UNIVERSITE SOLTAN MOLAY SLIMAN

FACULTE DE SCIENCE ET TECHNIQUE

DEPARTEMENT : SCIENCES DE LA VIE

BCG-S4

RAPPORT DE TRAVAUX PRATIQUE DE MICROBIOLOGIE

REALISE PAR: SAID DBILIJ

AHLAM DARUACHE

RESPONSIBLE: Pr.Azeddin EL BARNOSSI

2023- 2024

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 SOMMAIRE:
I. INTRODUCTION GENERALE.

II. LES MATÉRIELS ET LES MÉTHODES

III. LES RÉSULTATS DES MANIPULATIONS.

IV. CONCLUSION

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 I. INTRODUCTION

La microbiologie : C’est une science qui étudie les micro-organismes microscopique

autrement dit l'étude des micro-organismes a connu son plein de développement à partir du
moment où furent mises au point des méthodes permettant de les cultiver, les isoler et les
identifier.
La microbiologie contribue à plusieurs secteurs économiques de première importance .Au
travers le domaine agroalimentaire : c'est utilisation des microorganismes afin d'obtenir des
produits d'origine microbienne saine fiable et utile :
 Le domaine moléculaire : cette spécialité de la microbiologie est au croisement de la
génétique microbienne et de la biochimie
 Le domaine bio pharmaceutique : ils exploitent les systèmes enzymatiques et
moléculaire des micro-organismes pour synthétiser de nombreuses substances
thérapeutique (antibiotiques, les hormones, enzymes....)
 Le domaine clinique et santé : les microbiologistes interviennent également dans le
domaine de la santé en mettant à profit leur expertise scientifique dans l'investigation
d'éclosion de maladies infectieuses et dans l'analyse des microorganismes
 Le domaine industriel : les microbiologistes exploitent les capacités de synthèse et de
dégradation des microorganismes pour la production de substances chimiques et pour
l'extraction de certains minéraux du sol

Dans les travaux pratiques de microbiologie on a des objectifs :

1- les objectifs pédagogiques : manipulation qui nous faisons consiste à apprendre aux
étudiants quelques notions pratiques de base qui le permettent d'acquérir des performances
satisfaisant les rendements capables de pratique la microbiologie selon les énormes et de
manière correcte dans les laboratoires spécialisé.
_ Nous allons apprendre comment mettre en ordre les résultats comment lire, analyser, et
interprète pour sortir les conclusions
_ C’est de permettre aux étudiants de valoriser les résultats qui on obtient ce c'est par la
préparation d'un rapport à la fin de travaux pratiques
2-Objectifs appliqué : dans le domaine de la santé les manipulations qui l'ont faisant peut
permettre de isoler les micro-organismes pathogènes et aussi l'isolement de micro-organismes
qui présente des intérêts médicales et pharmaceutique on peut isoler des micros capables de
synthèse les antibiotiques et on peut isoler des microorganismes capable de synthèse les
pathogène
Antibiotiques : défensent aux bactéries
Phongycyles : défensent aux champignons
Dans le domaine agronomique on peut isoler des microorganismes de fertiliser le sol
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Importance de la fertilisation : augmente le rendement et la qualité des agricultures
Dans le domaine de l'environnement : on peut isoler des micro-organismes qui peuvent
intervenir dans la dépollution (élimination des polluants) pour maintenir les composants
biotique "être vivant" et abiotiques "facteurs globales"
Construction de la salle:
 Protection de manipulateur

_Installer haut inspirant en jaune (aspire les microbes les acides....) _ Les postes de travail
avec les barrières
 La protection de manipulation
_installer les paillasses avec surface lisse pour faciliter le nettoyage

