Criblage Phytochimique Et Activités Biologiques de Quatre Plantes Utilisées Au Mali Dans La Prise en Charge Du Paludisme Chez Les Enfants
Criblage Phytochimique Et Activités Biologiques de Quatre Plantes Utilisées Au Mali Dans La Prise en Charge Du Paludisme Chez Les Enfants
Criblage Phytochimique Et Activités Biologiques de Quatre Plantes Utilisées Au Mali Dans La Prise en Charge Du Paludisme Chez Les Enfants
European Scientific Journal February 2019 edition Vol.15, No.6 ISSN: 1857 – 7881 (Print) e - ISSN 1857- 7431
Korotoumou Traoré,
Faculté des Sciences et Techniques (FST), Université des Sciences, des
Techniques et des Technologies de Bamako (USTTB), Mali
Mahamane Haidara,
Adama Denou,
Faculté de Pharmacie, Université des Sciences, des Techniques et des
Technologies de Bamako (USTTB), Mali
Fatoumata Kanadjigui,
Marie Nyoni Sogoba,
Birama Diarra,
Département de Médecine Traditionnelle (DMT)/INRSP, Bamako, Mali
Seydou Maiga,
Faculté des Sciences et Techniques (FST), Université des Sciences, des
Techniques et des Technologies de Bamako (USTTB), Mali
Rokia Sanogo,
DER des Sciences Pharmaceutiques, Faculté de Pharmacie, Université de
Bamako, Mali Département de Médecine Traditionnelle, Institut National de
Recherche en Santé Publique, Ministère de la Santé Publique, Bamako, Mali
Résumé
Contexte : Selon les résultats d’une enquête menée dans différentes
zones écologiques et culturelles au Sud du Mali, beaucoup de plantes
médicinales sont utilisées dans la prise charge du paludisme chez les enfants,
dont Annona senegalensis, Flueggea virosa, Gymnosporia senegalensis et
Vitex doniana. Nous avons approfondi les études sur la composition
phytochimique, la sécurité d’emplois et les activités contre les symptômes du
paludisme. Objectifs : Caractériser les métabolites secondaires, déterminer la
toxicité aiguë, vérifier l’activité hémolytique et évaluer les propriétés
antalgiques, antipyrétiques et antiinflammatoires des quatre plantes.
Méthodologie : La composition phytochimique a été déterminée par des
réactions colorées en tube. L’activité hémolytique a été évaluée par CCM,
révélée par le sang humain. La toxicité aigüe et les activités biologiques ont
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été déterminées in vivo chez les souris et les rats. Résultats : Les coumarines,
stérols, tri terpènes, tanins et flavonoïdes ont été caractérisés dans les extraits
aqueux des quatre plantes. Ces extraits n’ont pas présenté de constituants qui
provoquent l’hémolyse. Les décoctés administrés par voie orale à la dose de
2000 mg /Kg chez des souris n’ont pas provoqués d’effets toxiques et de
mortalité. Les décoctés administrés par voie orale à la dose de 100 et 200 mg
/Kg chez des souris ont montré des remarquables activités antalgique,
antiinflammatoire et chez les rats l’activité antipyrétique. Conclusion: Ces
résultats préliminaires valident l’utilisation traditionnelle des quatre plantes
dans la prise en charge des symptômes du paludisme chez les enfants.
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Korotoumou Traoré,
Faculté des Sciences et Techniques (FST), Université des Sciences, des
Techniques et des Technologies de Bamako (USTTB), Mali
Mahamane Haidara,
Adama Denou,
Faculté de Pharmacie, Université des Sciences, des Techniques et des
Technologies de Bamako (USTTB), Mali
Fatoumata Kanadjigui,
Marie Nyoni Sogoba,
Birama Diarra,
Département de Médecine Traditionnelle (DMT)/INRSP, Bamako, Mali
Seydou Maiga,
Faculté des Sciences et Techniques (FST), Université des Sciences, des
Techniques et des Technologies de Bamako (USTTB), Mali
Rokia Sanogo,
DER des Sciences Pharmaceutiques, Faculté de Pharmacie, Université de
Bamako, Mali Département de Médecine Traditionnelle, Institut National de
Recherche en Santé Publique, Ministère de la Santé Publique, Bamako, Mali
Abstract
Introduction: According to the results of a survey conducted in
different ecological and cultural areas in southern Mali, many medicinal plants
are used by traditional paediatricians in taking charge of malaria in children.
