RÉPUBLIQUE DU CAMEROUN REPUBLIC OF CAMEROON

Paix-Travail-Patrie Peace-Work-Fatherland
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UNIVERSITÉ DE DSCHANG UNIVERSITY OF DSCHANG
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École doctorale Post-graduate school

DSCHANG SCHOOL OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

UNITE DE RECHERCHE DE BIOCHIMIE DES PLANTES MEDICINALES DES

SCIENCES ALIMENTAIRES ET NUTRITION (URBPMAN)

Sujet:

Sélection de bactéries probiotiques du microbiote intestinal

pour la lutte contre la dysbiose et les maladies associées

Projet rédigé en vue de l’obtention du grade de Docteur/Ph.D en Biochimie

Option : Nutrition et Sécurité Alimentaire

Spécialité : Biotechnologie Alimentaire
Par :

DJODJEU KAMEGA Lysette Chabrone

Matricule : CM-UDS-16SCI0452
Master of Science (MSc) en Biochimie

Sous la direction de :
KAKTCHAM Pierre Marie, Ph.D
(Maître de Conférences)
Université de Dschang

Année académique 2022-2023

1
 Table des matières
Table des matières ....................................................................................................................... i
Liste des abréviations ................................................................................................................ iii
Résumé ...................................................................................................................................... iv
Abstract ...................................................................................................................................... v
Introduction ................................................................................................................................ 1
Matériel et méthodes .................................................................................................................. 4
I. Caractérisation des bifidobactéries et lactobacilles isolés des fèces de nourrissons dans la
région de l’Ouest-Cameroun ...................................................................................................... 4
I.1. Population d’étude, considérations éthique et collecte d'échantillons ............................. 4
I.1.1. Lieu de l’étude....................................................................................................... 4
I.1.2. Période de l’étude .................................................................................................. 4
I.1.3. Population cible ..................................................................................................... 4
I.1.4. Critères de sélection des sujets .............................................................................. 4
I.1.5. Stratégie de recrutement de la population ............................................................. 4
I.1.6. Collecte des échantillons de fèces ......................................................................... 5
I.2. Isolement et pré identification des isolats ........................................................................ 5
I.2.1. Isolement ............................................................................................................... 5
I.2.2. Pré-identification des isolats ................................................................................. 5
I.3. Etude de l’activité anti bactérienne des isolats................................................................. 6
I.3.1. Antagonisme bactérien entre les différents isolats ................................................ 6
I.3.2. Evaluation de l’activité antimicrobienne des surnageants de culture ................... 6
I.3.3. Evaluation de l’effet des enzymes protéolytiques et non protéolytiques sur
l’activité des SCN ........................................................................................................... 7
I.4. Evaluation de l’innocuité des isolats ................................................................................ 7
I.4.1. Activité hémolytique ............................................................................................. 7
I.4.2. Production de gélatinase ....................................................................................... 7
I.4.3. Production d'amines biogènes ............................................................................... 7
I.5. Identification des souches bactériennes par séquençage de L’ARNr 16S ............... 8
II. Caractérisation fonctionnelle des propriétés probiotiques et immunomodulatrices des
souches.................................................................................................................................... 8
II.1. Sensibilité aux antibiotiques ................................................................................... 8
II.2. Evaluation in vitro de l’aptitude des souches à résister au suc gastrique et intestinal
simulé...................................................................................................................................... 8

i
 II.3. Déconjugaison des sels biliaires ..................................................................................... 9
II.3.1. Criblage des souches productrices d'hydrolase des sels biliaires ........................ 9
II.3.2. Activité hydrolase des sels biliaires ..................................................................... 9
II.4. Evaluation de la production d'exopolysaccharides ......................................................... 9
II.5. Réduction du 2,2-diphényl-1-picryl hydrazyle ............................................................... 9
II.6. Evaluation de l'autoagrégation et de la coagrégation .................................................... 10
II.7. Etude de l'adhésion des souches à la cellule épithéliale intestinale .............................. 10
II.8. Evaluation de l’activité immunomodulatrice des souches in vitro ............................... 11
Résultats escomptés.................................................................................................................. 12
Impacts attendus ....................................................................................................................... 12
Bénéfices de l’étude pour la communauté ............................................................................... 12
Avantages de l’étude pour les participants ............................................................................... 12
Inventaire des risques et mesures prises pour y remédier ........................................................ 12
Mesures spécifiques pour assurer la confidentialité des données ............................................ 12
Chronogramme des activités .................................................................................................... 13
Références ................................................................................................................................ 15

ii
 Liste des abréviations
ANOVA: ANalyse Of VAriance
BHI: Brain Heart Infusion
DMEM: Dulbecco’s Modified Eagles Medium
DO: Densité Optique
DPPH: 2,2-DiPhényl-1-Picryl Hydrazyle
ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
EPS: ExoPolySaccharide
FAO: Food and Agriculture Organisation of the United Nations
FBS : Fetal Bovine Serum
IL : InterLeukine
LPS : LipoPolySaccharide
MCP : Monocytes chemoAttractant Protein
MRS: Man Rogosa Sharpe
MRSc: Man Rogosa Sharpe cysteine
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
PBS: Phosphate-Buffered Saline
PCR: Polymerase Chain Reaction
SCB: Surnageant de Culture Brute
SCC: Surnageant de Culture Chauffé
SCNC: Surnageant de Culture Neutralisé et Chauffé
TNF: Tumor Necrosis Factor
UFC: Unité Formant Colonie