_installer les espaces de circulation _ Les Méthodes microbiologique :

o Isolement des microorganismes

o Purification de colonies séparées jusqu'à obtient une seule espèce
o Conservation et identification à 4°C ,20°C ,80°C
o Identification des caractéristiques macroscopique dans milieu liquide
(laMobilité. Type de respiration...) où milieu solide (la forme, la
taille,L’aspect, couleur)
Identification microscopique : on cherche la forme microscopique des micro-organismes,
les diamètres et le mode de groupement des organismes
_Identification physiologique et métaboliques : la fermentation des sucres et la production
de certains enzymes
 Les milieux de cultures
-Milieu solide on ajout :
Agar agar: polymère de galactose à partir des algues rouges -milieu base
-milieu d'identification
-milieu DEA conservation : milieu pauvre ralenti la croissance de microorganismes
-milieu d'isolement :
 Électif sert isoler des groupes microbienne
 Sélectif sert à sélectionner des microorganismes bien déterminée
 Enrichie dans la composition on ajout des substances pour favorise la
Croissance
 Méthodes de stérilisation :

C'est la stérilisation de l'asepsie c'est à dire l'absence totale des germes se fait paria facteurs
physiques ou chimiques

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 La stérilisation à la chaleur humide(le cas d'autoclave vapeur d’eau)
 La stérilisation sèche (la forme pasteur dessiccateur bec Bunsen)
 La stérilisation par filtration (des substances thermolacines)
 La stérilisation par les rayons ultras violet (α X UV VISIBLE IR
RADIAUX)
 La stérilisation par les substances chimiques (eau de javel +alcool

II. LES MATHERILES ET LES METHODES

TP1 :
 les Matériel

Bec Bunsen :
stérilisation par la
chaleur sèche
Boite à pétri : est

utilisé pour mise en culture de bactéries, de micro-organismes ou les cellules

Coton tige : prélever les microorganismes
Suspension microbienne : contient les microorganismes qui nous voulons utiliser
Ensemencer métallique : sert à étaler les germes dans la boîte à pétri
Portoir : contient les tubes utilisés
Étuve : pour effectuer à une température donnée

 Mise en évidence des microorganismes de l'environnement

Le but :
-recherche des microorganismes retrouvés dans l'environnement

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-comparer l'abondance et le type de micro-organismes mis en évidence
-savoir les sources éventuellement de contamination des milieux de culture utilisée aux
séances de TP
Procédure :
Source de prélèvement
Corps humain : les mains, les cheveux muqueux buccaux...
L'environnement : paillasse, poignée de porte, eau, air
Manipulation :
Cheveux : secouer les cheveux avec les doigts à la surface de la boîte contenant la gélose
nutritive
Muqueuse buccale: frotter avec un coton-tige stérile la muqueuse et inoculer la gélose par
striation
Palliasse : mouiller un coton tige à la surface de paillasse
Incubation ;
Après le prélèvement des microorganismes on met la boîte de gélose nutritive dans l'étuve

 Technique d'ensemencement des milieux de culture liquide

Principe : l'ensemencement c'est une technique consiste à déposer les germes dans un milieu
liquide ou solide
La Méthode opératoire :
*Désinfecter la paillasse avec l'eau de javel
*Désinfecter les mains avec de l'alcool
*Allumer le bec Bunsen pour avoir une flamme bleue
*Manipuler dans la zone stérile qui représente un rayon de 20 cm autour de bec Bunsen
*Placer à gauche de bec Bunsen un portoir contenant une suspension bactérienne et un tube de
bouillon nutritif stérile
*Placer à droite du bec bunsen l'ensemencer métallique
*Stériliser l'ensemencer au-dessus de la flamme en positif vertical, jusqu'à ce que le fil
devienne rouge et stériliser la tige de l'ensemencement en la passant
2 à3 fois sur la flamme du bec Bunsen
*Laissee refroidir l'ensemenceur à l'intérieur du tube et prélever un inoculum microbien en
s'assurant que l'extrémité du fil est bouclé
Puis flamber et boucher le tube et remettre le tube dans le portoirs

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*prendre le tube de bouillon nutritif et la secouer 2 à3 fois
*Stériliser l'ensemenceur sur la flamme
*Met les tubes dans l'étuve

TP2
 LES MATERIELS

Suspension microbienne
Solution désinfectante.