The survey highlighted the use of four plants, which we decided to carry out
further study on phytochemical composition, safety of use and activity against
symptoms of malaria. Objectives: To characterize secondary metabolites, to
determine acute toxicity, to check haemolytic activity, and to evaluate the
analgesic, antipyretic and anti-inflammatory properties of Annona
senegalensis, Flueggea virosa, Gymnosporia senegalensis, and Vitex doniana.
Methods: The phytochemical composition of the aqueous extracts of the leafy
twigs of the four plants was determined by coloured tube reactions.
Haemolytic activity was assessed by TLC and revealed by human blood.
Acute toxicity and biological activities were determined in vivo in mice and
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Introduction
L’OMS (2001) estime à plus de 80% la population africaine ayant
toujours recours à la médecine traditionnelle en matière de soins de santé
primaires. Des études conduites par le programme « Faire reculer le
paludisme » en 1998 indiquent qu’au Ghana, au Mali, au Nigéria et en Zambie,
le traitement de première intention pour 60% des enfants atteints de forte
fièvre due au paludisme fait appel aux plantes médicinales, administrées à
domicile (Guedje, Tadjouteu, & Dongmo, 2013).
Selon une étude en (RCI), 100% des enfants ont reçu des soins
traditionnels soit avant ou de manière juxtaposée à la médecine moderne aux
cours de leur hospitalisation (Konan, 2012).
Au Mali malgré les progrès accomplis dans le domaine de la prévention
et du traitement du paludisme, l’Annuaire statistique du Système Local
d’Information Sanitaire (SLIS) en 2014, révèle que le paludisme se situe
toujours au 1er rang des affections et représente 40,08% des motifs de
consultations. Les enfants de 0 à 5 ans et les femmes enceintes constituent les
cibles qui paient plus de tribut pour le paludisme. La prévalence palustre parmi
les enfants âgés de 6 à 59 mois est de 52% (EDSM V, 2012-2013).
En plus des pertes en vies humaines, le paludisme coûte cher aux états à
cause des dépenses de santé publique et la perte de capacité de travail (EDSM
V, 2012-2013).
Une enquête menée en 2010 auprès des pédiatres traditionnelles sur la
prise en charge des maladies infantiles dans différente zones écologique au
Sud du Mali, a permis de recenser de nombreuses plantes médicinales utilisées
dans le traitement du paludisme chez les enfants (Traoré, 2010). Une autre
étude menée au Mali (Traoré, 2014) a confirmé en général la très forte
utilisation des soins traditionnels chez les enfants, malgré la disponibilité et
l’accessibilité de la médecine moderne. En effet, 96,7% des mères de ladite
étude ont eu recours aux soins traditionnels pour traiter leurs enfants. Cette
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situation reste invariable quel que soit le niveau d’instruction, les conditions
socioculturelles ou la religion des parents.
Dans le cadre de la mise au point de nouveaux phytomédicaments pour
la prise en charge du paludisme chez les enfants, la présente étude a pour but
d’étudier la Phytochimie, la Sécurité d’emploi et les Activités antalgique,
antiinflammatoire et antipyrétique des quatre plantes utilisées dans le
traitement de la fièvre palustre chez les enfants, notamment Annona
senegalensis Pers. (Annonaceae), Flueggea virosa (Roxb. ex Willd.) Royle
(Phyllanthaceae), Gymnosporia senegalensis (Lam.) (Celastraceae) et Vitex
doniana (Sweet) (Lamiaceae), dont l’enquête du 2010 avait mis en évidence
l’utilisation par les pédiatres traditionnelles.
Matériel et méthodes
Matériel végétal
Les rameaux feuillés de Annona senegalensis (A. senegalensis),
Flueggea virosa (F. virosa), Gymnosporia senegalensis (G. senegalensis),
Vitex doniana (V. Doniana) ont été récoltés en juillet 2015 à Bamako (Mali).
Les plantes ont été identifiées et authentifiées au Département de Médecine
Traditionnelle de l’Institut National de Recherche en Santé Publique
(DMT/INRSP), sous les Numéros : F. virosa 1356/DMT, G. senegalensis
0239/DMT, A. senegalensis 281/DMT, V. doniana 2003/DMT.
