1 /L’Histoire :

Depuis les travaux de Watson et Cricks (1953), les scientifiques connaissent les
caractéristiques structurales de la molécule d’ADN, porteuse de l’information génétique. Ils
en ont décrypté les mécanismes de réplication et de transcription ainsi que ceux permettant
leur traduction en protéines. La connaissance précise de la séquence des génomes constitue
donc un enjeu majeur pour la compréhension de certaines maladies.

Dans un premier temps, les généticiens déterminent la carte génétique des génomes
permettant de localiser précisément les gènes sur les différents chromosomes. Pour cela, ils
ont fractionné les chromosomes en grands fragments afin d’y localiser les séquences codantes
correspondant aux gènes.

Dans un second temps, cette carte est affinée grâce à une fragmentation plus fine des
chromosomes (100 000 nucléotides par fragments). C’est ainsi que la première carte physique
humaine fut établie en 1995 (1).

Voici quelques-uns des moments les plus marquants du séquençage de l'ADN :

- 1972 : Paul Berg met au point la première technologie permettant d'isoler des fragments
d'ADN définis, ce qui conduit au développement du génie génétique moderne.
- 1973 : Walter Gilbert publie la première séquence de nucléotides, constituée de 24 paires de
bases de l'opérateur lac de l'ADN.

- 1977 : Walter Gilbert produit le "séquençage de l'ADN par dégradation chimique".

- 1986 : Leroy Hood, annonce l'invention de la première machine semi-automatique de
séquençage de l'ADN. Cette machine est devenue un outil essentiel pour la cartographie et le
séquençage du matériel génétique.
- 1987 : Applied Biosystems, aux États-Unis, commercialise le premier appareil de
séquençage automatisé, appelé ABI370. Il s'agit d'une avancée significative pour plusieurs
projets de recherche scientifique, notamment la cartographie du génome humain.
- 1990 : Le projet du génome humain est officiellement lancé, avec la participation des États-
Unis, du Royaume-Uni, de la France, de l'Allemagne, du Japon, de la Chine et de l'Inde. Le
projet devait durer environ 15 ans.
- 1998 : La "méthode d'amplification des acides nucléiques" est mise au point par Eric
Kawashima, Laurent Farinelli et Pascal Mayer . Il s'agit de l'une des principales étapes du
développement des technologies NGS.
- 2000 : Une "ébauche" du génome humain a été achevée dans le cadre du projet du génome
humain, principalement grâce aux progrès réalisés dans le domaine de la génomique, en
particulier dans l'analyse des séquences.
Les NGS sont apparues au début du 21e siècle. La plus grande avancée de la NGS a sans
doute été sa capacité à produire une énorme quantité de données, ainsi que sa capacité à
fournir une approche très efficace, rapide, peu coûteuse et précise du séquençage de l'ADN,
au-delà de la portée des méthodes Sanger traditionnelles.
Voici les moments clés de l'évolution des NGS :
- 2004 : 454 Life Sciences commercialise une technologie de pyroséquençage de nouvelle
génération, appelée Roche GS20. Il s'agit de la première plateforme NGS sur le marché.
Lancée quelques années plus tard, elle a révolutionné le séquençage de l'ADN en permettant
de produire jusqu'à 20 millions de paires de bases.
- 2008 : Le premier article est publié sur l'étude de la séquence du génome humain à l'aide de
la NGS. La séquence du génome personnel de James Watson lui est remise sur un disque dur
et son coût est estimé à 1 million de dollars. Ce fut la première d'une série de génomes
uniques produits à l'aide de diverses méthodes de NGS (2).

2/L’Introduction :
Support De L'information Genetique De Tout Etre Vivant, L'adn Ou Acide
Desoxyribonucleique Forme Une Helice Double Brin. Chaque Brin Est Constitue D'un
Enchainement De Nucleotides, Formes Eux-Memes D'un Sucre, Un Groupement
Phosphate Et Une Base Azotee ; Adenine, Cytosine, Guanine Ou Thymine. Celles-Ci
Constituent Les Elements Principaux Du Code Genetique D'un Organisme.

Cet Enchainement De Nucleotides Forme Les Genes, Qui, Au Sein De Chacune Des
Cellules, Codent Pour L'information Necessaire Au Developpement, Au Maintien Et A
La Reproduction D'un Organisme. La Taille D'un Genome (Ensemble Du Materiel
Genetique D'une Cellule Contenant Toutes Les Sequences Codantes Et Non Codantes)
Peut Varier De Quelques Milliers De Bases Pour Les Virus, A Quelques Millions Pour
Les Bacteries (4,6 Megabases Ou Mb Pour La Bacterie Escherichia Coli) Et A
Quelques Milliards Pour Les Organismes Pluricellulaires (3,4 Gigabases Ou Gb Pour
L'homme) (3).
La Sequence Du Genome Humain Permettra En Premier Lieu De Proceder A L'identification
Et A L'inventaire Complet Des Genes De L'homme. Les Estimations Les Plus Recentes Faites
Au Genoscope Donnent Un Nombre Total De Genes Humains Compris Entre 30000 Et
35000, Soit Un Nombre Bien Inferieur Aux Estimations Anterieures. Plusieurs Milliers De
Genes Responsables De Maladie Genetique Pourront Ainsi Etre Trouves Plus Rapidement
Grace A La Sequence Du Genome. La Connaissance De Ces Genes Permet De Mettre Au
Point Un Diagnostic A Partir De L'adn. Pour Les Maladies Les Plus Graves, Le Diagnostic
Genetique Peut Etre Pratique Avant La Naissance Dans Les Familles A Risque.
L'identification Du Gene Responsable Permet Aussi De Comprendre Le Mecanisme
Physiologique De L'apparition De Maladie Et Donc, Dans Certains Cas, D'explorer De
Nouvelles Possibilites Therapeutiques (4).

