Iso 20838 2006

NORME ISO
INTERNATIONALE 20838
Première édition
2006-04-15
Microbiologie des aliments — Réaction

de polymérisation en chaîne (PCR) pour
la détection des micro-organismes
pathogènes dans les aliments —
Exigences relatives à l'amplification et à
la détection pour les méthodes
iTeh STANDARD
qualitativesPREVIEW
(standards.iteh.ai)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain
reactionISO(PCR) for the detection of food-borne pathogens —
20838:2006
Requirements for amplification and detection for qualitative methods
https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/a034735d-61e1-41c2-9024-
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Numéro de référence
ISO 20838:2006(F)
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E-mail [email protected]
Web www.iso.org
Publié en Suisse
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ISO 20838:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos..................................................................................................................................................... iv
Introduction ........................................................................................................................................................ v
1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1
2 Références normatives ........................................................................................................................ 1
3 Termes et définitions............................................................................................................................ 2
4 Principe .................................................................................................................................................. 2
5 Réactifs .................................................................................................................................................. 2
6 Appareillage et matériel ....................................................................................................................... 4
7 Mode opératoire .................................................................................................................................... 4
8 Interprétation ......................................................................................................................................... 6
9 Performances ........................................................................................................................................ 7
10 Rapport d'essai ..................................................................................................................................... 7
Bibliographie ...................................................................................................................................................... 8
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ISO 20838:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'ISO 20837 a été élaborée par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires —
Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l'Accord de
coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
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ISO 20838:2006(F)
Introduction
L'amplification et la détection de séquences d'acide nucléique cible sont réalisées afin de détecter la présence
éventuelle de certaines séquences d'acides nucléiques dans la prise d'essai. Cette détermination dépend du
caractère approprié des témoins et des limites de détection de la méthode analytique utilisée et de la prise
d'essai analysée.
La présente Norme internationale décrit le mode opératoire permettant de détecter les micro-organismes
pathogènes présents dans les aliments par une analyse des acides nucléiques extraits d'aliments, d'aliments
pour animaux et d'échantillons environnementaux, ou de cultures ou de suspensions cellulaires préparées à
partir de l'aliment. Les modes opératoires appropriés relatifs à la préparation des échantillons, la mise en
culture des micro-organismes et l'extraction des acides nucléiques font l'objet d'une description séparée dans
l'ISO 20837.
La présente Norme internationale s'intéresse essentiellement aux méthodes d'amplification par PCR.
Cependant, au vu des évolutions constantes de la technologie relative à ce domaine, d'autres techniques
d'amplification et méthodes de détection peuvent être envisagées.
La présente Norme internationale fait partie d'une série de normes et d'une Spécification technique réunies
sous le titre générique Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
détection de micro-organismes pathogènes dans les aliments
La présente Norme internationale(standards.iteh.ai)

fait partie d'une série de normes et d'une Spécification technique réunies
sous le titre générique Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
détection de micro-organismes pathogènes dans les aliments:
ISO 20838:2006
⎯ Exigences générales et définitions (ISO 22174);
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⎯ Exigences relatives à la préparation des échantillons pour la détection qualitative (ISO 20837);
⎯ Critères de performances pour les thermocycleurs (ISO/TS 20836);
⎯ Exigences relatives à l'amplification et à la détection pour des méthodes qualitatives (ISO 20838).
L'Organisation internationale de normalisation (ISO) attire l'attention sur le fait qu'il est déclaré que la
conformité avec les dispositions du présent document peut impliquer l'utilisation d'un ou plusieurs brevets
intéressant la technologie PCR.
L'ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à la portée de ces droits de propriété.
L'ISO a été informé que les sociétés Applied Biosystems, Roche Molecular Systems Inc., et F. Hoffmann-La
Roche Ltd., détiennent des droits de propriété concernant la technologie PCR. Les sociétés précitées ont
donné l'assurance à l'ISO qu'ils consentent à négocier des licences avec des demandeurs du monde entier, à
des termes et conditions raisonnables et non discriminatoires. À ce propos, la déclaration des détenteurs de
ces droits de propriété est enregistrée à l'ISO. Des informations peuvent être demandées à:
Licensing Department
Applied Biosystems
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404
États-Unis
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et
Roche Molecular Systems, Inc.

Licensing Department
1145 Atlantic Avenue
Alameda, CA 94501
États-Unis
L'attention est d'autre part attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire
l'objet de droits de propriété autres que ceux qui ont été mentionnés ci-dessus. L'ISO ne saurait être tenue
pour responsable de l'identification de ces droits de propriété en tout ou partie.

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NORME INTERNATIONALE ISO 20838:2006(F)
Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en

chaîne (PCR) pour la détection des micro-organismes
pathogènes dans les aliments — Exigences relatives à
l'amplification et à la détection pour les méthodes qualitatives
AVERTISSEMENT — L'utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer l'intervention de