Animals
Des souris Albinos Swiss pesant entre 20 - 25 g et des rats pesant entre
100 - 150 g, de l'un ou l'autre sexe, ont été obtenus auprès de l’animalerie du
DMT/INRSP. Les animaux ont été maintenus dans des conditions de
laboratoire standard (25 ° C) avec des cycles lumière/obscurité de 12/12 h) et
ont été nourris avec une alimentation préparée au DMT, avec libre accès à
l'eau du robinet.
Extractions
Pour les études de la toxicité et les activités biologiques (activité
hémolytique, antalgique, antiinflammatoire et antipyrétique) nous avons
utilisés la décoction qui est la forme traditionnelle la plus utilisé (88,88%) dans
le traitement du paludisme des enfants (Traoré, 2010).
Les rameaux feuillés des 4 plantes ont été séchés à l'ombre pendant deux
semaines puis ont été réduits en poudre. Deux cent cinquante grammes de
poudre de chaque échantillon ont été bouillis dans de l'eau distillée (2500 mL)
pendant 15 minutes. Les décoctés ont été filtrés. Les filtrats ont été évaporés à
sec sous vide. Les extraits secs obtenus ont été stockés au réfrigérateur à 4-8 °
C jusqu'à l'utilisation.
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Etudes phytochimiques
Les grandes familles de métabolites secondaires ont été recherchées
dans les plantes suivant les méthodes classiques de caractérisation. Les tanins
et polyphénols ont été identifiés par le test au FeCl3 et le réactif de Stiasny ;
les flavonoïdes par la réaction à la cyanidine ; les saponosides par le test de
mousse; les tri-terpènes et stéroïdes par le test de Liebermann-Burchard et
enfin les alcaloïdes par les tests de Mayer et Dragendorf (Bruneton J, 1999 ;
Evans WC, 2002).
Les groupes chimiques ont été caractérisés par des réactions colorées
et de précipitations en tube et par la chromatographie en couche mince.
Les flavonoïdes ont été caractérisés par le test Shibata, les tanins et
les polyphénols par le test de chlorure ferrique. Le test de Liebermann-
Buchard a permis de caractériser les tri-terpènes et stéroïdes. La
caractérisation des saponosides est basée sur l’apparition des mousses
après agitation des extraits.
Evaluation de la toxicité
Test de l’activité hémolytique : Mode opératoire selon Paris et Moyse,
1965
Les extraits secs des décoctés à analyser ont été dissous à raison de 10
mg/mL, 20 mg/mL et 50 mg/mL dans du mélange méthanol : eau (1:1). Les
chromatogrammes ont été obtenus avec les extraits aqueux des décoctés des
quatre plantes dans le système de solvant acétate d’éthyle – methylethylcetone
- acide formique - eau (50-30-10-10). Les chromatogrammes ont été ensuite
aspergés de sang, puis séchés à l’air libre. Les constituants provoquant
l’hémolyse apparaissaient sous formes de taches blanches sur fond rouge.
Activité antalgique
L'activité analgésique a été testée à l'aide de souris albinos Swiss
(pesant de 20 à 25 g) de l'un ou l'autre sexe. Les animaux ont été randomisés
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en dix groupes de six souris. Les groupes I et II ont été traités par voie orale
respectivement avec de l'eau distillée (25 ml/kg) utilisée comme groupe
contrôle négatif et le paracétamol (100 mg/kg) utilisé comme médicament de
référence. Les groupes restants ont été traités par voie orale avec les décoctés
(100, 200 mg/kg). Une heure après ces traitements, les animaux ont reçu par
injection intrapéritonéale (IP) une solution d'acide acétique à 1%. Le nombre
de contorsions a été compté pendant 20 minutes, en commençant 5 minutes
après l'injection d'acide acétique (Siegmund, Cadmus, & Lu, 1957). La valeur
moyenne pour chaque groupe a été calculée et comparée au groupe contrôle
négatif. Les pourcentages d'inhibition ont été calculés en utilisant la formule
suivante:
(𝐖𝐜 − 𝐖𝐭) × 𝟏𝟎𝟎
% 𝐈𝐧𝐡𝐢𝐛𝐢𝐭𝐢𝐨𝐧 =
𝐖𝐜
- Wc représente la moyenne du nombre de contorsions des souris du groupe
contrôle négatif ;
- Wt est la moyenne du nombre de contorsion des souris des groupes traités
par les extraits et le paracétamol.