3/la définition de séquençage d’ADN :

Le séquençage de l’ADN constitue une méthode dont le but est de déterminer la succession
linéaire des bases A, C, G et T prenant part à la structure de l’ADN. La lecture de cette
séquence permet d’étudier l’information biologique contenue par celle-ci. Étant donné
l’unicité et la spécificité de la structure de l’ADN chez chaque individu, la séquence de
l’ADN permet de nombreuses applications dans le domaine de la médecine, comme, par
exemple, le diagnostic, les études génétiques, l’étude de paternité, la criminologie, la
compréhension de mécanismes physiopathologiques, la synthèse de médicaments, les
enquêtes épidémiologiques. Dans de nombreuses publications, le terme séquençage peut se
retrouver sous deux dénominations différentes qu’il est important de connaître. Dans les
études de génomes, le terme de reséquençage (expression pouvant prêter à confusion) est
utilisé à la place de séquençage. Cette dénomination, essentiellement utilisée en génétique,
désigne le séquençage d’un segment d’ADN suivi de la comparaison du résultat obtenu avec
celui d’une séquence de référence connue. Un autre terme est également employé : le
séquençage de novo. Dans ce cas, il s’agit du séquençage d’un génome pour lequel il n’existe
pas de séquence référence. Il s’agit donc de la détermination d’une séquence inconnue (5).

La définition d’un génome humain :

Le génome humain, encore appelé ADN, est la signature biologique qui différencie les
humains. Elle est à la base de la couleur de peau, de la couleur des yeux, de la ressemblance
entre la descendance et bien d’autres.

À l’aide de différentes techniques biologiques, ils ont pu déterminer la présence de 46

chromosomes dans le corps, dont 22 paires d’autosomes et 2 gonosomes (chromosomes
sexuels). Ces derniers possèdent, chacun, une succession de petites séquences de types A
(Adénine), C (Cytosine), G (guanine) et T (Thymine) dont l’ordre détermine l’unicité de
chaque être vivant (6).

Les téchniques classiques :

A/southern blot :

Définition :
Un Southern blot est une méthode de laboratoire utilisée pour détecter des molécules d'ADN
spécifiques parmi de nombreuses autres molécules d'ADN. Cette technique porte le nom de
son inventeur, Edward Southern. En tant que procédure de laboratoire, les Southern blots
peuvent être utilisés pour analyser l'ADN total d'un organisme, également connu sous le nom
de génome, afin d'identifier une séquence spécifique d'intérêt.

Principe :
La technique du Southern blot est basée sur le principe de la séparation des fragments
d'ADN par électrophorèse sur gel, suivie de l'identification par hybridation de sondes
marquées. Les fragments d'ADN sont séparés en fonction de leur taille et de leur charge au
cours de l'électrophorèse. La technique implique le transfert de l'ADN électrophorisé du gel
d'électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose. Le filtre de nitrocellulose est pris en
sandwich entre le gel et la pile de serviettes en papier, ce qui permet d'aspirer le tampon de
transfert du gel par capillarité. L'ADN souhaité est détecté à l'aide d'une sonde étiquetée
complémentaire de l'ADN souhaité (7).
Les étapes :

1. Extraction de l'ADN génomique :Cette extraction s'effectue à partir des leucocytes

circulants par exemple obtenus à partir de sang total.
2. Digestion par des enzymes de restriction différentes du même ADN génomique :
L'ADN génomique est digéré par des enzymes de restriction différentes (dans le tube 1, on
réalisera une digestion par l'enzyme 1 ; dans le tube 2, une digestion par l'enzyme 2 ;
etc....). On peut bien entendu réaliser des digestions par deux enzymes dans un même
tube. Dans ces conditions, on obtient un très grand nombre de fragments, mais seuls
quelques fragments correspondent à une partie ou à la totalité du gène étudié.
3. Séparation électrophorétique des fragments d'ADN par électrophorèse dans un gel
d'agarose :
Après séparation électrophorétique en gel d'agarose des fragments d'ADN bicaténaires
obtenus par digestion enzymatique, on réalise une dénaturation des fragments par un
traitement alcalin du gel d'électrophorèse. Ce traitement transforme les fragments d'ADN
double brin (ou bicaténaires) en fragments d'ADN monobrin (ou monocaténaires).
4. Transfert des fragments monocaténaires du gel d'agarose à un support souple
(feuille de nylon par exemple) :Le transfert des fragments monocaténataires du gel
d'agarose à un support type nylon s'effectue par simple capillarité.
5. Fixation des fragments monocaténaires d'ADN sur le support souple et hybridation
dans des conditions optimales de stringence avec une sonde complémentaire marquée à un
radioisotope.
Les fragments monocaténaires d'ADN transférés sur un support solide souple (nylon) sont
mis en présence d'une sonde qui va s'hybrider dans des conditions physico-chimiques bien
définies. on parle de conditions optimales de stringence. La sonde s'apparie avec les
fragments d'ADN monocaténaire selon les règles de complémentarité. De plus, elle est
marquée avec un radioisotope (soit à son extrémité 5', soit à l'intérieur de la chaîne
polynucléotidique).
6. Lavages et révélation (dans ce cas par autoradiographie) :Après de nombreux lavages,
le support solide est mis en contact avec un film photographique pendant plusieurs jours.
Le film est ensuite révélé. Les bandes d'ADN monocaténaires hybridées avec la sonde
radioactive sont visibles sous forme de bandes noires sur un fond blanc. La position de ces
bandes par rapport à des témoins de poids moléculaire permet de déterminer la taille de
ces fragments (8).
 Figure : les étapes de téchnique southern blout .