iii
 Résumé
Le microbiote intestinal joue un rôle essentiel dans la santé humaine. Cependant, les
perturbations dans ces communautés microbiennes sont associées à de nombreuses maladies,
aggravées par la hausse des résistances aux antimicrobiens (RAM) chez les agents pathogènes
bactériens et l'absence de développement de nouveaux antibiotiques. Pourtant, certains
membres du microbiote des nourrissons, comme Bifidobacterium et Lactobacillus, semblent
produire de nouveaux antimicrobiens capables de détruire des agents pathogènes clés
multirésistants, de moduler le microbiote intestinal, traiter les coliques du nourrisson, prévenir,
traiter ou la réduction du risque de troubles ou maladies liés à la dysbiose. Toutefois, rares sont
ces souches capables simultanément de rétablir le microbiote intestinal en cas de dysbiose et
lutter contre les germes pathogènes multirésistants aux antibiotiques, et leur besoin est croissant
sur le marché des probiotiques. À cet égard, c'est une idée prometteuse de rechercher de telles
souches dans des niches écologiques peu ou pas soumises à l'influence souches probiotiques
commerciales, à l’instar du microbiote des nourrissons camerounais. Cette étude projet vise à
isoler et caractériser les membres du microbiote dotés de nouvelles propriétés antimicrobiennes,
probiotiques et immunomodulatrices à partir d'échantillons fécaux de nourrissons vivant au
Cameroun. Pour y parvenir, les échantillons de fèces seront collectés dans le district de santé
de Dschang après obtention d’une clairance éthique. Les bactéries lactiques y seront isolées et
leurs propriétés antimicrobiennes évaluées. Les isolats présélectionnés seront testés pour leur
aptitude à produire les bactériocines, et suivront leurs caractérisations au niveau moléculaire.
Les souches productrices de bactériocines retenues seront évaluées pour leurs potentiels
probiotiques et immunomodulateur. Nous envisageons obtenir les souches productrices de
bactériocines aux potentiels probiotiques et immunomodulateurs qui seront utilisées dans la
prise en charge des diarrhées et colique chez les nourrissons, la prévention et le traitement des
maladies/troubles générés par la dysbiose. Elles permettront de mettre au point des produits
probiotiques typiques de notre terroir, facilement accessible et de moindre coût.
Mots clés : Nourrissons – microbiote intestinal – bactériocines – Probiotiques –
Immunomodulation.

iv
 Abstract
The gut microbiota plays an essential role in human health. However, disruptions in
these microbial communities are associated with many diseases, exacerbated by the rise in
antimicrobial resistance (AMR) in bacterial pathogens and the lack of development of new
antibiotics. Yet, some members of the infant microbiota, such as Bifidobacterium and
Lactobacillus appear to produce new antimicrobials capable of destroying key multidrug-
resistant pathogens, modulating the gut microbiota, treating infant colitis, preventing, treating
or reducing the risk of dysbiosis-related disorders/diseases. However, rare are these strains
capable of simultaneously restoring the intestinal microbiota in the event of dysbiosis and
combating pathogens multiresistant to antibiotics, and their need is of growing interest on the
world probiotic market. In this regard, it is a promising idea to search for such strains in
ecological niches little or not influenced by commercial probiotic strains, like the microbiota of
Cameroonian infants. This study is aimed to isolate and characterise the members of the
microbiota endowed with new antimicrobial, probiotic and immunomodulatory properties from
fecal samples of infants living in Cameroon. To achieve this, faecal samples will be collected
in Dschang Health District after obtaining ethical clearance. Lactic acid bacteria will be isolated
from and their antimicrobial properties evaluated. Preselected isolates will be tested for their
ability to produce bacteriocins, followed by their characterisations at the molecular level. The
selected bacteriocin-producing strains will be evaluated for their probiotic and
immunomodulatory potentials. We plan to obtain bacteriocin-producing strains with probiotic
and immunomodulatory potentials that will be used in the management of diarrhea and colitis
in infants, and the prevention and treatment of diseases / disorders caused by dysbiosis. They
will make it possible to develop probiotic products typical of our region/country, easily
accessible and at a lower cost.
Keywords: Infants – intestinal microbiota - bacteriocins - Probiotics - Immunomodulation.

