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******* CCE-DGXII ST2.A/89/215.

F
•••.Jr

VALEUR ALIMENTAIRE DES FOURRAGES LIGNEUX


CONSOMMÉS PAR LES RUMINANTS
EN AFRIQUE CENTRALE ET OCCIDENTALE

RAPPORT FINAL

ALLEMAGNE Universitat Hohenheim - Institut für Tierernahrung


BELGIQUE CRA Gembloux - Station de Haute Belgique
CAMEROUN IRZV - Yaoundé, Ngaoundéré, Garoua
CÔTE D'IVOIRE IDESSA-DRA - Bouaké
FRANCE CIRAD-EMVT - Maisons-Alfort
CIRAD-FORÊT - Nogent/Marne
INRA-SRNH - Theix
MALI IER - Sotuba, Niono
SÉNÉGAL ISRA-DRPSA-LNERV - Dakar
TCHAD LRVZ - Farcha, N'Djaména

et

BURKINA FASO !DR - Ouagadougou


CIRAD-FORÊT/IRBET - Ouagadougou
NOUVELLE-CALÉDONIE CIRAD-EMVT - Nouméa

NOVEMBRE 1994

Centre de Coopération internationale en Recherche agronomique pour le Développement

Il Département d'Élevage et de Médecine vétérinaire


CIRAD-EMVT
10, rue Pierre-Curie 94704 Maisons-Alfort Cedex France
Résumé

Chapitre I : Présentation succincte du programme d'étude de la valeur


fourragère des arbrés et arbustes d'Afrique tropicale centrale et occidentale

Chapitre Il : Caractérisation des disponibilités fourragères ligneuses

Chapitre Ill : Composition botanique des régimes des ruminants sur parcours -
Appétibilité relative des espèces ligneuses

Chapitre IV : Récolte et commercialisation des fourrages ligneux en régions


périurbaines

Chapitre V : Echantillonnage des fourrages ligneux - Analyses au laboratoire -


Composition chimique et dégradabilité enzymatique

Chapitre VI : Les tanins dans les fourrages ligneux

Chapitre VII : ln vitro Untersuchungen zur Ermittlung der Verdauchlichkeit, des


Gehaltes an umsetzbarer Energie und des Proteinverfübarkeit bei tropischen
Futterbiiumen und Buschen

ln vitro studies for the prediction of digestibility, metabolisable enrgy content and
protein fermentability of shrubs and tree fodders

(Mesures in vitro de la digestibilité pour estimer les teneurs en énergie


métabolisable et en azote dégradable dans le rumen des fourrages ligneux)

Chapitre VIII: Prévision par la spectrométrie dans le proche infrarouge (SPIR) de


la composition chimique et de la dégradabilité enzymatique ou in vitro des
fourrages ligneux

Chapitre IX : Dégradabilité in situ de la matière sèche et des matières azotées de


quelques fourrages ligneux : application des méthodes in sacco à l'étude de la
digestion dans le rumen et dans les intestins

Chapitre X : Ingestion et digestibilité in vivo des fourrages ligneux

Chapitre XI : Essais d'alimentation de moutons avec des fourrages ligneux

Conclusion générale

Annexe I : Liste des espèces ligneuses enregistrées au catalogue CIRAD-


EMVT/Laboratoire d'Ecologie végétale de l'Université Paris-Sud et des espèces
ligneuses et subligneuses échantillonnées et étudiées sur l'animal

~ Liste des Abréviations


CH API TRE VI

LES TANINS DANS LES FOURRAGES LIGNEUX 1

par

Colette GRILLET*, Francis VILLENEUVE**

* CIRAD-EMVT, 2477 Avenue du Val de Montferrand,


B.P. 5035 - 34060 Montpellier Cedex (France)
** {décédé en 1992) CIRAD-Forêt, 45 Avenue de la Belle Gabrielle
94130 Nogent sur Marne {France)

* GRILLET {Colette), VILLENEUVE (F.) - 1994. Les tanins dans les fourrages
ligneux. Chapitre VI In: GUERIN (H.) éd. Valeur alimentaire des fourrages
ligneux consommés par les ruminants en Afrique centrale et de 1 'ouest.
Commission des Communautés Européennes DG XII. Programme ST2/89/215.
Maisons-Alfort, CIRAD-EMVT.
1

INTRODUCTION

Les tanins végétaux sont des phénols hydrosolubles qui se caractérisent


par leur propriété de précipiter les alcaloïdes, la gélatine et les
protéines. On distingue habituellement (figure VI.1) :

- les tanins hydrolysables qui sont des polyesters d'hydrates de carbone


(comme le glucose) et de noyaux phénoliques carboxylés de l'acide
gallique ou de l'acide ellagique {Swain, 1965). Ils sont facilement
hydrolysés par la chaleur en milieu acide ou par des enzymes ;

- les tanins condensés (proanthocyanidines), sous-groupes des oligomères


flavanoliques, qui sont des polymères de flavane-3-ol (catéchine) ou de
flavan 3-4 diol (leucoanthocyanidine) ; ils sont polymérisés par la
chaleur en milieu acide.

Le grand nombre de noyaux phénoliques hydroxylés des tanins leur permet


de former des complexes avec les protéines (Swain, 1965) et avec d'autres
molécules comme les hydrates de carbones (Reddy et aZ., 1985), les
vitamines (Carrera et aZ., 1973), les minéraux, les ions métalliques en
particulier (Hartley, 1981 ; Reddy et aZ., 1985 ; Rao et aZ., 1988), les
structures membranaires des microorganismes (Singleton, 1981).

Si les plantes herbacées sont particulièrement riches en tanins


condensés (Mc Leod, 1974), les deux catégories de tanins sont présentes
dans les feuilles des fourrages ligneux (Waterman et al., 1980, Diagayete
et al., 1982 Coley, 1983; Lohan et al., 1983; Reed et aZ., 1985 ; Mole
et aZ., 1987 ; Leinmüller et al., 1991).

La très grande affinité des tanins pour les protéines est une des causes
majeures de leur effet sur la valeur alimentaire des fourrages ligneux:
d'une part la précipitation des protéines salivaires par les tanins
(Mehansho et al., 1987) ainsi que leur adhérence à la muqueuse buccale
(phénomène d'astringence) diminuent l'acceptabilité des fourrages par les
animaux, d'autre part la complexation des tanins avec les protéines
alimentaires et avec les membranes bactériennes le long du tractus digestif
expliquent les effets plus ou moins négatifs des tanins sur la
digestibilité des fourrages ligneux.

Dans le but d'étudier ces effets sur l'utilisation digestive des


protéines, les tanins ont été dosés sur différentes espèces de ligneux. De
nombreuses techniques de dosage étant décrites dans la littérature, dans un
premier temps, nous avons donc testé différentes méthodes afin d'identifier
une technique, applicable sur un grand nombre d'échantillons, qui permet
une bonne estimation des tanins ayant un effet sur les protéines.

Dans un deuxième temps, l'effet des tanins sur la valeur digestive des
fourrages ligneux a été abordé.
2

Figure VI.1 - Exemples de molécules de tanins hydrolysables et condensés.


Tanins hydrolysables (d'après Deshpande 1986, Leinmilller et
ai., 1991)

TANINS HYDROLYSABLES

HO
d:o
0 0
0

OH

OH
HO
HO

HO
0 COOH

ACIDE GALLIQUE
OH
0~
0

ACIDE ELLAGIQUE

ACIDE TANNIQUE
(GALLOTA.NNIN)

OH

TE>--NINS CONDENSES

~o"'---l~o\
1
1011 11 \ \ _ _/ /

~'oH

FL;?.,.VAl{-3-0L
FU.V.~.11-3, 4-DIOL (catéc:l.ine)
(leucoanthocyaniàine)
3

1. CHOIX DES METHODES DE DOSAGE

1.1. Principales fractions de polyphénols et principes des méthodes de


détermination

Les dosages peuvent être

- quantitatifs

non spécifiques : dosage des phénols totaux {PT), des oligomêres


flavanoliques totaux (OFT) qui permettent une estimation globale des
phénols;

spécifiques d'une catégorie de tanins: dosage des tanins condensés


{TC) ou bien des tanins hydrolysables (TH) ;

liés à un effet biologique, par exemple1 dosage des tanins


hydrolysables et condensés par précipitations des protéines (TP)
cette technique ne permet pas la distinction entre TC et TH

-qualitatifs : identification par HPLC.

Différentes techniques ont été testées sur des échantillons de ligneux


dans le but d'en identifier une ou plusieurs, d'application facile sur un
grand nombre d'échantillons, permettant une bonne estimation des tanins
ayant un effet sur les protéines alimentaires.

Elles visent donc à déterminer les phénols totaux (PT), les oligomêres
flavanoliques totaux (OFT), les tanins hydrolysables (TH), les tanins
condensés (TC), ou le pouvoir précipitant des tanins (TP) considérés
globalement (TC et TH).

