Université des Sciences et de la Technologie

Houari Boumediene (USTHB)

Faculté des Sciences Biologiques (FSB)
Département BCM

Licence L3, Spécialité: Biotechnologie et santé

Module: Biologie moléculaire et génie génétique

TD2:

Les enzymes; outils du génie génétique

Enseignants :
Dr N. Behairi
Dr S. LOUAHCHI
Dr M. Messaoud khelifi
Dr N. Rebbah
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 Plan
I- Introduction
II- Les classes d’enzymes
III- Les enzymes de restriction
1. Définition
2. Système de restriction-modification
3. Nomenclature
4. Classification
5. Les types et la fréquence de coupure
6. Les familles des ER
7. Applications

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 Introduction

I. Introduction
Le clonage moléculaire, la détermination de la séquence d’un acide
nucléique, l’étude des relations structure/fonction et des régulations
génétiques sont des manipulations qui ne sont possibles que grâce à une
panoplie d’enzymes spécifiques.

Les enzymes couramment utilisées en génie génétique

Les nucléases Les polymérases Les ligases
(enzymes de Enzymes
(enzymes de synthèse) (enzymes de liaison)
coupure) modifiant l’ADN
1. Exonucléases
2. Endonucléases

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 Les classes d’enzymes
II. Les classes d’enzymes:
1. Les nucléases :
Les ADN /ARN nucléases sont des enzymes qui dégradent les molécules d’ADN/ARN
en rompant les liaisons phosphodiesters liant un nucléotide au suivant. Il existe deux
types de nucléases:

1.1. Les exonucléases: Catalysent l’hydrolyse séquentielle des nucléotides de

l’acide nucléique à partir d’une extrémité libre (3’ ou 5’). Exp:
 Exonucléase III : Agit sur l’ADN double brin à partir d’une extrémité 3’OH libre.
 Nucléase S1: Dégrade spécifiquement les acides nucléiques simple brin.

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Mode d’action de l’exonucléase III
 Les classes d’enzymes
1.2. Les endonucléases:
1.2.a. Les endonucléases à clivage non spécifique: Elles sont capables de
rompre les liaisons phosphodiesters internes. Exp:
 DNase I: Coupe les molécules d’ADN simple et double brin préférentiellement
après une base pyrimidique.
 Nucléase S1: Dégrade seulement les acides nucléiques monocaténaires (ADNsb
ou ARN).
 RNase A: Agit sur les ribonucléotides des ARN.

Mode d’action de la DNase I et de la ribonucléase A

1.2.b. Les endonucléases à clivage spécifique (Les enzymes de restriction)

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 Les classes d’enzymes
2. Les polymérases et enzymes apparentées
Se sont des enzymes qui synthétisent un nouveau brin d’ADN complémentaire à une
matrice d’ADN ou d’ARN. Trois enzymes sont couramment utilisées:
 ADN polymérase I: Extraite d’E.coli / rôle majeur dans la réparation de l’ADN
/activité polymérasique 5’ 3’ / activité exonucléasique 3’ 5’ et 5’ 3’
 Fragment de Klenow: Produit de protéolyse ménagée de l’ADN polymérase I /
activité polymérasique 5’ 3’ / activité exonucléasique 3’ 5’ .
 Transcriptase reverse: Elle transcrit l’ARN en ADN complémentaire (cDNA) dans le
sens 5’ 3’. Elle peut aussi utiliser l’ADN comme matrice.

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Mode d’action de l’ADN polymérase I et de la transcriptase reverse
 Les classes d’enzymes
3. Les ligases
Se sont des enzymes qui établissent des liaisons phosphodiesters entre deux
nucléotides (extrémité 3’OH et 5’P) d’un ou de deux acides nucléiques. Elles
permettent la construction de molécules d’ADN recombinant. Exp:

 ADN ligase d’E.coli: Permet de lier deux molécules d’ADN présentant des
extrémités cohésives.
 T4 ADN ligase: Permet de lier deux molécules d’ ADN à bouts francs.

Mode d’action de l’ADN ligase d’E.coli

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 Les classes d’enzymes
4. Enzymes modifiant l’ADN
Elles modifient l’ADN par addition ou suppression de groupements chimiques
spécifiques.
 Phosphatase alcaline: Elle retire le phosphate en 5’ sur l’ADN, l’ARN et les
nucléotides libres empêchant ainsi toute action des ligases.
 T4 polynucléotide kinase: Elle transfère le phosphate d’un ATP en position γ
sur le phosphate en 5’ d’un polynucléotide.
 Transférase terminale: Catalyse l’addition de nucléotides à l’extrémité 3’ de
l’ADN sans brin matrice.

Mode d’action de la phosphatase alcaline et la T4 polynucléotide kinase 8

 Les enzymes de restriction
III. Les enzymes de restriction (ER)
1. Définition
Ce sont des endonucléases d’origine bactérienne qui coupent de manière définie
et reproductible l’ADN double brin à des endroits spécifiques (séquences
nucléotidiques) appelés ‘sites de restriction’ (généralement de 4 à 8 paires de
bases).