v
Introduction
Le microbiote intestinal joue un rôle essentiel dans la santé humaine, principalement
dans le métabolisme, la physiologie, la nutrition et la fonction immunitaire de l'hôte (Guinane
et Cotter, 2013 ; Carding et al., 2015). Il est constitué d'un écosystème microbien diversifié et
complexe et toute altération de sa diversité et/ou de sa richesse, due à divers facteurs induit la
« dysbiose ». De nombreuses preuves indiquent que la dysbiose du microbiote intestinal est
associée à la pathogenèse de troubles intestinaux tels que les maladies inflammatoires de
l'intestin, le syndrome du côlon irritable, les maladies cœliaques, et les troubles extra-
intestinaux, notamment les allergies, l'asthme, le cancer, le diabète sucré, l’obésité, les maladies
cardiovasculaires, maladies du foie, calculs urinaires et les infections (Simon Carding et al.,
2015 ; Wang et al., 2017 ; Wilkins et al., 2019 ; Vamanu et Gatea, 2020). Plusieurs de ces
maladies sont chroniques et augmentent à un rythme alarmant dans le monde (Kho et Lal,
2018), constituant ainsi un grave problème de santé publique. Plusieurs options pour moduler
et « stabiliser » le microbiote intestinal, ainsi que pour lui redonner sa composition saine à partir
d'états dysbiotiques, ont été étudiées et comprennent les stéroïdes, les immunosuppresseurs
et/ou les interventions chirurgicales, les ajustements de régime, la transplantation microbienne
fécale, les antibiotiques, les prébiotiques et probiotiques (Bull et Plummer, 2015 ; Vemuri et
al., 2017 ; Khan et al., 2019). Quoique les antibiotiques soient utilisés depuis longtemps pour
traiter les infections, non seulement ils constituent un facteur pouvant provoquer la dysbiose,
mais aussi leur utilisation abusive a conduit à l'augmentation et à la propagation de bactéries
pathogènes multirésistantes, une menace sérieuse et urgente pour la médecine et la société
d'aujourd'hui (Khan et al., 2019 ; Lynch, 2019 ; Wilkins et al., 2019 ; Yount et al., 2020),
incitant à la recherche de nouveaux agents antimicrobiens. Des approches fonctionnelles
fondées sur des preuves ont montré que les probiotiques et/ou les prébiotiques sont désormais
considérés comme des alternatives de modulation du microbiote potentiellement viables (Bull
et Plummer, 2015 ; Wischmeyer et al., 2016). Les probiotiques sont des micro-organismes
vivants qui confèrent un effet bénéfique sur la santé de l'hôte lorsqu'ils sont administrés en
quantités adéquates (FAO/OMS, 2002) et les plus largement étudiés et utilisés appartiennent
aux genres des bactéries lactiques (BAL) et bifidobacterium. De plus en plus de preuves ont
rapporté le succès des bactéries lactiques probiotiques et des bifidobactéries dans la modulation
du microbiote intestinal et également dans la prévention, le traitement ou la réduction du risque
de troubles ou de maladies liés à la dysbiose. Ils ont été efficaces dans le traitement de la
diarrhée associée aux antibiotiques, des maladies inflammatoires de l'intestin, du syndrome du
côlon irritable, des maladies du foie, de l'obésité et du diabète de type 2, de l'eczéma atopique,

1
des maladies cardiovasculaires, du cancer du côlon et des maladies cœliaques (Bull et Plummer,
2015 ; Wischmeyer et al., 2016 ; Vemuri et al., 2017 ; Appanna, 2018 ; Abdellatif et al., 2020 ;
Püngel et al., 2020). Toutefois, rares sont ces souches capables simultanément de rétablir le
microbiote intestinal en cas de dysbiose et lutter contre les germes pathogènes multirésistants
aux antibiotiques, alors que leur besoin est croissant du marché des probiotiques. L'attention est
aujourd'hui portée sur la recherche dans des niches peu ou pas explorées de nouvelles bactéries
lactiques productrices de bactériocines et au potentiel probiotique. À cet égard, c'est une idée
prometteuse de rechercher de telles nouvelles souches dans des niches écologiques qui n'ont
pas encore été soumises à l'influence des bactéries lactiques et bifidobactéries commerciales,
probiotiques ou non.
Questions de recherche
Ne serait-il pas intéressant de rechercher de telles nouvelles souches parmi les souches
autochtones du microbiote intestinal des sujets non soumis à l’influence des souches
commerciales probiotiques ou non ? Les microbiotes des nourrissons camerounais, peu ou pas
encore étudiés à notre connaissance ne constitueraient-ils, un réservoir de ces nouvelles
souches au potentiel probiotique et immunomodulateur?
Hypothèses
- Les fèces des nourrissons camerounais regorgent de nombreux bactéries lactiques et
bifidobactéries aux propriétés antimicrobiennes
- Certaines des bactéries aux propriétés antimicrobiennes isolées des fèces des nourrissons
camerounais sont productrices de bactériocines
- Les souches productrices de bactériocines sélectionnées présentent un bon potentiel
probiotique et immunomodulateur.
Objectif général
Rechercher les bactéries lactiques productrices de bactériocines et au potentiel
probiotique pouvant contribuer à la lutte contre les troubles/maladies liées à la dysbiose et
contre l’antibiorésistance chez l’Homme.
Objectifs spécifiques

a) Isolement d'une large gamme de bactéries lactiques et bifidobactéries à partir des fèces de
nourrissons de la région de l'Ouest du Cameroun et évaluation de leurs propriétés
antimicrobiennes
b) Sélection et caractérisation des isolats producteurs de bactériocines
c) Evaluation in vitro du potentiel probiotique et immunomodulateur des souches productrices
de bactériocines.

