Cours Biologie Moléculaire Et Génie Génétique

Télécharger au format ppsx, pdf ou txt
Télécharger au format ppsx, pdf ou txt
Vous êtes sur la page 1sur 79

RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE


Université Abou Bekr Belkaid Tlemcen, Algerie
Département de Biologie
Spécialité Génétique

Cours
Biologie moléculaire
et
Génie génétique

Mme :Selka Sarra

s.selka.sek@gmail.com
Contenu de la matière:

INTRODUCTION

CHAPITRE I : LES PRINCIPAUX OUTILS DE GENIE


GENETIQUE
• Enzymes, Vecteurs, Cellules hôtes, sondes nucléotidiques

CHAPITRE II : TECHNIQUES DE PREPARATION DE


L’ADN
• Extraction d’ADN (génomique et plasmidique), Digestion,
Electrophorèse, Isolement des fragments, Ligation,
• Transformation, Criblage de transformation
CHAPITRE III : LES BANQUES D’ADN ET
CRIBLAGE
• Banque d’ADN génomique, Banque d’ADN
complémentaire, Criblage des banques d’ADN

CHAPITRE IV : LES HYBRIDATIONS


MOLECULAIRES
• Southern blotting, Northern blotting, Dot blot,
Hybridation In Situ

CHAPITRE V : LA PCR
• Principe de PCR, Constituants, Technique de PCR,
Technique de RT-PCR, Les applications de la PCR
CHAPITRE VI : LE SÉQUENÇAGE
• Séquençage d’ADN, Séquençage d’ARN,
Banques de données, Séquençage automatisé de
l’ADN,
• Projets de séquençage

CHAPITRE VII : LE GENIE GENETIQUE ET


LES BIOTECHNOLOGIES

CHAPITRE IIX : LE GENIE GENETIQUE EN


MEDECINE VETERINAIRE ET SCEINCES
AGRONOMIQUES
Introduction
La biologie moléculaire parfois abrégé Bio mol est une
discipline scientifique au croisement de la génétique, de
la biochimie et de la physique dont l’objet est la
compréhension des mécanismes de fonctionnement de
la cellule au niveau moléculaire qui permettent la
conservation et la perpétuation de la structure vivante au
niveau du génotype.
Elle désigne également l’ensemble des techniques de
manipulation d’acides nucléiques (ADN, ARN), appelée
aussi techniques de génie génétique.
Pour cela, les techniques d’étude et de modification des
gènes et de leur expression font partie intégrante de la
biologie moléculaire. La biologie moléculaire est une
discipline scientifique qui décrit la manière dont
l’information génétique est conservée, transmise et
exprimée.
Le génie génétique est un « ensemble de techniques
permettant d'identifier et d'isoler, de modifier et de
transférer de façon contrôlée du matériel génétique».
Le génie génétique permet également d'apporter des
modifications à des gènes (mutagenèse dirigée)
qui, par conséquent, produiront des protéines modifiées.
Le génie génétique est une science qui s’attache à
l’étude du vivant ainsi que sont amélioration,
il comprend l’ensemble des techniques et approches
utilisés dans la modification et l’étude des gènes.
CHAPITRE I:
LES PRINCIPAUX OUTILS DE GENIE GENETIQUE
I- LES ENZYMES

1-1 Les enzymes qui coupent l’ADN


• les enzymes de restriction
• la Dnase
• la nucléase SI
1-2 Les enzymes qui ligaturent
• la ligase
1-3 Les enzymes qui déphosphorylent
• les phosphatases alcalines
1-4 Les enzymes qui phosphorylent
• les kinases
1-5 Les enzymes qui recopient un acide nucléique

a- ADN ADN
• ADN pol I
• Klenow Sequenase
• La Taq pol
b- ARN ADN
• La retrotranscriptase RT
c- ADN ARN
• L’ARN pol
1-1 Les enzymes qui coupent l’ADN

1. Les enzymes de restriction


Les enzymes de restrictions sont des protéines ayant une
activité enzymatique caractérisée par une capacité de
couper l’ADN double brin, de ce fait elles font partie de
la grande famille des endonucléases.