Activité anti-inflammatoire
L'inflammation aiguë a été produite par l'injection de carragénine dans
la région sous-plantaire de la patte postérieure droite des souris (Winter,
Risley, & Nuss, 1963). Les souris Albinos Swiss de l'un ou l'autre sexe ont été
randomisées en dix groupes de six souris. Les groupes I et II ont été traités par
voie orale respectivement avec de l'eau distillée (25 ml/kg) utilisée comme
groupe contrôle négatif et l’indométacine (8 mg/kg) utilisé comme
médicament de référence, tandis que les groupes restants ont été traités par
voie orale avec les décoctés des plantes (100 et 200 mg/kg). Une heure après
les traitements, 0,025 ml d’une suspension de carraghénine à 1% ont été
injectées dans la patte postérieure droite des animaux. Le volume de la patte a
été mesuré à l'aide d'un pied à coulisse. Les mesures ont été déterminées à 0 h
(V0): avant injection de la carraghénine) et à des intervalles de 1, 3 et 5 h plus
tard (VT). La différence entre VT (1, 3 et 5 h) et V0 a été prise comme valeur
d'œdème. Le volume moyen de la patte pour chaque groupe a été calculé et
comparé au groupe contrôle négatif. Les pourcentages d'inhibition ont été
calculés en utilisant la formule suivante:
[(𝐕𝐓 − 𝐕𝟎) 𝐜𝐨𝐧𝐭𝐫ô𝐥𝐞 𝐧é𝐠𝐚𝐭𝐢𝐟 − (𝐕𝐓 − 𝐕𝟎) 𝐠𝐫𝐨𝐮𝐩𝐞 𝐭𝐫𝐚𝐢𝐭é] × 𝟏𝟎𝟎
% 𝐈𝐧𝐡𝐢𝐛𝐢𝐭𝐢𝐨𝐧 =
(𝐕𝐓 − 𝐕𝟎) 𝐜𝐨𝐧𝐭𝐫ô𝐥𝐞 𝐧é𝐠𝐚𝐭𝐢𝐟
Activité antipyrétique
L'activité antipyrétique des décoctés a été évaluée en utilisant la pyrexie
induite par la levure chez les rats mâles ((Loux, Depalma, & Yankell, 1972).
Les rats ont été mis à jeun pendant 16 heures avec un accès libre à l'eau. À 0
h, les températures basales des rats ont été prises en utilisant un thermomètre
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clinique numérique. Ensuite, chaque animal a reçu par voie sous-cutanée une
suspension aqueuse à 20% de levure. La température rectale des animaux a été
prise 24 heures après l'injection de levure. Les animaux avec une augmentation
de température de 0,5 ° C ont été sélectionnés et regroupés en huit groupes de
cinq rats et traités par gavage. Un groupe a été traité avec du paracétamol (100
mg/kg) comme médicament de référence. Un deuxième groupe a reçu de l'eau
distillée (10 ml/kg) utilisée comme groupe contrôle négatif. Les groupes
restants ont été traités avec les décoctés (100 et 200 mg/kg). La température
rectale des rats a été prise chaque heure pendant 4 heures après l'administration
des traitements. La valeur moyenne pour chaque groupe a été calculée et
comparée au groupe contrôle négatif.
Analyses statistiques
L'analyse statistique des résultats a été réalisée par comparaison de
chaque lot d'animaux traités par rapport aux témoins en utilisant le test t de
Dunnett à l'aide du logiciel Graph Prism version 6. Les différences sont
considérées comme significatives si la valeur de « p » est inférieure à 0,05 par
rapport au groupe contrôle négatif.
n = 5. *P < 0.05; **P < 0.01; *** P < 0.001 et **** P < 0.0001.
