
23 sonication steps in 50% acetonitrile, 5% formic acid, and 100% acetonitrile. Digestion
24
25
26 and extraction solutions were pooled and dried under vacuum. Peptide mixtures
27
28 were re-dissolved in 25µl of water/acetonitrile 95/5 (v/v) containing 0.2%
29
30
31 Trifluoroacetic acid prior to LCMS/MS analysis. All experiments were
32
33
34 performed in a 96-well system coordinated by an EVO15 (Tecan) robot (EdyP,
35
36
37 Grenoble).
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
10
1
2
3 RESULTS
4
5
6
7
8 RrgB fiber formation requires a catalytic triad
9
10
11
12
13 SrtC-1 is the main sortase involved in formation of the RrgB pilus fiber, and
14
15 11;
16 mutation of its catalytic cysteine (Cys193) into Ala abolishes fiber-forming activity
17
30
18 . The high resolution structure of SrtC-1 from infectious pneumococcal strain TIGR4
19
20
21 revealed that, in addition to Cys193, the catalytic site also harbors His131 and
22
23 Arg202; although the functions of the two latter residues were unknown, their three-
24
25
26 dimensional arrangement is comparable to what is observed in active sites of non-
27
28 pilus-related sortases, which also carry Cys, His, and Arg residues 19; 22; 24; 30. In order to
29
30
31 explore the functions of His131 and Arg202 in SrtC-1‘s fiber-forming activity, we
32
33 mutated these residues into Asp and Glu, respectively, and searched for the capacity
34
35
36 of SrtC-1-H131D and SrtC-1-R202E variants to generate a pattern of high molecular
37
38 weight bands on SDS-PAGE upon incubation with RrgB at 37°C (as described in 30).
39
40
41 The Western blot on Fig. 1a, which was developed with anti-RrgB antibodies,
42
43 confirms that wild type SrtC-1 is able to catalyze the formation of a pattern of high
44
45
46 molecular weight RrgB bands (which correspond to the pilus backbone fibers as
47
48 shown by microscopy by Manzano and coworkers 30. In contrast, neither SrtC-1-
49
50
51 H131D (lane 3) nor SrtC-1-R202E (lane 4) were able to catalyze fiber formation. These
52
53 results suggest that, as in the case of non-pilus-related sortases, SrtC-1 employs a
54
55
56
catalytic triad composed of Cys193, His131, and Arg202 for RrgB fiber generation.
57
58
59
60
11
1
2
3 In order to address the issue of active site stability within SrtC-1 mutant
4
5
6 structures, we submitted both proteins to crystallization trials. SrtC-1-R202E crystals
7
8 were of poor quality and diffracted X-rays only to low resolution (8 Å). However,
9
10
11 SrtC-1-H131D crystals diffracted X-rays to high resolution (1.3 Å) at the ESRF
12
13 synchrotron in Grenoble and we were able to solve its structure by employing wild
14
15
16 type SrtC-1 (PDB code 2WIJ) as a search model in a molecular replacement
17
18 experiment (see methods). Data collection and refinement statistics are shown in
19
20
21 Table I. SrtC-1-H131D displays a highly similar fold to wild type SrtC-1 (rms
22
23 deviation of 0.2 Å over 196 Cα atoms), revealing that the mutation in the catalytic
24
25
26 cleft does not affect the general fold of the protein. Analysis of the SrtC-1-H131D
27
28 active site (Fig. 1c, where lid residues are shown in green) reveals only slight
29
30
31 differences from the wild-type SrtC-1 molecule (Fig. 1b). The side chain of Cys193 is
32
33 present in two conformations, as is the case for wild type SrtC-1 (only one is shown
34
35
36 for clarity). In addition, the side chain of the mutant residue, Asp131, stabilizes the
37
38 Nε group of Trp60, a lid anchor residue, through a close hydrogen bond (2.7 Å); in
39
40
41 the wild type structure, His131 does not make any interactions within the active site,
42
43 and is located 5.3 Å away from the nucleophilic cysteine. Thus, although the
44
45
46 mutation of His131 into Asp does not affect the overall fold of the protein, Asp131 is
47
48 not able to replace the catalytic function of His131, suggesting that the positive
49
50
51 charge on His131 is crucial for SrtC-1’s fiber-forming activity.
52
53
54
55
56 We further investigated the stability of wild type and mutant SrtC-1 forms
57
58 through thermal shift assays. Proteins were gradually heated in a IQ5 real time PCR
59
60
apparatus and thermal unfolding curves were monitored through the detection of
12
1
2
3 changes in fluorescence of a Sypro Orange probe. For data analysis, the melting
4
5
6 temperature (Tm) for each sample was determined as the minimum peak in the first
7
8 derivative plot of the melting curve representing the raw fluorescence data. Results
9
10
11 are shown in Fig. 2a. This analysis reveals that the Tm values for both wild type SrtC-
12
13 1 and SrtC-1-H131D are in the range of 46°C, while that of the SrtC-1-R202E mutant
14
15
16 is of 39°C. This suggests that mutation of Arg202 engenders structural destabilization
17
18 of SrtC-1, which could explain the lack of success in obtaining well-diffracting
19
20
21 crystals of this mutant. It is of note that in the active site of the wild type SrtC-1
22
23 molecule, lid anchor residue Asp58 interacts directly with both NH2 and Nε atoms of
24
25
26 Arg202 (Fig. 1b). The results with the SrtC-1-R202E mutant thus suggest that, at least
27
28 in the absence of substrate, the Asp58-Arg202 interaction is essential for lid and
29
30
31 overall protein stability. Thus, the lack of fiber-forming activity of SrtC-1-R202E
32
33 could be linked not only to the absence of the Arg side chain for catalytic function
34
35
36 (discussed below), but also to a decrease in structural stability.
37
38
39
40
41 The sortase lid is key for activity and stability
42
43
44
45
46 In all pilus-related sortases sequenced to date, lid anchor residues invariably
47
48 include an Asp at a position which is homologous to that occupied by Asp58 in SrtC-
49
50
51 1, and a large hydrophobic side chain (Trp, Tyr, or Phe) at the site occupied by Trp60
52
53 (Fig. 2b). The structure of SrtC-1 shows that lid anchor residues not only interact
54
55
56 directly with active site residues, as seen above, but the lid itself blocks an elongated
57
58 cleft which could be the LPXTG substrate binding site 30. This hypothesis was put
59
60
forth through comparison of the structures of SrtC-1/SrtC-3 and staphylococcal SrtA,
13
1
2
3 which binds an LPXTG peptidic substrate in a comparable cleft that harbors the
4
5 23; 30
6 active site residues on one end , and has also been suggested by the recent
7
8 24
structure of SrtA in complex with a covalent substrate analog . This could imply
9
10
11 that one of the functions of the lid is to regulate substrate access into the cleft. In
12
13 order to investigate this potential function of the lid, we constructed a SrtC-1 double
14
15
16 mutant in which lid anchor residues Asp58 and Trp60 were mutated into glycines.
17
18 Initially, we tested the ability of SrtC-1-D58GW60G to generate a RrgB high-
19
20
21 molecular-weight ladder on SDS-PAGE. As shown in the Western blot on Fig. 3a, in
22
23 which the same amount of sample mixture was loaded in all lanes, SrtC-1-
24
25
26 D58GW60G (lane 2) can recognize RrgB and generate an initial set of bands, but
27
28 polymerization is less efficient than for wild type SrtC-1 (lane 3).
29
30
31
32
33 To explore the effects of the two anchor side chains on the stability of SrtC-1,
34
35
36 we performed thermal shift assay (TSA) experiments on SrtC-1-D58GW60G. The
37
38 results, shown in Fig. 3b, indicate that SrtC-1-D58GW60G displays a Tm which is 8°C
39
40
41 lower than that of the wild type enzyme (38°C versus 46°C). Thus, the side chains of
42
43 lid anchor residues Asp58 and Trp60 are required for SrtC-1 stability. It is of note
44
45
46 that the SrtC-1-R202E mutant is also considerably less stable than wild type SrtC-1
47
48 (Fig. 2). This indicates that the Arg202-Asp58 interaction plays an important role in
49
50
51 SrtC-1 stabilization and suggests that mutants that cannot generate this interaction
52
53 have a lid region that tends to be in an ‘open’, or flexible state. If so, these mutant
54
55
56 forms could potentially be stabilized by the addition of substrate into the active site
57
58 region.
59
60
14
1
2
3 In order to test this possibility, we employed the TSA technology to test if
4
5
6 SrtC-1-D58GW60G could be stabilized by a peptide corresponding to the RrgB
7
8 LPXTG-like sequence (IPQTG). Addition of increasing amounts of peptide were
9
10
11 accompanied by an increase in the Tm of the mutant protein (Fig. 3b), suggesting that
12
13 the 5-residue substrate peptide can penetrate the active site of the ‘open lid’ SrtC-1
14
15
16 form and stabilize its structure. These data thus strongly point to a double role for
17
18 the lid region in pilus-related sortases: (1) covering of the active site in the absence of
19
20
21 substrate and ensuring protein stability (2) maintenance of Arg202 optimally pointed
22
23 towards the active site cysteine (through the Asp58-Arg202 interaction), enabling it
24
25
26 to efficiently participate in catalysis. The presence of a Phe and Asp residues as
27
28 anchor points in the lid region of SrtC-3 30, also expressed in the rlrA operon, suggests
29
30
31 that lids in pilus-related sortases could play similar roles.
32
33
34
35 11
36 Recently, Fälker and co-workers showed that SrtC-1 (named SrtB in their
37
38 manuscript), in addition to acting as a pilus polymerase, could also recognize minor
39
40
41 pilins. We thus set out to verify this point by incubating SrtC-1-D58GW60G with
42
43 increasing amounts of YPRTG, the LPXTG-like peptide from RrgA, a minor pilin,
44
45
46 and performing analysis through TSA, as described for the IPQTG peptide. Results
47
48 show that, much as in the case of IPQTG, SrtC-1-D58GW60G can also recognize and
49
50
51 is also stabilized by increasing amounts of YPRTG (Fig. 3c). The Tm is thus shifted
52
53 from 38oC (mutant enzyme with no peptide) to 43oC (highest amount of peptide),
54
55
56 indicating that the peptide from a minor pilin is as successful as IPQTG in rendering
57
58 SrtC-1-D58GW60G more stable. Thus, the presence of proline, threonine, and glycine
59
60
within the LPXTG-like sequence plays a key role in recognition of the motif within
15
1
2
3 24
the sortase active site. Interestingly, Suree and coworkers have recently proposed
4
5
6 that the lid anchor residues in pilus-related sortases (Asp58 and Trp60 in SrtC-1)
7
8 mimic the PX portion of the peptide motif and thus occlude the LPXTG binding site.
9
10
11 Our results are in agreement with this proposition, since the mutant that lacks both
12
13 anchor residues can recognize/be stabilized by two slightly different LPXTG-like
14
15
16 sequences. These data also suggest that pilus-related sortases do not show strict
17
11; 30
18 specificity for one specific LPXTG-like sequence, as proposed before . Preferences
19
20
21 for the individual Rrg substrates could potentially be dictated by the section of the
22
23 lid region that faces the outside of the molecule (and not the active site) 30, and/or the
24
25
26 region of the cleft which recognizes the donor substrate 24.
27
28
29
30
31 Formation in vitro of a covalent complex between SrtC-1 and RrgB
32
33
34
35
36 Upon incubation of SrtC-1 and RrgB and analysis on SDS-PAGE, in addition
37
38 to the RrgB ladder identified with anti-RrgB antibodies (Fig. 1, lane 2), development
39
40
41 of the gel with an antibody raised against SrtC-1 revealed three bands (Fig. 4a). The
42
43 most prominent one represents the sortase monomer, whilst an intermediary band,
44
45
46 identifiable both in the presence or absence of RrgB, represents a minor form of a
47
48 sortase dimer. The other additional band migrates above the 85 kDa marker and is
49
50
51 indicated with star in Fig. 4a; interestingly, a band migrating at approximately the
52
53 same point can also be identified in a gel developed with anti-RrgB serum (Fig. 1 and
54
55 30
56 ), indicating that it could represent a complex between RrgB and SrtC-1. In order to
57
58 investigate the nature of this band, we submitted the entire mix to mass
59
60
spectrometry, and the results are shown in Fig. 4b. In addition to the expected
16
1
2
3 masses of SrtC-1 and RrgB, we identified a form whose molecular mass (approx. 88. 3
4
5
6 kDa) could correspond to that of a covalent complex between SrtC-1 and RrgB. In
7
8 order to confirm this finding, we cleaved the band from the gel, trypsinized the
9
10
11 sample, and performed liquid chromatography coupled to tandem mass
12
13 spectrometry (LC-MS/MS). The peptides that correspond to this experiment are
14
15
16 shown in Fig. 4c, and all correspond to either RrgB or SrtC-1, indicating that this
17
18 additional band corresponds to a covalent complex between RrgB and SrtC-1.
19
20
21 Notably, the same band could be identified in experiments performed with SrtC-1-
22
23 D58GW60G, which was shown (Fig. 3a) to display some RrgB-polymerizing
24
25
26 capabilities, but no evidence of the complex could be detected with mutants SrtC-1-
27
28 C193A, SrtC-1-H131D or SrtC-1-R202E (data not shown). These results indicate that
29
30
31 the RrgB polymerization reaction proceeds through an acyl-complex intermediate
32
33 whose formation is dependent on an intact catalytic triad, and which can be trapped
34
35
36 in vitro.
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
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51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
17
1
2
3 DISCUSSION
4
