III/ LA RÉPLICATION DE L’ADN CHEZ LES EUCARYOTES

A) CARACTERISTIQUES DE LA RÉPLICATION CHEZ LES EUCARYOTES :

Le mécanisme de réplication chez les eucaryotes est similaire à celui des procaryotes :

- Elle se fait de manière "bidirectionnelle", "complémentaire", "antiparallèle", dans le sens 5'→3'

- Elle se fait de manière "semi-discontinue" (le brin avancé est synthétisé d'une manière continue, et le brin
retardé est synthétisé d'une manière discontinue)

- Les ADN polymérases eucaryotes ont les mêmes besoins que les ADN polymérases procaryotes (les 4
désoxynucléotides tri-(P), une matrice d'ADN simple brin et une amorce)

- Les ADN polymérases eucaryotes possèdent une activité de correction des erreurs d'incorporation.

Cependant, en raison de la forme linéaire des chromosomes eucaryotes et leur taille importante, ainsi que la
complexité du génome eucaryote (structure chromatinienne), la réplication de l'ADN eucaryote est un processus
plus complexe.

Le tableau suivant résume les différences de la réplication entre procaryotes et eucaryotes :

Procaryotes Eucaryotes Commentaires

Plusieurs origines par

Origine de 1 seule origine par Les chromosomes eucaryotes sont nombreux
chromosome (≈ 1
réplication chromosome et plus longs. La réplication est relativement
origine chaque 20 kb)
lente, d’où la nécessité de plusieurs origines
de réplication pour réduire le temps de
Vitesse de 1500 à 2000
≈ 100 nucléotides/sec réplication.
réplication nucléotides/sec

L’ADN eucaryote est organisé en chromatine.

Lorsque la fourche de réplication progresse,
Taille des l’ADN doit être déroulé du nucléosome pour
1000 à 2000
fragments 100 à 200 nucléotides que la réplication puisse avoir lieu. Ceci
nucléotides
d’Okazaki ralentit la fourche de réplication, ce qui
pourrait expliquer la faible longueur des
fragments d’Okazaki eucaryotes.

ADN polymérase α Les ADN polymérases α, δ et ε sont

impliquées dans la réplication de l’ADN
Enzymes de ADN polymérase III ADN polymérase δ
nucléaire.
réplication + ADN polymérase I ADN polymérase ε
L’ADN polymérase γ intervient dans la
ADN polymérase γ réplication de l’ADN mitochondrial

La réplication des chromosomes linéaires

conduit à leur raccourcissement après chaque
Réplication des
cycle de réplication. Les télomères sont
télomères
Etapes répliqués par un mécanisme particulier afin
supplémentaires Aucune d’empêcher ce raccourcissement.
de réplication
Reconstitution de la
structure Reformation des nucléosomes
chromatinienne

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B) LE CYCLE CELLULAIRE ET LE CONTRÔLE DE LA RÉPLICATION DE L'ADN EUCARYOTE

- Dans les cellules eucaryotes, la réplication de l’ADN se produit pendant la phase S du cycle cellulaire.
- Le cycle cellulaire est régulé par une série de "Points de contrôle" (ou chekpoints) qui contrôlent le passage
d'une phase à une autre.
- Le moment de la réplication est strictement contrôlé pour assurer que le génome soit répliqué une
seule fois par cycle cellulaire.
- Les points de contrôle impliquent des cyclines et des CDKs (Cyclin dependant protein kinases).
- Les cyclines sont des protéines synthétisées à une phase du cycle cellulaire et dégradées à une
autre. Ainsi, elles apparaissent et disparaissent à des moments spécifiques durant le cycle cellulaire. Les CDKs
sont des kinases dont l'activité dépend des cyclines. Elles sont donc inactives à moins qu'elles se complexent avec
leurs cyclines spécifiques. Les CDKs contrôlent des évènements à chaque phase du cycle cellulaire en
phosphorylant des protéines spécifiques.
- Chez les vertébrés, Les complexes [CDK4-Cycline D] et [CDK6-Cycline D] sont appelés G1-Cdk ; ils se
forment durant la phase G1et permettent la progression au-delà du point de restriction à la frontière G1/S.
- Le complexe [CDK2-Cycline E] (appelés G1/S-Cdk), est responsable du passage de la cellule à la phase S. La
progression dans la phase S est assurée par le complexe [CDK2-Cycline A] (S-Cdk) qui déclenche la réplication
de l’ADN.

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C) PROTÉINES ET ENZYMES IMPLIQUÉES DANS LA RÉPLICATION DE L’ADN EUCARYOTE :

- Les cellules eucaryotes contiennent plus de 15 ADN polymérases différentes (Voir tableau ci-après). Parmi
lesquelles 3 sont directement impliquées dans la réplication du génome nucléaire (ADN polymérase α, ε et δ).
L’ADN polymérase γ intervient dans la réplication de l’ADN mitochondrial.

