BREARD Dimitri -Année 2010-2011-STRUGALA Aurore

TP Pesticides et Phytoprotection
Responsable : Laurence Gondet

Etude du mode d’action de l’Atrazine

Mots-clés Résumé
Atrazine L’atrazine (C8H14ClN5), herbicide de la famille des triazines a été utilisé pendant de
Herbicides nombreuses années en agriculture. La molécule se lie à la protéine D1 du
PSII photosystème II et inhibe donc le transfert des électrons nécessaire à la
Détoxification
photosynthèse. Des plantes ont développées des mécanismes de résistance tels que
Activité GST
Spinacia oleracea la modification de la protéine D1 ou la formation d’un complexe entre l’atrazine et
Zea mays la GSH (Glutathion) par la GST (Glutathion-S-Transférase) qui modifie la
conformation de l’herbicide. Cette étude a porté sur la détermination in vitro du I50
de l’atrazine par la mesure spectrophotométrique du transport photosynthétique des
électrons pendant la photosynthèse chez l’épinard et le maïs. Dans un second temps,
nous étudions la détoxication de l’herbicide par la mesure de l’activité enzymatique
GST dans les feuilles de maïs par deux protocoles différents. De cette façon, une I50
de 0,18µM pour l’épinard et 0,23µM pour la maïs a été obtenue et l’activité de la
GST dans les racines a été mesurée 2 à 3 fois supérieure à celle des feuilles selon le
protocole utilisé.

Introduction D1 et son action ne peut plus avoir lieu [1].

Le deuxième mode d’action mis en
L’atrazine ou 2-chloro-4-(éthylamine)-6- évidence est une détoxication de l’herbicide
(isoprylamine)-s-triazine, est un herbicide par la formation de complexes GSH [2].
racinaire de la famille des triazines. Il a été Cette réaction de détoxication est catalysée
largement utilisé pendant des années mais par l’enzyme GST. Cette enzyme est très
est aujourd’hui considéré comme nocif et présente chez le maïs, ce qui explique sa
dangereux pour l’homme et tolérance à l’atrazine. En réalisant cette
l’environnement et a de ce fait été interdit expérimentation, nous avons voulu étudier
dans l’union européenne en 2004. Lorsque le mode de fonctionnement de l’atrazine à
les premières plantes résistantes sont l’aide de deux expériences. La première
apparues, il a fallu déterminer quels étant de déterminer le I50 de l’atrazine sur le
mécanismes y étaient associés. Deux transport photosynthétique des électrons
mécanismes distincts de résistance ont alors dans les chloroplastes d’épinards ( plante
été découverts. Le premier est une sensible) et de maïs ( plante résistante) puis
modification de la cible de l’herbicide par la seconde de mesurer l’activité
une mutation ponctuelle. L’atrazine perd enzymatique GST dans les racines et les
alors sa capacité de fixation à la protéine feuilles de plantules de maïs (en utilisant

1
deux protocoles différents) afin d’étudier la et quantification » mais seules les quantités
détoxication d’une plante résistante. du matériel de départ et des réactifs varient.

Protocole expérimental

Détermination du I50 de l’atrazine sur le

transport photosynthétique des électrons

Résultats
Détermination du I50 de l’atrazine

Le dosage spectrophotométrique de la
chlorophylle à 645 et 663 nm nous a permis
de calculer la concentration totale en
chlorophylle de notre préparation par la
formule de McKinney. Nous obtenons une
concentration de 188,6 µg/mL que nous
avons ramenée à 30 µg/mL par dilution afin
de pouvoir mesurer l’intensité du transport
d’électrons en présence de concentrations
croissantes en atrazine.
La mesure de DO600nm nous a permis de
tracer une courbe de l’absorbance à 600nm
en fonction de la concentration en atrazine
(document 1). Cette mesure fait appel au
DCPIP (2,6-dichlorophenolindophenol), qui
Etude de la réaction de détoxication par la possède des propriétés colorimétriques
mesure de l’activité GST dans les racines (document 2). L’absorbance mesurée pour
et les feuilles de maïs le témoin laissé à l’obscurité (100%
d’inhibition car pas de photosynthèse)
Nous avons utilisé deux protocoles donne une absorbance de 0,698. Cette
différents pour la manipulation « extraction valeur nous permet de déterminer
graphiquement le I50 qui est de 0,12 AE(GST)feuilles = 216 nmoles/mn/mg de
(document 1). Idem pour le maïs. protéinés