5
6
7
8 Pilus biosynthesis in Gram-positive bacteria requires the action of dedicated
9
10
11 sortases in order to guarantee the covalent association of its building blocks 35. The
12
13 pilus biosynthesis rlrA pathogenicity islet of S. pneumoniae encodes three sortase
14
15
16 enzymes (SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3) that do not display strict substrate specificities
17
18 towards Rrg molecules, although SrtC-1 has been shown to be the key protein in
19
20
21 formation of the RrgB fiber backbone 11; 30. In this work, we have shown that, as is the
22
23 case for non-pilus-related sortases, a catalytic triad composed of Cys, Arg, and His
24
25
26 residues are essential for the catalytic activity of SrtC-1. Although the side chain of
27
28 His131 is located more than 5 Å away from the nucleophilic Cys193 and its mutation
29
30
31 into Asp does not affect protein stability, this modification completely blocks SrtC-1’s
32
33 fiber formation ability. Interestingly, mutation of Arg202 into Glu, in addition to
34
35
36 generating a catalytically inactive SrtC-1, also affects enzyme stability, most probably
37
38 due to the loss of two hydrogen bonds with an anchor lid residue (Asp58; see below).
39
40
41
42
43 We were also able to identify a ‘trapped’ RrgB-SrtC-1 covalent intermediate in
44
45
46 the reaction catalyzed by wild type SrtC-1 by Western blotting and LC-MS/MS. This
47
48 suggests that, although the RrgB fiber can be formed in vitro, the SrtC-1 RrgB
49
50
51 polymerization reaction in these conditions is slow and/or inefficient, allowing the
52
53 intermediate to be identified. The covalent intermediate was also identified in
54
55
56 experiments in which the SrtC-1-D58GW60G mutant was incubated with RrgB; this
57
58 indicates that mutation of the lid anchor residues does not block either substrate
59
60
recognition or acyl-enzyme formation, but affects reaction processivity. Notably, no
18
1
2
3 bands for the covalent intermediate could be identified in SrtC-1 mutants in which
4
5
6 the His131 or Arg202 side chains were mutated. The absence of fiber-formation
7
8 activity and the inability of Arg and His active site mutants to form the acyl-enzyme
9
10
11 complex suggest that both residues participate in a catalytic step prior to acyl-
12
13 enzyme formation. In SrtA, the catalytic His residue has been hypothesized as being
14
15
16 responsible for the protonation of the substrate leaving group, while the Arg side
17
18 chain could stabilize the negative charge accumulation in the transition state 21; 25; 36 or
19
20
21 participates in positioning of the substrate by direct interaction with backbone
22
23 residues 24. Thus, acyl-enzyme trapping can be enhanced by mutation of either of the
24
25
26 two auxiliary members of the catalytic triad, His or Arg. It is also of note that recently
27
28 Ton-That and co-workers identified pilus polymerization acyl-enzyme intermediates
29
30 37
31 on the surface of Corynebacterium diphtheriae mutants , underlining that the
32
33 formation of a covalent complex in the pilus biogenesis process of Gram-positive
34
35
36 species is also identifiable directly on the bacterial surface.
37
38
39
40
41 Sortases involved in pilus formation in a variety of bacterial species carry lid
42
43 regions with two anchor residues (Fig. 2b). In SrtC-1, these key residues (Asp58 and
44
45
46 Trp60) anchor the lid in a seemingly closed conformation. Since, in the structure of
47
48 SrtC-3, Trp60 is replaced by a Phe 30, it seems likely that the hydrophobic nature of
49
50
51 this residue plays a role in lid closure. Asp58, however (which is invariably an Asp in
52
53 all sequences of pilus-related sortases known to date; examples in Fig. 2b), plays a
54
55
56 key role in stabilizing Arg202 (thus, a member of the catalytic triad) through two
57
58 hydrogen bonds, with the side chain facing the Cys nucleophile directly. Absence of
59
60
the two lid anchor side chains not only starkly diminishes SrtC-1’s capacity to
19
1
2
3 polymerize RrgB fibers, but also causes protein destabilization. Interestingly, protein
4
5
6 stability can be partly recovered through the addition of the LPXTG-like peptides,
7
8 which have been suggested to lodge within the elongated cleft upon lid opening.
9
10
11 These results support the proposition that lid movement is required prior
12
30
13 to/concomitant with substrate accommodation within the binding site . The
14
15
16 observation that large amounts of the LPXTG-like peptides cannot totally recover
17
18 SrtC-1 stability suggests that other features of the full-length RrgB substrate also play
19
20
21 a role in SrtC-1 recognition and stabilization.
22
23
24
25
26 The presence of a flexible lid that covers the active site in pilus-related
27
28 sortases, studied here, is also detected in other transpeptidases. Suree and coworkers
29
30 24
31 have identified that the access of substrate to the active site of SrtA from S. aureus,
32
33 an enzyme involved in the covalent association of virulence factors to the
34
35
36 peptidoglycan, is also regulated by a flexible loop. Although this region corresponds
37
38 to a loop which is in a different position from the lid described in this work for
39
40
41 sortases involved in pilus formation (Fig. 2b), it points to the possibility that sortases
42
43 control access of substrate to their active site through the movement of surrounding
44
45
46 flexible regions. Interestingly, another class of well-studied transpeptidases,
47
48 Penicilin-Binding Proteins (PBPs), also carry a malleable lid region in close proximity
49
50
51 to the active site (the loop between β3 and β4; 38; 39; 40; 41; 42). The transpeptidase domains
52
53 of PBPs catalyze the cross-linking of stem peptides of the peptidoglycan, thus
54
55
56 recognizing peptidic substrates within the cleft, much like sortases; in addition, they
57
58 are the targets for β-lactam antibiotics, whose structure mimics the last two residues
59
60
of the stem peptide 43. Thus, it is of interest that in the crystal structure of PBP1b from
20
1
2
3
S. pneumoniae, the β3/β4 loop maintains the active site in ‘closed’ conformation in the
4
5
38
6 absence of ligand largely through its obstruction by a polar residue (Asn656) .
7
8
Notably, opening of the cleft can only be achieved in vitro through incubation with
9
10
11 substrate or a pseudo-substrate which structurally mimics the pentapeptide. This
12
13
incubation, which causes an ‘opening’ movement of the loop, allows trapping of an
14
15
16 acyl-enzyme intermediate as well as complex formation with different β-lactam and
17
18
19 γ-lactam antibiotics, suggesting that substrate/pseudo-substrate recognition and lid
20
44; 45
21 opening are related events . Thus, due to the similarity in substrate recognition
22
23
24 patterns and catalytic functionality, a common mechanism of regulation of active site
25
26 access could be proposed for both sortase and PBP transpeptidases. In the absence of
27
28
29
substrate (stem peptides for PBPs, LPXTG-like peptides for sortases) the catalytic
30
31 cleft is maintained in closed conformation through specific interactions generated by
32
33
34
lid residues (Fig. 5). However, once substrate becomes available (i.e., when
35
36 peptidoglycan biosynthesis is required during different moments of the cell cycle
37
38
39
(PBPs) or when virulence factors subunits must be attached to partner molecules
40
41 (sortases), the lid is opened, potentially through direct interaction with substrates.
42
43
44
These observations lend support to the idea that conformational changes induced by
45
46 ligand binding should be taken into consideration in transpeptidase-targeted drug
47
48
design efforts.
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
21
1
2
3
4
5
6 ACKNOWLEDGEMENTS
7
8
9
10
11 The coordinates of SrtC-1-H131D were deposited in the Protein Databank with code
12
13 xx and are available pre-release from the authors. The authors wish to thank Carlos
14
15
16 Contreras-Martel (IBS) for help during the initial phases of the project, the ESRF ID29
17
18 beamline staff for help with data collection, Izabel Bérard and Eric Forest from the
19
20
21 IBS mass spectroscopy facility (LSMP, IBS) for analyses, and Alexandra Kraut and
22
23 Jérôme Garin (Lab. d’Etude de la Dynamique des Protéomes, EDyP Grenoble) for
24
25
26 access to the LC-MS/MS platform and experiments. This work was supported by EC
27
28 grant LSHM-CT-2004-512138 (to A.D).
29
30
31
32
33
34
35
36
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38
39
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51
52
53
54
55
56
57
58
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52
53
54
55
56
57
58
59
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25
1
2
3 TABLE I
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1
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3
4
5
6 FIGURE LEGENDS
7
8
9
10
11 Fig. 1. The active site of SrtC-1 contains a catalytic triad.
12
13 (A) Western blot developed with RrgB antiserum. Lanes: (1), monomeric RrgB; (2),
14
15
16 RrgB + SrtC-1; (3), RrgB + SrtC-1-H131D; (4), RrgB + SrtC-1-R202E. Molecular mass
17
18 standards (in kDa) are indicated on the left. (B) active site of wild type SrtC-1 and (C)
19
20
21 active site of SrtC-1-H131D. The active site residues are shown as sticks and the lid
22
23 region is colored green.
24
25
26
27
28 Fig.2 . Thermal stability of active site SrtC-1 variants (A) Thermal unfolding of
29
30
31 SrtC-1 and two active site mutants was followed in the presence of the Sypro Orange
32
33 fluorescent probe (left). The first derivative of the thermal denaturation curve allows
34
35
36 the determination of the minima reflecting the melting temperature (right). (B)
37
38 Sequence alignment of the lid regions of sortases involved in pilus formation in
39
40
41
different Gram-positive pathogens (six first lines) and association of virulence factors
42
43 to the peptidoglycan (two last lines). Those involved in pilus biosynthesis harbor the
44
45
46
Asp-Pro-Hyd motif, in which the Asp and the Hydrophobic residue serve as anchors
47
48 within the catalytic cleft.
49
50
51
52
53 Fig. 3. Activity and thermal stability studies of SrtC-1 carrying mutations in the lid
54
55 anchor residues.
56
57
58 (A) Western blot developed with antiserum against RrgB shows that SrtC-1-
59
60 D58W60G polymerizes RrgB less efficiently. Lanes: (1), monomeric RrgB; (2), RrgB +
27
1
2
3 SrtC-1-D58GW60G; (3), RrgB + wild type SrtC-1. The values on the left correspond to
4
5
6 molecular weight marker sizes in kDa. (B) Thermal unfolding studies of SrtC-1-
7
8 D58W60GC193A in the presence of IPQTG, which corresponds to RrgB’s LPXTG-like
9
10
11 motif. The incubation of SrtC-1-D58W60GC193A with the IPQTG peptide at 2
12
13 increasing molar ratios (1:10 and 1:20, protein:peptide) suggests a stabilization of the
14
15
16 mutant by the peptide.(C) Thermal unfolding studies of SrtC-1-D58W60GC193A in
17
18 the presence of YPRTG, which corresponds to RrgA’s LPXTG-like motif. In both (B)
19
20
21 and (C), the right panels represent the first derivative of the denaturation curves
22
23 shown on the left.
24
25
26
27
28 Fig. 4. SrtC-1 and RrgB form a covalent complex
29
30
31 (A) Western blot developed with SrtC-1 antiserum. Lanes: (1), monomeric SrtC-1; (2),
32
33 RrgB + SrtC-1. Monomeric SrtC-1 migrates as a band with an approximate molecular
34
35
36 mass of 23 kDa; a small amount of dimeric SrtC-1, which migrates above its
37
38 theoretical mass of 47.4 kDa, is also visible. The RrgB/SrtC-1 covalent complex is
39
40
41 indicated with a star. (B) MALDI results of the mix between SrtC-1 and RrgB, which
42
43 identifies not only the single proteins but also a mass of approximately 88 kDa,
44
45
46 which corresponds to a covalent complex. On occasion, the SrtC-1 dimer could also
47
48 be identified, yielding a mass value of 47,573 Da. (C) LC-MS/MS results for the band
49
50
51 indicated with a star in (A). The lanes correspond to: observed: mass to charge ratio
52
53 (m/z) of peptide; Mr (expt): experimental molecular mass (Da) of peptide; Mr (calc):
54
55
56 calculed molecular mass (Da) of peptide; Delta: mass difference (Da) between Mr
57
58 (expt) and Mr (calc); First: identification of the first amino acid of the peptide in the
59
60
full-length protein; Last: identification of the last amino acid of the peptide on the
28
1
2
3 full- length protein; Sequence: sequence of the identified peptide.
4
5
6
7
8 Fig. 5. Access to transpeptidation active sites in PBPs and sortases is regulated by
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11 flexible lids. Surface representations of (A) PBP1b from S. pneumoniae and (B) SrtC-1,
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13 with active site residues represented in red. Both transpeptidases display lid regions
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16 (yellow for PBP1b, green for SrtC-1) which are maintained in closed conformation in
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18 the absence of ligand. Polar residues Asn656 (A) and Asp58 (B) play key roles in
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ARTICLE IN PRESS
LDB YJMBI-61729; No. of pages: 13; 4C: 4, 5, 6, 7, 8
doi:10.1016/j.jmb.2009.08.058 J. Mol. Biol. (2009) xx, xxx–xxx
Available online at www.sciencedirect.com
Two Crystal Structures of Pneumococcal Pilus