2. Système de restriction-modification
Lorsqu’un bactériophage colonise une bactérie, le phénomène de lyse
bactérienne, après multiplication du phage par le biais de la machinerie
enzymatique de la bactérie hôte peut ne pas avoir lieu. Ceci est expliqué par le
fait que :
1. L’ADN phagique s’est intégré, sous forme silencieuse, dans celui de la
bactérie (la lysogénie).
2. L’ADN phagique est complètement détruit (hydrolysé) par les enzymes de la
bactérie hôte : les enzymes de restriction (la restriction).
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 Les enzymes de restriction
3. Nomenclature:
Plus de 1200 enzymes ont été
caractérisées. Une nomenclature normalisée
leur a été adoptée.

• La première lettre (en majuscule):

Initiale du genre bactérien.
• Les deux lettres suivantes (minuscules):
Espèce bactérienne. Le phénomène de restriction
• Le chiffre romain: le numéro d’ordre qui révèle l’ordre de découverte des
enzymes issues d’une même bactérie source.
• La dernière lettre majuscule (non obligatoire) : Souche de la bactérie.

Nomenclature des enzymes de restriction 10

 Les enzymes de restriction
4. Classification
Les ER sont classées en trois (03) types selon la relation structure-fonction :
 Type 1: Le site de coupure est éloigné du site de reconnaissance d’environ 1000 à
5000 nucléotides.
 Type 2: Ce sont les plus nombreuses et les plus utilisées en génie génétique. Elles
coupent au niveau du site de reconnaissance.
 Type 3: Le site de coupure est éloigné du site de reconnaissance d’une vingtaine de
nucléotides.

Exemples d’enzymes de restriction de type II 11

 Les enzymes de restriction
5. Types et fréquence de coupure
Les ER de type II reconnaissent des séquences palindromiques
de 4 à 8 nucléotides qui se lisent de la même façon sur le brin
parallèle et anti parallèle (c’est-à-dire en allant de droite
à gauche et inversement comme le mot radar).

Les enzymes de restriction de type II provoquent 2 types de coupure :

 Coupures à « bouts francs »: Les enzymes coupent exactement au même
niveau les 2 brins d'ADN. Pas d’association spontanée entre les fragments
(nécessité d’une ligase).

Coupures à « bouts cohesifs » ou protusifs: Les coupures sont décalées

l'une par rapport à l'autre. Association spontanée des fragments (exp:
recombinaison génétique)

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 Les enzymes de restriction
La fréquence des sites de coupure est fonction de la longueur du site de
reconnaissance de l’enzyme, les sites les plus courts (4 bases) étant les plus
fréquents.
Fréquence de coupure = 1 /4n
Longueur du site de
restriction
Nombre de bases (A,T,C,G)

Exemples:

Fréquence de coupure de BamHI = 1 /46 = 1/4096

(1 coupure tous les 4096 pb)

Taq1
Fréquence de coupure de Taq1 = 1 /44 = 1/256
(1 coupure tous les 256 pb)

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 Les enzymes de restriction
6. Familles des ER
Enzymes isoschizomères Enzymes néoschizomères

Des ER ayant des origines différentes, qui Des ER ayant des origines différentes, qui
reconnaissent la même séquence et la reconnaissent la même séquence mais la
coupent de la même façon. coupent différemment.

Enzymes compatibles

Des ER qui reconnaissent

des séquences différentes
mais qui génèrent
des extrémités cohésives
identiques (compatibles /
capables de s’apparier)

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 Les enzymes de restriction
7. Applications des ER

7.1. La carte de restriction de l’ADN:

Une carte de restriction de l’ADN est une suite linéaire de sites séparés par une
distance réelle (en pb). Ces sites correspondent à des coupures de la séquence par des
ER. Elle a pour objectif de reconstituer une séquence d’ADN en réordonnant les
fragments issus des digestions enzymatiques.
Exp 1: ADN linéaire

EcoRI
ADN purifié
HindIII Electrophorèse
Mesure de la taille
des fragments
EcoRI + HindIII
3
Aliquotes incubés avec les ER 2

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 Les enzymes de restriction
EcoRI
3kb 7kb
(1)
(1): Position des coupures par EcoRI.
10kb (2): Position des coupures par Hind III.
(2) (3): Position des coupures par Hind III + EcoRI.
8kb 2kb
HindIII
(3)
3kb 5 kb 2kb
Carte de restriction d’un ADN linéaire

Exp 2: ADN circulaire

Carte de restriction d’un ADN circulaire 16

 Les enzymes de restriction
7.2. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP)

C’est une méthode qui permet une analyse allélique directe grâce à l’étude du
polymorphisme de longueur des fragments de restriction. En effet, une mutation
(insertion/déletion) peut entrainer une modification de la carte de restriction (un
site qui disparait ou qui apparait).
La mutation peut donc être détectée par une variation du nombre et de la longueur
des fragments de restriction, après une séparation par électrophorèse et une
visualisation par hybridation avec des sondes marquées.

Exemple: Diagnostic de la drépanocytose

Drépanocytose

Mutation dans le gène de la β-globine : GAG GTG

(Acide glutamique) (Proline)
Suppression d’un site de restriction reconnue par MstII

Allèle sain βA Allèle muté βS

Deux fragments de restriction Un seul fragment de restriction
(0,2 Kb et 1,2 Kb) (1,4 Kb)
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 Les enzymes de restriction

Disparition d’un site de

restriction de MstII
Electrophorèse

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