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    Cours 3 L1 BioCell 2023-24 Upc

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    Le document décrit la technique de pulse-chase pour étudier la synthèse et le devenir des macromolécules au cours du temps. La technique implique un court pulse avec un précurseur radioactif suivi de chasses à différents temps avec un précurseur non radioactif pour suivre les molécules synthétisées pendant le pulse.

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    Cours 3 L1 BioCell 2023-24 upc

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    UE 1.

    02 : Biologie 1 (S1)
    Enseignement de biologie cellulaire

    COURS 3

    1
    TECHNIQUE DE PULSE - CHASE
    Principe

    u Technique permettant d’étudier un processus dynamique

    Ø Localisation du lieu de synthèse au sein d’une ¢ d’une macromolécule


    donnée et suivi de son déplacement éventuel au cours du temps

    Ø Forme synthétisée et devenir d’une protéine au cours du temps


    (clivage, dégradation…)

    u Principe général

    2 PHASES :

    v PULSE : Marquage des molécules à étudier pendant un temps court

    v CHASE : Suivi du devenir des molécules marquées pendant le pulse


    au bout d’intervalles de temps variables
    2
    Marquage des macromolécules

    Objectif -> rendre macromolécule détectable « visible »


    -> marquage radioactif ou fluorescent

    Marquage
    radioactif Acides aminés Protéines
    Nucléotides Acides nucléiques
    Acides gras Lipides
    Oses Polysaccharides

    Précurseurs Macromolécules
    du milieu synthétisées par ¢

    Précurseur radioactif Macromolécule radioactive

    Isotopes radioactifs utilisés en biologie:

    3H -> faible énergie de rayonnement (localisation)


    35S, 14C -> moyenne énergie
    32P -> forte énergie (biochimie) 3
    Différents marquages radioactifs d’un précurseur tel que l’ATP
    par substitution d’un atome par son isotope radioactif

    Attention pour étude


    synthèse ADN ou ARN
    -> ATP α 32P

    4
    TRANSCRIPTION
    REPLICATION Précurseur
    Précurseur ADN
    Spécifique de l’ARN :
    Spécifique de l’ADN : Uridine
    Thymidine -> ex: 3H-Uridine
    -> ex: 3H-Thymidine
    ARNm (+ ARNt, ARNr)

    TRADUCTION
    -> acide aminé* ex: 3H-Leu
    protéines
    GLYCOSYLATION
    -> ose*
    glycoprotéines

    Exemple marquage ADN : T radioactif


    5

    CGGTAATGGTTCGTAGCTGGTTACC
    Protocole du pulse - chase

    PULSE = Temps court pendant lequel le précurseur radioactif est laissé à la disposition des ¢
    => macromolécules synthétisées sont radioactives

    A la fin du pulse : Elimination du précurseur radioactif

    CHASE :

    Ø Soit temps de Chase = 0 par fixation immédiate des cellules => mort des cellules

    è Détermination du lieu ou forme de synthèse des macromolécules néosynthétisées


    ayant incorporé du précurseur radioactif

    Ø Soit temps de CHASE échelonnés :

    • Cellules cultivées en présence du même précurseur non radioactif en excès (1000 x plus)
    pendant un temps plus ou moins long => macromolécules synthétisées non
    radioactives

    • Après ≠ temps de chase -> fixation des cellules => mort des cellules

    è Détermination du devenir (déplacement, dégradation…)


    des macromolécules radioactives synthétisées pendant le pulse
    (macromolécules synthétisées pendant chase ne sont pas visibles car non radioactives)
    6
    Détection du signal radioactif : autoradiographie

    Ag+ -> Ag métallique

    7
    Exemple d’application : Etude de la synthèse protéique dans la cellule pancréatique

    Précurseur : acide aminé* (ex : Leu*)


    Pulse court : 3 min (avec Leu*) -> lieu de synthèse
    Chase : 20 et 90 min (avec Leu froid) ->
    devenir des macromolécules* synthétisées durant le pulse

    8
    Exemple d’application : Etude de la durée de vie d’une protéine

    § Marquage des protéines au 35S pendant pulse


    § Chasse à différents temps
    § Extraction des protéines à l’issue des ≠ temps de chasse
    § Isolement d’une protéine étudiée (ici Mfrn1)
    § Analyse après électrophorèse du devenir de la protéine au
    cours du temps de la protéine synthétisée pendant le pulse