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D) MÉCANISME DE LA RÉPLICATION CHEZ LES EUCARYOTES : (Exemple de la levure)

- Dans les cellules eucaryotes, la synthèse de l’ADN se produit pendant la phase S du cycle cellulaire.

- Le processus de réplication se déroule en trois étapes : Initiation, Elongation et Terminaison

1) Initiation

- En raison de la grande longueur de l’ADN, la réplication

chez les eucaryotes débute simultanément en plusieurs points
d’un même chromosome appelés réplicons. A partir de
chaque réplicon, elle progresse de façon bidirectionnelle,
jusqu’à ce que les deux réplicons adjacents entrent en contact
et que l’ensemble de l’ADN soit dédoublé.

- Il existe des milliers d’origines de réplication dans le génome eucaryote. Chez la levure, les origines de réplications
sont appelées ARS (Autonomously Replicating Sequences). Il s’agit de séquences d’environ 100 à 200 pb riches en
paires AT.

- La séquence ARS est reconnue par un complexe protéique

spécifique appelé ORC (Origin-Recognition Complex) qui s’y fixe
tout au long du cycle cellulaire.

- ORC rectrute le complexe RLF (Replication licensing Factor)

formé par les protéines Cdc6 et Cdt1.

- A leur tour, Cdc6 et Cdt1 recrutent les protéines Mcm

(Minichromosome maintenance) pour former le complexe de pré-
réplication. Ce complexe se forme uniquement en phase G1. A ce
stade les origines sont "licenciées", c'est à dire qu'elles sont
autorisées à démarrer la réplication.

- L'activation ultérieure de l'origine de réplication se produit lors de

la phase S, elle est assurée par la kinase S-Cdk.

- La S-Cdk phosphoryle le complexe de pré-réplication ce qui

conduit à la libération des protéines Cdc6 et Cdt1, à l'assemblage
d'autres protéines au niveau de l'origine de réplication pour former le
complexe de pré-initiation et à la stimulation de l’activité Hélicase
de la Mcm. (La S-Cdk bloque également la re-réplication en induisant
la dégradation de Cdc6 et l'inactivation de ORC.)

- Une fois les brins d’ADN sont séparés par Mcm, Les protéines RPA (replicating protein A) se lient à l’ADN simple
brin pour empêcher sa refermeture. L'ADN polymérase α et d'autres protéines de réplication sont recrutées l'origine
afin de démarrer la synthèse de l'ADN.

- L’ADN polymérase α synthétise des amorces d’ARN de 2 à 12 nucléotides. Elle allonge ensuite ces amorces
de courtes séquences d’ADN (appelée ADNi pour ADN initiateur) grâce à son activité ADN polymérase.
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2) Elongation

- Le RFC (Replication factor C), qui joue un rôle équivalent au

complexe gamma d'E. coli, se lie à l'ADNi puis charge la bride mobile
(PCNA) avec une ADN polymérase à chaque brin d'ADN (ADN
polymérase ε sur le brin avancé et ADN polymérase δ sur le brin
retardé). Les ADN polymérases allongent les amorces pendant que le
complexe Mcm continue à dérouler l'ADN et que la topoisomérase I
relâche la tension devant la fourche de réplication. L’ADN déroulé est
maintenu sous état simple brin grâce aux protéines RPA.

- Dans chaque fourche de réplication, les deux brins d’ADN sont synthétisés simultanément par deux ADN
polymérases : l’ADN polymérase ε assure la synthèse du brin avancé, et l’ADN polymérase δ synthétise le brin
retardé. Le mécanisme est très similaire à celui observé dans la réplication de l’ADN procaryote :

Synthèse du brin avancé : Une seule amorce est nécessaire pour initier la synthèse. L’ADN polymérase ε ajoute
des nucléotides sur le 3’-OH de l’amorce dans le sens 5’→3’ continuellement sans avoir à se détacher de l’ADN
matrice.

