Biochimie Analytique III

BIOCHIMIE ANALYTIQUE 2021/2022
CHAPITRE III: MOYENS DE PURIFICATION
Précipitation
Il existe des techniques plus complexes de séparation des mélanges, qui nécessitent l'ajout de
réactifs pour initier une réaction chimique (la précipitation). La précipitation peut être utilisée
afin d'extraire une espèce chimique particulière d'un mélange, l'espèce précipitée étant en
suite filtrée. Un certain nombre de paramètres peut servir à séparer un échantillon intéressant
des impuretés en réduisant sa solubilité et désolidarisé de la solution sous forme de solide.
Tout d’abord, la force ionique de la solution peut changer une solubilité de substances. Cela
implique souvent l’ajout de sel supplémentaire (également appelé relargage), ou l’ajout d’un
contre-ion, qui forme une espèce moins soluble avec le composé d’intérêt.
La précipitation est la création d'un solide à partir d'une solution. Lorsque la réaction se
produit dans une solution liquide, le solide formé est appelé "précipité". Le produit qui
provoque la formation du solide est appelé «précipitant».
Principe
La précipitation consiste à former une phase hétérogène au sein d’une autre phase. Si l’on
suspecter la présence de certains ions dans une solution, nous pouvons ajouter un autre ion qui
formera une substance solide avec eux. Ainsi, s’il y a effectivement présence de l’ion
recherché, on verra apparaître une substance solide qu’on pourra par la suite filtrer et
récupérer. La précipitation est un moyen de séparation des mélanges.
Précipitation en biochimie
La précipitation de biomolécules, particules ou cellules, leurs agrégats ou leurs complexes

avec d'autres composés résulte d'une perte de solubilité et d'une augmentation de masse
moléculaire ou pondérale (ex: formation de complexes antigènes/anticorps; agrégation de
cellules; association de particules et cellules). Elle peut aussi résulter d'un changement de la
composition du milieu, ou des caractéristiques des biomolécules.
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- la protéine: en modifiant le pH du solvant; de manière générale, les protéines précipitent
lorsque le pH de la solution est égal au pI (point izoélectrique) de la protéine: les protéines
formeront des agglomérats qui précipiteront.
- La solution d’ADN, portée à haute force ionique par addition de NaCl est additionnée d’un
large excès d’éthanol absolu à - 20°C. Au bout de quelques minutes au maximum, on voit
apparaître un précipité blanchâtre, translucide et filamenteux (la «méduse») constitué de longs
filaments d’ADN précipité.
Exemple d’application
Précipitation des protéines du lait:
1. Versez le lait dans un bol.
2. Chauffé le lait doucement jusqu'à 40 °C dans une plaque de cuisson en remuant. Ne pas
chauffer à plus de 40 °C.
3. Préparer un 15 % (v/v) d’acide acétique en mélangeant 7,5 mL d’acide acétique et diluer

dans l’eau jusqu’à 50 ml.
4. Ajoutez l’acide acétique goutte-à-goutte au lait jusqu'à atteindre un pH de 4,6.
5. Filtration du lait ou centrifugation du lait (comme alternative à la filtration)
6. Resuspendre le culot dans un tampon pour approfondir l’analyse, sinon conserver à 4 °C.
Techniques chromatographique
Définition
La chromatographie est une méthode de séparation des constituants présents dans des
mélanges variés. Elle sert en analyse pour purifier, identifier et quantifier des composés au
sein d’échantillons divers. Le principe de base repose sur les équilibres de concentration qui
apparaissent lorsqu’un composé est mis en présence de deux phases non miscibles, l’une dite
stationnaire, est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un support et l’autre, dite mobile,
se déplace au contact de la première. Si plusieurs composés sont présents, ils se trouvent
entraînés à des vitesses différentes, provoquant leur séparation.
Principe
La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différentes affinités
d’un (des) composé(s) à l’égard de deux phases (stationnaire et mobile). Le principe de cette
technique est basé sur la migration différentielle des divers solutés contenus dans un
échantillon analysé. L’échantillon est entrainé par la phase mobile au travers de la phase
stationnaire qui a tendance à retenir plus ou moins les composés de l’échantillon à l’aide
d’interactions comme les forces de Van der Waals ou les liaisons hydrogène. Une fois la