Résultats
Phytochimie
Tableau 1 : Groupes chimiques des rameaux feuillés de Annona senegalensis (AS),
Flueggea virosa (FG), Gymnosporia senegalensis (GS), Vitex Doniana (VD)
Rameaux feuillés des plantes
Groupes chimiques AS FV GS VD
Alcaloïdes - - - -
Tanins +++ +++ +++ +++
Tanins catéchiques +++ +++ +++ + ++
Tanins galliques - - - -
Anthocyanes ++ - - -
Flavonoïdes + ++ ++ ++ +
Anthraquinones +++ ++ ++ +++
O-hétérosides + +++ ++ ++
C-hétérosides + + - -
Stérols et triterpènes ++ +++ +++ +++
Caroténoïdes - - +++ -
Coumarines ++ ++ +++ ++
Hétérosides
- - - -
cardiotoniques
Composés réducteurs - - - -
Oses et Holosides - + + -
Mucilages + + ++ ++ + -
Saponosides ++ ++ ++ +
++++ Très abondant; +++ abondant; ++ présence modérée; + faible; - absent.
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Activité analgésique
Les extraits (100 - 200mg/kg) des quatre plantes et le paracétamol (100
mg/kg) ont significativement (p < 0,0001) réduit le nombre de contorsions
induites par l'acide acétique par rapport à l'eau distillée. Le meilleur effet
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Activité anti-inflammatoire
Les décoctés des quatre plantes et l’indométacine administrés par voie
orale chez la souris ont réduit significativement (p < 0 ,5 – 0,0001) l'œdème
provoqué par l'injection de la carraghénine comparativement au groupe
contrôle négatif (voir tableau 3). La meilleure activité anti-inflammatoire a été
obtenue à la 5ème heure avec l'extrait aqueux de F. virosa (200 mg/kg) avec
un pourcentage d'inhibition de 88,7% (voir tableau 3).
Tableau 3: Effets des extraits A. senegalensis, F. virosa, G. senegalensis et V. doniana sur
l’œdème induite par injection de la carraghénine chez les souris.
Volume moyen de l’œdème de la patte (mm) % Inhibition
Traitements (doses) 1 Heure 3 Heures 5 Heures 1 Heure 3 Heures 5 Heures
Eau distillée (25mL/kg) 0,92±0,1 1,05±0,3 0,81±0,2
A, senegalensis (100mg/kg) 0,67±0,3 0,55±0,09** 0,33±0,2** 27,17 47,62 59,26
A, senegalensis (200mg/kg) 1,08±0,6 0,49±0,1*** 0,18±0,08**** -17,39 53,33 77,78
F. virosa (100mg/kg) 0,78±0,2 0,54±0,1** 0,26±0,1*** 15,22 48,57 67,9
F. virosa (200mg/kg) 0,88±0,2 0,26±0,2**** 0,094±0,04**** 4,35 75,24 88,4
G. senegalensis (100mg/kg) 0,52±0,4* 0,34±0,1**** 0,13±0,1**** 44,02 67,62 83,95
G. senegalensis (200mg/kg) 0,83±0,2 0,4±0,09**** 0,37±0,09** 9,78 61,9 53,83
V. doniana (100mg/kg) 0,84±0,1 0,69±0,2* 0,63±0,2 9,13 34,29 22,72
V. doniana (200mg/kg) 0,81±0,5 0,66±0,3* 0,57±0,2 11,74 37,14 29,14
Indométacine (8mg/kg) 0,74±0,04 0,62±0,2* 0,34±0,1** 19,57 40,95 58,02
Les données sont exprimées en moyenne ± DS, *P < 0.05; **P < 0.01; *** P < 0.001 et ****
P < 0.0001 comparé au groupe de contrôle négatif (test de comparaison multiple de Dunnett)
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Activité antipyrétique
Le résultat de l’activité antipyrétique des extraits est présenté dans le
tableau 4. Les décoctés des quatre plantes ont considérablement réduit
l’hyperthermie induite par la levure par rapport au groupe contrôle (eau
distillée). À la troisième heure, nos quatre plantes ont un effet antipyrétique
comparable à celui du médicament de référence (paracétamol).
