Laboratoire(5) BCH2733

Isolement et caractérisation d’ADN bactérien d’E. Coli

SECTION : 3 (vendredi matin 1ère semaine)

Date de la séance

Vendredi le 27 Mars 2015

Remise :

Vendredi le 3 avril

ÉQUIPE # 20

Université d’Ottawa

But :

Ce laboratoire a comme but d’extraire l’ADN de cellules E.coli et

comparer l’homogénéité et l’intégrité de sa structure. Dans la première
expérience, nous avons eectué l’extraction par en déterminant les
absorbances à 234, 260 et 280 nm. Dans la deuxième expérience, on
va analyser les valeurs d’absorption de l’ADN à 260 nm en fonction de
la température. en eectuant des courbes de fusion pour déterminer
sapureté , on travaille à ce niveau-là avec 3 échantillons de sources
commerciales d'ADN diérents. Dans la dernière partie de laboratoire
nous allons utiliser les enzymes de restriction EcoRl (U/µL),Hindlll
(U/µL) et un gel d’agarose pour déterminer les tailles relatives des
fragments.En4n,On doit noter le numéro de notre échantillon qui est un
plasmide #41 dans ce laboratoire.

R1 : Tableau 1 : Absorbances d’une solution d’ADN d’une

cellule souche B d’E.coli e4ectuée par un spectrophotomètre
ultra-violetà234, 260 et 280 nm

On fait une extraction d’ADN d’une cellule souche B de E.coli , on doit

d’abord eectuer une dénaturation des protéines membranaires .
Ensuite on ajoute 4 ml d’une solution saline d’EDTA (NaCl 0,15 M dans
EDTA- l’éthylène-diamine-tétra-acétate 0,1M, a pH 8,0 ) dans un tube
Falcon de 50 mL, un volume de 375 uL d’une solution de dodecyl
sulfate de sodium (SDS) est ajouté , on met le milieu de réaction dans
un bain marie a 60 0C , ensuite on ajoute 0.725mL NaClO4 6M et 5 ml
de chloroforme : alcool isoamylique (24 : 1v /v) sous la hotte. Avant de
centrifuger le mélange a 12000 xg pendant 5 min on mélange dans un
agitateur ondulant, on pipete après 200 µL de la solution d’ADN
(formée après la récupération de l’ADN enroulé)dans une cuvette en
quartz contenant 800µL de tampon citrate 15 mM.

A234 A260 A280

Absorbance 0,343 0,418 0,298

A4n d’évaluer la pureté de notre échantillon on utilise le ratio

A260/A280, l’idéalité dans ce cas est entre 1,8-1,9 après nos calculs, si
on trouvera une valeur de ration qui est inferieure a cet intervalle on
pourra conclure qu’il y a une contamination de protéine, si c’est le cas
contraire (supérieure à l’intervalle) on pourra conclure qu’il y a une
contamination d’ARN . pour s’assurer de la contamination par des
protéines on applique le ratio A234/A260 , si il est supérieur à 0,5 on dit
que notre échantillon est contaminé

Exemple de calculs des ratios d’absorbances

A260 = 0,418

A280 = 0,298

A260/A280= (0.418)/ (0.298)

=1,40

Notre rapport A260/ A280 est de 1,4 et ce qui traduit une contamination
protéique ou d’ARN. Pour véri4er ceci. On utilise le rapport A 234/ A260 car les
acides nucléiques ont une absorption minimale a 234nm et la présence de
protéines résulte une augmentation de l’absorption. En général, notre
rapport de A234/ A260 est de 0,82 ce qui traduit une contamination protéique
dans l’ADN d’E. Coli qu’on a isolé.
R2 :

0.02 0.7

0.02 0.6
0.01
0.5
0.01
0.4
0
Derivé dA/dT Absorbance
0.3
-0.01
0.2
-0.01

-0.02 0.1

-0.02 0
45 55 65 75 85 95 105

Température

Figure 1. Graphique des courbes de fusion de l’ADN commercial .