2
 Administration du Collecte des fèces de
questionnaire nourrissons

Analyse des échantillons

 Isoler les bifidobactéries et lactobacilles

 Déterminer l’innocuité des souches
Traitement et analyse
 Rechercher les propriétés antimicrobiennes
des résultats
 Identifier les souches bactériennes par séquençage
du génome entier
 Evaluer les propriétés probiotiques et
immunmodulatrices des souches de bifidobactéries
et lactobacilles in vitro

Dissémination des résultats

Figure : schéma général du travail

3
Matériel et méthodes
I. Caractérisation des bifidobactéries et lactobacilles isolés des fèces de nourrissons dans
la région de l’Ouest-Cameroun
I.1. Population d’étude, considérations éthique et collecte d'échantillons
I.1.1. Lieu de l’étude
Cette étude se déroulera de manière aléatoire dans les aires de santé de L’ouest. Etant
donné l’objectif d’isoler une large gamme de bifidobactéries et lactobacilles.
I.1.2. Période de l’étude
L’étude se déroulera de Aout 2023 à Octobre 2023.
I.1.3. Population cible
Les sujets visés pour cette étude sont les nourrissons âgés de 0 à 5 mois.
I.1.4. Critères de sélection des sujets
 Critères d’inclusion
Seront inclus dans cette étude :
-Les nourrissons âgés de 0 à 5 mois, nés par voie basse,
-Allaités ou recevant du lait infantile ne contenant pas de bactéries probiotiques,
-En bonne santé ainsi que leurs mères (auto-déclaration), et dont les mamans ont accepté de
participer à l’étude.
 Critères de non inclusion
Ne seront inclus dans cette étude :
-Les nourrissons de plus de 5 mois
-Les nourrissons de 0 à 5 mois nés par césarienne
 Critères d’exclusion
Seront exclus de l’étude:
- Les nourrissons de 0 à 5 mois ayant des troubles gastro-intestinaux, malades au cours des 7
jours précédents ou prenant des antibiotiques au cours des 14 jours précédents
- Les nourrissons dont les mères auront refusé de participer
I.1.5. Stratégie de recrutement de la population
Les jours de vaccination dans les différents centres de santé choisis, les mères de
nourrissons seront approchées, l’étude leur sera expliquée, et après avoir obtenu leur
consentement éclairé par écrit, elles rempliront le questionnaire ou nous livreront des
informations nécessaires pour le remplissage du questionnaire.

4
I.1.6. Collecte des échantillons de fèces
De chacun des nourrissons, 5g de matières fécales fraîches seront prélevés de manière
aseptique et introduits dans des tubes à vis contenant 5 ml de solution physiologique et 0,05%
de cystéine-HCl stérile, pour former une solution mère. Quelques gouttes de cette solution
seront utilisées pour une préparation à l’état frais et le reste servira à l’isolement des bactéries
lactiques.

I.2. Isolement et pré identification des isolats

I.2.1. Isolement
L’isolement des bifidobactéries est réalisé en profondeur sur MRS cystéiné. A partir de
la solution mère, des dilutions (109,1010 et 1011), sont faites et ensemencées sur milieu MRSc.
Trois boites pour chaque dilution sont incubées dans un incubateur à CO2 pendant 3 jours à
37°C (Beerens, 1990). A la différence des bifidobactéries, les lactobacilles sont cultivés sur
MRS simple pendant 24h à 48h (Badis et al., 2004) et ne nécessitent pas un incubateur à CO2.
Après l’incubation, les colonies sont sélectionnées selon leur aspect morphologique (observées
grâce à une loupe binoculaire) ainsi que sur la base de leurs mobilités, formes, couleurs,
contours, état frais et de la coloration de Gram. Les colonies de bifidobactéries et lactobacilles
sont ensuite repiquées en milieu liquide, puis incubés pendant 24 h-48h à 37°C.
A partir des cultures liquides, on effectue une série de repiquage sur milieux solides
pour obtenir des cultures pures. L’opération est renouvelée en prenant chaque fois une colonie
isolée. Ceci conduit à obtenir une culture dont la pureté est estimée par observation
microscopique après coloration de Gram.
I.2.2. Pré-identification des isolats
Elle permet de s’assurer que les bactéries isolées sont bien des bifidobactéries et
lactobacilles
I.2.2.1. Détermination de la morphologie cellulaire des isolats
Une observation macroscopique sera effectuée pour déterminer l’aspect des colonies
bactériennes (couleur, aspect, forme, taille, marge, disposition).
L’observation microscopique photonique à l’objectif X100 permettra de déterminer la
forme (bâtonnets ou coques, bacilles) et la disposition (isolées, paires, chaînettes, amas) des
cellules (Joffin et leyral, 1996). Elle permettra aussi de contrôler la pureté des souches après
coloration de Gram.

5
I.2.2.2. Test de production de catalase
Le test de catalase sert à démontrer si la bactérie possède l’enzyme catalase servant à
décomposer le peroxyde d’hydrogène en eau et oxygène. Ce test consiste à prélever une colonie
sur gélose MRS et déposé sur une lame. Ensuite on dépose sur la lame quelques gouttes d’eau
oxygénée à 3% (v/v). L’apparition de bulles révèle le dégagement d’oxygène (Delarras, 2007).
Les bifidobactéries et lactobacilles sont catalase négative.