AE(GST) racines = 1203 nmoles/mn/mg de

Mesure de l’activité enzymatique GST protéinés
dans les racines et feuilles de maïs
Protocole 2 (Vtotal = 3mL ; Vextrait = 100µL)
Le dosage des protéines a été réalisé à partir
d’une gamme étalon de BSA (document 3).
Les protéines sont détectées par AE(GST) feuilles = 66 nmoles/mn/mg de
spectrophotométrie à 595nm grâce au protéinés
réactif de Bradford qui forme des
complexes aspécifiques avec les protéines. AE(GST) racines = 648 nmoles/mn/mg de
Grâce à cette courbe, on peut déterminer la protéinés
quantité de protéine présente dans notre
extrait brut. Nous avons répété trois fois Discussion
l’expérience, avec 10, 20 et 30 µL d’extrait
brut de feuilles et de racines de maïs obtenu L’atrazine est un herbicide qui a été utilisé
par le protocole 1 et le 2. En faisant les pendant de nombreuses années mais est
moyennes nous obtenons : maintenant interdit du fait de sa grande
toxicité. Les doses élevées (voire
Protocole 1 excessives) utilisées de cet herbicides ont
fait naitre des résistances chez certaines
[Protéines] feuilles = 1,49 mg/mL espèces. Cela a permis de découvrir son
mécanisme d’action qui est de bloquer la
[Protéines] racines = 0,39 mg/mL protéine D1 du photosystème II en s’y
fixant grâce à son analogie avec la
Protocole 2 plastoquinone, le substrat physiologique
(document 5).
[Protéines] feuilles = 4,4 mg/mL

[Protéines] racines = 0,96 mg/mL

Vient ensuite la mesure au

spectrophotomètre à 340nm de l’activité
enzymatique de la GST qui est possible
grâce à la formation du complexe entre le
GSH et le CDNB (2,4-
Dinitrochlorobenzene). Pour les feuilles du
protocole 1, nous obtenons une droite
(document 4) avec une pente de
0,0774ΔDO/mn. On peut alors déterminer
l’activité enzymatique de la GST :

Protocole 1 (Vtotal = 1mL ; Vextrait = 25µL)