    9
    II.2. Les plans d’organisation cellulaire
    LES PROCARYOTES
    grains de réserve

    ADN (nucléoïde)

    Mésosome (artefact
    de fixation pour ME)
    Mb plasmique

    ribosome

    paroi
    Bactérie non photosynthétique

    2 µm

    Bactérie photosynthétique
    Cils ou pili Flagelles (possédant des thylakoïdes)
    10
    CARACTERISTIQUES GENERALES DES CELLULES PROCARYOTES

    q Cellule de forme sphérique ou en bâtonnet et de petite taille (1 à 5 µm)


    q Pas de noyau ni d’organite -> pas de compartimentation
    q Pas de cytosquelette structuré comme eucaryotes -> pas de mouvements intracellulaires ni
    exocytose/endocytose
    q MAIS découverte de protéines analogues à l’actine ou tubuline (rôles dans forme, division)
    q Paroi bactérienne en général rigide -> protection
    q Division par fission binaire (scissiparité) -> rapide (toutes les 20 min en conditions optimales)

    DOUBLEMENT DES CONSTITUANTS


    ET REPLICATION DE L’ADN
    PUIS DIVISION

    10 milliards de cellules en 12 h

    11
    ORGANISATION DES MEMBRANES EUBACTERIENNES

    décoloré violet
    Les + nombreuses
    Bâtonnets Bâtonnets
    (Escherichia Coli, (Lactobacillus,
    Salmonella,…) Listeria,..)

    Cocci Cocci
    (N. Menengitidis,..) (Staphylocoques,
    Streptocoques)

    Cyanobactéries
    12
    LES PLASMIDES

    Définition : ADN extrachromosomique de petite taille, capable de réplication


    autonome et non essentiel à la survie

    - Plasmides conjugatifs (gènes codant pili de conjugaison)


    - Plasmides de résistance (antibiotiques, métaux lourds...)
    - Plasmides métaboliques (utilisation de nutriments)
    - Plasmides de virulence (adhésion, toxines)
    - Plasmides de bactériocines

    13
    Les plasmides artificiels comme outils du génie génétique

    Insertion dans le polylinker


    de la séquence d’ADN d’intérêt
    grâce à des enzymes de restriction

    14
    LES EUCARYOTES
    UNE CELLULE ANIMALE TYPIQUE

    15
    16
    CARACTERISTIQUES GENERALES DES CELLULES EUCARYOTES

    q Taille plus élevée que ¢ procaryote (5 à 100 µm)


    q Membrane plasmique : frontière - fonctions d’échange et communication avec extérieur

    q CYTOPLASME -> ensemble du contenu cellulaire à l’exclusion du noyau

    Ø Délimité par membrane plasmique


    Ø Contient :

    • Cytosol = solution aqueuse de sels minéraux et composés organiques


    • Cytosquelette (cytosol + cytosquelette = hyaloplasme)
    • Organites (hyaloplasme + organites = cytoplasme)
    • Ribosomes libres

    Ø Fonctions :

    • Réactions métaboliques, réserves de macromolécules, signalisation


    • Architecture, mouvements cellulaires et intracellulaires
    q NOYAU -> contient l’essentiel du matériel génétique
    Ø Délimité par 1 double membrane = enveloppe nucléaire

    Ø Contient :

    • Chromatine : matériel génétique (ADN) sous forme d'un complexe ADN –


    protéines composé de plusieurs unités discontinues appelées
    chromosomes

    • Nucléole : compartiment où s'effectue la transcription des ARN ribosomiques


    et l'assemblage des sous-unités de ribosomes

    • Nucléosquelette : rôle dans l’organisation spatiale de l’ADN

    • Nucléoplasme

    Ø Fonctions :

    • Réplication de l’ADN
    • Transcription et maturation des ARN 18
    Ø Séparation transcription (noyau) – traduction (cytoplasme)

    transcription et
    traduction
    spatialement et
    temporellement
    séparés

    19
    Ø Organisation du matériel génétique différente des procaryotes

    Ø Génome 10 à 1000 fois plus important en taille en général


    Ø Mais pas en nombre de gènes
    Ø Ensemble de chromosomes linéaires distincts

    Télomères d’1 chromatide

    Chromosome
    avec
    1 chromatide 2 chromatides
    (double hélice d’ADN sœurs
    + protéines) Bras court Bras long

    centromère

    Chromosome compacté typique en métaphase de mitose


    20

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