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Portoir de tubes.
Pilan et mortie : pour libéré la charge microbien
Dessicateur : pour protéger des substituions contre l’humidité
Agitation magnétique et barreau magnétique : agitation

 Techniques d’ensemencement d’un milieu solide par: Méthode de quadrant

La technique d'ensemencement des milieux de culture solide consiste à étaler des germes sur
un milieu de culture solide (milieu gélosé) afin de les faire croître.
But
*Savoir manipuler les milieux de culture
*Apprendre les différentes techniques d'ensemencement des milieux solides
*Savoir étudier les microorganismes dans les conditions aseptiques
*Dénombrer les colonies bactériennes si l'ensemencement du milieu solide est par étalement
ou dans la masse
Mode opératoire :
_Désinfecter la paillasse avec l'eau de javel
_désinfecter les mains avec de l'alcool
_allumer le bec benzène pour avoir une flamme bleue
_prendre boîte de gélose nutritive et partage en 3
_prélever à l'aide de l'ensemenceur stérile la suspension microbienne
-met des stries dans la surface 1 puis des stries de la surface 2 à partir de 1, des stries de la
surface 3 par 2

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-incuber la boîte en position renversé dans l'étuve

 _dénombrement des microorganismes du sol

*Prélèvement de l'échantillon
Le prélèvement doit été selon les normes standards connues en microbiologie ;
_l'aspesie : utilisation de matériel stérile
_L'homogénéité : prélèvement en plusieurs répétition sur différents points puis homogénéiser
les prélèvements dans la même emballage
_l'état standard : l'échantillon doit été analysé dans leur état le plus caractéristiques
*Préparation de la suspension mère
-Peser 10 f de l'échantillon du sol prélevé
-broyer l'échantillon par le mortier et le pilon dans une quantité d'eau destillé ou d'eau
philologique pour réalise la suspension 10^-1
-agiter la suspension dans le but de libérere maximum de la charge microbienne
*La préparation des suspensions dilution
La suspension mère correspond exactement à la dilution 10^-1 jusqu'à 10-7 à l'ordre de 1 ml
dans 9ml d'eau distillée ou d'eau physiologique

 TECHNIQUE D’ENSEMENSEMENT UTILISEES

 Méthode d'étalement en surface ;

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Prélevé 0.1ml de suspension mère dilué à l'aide d'une micropipete et déposer ce volume au
milieu de la boîte contenant la gélose nutritive
_tremper la pipette râteau avec l'alcool et le stériliser
_refroidir la pipette râteau sur la gélose sans toucher l'inoclum
-étaler l'inlculum en faisant des mouvements de va et vient
Stérilisé la pipette puis laisser la boîte 10 min après incuber dans l'étuve

 Ensemencement de masse
Prélever 1 ml à l'aide d'une pipette et déposer l'inoculim dans boîte vide
-couler le milieu gélosé dans la boîte
-mélanger doucement et laisse dans le paillasse

TP 3

 LES MATERIELS

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 Préparation de milieu de culture
 Muser les se milieu soit (CHAPMAN, VRBL [violet Red Bile Agar with lactose], GELOSE
NUTRITIVE).
 Ajoute les constations de chaque milieu dans un flacon et joute 20 ml de l’eau distillé pour
chaque milieu.
 On agiter les trois flacons.
 Placer les 3 flacons dans l’autoclave pendant 2 heurs.
 Préparé les milieux dans les boites de pétri.

 Isolement des staphylocoques

-les staphylocoques sont des bactéries en formes des coques, gran positives anaérobie
facultatif groupé en amas
 Nature du milieu de culture
Le milieu de culture sélectif utilisé pour la culture des staphylocoques est le milieu de
Chapman .il contient un inhibiteur tel que le chlorure de sodium à une concentration de 75 g/l
cet agent inhibe la croissance de la plupart des bactéries gram négatif et gram positive il
contient également le mannitol comme source de carbone et d'énergie.il est mis en évidence
grâce à un indicateur coloré de ph : le rouge de phénol.
Si le milieu reste rouge ,les colonies sont mannitol cas elles ne ferment pas le mannitol avec
une légère alcalinisation du milieu par utilisation de peptones dans leur métabolisme
énergétique
_si le milieu devient jaune les colonies sont mannitol car elles fermetent le mannitol dans leur
métabolisme énergétique avec acidification du milieu
 Mode opératoire
Après la préparation du milieu Chapman, on fait la technique d'ensemencement, on divise la
boîte de pétri en 3 puis on stérilise l'ensemenceur puis on prend la suspension microbien on
met des stries dans les 3 partie de la boîte puis on incube dans l'étuve