Les enzymes de restriction ont été identifiés au début


des années 50 chez les bactéries. Ces enzymes
permettent de dégrader l’ADN étranger pénétrant au
sein des cellules bactériennes incluant ceux des phages.
1.1. Le phénomène de restriction
Le phénomène de restriction est une réaction chimique
qui aboutit au clivage d’un ADN bicatainaire de
manière séquence spécifique.
Il existe dans la nature un nombre important d’enzymes
isolées à partir des bactéries, chaque enzyme reconnait
une séquence spécifique de 4 à 8 paires de bases qui
forment un palindrome, c’est-à-dire ayant la même
séquence sur les deux brins, mais en direction opposée.
La coupure de l’ADN peut aboutir à la libération de
bouts francs ou de bouts cohésives, ces derniers à
l’inverse des bouts francs sont complémentaire et
peuvent se réhybrider (reformer un double brin).
Ce deuxième type de coupure est privilégié en génie
génétique car il permet de réaliser le clonage
moléculaire par technique de restriction-ligation.
1.2. Nomenclature des enzymes de restriction
Dans la nature on peut identifier trois grandes classes d’enzyme de
restriction, les enzymes de classe/type I, II et III.

1.2.1. Enzymes de type I


La caractéristique principale réside dans le fait que la séquence
reconnue et celle qui subit la réaction de clivage sont séparées.

Ainsi l’enzyme après reconnaissance clive de manière non-spécifique


une séquence d’ADN situé de 100 à 1000 pb en aval du site de

reconnaisse.
1.2.1. Enzymes de type II
A l’inverse des enzymes de type I, celle de type II
réalisent la reconnaissance et le clivage sur la même
séquence, de ce fait le clivage devient site spécifique.

Ce type d’enzyme est celui le plus employé en génie


génétique, notamment pour le clonage moléculaire.
1.2.2. Enzymes de type III
De manière similaire aux enzymes de classe I, le type
III se présente dont la séquence de reconnaissance
et celle de clivage sont séparées physiquement.
Type I et III ne sont pas utilisées en pratique, car elles
coupent l’ADN de façon aléatoire.
Enzyme de restriction
- Isoler de micro organismes (B*)
- Couper l’ADN db en des séquences spécifiques =
palindrome

- Conditions opératoires (T° , force ionique)


Notion d’isoschizomères:

 Enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître


des mêmes sites spécifiques.
 Ils fournissent souvent après clivage enzymatique des
fragments dont les extrémités sont différentes.
Exemple :
Soit la séquence suivante: GGTACC, cette séquence est
coupée par l’enzyme Kpn I et l’enzyme Acc65 I:

Kpn I: 5’-G-G-T-A-C/C-3’
3’-C/ C-A-T-G-G-5’

Acc65 I: 5’-G/G-T-A-C-C-3’
3’-C-C-A-T-G/G-5
Notion d’enzymes compatibles:

 Deux enzymes de restriction sont dites


compatibles quand elles génèrent après
digestion des fractions aux extrémités cohésives
complémentaires.

 Ces fragments peuvent être facilement ligaturés.


Exemple:

Les enzymes Bam HI (G / GATCC)


et
Mbo I ( / GATC)
2. Les nucléases
Les nucléases dégradent les molécules d'ADN
en rompant les liaisons phosphodiesters liant un
nucléotide au suivant.

Il existe 2 types de nucléases:


• la Dnase
• la nucléase SI
2.1 La Dnase
• Endonucléase
• Coupe l’ADN db et sb au hasard
• Origine bovine (pancréas)
• Mn++ les 2 brins au m endroit
• Mg++ chaque brin indépendamment
2.2 La nucléase S1
• Attaque l’ADN sb
• Isoler d’Aspergillus oryzae (champignon)
3. Les autres enzymes d’usage courant en
biologie moléculaire:

En génie génétique il existe en plus des enzymes

de restrictions utilisées traditionnellement pour le

clonage moléculaire, d’autres familles d’enzymes

utilisées dans différentes expérimentations.