https://www.mybiosource.com/learn/southern-blotting/

Application de la technique du Southern blout :

1. La technique du Southern blotting est utilisée pour détecter l'ADN dans un échantillon
donné.
2. L'impression digitale de l'ADN est un exemple de la technique du Southern blotting.
3. Utilisée pour les tests de paternité, l'identification criminelle et l'identification des
victimes.
4. Pour isoler et identifier le gène d'intérêt du désir.
5. Utilisé dans le polymorphisme de longueur des fragments de restriction.
6. Pour identifier une mutation ou un réarrangement génétique dans la séquence de
l'ADN.
7. Utilisé pour le diagnostic de maladies causées par des défauts génétiques.
8. Utilisé pour identifier les agents infectieux (9).
 B/Sanger :
Définition :
 La méthode de Sanger, également appelée séquençage Sanger ou séquençage par
terminaison de chaîne, est une technique qui permet de déterminer la séquence de
nucléotides d'un ADN. Elle a été mise au point en 1977 par le double prix Nobel
Frederick Sanger et son équipe, d'où le nom de "séquence Sanger" (10).
 Principe :
 Le principe se base sur l’ADN polymérase et les di-déoxyribonucléotides (ddNTP). Les
échantillons d’ADN à séquencer sont mélangés avec des amorces spécifiques, de l’ADN
polymérase, des déoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) et des di-
déoxyribonucléotides (sans groupement hydroxyle en position 3’) (ddATP, ddCTP, ddGTP et
ddTTP). L’incorporation de ces ddNTP empêche la formation de la liaison phospho-diester, et
donc la poursuite de l’élongation du brin d’ADN . Des fragments d’ADN de tailles variables
se terminant par un ddNTP sont ainsi obtenus (11).
Dans la première version de cette méthode, les amorces étaient marquées radioactivement et
les bouts d’ADN migraient sur un gel dénaturant permettant l’obtention d’un profil de
migration. Actuellement, une amplification par PCR est réalisée en amont, et la méthode
employée utilise l’électrophorèse capillaire et la fluorescence. L’électrophorèse permet de
classer les fragments selon leur taille et ainsi obtenir la séquence nucléotidique. De plus,
chaque ddNTP est marqué par un fluorochrome différent. Un rayonnement laser excite la
molécule fluorescente qui réémet une longueur d’onde spécifique. Cette dernière est détectée
par une caméra. A la fin du séquençage, cela permet d’obtenir un électrophorégramme (12).

Séquençage de l’ADN à l’aide d’électrophorèse capillaire en gel

https://www.lesbonsprofs.com/cours/le-sequencage-de-ladn/
les étapes :

1. SÉQUENCE D'ADN POUR PCR À TERMINAISON DE CHAÎNE

La séquence d'ADN d'intérêt sert de matrice pour un type spécial de PCR appelé PCR à
terminaison de chaîne. La PCR à terminaison de chaîne fonctionne comme une PCR standard
à une différence près : l'ajout de nucléotides modifiés (dNTP) appelés
didésoxyribonucléotides (ddNTP). À l'étape d'élongation de la PCR standard,
l'ADN polymérase ajoute des dNTP sur un brin d'ADN en croissance en catalysant la
formation d'une liaison phosphodiester entre le groupement 3'-OH libre du dernier nucléotide
et le groupement 5'-phosphate du nucléotide.

Dans la PCR à terminaison de chaîne, l'utilisateur mélange une faible proportion de ddNTP
de terminaison de chaîne avec les dNTP classiques. Les ddNTP ne possèdent pas le
groupement 3'-OH nécessaire à la formation d'une liaison phosphodiester ; ainsi, lorsque
l'ADN polymérase incorpore aléatoirement un ddNTP, l'élongation s'arrête. Une PCR à
terminaison de chaîne produit des millions voire des milliards de copies d'oligonucléotides de
la séquence d'ADN d'intérêt terminées, après une longueur aléatoire (n), par des 5'-ddNTP.

,,Dans le séquençage manuel de Sanger, quatre réactions de PCR sont mises en place,
chacune ne recevant qu'un seul type de ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP ou ddCTP).

Dans le séquençage automatisé de Sanger, tous les ddNTP sont mélangés dans une seule et
même réaction, et chacun des quatre dNTP comporte un marqueur fluorescent unique.