Synthèse du brin retardé : La synthèse du brin retardé se fait également dans le sens 5’→3’, mais son sens ne
coïncide pas avec la direction de la progression de la fourche de réplication. Sa synthèse est donc discontinue
selon la séquence d’événements suivante :

1) L’ADN polymérase α synthétise une amorce d’ARN + ADNi ;

2) L’ADN polymérase δ s’attache à l’ADN matrice par le PCNA
et allonge l’amorce par de l’ADN dans le sens 5’→3’ ;
3) La synthèse d’ADN se poursuit (100 à 200 nucléotides)
jusqu’à ce que l’ADN ploymérase δ rencontre une zone d’ADN
double brin, la bride mobile s’ouvre et l’ADN polymérase quitte
l’ADN.
4) L’ADN polymérase δ se fixe sur la prochaine amorce pour
commencer un autre cycle de synthèse ;
5) En parallèle, la RNase H et FEN-1 interviennent pour dégrader
l’amorce d’ARN + ADNi et l’ADN polymérase δ remplacer les
ribonucléotides éliminés par des désoxyribonucléotides ;
6) Une ADN ligase intervient ensuite pour souder les extrémités
libres.
- Les étapes (1) à (6) sont répétées jusqu’à ce que les fourches de réplication se joignent.
- Tout au long de la synthèse d'ADN, les nucléosomes sont désassemblés devant la fourche de réplication afin de
permettre le passage de la machinerie de réplication. Les nucléosomes se reconstituent ensuite sur les deux hélices
post-réplicatives à environ 250 pb derrière la fourche de réplication.

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3) Terminaison : Réplication des télomères

- Le fait que les ADN polymérases ne puissent ajouter des

nucléotides qu’à une extrémité 3'-OH préexistante, la réplication de
l'ADN eucaryote linéaire pose problème, notamment à l'extrémité
des chromosomes. Le mécanisme normal de réplication ne permet
pas de compléter l’extrémité 5' des brins d’ADN nouvellement
formés. Même si une amorce d’ARN liée à l’extrémité du brin
matrice peut commencer la synthèse d’un fragment d’Okazaki, cette
amorce ne peut pas être remplacée par de l’ADN une fois qu’elle est
enlevée. En effet, il n’y a pas d’extrémité 3' sur laquelle l’ADN
polymérase peut ajouter des nucléotides. Au fil des réplications
successives, les molécules d’ADN deviennent de plus en plus courtes
et la cellule finira par perdre des parties indispensables de son ADN,
entrainant sa mort.

- Rappelons que les télomères sont constitués de séquences courtes

répétées en tandem (Voir l’avant dernier point du cours du
08/04/2020).

- La solution au problème de raccourcissement des chromosomes

linéaires à la fin de la réplication est l’allongement des télomères.
Ceci est assuré par une enzyme appelée "Télomérase". Cette enzyme
allonge l'extrémité 3' suffisamment pour permettre la synthèse d'une
amorce et la reconstitution du brin complémentaire.

- La télomérase est une ribonucléoprotéine (c’est-à-dire que c’est une

protéine qui contient de l’ARN dans sa structure).

- L’ARN faisant partie de la télomérase a une séquence

complémentaire à la séquence du télomère. La télomérase reconnait
l’extrémité du chromosome et s’y lie grâce à cette complémentarité.

- La télomérase utilise son propre ARN comme matrice et commence

à ajouter les nucléotides sur l’extrémité 3’-OH de l’ADN dans le sens
5’3’. La télomérase est donc une transcriptase inverse.

- Arès l'addition de quelques nucléotides, la télomérase se déplace

(translocation) pour allonger davantage l'extrémité 3'. Après
plusieurs cycles de synthèse, l'ADN polymérase α (primase) vient
synthétiser une amorce sur le brin 3' maintenant allongé, afin de
permettre à l'ADN polymérase de synthétiser le brin complémentaire.

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E) RÉPLICATION DE L’ADN MITOCHONDRIAL :

- La réplication de l'ADN mitochondrial (ADNmt) est indépendante de celle de l'ADN nucléaire. Elle est assurée
par l'ADN polymérase γ.

- L'ADN mitochondrial est circulaire double brin. Un brin est appelé "Brin H" (Heavy) et l'autre "Brin L" (Light).

- Contrairement à celle de l'ADN nucléaire, la réplication de l'ADNmt est uni-directionnelle à partir de deux
origines de réplication différentes ; une pour chaque brin. La réplication se fait de manière "continue" pour les
deux brins.

- La réplication débute d'abord au niveau de l'origine OH en utilisant le brin H comme matrice. La machinerie de
réplication synthétise un nouveau brin L en déplaçant le brin parental L formant une structure appelée "Boucle
D" (D-Loop).

- Le brin parental L continue à être déplacer à fur et à mesure jusqu'à ce que la machinerie de réplication ait
parcouru les 2/3 de l’ADN arrivant à la deuxième origine OL. A ce moment la réplication de l'autre brin est
déclenchée et la synthèse d'un nouveau brin H commence et progresse dans le sens opposé à celui de la synthèse
du nouveau brin L.

- Lorsque la synthèse du nouveau brin L s'achève, la première molécule fille est libérée tandis que se poursuit la
synthèse du nouveau brin H.

- La synthèse du nouveau brin H se poursuit jusqu'à la formation de la deuxième molécule fille.