phase stationnaire traversée, les composés sont élués. Les différents composants de
l’échantillon ont généralement une affinité différente pour l’une et l’autre des deux phases. Il
en résulte une différence de vitesse de progression des produits et donc d’élution. Ceci permet
de les séparer les uns des autres voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est
fortement indépendante de la nature des phases mobile et stationnaire.
Types de chromatographie
Les méthodes chromatographiques peuvent être classées selon le support de la phase

stationnaire en:
- Chromatographie sur colonne (HPLC, CPG, et les colonnes de silice).
- Chromatographie sur surface (chromatographie sur couches minces ou CCM,

chromatographie sur papier).
Elles peuvent être classées aussi selon la nature de la phase mobile en:
- Chromatographie en phase gazeuse (CPG).
- Chromatographie en phase liquide (CPL):
Suivant le type de chromatographie, elle peut servir à identifier (CCM, HPLC, CPG), à
séparer ou à purifier les composés d’une réaction (chromatographie sur colonne, HPLC).
Cette technique peut également, grâce à un témoin, permettre de quantifier un produit (CPG,
HPLC).
Le choix de l’une ou l’autre de ces techniques dépend de la nature des composés à séparer et
en fonction de celle-ci, le choix de l’adsorbant utilisé
Chromatographie sur Couche Mince (CCM)

La chromatographie sur couche mince est la plus simple des méthodes chromatographiques.
Elle consiste à placer sur une feuille (papier, silice ou autre….) une tache et de la laisser éluer
en la trempant dans un solvant ou un mélange de solvant (appelé éluant), l’éluant diffuse le
long du support. La tache migre sur la feuille plus ou moins vite selon la nature des
interactions qu'elle subit de la part du support et de l'éluant.
Principe Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l’échantillon est placée dans la cuve,
l’éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque
composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette
vitesse dépend d’une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque
stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile.
Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile,

l’action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des
phénomènes d’absorption.

Les principaux éléments d’une séparation chromatographique sur couche mince sont:
– la cuve chromatographique: un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé

par un couvercle étanche.
– la phase stationnaire: une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice ou d’un autre
adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l’aide d’un liant comme l’amidon.
– l’échantillon: environ un microlitre (ml) de solution diluée (2 à 5 %) du mélange à analyser,

déposer en un point repère situé au-dessus de la surface de l’éluant.
– l’éluant (phase mobile): un solvant pur ou un mélange: il migre lentement le long de la

plaque en entraînant les composants de l’échantillon.
Après migration les taches doivent être révélées; c'est la détection qui peut se faire soit:
Pulvérisation d'un réactif caractéristique
Par immersion dans un bain de permanganate de potassium
Par pulvérisation de vapeur de diiode
Par observation à la lumière Ultra-Violet (UV) si la plaque de silice comporte un indicateur

de fluorescence.
Applications de la CCM
Lorsque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et rapide de la
pureté d’un composé organique. Si l’analyse, réalisée avec divers solvants et différents

adsorbants, révèle la présence d’une seule substance, on peut alors considérer que cet
échantillon est probablement pur. De plus, étant donné que la chromatographie sur couche
mince indique le nombre de composants d’un mélange, on peut l’employer pour suivre la
progression d’une réaction.
Exemple d’application Chromatographie des sucres Vérification de la présence de 3 glucides

(glucose, maltose et saccharose) dans un jus de fruit.
Solutions de glucose, maltose et saccharose
Jus de fruit (jus d’orange)
- A l’aide d’un tube capillaire, déposer une très petite goutte de chaque solution préparée ainsi
que 1e jus d’orange sur la plaque de chromatographie.
- Insérer la plaque dans la cuve à chromatographie contenant 0.5 cm d'éluant.
- Retirer la plaque quand l’éluant est à environ 1cm du bord supérieur de la plaque.
On a observé des tâches lors de la migration des dépôts de glucose et saccharose similaires
aux tâches de l'orange, et l’absence de la tache du maltose par rapport au jus d’orange. Nous
en déduisons donc que le jus d'orange contient du saccharose et du glucose.
Chromatographie sur colonne