 -isolement de coliformes :
Les coliformes appartiennent à la famille des Entérobactériaceae en forme de bâtonnet
gram négative non sporulé anaérobie facultatif
_nature du milieu de culture
Le milieu de culture sélectif utilisé pour la culture des coliformes est le milieu à
l'éosine et au bleu de méthylène (EMB agar).ce milieu contient deux colorants l'éosine
et le bleu de méthylène qui sont inhibiteurs partiels de la plupart de la flore gram
positif ces colorants assurent aussi la différenciation entre les germes lactose +et les
germes lactose _
 Mode opératoire

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 Après la préparation du milieu EMB(agar) ,on fait la technique d'ensemencement, on
divise la boîte de pétri en 3 puis on stérilise l'ensemenceur puis on prend la suspension
microbien on met des stries dans les 3 partie de la boîte puis on incube dans l'étuve
 _isolement des bacillus
Les Bacillus forment un genre de bactéries à gram positif appartenant à la famille
bacillaceae .ces bactéries sont aérobies ou aéro-anaérobies facultatif et tirent leur
énergie par la respiration et la fermentation. Elles sont capables de produire les
endospores on distingue 3;
Bacillus à spore ovale ou arrondie non déformante
Bacillus à spore ovale déformante
Bacillus à spore ronde déformante
 Mode opératoire
Après la préparation du milieu gélose nutritive, on fait la technique d'ensemencement,
on divise la boîte de pétri en 3 puis on stérilise l'ensemenceur puis on prend la
suspension microbien on met des stries dans les 3 partie de la boîte puis on incube
dans l'étuve

TP 4
 LES MATERIELS

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  Observation de l'état frais des levures(Frottis frais
L'observation microscopique est nécessaire pour identifier les microorganismes savoir
leur forme leur dimension et leur mode de groupement les formes existantes des
bactéries sont : les coques, les bacilles, cocobacillus, les bacilles fusiformes, les
vibrions, les spirilles ,les tréponèmes et les leptospires
-But
*Observer les différentes formes et mode de groupement des levures
*Observer les différentes formes et mode de groupement des bactéries
*Apprendre la technique de la coloration de gram et de la spore
_Observation de l'état frais des levures (frottis frais)
Mode opératoire :
-allumer le bec Bunsen pour avoir une flamme bleue
-prendre une lame propre et mettre au dessus une goutte d'eau
-prélevrr avec la pipette pasteur stérile une goutte de la suspension de la levure
-prendre une lame propre et mettre au dessus la goutte prélevé
_ajouter une goutte de bleu de méthylène.
_prendre une lamelle par deux de ses côtés et la poser délicatement
-observer au microscope en commençant par le faible grossissement (obj 4) puis le fort
grossissement (obj 10et 40)
-dessiner la forme des cellules observées
 Coloration de gram(frottis sec)
But
C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les propriétés de la paroi
bactérienne et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier .on distingue
les bactéries gram -et les gram
*Mode opératoire
La coloration de gram est rèalisé en 4 étapes suivantes
_etalement : c'est la préparation du frottis bactérien qui est basé sur l'étalement des
microorganismes sur une lame

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 _séchage:sécher la lame en la posant sur une plaque chauffante ou sur flamme du bec
Bunsen
La fixation :passer la lame 2 à 3 fois sur la flamme du bec bensun afin de tuer les
microorganismes et laisser de refroidir