2. SÉPARATION PAR TAILLE PAR ÉLECTROPHORÈSE SUR GEL

À la deuxième étape, les oligonucléotides à terminaison de chaîne sont séparés selon leur
taille par électrophorèse sur gel. Dans l'électrophorèse sur gel, les échantillons d'ADN sont
déposés à une extrémité d'une matrice de gel et un courant électrique est appliqué ; l'ADN
étant chargé négativement, les oligonucléotides sont attirés vers l'électrode positive située à
l'autre extrémité du gel. Sachant que tous les fragments d'ADN ont la même charge par unité
de masse, la vitesse à laquelle les oligonucléotides se déplacent est uniquement déterminée
par leur taille. Plus un fragment est petit, moins il subit de frottements en se déplaçant dans le
gel et plus sa vitesse de migration est rapide. Ainsi, les oligonucléotides sont disposés du plus
petit au plus grand lorsqu'on lit le gel de bas en haut.

Dans le séquençage manuel de Sanger, les oligonucléotides de chacune des quatre réactions
de PCR sont déposés sur quatre pistes différentes d'un gel. Cela permet d'identifier les
oligonucléotides correspondant à chaque ddNTP.

Dans le séquençage automatisé de Sanger, tous les oligonucléotides sont analysés en une
seule et même électrophorèse capillaire sur gel dans le séquenceur.

3. ANALYSE DU GEL ET DÉTERMINATION DE LA SÉQUENCE D'ADN

La dernière étape consiste simplement à lire le gel pour identifier la séquence d'ADN de
départ. Étant donné que l'ADN polymérase ne synthétise l'ADN que dans le sens 5'→3' à
partir d'une amorce fournie, chaque ddNTP terminal correspond à un nucléotide spécifique de
la séquence de départ (par exemple, le fragment le plus court doit se terminer au niveau du
premier nucléotide à partir de l'extrémité 5', le deuxième fragment le plus court au niveau du
deuxième nucléotide à partir de l'extrémité 5', et ainsi de suite). En lisant le gel de la plus
petite à la plus grosse bande, il est donc possible de déterminer la séquence 5'→3' du brin
d'ADN d'origine.
 En mode manuel, l'utilisateur lit simultanément les quatre pistes du gel de bas en haut, en se
servant de la piste pour identifier le ddNTP terminal de chaque bande. Par exemple, si la
bande inférieure se trouve dans la colonne correspondant au ddGTP, cela signifie que le plus
petit fragment de PCR se termine par un ddGTP, et donc, que le premier nucléotide à partir de
l'extrémité 5' de la séquence de départ contient une base guanine (G).

En mode automatisé, un ordinateur lit chaque bande du capillaire dans l'ordre, en se servant
de la fluorescence pour déterminer l'identité de chaque ddNTP terminal. En quelques mots, un
laser excite les marqueurs fluorescents de chaque bande et un ordinateur détecte la lumière
émise. Étant donné que chacun des quatre ddNTP comporte un marqueur fluorescent
différent, la lumière émise peut être directement associée à l'identité du ddNTP terminal. Le
résultat obtenu est un chromatogramme faisant apparaître le pic de fluorescence de chaque
nucléotide le long de l'ADN matrice (13).

Applications du séquençage de Sanger :

Le séquençage de l'ADN selon la méthode Sanger est largement utilisé à des fins de recherche
suivante :

(1) le ciblage de régions génomiques plus petites dans un plus grand nombre d'échantillons.

(2) le séquençage de régions variables.

(3) la validation des résultats d'études de séquençage de nouvelle génération (NGS).

(4) la vérification de séquences plasmidiques, d'insertions, de mutations.

(5) le typage HLA.

(6) le génotypage de marqueurs microsatellites.

(7) l'identification de variantes génétiques causant une seule maladie (14).

C / maxam gilbert :

Définition :

Séquençage de Maxam Gilbert, également connu sous le nom de méthode de séquençage

chimique, est une technique qui a été développée pour déterminer l'ordre des nucléotides dans
l'ADN. Cette méthode a été introduite par Walter Gilbert et Alan Maxam en 1976 et est
devenue populaire puisqu'elle peut être réalisée directement avec de l'ADN purifié. La
méthode Maxam Gilbert appartient à la première génération de séquençage d'ADN, et c'était
la première méthode de séquençage largement utilisée par les scientifiques (15).

Principe :
 Cette méthode implique des procédures de purification de l'ADN et un marquage radioactif à
une extrémité de l'ADN à séquencer. La molécule sera ensuite traitée avec des produits
chimiques, chacun clivant des bases spécifiques (c'est-à-dire l'adénine, la guanine, la cytosine
ou la thymine). Il en résultera une série de fragments d'ADN radioactifs de taille variable. Ces
fragments seront ensuite séparés par électrophorèse sur gel. Les fragments les plus petits
voyageront le plus loin, tandis que les fragments les plus grands seront les plus proches du
puits de gel. Ainsi, la séquence des bases nucléotidiques peut être déterminée grâce aux
marques que les fragments marqués font sur le gel (16).

Les étapes :

1. Préparation de votre échantillon

L'ADN utilisé dans le séquençage Maxam-Gilbert est d'abord dénaturé en chaînes simple
brin et radiomarqué à l'extrémité 5', généralement avec 32 P.

2. Clivage
L'étape suivante clive l'ADN. Et c’est là que le séquençage Maxam-Gilbert devient vraiment
intéressant.
En tirant parti de la pipéridine et de deux produits chimiques qui attaquent sélectivement les
purines et les pyrimidines (respectivement le sulfate de diméthyle et l'hydrazine), l'ADN est
clivé à des points spécifiques.
Pour être plus précis, en utilisant différentes combinaisons de ces produits chimiques, vous
pouvez cliver une séquence d'ADN partout où il y a un C, partout où il y a un C ou un
T ; partout où il y a un G, ou partout où il y a un G ou un A.
Ainsi, si vous mettez votre échantillon dans ces 4 tubes de réaction différents, vous obtenez
des fragments différents selon la combinaison de produits chimiques !