I.3. Etude de l’activité anti bactérienne des isolats

I.3.1. Antagonisme bactérien entre les différents isolats
Ce test consiste à évaluer l’activité des isolats entre eux afin de
déceler ceux qui produisent des substances inhibitrices capables d’inhiber la croissance des
autres microorganismes. Après activation de l’isolat pendant 24h, 2µl sont prélevés et
déposés sous forme de spot sur le milieu solide préalablement coulé en boîte, puis
incubé à 37ºC pendant 6h en condition microaerophile. Après croissance, 7 ml de milieu MRS
semi-solide (MRS + 0,75% d’agar) contenant 1% (v/v) de l’isolat sensible et maintenu en
surfusion (45 à 50°C) est coulé au-dessus des spots conformément à la méthode de la double
couche, puis les boîtes sont incubées à nouveau pendant 24h à la même température. Les zones
d’inhibitions (zone claire autour du spot) sont ensuite observées.
I.3.2. Evaluation de l’activité antimicrobienne des surnageants de culture
L’activité antimicrobienne des isolats sélectionnés à l’issue de l’étape précédente sera
vérifiée par la méthode des spots sur milieu gélosé des surnageants de culture d’une part contre
les isolats les plus sensibles sélectionnées et d’autre part contre les souches et isolats pathogènes
selon la méthode de (Karina et al., 2017).

Pour préparer les surnageant de culture bruts (SCB), chauffés (SCC) et neutralisés
(SCNC) : une pré-culture pure de 24h, de l’isolat à tester, sera inoculée (1%) dans 8 ml
de bouillon de culture MRS, puis incubée à 37°C pendant 18h. Cette culture sera centrifugée à
8000 trs/min pendant 30 minutes, puis le surnageant obtenu reparti dans trois tubes stériles. Le
premier tube sans traitement (SCB), le second tube chauffé à 80°C pendant
10min (SCC) et le troisième tube neutralisé (pH 6,5) à l’aide d’une solution stérile de NaOH
6N, dans le but d’exclure toute inhibition due aux acides organiques. Le chauffage permettra
de détruire les cellules résiduelles, le peroxyde d’hydrogène, et aussi d’inactiver les protéases
si elles existent. Dans des boites de pétri contenant chacune la gélose stérile, sont coulés le
milieu BHI ou MRS semi-solide, ou MRS pré-inoculés à 0,1%, avec une suspension cellulaire
de la souche ou l’isolat pathogène indicatrice (ou l’isolat sensible). Après solidification et

6
séchage des milieux, des spots de 5µl environ de SCB, SCC, SCNC, de l’isolat à tester seront
déposés. Après diffusion, les boites sont mises en incubation à 37°C pendant 24h. Les colonies
entourées d'une zone claire dans la nappe de culture de la souche test et ayant un diamètre
supérieur à 2 mm sont considérées comme positive. (Tagg et al., 1971 ; Barefoot et al., 1983).
I.3.3. Evaluation de l’effet des enzymes protéolytiques et non protéolytiques sur l’activité
des SCN
L’effet des enzymes sur l’activité antimicrobienne des SCNC (pH 6,5) a été déterminé
en ajoutant à des fractions de SCNC les enzymes à des concentrations finales de 1 mg/ml
(Todorov et Dicks, 2005). Des solutions à 10 mg/ml de protéinase K, (dans le tampon phosphate
50 mM, pH 7) et de trypsine (dans le tampon Tris-HCl 50mM, pH 8) seront préparées. Ensuite,
50 µl de chacune de ces solutions enzymatiques sera introduit dans des tubes épendorfs stériles
contenant 450 µl de SCNC, la concentration finale sera de 1 mg/ml de l’enzyme. Les différentes
solutions enzymatiques et les différents tampons sont utilisés comme contrôles négatifs d’une
part, les SCNC seuls et les SCNC additionnés à 10 µl de chacun de ces tampons, de préparation
des enzymes sont utilisés comme contrôles positifs d’autre part. Tous ces échantillons sont
incubés à 37° C pendant 2 h. Au bout de ce temps, les différentes solutions sont chauffées au
bain-marie à 100°C pendant 5 minutes afin de stopper l’action des enzymes. L’activité
résiduelle est déterminée par la méthode de diffusion en puits sur milieu gélosé telle que décrite
précédemment, contre les souches sensibles.
I.4. Evaluation de l’innocuité des isolats
I.4.1. Activité hémolytique
L’innocuité des isolats vis-à-vis des cellules sanguines sera évaluée sur gélose MRSc
additionnée de 5 % de sang de mouton. Les cultures retenues seront déposées sous forme de
spots et incubées à 37°C pendant 48h. Le développement de zones claires (β-hémolyse) et
verdâtres (α-hémolyse) sera recherché autour des colonies (Fadda et al., 2017).
I.4.2. Production de gélatinase
La production de gélatinase sera réalisée sur gélose contenant 7 % (p/v) de gélatine
(Rohde et al., 1978). Deux microlitres (2 μl) de culture de chaque isolat sont déposés en un
point à la surface de la gélose et incubés à 37°C pendant 72h. Suite à cette incubation, la surface
de la gélose est inondée avec une solution saturée de sulfate d'ammonium et les zones claires
autour des tâches de bactéries sont recherchées.
I.4.3. Production d'amines biogènes
Les isolats testés seront cultivés sur du bouillon MRSc pendant 24 h, puis recueillis par
centrifugation et déposés sur un milieu de test constitué de MRSc, additionné de chacun des