Les autres lettres d'abréviation servant à ci ter les techniques de


dosage dans les tableaux évoquent leur principe et les principaux
réactifs : C pour colorimétrie, G pour gravimétrie, DR pour diffusion
radiale; les réactifs et leurs abréviations sont mentionnés dans la liste
des méthodes et le diagramme résumant les possibilités de fractionnement
des polyphénols (figure VI.2).

1
D'autres méthodes utilisent les propriétés de blocage enzymatique des
tanins.
4
Figure VI.2 - Diagramme décrivant les possibilités de fractionnement des
polyphénols

PHENOLS 10TAUX (PT)

colorimétrie (PT-C) gravim~trie (PT - G)

Fo!i~-Ciocalteu
' Bleu de Prusse 1 .
Ytterbium
(PT·C-FC) ( PT- C • B P) (PT-G-Y)

OUGOMERES FlAVANOUQUES TOTAUX(OFT)


1
gravimétrie (OFT-G)

TANINS HYDROLYSABLES (TH) TANINS CONDENSES ( TC)


1 1
colorimétrie (TC - C )
colorimétrie (TH • C )
1
1
nitrite de sodium vanilline but:an~I-HCI
(TH - C. NaNo2) (TC-C -V) (TC-C-Bu)

- --- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - - -
TANINS TOT AUX PRECIPITANTS (TP)
1
précipitation
1
ge!Jtine hémoJ!oblne albumi~e bovine
1 1
1
colorimétrie diffu5îon[radiale colorimltne
Folin-Ciocalteu 1
1 1
(TP • C - G/FC) (TP-OR-H) (TP • DR - AB) (fP-C-AB)

Onze techniques de dosage ont donc été testées

a) dosage des phénols totaux

par colorimétrie

- au Folin-Ciocalteu (PT-C-FC) (Marigo, 1973) (20 échantillons) ;

- au Bleu de Prusse (PT-C-BP) (Price et Butler, 1977) (28 échantil-


lons) ;

par gravimétrie

précipitation à l'ytterbium (PT-G-Y) (Reed et ai., 1985) (13


échantillons)

par chromatographie

- chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) (technique


appliquée au NRI) (26 échantillons)

b) dosage des oligomères flavanoliques totaux (OFT) par gravimétrie


(OFT-G) Masquelier et ai., 1979) (13 échantillons)

c) dosage des tanins condensés (TC) par colorimétrie

- après condensation des proanthocyanidines avec la vanilline en milieu


acide (TC-C-V) (Brun, 1987) (13 échantillons)
5

- après hydrolyse acide des proanthocyanidines en milieu butanolique


(TC-C-Bu) (Scalbert et aL., 1987) (105 échantillons) ;

d) dosage des tanins hydrolysables (TH) par colorimétrie après oxydation


par le nitrite de sodium (TH-C-NaNo2) (Scalbert et al., 1987) (5 échan-
tillons) ;

e) dosage des tanins précipitants (TP) (totaux = hydrolysables +


condensés)

par colorimétrie

- après précipitation de la gélatine et réaction au Folin-Ciocalteu


(TP-C-G/FC) (Marigo, 1973) (18 échantillons) ;

- après précipitation de l'albumine bovine (TP-C-AB) (Hagerman et


Butler, 1978) (456 échantillons) ;

par diffusion radiale (Hagerman, 1987)

- après précipitation de 1 'albumine bovine (TP-DR-AB) ( 5 échan-


tillons) ;

- aprés précipitation de l'hémoglobine (TP-DR-H) (28 échantillons).

Une même fraction de phénols peut donc être déterminée par plusieurs
méthodes qui différent dans leurs principes, ce qui explique par avance la
variabilité des données bibliographiques et celle qui ressort du tableau
VI.1.

Selon les techniques utilisées (tableau VI.l), les résultats présentent


en effet une grande hétérogénéité: pour certaines espèces, aucuns tanins
totaux n'ont été dosés alors que les teneurs en tanins condensés ne sont
pas nulles (ex. Sesbania rostrata). De même, certaines teneurs en
oligomères flavanoliques totaux sont plus faibles que les teneurs en tanins
condensés (ex. Acacia Linearoides). Pour certains échantillons, les teneurs
en polyphénols obtenues par dosage à l'ytterbium sont surestimées ( ex.
Gardenia ternifoLia).
6

Tableau VI.1 - Teneurs en diverses fractions polyphénoliques de quelques


espèces ligneuses (Villeneuve, 1991)
{en g d'équivalent étalon p.100 g de MS; étalon variable suivant la
méthode: 1. acide ellagique; 2. p.100 de MS; 3. catechine;
4. acide tanique)

METHODE PHENOLS 1 PHENOLS 2 OFT- 2 Tanins 3 Tanins 1 Tanins 4


TOTAUX TOTAUX G condensés précipitants précipitant;
PT-C-FC. PT-G-Y TC-C-V TP-C-GIFC TP-C-AB.
Boscia 0.3 2.1 0.5 02 a.a a.a
senegalensis

Balanites 0.5 0.0 0.5 0.3 a.a 0.1


aegyptiaca

Sesbania 1.1 a.a 0.3 0.8 0.1 0.1


rostrata

Rhigozum 1.5 4.8 6.3 1.6 0.9 -


somalense

Acacia 4.1 0.3 0.2 0.6 2.3 a.a


linearoïdes

Gardenia 5.7 29.4 1.5 1.6 3.4 -


temifolia

Acacia 9.3 19.6 3.7 1.4 6.9 8.6


ataxacantha
Acacia 24.6 31.2 2.7 3.6 4.8 1.1
meamsîi

Selon la méthode de détermination, la hiérarchie des espèces est


différente ; cependant, certaines espèces apparaissent globalement riches
en tanins, d'autres pauvres.

De nombreux autres facteurs peuvent faire varier les résultats obtenus


pour une même méthode.

I.2. Influence du mode de conditionnement des échantillons

Les tanins sont supposés être dans les vacuoles des cellules fraîches
(Mc Leod, 1974 ; Terrill et aL., 1990). Lors du séchage, le rétrécissement
des vacuoles permettrait le contact des tanins avec les protéines
membranaires. La complexation tanin-protéines, ainsi qu'une polymérisation
et une oxydation des tanins par la chaleur (Golstein et Swain, 1963),
pourraient expliquer la diminution des teneurs en tanins observée sur les
échantillons séchés ; ceci d'autant plus que la température est élevée
(Terrill et aL., 1990). L'hypothèse est donc faite qu'un séchage à l'air
libre devrait entraîner une dénaturation des tanins moins importante qu'à
l 1 étuve.

En début de programme, cinq échantillons ont donc été conservés dans les
mêmes conditions que celles appliquées par Ho-Ahn et al., (1989) et Terrill
et al., 1990 en vue de déterminer les conséquences d'un séchage
systématique à l'air, le plus adapté aux conditions logistiques du projet.

Les échantillons frais ou congelés, lyophilisés, séchés à l'air ou à


l'étuve à 60°C ont été analysés pour leurs teneurs en :
SOMMAIRE

Page
INTRODUCTION ..................................................... 1
1. CHOIX DES METHODES DE DOSAGE . . . . . . • . . • . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . • . . . 3
1.1. Principales fractions de polyphénols et principes des
méthodes de détermination . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2. Influence du mode de conditionnement des échantillons .•.. 6
1. 3. Influence du mode d'extraction . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . 10
1.4. Influence du choix des étalons de référence pour calibrer
les réactions colorimétriques . . . • . . . . . . . . . • . . . . . . • . . . . . . . 11
1.5. Relations entre les résultats obtenus dans plusieurs
laboratoires et/ou par plusieurs méthodes ................ 12
1.6. Détermination qualitative des phénols par HPLC ........... 13
1.7. Conclusion sur le choix des méthodes..................... 16

2. TENEURS EN TANINS DE QUELQUES LIGNEUX D'AFRIQUE CENTRALE ET DE


L'OUEST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . 17

2 .1. Matériel et méthode . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2 . 1 .1 . Matériel . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2. 1. 2. Méthode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.2. Résultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . 17

3. EFFETS DES TANINS SUR LA VALEUR ALIMENTAIRE DES FOURRAGES


LIGNEUX . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . • . 23

3 .1. Rappels bibliographiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.1.1. Effet des tanins sur l'ingestion.................... 23


3.1.2. Effet sur la digestibilité de la.fraction fibreuse.. 23
3.1.3. Effet sur la digestibilité de l'azote............... 23

3. 2. Etude expérimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

CONCLUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

BIBLIOGRAPHIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
7
- phénols totaux (PT-C-FC) (PT-G-Y)

- oligomères flavanoliques totaux (OFT-G)

- tanins hydrolysables (TH-C)

- tanins condensés (TC-C-V) ou (TC-C-Bu)

- tanins précipitants (TP-C-G/FC).