Sortase C Provide Novel Insights into Catalysis and
Substrate Specificity
Fabrice Neiers 1,2,3 , Chaithanya Madhurantakam 2 †, Stefan Fälker 1,3 †,
Clothilde Manzano 4 , Andrea Dessen 4 , Staffan Normark 1 ,
Birgitta Henriques-Normark 1,3 ⁎‡ and Adnane Achour 2 ⁎‡
1
Department of Microbiology, The respiratory tract pathogen Streptococcus pneumoniae is a primary cause
Tumor and Cell Biology, of morbidity and mortality worldwide. Pili enhance initial adhesion as well
Karolinska Institutet, as the capacity of pneumococci to cause pneumonia and bacteremia. Pilus-
SE-171 77 Solna, Sweden associated sortases (SrtB, SrtC, and SrtD) are involved in the biogenesis of
2 pneumococcal pili, composed of repeating units of RrgB that create the stalk
Center for Infectious Medicine, to which the RrgA adhesin and the preferential pilus tip subunit RrgC are
F59, Department of Medicine covalently associated. Using single sortase-expressing strains, we demon-
Huddinge, Karolinska strate that both pilin-polymerizing sortases SrtB and SrtC can covalently
University Hospital Huddinge, link pili to the peptidoglycan cell wall, a property shared with the non-pilus-
Karolinska Institutet, polymerizing enzyme SrtD and the housekeeping sortase SrtA. Compar-
SE-141 86 Stockholm, Sweden ative analysis of the crystal structures of S. pneumoniae SrtC and SrtB
3
Department of Bacteriology, revealed structural differences explaining the incapacity of SrtC, but not of
Swedish Institute for Infectious SrtB, to incorporate RrgC into the pilus. Accordingly, site-directed
Disease Control, mutagenesis of Thr160 in SrtB to an arginine as in SrtC (Arg160) partially
SE-171 82 Solna, Sweden converted its substrate specificity into that of SrtC. Solving two crystal
4 structures for SrtC suggests that an opening of a flexible lid and a
Institut de Biologie Structurale concomitant cysteine rotation are important for catalysis and the activation
Jean-Pierre Ebel, UMR 5075 of the catalytic cysteine of pilus-associated sortases.
(CEA, CNRS, UJF, PSB),
© 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.
41 rue Jules Horowitz,
F-38027 Grenoble, France
Received 25 June 2009;
received in revised form
24 August 2009;
accepted 25 August 2009
Edited by R. Huber Keywords: sortase; crystal structure; substrate recognition; catalysis; pili
Introduction one of the four major infectious disease killers,