3.1. Les polymérases

- Les ADN polymérases sont des enzymes ayant la capacité de néo-

synthétiser de l’ADN à partir d’une matrice d’ADN simple brin ou d’un

ARN pour les reverses transcriptases.

- La taq polymérase est l’une des ADN polymérase les plus utilisée au

monde, sa spécificité réside dans sa capacité à résister à de forte température,

elle est utilisée dans la PCR (Polymerase Chaine Reaction) qui est une

technique permettant d’amplifier de manière importante et spécifique des

fragements d’ADN.

- La reverse transcriptase est utilisée pour la synthèse d’ADN

complémentaire (ou ADNc) obtenus à partir d’une matrice d’ARNm.


1.2 Les enzymes qui ligaturent

L'ADN ligase répare les discontinuités qui peuvent


apparaître dans un ADN double brins, notamment lors
de la réplication.
Il permet de relier les 2 fragments d'ADN double brins
(enzyme capitale puisqu'elle permet la construction de
molécules d'ADN recombinées).
ADN ligase
L'enzyme n'agit que si les 2 ADN sont associés par des
extrémités cohésives. Cette ligase assure la formation des
liaisons phosphodiesters entre une extrémité 3'OH et une
extrémité 5' phosphate.
T4 ADN ligase
Elle est capable d'effectuer des ligations entre 2 ADN à
bouts francs.
La ligase
• Liaison Phosphodiester entre 5’ P et 3’ OH
• Nécessite ATP
• Plus facile de ligaturer 2 fragments a bouts
cohésifs
• Extraites de bactéries
La réaction utilise de l’ATP qui est hydrolysé pour fournir
l’énergie ainsi que le phosphate servant à engendrer la
liaison.

Les ligases sont notamment utilisées en clonage


moléculaire, par exemple afin de souder deux bouts cohésifs
générés sous l’action d’une enzyme de restriction.
1.3 Les enzymes qui déphosphorylent
Les phosphatases alcalines
• Active pH alcalin
• Origine bactérienne ou bovine (intestins)
• Elimination d’un groupement (P) en 5’ d’une
chaine d’ADN
1.4 Les enzymes qui phosphorylent
Les kinases

• Transfert d’un groupement (P) a partir d’une molécule

d’ATP à l’extrémité 5’ de l’ADN déphosphorylé

• Extraites de bactéries
1.5 Les enzymes qui recopient un acide nucléique
 ADN ADN : ADN pol ADN dépendante

Nécessite une amorce d’ADN: ADN pol I , La Taq pol


 ARN ADN : ADN pol ARN dépendante
La retrotranscriptase RT ( isoler de rétrovirus)
 ADN ARN: L’ARN pol ADN dépendante

Capable d’initier une chaine


II- LES VECTEURS

1 Les bactériophages (phage λ, phage M13)

2 Les plasmides (pBR322 pUC 18, 19)

3 Les phagémides

4 Les cosmides

5 Les vecteurs navettes

6 Les banques YAC

7 Le plasmide Ti d’Agrobacterium temefaciens

8 Baculovirus

9 Vecteurs viraux des mammifères (rétrovirus, adénovirus, SV40,…)

10 Transfert direct des gènes (microinjection, electroporation,… )


Définition d’un vecteur en biologie moléculaire :
Un vecteur est un véhicule de transport qui
permet le transfert d'une séquence d'ADN
spécifique dans une cellule hôte (Ex Bactérie) ,
cette insertion doit assurer la réplication ou
l’expression de cet acide nucléique dans la cellule
qui le reçoit.
Il existe plusieurs types de vecteurs, on peut citer:
Les vecteurs de clonage qui sont utilisés pour le
stockage et la multiplication de fragments d’ADN
(amplifier le nombre de copies).