Conformément aux résultats de la bibliographie (cf. ci-dessus), le mode


de séchage a affecté différemment les teneurs en phénols selon l'espèce et
la technique de dosage (tableau VI.2 et figure VI.3). Globalement, les
échantillons séchés à l'étuve avaient les teneurs les plus basses et ce
mode de conditionnement masquait les hiérarchies entre espèces qui
pouvaient être établies avec les échantillons conservés par d'autres
techniques. Les échantillons frais avaient les teneurs les plus élevées
mais ceux qui ont été lyophilisés ou séchés à l'air se classaient dans le
même ordre.

Compte tenu de l'intérêt irrégulier du dosage sur des échantillons frais


ou lyophilisés, comparativement à des échantillons séchés à l'air, c'est ce
dernier mode de conservation qui a été finalement adopté pour des dosages
en série.
8.

Tableau VI.2 - Teneurs en polyphénols (en g d'équivalent étalon/100 g de


MS) en fonction des techniques de dosage utilisées et en
fonction du mode de séchage des échantillons

METHODE SECHAGE Leucaena Piliostigma Grewia Guiera Calotropis


leucocephala reticulatum senegalens procera
bicolor

Frais 6.8 10.6 7.2 7.6 1.4


PHENOLS
TOTAUX Lyoph. 3.5 5.1 2.1 5.6 -
Sec Air 1, 4.7 4.3 3.9 4.6 0.0
PT-C-F
SecEtuve* 3.6 3.9 1.3 2.8 0.3
(1)
Frais 13.9 6.9 10.9 24.2 0.0
PHENOLS
TOTAUX Lyoph. 9.2 8.7 9.9 15.6 -
Sec Air 8.6 5.2 8.4 7.8 0.0
PT-G-Y
SecEtuve 10.7 5.1 11.0 9.0 0.0
(2)
Frais 0.3 0.3 0.0 1.4 0.0
OFT
OFT-G Lyoph. 0.6 0.3 0.4 0.8 -
Sec Air 1.8 0.4 1.0 1.6 0.4
(2)
SecEtuve 0.8 0.5 0.8 0.7 0.9

Frais 2.6 3.0 2.7 1.4 0.0


Tanins
condensés Lyoph. 3.5 4.1 1.8 2.4 -
Sec Air 1.3 2.4 2.5 0.5 0.2
TC-C-V
SecEtuve 1.7 2.0 0.7 0.4 0.2
(1)
Frais 0.7 6.0 3.5 0.0 0.0
Tanins
condensés Lyoph. 1.6 2.9 2.8 0.6 -
Sec Air 1.5 3.6 0.4 0.5 0.2
TC-C-Bu
1.9 2.0 1.3 0.4 0.3
(3) SecEtuve

Tanins Frais - - - - -
hydrolysables Lyoph. 7.3 9.9 8.4 8.6 -
10.0 8.6 3.0 1.5 0.9
TH-C-NaNo2 Sec Air
8.0 7.6 1.7 1.3 2.1
(4) SecEtuve

3.0 8.0 4.9 1.9 0.6


Tanins Frais
3.6 1.9 2.1 -
précipitants Lyoph. 1.3
2.0 2.7 3.7 2.4 0.0
TP-C-G/FC Sec Air
SecEtuve 2.3 2.5 0.9 1.2 0.1
(1)

Tanins Frais 1.16 1.9 3.6 2.3 -


- - 6.1 -
précipitants Lyoph. 1.57
2.35 3.8 3.4 4.7 0.0
TP-C-AB Sec Air
SecEtuve 0.90 3.6 1.4 1.4 0.0
(5)

Etalon : (1) - catéchine. (2) - p.100 de MS. (3) - cyanidine. (4) - acide
ellagique. (5) - acide tanique.
* séchage à 1' air à 23° C - séchage à l'étuve à 60° C pendant 72 h.
9

Figure VI.3 - Teneurs en phénols totaux (PT-C-FC) et en tanins précipitants


(TP-C-AB) de quatre espèces ligneuses suivant le mode de
conservation des échantillons (cf. d'après tableau VI.2)

PHÉNOLS TOTAUX

"' 12
u
~ 10
0
CO 8
0 6
-..
C:
0 4

lEUCAENA PILIOSTIGMA GREWIA GUIERA


ESPÈCE

• Frais FM lyophilisé
Ili Séché air D Séché étuve

TANINS PRÉCIPITANTS

V)
7
:E
u
<l/
6
'"'
0
0
5
-.. 4
<l/
Cl
CT
C: 3
B
u
<li 2

"' 1
°a
'"' 0
lEUCAENA PILIOSTIGMA GREWIA GUJERA
ESPÈCE

• Frais lyophilisé
Ili Séché air D Séché étuve
10

I.3. Influence du mode d'extraction


Les paramètres qui caractérisent le mode d'extraction sont nombreux :
le poids de la prise d'essai et le volume d'extraction ; le dégraissage
préalable des échantillons; le choix du solvant et son élimination avant
dosage; la durée d'extraction.

La méthode retenue au début du projet (Villeneuve, 1991) est celle de


Scalbert et al. (1987) qui a été progressivement adaptée (simplifications
avec contrôle des résultats} (Grillet, 1993) et comparée à celle appliquée
par le NRI et l'Université de Hohenheim (tableau VI.3}.

Tableau VI.3 - Simplification de la technique d'extraction de Scalbert et


al. (1987) par Grillet (1992) : comparaison à celles
appliquées à l'Université de Hohenheim et au NRI

CIRAD-Forêt CIRAD-EMVT Uni. Hohenheim NRI(4)


1991(1) 1992-1993(2) ( 3)

Solv2.nt Méthanol Méthanol Méth./acêtone(S) Acétone

Durée à'extraction 2 h 1 h entre 3 et 60mm 1 mn

Voluwe d'extraction 100 ml 5 ml variable 5 ml

Prise d essai
1
1 g 100 mg variable 500 mg

E.xtraction préalable oui non variable non


àes lipides

Elioination du méthe..nol oui non variable non

(1) d'après scalbert et al.. 1987 : (2) Crillet. 1993 ; (3) Lei=Uller. 1989 : (4) !Jood
(coi:nmunication personnelle) ; (5) Phénols totaux et tanins condensés: acétone 70 p.100. Tanins
précipitants: méthanol 50 p.100.

Comme l'ont déjà signalé Terrill et al., (1990), la nature du solvant


influence les résultats : Grillet (1993) a comparé les teneurs en phénols
totaux (PT-C-BP} de trois espèces en faisant varier le solvant, méthanol ou
acétone, ainsi que la durée et le mode d'agitation; (agitation magnétique
pendant 1 heure ou homogénéisation par ultra turrax pendant 1 minute}
( tableau VI. 4) .

Tableau VI.4 - Teneur en phénols totaux (PT-C-BP} en fonction du mode


d'extraction (en DO/g de MS) {Grillet, 1993 - Résultats
obtenus au NRI)

Méthanol 70 p.100 Méthanol 70 p.100 Acétone 70 p.100


Agitation magnéti- ultra turrax 1 min ultra turrax 1 min
que 1 heure

Combretum aculeatum 460 385 712


ZiziEhus mauritiania 181 232 336
Mangifera indica 610 655 736
12

I.5. Relations entre les résultats obtenus dans plusieurs laboratoires


et/ou par plusieurs méthodes

En dépit de ces variations il est utile de vérifier la cohérence des


résultats obtenus par diverses méthodes et/ou dans plusieurs laboratoires.
A cette fin, les relations entre les teneurs en phénols totaux (PT-C-FC),
en tanins condensés (TC-C-Bu) et en tanins précipitants (TP-C-AB) mesurés
sur 12 à 18 échantillons (suivant les méthodes) à l'Université de Hohenheim
et au CIRAD-EMVT, ont été calculées. Malgré des étalons différents, les
relations sont précises et permettent une bonne prédiction des résultats
d'un laboratoire à partir de ceux obtenus dans l'autre (tableau VI.6).

Tableau VI.6 - Relations entre les teneurs en tanins (en g d'équivalent


étalon/100 g MS) mesurés à l'Université de Hohenheim (*) et
au CIRAD-EMVT

DOSAGE MOY ETALON SD MIN MAX R ETR N

PT-C-FC 1 6.6 A.GALLIQUE 6.5 2.2 26.2 0.96 1.8 12


2 4.9 A.GALLIQUE 6.5 0.7 24.8

TC-C-Bu 1 0.5 CYANIDINE 0.6 0 2.3 0.89 0.3 18


2 7.2 Combretum 1.6 0 20.1
Col!inum

TP-C-AB 1 1.4 A.TANIQUE 1.5 0 5.3 0.91 0.7 15


2 7.2 prot.précipitée 7.2 0 24.3

PT-C-FC : phénols totaux (Folin Ciocalteu) ; TC-C-Bu: tanins condensé (butanol-HCI) TP-C-AB
tanins précipitant l'albumine bovine.
1-EMVT : 2-Hohenheirn ; * résultats de Leinmüller (1989)

Par ailleurs, des ensembles d'échantillons furent analysés au CIRAD-


Forêt puis au CIRAD-EMVT par plusieurs méthodes parmi celles décrites ci-
dessus. Les coefficients de corrélation ont été calculés deux à deux. Ils
mettent en évidence les liaisons étroites entre les phénols totaux et
celles en tanins précipitants ou condensés (tableau VI.7).