3. Électrophorèse et autoradiographie
Ces réactions sont ensuite chargées sur un gel d’agarose à haut pourcentage pour différencier
la taille des fragments. Les fragments sont visualisés via l'étiquette radioactive.

4. Lecture de la séquence
Pour lire la séquence, commencez par les fragments plus petits au bas du gel. « Appeler »
chaque base implique d'interpréter le modèle de bande par rapport aux quatre réactions
chimiques.
Par exemple, si une bande dans la séquence d’ADN apparaît à la fois dans les bandes de
réaction G et de réaction G+A, alors ce nucléotide est un G.
Si une bande dans la séquence d'ADN apparaît uniquement dans la voie de réaction G+A,
alors il s'agit d'un A. Le même processus de décision fonctionne pour les voies de réaction C
et C+T. Les séquences sont confirmées en exécutant des réactions répétées sur le même gel et
en comparant les modèles autoradiographiques entre les répétitions.
Ensuite, le processus se répète comme si vous résolviez un puzzle (17).
 Figure : Exemple de gel de séquençage .
https://bitesizebio.com/36696/maxam-gilbert-sequencing/

Exemple :
Figurer : ADN simple brin radiomarqué avec le 32P en extrémité 5’ et il est séquencé .

https://www.lesbonsprofs.com/cours/le-sequencage-de-ladn/#

On met cette séquence qu’on ignore dans 4 tubes à essai :

– Le 1er contient des produits qui dénaturent spécifiquement les bases A (adénine) et G
(guanine).
– Le 2e contient un produit dénaturant la guanine exclusivement.
– Le 3e contient un produit qui dénature la cytosine exclusivement.
– Le 4e contient un produit qui dénature la cytosine et la thymine.

On laisse la dénaturation se faire et ensuite on récupère les différents fragments.

Par exemple, on voit que dans le tube contenant un produit qui dénature A et G, si on regarde
la séquence de départ, elle va couper juste après G, juste après A, puis de nouveau G, puis de
nouveau A : on obtient des fragments de plusieurs tailles.
On dépose ces derniers dans un gel de polyacrylamide dans lequel on a fait des petits puits,
chaque contenu de tube à essai est déposé dans un puits. On met ensuite en place
un générateur qui crée un courant électrique : les fragments chargés négativement vont
migrer vers le pôle +. Plus le fragment est petit plus il migre loin. Si on regarde le résultat
du gel on constate que le fragment qui a migré le plus loin provient du tube qui contenait
un produit dénaturant G. Cela signifie que le premier nucléotide de la séquence est le
nucléotide G. Ensuite, on constate qu’on a deux petits fragments provenant des tubes qui
contenaient des produits dénaturant C et C+T. On en déduit que le deuxième nucléotide est le
nucléotide C. On poursuit dans cette logique la lecture du résultat du gel : vient ensuite dans
la séquence le nucléotide T, puis le nucléotide A, ainsi de suite.
De cette manière Maxam et Gilbert on pu séquencer de courts fragments d’ADN (18).
Applications:
1. La méthode Maxam-Gilbert a été largement utilisée au début du séquençage de l’ADN
et a joué un rôle crucial dans le projet du génome humain. Certaines des applications
de la méthode Maxam-Gilbert incluent :
2. Séquençage de l'ADN : La méthode Maxam-Gilbert a été l'une des premières
techniques utilisées pour séquencer l'ADN. Il a été utilisé pour séquencer les génomes
de nombreux organismes, notamment les bactéries, les virus et les humains.
3. Analyse mutationnelle : La méthode Maxam-Gilbert peut être utilisée pour identifier
des mutations dans l'ADN. En comparant la séquence d'un échantillon d'ADN muté à
un échantillon de type sauvage, l'emplacement et la nature de la mutation peuvent être
déterminés.
4. Cartographie des interactions protéine-ADN : La méthode Maxam-Gilbert peut être
utilisée pour cartographier l'emplacement des interactions protéine-ADN. En clivant
sélectivement l'ADN aux sites où les protéines sont liées, les sites de liaison peuvent
être identifiés et cartographiés.
5. Analyse structurale de l'ADN : La méthode Maxam-Gilbert peut être utilisée pour
étudier la structure de l'ADN. En clivant sélectivement l'ADN sur différents sites,
l'emplacement et la nature des caractéristiques structurelles telles que les courbures et
les torsions peuvent être identifiés.
6. Caractérisation des modifications de l'ADN : La méthode Maxam-Gilbert peut être
utilisée pour identifier et caractériser les modifications de l'ADN telles que la
méthylation. En clivant sélectivement l'ADN modifié sur des sites spécifiques, la
présence et l'emplacement des modifications peuvent être déterminés (19).
Les techniques de nouveaux générations :

A /Evolution puces à ADN :

Définition :

Une puce à ADN est un ensemble de molécules d'ADN fixées en rangées ordonnées
sur une petite surface qui peut être du verre, du silicium ou du plastique.
Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes
(transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore
un mélange complexe, à un moment donné et dans un état donné par rapport à
un échantillon de référence (20).