produits, d'opérations et d'équipements à caractère dangereux. La présente norme n'a pas la
prétention d'aborder tous les problèmes de sécurité concernés par son usage. Il est de la
responsabilité de l'utilisateur de la présente norme d'établir des règles de sécurité et d'hygiène
appropriées et de déterminer l'application des restrictions réglementaires avant utilisation.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale fournit le cadre de travail général des méthodes qualitatives pour la
détection des micro-organismes pathogènes présents dans les aliments à l'aide de la réaction de
polymérisation en chaîne (PCR).
Elle concerne les exigences générales(standards.iteh.ai)
relatives à l'amplification spécifique des séquences d'acide nucléique
cible et à la détection et la confirmation de la nature de la séquence d'acide nucléique amplifiée.
ISO 20838:2006
Les lignes directrices, les exigences minimales et les caractéristiques de performances décrites dans la
présente Norme internationale visent à garantir l'obtention de résultats comparables et reproductibles dans
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des laboratoires différents.
La présente Norme internationale a été conçue pour les micro-organismes pathogènes présents dans les
aliments et les matrices alimentaires ou isolés de ces derniers, mais elle peut également s'appliquer à
d'autres matrices, par exemple les échantillons environnementaux, ainsi que pour la détection d'autres micro-
organismes.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 16140, Microbiologie des aliments — Protocole pour la validation des méthodes alternatives
ISO 22174:2005, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la
recherche de micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
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3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO 22174 s'appliquent.
4 Principe
4.1 Généralités
Pour les besoins de la présente Norme internationale, l'analyse qualitative comprend le dépistage global et/ou
la détection spécifique des séquences d'acides nucléique cible dans les échantillons d'essai. La spécificité
peut être définie au niveau du genre, de l'espèce, ou à un niveau taxonomique inférieur.
Un résultat qualitatif doit indiquer clairement la présence ou l'absence de la séquence cible étudiée, en
fonction des témoins appropriés et dans les limites de détection de la méthode analytique utilisée et de la
prise d'essai analysée.
L'analyse est généralement constituée des opérations suivantes:
a) l'amplification par PCR des séquences cibles spécifiques;
b) la détection du produit PCR;
c) la confirmation de l'identité du produit PCR; et/ou

d) la confirmation au moyen d'une méthode de culture microbiologique normalisée (par exemple une Norme
internationale). (standards.iteh.ai)
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5 Réactifs https://standards.iteh.ai/catalog/standards/sist/a034735d-61e1-41c2-9024-
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Dans tous les cas, les réactifs utilisés doivent être de qualité analytique et adaptés à des applications de
biologie moléculaire. Il est généralement recommandé de préparer des aliquotes des solutions de réaction
nécessaires à une méthode PCR et de les conserver dans des conditions appropriées, par exemple à −20 °C.
5.1 ADN polymérase
Une polymérase thermostable (comprenant éventuellement une activité de transcriptase inverse) est utilisée
pour la PCR. Il peut s'agir d'une enzyme naturelle purifiée ou d'une forme transgénique de l'enzyme,
recombinée et purifiée.
Il convient de l'utiliser conformément aux instructions du fabricant.
Chaque ADN polymérase peut nécessiter des conditions expérimentales différentes, par exemple tampon,
température.
5.2 Transcriptase inverse
Cette enzyme est utilisée pour la transcription de l'ARN en ADN complémentaire (ADNc) simple brin pouvant
être ultérieurement amplifié par PCR.
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5.3 Solution tampon de réaction
Il convient d'utiliser la solution tampon appropriée conformément aux instructions du fabricant de l'enzyme.
Des réactifs prêts à l'emploi sont disponibles dans le commerce. Les matériaux utilisés pour la préparation
d'une solution tampon de réaction de PCR doivent être stables dans les conditions de stockage et de
thermocyclage.
5.4 Désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP), pour PCR
Des solutions contenant les désoxyribonucléosides triphosphates dATP, dCTP, dGTP, dTTP et/ou dUTP,
selon le cas, de qualité requise pour la biologie moléculaire doivent être utilisées. Elles doivent rester stables
pendant la période de conservation et dans les conditions de la PCR. Elles sont disponibles dans le
commerce.
5.5 Amorces
Il convient de choisir les amorces à partir d'une séquence conçue spécifiquement pour détecter l'ADN du
micro-organisme cible.
5.6 Eau
Pour la réaction d'amplification, il convient de toujours utiliser de l'eau exempte de DNase et de RNase. De
l'eau ultrapure appropriée est disponible dans le commerce.
5.7
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Chlorure de magnésium (MgCl ) 2
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Ce composé est fourni sous forme soit d'un composant de la solution tampon de réaction, soit d'une solution
séparée.
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5.8 Produits chimiques pour la détection des produits PCR
Il convient que les produits chimiques utilisés pour le système de détection décrit dans une méthode PCR
soient de qualité appropriée.
5.9 Réactifs supplémentaires optionnels
5.9.1 Huile minérale
Elle est distribuée sur le mélange réactionnel afin de minimiser l'évaporation au cours des cycles thermiques
de la PCR.
5.9.2 Activateurs
Il s'agit de substances telles que le polyéthylèneglycol ou l'albumine de sérum bovin qui peuvent être ajoutées
à la réaction de PCR pour réduire l'effet inhibiteur de substances issues de la matrice [1].
5.9.3 Inhibiteurs de ribonucléase (RNase)
Ils sont ajoutés lors d'une RT-PCR afin d'empêcher la dégradation de l'ARN cible par des RNases
susceptibles d'avoir contaminé les réactifs ou le matériel plastique utilisé lors de l'opération d'extraction. Les
inhibiteurs de RNase sont disponibles dans le commerce.
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⎯ Critères de performances pour les thermocycleurs (ISO/TS 20836);

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Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en

AVERTISSEMENT — L'utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer l'intervention de

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L'analyse est généralement constituée des opérations suivantes:

a) l'amplification par PCR des séquences cibles spécifiques;

b) la détection du produit PCR;

c) la confirmation de l'identité du produit PCR; et/ou

5.1 ADN polymérase

Il convient de l'utiliser conformément aux instructions du fabricant.

5.2 Transcriptase inverse

Il convient de l'utiliser conformément aux instructions du fabricant.

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5.3 Solution tampon de réaction

Il convient de l'utiliser conformément aux instructions du fabricant.

5.4 Désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP), pour PCR

5.9 Réactifs supplémentaires optionnels

5.9.1 Huile minérale

5.9.3 Inhibiteurs de ribonucléase (RNase)

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