7
précurseurs d'amines biogènes correspondants (lysine, phénylalanine, arginine et histidine) à
0,5 % (p/v ), pourpre de bromocrésol (0,006 %, p/v). Le pH sera ajusté à 5,3 (Mete et al., 2016).
Le témoin négatif sera constitué de MRSc et pourpre de bromocrésol sans acides aminés.
L'ensemble est incubé pendant 5 jours. La formation d'une couleur violette autour des taches
dans le milieu contenant les acides aminés contre le jaune dans le témoin est considérée comme
une production d'amines biogènes.
I.5. Identification des souches bactériennes par séquençage de L’ARNr 16S
Les isolats sélectionnés sont soumis à une caractérisation moléculaire par séquençage
de l'ARNr 16S. L'ADN des isolats sont extrait en utilisant un protocole standard suivi par
Rohini et al. (2006). La confirmation de l'ADN sera effectuée en utilisant une électrophorèse
sur gel d'agarose à 1 %. Le fragment du gène de l'ARNr 16S est amplifié par les amorces
universelles 27F (5-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3) et 1492 (RTACGGYTACCTGTTACG
ACTT). La réaction PCR est réalisée dans des conditions telles qu'une dénaturation initiale à
94°C pendant 2 min, 35 cycles d'amplification à 94°C pendant 45 s, 55°C pendant 60 s, 72°C
pendant 60 s et une extension finale à 72 °C pendant 10 min. L'amplicon PCR est purifié pour
éliminer les contaminants. La réaction de séquençage d'ADN direct et inverse de l'amplicon
PCR est effectuée avec une amorce directe et des amorces inverses à l'aide d’un kit de
séquençage à 1 Cycle sur l'analyseur génétique. La séquence consensus du gène de l'ARNr 16S
est générée à partir des données de séquence directe et inverse à l'aide d'un logiciel
d'alignement.
II. Caractérisation fonctionnelle des propriétés probiotiques et immunomodulatrices des
souches
II.1. Sensibilité aux antibiotiques
La sensibilité et la résistance des isolats sont déterminées par la technique standardisée
de diffusion sur milieu gélose MRS. A partir d’une préculture, on ensemence toute la surface
du milieu. Après le séchage, on dépose les disques d’antibiotiques sur la boite et on les incubes
à 37C° pendant 24h. Après incubation, le diamètre (mm) de la zone d'inhibition sera mesuré.
II.2. Evaluation in vitro de l’aptitude des souches à résister au suc gastrique et intestinal
simulé
La capacité des isolats à franchir les barrières du tractus gastro-intestinal sera évaluée
selon la méthode de Pisano et al. (2014). A partir d'une pré-culture de 24 h, une suspension
d'environ 107 unité formant colonie (UFC/ml) est obtenue après deux lavages successifs dans
de l'eau physiologique (NaCl, 0,9%). 1 ml est introduit dans 9 ml de suc gastrique simulé (6,2
gl1NaCl, 2,2 g1KCl, 0,22 g1CaCl2, 1,2 g1NaHCO3, 0,3% pepsine, pH 2 et 3) puis incubé à

8
37°C pendant 120 min, le temps recommandé par Minekus et al. (2014). Après ce temps, le
nombre de cellules viables est évalué sur gélose MRS. Le volume restant est centrifugé (3500
g, 15 min) et le surnageant est détruit. Ensuite, 8,75 ml de suc intestinal synthétique (6,4 gl1
NaHCO3, 0,239 g1KCl, 1,28 g1NaCl, 0,1 % de pancréatine, pH 7,4) additionné de 2 ml de sels
biliaires à 10 % (p/v) est ajouté pour simuler le passage dans la première partie de l'intestin.
L'incubation est effectuée pendant 180 min à 37°C après quoi les pourcentages de survie sont
calculés.

II.3. Déconjugaison des sels biliaires

II.3.1. Criblage des souches productrices d'hydrolase des sels biliaires
Le milieu de culture est le MRS additionné de 0,5 % de sels biliaires (composé de
50 % de taurodésoxycholate et de glycodésoxycholate) et de 0,37 gl1CaCl2. Après une culture
de 24 h, 2 μl de chaque isolat sont déposés en spot à la surface du milieu, suivi d'une incubation
à 37°C pendant 48h. La présence de halos clairs et opaques autour des taches marque la
présence des hydrolyses de type glycodésoxycholate et de taurodésoxycholate (Fadda et al.,
2017).
II.3.2. Activité hydrolase des sels biliaires
La production d'hydrolase des sels biliaires est évaluée sur surnageants et contenus
intracellulaires en déterminant la quantité d'acides aminés libérés suite à l'hydrolyse des sels
biliaires (Glycodéoxycholate et Taurodésoxycholate, 50%) à l'aide du dosage à la Ninhydrine
(Jiang et al., 2010). Ainsi, l'activité sera exprimée en U/mg, représentant la quantité d'enzyme
qui libère 1 μmol d'acides aminés (Glycine et/ou Taurine) du substrat par minute.

II.4. Evaluation de la production d'exopolysaccharides

Les isolats seront étalés sur MRS sur plaque de gélose avec du glucose comme seule
source de carbone. Les plaques seront ensuite incubées à 37°C pendant trois jours. Des plaques
en triple contenant de 25 à 250 colonies seront notées pour leur propriété mucoïde, selon la
méthode rapportée par (Manini et al., 2016).