Une solution diluée a 1 :20 de l’ADN commercial a été utilisée dans 1

mL de tampon sitrate 15 mM a PH 7 on analyse l’échantillon avec un
spectrophotomètre Cary 100 Bio .Ensuite et sur le même graphique on
trace deux courbes , la rouge qui montre la dépendance entre
l’absorbance et l’échantillon A ( provenant de notre equipe # 20 ) et la
température , avec une autre bleu qui montre la dépendance entre la
température et la première dérivé , les données ont été pris des
document envoyé par nôtres TA sur la section de laboratoire , les axes
dans le graphique ont été identi4és , la raison pour laquel on a fait
deux axes est que l’intervalle des valeurs de la dérivés et les
absorbances sont diérents . As et Ad correspondent aux absorbances
4nales et initiales de la courbe d’absorbance.
 12.2 0.01

10.2 0.01

0.01
8.2
0.01
6.2
Absorbance dA\dT
0
4.2
0

2.2 0

0.2 0
40 50 60 70 80 90 100

Température

Figure 2. Graphique des courbes de fusion de de l’échantillon B

( ADN commercial + 0,03 M NaClO4 )

Une solution diluée a 1 :20 de l’ADN commercial a été utilisée dans 1

mL de tampon sitrate 15 mM a PH 7 on analyse l’échantillon avec un
spectrophotomètre Cary 100 Bio .Ensuite et sur le même graphique on
trace deux courbes , la rouge qui montre la dépendance entre
l’absorbance et l’échantillon A ( provenant de l’équipe# 22 ) et la
température , avec une autre bleu qui montre la dépendance entre la
température et la première dérivédA/dT, les données ont été pris des
document envoyé par nôtres TA sur la section de laboratoire , les axes
dans le graphique ont été identi4és , la raison pour laquel on a fait
deux axes est que l’intervalle des valeurs de la dérivés et les
absorbances sont diérents . As et Ad correspondent aux absorbances finales et
initiales de la courbe d’absorbance.
 12.2 0.01

10.2 0.01

8.2 0.01

6.2 0
Absorbance dA\dT

4.2 0

2.2 0

0.2 0
40 50 60 70 80 90 100

Température

Figure 2. Graphique des courbes de fusion de de l’échantillon C

( ADN commercial + 4,75 M NaClO4 )

Une solution diluée a 1 :20 de l’ADN commercial a été utilisée dans 1

mL de tampon sitrate 15 mM a PH 7 on analyse l’échantillon avec un
spectrophotomètre Cary 100 Bio .Ensuite et sur le même graphique on
trace deux courbes , la rouge qui montre la dépendance entre
l’absorbance et l’échantillon A ( provenant de l’équipe# 18 ) et la
température , avec une autre bleu qui montre la dépendance entre la
température et la première dérivédA/dT, les données ont été pris des
document envoyé par nôtres TA sur la section de laboratoire , les axes
dans le graphique ont été identi4és , la raison pour laquel on a fait
deux axes est que l’intervalle des valeurs de la dérivés et les
absorbances sont diérents . As et Ad correspondent aux absorbances finales et
initiales de la courbe d’absorbance.
 0.49 0.01

0
0.47
0
0.45 0

0
0.43
0
Absorbance Dérivé sA/dT
0.41
0

0.39 0

0
0.37
0

0.35 0
40 50 60 70 80 90 100

Température

Figure 2. Graphique des courbes de fusion de de l’échantillon D

( extrait d’ADN )

Une solution diluée a 1 :20 de l’ADN commercial a été utilisée dans 1

mL de tampon sitrate 15 mM a PH 7 on analyse l’échantillon avec un
spectrophotomètre Cary 100 Bio .Ensuite et sur le même graphique on
trace deux courbes , la rouge qui montre la dépendance entre
l’absorbance et l’échantillon A ( provenant de notre équipe # 20 ) et la
température , avec une autre bleu qui montre la dépendance entre la
température et la première dérivédA/dT, les données ont été pris des
document envoyé par nôtres TA sur la section de laboratoire , les axes
dans le graphique ont été identi4és , la raison pour laquel on a fait
deux axes est que l’intervalle des valeurs de la dérivés et les
absorbances sont diérents . As et Ad correspondent aux absorbances finales et
initiales de la courbe d’absorbance.
 Tableau 2 :. Résultats de la fusion des échantillons d’ADN.
L’échantillon A contenait de l’ADN à partir d'une source commerciale
de E. coli dilué dans 15 mM de tampon citrate, pH 7,0. L'échantillon B
contenait de l'ADN à partir d'une source commerciale de E. coli dilué
dans 15 mM de tampon citrate et 0,03 M NaClO 4. L'échantillon C
contenait l'ADN à partir d'une source commerciale de E. coli dilué dans
15 mM de tampon citrate et 4.75M NaClO4. Le dernier échantillon,
l'échantillon D, contenait une partie de notre ADN en laboratoire extrait
dilué dans un tampon de citrate 15 mM, pH 7,0. .Les valeurs utilisés
dans ce tableau proviennent des quatre graphiques ci haut , en
extrapolant les points, un système de Cary100 Bio a été utilisé dans le
laboratoire a4n de suivre les absorbances a 260 nm A chaque fois, 1mL
d’une solution diluée 1 :20 à partir de la solution d’ADN commercial
correspondante est utilisé. Notre équipe # 20 a fait l’expérience avec
les échantillons a et d , les valeurs pour les autres échantillons ont été
pris des autres groupes , # 18 et 22 pour les échantillons C et B
respectivement