together with HIV, malaria, and tuberculosis.1,2 S.
The human-specific pathogen Streptococcus pneu- pneumoniae is the main cause of respiratory tract
moniae (pneumococcus) is a primary cause of infections such as otitis media, sinusitis, and
morbidity and mortality worldwide and represents community-acquired pneumonia, and it is also an
important pathogen in invasive diseases such as
septicemia and meningitis. Invasive pneumococcal
⁎Corresponding authors. Department of Microbiology, disease is preceded by initial colonization of the
Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet, SE-171 77 nasopharynx, but the detailed mechanisms of
Solna, Sweden. adhesion are still not well understood.
E-mail addresses: [email protected]; Most bacterial pathogens have long filamentous
[email protected]. structures known as pili or fimbriae extending from
† C.M. and S.F. contributed equally to this work. their surface. These structures are often involved in
‡ B.H.-N. and A.A. are shared last authors. the initial adhesion of the bacteria to host cells and
0022-2836/$ - see front matter © 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Please cite this article as: Fabrice Neiers, et al., Two Crystal Structures of Pneumococcal Pilus Sortase C Provide Novel Insights into
Catalysis and Substrate Specificity, J. Mol. Biol. (2009), doi:10.1016/j.jmb.2009.08.058
ARTICLE IN PRESS
2 SrtC Crystal Structures and Substrate Specificity
tissues, as well as to other bacteria, during coloni- tip of pili but may also appear along the pilus
zation. Pilus expression mediates host cell responses stalk and in proximity of RrgA.12 RrgA has been
that depend on the host receptor being recognized shown to be the major pilus-associated adhesin of
and may also increase the host inflammatory pneumococcal pili, but RrgC may also have some
responses.3,4 Until recently, pili had only been binding functions.13
recognized as an attribute of Gram-negative bacteria In general, sortases can be described as mem-
in which they have been well characterized from the brane-associated transpeptidases that transfer and
genetic, biochemical, and structural perspectives. covalently link surface proteins to the peptidoglycan
During the last few years, some major human Gram- cell wall.14,15 The linkage mechanism is initiated by
positive bacterial pathogens have also been shown the cleavage between the threonine and glycine
to encode pili, and their biogenesis, structure, and residues of the conserved LPXTG motif (where X
function are now being investigated.3,5–9 represents any amino acid) in substrate proteins.15,16
Multiple-drug resistant S. pneumoniae strains have The C-terminal threonine of the surface protein is
emerged over the last 30 years, requiring rapid concomitantly linked to the sortase catalytic cyste-
development of novel preventive and therapeutic ine, after which it is incorporated to the cell wall
approaches including the development of protein- through the formation of an amide bond between
based vaccines.10 We have previously demonstrated the C-terminal threonine and the stem peptide of the
that globally spreading penicillin nonsusceptible peptidoglycan. 14 In contrast to these so-called
pneumococci belong to clonal lineages that fre- housekeeping sortases, pilus-associated sortases
quently carry pili, encoded by the rlrA pathogenicity covalently link the different subunits of the pilus
islet, suggesting that pili contribute to the successful to each other, resulting in the assembly of mature
spread of these clones.11 Pili enhance initial adhe- pili.5,8,17
sion as well as the subsequent capacity of the The relative contributions of pneumococcal-asso-
bacteria to cause pneumonia and bacteremia.3 The ciated sortases, SrtB, SrtC, and SrtD, have recently
rlrA pilus islet in S. pneumoniae encodes three surface been established.12 While SrtD did not polymerize
proteins, RrgA, RrgB, and RrgC, which form the any of the Rrg subunits, SrtB and SrtC were
pneumococcal pilus as well as three pilus-associated redundant in terms of their activity, as both were
sortases, SrtB, SrtC, and SrtD.3,12,13 The stalk of the able to polymerize RrgB in order to form the
pneumococcal pilus is composed of repeating units structural backbone of the pilus as well as link
of RrgB to which RrgA and RrgC are covalently RrgA to this backbone. However, in contrast to SrtB,
associated. The RrgA protein also occurs associated SrtC cannot incorporate RrgC to the pilus.12 SrtC
to the cell wall.3 RrgC is frequently present at the also differs from SrtB and SrtD in that the absence of
Fig. 1. Role of individual sortases in pilus biogenesis and cell wall anchoring. The production of polymeric high-
molecular-mass cell wall-associated pili in isogenic T4 mutants was evaluated by immunoblotting for RrgA (a), RrgB (b),
and RrgC (c). In all cases, cell wall proteins were separated by gradient SDS-PAGE, transferred to polyvinylidene fluoride,
and probed. Approximate molecular masses are indicated in kilodaltons to the left. The three images show
immunoblotting for RrgA (a), RrgB (b), and RrgC (c) in the wild-type TIGR4 (‘T4’); the single sortase mutant strain
T4ΔsrtA (‘ΔsrtA’); the double-mutant strains T4ΔsrtAB (‘ΔsrtAB’), T4ΔsrtAC (‘ΔsrtAC’), and T4ΔsrtAD (‘ΔsrtAD’); the
triple-mutant strain T4ΔsrtBCD (‘ΔsrtBCD’) that expresses only SrtA; the trans-complemented srtABCD quadruple-
mutant strains T4ΔsrABCD+lacE::srtB (‘ΔsrtABCD+srtB’), T4ΔsrABCD+lacE::srtC (‘ΔsrtABCD+srtC’), and T4ΔsrABCD+
lacE::srtD (‘ΔsrtABCD+srtD’); and the quadruple-mutant strain T4ΔsrABCD. The predicted molecular masses for the
RrgA (90 kDa) and RrgB (67 kDa) monomers are indicated by an asterisk. All four sortases are redundant in their capacity
to transfer pili and/or pilin monomers to the cell wall. SrtD shows an in vivo activity. SrtB and SrtC differ only in their
capacity to incorporate RrgC into the pilus.
ARTICLE IN PRESS
SrtC Crystal Structures and Substrate Specificity 3
either of the two latter enzymes, but not of SrtC, pneumococcal sortase in the genome still display
abrogates the focal presentation of pilus antigens at cell wall anchoring activity specific for pilin pro-
the bacterial cell surface.12 teins. Indeed, both SrtB and SrtC transfer pili to the
In the present study, we made use of single peptidoglycan, while SrtA and SrtD lacking pilus
sortase-expressing strains to assess the capacity of polymerization activity still link RrgA monomers
each of the S. pneumoniae-associated sortases (SrtB, and RrgB monomers (approximately 90 and 67 kDa,
SrtC, and SrtD as well as the housekeeping sortase respectively, after processing) to the cell wall (Fig. 1).
SrtA) to incorporate and link (or not) pilin mono- However, linkage of RrgB monomers to the cell wall
mers as well as the polymerized pilus to the seems to occur only if no or insufficient RrgB
peptidoglycan cell wall. We demonstrate that the polymerization activity is present. As previously
pilus-polymerizing enzymes SrtB and SrtC can described,12 an additional band corresponding to a
individually covalently anchor pilus polymers to processed RrgA protein with a smaller molecular
the cell wall, reducing the substrate differences mass (around 60 kDa) is observed in all strains
between these two sortases to their capacity to except for the wild type and the strain without any
incorporate (SrtB) or not (SrtC) the RrgC pilin sortase. This processing event remains to be
subunit into the pilus. Comparing the two crystal explained. As also previously described, 12 only
structures of the pilus-polymerizing sortase SrtC, SrtB is able to incorporate RrgC in pili (Fig. 1).
solved in this study, with the previously described Furthermore, RrgC monomers are not transferred to
three-dimensional structure of SrtB,18 which exhi- the cell wall by any sortase, suggesting that cell
bits different substrate specificities, as well as the surface exposure of this protein is strictly dependent
nonpolymerizing enzyme (but with pilin cell wall on SrtB-mediated linkage to either RrgA or RrgB. A
anchoring activity) SrtD provides novel insights into
the mechanisms underlying the activation of the
catalytic cysteine Cys221.
Table 1. Data collection and refinement statistics
SrtC (PDB SrtC (PDB
code 3G66) code 3G69)
Results
Data collection
Space group P212121 P212121
All three pilus-associated sortases of Cell dimensions
S. pneumoniae can recognize the peptidoglycan a, b, c (Å) a = 48.9, b = 96.9, a = 48.6, b = 96.5,
c = 98.9 c = 98.8
cell wall as substrate for pili and pilin monomers α, β, γ (°) α = β = γ = 90 α = β = γ = 90
Observed reflections 350,859 (46,799) 228,540 (28,510)
The first two steps within the proposed model of Unique reflections 52,404 (7580) 31,946 (4490)
pilus assembly in Gram-positive organisms consist Redundancy 6.7 (6.3) 7.2 (6.3)
of the covalent linking of individual pilin subunits Completeness (%) 99.8 (99.2) 99.2 (97.2)
Rmergea (%) 9.3 (51.7) 10.9 (30.5)
followed by the linkage of the polymerized pilus to I/σ(I) 14.6 (3.4) 16.1 (6.3)
the peptidoglycan cell wall.19 It has been demon-
strated in C. diphtheriae that housekeeping and pilus- Refinement
associated sortases are able to transfer pili to the cell Resolution (Å) 32.3–1.7 43.6–2.0
(1.74–1.70) (2.05–2.00)
wall.20 Furthermore, recent studies also indicated No. reflections 49,719 30,362
that the capacity of a S. pneumoniae strain lacking the Rwork/Rfreeb (%) 18.7/23.5 19.2/25.8
housekeeping sortase SrtA to link pili to peptido- No. atoms
glycan is not affected.21 We have demonstrated that Protein 3145 3126
a S. pneumoniae strain expressing only SrtA is able to Mes/ion 24 34
Water 557 467
transfer RrgA monomers to the cell wall.12 There- B-factors (Å2)
fore, we hypothesized that at least one of the pilus- Protein 20.3 23.7
associated sortases and the housekeeping SrtA are Mes 25.6 24.2
redundant in their capacity to covalently link pilin Sulfate ion — 37.8
Water 40.5 36.2
proteins to the cell wall peptidoglycan. R.m.s. deviations
In order to address this question and to further Bond lengths (Å) 0.015 0.023
determine the specificities of SrtC as compared to Bond angles (°) 1.74 2.13
SrtA, SrtB, and SrtD, pneumococcal strains lacking Ramachandran plot (%) 86.8, 11.1, 87.2, 10.4,
diverse combinations of the four sortases were (favored, allowed, 2.1, 0 2.4, 0
generous, disallowed)
constructed and analyzed for the presence of pili PDB code 3G66 3G69
and/or pilus subunits in the cell wall fractions. Our
results demonstrate that strains lacking SrtA or Values in parentheses are for highest-resolution shell.
a
Rmerge = ΣhklΣi||Ii(hkl) − {I(hkl)}||/ΣhklΣiIi(hkl), where Ii(hkl)
lacking a combination of SrtA and any of the pilus- is the ith observation of reflection hkl and {I(hkl)} is the weighted
associated sortases still contain pili in the cell wall average intensity for all observations i of reflection hkl.
b
fractions (Fig. 1). These data indicate that more than Rcryst and Rfree = (∑||Fo| − |Fc||)/(∑|Fo|), where |Fo| is
one pilus-associated sortase is able to catalyze the the observed structure-factor amplitude and |FC | is the
calculated structure-factor amplitude. Rfree is based on 5% of the
transfer of pilin proteins to the peptidoglycan. total reflections excluded from refinement.
Surprisingly, even strains that express only one
ARTICLE IN PRESS
quadruple-mutant strain, which does not express of SrtC, SrtB, and SrtD should highlight conserved
any of the pneumococcal sortases, does not contain features characteristic of pilus-specific sortases as