Les vecteurs d’expression Destine a transférer un


gène et le faire exprimer dans une cellule hôte qui
n'est pas sa cellule d'origine.
Principes généraux d’utilisation d’un vecteur
Les principaux vecteurs de clonages sont
les plasmides bactériens, les vecteurs phagiques (qui
sont des virus infectant les bactéries) ainsi que
les chromosomes artificiels de levure et de bactérie,
YAC et BAC respectivement.
Le choix du vecteur dépend du type d’approche choisie
lors de l’étude, un vecteur plasmidique sera
préférentiellement utilisé pour le séquençage de petit
fragments d’ADN (jusqu’à 2 kilo bases), alors que des
vecteurs phagiques, YAC (Yeast Artifical Chromosome)
ou BAC (Bacterial Artificial Chromosome) sont utilisés
pour réaliser des banques d’ADN génomiques.
II- 1 Les bactériophages

a- Phage λ

bactériophage lambda est un virus qui infecte les souches d’ E


coli.

L’ADN du phage est une molécule linéaire de 48,5 Kpb compacté


dans la capside, il porte à ses extrémités des séquences
cohésives dites extrémités cos.

Après injection dans la cellule, cet ADN se re-circularise sur lui


spontanément par les extrémités cos et la forme circulaire est
stabilisée par la ligase de l’hôte.
Structure binaire (tête + queue)
Cycle biologique: 2 modes sont possibles

1- Lytique
 Adsorption et pénétration:

Fixation sur des récepteurs codés par le gène


bactérien (transporteur de maltose).

ADN phagique est injecté dans la cellule hôte et


va se circulariser par complémentarité des
extrémités cos site cos (ligase bactérienne)
 Multiplication du phage:

Réplication de l’ADN et synthèse des protéines


de tête et queue, ensuite Le site cos est clivé par
protéinées phagiques
 Assemblage et libération des phages:

Lyse bactérienne provoque la libération (phages


matures)
2- Lysogénique

Intégration dans le génome bactérien et transmission à la

descendance.

 Adsorption et pénétration:

Fixation sur des récepteurs codés par le gène bactérien (transporteur

de maltose).

 Multiplication virale:

Les gènes qui codent le cycle lytique (Ex tête, queue…) sont réprimés

par un répresseur codé par le gène cI.

Le mode de multiplication dépend donc du gène cI (actif ou inactif)


Modifications apportées au phage λ
 Réduction du nombre de sites de restriction identiques:

(Ex 5 sites EcoRI ------1 ou 2 sites)


• Délétion des parties non essentielles:

Elimination de la région impliquée dans la lysogénie et la


recombinaison---- ( gènes cI)
 Insertion d’un fragments de l’opéron lactose:

LacZ (+ son promoteur en amont) ---- sélection visuelle des


phages recombinants.
- Plages de lyse blanches s’ils ont inséré un
fragment étranger ( ADN recombinant) --- inactif---
cycle lytique
- Plages de lyse bleues s’ils n’ont pas intégré (ADN
non recombinant) -----actif----- cycle lysogénique
Description de qlq phages λ

Vecteurs d’insertion : 1 exemplaire du R .S. (<7kb)

λ gt 10: site EcoRI unique est situé dans le gène cI---


sélection – cycle lytique ou cycle lysogénique

Λ gt 11: site EcoRI unique est situé dans le Lac Z---


sélection--- plages de lyse bleu ou plages de lyse
blanche.
Vecteurs de substitution ou de remplacement :

On laisse 2 exemplaires des sites de restriction


identiques espacés de quelque Kb, encadrant la
partie non essentielle (gènes cI) qui peut être
remplacée par l’ADN étranger----- (23kb)
Ex EMBL3 et 4
b- Phage M13
Définition
• Filamenteux
• Spécifique pour E. coli (plasmide F)
• ADN sb circulaire (brin +) 6.4kb
• 10 gènes + 2 régions non codantes
Le M13 à des dérivés contenant une partie du gène lacZ
avec un polylinker (MCS: multiple cloning site) de 13 sites
uniques de restriction (54pb).
Ce qui permet d'insérer des fragments d'ADN dans ces
sites, et la sélection des colonies blanches.
Le phage M13 et ces dérivés peuvent être
utilisés :
- Pour séquencer des fragments d'ADN même de
séquences inconnues par la technique de
Sanger.
- Pour le clonage des fragments d'ADN de taille
jusqu'à six fois plus grand que l'ADN viral.
- Pour la transfection des cellules compétentes
d’E. coli.
- Dans la mutagénèse dirigée
La multiplication intracellulaire du phage fait
intervenir une forme réplicative (RF) constituée
par l'association du brin génomique (+) et d’un
brin complémentaire nouvellement synthétisé
noté brin (-).