C’est une méthode de séparation des constituants d’un mélange par migration dans un
dispositif constitué de deux phases:
- La phase stationnaire: support solide.
- La phase mobile: le solvant.
La vitesse de déplacement des composés dans la colonne dépend de:
L’affinité à la phase stationnaire: plus l’affinité à la phase stationnaire est grande, plus le
déplacement des composés dans la colonne est très lent.
La solubilité dans la phase mobile (plus le composé est très soluble dans la phase mobile,
plus déplacement dans la colonne est très vite).
Le choix du type de chromatographie et du support dépend de la nature des composés à

séparer.
Eléments chromatographiques
Les éléments de la chromatographie sont: L’échantillon, la phase stationnaire, la phase
mobile, la colonne, la pompe, le détecteur, le collecteur de fractions et l’enregistreur.
 L’échantillon: C’est la solution qui contient les composés à analyser.

 La phase stationnaire: C’est un gel constitué de granules qui se trouve dans une
colonne
 La phase mobile: C’est un liquide qui se déplace à travers la phase stationnaire, en
entraînant avec lui les composés de l’échantillon. Elle doit être soluble et interagir
avec les composés de l’échantillon et non pas avec la phase stationnaire.
 La colonne: C’est le support de la phase stationnaire (gel ou résine). A travers lequel,
la phase mobile passe. Elle peut être en verre, en plastique ou en inox et de différentes
dimensions
 La pompe: Elle permet de regler le debit de la phase mobile a travers la colonne
 Le détecteur: Il évalue la quantité de chacun des composés séparés et envoie un signal
électronique vers l’enregistreur. Par exemple, les protéines sont détectées grâce à un
détecteur UV-visible.
 L’enregistreur: Il dessine les pics en fonction de leur intensité
 Le collecteur de fractions: permet de collecter les fractions de l’échantillon
Mode opératoire
Il consiste à:
- Préparer le gel.
- Remplir la colonne.
- Equilibrer la colonne.
- Injecter l’échantillon.
- Effectuer l’élution.
- Récupérer les fractions.
- Analyser le chromatogramme.
- Régénérer le gel.
Chromatographie d’exclusion stérique (filtration sur gel ou tamisage moléculaire)
C’est une méthode chromatographique qui permet de séparer des molécules en fonction de
leur poids moléculaire et de leur forme. La phase stationnaire est un solide poreux dont la
dimension des pores est voisine de celle de certaines molécules à séparer. Les grosses
molécules dont le diamètre est supérieur à celui des pores sont exclues et donc élués en
premier. Les petites molécules et les molécules de taille moyenne sont éluées plus
tardivement, elles pénètrent dans les pores du gel, leurs migration est donc retardée (Fig. 6).
La chromatographie d’exclusion stérique est généralement utilisée pour déterminer le poids

moléculaire des composés d’un échantillon par l’utilisation de substances standards.

Le gel de ce type de chromatographie est caractérisé par:
Le diamètre des pores (la porosité): Il est fixé par le degré de réticulation du gel qui
correspond à la proportion de substrat dans l’ensemble de la phase stationnaire. Il détermine le
pouvoir de séparation (séparation microporeuse ou macroporeuse).
L’inertie chimique: Le gel ne doit pas réagir avec la phase dispersante. Il se dégrade si le
pH est inférieur à 2 et supérieur à 8. Donc il doit être inerte chimiquement vis-à-vis des
composés de l’échantillon et de la phase mobile.
La stabilité physico-chimique: Le gel doit être résistant à la température et à la pression de

l’expérience.
La taille et la forme des particules (la granulométrie): Les particules du gel sont petites de
granulométrie de 40 à 300 μm en chromatographie classique et de 20 à 80 μm en haute
performance.
La forme: La forme sphérique assure un écoulement uniforme de la phase mobile.
La nature: Les gels peuvent être en dextran, en polyachrylamide ou en agarose.
La consistance: Elle varie selon la nature et le degré de réticulation des gels. On distingue:
- Les xérogels: Sont des gels semi-rigides qui ne gardent pas leur forme initiale lorsque la
phase dispersante est éliminée.
- Les aerogels: Sont des gels rigides intéressants lorsqu’on travaille avec des débits élevés ou
sous forte pression.