any pilin protein in the cell wall, demonstrating that well as allow the identification of key residues that
covalent linking of pili and/or pilin monomers to the dictate differences in substrate specificity.
peptidoglycan is strictly sortase dependent and that
no other factor/molecule can accomplish this pro- Overall structure of sortase C
cess (Fig. 1). Our mutation study provides the first
evidence for an in vivo enzymatic role of SrtD in pilus Two crystallization conditions were determined
biogenesis in that it is able to covalently link RrgA for SrtC.22 The two crystal structures were solved to
and RrgB proteins to the peptidoglycan. This 1.7- and 2.0-Å resolutions, respectively (Table 1). The
enzymatic activity of SrtD probably explains its two SrtC structures are identical except for sections
requirement for regular focal presentation of pilus of a loop encompassing residues 79–100 that form a
antigens on the bacterial surface.12 On the basis of lid, as well as for the conformation of the key
these results, the comparison of the crystal structures catalytic residue Cys221 . The fold of SrtC corresponds
Fig. 2. Topology diagram and overall view of the pilus-associated SrtC from S. pneumoniae. (a) The secondary
structure diagram of SrtC is displayed to the left with the β-strands in yellow and the 310- and α-helices in red. The N- and
C-termini of the enzyme are indicated by N and C, respectively. The lid specific to pilus-associated sortases is in cyan. The
figure was generated using the program TopDraw.23 An overall view of the crystal structures of the S. pneumoniae-derived
SrtC is presented to the right. The yellow-colored β-strands form the β-barrel core of the enzyme. Helices are colored in
red. The loop consisting of residues 79–100 and that links α2-helix and β1-strand forms a flexible lid that closes the active
site, and has different conformations in the two crystal structures of SrtC presented in this study. The loops found in the
crystal structures of SrtC (PDB code 3G66) and SrtC (PDB code 3G69) are colored cyan and blue, respectively. The N- and
C-termini of the enzyme are indicated by N and C, respectively. (b) The 2Fo − Fc electron densities (contoured at 1.0σ) of
the lid regions are displayed in blue for SrtC to the left (PDB code 3G69) and in cyan for SrtC (PDB code 3G66) to the right.
Residues 79 and 100 are indicated in the figure. Residues 79–100 that correspond to the lid regions of SrtC are shown in
stick mode, while the rest of the two structures are colored in transparent white.
ARTICLE IN PRESS
to the previously described β-barrel structure, different. The relative mobility is evidenced by the
specific for sortases, composed of eight anti-parallel poorer electron density for most of the side chains
β-strands linked by multiple α- and 310-helices and some of the main chain of the residues forming
(Figs. 2a and 3).24–28 However, in contrast to house- the lid (residues 79–85 and 89–100) (Fig. 2b). In
keeping sortases such as SrtA,24 the structure of SrtC contrast, the electron density of the central section of
contains a lid that is common to pilus-associated the lid (residues 86–88) that is anchored within the
sortases such as SrtB and SrtD in S. pneumoniae.18 active site through several interactions with key
As expected from the sequence identity (58%), the catalytic residues is well defined (Fig. 2a and b).
overall fold of SrtC is similar to the recently des- The relatively higher B-factor values observed for
cribed crystal structure of SrtB,18 with an average the lid regions in both crystal structures (41.2 and
root mean square deviation (rmsd) upon super- 45.7 Å2 on average for residues 79–100 in 3G66
position of all Cα atoms for the two structures of and 3G69, respectively) when compared to the
1.2 Å (Fig. 4). Despite lower sequence identity (27%), overall values (20.3 and 23.7 Å2 on average for
SrtC also resembles SrtD 18 (with an rmsd of 1.9 Å), 3G66 and 3G69, respectively) argue for a higher
although major localized differences can be noted mobility of the lid. The quality of the electron
such as the presence of an additional C-terminal density allows a well-defined positioning of most
helix in SrtD (Figs. 3 and 4). The active site is of the main-chain residues of the lid. Thus, the
localized on the external face of the β-barrel and is main chain of the lid can adopt at least two
closed by the lid (Fig. 2a). Although the lid feature different conformations, reflecting further the
is shared by SrtB and SrtD, its conformation is mobility of the lid (Fig. 2a and b).
Fig. 3. Sequence alignment of the pilus-associated sortases SrtC, SrtB, and SrtD from S. pneumoniae. The numbering
used for SrtB and SrtD is aligned on the numbering of the sequence of SrtC. The secondary structures are indicated for
each sortase with black arrows (β-strands) and red lines (310- and α-helices). Identical and similar residues are indicated
with black letters on yellow background and black letters only, respectively. The sequences were aligned using the
program Bioedit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).
ARTICLE IN PRESS
Fig. 4. All pilus-associated sortases from S. pneumoniae contain a lid that covers the active site. Structural comparison
of the three pilus-associated S. pneumoniae-derived sortases, SrtB (PDB code 2W1J), SrtC, and SrtD (PDB code 2W1K), and
the housekeeping sortase SrtA derived from Staphylococcus aureus (PDB code 1T2P). All three pilus-associated sortases
SrtB, SrtC, and SrtD from S. pneumoniae display an additional loop (blue) that closes the active site that is absent in the
housekeeping sortase SrtA from S. aureus. The superpositions of SrtC (purple) with SrtB (gold) and SrtD (gold) are
displayed at the bottom of the figure. The structures differ by the lid positioning and an additional helix in the C-terminal
region that is only present in SrtD.
ARTICLE IN PRESS
The tip of the lid is anchored within the active a sulfur-aromatic interaction between Cys221 and an
site through multiple interactions with key aromatic residue on the lid results in its anchoring
catalytic residues within the active site.
The carboxylate group of the side chain of Asp86 on Comparative structural analysis suggests a
the tip of the lid forms a salt bridge with a ‘fork-stick’ molecular mechanism for catalysis within the
geometry with the side chain of Arg230 within the active site
active site (Fig. 5).29 The sulfur atom of the catalytic
residue Cys221 forms a sulfur-aromatic interaction It has previously been demonstrated that Cys221 is
with the aromatic ring of Phe88, strengthening the essential for the catalytic activity of housekeeping
anchoring of the lid within the active site.30 Sulfur- and pilus-associated sortases. 12,32 However, the
aromatic interactions between cysteine and phenya- molecular mechanisms leading to the deprotonation
lanine residues have been described previously as a of Cys221 remain to be defined. The crystal struc-
combination of hydrophobic and electrostatic tures of SrtC indicate that the distance between
interactions.31 Interestingly, sulfur-aromatic interac- residues His159 and Cys221 (N5.1 Å) is not compatible
tions are also formed between the catalytic cysteine with a direct deprotonation via a thiolate–imidazo-
and a tryptophan or a phenyalanine residue on the lium pair. Omit map analysis of SrtC (PDB code
lids of SrtB and SrtD, respectively.18 This indicates a 3G66) demonstrates that Cys221 can adopt two
general mechanism for SrtC, SrtB, and SrtD in which different conformations within the active site of
Fig. 5. The catalytic cysteine residue Cys221 can take two different conformations within the active site of SrtC. (a) An
overview of the crystal structure of SrtC; the square indicates the region that is enlarged in (b) and (c). The active sites of
SrtC are presented in (b) (PDB code 3G66) and (c) (PDB code 3G69), respectively. While the catalytic cysteine Cys221
adopts two different conformations (modeled with 0.5 occupancy) in (b), the same residue adopts only one conformation
in (c). Electron density (contoured at 1.2 Å) is displayed in blue. Water molecules are indicated by red spheres and
hydrogen bonds are shown as broken lines with distances indicated in angstrom. The figure was generated using the
program PyMol (Delano Scientific LLC). In (d), a mechanism for the activation of the catalytic cysteine in the pilus-
associated sortases is proposed. The substrate binding can be the driving force that disrupts the stabilizing interaction
between the catalytic cysteine and the aromatic residue of the loop (Phe for SrtD and SrtC and Trp for SrtB) as observed in
the structure display in (c). The cysteine residue becomes available for proton transfer via a conserved water molecule
(similar to the structure shown in Fig. 4b), resulting in the formation of the active thiolate form.
ARTICLE IN PRESS
SrtC (Fig. 5b and c). One conformation of Cys221 resulting in the formation of a thioacyl intermediate.
forms sulfur-aromatic interactions with Phe88, while A similar relay between the nucleophilic group and
the second conformation forms a hydrogen bond the general base by a water molecule has been
interaction with a water molecule (WAT 74 ). It proposed before for β-lactamases.33 As also sug-
should be noted that a water molecule is localized gested by studies in housekeeping sortases,25 the
at exactly the same position in the crystal structures oxyanion formed on the thioacyl intermediate
of all three described pilus-associated sortases. A would probably be stabilized by interactions with
network of hydrogen bond interactions is formed Arg230 , which is conserved in all sortases. The
within this section of the active site, reaching from second step of the catalytic mechanism would lead
Cys221 to Glu130 . In addition to the hydrogen bond to the release of the cleaved peptide before the attack
interaction formed with Cys221 , WAT74 also forms of the thioacyl intermediate by an amine group
two hydrogen bond interactions with His159 and (from the side chain of the lysine residue in the case
Arg160. In turn, the nitrogen atom Nε of His159 forms of the pilin motif), resulting in the production of a
a hydrogen bond interaction with Glu130 (Fig. 5b). cross-linked peptide and the regeneration of the
Omit map analysis clearly shows that only one enzyme. Future determination of the thioacyl
conformation is present for Cys221 in the second intermediate of pilus-associated sortases should
crystal structure of SrtC (PDB code 3G69) (Fig. 5c). It provide a better understanding of this mechanism.
should be noted that the position of the water
molecule WAT 74 is conserved in both crystal Structural differences between SrtC and SrtB
structures of SrtC (Figs. 4c and 5b). Thus, other explain the incapacity of SrtC to incorporate
factors may result in the dual or single conforma- RrgC in the pilus
tions of Cys221 observed in the two crystal structures
of SrtC. The interaction with a substrate could open In order to build pili, pilus-associated sortases cut
the lid of SrtC, resulting in the disruption of sulfur- LPXTG-like motifs in Rrg molecules (YPRTG for
aromatic interactions between Phe88 and Cys221 and RrgA, IPQTG for RrgB, and VPDTG for RrgC). The
an increased propensity for the second conformation cleaved Rrg molecule is thereafter linked to a pili
of Cys221 to occur. The water molecule WAT74 motif such as YPKN, particularly in the case of
would then be able to transfer the proton from RrgB–RrgB linking.8 Subtle modifications within the