Tableau VI.7 - Corrélations entre différentes techniques de détermination


des polyphénols des fourrages ligneux (n = 5 à 100)

PHENOLS TOTAUX OFT Tanins condensés Tanins


1 précipitants
PT-C-FC PT-C- BP PT-G- Y G TC-C-V TC-C·B TP-C-G/FC TP-C-AB

PT-G-Y 0.827 . 1

OFT-G 0.323 0.323 1 0.312

TH-C-Na 0.756 0.122 0.811

TC-C-V 0.867 0.726 0.431 1 0.684

TC-C-Bu 0.973 0.417 -0.525 0.952 1 0.809

TP-C-G/FC 0.869 0.689 1

TP-C-AB 0.969 0.804 0.572 1

TP-DR-AB 0.956 0.963 0.982

TP-DR-H 0.849 0.779

Les valeurs en gras sont significatives pour p < 0.01.


11

Pour une technique d'agitation identique (1 minute à l'Ultra turrax),


l'extraction à l'acétone est plus performante. Cependant ce solvant ne peut
pas être retenu pour toutes les techniques : l'acétone précipitant les
protéines, il doit être éliminé en totalité pour les méthodes mesurant
cette propriété commune aux tanins, excepté pour la technique par diffusion
radiale (d'après Hagerman, 1987).

Les durées d'extraction préconisées dans la littérature varient de 20


min à 24 h (Leinmüller et ai., 1991). D'après les résultats du tableau
VI.4, une extraction d'une minute sous agitation rapide (ultra turrax)
semble même suffisante. De plus, aucune différence n'a été observée entre
les résultats obtenus après 1 hou 2 h d'agitation (résultats non publiés
de Grillet (1992) sur 5 échantillons) Villeneuve (1991) avait fait la même
observation.

Les phénols sont des molécules facilement oxydables, des temps


d'extraction trop longs peuvent donc entraîner une sous-estimation de leurs
teneurs (Price et ai., 1978 ; Kuhla et ai., 1981), il est donc préférable
de rechercher les techniques d'extraction les plus rapides.

1.4. Influence du choix des étalons de référence pour calibrer les


réactions calorimétriques

Les composés phénoliques totaux et les tanins peuvent par exemple être
exprimés par rapport à deux étalons choisis arbitrairement parmi la liste
des composés phénoliques disponibles à l'état pur: la catéchine, monomère
de tanin condensé, et l'acide ellagique, monomère de tanin hydrolysable.
Les résultats rapportés au tableau VI.5 montrent des différences liées aux
choix de l'étalon mais elles sont faibles par rapport à celles dues aux
facteurs étudiés (espèce et mode de conservation).

Tableau VI. 5 - Phénols totaux (PT-C-FC g eq. étalon/100 g de matière


sèche)
.
Frais Lyophilisé Sec.à l'air Sec.à l'étuve
23·c 6o'c 72 h

1 2 1 2 1 2 1 2
1 1

Leucaena leucocephala 7,16 3,48 4,06 4,7 5.5 3,6 4,2


6,84
12,14 5,07 5,87 4,3 4.99 3.9 4,6
Piliostigma reticulatum 10,58
8,31 2,13 2.53 3,95 4,6 1,3 1,6
Grewia bicolor 7 ,24
Calotropis procera 1,43 1,33 · - 0 0,07 0,3 o.4
Guiers senegalensis 7,63 8,82 5,58 6,46 4,6 5,4 2,8 3,3

1; catéchine ; 2; acide ellagique

Quoi qu'il en soit, divers auteurs, dont Villeneuve (1991) citant


Ribereau Gayon ( 1968) soulignent qu'une des difficultés de l'étude des
tanins réside dans le fait que l'on compare la réactivité de mélanges de
molécules à celle de composés "étalons choisis arbitrairement
11
et
n'appartenant au mieux qu'à une des familles chimiques étudiées.
13

En revanche, malgré une liaison étroite entre les deux méthodes de


détermination des tanins condensés, seule celle utilisant le butanol est
bien corrélée avec l'effet précipitant des tanins en particulier lorsqu'il
est mesuré par diffusion radiale.

Ces observations confirment la conclusion de Villeneuve (1991) suivant


laquelle la détermination des phénols totaux au Folin-Ciocalteu complétée
par celle des tanins condensés avec le n-butanol donnait une idée suffi-
sante et cohérente du contenu tanique des fourrages ligneux. En revanche,
les dosages des tanins hydrolysables (TH) ont été trop peu nombreux pour
étudier la relation entre ce dosage et le pouvoir précipitant.

I.6. Détermination qualitative des phénols par IIPLC

Malgré les fractionnements, les méthodes de dosage globales des tanins


ne rendent pas compte de leur diversité chimique et donc des variations
d'activité biologique. Il est nécessaire pour cela de faire appel à la
connaissance structurale des molécules, à leur activité propre et à leurs
proportions relatives dans les ligneux. Les techniques modernes telles que
1 'HPLC peuvent renseigner sur ces points, espèce végétale par espèce
végétale. Les spectres obtenus au NRI {Grillet, 1993) sur trois espèces
présentent des pics différents, mais ils n'ont pas été interprétés
quantitativement (figures VI.4 et VI.5). Vingt-trois autres échantillons
ont été étudiés par la même technique.

L'étape suivante consisterait à déterminer la nature des produits


correspondants à ces pics ainsi que leur activité biologique. Il s'agit là
d'un programme de travail utile et ambitieux, entrepris en 1993 au NRI, qui
n'était pas réalisable dans le cadre de ce projet. Cette nouvelle approche
des tanins devrait, en revanche, être incluse dans une étude associée aux
effets des régimes à base de ligneux sur l'activité cellulolytique mesurée
in sacco.
14

Figure VI.4 - Spectres en HPLC (240 nm) de trois espèces ligneuses soumises
à une extraction par le méthanol sous agitation magnétique
(entre parenthèses teneur en phénols totaux mesurée par
colorimétrie par le bleu de prusse: PT-C-BP)

Combretwn aculeatwn (460 DO/g MS) (échantillon n° 855)


''
l
1
'
1 :
:
1
!1'
0.8000 - - ----- - - --+-
1
--- -- ------+----
1
----------+----
r
- --- -----4--
1
- - -- --- ___ ,.. - - ---
1
1 1 1 1 1
J J 1 1 J

: 1 : 1 :
r 1 1 , r
0.6000 ------------T-----------t-------------+-------------r-----------+-----
1 l 1 : :
1 1 : ! :
J 1 ' :
0.4000 ----- -------------+·------------+------------+-------------+------
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1 1 1 1
1 1 1 1
1 r 1 1
1 1 1 1
1 1 1 1
0.2000 -· -- ---.,------------r--- ____ ,.._ -------------4--------------4----- -
o 1 1 1
1 1 1 ,

' ' '


o. oooo u ___ ' :' !'
-1_____(._____:_:::i:::::::::::::::=:i:==-o..c>-i--J
0 10 20 30 40 50

Nangifera indica (610 DO/g MS) (échantillon n° 1601)

' ''
''
'' '
1 : l
'
:'
' -~-------------1-------------r------------+-----------
0 .8 0 00 ------------:----------
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''' 1
1
1
1
1
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1
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-~------------+------~----4-----------t----------
1

0.6000 -------------:---------- l : 1
'1
'
1 '
1 1 :
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0.4000 --------- ---L--------
1
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1
1

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1 1 1 1

0.2000 --------
-+1 -------t----------- _+------------+------------
1 1
1
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0.0000 LJ'd.~:::'-!-!._t'!...:':::::'...__:__~f-------+::::====d.'1..._.;'------~·-:-------1
50
O 10 20 30 40

Ziziphus mauritiana (181 DO/g MS) (échantillon n°

''
1 1 ! 1
: j f 1 :
0.8000 -----------r------------r-----------+-------------+------------r----------
1 1 l 1 1
: : 1 1 :
1 1 1 1 r
1 1 1 l 1
0.6000 - ---- -- - ----+1- ------ - ---~-
1
-- - - - - - - - -+---------- +-------- -- -1---
1 !
- - - - - ---
1
1 l 1 1 1
] t I l l
l : l 1 1
0.4000 ---- -------t---------
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1
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1
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1 1
1 I 1 1
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1
: 1 1 J
0.2000
- - - - - - - - - - - ..j..-- - - - - - - - - -+- - --- -- ---+-------- --+--- _______ .,.i ______ - --
1 1 1 l 1
1 J 1 1 l
1 1 1 1 1
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o. oooo Lï!!..'~::::._::=...;____~:::;:'.:::::.'~'..:'...'.'.'::t::::::::::~===k=-~-.....:'-----
0 10 20 30 40 50
15