Les différentes étapes de la chromatographie d’exclusion stérique regroupent:
Le choix du gel: Il dépend du poids moléculaire des composés à séparer (Tab. 3).
Le choix de la phase mobile: Le pH et la force ionique de la phase mobile dépendent de la

nature des composés de l’échantillon. La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase
stationnaire.
La préparation du gel: Il existe des gels prêts à l’emploi et des gels qui nécessitent un
gonflement par l’eau.
Le remplissage de la colonne avec la phase stationnaire.
L’équilibration de la colonne: C’est le lavage de la colonne avec la phase mobile (3 fois).
L’injection de l’échantillon.
L’élution: Elle se fait avec la phase mobile qui se déplace le long de la phase stationnaire
avec un débit bien déterminé selon le poids moléculaire des composés de l’échantillon.
La collection des fractions et l’analyse du chromatogramme.
La régénération du gel: Pour éliminer les contaminants, le gel est lavé par une solution
saline. Le gel est conservé à 2-4°C après addition d’un agent antimicrobien et de conservation
(azide de sodium).
Applications de la chromatographie d’exclusion stérique
Le domaine d’application de ce type de chromatographie est celui de la séparation des

macromolécules de masses molaires élevées.
Séparation de petites molécules et de macromolécules: Comme l’élimination des ions d’une

solution de macromolécules (exemple le facteur VIII antihémophilique) et la purification
d’une protéine après marquage à l’iode 131.
Analyse d’un mélange de macromolécules: C’est la purification de fractions plasmatiques

(immunoglobulines M) pour la préparation de médicaments ou de réactifs de diagnostic.
Fractionnement de petites molécules: Il regroupe l’analyse de peptides (en analyse

alimentaire dans les fromages), l’analyse d’enzymes et l’analyse de colorants dans les
produits alimentaires.
Séparation de cellules: La chromatographie sur gel de dextran permet d’isoler les

lymphocytes des monocytes.
Détermination des poids moléculaires: La meilleure méthode est l’étalonnage direct des
colonnes de chromatographie d’exclusion stérique avec des étalons de poids moléculaires

connus tels que le cytochrome C (12600), la myoglobine (17500), l’albumine (68000),
l’ovalbumine (45000) et la γ-globuline (160000).
Chromatographie échangeuse d’ions
Elle permet la séparation de molécules chargées (La séparation est en fonction de la charge
électrique). La phase stationnaire est un solide ayant des propriétés particulières que l’on
appelle un échangeur d’ions constitué par une résine porteuse de groupements ionisés
négativement ou positivement, exerçant des interactions électrostatiques (ioniques) avec des
composés (protéines) ionisées. Les échangeurs d’ions sont des macromolécules insolubles
portant des groupements ionisables ayant la propriété d’échanger de façon réversible certains
de leurs ions au contact d’autres ions provenant d’une solution (Fig. 7).
C’est une séparation des composés basée sur des interactions ioniques réversibles entre une
phase stationnaire appelée échangeur d’ion, des contres ions échangeables ou mobiles et un
soluté ou protéine chargé.
A) Les échangeurs d’ions
Ce sont des solides plus au moins poreux, gélifiables le plus souvent, se présentant sous forme
granulée. Ils constituent un réseau de macromolécules insolubles. Il existe deux grands
groupes de résines utilisées dans ce type de chromatographie (Fig. 8):
1. Les résines échangeuses de cations dont la phase stationnaire possède des groupements
fonctionnels de nature anionique se classent en fonction de leur aptitude à l’ionisation en:
Résines cationiques fortes: Résines sulfoniques (très fortement ionisées quelque soit le pH).
Résines cationiques intermédiaires: Résines phosphoriques.
Résines cationiques faibles: Résines carboxyliques (non ionisées en milieu acide fort).
Résines cationiques très faibles: Résines phénoliques (ionisées en milieu basique

uniquement).
2. Les résines échangeuses d’anions dont la phase stationnaire possède des groupements
fonctionnels de nature cationique se classent en fonction de leur aptitude à l’ionisation en:

Résines anioniques fortes (résines à amine quaternaire).
Résines anioniques faibles (résine à amine secondaire).