Cys221 to His159 , which is stabilized and properly active sites of SrtC and SrtB may explain the
oriented through hydrogen bond interactions with observed differences in the fine specificity and the
Glu130. The interactions with Glu130 could thereafter recognition of substrates by these two sortases.
result in an increase of the pKa of His159, allowing for While the active site of SrtB is mainly occupied by
its protonation (Fig. 5d). Cysteine proteases have the lid, surface analysis indicates the presence of an
been previously described to perform a nucleophilic empty pocket that could be used for substrate
attack on the carbonyl carbon at the scissile peptide recognition (Fig. 6a). Importantly, the correspon-
bond of the substrate by the thiolate form of Cys221, ding pocket is occupied by the side chain of residue
Fig. 6. Comparative structural analysis suggests a molecular explanation for the substrate specificity. Comparison of
the active sites of SrtB (PDB code 2W1J) (a) and SrtC (b) provides a structural explanation for the functional differences
observed between these two sortases. The side chains of the catalytic cysteines Cys221, as well as the side chains of residues
within and near the vicinity of the active site, are displayed. The side chain of the residue Phe88 localized on the lid of SrtC,
as well as the side chain of the corresponding residue Trp60 in SrtB, is displayed. The side chain of residue Arg160 in SrtC
forms hydrogen bond interactions with the side chain of the Asp172 and the oxygen atom of the main chain of Cys221.
Hydrogen bonds are shown as black broken lines with distances indicated in angstrom. The side chains of residues Thr160
and Thr172 in SrtB that correspond to Arg160 and Asp172 in SrtC, respectively, are smaller, creating a substrate pocket in the
active site of SrtB that is not present in SrtC. It should also be noted that the negatively charged residue Glu166 present
at the surface of SrtC within the vicinity of the active site is substituted to a positively charged lysine residue Lys166 in SrtB.
A superposition of SrtC (in red) and SrtB (in blue) is provided in (c). As indicated in (a) and (b), the majority of the residues
within the active site are conserved (represented in line mode) except for a few residues (represented in stick mode).
ARTICLE IN PRESS
Fig. 7. Substitution of Thr160 in SrtB to an arginine (as in SrtC) impairs its capacity to incorporate RrgC. Production of
polymeric high-molecular-mass cell wall-associated pili in isogenic T4 mutants was evaluated by immunoblotting for
RrgA (a), RrgB (b), and RrgC (c). Approximate molecular masses in kilodaltons are indicated to the left. The three images
show immunoblotting for RrgA, RrgB, and RrgC in the triple-mutant strain T4ΔsrtBCD (‘ΔsrtBCD’), the trans-
complemented srtBCD triple-mutant strain T4ΔsrBCD+lacE::srtB (‘ΔsrtBCD+srtB’), the srtBCD triple-mutant strain trans-
complemented with SrtB with the point mutation Thr160Arg T4ΔsrBCD+lacE::srtBT160R (‘ΔsrtBCD+srtB’T160R), and the
trans-complemented srtBCD triple-mutant strain T4ΔsrBCD+lacE::srtC (‘ΔsrtABCD+srtC’). Substitution of Thr160, one of
the few positions in SrtB differing with SrtC, to an arginine as in SrtC affects the capacity of the mutated SrtB to
incorporate RrgC.
Arg160 in the crystal structures of SrtC (Fig. 6b). The the Staphylococcus aureus-derived SrtA is localized
side chain of Arg160 in SrtC is stabilized through within a hydrophobic pocket,24 which can probably
double hydrogen bond interactions with the main protect against erroneous oxidation. In contrast, the
chain of Cys221 and the side chain of Asp 172 . corresponding catalytic cysteine is hidden by a lid in
Conversely, the positions corresponding to Arg160 the pilus-associated SrtB, SrtC, and SrtD, indicating
and Asp172 in SrtC are occupied by two threonines that unregulated oxidation is prevented through an
(Thr160 and Thr172) in SrtB (Fig. 6a and b). Indeed, alternative pathway. The two crystal structures of
repeated in vivo analysis of the effects of the SrtC presented within this study also indicate that
substitution of Thr160 to an arginine in SrtB clearly the lid is mobile and can take at least two different
reduces its capacity to incorporate RrgC in the pilus, conformations, suggesting a second important role
while its capacity to incorporate both RrgA and for the lid in the regulation of substrate accessibility
RrgB remains unaffected (Fig. 7). While the ob- to the active site.18 The presence of a lid, however,
served effect reveals the importance of Thr160 in does not strictly correlate to pilin–pilin transpepti-
SrtB, it also indicates that other residues such as dase activity, since SrtD, having a lid, lacks this
Thr172 may play a role in the specificity of SrtB in activity. Furthermore, it is not required for the
incorporating RrgC (Fig. 6b). enzyme to discriminate between peptidoglycan and
pilin substrates, since SrtB and SrtC, both having a
lid, can use both types of substrates. Also, SrtD,
Discussion which contains a lid, and SrtA, which most likely
lacks a lid in analogy to staphylococcal SrtA, can
The three-dimensional structures of pneumococ- both use peptidoglycan as substrate for anchoring
cal SrtC provide novel information regarding the of pilin. Our structural analysis indicates the dual
catalysis and the specificity of this enzyme. The conformation of the catalytic cysteine in SrtC as
catalytic cysteine of housekeeping sortases such as an intrinsic general property of pilus-associated
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sortases and suggests a general mechanism of The molecular mechanisms underlying the forma-
catalysis for the pilus-associated sortases described tion of the pilus still remain to be fully assessed. Our
here. Future pKa determination and in vitro kinetic results demonstrate cell wall anchoring activity of
studies should provide a better understanding of SrtB, SrtC, as well as SrtD. Analysis of the two three-
this mechanism that is probably similar for all three dimensional structures of SrtC suggests the mobility
pilus-associated sortases in pneumococci. of the lid specific to pilus sortases as well as its
The in vivo experiments provided in this study importance for the activation of the catalytic cysteine
demonstrate the dual functions of SrtC and SrtB residue. In vivo experiments demonstrate that the
comprising pilus building and LPXTG–cell wall only functional difference between SrtB and SrtC is
anchoring activity. From an evolutionary point of the incorporation of RrgC in the pilus. The structural
view, our results suggest the existence of a common comparison of SrtC and SrtB suggested the impor-
ancestor for pilus-associated and housekeeping tance of specific amino acids in the vicinity of the
sortases. Since the housekeeping function is con- active site for the observed functional differences
served among most known Gram-positive bacterial between these two sortases. Finally, comparison of
organisms, we hypothesize that the common ances- the two structures of SrtC suggests that rotation of
tor was a housekeeping sortase with a β-barrel the active-site cysteine close to a water molecule, in
structure fold. Pilus-associated sortases have most association with lid mobility, may allow for depro-
probably evolved from this common ancestor tonation of the cysteine, resulting in the thiolate
through the addition of structural features such form required for forming a thioacyl intermediate
as the lid and an additional α-helix in the case of with the substrate.
SrtD.
In this context, it may not be surprising to note
that the charge of the solvent-exposed lid is similar
when comparing SrtB and SrtC. Both lids possess a Materials and Methods
positively charged portion composed of three lysine
residues (positions 93–95), in contrast to the entire Bacterial strains, media, and growth conditions
lid in SrtD that is exclusively composed of hydro-
phobic or negatively charged residues (Fig. 3). The All the pneumococcal strains used within this study,
lid could play an important role in the interaction of including isogenic mutant derivatives, are described in
pilus-associated sortases with substrates, since it can Table 2. The insertion–deletion mutagenesis used for most
open or close access to the active site. The observed strains as well as the strategy to achieve complementation
differences in charge on the lid can represent in trans are described elsewhere.3,35 The primers used for
another important aspect that explains why SrtB each strain are indicated in Table 2, and all primers are
described in Table 3. All resulting strains were checked by
and SrtC act as pilus-polymerizing enzymes, in PCR, sequencing, and immunogenicity, thereby demon-
contrast to SrtD. strating a lack of polar effects of deletion of one subunit
Comparative analysis indicates that very few gene on the expression of other genes. Unless otherwise
residues differ between the active sites of SrtB and noted, bacteria were streaked from frozen stocks onto
SrtC. The crystal structures of SrtC reveal that the blood plates with appropriate selection for overnight
side chain of residue Arg160 in SrtC fills a substrate growth and inoculated briefly into pre-warmed DS
recognition pocket in the active site. Substitution of (dextrose–serum) medium (OXOID manual, 1990). DS
the corresponding residue Thr160 in SrtB to an was thereafter inoculated into pre-warmed C + Y medium
arginine demonstrates the essential role of this in order to achieve an absorbance of 0.05 when measured
residue for the incorporation of RrgC. Interestingly, at a wavelength of 620 nm. Cultures were permitted to
grow to mid-log (A620 = 0.4) at 37 °C without agitation
this pocket is also filled in SrtD by an arginine that before collection for experimentation.
forms hydrogen bond interactions with the catalytic
cysteine and an aspartate residue. This may provide
a structural explanation to the fact that SrtD is not Cell wall preparation and immunoblotting
able to incorporate RrgC into a pilus polymerized by
SrtC. The observed reduction of the in vivo capacity Cell wall-associated proteins were isolated from genet-
of the SrtB mutated variant to incorporate RrgC also ically defined strains of S. pneumoniae and analyzed as
indicates that other residues can be involved in the previously described.3
nonrecognition of RrgC by SrtC. Asp172, which
stabilizes the positioning of Arg160 in SrtC via a
hydrogen bond interaction, may play an important Protein expression and purification
role for the closing of the recognition pocket in SrtB.
Also, if we consider the size of the RrgC protein DNA encoding residues 46 to 267 of the SrtC protein
(30 kDa), the interaction might not be limited to the from S. pneumoniae (TIGR4, SP_0467) was cloned into the
NdeI and SacI restriction sites of the pET24c plasmid
sortase active site, but other residues involved in (Novagen). The resulting construct was transformed into
surface charge could also determine RrgC recogni- Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen) for over-
tion. The only difference in surface charge close to expression at 37 °C. The cultures were maintained at 37 °C
the active site is the positively charged Lys166 in SrtB for 12 h after induction with isopropyl-D-1-thiogalacto-
replaced by the negatively charged Glu166 in SrtC pyranoside. SrtC was purified following previously
(Fig. 6a and b). described procedures.22
ARTICLE IN PRESS
Table 2. Characteristics of strains or mutants used in the study