Ce dernier devient la matrice pour la synthèse


de nouveaux brins (+) qui seront encapsidés et
relâchés dans le milieu.
Cycle biologique
- Entrée de M13 via le pilus F d’E. coli
- Multiplication de M13 les « RF »

Après être débarrassé de sa capside, le brin (+)


est complété RF (db); après plusieurs cycles de
réplication (100 à 200 RF)----la synthèse devient
asymétrique------seul le brin (+) sera synthétisé

Il sera revêtu de protéines lors de l’expulsion à


travers la membrane
Modifications apportées au phage M13
Introduction d’un polylinker et suppression des
sites pré-existants.
Un polylinker est un petit fragment db
synthétisé chimiquement introduit dans un
vecteur (phage ou plasmide) → un choix de sites
de restriction uniques
Les séries du messing M13 mp
- Famille de M13 portants des polylikers

- Ils sont Proposés par couple (M13mp1/M13mp2,


… mp18/mp19)

- Chaque couple offre les mêmes (RS)

Les plus utilisé M13mp18/mp19 ----offre 13 (RS) ≠


II-2-Les plasmides
- Petit ADN db circulaire, extrachromosomique

- Origine bactérienne

- Réplication autonome (indépendants du génome


bactérien).

- Le nombre varie de 1 à 20 copies / B* (contrôle par le


gène Rop)

- Au labo : plasmides artificiels à partir de plasmides


naturels.
Les premiers utilisés en génie génétique.
• Ce sont des plasmides à l’état naturel, non
modifiés au laboratoire.
• Il s’agit des plasmides suivants :
ColE1/ RSF 2124 / pSC 101
Les plasmides de seconde génération ce sont des
plasmides dérivés de ceux de premier génération,
mais ayant subis des modifications afin de les
améliorer, notamment par :
- l’ajout de gène de résistance à différents
antibiotiques, ceci afin d’améliorer le processus
de sélection des clones.
- Par l’ajout d’un site de multicolonnage
possédant des sites de restrictions pour plusieurs
enzymes dans le but de faciliter l’intégration de
l’insert.
Des plasmides artificiels:
• La série la plus importante de ces plasmides
est la série pBR 312 à pBR 322.
LES PLASMIDES pBR322
• Le plasmide pBR est constitué d’environ 4,4
Kb.
• Possède deux gènes de résistance à la
tétracycline et à l’amplicilline.
• Il possède 20 sites de restriction uniques dont
11 localisés sur les deux gènes de résistance.
Des plasmides artificiels : la famille des pUC de
pUC18 - pUC19.
• Ont une taille qui avoisine 2,6 Kb.
• Un plasmide pUC est un plasmide pBR dans
lequel on a remplacé le gène de résistance à la
tétracycline par un gène bactérien lacZ qui code
la β-galactosidase.
pUC 18, pUC19
pUC18
• 2.7 kb
• Comparable a M13mp18 (operon lac, même
polylinker)
• Un gène de résistance à l’amp
Les pUC (pUC18 à pUC19) ne différent que par le
nombre de nucléotides et par l’emplacement du
polylinker.
- Un site de polyclonage : Le polylinker est inséré dans
le gène lacZ qui intervient dans le catabolisme du
lactose permettant de révéler facilement
l’intégration d’un insert par « inactivation
insertionnelle).
- L'utilisation d'un inducteur coloré comme le X-gal (5-
bromo-4chloro-3-indonyl-β-Dgalactoside), l'hydrolyse
de ce dernier en dibromo-5,5-dichloro-4, 4-indigo (de
couleur bleu), indique la production de β

Vous aimerez peut-être aussi