B) Mode opératoire
Il consiste à:
- Choisir le gel.
- Choisir la phase mobile.
- Equilibrer la colonne (fixation des contres ions).
- Injecter l’échantillon (l’étape de fixation ou adsorption des protéines).
- Effectuer l’élution (étape de désorption par la Fi ou pH).
Donc, la colonne est remplie, sans irrégularité, puis équilibrée (l’effluent doit avoir la même
composition que l’éluant). Lorsque le dépôt de l’échantillon est fait, on procède à une élution
soit en modifiant le pH, soit en modifiant la force ionique de l’éluant. On peut opérer avec un
gradient continu ou un gradient discontinu.
Le pH influe sur la charge nette de la protéine (caractère amphotère):
Si le pH du milieu est supérieur au point isoélectrique de la protéine, cette dernière devient

chargée négativement: Pour l’éluer, il faut diminuer le pH. Les protéines seront chargées
positivement et elles décrocheront de la résine.
Si le pH du milieu est inférieur au point isoélectrique de la protéine, cette dernière devient

chargée positivement: Pour l’éluer, il faut augmenter le pH. Les protéines seront chargées
négativement, elles décrocheront de la résine.
La force ionique exerce un effet de compétition entre la protéine fixée et des autres ions
(déplacement des ions fixés «les protéines» par un autre ion qui est fortement chargé et de
concentration plus élevée (exp. Cl-, HO-, Na+, H+...).
C) Applications
La chromatographie échangeuse d’ions est utilisée au laboratoire, depuis la préparation de

l’eau déminéralisée jusqu’à l’analyse de traces ioniques dans un échantillon. Elle s’applique à
l’analyse et à la séparation de sels minéraux, d’acides aminés, de peptides, de protéines, de
nucléotides, d’acides nucléiques, de lipides et de glucides ionisés.
Chromatographie d’affinité

Elle est basée sur des interactions spécifiques et réversibles entre des composés spécifiques
(ligands), lié par covalence à un support inerte qui constitue la phase fixe et son partenaire
d’affinité en solution (substance à analyser ou affinant) (Tab. 4; Fig. 9). Le ligand est fixé sur
une matrice (résine) directement ou indirectement à l’aide d’un bras fixateur (espaceur).
Dans le complexe de nature biologique, dont la formation est à la base de la chromatographie

d’affinité, l’un des partenaires au moins est une protéine ; cette protéine peut constituer le
ligand fixe ou le partenaire d’affinité en solution.
Exemples de ligand et d’affinant :
La phase stationnaire (le gel): Est constituée d’un effecteur (ligand), fixé par covalence à
un support poreux (matrice ou résine) par l’intermédiaire d’une chaîne latérale: le bras
fixateur. Le support peut-être en dexran, en agarose ou en polyachrylamide. Ce sont des
particules uniformes. Il doit être insoluble dans l’eau, stable chimiquement et mécaniquement
et doit porter des groupements fonctionnels réactifs permettant la fixation des bras fixateurs
Le bras fixateur: C’est une chaîne polycarbonnée (C6-C8) intercalée entre la matrice et le
ligand.
Le ligand: Toute substance capable de former des complexes stables avec les molécules à
isoler et possédant, par surcroît un groupement réactif assez éloigné du site actif pour que
celui-ci reste librement accessible après la fixation. C’est la molécule fonctionnelle, fixée
directement ou indirectement sur la matrice.