II.5. Réduction du 2,2-diphényl-1-picryl hydrazyle

L'activité antioxydante des différents extraits est évaluée dans les surnageants de
culture, les contenus intracellulaires et les cellules entières par la méthode radicalaire 2,2-
diphényl-1-picryl hydrazyl telle que décrite par Chen et al. (2010). Les souches sélectionnés
sont cultivés dans un bouillon MRS pendant 24 h à 30°C. Puis les surnageants de culture sont
obtenus par centrifugation (3500 g, 15min) et les contenus intracellulaires par éclatement
cellulaire dans du tampon citrate pH 5 à 50°C. Une aliquote (800 μl) de surnageant ou contenu

9
intra cellulaire et 1000 μl de DPPH (0,2 mM) sont mélangés, laissés à l'obscurité à 25°C
pendant 30 min. Les densités optiques (DO) sont mesurées à 517 nm à l'aide d'un
spectrophotomètre. Le test est réalisé en triple et le blanc est préparé dans de l'eau
déminéralisée. L'activité anti radicalaire des extraits (A) est calculée selon la formule: 𝐴 =
1−𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝑙′é𝑐ℎ𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑙𝑜𝑛
𝐴𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑒 𝑑𝑢 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐

II.6. Evaluation de l'autoagrégation et de la coagrégation

L'auto-agrégation et la co-agrégation seront réalisées selon Kos et al. (2003) avec
quelques modifications. Pour l'auto-agrégation, 5ml de bouillon MRS des souches isolées sont
incubés à 37 ° C pendant 18 h. Ensuite, les cellules sont récoltées par centrifugation (9000
tr/min, 4 min), lavées trois fois dans du tampon phosphate salin (PBS ; pH 7,0) et mises en
suspension dans la même solution. La DO de la suspension cellulaire est ajustée à une DO de
0,3. Les échantillons sont laissés au repos pendant 60 min. La DO à 600 nm des surnageants est
mesurée et utilisée pour déterminer l'indice d'autoagrégation (%) comme : (DOtotale -
DOsurnageant /DOtotal) × 100.
Pour le test de co-agrégation, un volume égal de chaque suspension cellulaire de
partenaires de co-agrégation (DO 600nm de 0,3 ; PBS, pH 7,0) est mélangé. Des tubes témoins
contenant des suspensions bactériennes pures sont mis en place en même temps, pour vérifier
l'autofloculation. Les échantillons sont laissés au repos pendant 60 min. Ensuite, la DO à 600
nm des surnageants est déterminée et le pourcentage de coagrégation est calculé comme suit : %
de co-agrégation = (Ax+Ay)/2)−A(x+ y)/(Ax+Ay/2)×100. Où x et y représentent chacune des
deux souches dans les tubes témoins, et (x+y) le mélange. Les expériences seront réalisées avec
répétitions.

II.7. Etude de l'adhésion des souches à la cellule épithéliale intestinale

Elle sera réalisée comme décrit par Shang et al. (2020) Afin d'examiner l'adhésion
cellulaire des bifidobactéries, lactobacilles et de la souche de référence aux cellules intestinales
humaines, la lignée cellulaire d'adénocarcinome du côlon humain (Caco-2) sera achetée. Les
cellules Caco-2 seront cultivées dans du Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et de 1 % de pénicilline streptomycine à 37°C,
5% CO2. Pour les tests d'adhérence, les cellules sont ensemencées à une concentration de
2×105cellules par puit dans des plaques de culture à 12 puits et incubées jusqu'à confluence.
Les bactéries seront ensemencées à une concentration de 108unités formant colonies (UFC) par
puits. Après co-culture pendant 2h, chaque puits sera lavé quatre fois avec du PBS. Les cellules
seront traitées avec 250µL de trypsine et incubées à 37°C pendant 3 minutes. Ensuite, à chaque

10
puits sera ajouté 250µL de DMEM additionné de 10 % de FBS pour mettre fin à l'activité de la
trypsine. Les bactéries liées seront soumises à une dilution en série de 10 fois et étalées sur des
plaques de gélose MRS. Le nombre de colonies sera compté après 36 d'incubation à 37◦C dans
des conditions anaérobies.
C1
Taux d'adhésion (%)= C0 × 100

C1 représente le nombre total de formations adhésives après traitement.

C0 représente le nombre total de souches avant traitement

II.8. Evaluation de l’activité immunomodulatrice des souches in vitro

La lignée cellulaire d'adénocarcinome du côlon humain Caco-2 seront utilisé pour ce
test. Elle seront cultivées comme décrit précédemment. Pour évaluer la sécrétion de cytokines,
une bactérie pathogène (1×109CFU/ml) sera ajouté aux cellules Caco-2 gélosé solide à 37°C
pendant 24 h, les bifidobactéries viables seront ajoutées avec du LPS (Lipopolysaccharide)
1μg/ ml. Grâce à ce test, la concentration de six types de cytokines notamment, les cytokines
proinflammatoires (TNF-α, IL-6 et IL-12) et les cytokines anti-inflammatoires (IL-10) et les
cytokines chimiotactiques (chimiokines (MCP-1 et IL-8). Les mesures seront effectuées via le
kit ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Les cellules du groupe témoin négatif seront
incubées avec du milieu seul, et ceux du groupe témoin positif seront traités avec du LPS seul.
L'absorbance sera mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. Les courbes
d'étalonnage seront créées à l'aide de solutions diluées en série contenant six types humains de
cytokines telles que TNF-α, IL-6, IL-12, IL-10, MCP-1 et IL-8 utilisées pour quantifier la
libération de cytokines dans les surnageants.