Principe :

La technologie par «puces à ADN» utilise le principe de l’hybridation génomique

comparative (CGH) et consiste à cohybrider une même quantité d’ADN d’un patient et
d’un témoin contrôle, marqués chacun par un fluorochrome de couleur différente, sur un
réseau de séquences d’ADN (puce à ADN) représentant l’entier du génome. La lecture des
signaux fluorescents est réalisée grâce à un scanner laser automatisé. Une analyse
bioinformatique des données est ensuite effectuée à l’aide d’un logiciel qui enregistre
l’intensité des différentes fluorescences. Après normalisation de ces données, un rapport
sous forme de représentation graphique est effectué à l’aide d’un logiciel, les rapports
d’hybridation étant proches de «0» pour toutes les régions sans anomalie structurelle. Une
déviation significative de cette valeur sur plusieurs signaux d’une même région
génomique suggère la présence d’anomalies, perte ou gain d’ADN. Cette analyse est
répétée à l’ensemble du génome. Il est alors possible de voir le caryotype avec une loupe
contenant un grossissement d’environ 1000 fois (21).
 Figure :principe de la méthodologie par puce ADN.

https://www.revmed.ch/revue-medicale-suisse/2010/revue-medicale-suisse-237/puce-a-
adn-pourquoi-et-pour-qui

Les types :

Il existe quatre types de puces à ADN :

1. Puce à oligo-ADN : Il est composé d'oligonucléotides d'une longueur de 20 à 50

nucléotides. Les oligonucléotides sont fabriqués directement sur les lames. Une
hybridation de couleur unique est utilisée pour fabriquer chaque sonde. Il est très
spécifique mais peu sensible.
2. Puce à ADNc : Il est souvent appelé un microréseau qui est repéré. Il comprend des
fragments d'ADN de n'importe quelle taille (500bp-1kb) ou des oligos de 20-100 nt sont
collés sur des lames de verre. Il utilise une hybridation bicolore pour chaque sonde.
3. Micropuce BAC : Il est réalisé à l'aide du modèle, qui est amplifié par réaction en chaîne
de la polymérase pour former la sonde.
4. Micropuce SNA : Il est utilisé pour déterminer les polymorphismes au sein de la
population (22).
Les étapes :
1. PRÉPARATION DE L'ADN CIBLE Identification Extraction de l'ARNm des cellules
d'un patient atteint d'une maladie génétique puis identification des gènes qui s'expriment
effectivement chez le patient. Purification des ARNm en ADN cible. Greffage de l'ADN
sonde ident de fragments d'ADN de sequences d'une ou plusieurs maladies pour I'ADN
sonde Intégration de bes sur la puce tquelques cou en verre, slicium, atc Marquage
Reproduction en milliers de brins d'ADN des ARNm, et marquage des ADN cible avec
une molécule fluorescente.
2. PRÉPARATION DE L'ADN SONDE Greffage de l'ADN sonde Identification de
fragments d'ADN de séquences connues d'une ou plusieurs maladies pour former I'ADN
sonde. Intégration de ces brins d'ADN sur la puce (quelques cm d'un support solide en
verre, silicium, etc.).
3. UTILISATION DE LA PUCE A ADN Liaisons des bases ADN Mise en contact des
brins ADN cible avec ceux ADN sonde greffés sur la puce. Liaisons de certains des brins
ADN cible avec ceux ADN sonde. Les brins qui ne s'apparient pas sont éliminés lors du
rinçage de la puce.
4. INTERPRÉTATION DES DONNÉES Analyse Mise en évidence des appariements des
brins d'ADN par détection de la fluorescence des brins ADN cible. Localisation des
liaisons qui signifient et désignent les gènes du patient qui sont porteurs de maladie (23).

Les applications :

Les puces à ADN sont largement utilisées pour étudier l'expression des gènes dans les
cellules humaines. Voici quelques domaines d'application :

1. Recherche biomédicale

- Étude des maladies : Les puces à ADN peuvent être utilisées pour identifier les gènes dont
l'expression est modifiée dans des états pathologiques tels que le cancer, les maladies
cardiaques, le diabète, etc.

- Pharmacogénomique : Ces puces permettent de prédire la réaction d'un patient à un

médicament en fonction de ses caractéristiques génétiques.

- L'étude des voies de signalisation : Les puces à ADN révèlent les interactions complexes
entre les gènes et les protéines dans les voies de signalisation cellulaire.

2. Diagnostic clinique :

- Cancer : Les puces à ADN permettent de classer les tumeurs en fonction de leur profil
d'expression génétique, ce qui contribue à personnaliser les traitements.
 - Maladies génétiques : Détection des mutations génétiques responsables des maladies
génétiques.

3. Suivi de la santé :

- Surveillance de la réponse au traitement* : Les puces à ADN peuvent être utilisées pour
surveiller les changements dans l'expression des gènes pendant le traitement.

- Détection précoce des maladies : Permet d'identifier les premiers signes d'une maladie
avant l'apparition des symptômes cliniques.

4. Recherche fondamentale

- L'évolution humaine : Les puces à ADN permettent d'étudier les différences d'expression
génétique entre les espèces et de comprendre l'évolution humaine.

- Biologie évolutive : Les puces à ADN révèlent les gènes impliqués dans le développement
embryonnaire et la différenciation cellulaire.

les puces à ADN sont des outils puissants pour explorer la biologie cellulaire humaine,
comprendre les mécanismes moléculaires et améliorer les soins de santé (24).