Les effecteurs utilisés sont:
- Pour la purification des enzymes:
Des substrats et analogue de substrat.
Des inhibiteurs réversibles.
Des effecteurs allostériques.
Des coenzymes.
- En immunologie:
Des haptènes.
Des antigènes.
Des anticorps.
- Pour l’étude des protéines réceptrices:
Des hormones.
A) Mode opératoire
Il consiste à:
- Choisir la phase mobile.
- Equilibrer la colonne.
- Injecter l’échantillon.
- Laver la colonne pour éliminer les substances non adsorbées.
- Eluer les substances adsorbée ou fixée.
La première opération consiste à préparer le gel d’affinité, en fixant le ligand sur le support.
Une colonne est remplie de ce gel d’affinité. On y fait passer la solution aqueuse contenant la
substance à purifier. Celle-ci est retenue, alors que les contaminants en solution passent
librement. Des lavages successifs permettent d’éliminer toute trace de produits indésirables.
Enfin, on élue la substance retenue en décomposant le complexe (Fig. 10).

B) Elution
Pour éluer les substances adsorbées, il est nécessaire de modifier certains paramètres:
Le pH: Le substrat voit alors ses charges électriques se modifier et son affinité pour le
ligand changer voire disparaître (élution non spécifique).
La force ionique en augmentant la concentration en sels (élution non spécifique).
La composition en ajoutant un composé (un tampon d’élution qui contient un compétiteur

ou un ligand non fixé) dont l’affinité avec le ligand est plus forte (élution spécifique).
C) Applications
La chromatographie d’affinité est adaptée, soit à l’analyse, soit à la préparation de substances

biologiques. Elle a été utilisée en:
- Enzymologie, pour l’extraction d’enzymes et la purification d’extrait enzymatiques.
- Immunologie, pour la purification d’anticorps.

- Protéino-chimie, pour l’étude des protéines membranaires.
- Chimie des acides nucléiques, pour le fractionnement de divers acides nucléiques (ARNm,
ARNr, etc.)
Autres types de chromatographie sur colonne
A. Chromatographie d’interaction hydrophobe
Le gel de chromatographie d’interactions hydrophobes porte un groupement hydrophobe tel

qu’un noyau phénol à l’extrémité d’une chaîne carbonée.
Dans la figure (11) suivante, les parties hachurées représentent les régions de caractère
hydrophobe en surface de la protéine.
1ère étape: La protéine à séparer est fixée sur le support chromatographique en présence
d’une forte concentration en sel: Dans un milieu à haute force ionique, les molécules d’eau de
l’enveloppe d’hydratation des protéines sont mobilisées pour hydrater les anions et les cations
issus de la dissociation du sel, c’est le phénomène de "salting-out". Il en résulte une
modification de l’organisation des molécules d’eau autour des protéines et ce changement
d’environnement est thermodynamiquement favorable à l’établissement d’interactions
hydrophobes entre les régions hydrophobes à la surface des protéines et le groupement
hydrophobe porté par la phase stationnaire.
2ème étape: Après rinçage du gel afin d’éliminer les protéines non adsorbées, l’élution des
protéines fixées est obtenue: En faisant passer un tampon de force ionique décroissante, les
ions du sel étant ainsi progressivement éliminés. Les acides aminés chargés ou polaires à la
surface des protéines peuvent de nouveau établir des liaisons hydrogène avec la phase mobile,
c’est-à dire que la solubilité des protéines dans la phase mobile redevient maximale et elles
sont éluées.

B. Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC)
Elle a été utilisée depuis 1975 et elle a réduit en moyenne de dix fois le temps nécessaire à
l’analyse de nombreux composés biochimiques. Elle se distingue des systèmes classiques par
une augmentation de la vitesse d’échange entre phase solide et liquide.
C’est une technique de séparation analytique en fonction de l’hydrophobicité et préparative

des molécules d’un composé ou d’un mélange de composés. Pour certains, HP signifie «haute
pression». Cette forme de chromatographie est fréquemment utilisée en biochimie, ainsi qu’en
chimie analytique. Le «P» du sigle, à l’origine signifiait Pression mais lorsque la méthode a
été améliorée (réduction des particules et régulation de la phase stationnaire) le «P» a donc été
attribué à Performance afin de marquer cette innovation. La fine granulométrie de la phase
stationnaire permet une meilleure séparation des composants. Les pics obtenus sont plus
étroits donc la résolution est améliorée (les pics sont bien séparés). La combinaison de la
rapidité et de la résolution élevées conduit à l’appellation haute performance.
Le champ d’application de ce type de chromatographie recouvre une grande partie du