Strain/mutant Relevant characteristics Primers employed in construction Source/reference
T4 TIGR4 piliated invasive isolate Not applicable 3
T4ΔsrtA KanR, strain lacking srtA Upstream: SrtA-1 and SrtA-2; downstream: 34; this study
SrtA-3 and SrtA-4; Kan-resistance cassette
from Janus-fragment:
Dam406 and Kan-Rev-Apa
R R
T4ΔsrtAB Erm , Kan , strain lacking srtA SrtA-1/SrtA-4 fragment moved 12; this study
and srtB from T4ΔsrtA to T4ΔsrtB
T4ΔsrtAC ErmR, KanR, strain lacking srtA SrtA-1/SrtA-4 fragment moved 12; this study
and srtC from T4ΔsrtA to T4ΔsrtC
T4ΔsrtAD ErmR, KanR, strain lacking srtA SrtA-1/SrtA-4 fragment moved 12; this study
and srtD from T4ΔsrtA to T4ΔsrtD
T4ΔsrtBCD ErmR, strain lacking srtB, srtC, and Upstream: SrtB-1 and SrtB-2; 12
srtD, expressing srtA downstream: SrtD-3 and SrtD-4
T4ΔsrtBCD+ SpcR, ErmR, T4ΔsrtBCD containing Upstream: NlacEF and SpcR1; coding sequence: 12
lacE::srtB srtB in trans SrtB-aad9 and Sp0479-SrtB; downstream:
NlacER and Sp0479R
T4ΔsrtBCD+ SpcR, ErmR, T4ΔsrtBCD containing Upstream: NlacEF and SpcR1-EcoRI; coding sequence: 12
lacE::srtC srtC in trans SrtC5′-EcoRI and SrtC3′-HindIII; downstream:
NlacER and Sp0479R-HindIII
R R
T4ΔsrtBCD+ Spc , Erm , T4ΔsrtBCD containing Upstream: NlacEF and SrtBT131Rrev; downstream: This study
lacE::srtBT131R srtB in trans, Thr131 changed to Arg NlacER and SrtBT131Rfor; fragments from
T4ΔsrtBCD+lacE::srtB fused by overhang extension PCR
R R
T4ΔsrtABCD Erm , Kan , strain lacking SrtA-1/SrtA-4 fragment moved from 12; this study
srtA, srtB, srtC and srtD T4ΔsrtA to T4ΔsrtBCD
T4ΔsrtABCD+ SpcR, ErmR, KanR, quadruple-sortase SrtA-1/SrtA-4 fragment moved from T4ΔsrtA to 12; this study
lacE::srtB mutant strain containing srtB in trans T4ΔsrtBCD+lacE::srtB
lacE::srtC mutant strain containing srtC in trans T4ΔsrtBCD+lacE::srtC
lacE::srtD mutant strain containing srtD in trans T4ΔsrtBCD+lacE::srtD
Crystallization, data collection, and processing cryoprotected by adding 20% glycerol, followed by flash
cooling in liquid nitrogen. Data collection was performed
Purified SrtC was dialyzed against 50 mM Tris–HCl, under cryogenic conditions (T = 100 K), at beamline ID14-1
1 mM ethylenediaminetetraacetic acid and concentrated in European Synchrotron Radiation Facility (Grenoble,
thereafter to 10 mg ml− 1. Two different crystallization France) (λ = 0.934 Å) using an ADSC Q210 CCD detector.
conditions were established for SrtC. Orthorhombic The diffraction data were processed using MOSFLM.36
P212121 crystals appeared in sitting drop by vapor Data collection statistics for the data sets as well as cell
diffusion in 1.6 M magnesium sulfate and 0.1 M Mes dimensions of the two orthorhombic crystals of SrtC are
(pH 6.5) at 20 °C (crystal form A) and were also obtained presented in Table 1.
in hanging drops by vapor diffusion in 0.1 M Mes (pH 7.0)
and 1.9 M ammonium sulfate at 20 °C (crystal form B). The Structure determination and refinement
two crystal structures from SrtC were here termed by their
respective PDB codes, 3G66 (crystal form A) and 3G69
(crystal form B). Two microliters of a 10 mg/ml protein Both crystal structures of SrtC were solved by molecular
solution was mixed in 1 μl of the crystallization reservoir replacement using the PHASER program.37 Matthew
solutions for the hanging drops, and 0.1 μl of the same coefficient calculations suggested the presence of two
protein solution in 0.1 μl of the crystallization reservoir molecules in the asymmetric units for both crystals.38 The
solutions for the sitting drops. Both crystal forms were crystal structures of SrtC were determined using a
polyalanine model of SrtB (58% identity and PDB code
2W1J). Successive cycles of manual model building were
performed with COOT,39 with the rigid-body refinement
Table 3. Primers used in the study, with restriction in the initial steps and with the restrained refinement in
enzymes sites the later steps by using REFMAC.40 Five percent of the
reflections was set aside for monitoring the refinement by
Primer name Sequence Rfree.41 The loop (comprising residues 79–100) was built
SrtA-1 aggatgaggacttgattgaagaat manually in both crystal structures of SrtC. Besides
SrtA-2 ttttgggccctatgcttcaccttctgtttcgttt residues 255–267 at the C-terminal of SrtC, the loop
(ApaI site underlined) residues 90–97 and 96–98 in chains A and B of SrtC (PDB
SrtA-3 ttttggatcctacaaatcagtgaaatccatgatt code 3G66), respectively, could not be modeled due to the
(BamHI site underlined) poor quality of the electron density. Similarly, we were not
SrtA-4 tccgataaagtttccgatgaaagt able to model the side chains of residues 89–98 and 90–93
SrtBT131Rfor gtgattacggcacatagaggtttgccaacagct in chains A and B of SrtC (PDB code 3G69), respectively.
SrtBT131Rrev agctgttggcaaacctctatgtgccgtaatcac Two 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid molecules were
Dam406 tctatgcctattccagaggaaatggat
Kan-Rev-Apa ttttgggccctaaaacaattcatccagtaaaat
added in observed excess densities within both SrtC
(ApaI site underlined) crystal structures. The final rounds of refinement yielded
Rfree and Rcryst values of 23.5% and 18.7% for SrtC (PDB
ARTICLE IN PRESS
code 3G66) and 25.8% and 19.2% for SrtC (PDB code duce pilus-like structures containing protective anti-
3G69), respectively. The two models conform well to the gens and Lancefield T antigens. Proc. Natl Acad. Sci.
expected protein geometry and the rmsd of bond lengths USA, 102, 15641–15646.
from standard values for such resolutions (Table 1). The 7. Nallapareddy, S. R., Singh, K. V., Sillanpaa, J., Garsin,
stereochemistry of the models was analyzed with D. A., Hook, M., Erlandsen, S. L. & Murray, B. E.
PROCHECK.42 Refinement statistics are provided in (2006). Endocarditis and biofilm-associated pili of
Table 1. The secondary structure assignment was per- Enterococcus faecalis. J. Clin. Invest. 116, 2799–2807.
formed with DSSP.43 The SSM algorithm was used to 8. Ton-That, H. & Schneewind, O. (2003). Assembly of
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We gratefully acknowledge access to synchrotron
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radiation at beamline ID14-1 at the European 12. Falker, S., Nelson, A. L., Morfeldt, E., Jonas, K.,
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Résumé :
Streptococcus pneumoniae est un pathogène majeur chez l'homme, responsable
d’otites sévères, de pneumonies, de bactériémies et de méningites. C’est une cause majeure de
mortalité et de morbidité, essentiellement chez les enfants et les personnes âgées. Il a été
récemment découvert que certaines souches virulentes de S. pneumoniae portent à leur surface
des pili, considérés comme un important facteur de virulence. Cependant, contrairement aux
bactéries à Gram-négatif, peu de choses sont connues sur la structure des pili des bactéries à
Gram-positif. Les gènes requis pour la production des pili chez S. pneumoniae sont localisés
sur un îlot de pathogénicité et codent pour 3 sortases (SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3) et 3 protéines
structurales (RrgB, qui forme le corps du pilus, RrgA et RrgC). Celles-ci contiennent un motif
LPXTG, motif de reconnaissance des enzymes sortases.
Dans ce travail, nous apportons de nouvelles informations structurale, biochimique et
microbiologique sur le mécanisme de formation du pilus par (1) une reconstitution du corps
de la fibre in vitro après avoir identifié SrtC-1 comme étant la principale pilus-polymérase;
(2) une étude de microscopie électronique montrant que les fibres produites in vitro mimaient
structuralement les pili ; (3) une étude in vivo confirmant les résultats obtenus in vitro; (4) la
résolution de la structure par cristallographie aux rayons X de SrtC-1 et SrtC-3 qui révèle un
site actif dont l’accès est contrôlé par un couvercle flexible, contrairement aux sortases non
impliquées dans la biogenèse de pili. Ces observations suggèrent que la spécificité de substrat
est dictée par une reconnaissance de surface couplée à une ouverture du couvercle. Dans un
second temps, nous avons caractérisé la région du site actif de SrtC-1 : la triade catalytique
mais aussi les deux résidus du couvercle qui s’ancrent dans le site actif. L’identification de
résidus clés dans l’activité sortasique aussi bien que dans la stabilisation structurale a été ainsi
mis en évidence.
Abstract :
Streptococcus pneumoniae, a piliated pathogen, is the causative agent of otitis,
pneumonia, bacteremia, and meningitis, and is a major cause of community-acquired
illnesses, especially in the very young and the elderly. Pili have been shown to play key roles
in pneumococcal infection, and although the pilus biogenesis mechanism has been well
studied in Gram-negative bacteria, it remains poorly understood in Gram-positive species.
Pilus assembly in S. pneumoniae involves a membrane-associated macromolecular machinery
encoded on a single pathogenicity islet, and includes the backbone fiber protein (RrgB), two
minor pilins (RrgA and RrgC), and three dedicated sortases (SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3). These
pilin subunits contain the recognition LPXTG motif of sortases.
Here, we provide structural, biochemical, and microbiological insight into this novel
pilus formation mechanism by (1) reconstituting the main backbone fiber of the
pneumococcal pilus in vitro upon identification that SrtC-1 acts as the main pilus-polymerase
and can form RrgB fibers; (2) employing electron microscopy in order to visualize fibers
produced in vitro and showing that they structurally mimic the pneumococcal pilus backbone;
(3) confirming this result in vivo; (4) solving the high resolution crystal structures of SrtC-1
and SrtC-3 which reveal active sites whose access is controlled by flexible lids, unlike in non-
pilus sortases, suggesting that substrate specificity is dictated by surface recognition coupled
to lid opening. In addition, we characterize the catalytic triad present in the sortase active site
as well as lid residues, and identify key amino acids which are relevant for sortase activity as
well as structural stabilization.