Échantillond’ADN Tm (°C) DT (°C) h (%) h/DT (°C-1)

a) Commercial 79,06 19,99 26,26 1,32
b) Commercial + 0.1M NaClO4 82,62 20,01 35,54 1,78
c) Commercial +4,75M NaCLO4 71,15 25,99 35,14 1,35
d) AND extrait (etape 15) 86,02 11,03 7,31 O,66

Calcul pour echantillon a :

Température de fusion (Tm):
Température(sur l’axe des X ) correspondant au point d’inflexion de la courbe de
dénaturation thermique , cette dernière est une courbe de dépendance entre la température
et la première dérivé . Cette valeur se trouve en extrapolant le point maximal sur la
courbe
Tm = 79,06OC

D Température:
Le différence entre Tf et Tiqui correspondent aux températures correspondantes aux
points d’inflexion de la courbe de l’absorbance en fonction de température
Ti = 73,27 OC( extrapolation sur axes des X )
Tf = 93,26 OC( extrapolation sur axes des X )
DT = Tf - Ti= 93,26 OC –73,27 OC = 19,99 OC

Hyperchromicité (h) %:

Ce pourcentage indique la pureté de l’ADN , en d’autres mots , un effet hyperchrome

inférieur à 40% indique que l'ADN est contaminé As correspond à l'absorbance d'un seul
brin d'ADN (absorption élevée), tandis qu’Ad correspond à l'absorbance de l'ADN double
brin (faible absorbance).
Asimplebrin = 0,601
Adoublebrin = 0.476
h% = 100 (As – Ad) / Ad
= 100 (0,601- 0,476) / (0.476)
= 26,26 %
Rapport de h / DT:
h / ΔT: = 26.10 % / 19.95 ºC = 1,315
R3)
Pour mieux comprendre l’eet de la concentration en sel sur la
structure de l’ADN on pourra faire une comparaison entre la
température de fusion Tm et l’hyperchromicité h des diérentes
solutions utilisées , la première est la solution qui possède une faible
concentration du sel B ( o,o3 M NaClO4 ) ou le sel joue un rôle d’un
agent stabilisant qui cause une augmentation de la température de
fusion car il stabilise les charges négatives ( par les cations NA+ ) ou on
aura moins de désordre qui déstabilise l’ADN a double brin , la
deuxième est celle qui possède une concentration plus signi4cative en
sel C( 4,75 M NaCLO4) ou on va avoir plus de déstabilisation sur la
double hélice d’ADN et la dernière est la solution témoin (sans sel ) .
On regardant nos valeurs on remarque que la Tm de l’échantillon C
ayant une concentration élevée en sel est de 71°C , plus petite que
celle de l’ADN commercial 79 °C et celle de l’échantillon B est de 82 °C
qui est plus grande que l’échantillon de l’ADN commercial .

R4 )
L’échantillon D est un extrait d’ADN qui ne possède aucune portion de
sel ,donc on l’utilise pour mieux commenter et discuter la pureté et
l’intégrité de l’ADN , la valeur de Tm était trouvée en extrapolant le
point maximale dans la courbe dans le graphique de l’échantillon Dans
notre , cas la valeur est de 86,02°C. cette valeur est beaucoup plus
élevée que la valeur attendue ce qui traduit une contamination ou une
dénaturation des brins d’ADN . De plus, l’hyperchromicité est de 7,31.
Ce qui prouve encore que notre ADN est impure (par rapport aux
valeurs d’hyperchromicité commerciales) .Une contamination
protéique produite au cours du laboratoire peut expliquer cette petite
valeur d’hyperchromicit

R5 )