B/haute début :

Définition :

La notion de séquençage haut-débit est apparue en 2000 avec la 1re génération,

aujourd’hui oubliée, de Machines proposées par la société Lynx Therapeutics. Cinq ans après,
avec l’arrivée des séquenceurs de2e Génération, le séquençage multi-parallélisé n’aura De
cesse d’être la source de plus en plus d’appli-Cations dans les laboratoires de recherche (25).
Depuis, Le nombre de génomes complètement séquencés et Accessibles dans les banques
de données a cru de Façon exponentielle. Cette diffusion technologique S’est accompagnée
d’une baisse brutale du coût Associé à l’opération de séquençage : l’analyse du 1erGénome
humain, accomplie en 2001, aura coûté environ trois milliards de dollars ; la même analyse
coûte Un millier de dollars 13 ans plus tard.
En 2014 cohabitent deux générations de séquenceurs : les séquenCeurs de 2eGénération,
don’t une partie est déclinée en séquenceurs De paillasse aux débits généralement suffisants
pour les appliCations en microbiologie ; et les séquenceurs de 3e Génération. Ces derniers,
plus sensibles, permettent de s’affranchir de l’étape D’amplification clonale, caractéristique
qui les rend plus rapides que leurs aînés (26).
Principe :

Le NGS repose sur la génération massive de données de séquences obtenues par des
cycles successifs d’incorporation de nucléotides, et ainsi l’émission de signaux qui sont
ensuite convertis en information de séquence. Différentes technologies existent
actuellement, notamment basées sur un séquençage en parallèle de millions de molécules
d’ADN, avec une augmentation toujours croissante des capacités de séquençage associée
à une diminution progressive des coûts, et de nouvelles approches sont en développement
(en particulier le séquençage direct de molécules d’ADN uniques). De manière
schématique, le processus de NGS est constitué de multiples étapes de génération et
d’analyse des données, avec la prise en compte de critères de qualité de séquençage (en
particulier l’analyse de la « couverture » et de la « profondeur de lecture » de la séquence
d’intérêt), qui sont présentées de manière synthétique dans la figure en association avec
des termes d’usage courant associés (27 ).

Les étapes :

a) Préparation de librairies NGS

Le séquençage de nouvelle génération nécessite une préparation soigneuse du matériel

génétique en amont de la réaction de séquençage pour garantir des résultats fiables.
Le séquençage haut débit est réalisé sur des fragments de taille homogène présentant à
leurs extrémités de courtes séquences appelées étiquettes permettant de définir l'origine
des fragments lors du séquençage simultanée de plusieurs échantillons, la fixation sur un
support solide et l'initialisation de la réaction de séquençage par incorporation de dNTPs
marqués.
Pour générer ces fragments qui constituent ce que l'on appelle une librairie, il existe
différentes approches comme par exemple :
La préparation de librairies par fragmentation : le matériel génétique est dans un
premier temps découpé en fragments de différentes tailles. La fragmentation peut être
mécanique, chimique ou enzymatique. Une sélection des fragments est réalisée suivant
leur taille. La dernière étape consiste en l'ajout d'étiquettes aux extrémités des fragments
sélectionnés.
Figure:La préparation de librairies par fragmentation

https://www.universalis.fr/encyclopedie/sequencage-haut-debit-de-l-adn/3-le-sequencage-ngs-et-
ses-approches-a-haut-debit/

La préparation de librairies par amplification : des régions d'intérêt sont dans un

premier temps amplifiées par PCR avec des amorces spécifiques. Des étiquettes sont
ajoutées aux extrémités des amplicons soit par ligation, soit par PCR.
 Figure 2:La préparation de librairies par amplification

https://www.universalis.fr/encyclopedie/sequencage-haut-debit-de-l-adn/3-le-sequencage-ngs-
et-ses-approches-a-haut-debit/
L'approche utilisée ainsi que l'ordre des étapes (sélection des fragments et ajout des
étiquettes) peuvent varier en fonction des recommandations des fournisseurs de kits de
préparation de librairies .