Figure VI.5 - Spectres en HPLC (240 nm) de Combretwn aculeatwn soumis à


trois techniques d'extraction

Méthanol sous agitation magnétique (460 DO/g MS) (échantillon n° 855)

'
''
: t : : l'
0.8 0 0 0 - - ----- - ---+------------+--------------+-------------;--- -- --1-- -
l 1 : l 1
: : 1 1 !
1 1 : 1 1

0. 6 0 0 0 -- - -- - ------+---------
1
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1 • : :
r

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1 1 1 1
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0 .4 0 0 0 ----- -------------~·------------+------------+---- ---------:------
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1 J 1 1
0.2000 -· ·- · - -------------~--- ----.;.--------------+-------------~------
' 1 : 1
r 1
1
1

: 1 ;

o. 0000ou.:____1J0_____2.:.0____:.::3:;0:::::::===4~·0==--"'"'""--::s~'o-_J

Méthanol et homogénéisation par Ultra Turrax (385 DO/g MS)


(échantillon n° 855)

'
1
1 1 1 , 1
1
J 1 1 1
0.8 000 -----------j------------~--- ----------r----------+---------+----------
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r r 1 1 J
J 1 1 1 1
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0.6 000 ------------ -~------------+-
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1 1 J 1 1
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0 .40 0 0 ------ -----.l,.-- ---------!-------------t----------+------------t---------
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1 1
1 1 1 r 1
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1 : J : - 1
0 .2 0 0 0 - -- -~- -----------t-----------+------------r------------r·---------
1 1 1 r 1
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1 1
0·0000 ol.J~~_:=~j10_____2J.o___::_.::_:3Jo-=.::::::::==4:lo;::=::::::::~sJ'o:====J

Acétone et homogénéisation par Ultra Turrax (712 DO/g MS)


( échantillon n° 855)

''
1 1
J '
1 '
1
1 1 1 l
0.8000 -- -- -----------+-----------+-------------+------------t----------
1 : : !
1 t I l
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0.6000 -- -- ------ ------------+-----------t-----------+----------1---------
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1 ' 1
0.4000 - -----------+------------t-----------t-----------r----------
1
1
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1 : 1

0.2000 -- --- - ----~------------r-----------+---------


1 , 1
1 ' 1
1 :

'
0 10 io 40 50
16-

1.7. Conclusion sur le choix des méthodes

Il n'existe actuellement aucune méthode définitivement normalisée pour


étudier les tanins des fourrages ligneux.

Aprés les avoir testés comparativement, Grillet a progressivement


éliminé les méthodes de fractionnement en s'appuyant sur les arguments
suivants:

-les techniques de dosages des phénols totaux (PT) ne sont pas


spécifiques et ne permettent pas de distinguer les phénols de faible
poids moléculaire qui n'ont pas d'effet biologique (Deshpande et aZ.,
1986) ;

-tous les flavanes ne sont pas des tanins ; le dosage des OFT entraîne
donc une surestimation des tanins variables suivant l'espèce.

- à la différence des fourrages herbacés, les tanins hydrolysables sont


importants dans les fourrages ligneux et leur effet précipitant n'est
pas moindre que celui des tanins condensés. Il faudrait donc déterminer
les deux fractions, ce qui représente un travail très important dans le
cas de l'étude de nombreuses espèces.

Le choix d'une technique de mesure du pouvoir précipitant a été orienté


par les observations suivantes :

-la mesure de la précipitation de la gélatine par le réactif de Folin-


Ciocalteu (TP-C-FC) permet une bonne estimation des tanins totaux, mais
la technique est longue et délicate ; il est en particulier difficile
d'apprécier le précipité formé par la gélatine

-inversement, la mesure de la précipitation des protéines par diffusion


radiale est simple et rapide mais l'appréciation des résultats est très
subjective ;

-parmi toutes les techniques testées, le dosage par précipitation de


l'albumine bovine (Hagerman et Butler, 1978) semble le plus adapté pour
mesurer l'activité biologique des tanins sur un grand nombre
d'échantillons (Hahn et aZ., 1984 ; Deshpande et aZ., 1987 ; Dawra et
aZ., 1988 ; Bernays et aZ., 1989). Ce fut donc la technique retenue
pour caractériser en série les échantillons du projet en analysant en
priorité ceux étudiés in vitro ou sur l'animal.

Cependant, les liaisons trouvées entre les résultats obtenus par cette
méthode et les résultats de digestibité in vitro, in sacco ou in vivo
doivent être précisés: en effet, les valeurs obtenues par cette technique
sont des teneurs en tanins précipités et non pas des mesures d'activité
précipitantes, qui varient en fonction de la structure des tanins et de la
protéine concernée. La détermination simultanée des teneurs en protéines et
en tanins du complexe tanin-protéine formé permet d'estimer cette activité
{Makkar, 1989). Par cette technique, Leinmüller (1989) observe une bonne
corrélation (p < 0.01) entre les mesures d'activité précipitantes des
tanins et la dégradation des protéines in vitro.
17.

2. TENEURS EN TANINS DE QUELQUES LIGNEUX D'AFRIQUE CENTRALE ET DE L'OUEST

2.1. Matériel et méthode

2 .1.1. Matériel

Les tanins ont été dosés sur 560 échantillons appartenant à 124
espèces ; pour 39 d'entre elles, 5 échantillons ou plus ont été analysés.
Sur tous, les analyses chimiques classiques (MS, MAT, MGE, CBW, NDF, ADF,
ADL ... ), ainsi que des mesures de dégradabilité enzymatique des matières
sèche ou organique (dégradabilité à la pepsine cellulase) ou azotée
(dégradabilité par la pronase) ont été effectuées. 65 d'entre eux ont fait
l'objet d'études de dégradabilité in vivo, in vitro ou in sacco. La
fréquence d'une espèce ainsi que sa consommation par le bétail ont été le
critère de choix des échantillons.

Pour une méme espèce des organes divers (feuilles, fruits, fleurs,
graines, tiges ... ) ainsi que des feuilles à différents stades phénologiques
ont été analysés.

2 .1. 2. Méthode

Les échantillons séchés à 60°C ont été broyés (grille de 1 mm). Les
tanins ont été extraits par un mélange méthanol/ eau ( 7 /3) ( 100 mg
d'échantillon dans 5 ml de solvant, agitation magnétique pendant 1 heure à
température ambiante) . Les tanins ont été dosés par la technique de
précipitation de l'albumine bovine décrite par Hagermann et Butler (1978).
( TP-C-AB) (cf. § 1.1. )

2.2. Résultats

Les teneurs en tanins des feuilles des espèces représentées par au moins
5 échantillons sont présentées dans le tableau VI.8. Celle des fruits dans
le tableau VI.9. Les résultats sont exprimés en gramme d'acide tanique pour
100 grammes de matière sèche.

----·-·-·----··
18

Tableau VI.8 - Teneur en tanins précipitants de feuilles de fourrages


ligneux (en g d'acide tanique pour 100 g de MS) (TP-C-AB)

ESPECE N MOY SD MIN MAX

Af:zelia africana 6 0.00 0.00 0.00 0.00

Boscia senegalensis 0.00


" 0.00 0.00 0.00

Calotrcpis procera 8 0.00 0.00 0.00 0.00

Capparis deodua 7 0.00 0.00 0.00 0.00

Ficus exasperata 5 0.00 0.00 0.00 0.00

Gliriodia sepium 8 0.00 0.00 0.00 0.00

Leptadenia pyrotechnica 5 0.00 0.00 0.00 0.00

Satvadora persica 9 0.00 0.00 0.00 0.00

Sesbania rostrata 7 0.07 O.îO 0.00 0.24

Sa!amtes aegypt1aca 12 0.08 0.19 0.00 0.58

Monnda lucida 5 0.12 0.24 0.00 0.60

Cordia sinensis 7 0.16 0.07 006 0.27

Acaoa senegal 9 0 18 0.43 000 1.42

Pterocarpus ennaceus a 0.38 0.54 0.00 1.75

Prthece!lob,um dulœ 6 0.41 0.13 O.Z3 0.62

Leucaena leucoœpha/a 5 1.08 0.58 0.28 1.62

Spond,as mombin 5 1.23 0.29 0.81 1.67

Pteroc;;arpus !ucens 6 1.48 0.75 0.77 2.69

Combretum aculeatum 19 1.79 0.71 0.11 3.19

Frcus sycomorus 38 1 97 144 000 5.02

Hyphaene theba,ca 16 2.08 0.45 1.02 2.76

Pencops,s iax,flora 5 2.2'.l 0.45 1.67 2.73

P1hostigma tl'lonning1i 7 2.41 1 S6 0 00 5.07

Daniella oliveri 9 2.43 2.15 0.36 6.64

Ziz1phus maunt1ana 22 2.56 1.30 0.66 4.86

Faidherb1a alb1da 8 2.73 1.28 OAO 4.50

Comb1etum glutmosum 6 2."3 0.86 1.17 3.71

Acacia tort1hs 7 3.05 1..40 1.02 4.74

Bauhinia rufescens 6 3..42 1.6 100 5.60

Ac;acia nilot1c:a ,a 3..44 063 2.48 4.82

Combretum m1cranthum 5 3 56 3.89 0.81 11.24

FiOJs sur forsk 5 3.62 2.01 0.68 6.32

Adansonia digitata 8 4.79 2.22 2.63 9.02

Gu1era senegalenS1s 13 4 a, 1 68 0.85 703

Combretum nigricans 6 5.53 2.11 2.21 7.64

Parlua b1globos.a 6 5.92 3.32 0.52 9.88

Remarque les résultats relatifs aux 85 autres espèces représentés par


moins de 5 échantillons sont disponibles et figurent dans les tables
générales de composition des ligneux.
.
19