domaine de la chromatographie en phase gazeuse auquel s’ajoute l’analyse:
Des composés thermosensibles.
Des composés très polaires.
Ainsi que des composés de masses molaires élevées.
Un appareil d’HPLC comprend différents modules: un réservoir à solvant contenant la phase

mobile, un système de pompage permettant d’effectuer des élutions graduées, un injecteur,
une colonne, un détecteur et un système d’acquisition de données (Fig. 12).

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CHAPITRE III: MOYENS DE PURIFICATION

La précipitation de biomolécules, particules ou cellules, leurs agrégats ou leurs complexes

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Précipitation des protéines du lait:

1. Versez le lait dans un bol.

3. Préparer un 15 % (v/v) d’acide acétique en mélangeant 7,5 mL d’acide acétique et diluer

4. Ajoutez l’acide acétique goutte-à-goutte au lait jusqu'à atteindre un pH de 4,6.

5. Filtration du lait ou centrifugation du lait (comme alternative à la filtration)

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Les méthodes chromatographiques peuvent être classées selon le support de la phase

- Chromatographie sur colonne (HPLC, CPG, et les colonnes de silice).

- Chromatographie sur surface (chromatographie sur couches minces ou CCM,

- Chromatographie en phase gazeuse (CPG).

- Chromatographie en phase liquide (CPL):

Chromatographie sur Couche Mince (CCM)

Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile,

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– la cuve chromatographique: un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé

– l’échantillon: environ un microlitre (ml) de solution diluée (2 à 5 %) du mélange à analyser,

– l’éluant (phase mobile): un solvant pur ou un mélange: il migre lentement le long de la

Pulvérisation d'un réactif caractéristique

Par immersion dans un bain de permanganate de potassium

Par pulvérisation de vapeur de diiode

Par observation à la lumière Ultra-Violet (UV) si la plaque de silice comporte un indicateur

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Exemple d’application Chromatographie des sucres Vérification de la présence de 3 glucides

Solutions de glucose, maltose et saccharose

Jus de fruit (jus d’orange)

- Insérer la plaque dans la cuve à chromatographie contenant 0.5 cm d'éluant.

Chromatographie sur colonne

- La phase stationnaire: support solide.

- La phase mobile: le solvant.

La vitesse de déplacement des composés dans la colonne dépend de:

Le choix du type de chromatographie et du support dépend de la nature des composés à

 L’échantillon: C’est la solution qui contient les composés à analyser.

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- Récupérer les fractions.

Chromatographie d’exclusion stérique (filtration sur gel ou tamisage moléculaire)

La chromatographie d’exclusion stérique est généralement utilisée pour déterminer le poids

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Le gel de ce type de chromatographie est caractérisé par:

La stabilité physico-chimique: Le gel doit être résistant à la température et à la pression de

La forme: La forme sphérique assure un écoulement uniforme de la phase mobile.

La nature: Les gels peuvent être en dextran, en polyachrylamide ou en agarose.

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Les différentes étapes de la chromatographie d’exclusion stérique regroupent:

Le choix de la phase mobile: Le pH et la force ionique de la phase mobile dépendent de la

Le remplissage de la colonne avec la phase stationnaire.

L’équilibration de la colonne: C’est le lavage de la colonne avec la phase mobile (3 fois).

La collection des fractions et l’analyse du chromatogramme.

Applications de la chromatographie d’exclusion stérique

Le domaine d’application de ce type de chromatographie est celui de la séparation des

Séparation de petites molécules et de macromolécules: Comme l’élimination des ions d’une

Analyse d’un mélange de macromolécules: C’est la purification de fractions plasmatiques

Fractionnement de petites molécules: Il regroupe l’analyse de peptides (en analyse

Séparation de cellules: La chromatographie sur gel de dextran permet d’isoler les

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Chromatographie échangeuse d’ions

A) Les échangeurs d’ions