b)Purification de librairie :
Pour la purification des librairies et la sélection des fragments en fonction de leur taille,
BIOMNIGENE est équipée du PippinHT (Sage Science). Cet appareil permet de sélectionner
simultanément des fragments d'AND de 24 librairies différentes et ceci avec un degré
d'incertitude de 5 % de la taille attendue. Par exemple, pour une taille donnée de 500 paires de
bases, la longueur des fragments conservés s'échelonnera de 475 à 525 pb.
Cette méthode de purification de librairies nous permet d'homogénéiser toutes les librairies
passant sur nos appareils de séquençage haut débit Illumina (28).
 Appareil :BIOMNIGENE [équipée du PippinHT (Sage Science)[
https://www.universalis.fr/encyclopedie/sequencage-haut-debit-de-l-adn/3-le-sequencage-ngs-
et-ses-approches-a-haut-debit/
b)L’amplification « clonale » :
Chacun des fragments contenus dans les librairies doit être ensuite multiplié – amplifié – à
l’identique, individuellement et en proportions équivalentes. La première étape va donc
consister à isoler physiquement chaque fragment d’AND dans le mélange en fixant chacun
soit sur un support unique (bille) soit sur une zone dédiée d’un support commun (flowcell).
Puis l’amplification de ces fragments fixés (chacun équivalent à un clone) est réalisée par
PCR (polymerasechainreaction). Cette technique permet de recopier rapidement une séquence
précise d’AND et de doubler le nombre de copies de cet AND à chaque cycle de
l’amplification. Suivant la technologie NGS employée, la PCR sera réalisée en émulsion ou «
en pont ».
 Figure 5: Amplification clonale
https://www.biorigami.com/?tag=sequencage-haut-debit
Au cours de la PCR en émulsion (Life TechnologiesTM), les fragments sont dilués et fixés
sur des microbilles via les adaptateurs, de sorte que, le plus souvent, une seule molécule
d’AND se fixe sur chaque bille (fixation monoclonale). Les billes sont ensuite recouvertes
d'un film liquide aqueux contenant tous les réactifs nécessaires à l’amplification par PCR et
mélangées dans un tube rempli d'huile. Chaque bille est ainsi isolée des autres dans son propre
microréacteur et toutes les billes vont subir en même temps les différentes étapes
d’amplification. Chaque fragment va ainsi être amplifié à la surface de chaque bille.
Dans le cas de la PCR en pont (Illumina), l’ensemble des fragments à cloner est dilué et
réparti à la surface d'une plaque en verre (dite flowcell), de façon à ce que les molécules
soient éloignées les unes des autres. Celles-ci vont s’hybrider sur des amorces universelles
don’t la plaque est recouverte, par l’intermédiaire(29).

C) Le séquençage :
Il existe différentes méthodes de séquençage:
Le séquençage par synthèse (Illumina).
Le pyroséquençage (Roche 454).
La ligation (SOLid Thermofisher).
La détection des ions H+ (Proton Thermofisher).
Dans l'ensemble, le principe général reste le même. Chaque fragment est d'abord cloné
plusieurs fois afin d'amplifier le signal. Puis le brin complémentaire de chaque fragment cloné
est synthétisé. À chaque incorporation d'un nucléotide, un signal est détecté. De la lumière
pour Illumina ou une variation de pH sur du Proton. À la fin du séquençage, chaque fragment
a été séquencé en parallèle. L'ensemble des données est enregistré dans un fichier Fastq (30).

Les applications :
Le séquençage à haut débit (NGS) est largement utilisé dans la recherche biomédicale pour
explorer et comprendre les aspects complexes du génome, de l’ARN et de l’ADN. Voici
quelques-unes de ses applications essentielles :
1. Découverte de Mutations Génétiques : Le NGS permet d’identifier des mutations
ponctuelles, des insertions, des délétions et des réarrangements chromosomiques. Cela est
crucial pour le diagnostic des maladies génétiques et le suivi des traitements (31).
2. Études de l’Épigénétique : Le NGS peut cartographier les modifications chimiques sur
l’ADN, telles que la méthylation, qui jouent un rôle clé dans la régulation des gènes (32).
3. Transcriptomique : Le NGS analyse l’ensemble des ARN produits par un organisme à
un moment donné. Cela permet d’étudier les niveaux d’expression des gènes et
d’identifier de nouveaux ARN non codants.
4. Métagénomique : Le NGS peut séquencer l’ensemble des gènes présents dans un
échantillon environnemental (par exemple, le microbiome intestinal) pour comprendre sa
diversité et sa fonction.
5. Pharmacogénomique : Le NGS aide à identifier les variations génétiques qui influencent
la réponse d’un individu à un médicament. Cela permet une médecine plus personnalisée.
6. Recherche sur le Cancer : Le NGS est utilisé pour identifier les gènes mutés dans les
tumeurs, comprendre les mécanismes de résistance aux traitements et développer de
nouvelles thérapies ciblées.
7. Études de Population : Le NGS permet de séquencer de nombreux échantillons
simultanément, ce qui est essentiel pour les études de population et la génétique des
maladies complexes.
8. Identification de Gènes de Fusion : Le NGS peut détecter les gènes fusionnés, qui sont
impliqués dans certains cancers ( 33).

Diagnostics ADN :
Connaître le génome humain dans son intégralité permet donc d’envisager la connaissance
des allèles des gènes responsables de maladies génétiques. Ceci pourra faciliter la mise au
point de test diagnostics à partir de l’ADN.

Pour les maladies les plus graves, le diagnostic génétique peut être pratiqué avant la
naissance dans les familles à risque. De manière générale, la mise au point de diagnostics
génétiques permet d’affiner l’identification précise de la maladie atteignant le patient ; ceci ne
peut que conduire à une meilleure prise en charge de cette maladie (34).
La conclusion :
Le séquençage de l'ADN est apparu à la fin des années 1970, alors qu'il avait déjà fait des progrès
remarquables dans le domaine de la biologie moléculaire grâce, entre autres, à l'arrivée progressive
de systèmes d'analyse de séquences de plus en plus autonomes, surtout au cours des années 1990,
même s'ils ne traitaient que quelques séquences à la fois. Cependant, depuis les années 2000, une
"révolution technologique" s'est produite en génomique, avec l'émergence de nombreuses
technologies innovantes, y compris dans le domaine du séquençage, qui nous ont permis d'entrer
véritablement dans l'ère du séquençage à haut débit ou séquençage de nouvelle génération (NGS).
Ces outils hautement automatisés et performants, qui peuvent traiter jusqu'à plusieurs millions de
séquences en parallèle, ouvrent de grandes perspectives, notamment dans les domaines de la
médecine et de l'ingénierie agricole (35).