AE(GST)feuilles = (ΔDO/mn * Vtotal * 103) / (l

* ε * Vextrait * [protéine]feuilles)
La plastoquinone ne peut plus être réduite GSH-atrazine par la GST tout en comparant
et les électrons s’accumulent dans les 2 protocoles différents.
chloroplastes et la photosynthèse est La formation de ce complexe fait que
bloquée grâce à l’inhibition compétitive de l’atrazine prend une nouvelle conformation
l’atrazine. et n’est alors plus capable de se fixer à la
place de la plastoquinone sur la protéine
Le calcul du I50 (valeur pour laquelle on D1. La complexation GSH-atrazine
observe 50% d’inhibition du transport constitue donc un mécanisme spécifique de
photosynthétique des électrons) nous a détoxication mis en place par le maïs pour
permis de vérifier l’efficacité de l’atrazine survivre à l’herbicide. Cette capacité de
sur l’épinard et le maïs et donc de conclure détoxication peut être quantifiée en
sur la présence d’une résistance ou d’une mesurant l’activité de la GST.
sensibilité à l’herbicide. L’étude du L’activité GST est déterminée grâce à un
transport des électrons nous a donné une I50 substrat artificiel, le CDNB. L’activité GST
de 0,18µM (moyenne) pour l’épinard est plus importante dans les racines que
(valeurs des livres comprises entre 0,2 et dans les feuilles du maïs (2 à 3 fois plus
0,3). Cela indique bien que l’épinard est selon le protocole utilisé). L’atrazine étant
une plante sensible avec une I50 faible. En un herbicide racinaire, ce fonctionnement
revanche, pour le maïs, nous trouvons une plus important de la GST dans les racines
I50 de 0,23µM (moyenne) qui apparait assez doit probablement permettre d’éviter la
faible pour une espèce résistante à montée de l’herbicide dans les parties
l’atrazine. En temps normal, les plantes aériennes.
résistance ont un I50 entre 100 et 200 fois Les résultats des deux protocoles ne
supérieure. Mais il s’agit là des valeurs donnent pas les mêmes résultats mais sont
pour les résistances dues à une mutation de cohérents pour la comparaison de l’activité
la cible (protéine D1) [1]. D’après le cours, enzymatique dans les feuilles et racines (2 à
le I50 du maïs est de 0,3µM alors qu’il est 3 fois plus dans les racines). Il faut juste
résistant à l’atrazine. En fait, la cible n’est prendre en compte que pour le protocole 2,
pas résistante à l’herbicide et donc, la la concentration protéique dans les feuilles
détermination de l’intensité du transport des est trop importante dans 20 et 30µL pour
électrons en présence d’atrazine et de pouvoir rentrer dans la gamme de BSA
DCPIP par spectrophotométrie donne les réalisée et donc le calcul ne se base que sur
mêmes résultats qu’une plante sensible [2]. une seule valeur ce qui pourrait poser des
Le facteur de tolérance de la protéine D1 problèmes dans d’autres circonstances.
étant nul pour les plantes résistantes et
sensibles, la résistance du maïs doit
provenir d’une détoxication par la GST (ce Conclusion
n’est pas le seul mécanisme, il existe
également les transférases types glycosyl- L’Atrazine agit sur le transport des
transférase qui participent chez certaines électrons lors de la photosynthèse. Elle
espèces à la détoxication par exemple). entre en compétition pour la protéine D1
C’est cette activité GST que nous allons avec la plastoquinone et empêche sa
quantifier dans la deuxième partie. réduction ce qui conduit à la mort de la
plante.
Des études ont montré que le maïs Elle possède une forte action cytotoxique
possède une forte activité GST et qu’il est sur les plantes sensibles comme l’épinard,
capable de détoxiquer plusieurs herbicides. mesurable par le I50.
Notre étude s’est concentrée sur le Des plantes comme la pomme de terre
mécanisme de formation des complexes (Solanum tuberosum) ont développé une
résistance suite à la mutation d’un acide
aminé de la protéine cible [1]. Mais d’autres
comme le maïs (Zea mays) ou l'abutilon
d'Avicenne (Abutilon theophrasti) ont
développé des mécanismes de
détoxification de l’herbicide comme celui
réalisé par la GST [2].
La GST catalyse la formation d’un
complexe entre le GSH et l’atrazine
empêchant son action sur la protéine D1.
L’atrazine fait partie des herbicides
systémique ascendant, c’est pourquoi les
mécanismes de détoxication sont plus
importants au niveau racinaire qu’au niveau
foliaire afin de combattre le mal à sa source
et d’éviter la propagation de l’herbicide.

Bibliographie
[1] Reid j. Smeda, Paul M. Hasegawa,
Peter B. Goldsbrough, Narendra K.
Singh, and Stephen C. Weller. A serine-
to-threonine substitution in the triazine
herbicide-binding protein in potato cells
results in atrazine resistance without
impairing productivity. Plant Physiol.
(1993) 103: 911-917.

[2] Michael P. Anderson and John W.

Gronwald. Atrazine resistance in a
velvetleaf (Abutilon theophrasti) biotype
due to enhanced Glutathione S-Transferase
activity. Plant Physiol. (1991) 96, 104-109.

Aqel W. Abu-Qare, Harry J. Duncan.

Herbicide safeners: uses, limitations,
metabolism, and mechanisms of action.
Chemosphere 48 (2002) 965–974.