Le clonage

Le clonage désigne principalement le processus de multiplication d'un organisme, d'une cellule

souche ou d'un gène, en grand nombre d'exemplaires identiques (soit in vitro, soit in vivo)
En biotechnologie, le clonage désigne la reproduction en laboratoire de gènes, cellules ou
organismes à partir d'une même entité originale. Par conséquent, il est possible de
produire des copies génétiques exactes du gène, de la cellule ou de l'organisme original
il est également possible de cloner un gène ou un fragment d'ADN. Cette opération, appelée
clonage moléculaire, Elle repose sur un ensemble de techniques de génie génétique qui
permettent d'isoler et de reproduire des gènes.
Le clonage moléculaire est une des bases du génie génétique. Il consiste à isoler un
fragment d'ADN et à le multiplier à l'identique en l'« insérant » dans une molécule
d'ADN « porteuse » appelée vecteur permettant son amplification .
L'« insertion » est souvent réalisée à l'aide d'un vecteur, les plus communément utilisés
étant les virus ou les plasmides
Cloner un gène consiste donc à l’insérer dans un plasmide. Un clone sera le
transformant bactérien qui contient ce plasmide particulier. Dans ce cas on parle de
clone car tous les individus de la colonie bactérienne sont génétiquement identiques.
Le clonage moléculaire est donc différent du clonage reproductif (créer un individu
génétiquement identique à un autre mais d'un âge différent) ou du clonage
thérapeutique (fabriquer des tissus à partir de cellules souches pour effectuer des
greffes compatibles avec le receveur).
L'opération consiste alors à introduire un fragment d'ADN d'intérêt (par exemple le gène
que l'on souhaite étudier) dans un organisme unicellulaire. Le plus souvent on utilise
comme organisme hôte une bactérie (la plus communément utilisée étant la bactérie
Escherichia coli) ou un champignon unicellulaire : la levure Saccharomyces cerevisiae. On
tire ainsi profit des capacités de multiplication végétative et de la grande vitesse de
prolifération de ces dernières pour reproduire à l'identique un très grand nombre de
copies de ce fragment d'ADN.
Pour cela, le fragment d'ADN est au préalable introduit dans une construction que l'on
appelle vecteur ou plasmide. Ce plasmide est une molécule d'ADN circulaire qui permet à
la fois d'introduire la séquence d'ADN à étudier dans le microorganisme récepteur mais
aussi d'assurer le maintien de ce fragment d'ADN d'intérêt dans la cellule hôte de
génération en génération au cours des divisions cellulaires.
 Les vecteurs de clonage

 Vecteur est une séquence d'ADN permettant la propagation, la

sélection, la modification d'une séquence d'ADN d'intérêt. En
bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'ADN isolée.

 Clonage
- pour amplifier et conserver une séquence d’ADN
- pour exprimer une séquence d’intérêt
- pour introduire un gène dans des cellules ou des organismes
- pour produire une protéine d’intérêt

 ADN génomique est le support physique de l'ensemble des

gènes de la cellule.

 ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.

2. Utilité
● Permet de conserver une séquence d'ADN donnée.
● Permet de la multiplier pour en accroître la quantité.
● Permet de la modifier pour y introduire des mutations,
délétions.
● Permet de la réintroduire dans des cellules.

3. Principe
● Un Vecteur Circulaire
Linéaire

● Une Cellule hôte Procaryote

Eucaryote

●Un fragment d'ADN ADN génomique

d'intérêt. ADNc
Les caractéristiques d'un vecteur de clonage idéal
 Principes généraux d’utilisation d’un vecteur
1. préparation de l’insert à cloner (fragment d’ADN d’intérêt) et du vecteur
2. Intégration - ligation de l’insert dans le vecteur (Une enzyme, la ligase, est capable de
lier de façon covalente deux molécules d’ADN en une).
3. transformation de l’hôte par le vecteur recombiné
4. sélection des hôtes recombinants
 Différents vecteurs pour différentes utilisations
Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut être cloné dans chaque vecteur

VECTEURS HOTE INSERT (Kb)