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DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ JOSEPH FOURIER

Discipline : Biologie Structurale

Présentée et soutenue publiquement par

Caractérisation structurale et fonctionnelle des

Dr. Anne IMBERTY Présidente de jury

Thèse préparée au Laboratoire des Protéines Membranaires (LPM) de l’Institut de Biologie

II. Les facteurs de virulence du pneumocoque ...................................................................................................10

III. Les pili, organelles de surface bactériens .....................................................................................................16

CONTEXTE ET OBJECTIF DES TRAVAUX............................................................ 44

MATERIEL ET METHODES ..................................................................................... 47

II. Biochimie .............................................................................................................................................................50

III. Analyses biophysiques .....................................................................................................................................53

IV. Études cristallographiques des protéines SrtC-1, SrtC-3 et RrgB ...........................................................58

III. Caractérisation de la région du site actif de SrtC-1..................................................................................100

IV. Formation in vitro d’un complexe covalent entre SrtC-1 et RrgB..........................................................108

V. Étude structurale de RrgB..............................................................................................................................111

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES.................................................................... 114

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES................................................................... 120

PUBLICATIONS ..................................................................................................... 137

En 1881, Sternberg, aux Etats-Unis, et Pasteur, en France, ont décrit indépendamment

S. pneumoniae, communément appelé pneumocoque, est une bactérie à Gram-positif,

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I.2.1. Les infections associées

I.2.2. Le processus de l’infection

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I.3.2. Les antibiotiques

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L'émergence et la diffusion de la résistance aux antibiotiques chez Streptococcus

II. Les facteurs de virulence du pneumocoque

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II.1. Les polysaccharides capsulaires

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Figure 4 : Vue de la capsule polysacharridique

II.2. La paroi bactérienne

La paroi est composée du peptidoglycane, d’acides teichoïques (polymères contenant de

II.3. Les protéines pneumococciques

Le pneumocoque possède de nombreuses protéines jouant un rôle dans la pathogénie,

II.3.1. La protéine de surface PspA

II.3.2. L’adhésine CbpA

Des souches mutées de S. pneumoniae ne produisant plus la protéine CbpA présentent

La pneumolysine est une cytotoxine initialement présente dans le cytoplasme de toutes

II.3.6. L’autolysine LytA

LytA est une enzyme intervenant dans la dégénérescence de la paroi bactérienne en

II.4. Les pili

Figure 5 : Microscopie électronique de

III. Les pili, organelles de surface bactériens

III.1. Les pili des bactéries à Gram-négatif