Tableau VI.9 - Teneur en tanins précipitants (TP-C-AB) des fruits de


ligneux (en g d'étalon - acide tanique - pour 100 g de MS)

ESPECE N MOY SD MIN MAX

Bauhinia rufescens 3 2.93 0.83 1.98 3.44

Pterocarpus erinaceus 2 0.57 0.64 0.11 1.02

Acacia albida 11 0.72 0.34 0.24 1.32

Acacia nilotica 5 6.93 1.07 5.25 8.22

Acacia tortilis 6 1.48 0.96 0.00 2.94

Acacia seyal 2 3.35 0.27 3.16 3.54

Acacia asak 2 2.31 0.20 2.17 2.45

Les teneurs en tanins mesurées dans nos conditions varient de O à 11


pour 100 de la matière sèche (tableaux VI.8 et VI.9). Cette variabilité se
retrouve à l'intérieur d'une même famille botanique comme en témoignent les
exemples des figures VI.6 et Vi.7.

Figure VI.6 - Variabilité des teneurs en tanins précipitants (TP-C-AB) des


feuilles de Nimosaceae

... ·-·· ··-·--·-··--·------------·---···-·--- . ····----------·-·····--·-···-··-·------··-·--·-·-·------·--·--

10

···-··· -···-·-··------·--·--·--·---·--·- ··· ·---·····-----·---···----··-···-------·---------------

8
UJ
2
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0)

g 6

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2 4
"'
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(1l
'o
0)
2
20

Figure VI.7 - Variabilité des teneurs en tanins précipitants (TP-C-AB) des


feuilles de Combretaceae

····-----------·-- ··--·---------·------··--···-
8

Pour une même espèce, les teneurs en tanins sont fonction de l'organe
analysé ; par exemple pour l'espèce Acacia niLotica les teneurs en tanins
varient de 0,3 à 8,2 selon que les mesures sont faites sur des graines, des
fleurs, des tiges, des fruits ou des feuilles (tableau VI.10.)

Tableau VI.10 - Teneur en tanins précipitants (TP-C-AB) d'Acacia niLotica


en fonction de l'organe (acide tanique en p.100 de MS)

ORGANES N MOYENNE SD MINIMUM MAXIMUM

FRUITS 5 6.92 0.95 5.25 8.22

FEUILLES 9 3.39 0.65 2.46 4.82

TIGES 4 2.57 0.87 1.58 3.9

FLEURS 2 2.23 - 2.17 2.29

GRAINES 2 0.44 - 0.31 0.58

Pour un même organe, les teneurs en tanin semblent varier avec le stade
phénologique. Pour de nombreuses espèces on remarque une augmentation de la
teneur en tanin avec l'âge des feuilles, pour d'autres on constate une
diminution des tanins dans les feuilles plus âgées (tableau VI.11)
21

Tableau VI.11 - Teneur en tanins précipitants (TP-C-AB) en fonction du


stade phénologique des feuilles (acide tanique en p.100
de MS; moyenne den échantillons)

ESPECE JEUNES DEVELOPPEES VERTES*


BAUHINIA RUFESCENS 2.8 n=3 4.5 n=2
COMBRETUM ACULEATUM 1.6 n=11 2.3 n=6
.

COMBRETUM LECARDII 2.9 n=2 10.4 n=1


COMBRETUM MICRANTHUM 1.2 n=3 7.1 n=2
COMBRETUM NIGRICANS 7.5 n=2 5.3 n=3
COMBRETUM GLUTINOSUM 3.0 n=3 2.1 n=2
DANIELLIA OLIVER! 5.2 n=3 1.0 n=6
FICUS SUR FORSK 6.3 n=1 5.2 n=1 2.2 n=3
PARKIA BIGLOBOSA 5.8 n=1 8.7 n=3
PILIOSTJGMA THONNINGII 1.6 n=2 3.0 n=3
PTEROCARPUS LUCENS 0.4 n=1 1.4 n=4 2.7 n=1
ACACIA TORTILIS 3,8 n=5 1.2 n=2

* feuilles vertes : feuilles vivantes sans précision de leur stade de


développement ou de leur âge

Cette remarque n'est cependant pas générale, pour certaines espèces la


variabilité pour un même organe au même stade phénologique est plus
importante que la variabilité liée au stade phénologique lui-même. Seul un
nombre suffisant d'échantillons peut permettre de confirmer cette
variabilité comme par exemple pour les feuilles de Ficus sycomorus (tableau
VI.12)

Tableau VI.12 - Teneur en tanins précipitants (TP-C-AP) des feuilles de


Ficus sycomorus en fonction de leur stade phénologique
(acide tanique en p.100 de MS)

FEUILLES MOYENNE SD MINIMUM MAXIMUM N


JEUNES 2.98 0.39 2.59 3.38 2
DEVELOPPEES 1,89 1,34 0 4,76 11
VERTES 0.67 0.47 O. 1.30 6

Toutes ces feuilles proviennent d'un même pays, le Cameroun.

Nous avons aussi constaté pour cette espèce une différence des teneurs
en tanin des feuilles suivant l'origine géographique (tableau VI.13).
22

Tableau VI.13 - Teneur en tanins précipitants (TP-C-AB) des feuilles


vertes de Ficus sycomorus suivant l'origine géographique
(acide tanique en p.100 de MS)

PAYS MOYENNE SD MINIMUM MAXIMUM N


.CAMEROUN 0.67 0.47 0.0 1.3 6

COTE D'IVOIRE 3.43 1.13 1.89 5.0 9

Il s'avére que les Ficus sycomorus de Côte d'Ivoire sont identifiés


comme appartenant à la variété gnaphalocarpa, ce qui n'est pas le cas de
ceux du Cameroun.

Ces différents facteurs de variation montrent à quel point il est


difficile d'attribuer une teneur moyenne en tanin à une espèce. La
comparaison des résultats avec ceux de la bibliographie nécessite une
description très précise de l'origine des échantillons et des méthodes
d'analyses. Ces informations étant rarement réunies seule une
hiérarchisation comparative peut être faite. Le tableau VI.14 présente les
teneurs de quelques espèces relevées dans la bibliographie et déterminées
par nous-mêmes.

Tableau VI.14 - Teneur en tanins précipitants des feuilles et fruits de


quelques espèces ligneuses

FEUILLES AUTEURS TECHNIQUE TENEUR EN P.100

GLIRICIDIA SEPIUM ONWUKA (1992) TC-C-V 0.0


LIM (1992) TC-C-V 0.1
D'MELLO (1992) TC-C-V 0.0
ASH (1990) TC-C-V 2.0
AHN et al (1989) TC-C-Bu 0.0
GRILLET (1992) TP-C-AB 0.0

LEUCAENA LOHAN et al (1980) AOAC 1.9


LEUCOCEPHALA D'MELLO (1992) TC-C-V 3.7
LIM (1992) TC-C-V 3.1
AHN et al (1989) TC-C-Bu 1.4
GRILLET (1992) TP-C-AB 1.1

ZIZIPHUS LOHAN et al (1980) AOAC 2.3


MAURITIANA GRILLET (1992) TP-C-AB 2.6

ALCHORNEA ONWUKA (1992) TC-C-V 1.3


CORDIFOLIA GRILLET (1992) TP-C-AB 2.5

SPONDIAS MOMBIN ONWUKA (1992) TC-C-V 0.2


GRILLET (1992) TP-C-AB 1.2

CALLIENDRA D'MELLO (1992) TC-C-V 7.9


CALOTHYRSUS LIM (1992) TC-C-V 4.4
AHN et al (1989) TC-C-Bu 1.5
GRILLET (1992) TP-C-AB 2.5

FRUITS D'ACACIA TANNER et al 1990 GRILLET 1992


TC-C-Bu en 00/NDF TP-C-AB en p.100

ALBIDA 27 0.7

TORTIUS 32 1.5

NILOTICA 89 6.9
23
3, EFFETS DES TANINS SUR LA VALEUR ALIMENTAIRE DES FOURRAGES LIGNEUX
3.1. Rappels bibliographiques

3.1.1. Effet des tanins sur l'ingestion

Les fortes teneurs en tanins diminuent 1' appétibili té et l'ingestion des


fourrages ligneux par un phénomène d'astringence au niveau de la bouche
{Goldstein et al. 1963, Bate-Smith 1973). Pour les espèces à teneurs
moyennes, l'effet est controversé, certaines espèces améliorent la
consommation de fourrages grossiers (Woodward et ai. 1989, Reed et ai.
1990, Gobi 1993, Cordesse, communication personnelle), d'autres provoquent
une diminution de l'ingestion de ces fourrages (Tanner 1988, Reed et al.
1990).