11
Résultats escomptés
A la fin de ce travail les résultats attendus sont :
 Identifier de nouvelles souches de bifidobactéries et lactobacilles sans danger pour l’hôte.
 Obtenir des souches capables de résister aux conditions du tube digestif, d’adhérés aux
cellules épithéliales de l’intestin, d’exercer une activité antimicrobienne et de moduler le
système immunitaire.
 Obtenir des souches capables de restaurer l’équilibre des microbiotes intestinaux perturbés
chez les rats.
Impacts attendus
 Impact à court terme : motivation de la recherche, sur les essais cliniques avec les souches
obtenus, afin de formuler un supplément alimentaire pour combattre la dysbiose chez
l’Homme.
 Impact à long terme : réduction de l’incidence de la dysbiose et des maladies associées.
Bénéfices de l’étude pour la communauté
Cette étude sera bénéfique pour la communauté en ce sens que, les souches productrices
de bactériocines aux potentiels probiotiques et immunomodulateurs seront utilisées dans la
prise en charge des diarrhées et colique chez les nourrissons, la prévention et le traitement des
maladies/troubles générés par la dysbiose. Enfin, ces résultats nous aiderons, à partir des
souches probiotiques adaptées à notre climat et environnement, à mettre au point des produits
probiotiques typiques de notre terroir, facilement accessible et de moindre coût.
Avantages de l’étude pour les participants
Elle permettra dans aux participantes de bénéficier des résultats d’un examen gratuit de
selles de leurs nourrissons.
Inventaire des risques et mesures prises pour y remédier
Il n’y a aucun risque particulier. La crainte ou le stress pourra survenir pendant les
échanges, mais en donnant aux participants un peu de temps pour lire le questionnaire, en leur
expliquant et en répondant à leurs questions, tout ceci pourra être surmonté. Les participants
pourraient ressentir de la peine à revenir au centre de santé un autre jour remettre l’échantillon
collecté à domicile.
Mesures spécifiques pour assurer la confidentialité des données
Les échantillons et les résultats seront codés, les codes remplaçant les noms des
participants. Les informations personnelles et les résultats seront tenus confidentiels et gardés
secrets. Seules les informations qu’elles voudront divulguer seront prises en compte. Elles ne
seront abordées qu’au sein de l’Hôpital ou du centre de santé. Tous les échantillons seront

12
prélevés au service de laboratoire dudit Hôpital. Les échantillons nous servirons uniquement à
réaliser les analyses énumérées plus haut.
Chronogramme des activités

Octobre 2023 – Mai 2024 Cours, Rédaction du projet, présentation en séminaire et

validation par le comité scientifique
Juin – Juillet 2023 Soumission du document pour la clairance éthique
Août 2021 - Février 2023 Recherche documentaire
Août 2023 – Février 2024 Collecte des échantillons, isolement et caractérisation
préliminaire des bactéries lactiques, évaluation de leurs
propriétés antimicrobiennes
Mars - Août 2024 Sélection des isolats producteurs de bactériocines,
caractérisation des bactériocines, identification moléculaire
des isolats sélectionnés, rédaction du 1er article et soumission
Septembre - Avril 2024 Deuxième phase de collecte des échantillons, isolement et
caractérisation, Evaluation du potentiel probiotique et des
propriétés immunomodulatrices des bactéries sélectionnées
Avril - Juillet 2024 Rédaction du second article et soumission, rédaction de la
thèse et soumission pour correction
Août 2024 Soumission de la Thèse pour Pré soutenance, corrections
finales et dépôt
Septembre - Octobre 2024 Expertise et autorisation de soutenance
Novembre 2024 Soutenance

13
Considérations financières

Numéro Matériels et réactifs Quantités Prix unitaire Montant en

(FCFA)
1 MRS Broth et agar 4 boites 70 000 280 000

2 Boites de Pétri en verre 100 3000 300 000

3 Tubes à essais à vis 200 600 120 000
4 boites stériles pour les 1000 100 100 000
échantillons de selles
5 Lames, lamelles, réactif / / 50 000
de coloration de Gram,
alcool, gants,
détergents, eau de javel
6 Réactifs SDS-PAGE / / 200 000
7 Réactifs PCR et / / 1 000 000
électrophorèse
8 Amorces / / 150 000
9 Antibiotiques / / 150 000
10 Nutrient agar 1boite 50 000 50 000
11 Cellules PBMC et HT- / / 100 000
29
12 lignée cellulaire THP1- / / 50 000
Blue™
13 milieu RPMI 1640 / / 50 000
14 Kit ELISA dosage des / / 300 000
cytokines
15 Internet 30 000
16 Transport 50 000
17 Clairance éthique 50000 10000
Total 3 030 000

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