Tableau 3: Effets des extraits de A. senegalensis, F. virosa, G. senegalensis et V. doniana
sur l’hyperthermie induite par injection de la levure chez les rats
Température (°C)
Extraits (Doses) T-24 Heures 0 Heure 1 Heure 2 Heures 3 Heures 4 Heures
E D (25mL/kg) 37,7±0.4 38,9±0,65 39,6±0,29 39,4±0,43 39,8±0,7 39,7±0,45
A S (200mg/kg) 36,9±0,15 38,1±0,61 38±0,49**** 37,8±0,30**** 37,7±0,4**** 37,6±0.49****
F V (200mg/kg) 37,4±0,67 38,3±0,17 38,5±0,85** 38,4±0,53* 38,1±0,5**** 37,7±0,36****
M S (100mg/kg) 37±0,47 37,9±0,72 38,6±0,61* 38,4±0,72* 37,9±0,75**** 37,8±0,8****
V D (200mg/kg) 36,4±0,78 38±0,64 37,8±0,46**** 37,5±0,45**** 37,4±0,79**** 37,4±0,79****
Paracétamol 100mg/kg 37±0,33 38,2±0,32 38,1±0,49*** 37,6±0,36**** 37,2±0,24**** 37,2±0,29****
Les données sont exprimées en moyenne ± DS, n = 5. * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 et
**** P <0,0001 comparé au groupe contrôle négatif (test de comparaison multiple de
Dunnett).
Discussions
Etude phytochimique
Le criblage phytochimique a permis de mettre en évidence la présence
des tanins, des flavonoïdes, et polyphénols, des saponosides et des tri-
terpènes dans les extraits des quatre plantes. Des études antérieures ont
montré les effets anti-inflammatoire, analgésique et antipyrétique des
tanins, des flavonoïdes, des saponosides et des tri-terpènes (Akindele &
Adeyemi, 2007 ; Bose et al., 2007; Ableto et al., 2007 ).
Le rapprochement de la relation entre constituants actifs et pratiques
traditionnelles de soins nous permet de dire que :
Les tanins, les flavonoïdes, les saponosides et les tri-terpènes
pourraient être à l’origine de la prise en charge des symptômes du paludisme
(fièvres palustres, inflammations et douleurs)
Les tri-terpènes ont des propriétés anti-malariques ; donc pourraient
justifier l’utilisation de ces plantes dans le traitement du paludisme et même
des accès pernicieux.
Les flavonoïdes possèdent une forte activité antiparasitaire sur un large
spectre de parasites comme le genre Plasmodium et manifestent des activités
antispasmodiques (Portet et al., 2007).
La présence de ces composés chimiques dans l’extrait des rameaux
feuillés des quatre plantes pourrait être responsable des propriétés
pharmacologiques observées.
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Sécurité d’emploi
Activité hémolytique
L’absence de constituants provoquant l’hémolyse est un atout pour
l’utilisation thérapeutique de nos plantes. Ces résultats confirment l’innocuité
et sécurité d’emploi de la forme traditionnelle d’utilisation (décocté) de
chacune des quatre plantes.
Activités biologiques
Dans cette étude nous avons démontré les propriétés antipyrétiques et
antalgiques des extraits aqueux (décocté) des rameaux feuillés d’A.
senegalensis, F. virosa, G. senegalensis , V. doniana sur les modèles
expérimentaux de fièvre et de douleur. Ces propriétés pourraient être
bénéfiques pour atténuer les symptômes de fièvre et de douleur associés au
paludisme (OMS, 2014), et pour toute manifestation pathologique,
accompagnée d'un symptôme fébrile. Egalement, l'effet antalgique de ces
quatre plantes pourrait trouver une application thérapeutique dans un grand
nombre de pathologies pour lesquelles un symptôme douleur est présent.
Nos extraits ont aussi démontré des propriétés anti-inflammatoires sur
un modèle expérimental d’inflammation. L'inflammation est la première
réaction de l'organisme face à une agression (Pickup, 2004). L'effet anti-
inflammatoire d’A. senegalensis, F. virosa, G. senegalensis, V. doniana,
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Conclusion et perspectives
Les extraits de F. virosa, G. senegalensis , V. doniana et A.
senegalensis ont montré des propriétés antipyrétiques, analgésiques et anti-
inflammatoires. Ces résultats préliminaires, qui corroborent les données
existantes dans la littérature, valident l'utilisation traditionnelle de ces plantes
dans le traitement symptomatique du paludisme chez les enfants. En
perspective, nous envisageons d’évaluer l'activité antiplasmodiale des quatre
plantes et d’identifier le principe actif responsable de l'activité
antiplasmodiale.
Remerciements
Nous remercions l’Ong Aidemet (Aide au Développement de la
Médecine Traditionnelle) pour son assistance technique et financière à la
réalisation de ce travail.
References:
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European Scientific Journal February 2019 edition Vol.15, No.6 ISSN: 1857 – 7881 (Print) e - ISSN 1857- 7431
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