L'effet n'est pas le même selon l'espèce animale considérée, les chèvres
seraient moins sensibles aux fortes teneurs en tanins que les moutons ou
les bovins. Cette différence pourrait être liée à la présence chez les
caprins d'une protéine salivaire riche en proline qui présente une forte
affinité pour les tanins (Mehansho 1987, Rabbins et al. 1987, Burritt et
al. 1987, Austin et al. 1989, D'Mello 1992).

Reed et al. (1990) mentionnent aussi une adaptation des moutons à la


consommation d'Acacia seyal espèce riche en phénols.

3.1.2. Effet sur la digestibilité de la fraction fibreuse

Par fixation des enzymes bactériennes et/ou formation de complexes avec


les glucides pariétaux, les tanins peuvent réduire la digestibilité de la
fraction fibreuse des parois cellulaires (Barry et al. 1984, Barry et al.
1986, Reed 1986, Mueller-Harvey 1987). L'interférence des tanins avec les
fractions fibreuses rend difficile, dans le cas des fourrages ligneux, la
détermination de la valeur nutritive à partir de critères chimiques comme
elle est habituellement pratiquée pour d'autres fourrages (Woodward et al.
1989).

3.1.3. Effet sur la digestibilité de l'azote

Du fait de leur propriété de former des complexes avec les protéines,


les tanins affectent surtout le métabolisme azoté de l'animal {Woodward et
ai. 1989) .

Dans le milieu neutre du rumen certains tanins pourraient se lier aux


protéines et exercer ainsi un effet protecteur. Le complexe tanin-protéine
se dissocierait au niveau de la caillette (pH < 5) libérant ainsi les
protéines qui seraient alors assimilées au niveau de l'intestin. Seuls les
tanins hydrolysables pourraient se dissocier par hydrolyse des liaisons
estériques par l'acide gastrique (Driedger et al. Haslam 1966) la
structure diphényle (Haslam 1966) des proanthocyanidines (tanins condensés)
rendrait difficile leur hydrolyse en milieu acide (Zelter et al. 1970) :
les complexes tanins-protéines n'étant pas dissociés, les protéines non
libérées ne sont donc pas assimilées.

Cette formation de complexes tanins-protéines entraîne une réduction de


la digestibilité de l'azote. Elle se traduit chez l'animal par une
augmentation de l'azote excrété dans les fèces et par une baisse du taux de
fermentation ruminale d'où une baisse des pertes urinaires. En résumé, les
tanins hydrolysables entraîneraient une baisse de la digestion ruminale et
24

des pertes urinaires d'azote, mais un accroissement de la proportion


d'azote alimentaire digéré dans l'intestin, en revanche, les tanins
condensés provoqueraient aussi une diminution de la digestion microbienne
mais sans compensation au niveau de l'intestin. En accord avec les travaux
de Nastis et ai. (1981), Woodward (1988), Numez-Hernandez et ai. (1989),
Reed et ai. (1990), Tanner et ai. (1990), Coppock et ai. (1992) font
remarquer que les fourrages possédant des teneurs moyennes en tanins sont
des sources de protéines intéressantes tant que l'effet négatif des tanins
sur l'augmentation de l'azote fécal est inférieur à leur effet positif sur
la réduction des pertes urinaires d'azote.

Pour les fourrages riches en tanins, la diminution de la rétention


azotée est plus due à une diminution de l'ingestion qu'à une influence sur
la digestibilité de l'azote (Holechek et ai. 1990).

3.2. Etude expérimentale

Les teneurs en tanins ont été déterminées en priorité sur des


échantillons dont la valeur nutritive a été étudiée par des méthodes in
vivo, in sacco ou in vitro (technique du gastest cf. chapitre ). Les
mêmes échantillons furent aussi l'objet de mesures de dégradabilité
enzymatique de la matière sèche (SMS) ou de la matière organique (SMO) par
la pepsine cellulase et des matières azotées par la pronase ( dMAprol)
( tableau VI.15) .

Les coefficients de corrélation entre les teneurs en tanins précipitants


et les dégradabilités théoriques de la matière sèche ou des matières
azotées sont négatifs mais non significatifs. A noter que les effectifs
sont faibles. La liaison est plus étroite avec les mesures de
digestibilités in vivo et avec celles in vitro (production de gaz - GP -
par le gastest de Hohenheim). En revanche, la teneur en tanins explique peu
les variations de dégradabilités enzymatiques de la matière organique ou
des matières azotées (tableau VI.15),

Tableau VI.15 - Corrélations entre les différentes mesures de dégradabilité


et les teneurs en tanins précipitants

IN SACCO IN VIVO GASTEST SMS NPRO


DT MAT DTMS DMS DMO
N 22 9 32 29 345 347 438
TP-C-AB -0,240 -o,448 -o,409 -o,436 -0,420 -0,282 -0,162
Valeurs en gras p < 0.05
DTMA: dégradabilité théorique de la matière azotée in sacco (p.100).
DTMS : dégradabilité théorique de la matière sèche in sacco (p.100).
DMS et DMO: digestibilité de la matière sèche et de la matière organique
in vivo (p.100).
GP: production de gaz in vitro par le gastest de Hohenheim.
SMS dégradabili té enzymatique de la matière sèche par la pepsine
cellulase (p.100 de MS).
dMAprol : dégradabilité enzymatique de la matière azotée par la pronase
(p .100 de MAT).

L' étud.e des corrélations avec les teneurs en proanthocyanidines ( dosées


par le butanol HCI) donne des résultats similaires tableau VI.16)
25
Tableau VI.16 - Corrélations entre les teneurs en tanins précipitants et en
proanthocyanidines {tanins condensés) et les mesures de
dégradabilité enzymatique et in vitro

GASTEST SMS 1 NPRO

TP-C-AB --0.427 --0.446 --0.326


1

TC-C-Bu --0.354 --0.391 --0.364

N 94 87 116
1

valeur en gras p < 0.01


TC-C-Bu proanthocyanidines dosées par le butanol HCI
TP-C-AB: tanin précipitant l'albumine bovine

Les résultats présentés aux tableaux VI.15 et VI.16 montrent que


globalement les espèces les plus riches en tanins sont les moins
digestibles mais ils ne permettent pas de conclure à un effet direct et
automatique: en effet, les coefficients de corrélation intra-espèce entre
les teneurs en tanins et les paramètres de digestiblité sont, soit non
significatifs, soit positifs, soit négatifs (tableau VI.17).

Pour certaines espèces (par exemple, Ziziphus mauritiana) les


corrélations sont opposées selon le stade phénologique des échantillons,
pour d'autres espèces (par exemple, Acacia tortiZis) la corrélation est
opposée selon le critère de digestibilité étudié.

Tableau VI.17 - Corrélation entre les différentes mesures de dégradabilité


et les teneurs en tanins : corrélation significative pour
p < 0.05

CORRELATION 1 POSITIVE 1
NÉGATIVE

Acacia tortilis (7) Ficus sycornorus (11)


Pithecel/obiurn du/ce (4) Hyphaene thebaica (15)
TP-C-AB/GASTEST Pterocarpus erinaceus (6)
Ziziphus mauritiana (5) FA
Danieilia oliveri (8)

Acacia tortilis (4) Acacia nilotica (8)


TP-C-AB/SMS Paricia biglobosa (6) Danieilia oliveri (7)
Ziziphus mauritiana (11) FV Pericopsis laxiflora (5)

Guiera senegalensis (13) Faidherbia aibida (9)


TPcC-AB/NPRO Bauhinia rufescens (4) Acacia tortiiis (7)
Ziziphus mauritiana (11) FV

SMS : dégradabilité de la matière sèche par la pepsine-cellulase.


NPRO : dégradabilité de la matière azotée par la pronase.
FV: feuilles vertes ; FA: feuilles âgées.
entre parenthèses : nombre d'échantillons.