 Coloration des spores

But
La coloration des spores permet de mettre en évidence les endospores des bactéries et
bacillus
Mode opératoire
Prendre une lame et préparer un frottis à partir la culture de Bacillus et laisser sécher
fixer sur la flamme et recouvrir par la solution vert malachite laisse agir puis laver et
colorer avec fuscine, laver, observer au microscope
La coloration :
Plonger la lame dans le Borel contenant le cristal violet et laisse agir 1 min
Rincer la lame sous un filet fin d'eau du robinet jusqu'à élimination de l'excès du
colorant
Plonger la lame dans le Borel contenant le lugol et laisse agir une minute
(morçendage)
Rincer la lame sous un filet fin d'eau du robinet mettre la lame dans le Borel du alcool
acétone rincer puis sécher
Mettre sous microscope (g*1000)

III. RESULTAT DES MANIPULATIONS.

TP1
 Mise en évidence des microorganismes de l'environnement
Apres 1 semaine on obtenir les résultats suivant
• Notre résultat :

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 Punie de porte

• Les résultats d’autre équipe :

 Technique d'ensemencement des milieux de culture liquide

 Les résultats de l’équipe 6

Respiration anaérobie strict

 Les résultats de group 3

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TP2
 Techniques d’ensemencement d’un milieu solide par: Méthode de quadrant

 TECHNIQUE D’ENSEMENSEMENT UTILISEES

 étalement en surface ;
Résultat de l’équipe 8

Les résultats de tous les équipes

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 Ensemencement de masse
Les résultats de notre équipe

Les résultats de l’autre équipe :

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La technique de dénombrement des colonies ;
Si la boîte de pétri est difficile de dénombré on divise la boîte en 2 si encore difficile en 4, en
8, malgré les divisions le dénombrement est difficile en dénombre une carré de 1 cm
*La valeur de colonie doit compris entre 30,500 milieux enviromental
Après l’evaluation de cellule par ml contenues dans la culture mére selon la relation suivant :
N=n/v×d
On Calcul de nombre des bactéries en UFC /PS
 Ensemencement de surface

Nbr(B)= 35,94 ×10 ⁶ UFC / ml=4,72× 10 ⁸ UFC/g.Ps

Ensemensement de masse
Nbr(B)=4,16×10⁶ UFC/ml=4,16×10⁶/0,076=5,47×10⁷ UFC/g.Ps

TP3
A prés la préparation des trois milieux de cultures et met dans les boites de pétri on trouve les
résultats suivants :

a) Isolement des staphylocoques

Les colonies mannitol+présentent un halo jaune, pigmenté en jaune d'or, de diamètre intérieur
à 1 mm et sont éventuellement des staphylococcus aureus
*Les colonies mannitol -ne modifient pas la couleur du milieu, ne présentent pas d'halo jaune
et sont éventuellement des staphylococcus épidermes
Notre résultat

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Les résultats de l’autre équipe

b) Résultats de coliformes ;
*Les colonies de diamètre de 2 à 3 mm, plates à centre noir et qui présentent un éclat
métallique verdâtre en lumière réfléchie sont des Escherichia coli
* Les colonies convexes et tendance à conclure sont des klebsiella pneumonie
*Les colonies de diamètre de 4 à 6 mm et qui présentent un centre gris marron par
transparence sont des Entérobactérie
*Les colonies de diamètre à 1 à 2 mm transparent et grises sont des salmonella
*les colonies de diamètre de 2 à 4 mm plates et bleuâtre pour les ouches pigmentées sont des
Pseudomonas
*Les colonies de diamètre de 2 mm environ et grisâtre des Proteus
*Les colonies très petites et grises sont des Enterococus
Notre résultat :

Autre résultat de l’autre équipe

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 c) Résultats des bacillus :
Les endospores de bacillus se développent à la surface de la gélose nutritive.
Notre résultat

Les résultats de l’autre équipe :

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TP4 :

Levures observées par microscope optique

(Saccharomyces cerevisiae)

Escherichia coli (gram négatif)

IV. CONCLUSION

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