Plasmides Bactérie 10

Phage lambda Bactérie 25

Cosmide Bactérie 45

Phage P1 Bactérie 100

BAC (bacterial artificial chromosome) Bactérie 300

YAC (yeast artificial chromosome) Levure 1000

 Les plasmides comme vecteurs de clonage
Molécule d’ADN de taille réduite, d'origine bactérienne
Molécule d’ADN circulaire – taille 2kb à 5kb
Peut integrer jusqu’à 10kb d’ADN exogène
Peut être considérée comme un minichromosome capable de réplication autonome
Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques = sélection
 Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes
Après purification du plasmide contenant le fragment d'ADN d'intérêt, on l’ introduit dans des
bactéries, dites de clonage
La première étape est la préparation des bactéries à la transformation, nommée acquisition
de la compétence des bactéries. Cette étape vise à fragiliser la membrane des bactéries
pour faciliter l’entrée du plasmide. Il existe plusieurs méthodes pour induire la compétence:
Compétence par électroporation :
la suspension de cellules à transformer ainsi que l’ADN à transfecter sont placés dans une
cuve à électroporer. (Lors de l’électroporation, un champ électrique de l'ordre de 1000 à 10
000 volts par centimètre est appliqué pendant quelques millisecondes. Ceci fait augmenter
la tension à travers la membrane jusqu'à 0,5-1 volt. Puis, les cellules sont placées dans des
plaques de culture, agitées pendant une heure et incubées toute la nuit à 37°C).
Compétence par une méthode chimique : il existe de nombreuses méthodes de compétence
par une méthode chimique. Exemple la méthode MgCl2–CaCl2: Les cellules sont incubées
dans la glace dans une solution de MgCl2 pendant 10 minutes, puis lavées et incubées dans
la glace dans une solution de CaCl2 pendant 30 minutes. Ensuite, les cellules sont rincées et
resuspendues dans une solution de CaCl2 et de glycérol. Dans un second temps, les bactéries
compétentes sont mélangées avec les plasmides contenant le gène d’intérêt et incubées
dans la glace pendant 30 minutes. Puis, un choc thermique de 42°C est appliqué aux cellules,
qui sont ensuite immédiatement placées dans la glace pendant 2 minutes. Enfin, les cellules
sont placées dans du milieu de culture et incubées à 37°C toute la nuit.
 Identification des clones intéressants
Les plasmides utilisés pour les transfections contiennent le plus souvent un gène de
résistance à un antibiotique qui permet la sélection des bactéries recombinantes .
La sélection des bactéries avec un insert peut se faire par la manière suivante :
La sélection blanc/bleu :
le plasmide peut être construit de telle façon que le gène
d’intérêt soit inséré à l’intérieur du gène de la β-galactosidase.
En présence de Xgal (un substrat de la β-galactosidase), les
bactéries possédant un plasmide ayant un gène de la β-
galactosidase intact (et donc n’ayant pas intégré le gène
d’intérêt) produisent un produit bleu.
Celles ne possédant pas un plasmide ayant un gène de la β-
galactosidase intact (et donc ayant intégré le gène d’intérêt)
ne produisent rien en réponse au substrat Xgal, et les colonies
restent donc blanches. Il faut donc sélectionner les colonies
blanches.
Insertion d'un fragment d'ADN
(< 10 kb) dans un vecteur de
deuxième génération (type
pUC).
L'inactivation insertionnelle du
gène lacZ permet de révéler
facilement les colonies
contenant le gène d'intérêt
(sélection positive: colonies
blanche).
Le milieu de sélection est
supplémenté par l'ampicilline.
 Les phages comme vecteurs de clonage
Deux phages ont été très utilisés comme vecteurs dans les premiers temps de la biologie
moléculaire. Ce sont les phages λ (lambda) et le phage M13, ou plus exactement des dérivés de ces
deux phages qui doivent en effet subir divers types de modifications pour pouvoir être utilisés comme
vecteurs de clonage
Le bactériophage λ ou phage entérobactérien λ (phage lambda, coliphage λ) est un virus bactérien, ou
bactériophage, qui infecte l'espèce bactérienne Escherichia coli. Ce virus est tempéré et peut résider
dans le génome de son hôte par lysogénie. Ce phage a donné naissance aux premiers vecteurs de types
phagiques car:
- sa biologie est bien connue
- La quantité d'ADN qu'il peut intégrer est plus importante que celle véhiculée par les vecteurs
plasmidiques. Il est possible d'insérer jusqu'au 22kb, après élimination de la partie indispensable au
cycle de vie du phage.
- La possibilité d'empaqueter in vitro l'ADN phagique nu recombinant dans les têtes de phage.
- Il a une capacité d'infection (transfection) de l'hôte très rapide.
- Le nombre de copies par cellule étant considérable.
- Le rendement de cette transfection est très supérieur à celle qui est obtenu lors de la transformation
de la bactérie par les plasmides.
A chaque extrémité 5' se trouve une région monocaténaire
de 12 nucléotides, l'une complémentaire de l'autre et leur
association donne une structure circulaire à l'ADN dans la
cellule hôte.
L'association de ces extrémités cohésives naturelles forme le
site cos.
[cos: Des éléments important pour la réplication et
l'encapsidation de bactériophage λ]
Les YACs comme vecteurs de clonage
 16. Applications des vecteurs

- Clonage et amplification d’une séquence d’ADN

- Création des banques d’ADN génomiques et d’ADNc

- Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou des organismes (animaux

transgéniques)

- Production d’ARN

- Production de protéines codées par les gènes insérés

- Production de protéines humaines à but thérapeutique

- Facteur VIII de la coagulation dans l’hémophilie A, Hormone de croissance , Insuline…