----··--··---·-·-·-~··-·----~· ---""·'------·--------------·---·---··--··---------
26
Cette incohérence dans les résultats a été constatée par de très
nombreux auteurs étudiant l'effet des tanins sur la digestibilité des
ligneux (Lohan et ai. 1983, Nastis et ai. 1981, Kumar et ai. 1984, Ahn et
ai. 1989, Nunez-Hernandez et ai. 1989, Woodward et ai. 1989, Holechek et
ai. 1990, Ash 1990, Reed et ai. 1990, Coppock et ai. 1992). Il ressort de
toute cette littérature que la variabilité de l'effet des tanins est plus
liée à la nature des tanins (tanins hydrolysables ou tanins condensés
(proanthocyanidines)) et plus à leur concentration relative qu'à leur
teneur totale (Woodward 1989), mais il n'a pas encore été possible
d'attribuer des effets nutritionnels précis aux différents composés
phénoliques. La concentration relative des tanins solubles et des tanins
insolubles est variable au sein même d'une même espèce, elle varie en
fonction de la saison (Woodward 1988), du site (Le Houérou 1980) du
stockage (Rittner 1987) de l'organe (Tanner 1988) ce qui accentue la
difficulté de prédire la valeur nutritive des fourrages ligneux sur la base
de leur analyse chimique.

CONCLUSION
Cette étude sur les tanins des fourrages ligneux d'Afrique tropicale a
été motivée par le souci d'expliquer, voir prédire, les variations de leur
digestibilité en particulier celle de leurs matières azotées.

Les connaissances sur la nature chimique des tanins et leurs effets


nutritionnels n'ont pas permis en début de programme de donner la priorité
aux phénols .totaux ou à leurs principales fractions, hydrolysables ou
condensées : il était alors admis que, faute de pouvoir quantifier les
effets antinutritionnels de ces fractions, il était nécessaire de procéder,
de façon complémentaire, à leurs déterminations respectives ; 1' opinion
générale a peu varié sur ce point.

Dans urt premier temps, les efforts ont cependant été concentrés sur la
mise au point de techniques répétables en s'attachant à définir des
méthodes standardisées de conditionnement des échantillons et d'extraction
des tanins. Des essais préliminaires, inspirés de la bibliographie, ont
produit les mêmes conclusions, en particulier, celles relatives au
séchage: le séchage à l'étuve, à l'air ou par lyophylisation entraîne une
diminution des concentrations de toutes les fractions de tanins étudiées
mais les variations sont fonction de l'espèce; toutefois, quelle que soit
la technique de séchage les hiérarchies entre espèces sont conservées.
Compte tenu des difficultés de transport et de conservation d'échantillons
frais, il a donc été retenu de travailler avec des échantillons séchés à
l'air Zimmer (1993) qui s'intéresse aux effets nutritionnels et
métaboliques des tanins, des ligneux méditerranéens, aboutit également à la
conclusion que l'on peut s'accommoder des variations de teneurs et d'effets
biologiques liées au mode opératoire (séchage et broyage des échantillons,
extraction des tanins), mais qu'il est indispensable de standardiser ceux-
ci pour autoriser des comparaisons entre échantillons.

Néanmoins, compte tenu du grand nombre d'espèces dont il était souhaité


une première connaissance qualitative, du temps nécessaire à la réalisation
de plusieurs dosages par échantillon, des liaisons relativement étroites
entre les résultats obtenus par les différentes méthodes de détermination
des tanins totaux et de leur fraction, il a été retenu dans un premier
temps de hiérarchiser les espèces suivant le principal effet biologique de
leurs tanins, à savoir l'effet précipitant des protéines. L'examen des
relations entre les mesures de valeurs nutritives (enzymatiques, in vitro,

l
27
in sacco et in vivo) et le pouvoir précipitant des tanins (tableau VI.16)
se sont d'ailleurs avérées plus étroites que celles calculées avec les
teneurs en tanins condensés considérés comme étant la fraction ayant le
plus fort effet antinutritionnel (§ 3.1.3.).

Ces investigations sur 124 espèces de ligneux d'Afrique subsaharienne


viennent donc compléter les travaux antérieurs (Rittner et Reed 1992, pour
les plus récents) : les travaux menés jusqu'ici permettent de classer les
espèces suivant les teneurs et d'établir des relations entre paramètres
analytiques {fractions de tanins caractérisées par leur type chimique ;
leur liaison avec les parois ou les matières azotées, leur dégradabilité
enzymatique ou in vitro, etc.) mais ils ne suffisent pas encore à expliquer
à eux seuls, de façon suffisamment fiable, pour des objectifs zootechniques
ou d'aménagement agroforestier, les variations de valeur alimentaire
(appétibilité, valeur énergétique, valeur azotée, site de digestion des
protéines). La faiblesse de ces approches tient aussi au fait que, sauf
pour les espèces sans tanins, les hiérarchies qui sont établies dépendent
partiellement des méthodes de dosages retenues.

Il est nécessaire pour mieux cerner les effets zootechniques des tanins
de procéder sur quelques espèces, choisies d'après leur importance pour
l'élevage, à des expérimentations complètes comprenant à la fois:

- des déterminations détaillées des fractions phénoliques, par des méthodes


chimiques colorimétriques, gravimétriques, etc., sélectionnées en
concertation avec d'autres équipes ;

- des méthodes physiques, HPLC en particulier, cette technique permettant


de différencier les espèces par une estimation des concentrations relatives
des différentes molécules appartenant à un même groupe de phénols (tanins
condensés et hydrolysables préférentiellement), ce que ne permettent pas
les méthodes de laboratoire usuelles. L'HPLC semble constituer un préalable
indispen·sable à des tentatives de prédictions par les méthodes rapides
telles que le SPIR {cf. chapitre VIII) ;

- des mesures des effets biologiques au laboratoire pouvoir précipitant


par une ou plusieurs méthodes retenues également de façon concertée;

des analyses détaillées des fractions pariétales et azotées qui


interagissent avec les tanins sur la valeur nutritive;

- des mesures enzymatiques et "in vitro" de la dégradabilité de la matière


organique et des matières azotées. S'il est admis que ces mesures ne
permettent pas d'intégrer l'ensemble des facteurs de variations de la
valeur nutritive, notamment les interactions entre aliments ou la
digestibilité intestinale, elles ont 1 'avantage de la répétabilité et, même
pour les fourrages ligneux, ont fait la preuve de leur robustesse pour
hiérarchiser les espèces, les organes et, dans certains cas, les stades de
développement

- des mesures "in situ, in sacco" de la digestion de la matière organique,


des parois et des matières azotées: ces mesures peuvent concerner, soit
un aliment standard sans tanins mis en présence de rations comportant des
proportions croissantes de ligneux, dont on étudiera les effets sur les
autres constituants des rations, soit le ligneux lui-même. L'idéal serait
de pouvoir effectuer ces mesures au niveau des différents compartiments du
tube digestif comme dans les travaux de Fall Touré et al. 1994 (cf.
chapitre IX) .
1
1~ · - · · · · - - - · · ~ · · - ~ - ~ - - - ~ ~ · - ~ - - · · · ~·-- --··--··~------·"---·---·-· ..~.~----
28
- des mesures in vivo, des bilans azotés et des essais d'alimentation avec
les mêmes rations. Des différences ayant été mises en évidence entre
espèces animales, un protocole complet devrait au minimum intégrer des
ovins et des caprins et, si possible, une espèce brouteuse de faune
sauvage.
Une des difficultés pour mener des études complètes, telle que celle
proposée ci-dessus, sur les fourrages ligneux tropicaux est l'approvision-
nement régulier en ligneux en quantité suffisante, de qualité constante et
dans une forme comparable à celle consommée par le cheptel : les gousses
de mimosaceae, en particulier celles d' Acacias sahélo-soudaniens, qui
contiennent suivant l'espèce entre 1 et 7 p.100 de tanins précipitants,
remplissent ces conditions; de plus, elles ont l'intérêt de jouer un rôle
important dans l'alimentation du cheptel tant au pâturage que par les
récoltes et le commerce qu'elles suscitent dans certains pays.

Une autre difficulté concerne les variations intra-espèce des teneurs


en tanins et de leurs conséquences sur la valeur nutritive. Les quelques
prélèvements guidés par les cycles phénologiques et les conditions
pédoclimatiques ont conduit à des observations contradictoires d'une espèce
à l'autre quant aux variations corrélatives des teneurs en tanins et celles
des paramètres de digestibilité. Il est donc nécessaire, pour quelques
espèces réputées fourragères, dont la composition varie significativement
au cours du cycle de végétation (Ziziphus mauritiana, ... ) ou suivant
l'origine géographique (Ficus gnaphaZocarpa, ... ), de renouveler un
échantillonnage systématique sur des organes précisément définis. Il n'est
pas envisageable dans ce cas de procéder, comme avec les gousses, à des
investigations complètes comprenant des mesures in vivo, mais l'ensemble
des analyses de laboratoires évoquées précédemment sont applicables.
29

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Communications personnelles : René CORDESSE - Ecole nationale superieure


agronomique de Montpellier - membre d'un groupe de travail international
sur les tanins "groupe Polyphenols".

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