EcoRi HindII Ecori+Hi Contr Échelle

ndII ole d’ADN

10000
7000
5000

3000

2000

1500

1000

700
500
300
200
100

Figure 5. Électrophorèse sur gel d’agarose

le plasmide utilisé dans cette analyse est le plasmide # 41 (100 ng/µ) digéré avec
l’enzyme de restriction EcoRI, en lisant de gauche a droite , dans le puit #1, EcoRI dans
le puit #2, HindIII dans le puit #3 HindIII + EcoRietet enfin #4qui correspond a notre
échantillon et le puit # 5 contient le MassRuler Express Forward DNA ladder marker
afin de l’utilise comme repère pour identifier la longueur du fragment Un volume de
15µL était injecté a chaque puit . Le gel a été effectué à 100 V pendant 45 minutes avant
de pouvoir placer le gel avec son cabaret dans l’UV Gel Doc System afin de prendre une
photo. Les distances ont été mesurées en utilisant une règle sur l’écran à partir du haut de
la figure (base de plaque)

4.5

4
f(x) = - 0.22x + 4.58
3.5
R² = 0.99
3
Log (longuer de fragment pb) 2.5

1.5

1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Mobilité (cm)

Figure 6.Graphique de dépendance entre les longueurs des fragments en log (pb) du
MassRuler Express DNA en fonction de la distance de migration mesurée avec une
règle sur l’écran (cm).Les valeurs des longueurs des fragments et les déplacements
étaienttirés de l’Annexe C à la page 132 de manuel de laboratoire. L’équation de
généréeest notée sur le graphique pour nous permettre de calculer la masse moléculaire
en remplaçant la variable dans la fonction avec les distance de migration de nos
échantillons

Tableau 3. Valeurs de la distance de migration mesurées avec une règle (cm) et

masse moléculaire des bandes dans chaque puit. le plasmide utilisé dans cette analyse
est le plasmide # 41 (100 ng/µ) digéré avec l’enzyme de restriction EcoRI, en lisant de
gauche adroite , dans le puit #1, EcoRI dans le puit #2, HindIII dans le puit #3 HindIII +
EcoRietet enfin #4qui correspond a notre échantillon et le puit # 5 contient le MassRuler
Express Forward DNA ladder marker afin de l’utilise comme repère pour identifier la
longueur du fragment . Un volume de 15µL était injecté à chaque puit . le numéro de
bande correspond au nombre de bande apparente sur une zone d’un échantillon sur la
plaque, la distance en cm était mesurée avec une règle .
 EcoRI HindIII EcoRI+HindI Controle
II
Numéro de bande 1 1 1 1 2 3
Distance sur gel 2,0 2,2 2,4 1,0 1,9 2,5
(cm)
Masse moléculaire 13803, 23163,2 14682,49 10834,
(bp) 84 12589,25 11397,248 77 97 28
Exemple de calcul : EcoRI

On calcule d’abord la longueur d’onde en utilisant la fonction générée par le

graphique de log (pb) en fonction de distances du fragment en cm

y = -0,22x + 4,5848

y= -0,22(2) + 4,5848

y=4,1448

Pour calculer la masse molaire utilise

MM=10y

MM=104,15

MM=13957,25 bp

6) Dans notre plaque de gel, la digestion double ne montrait pas plus

qu’une marque par contre qu’on a eectué une coupure avec 2
enzyme ce qui veut dire qu’on devait trouver 3 barres pour faire une
meilleure conclusion de dessin de plasmide mais ces valeurs nous
permet comme même d’avoir un plasmide . La seule barre dans notre
puit double est 11397,248pb , on peut remarquer que Ecori a une
valeur de pb de 13803 donc c’est évident que la somme des barres
double avec la barre de HindII donne presque 13803pb . ce qui nous
permet de dessiner un plasmide comme ceci : Ecori coupe le plasmide
en une place ce qui donne un seul morceau de 13803pb , parce qu’on
a un entre enzyme , HindIII qui coupe a 12589 , on sait qu’on va alors
trouver2coupures, une de 12589 pb et une autre 11397( le reste )

Ecor
I
 11397
12589p pb
b

HindI
I

7) En analysant notre gel de l’équipe20 , on voit clairement qu’il y a une

mauvaise digestion dans le puit 4 de control , car on est supposé d’avoir les
mêmes bandes que ceux d’enzymes de restriction , la barre blanche sur le
puit de control non digéré peut être expliqué par une ADN super enroulée ou
même un brin cassé ( cercle ouvert ) .Par contre la digestion dans le premier
puis qui contient l’enzyme de restriction EcoR1 était bien faite ou bien
digérée de même que dans le deuxième et le troisième puis, les bandes
blanches intense sur ces niveau-là montrent la bonne digestion de plasmide ,
notre équipe a utilisé le plasmide inconnue #41 .