Ce document décrit le génie génétique et le transfert naturel de gènes par la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Il explique ensuite les techniques utilisées en génie génétique comme la recombinaison d'ADN, le clonage de gènes et le criblage de clones.
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Ce document décrit le génie génétique et le transfert naturel de gènes par la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Il explique ensuite les techniques utilisées en génie génétique comme la recombinaison d'ADN, le clonage de gènes et le criblage de clones.
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Le génie génétique
I- Introduction Le génie génétique est un ensemble de techniques permettant d'identifier et d'isoler, de modifier et de transférer de façon contrôlée du matériel génétique.
Dans la nature il se peut qu’un gène soit transféré d’un être vivant pour s’incorporer dans le programme génétique d’un autre.
II- Transfert naturel des gènes de l’Agrobacterium à une plante
2-1/ Données sur la galle du collet Agrobacterium tumefaciens est une bactérie qui vit dans le sol et infecte naturellement les végétaux présentant des blessures à la base de leur tige (collet) :
En réaction à cette infection, les cellules du végétal se multiplient de manière
importante et forment une tumeur (galle du collet) qui libère dans le milieu des opines :
Les bactéries présentés dans le sol près de la tumeur sont alors capables d’utiliser ces opines comme source d’azote, mais aussi de carbone et d’énergie. La réaction du végétal est due au transfert d’un petit ADN, l’ADN-T, depuis la bactérie jusque dans le génome des cellules de la plante par l’intermédiaire d’un plasmide (ADN circulaire bactérien de petite taille) appelé plasmide Ti.
Le schéma de la figure 3, montre les étapes du transfert naturel du gène de l’A.
Tumefaciens à une cellule végétale :
L’ADN-T est contenu dans le plasmide Ti, qui est responsable des propriétés transformantes (pénétration et intégration d'ADN).
Des études ont permis d’établir la carte génétique du plasmide Ti.
La figure suivante présente une carte génétique simplifiée du plasmide Ti :
2-2/ Conclusion La bactérie Agrobacterium oriente l’activité de la cellule végétale à son profit.
Elle réalise donc, naturellement, une transformation génétique d’un organisme végétal.
Une fois ce mécanisme connu, ADN-T a été rapidement proposé, de le détourner dans un but de transgénèse (implanter un ou plusieurs gènes dans un organisme vivant).
Pour cela, il « suffit » de remplacer l’ADN-T par un autre ADN portant un gène d’intérêt. L'homme s'est inspiré de cette transformation génétique naturelle pour commencer en 1970 à faire les biotechnologies modernes basées sur l'ADN recombiné.
III- Les techniques du génie génétique
3-1/ Matériel biologique employé dans le génie génétique La bactérie Escherichia coli Le matériel biologique le plus utilise dans le génie génétique est la bactérie Escherichia coli, et ce pour 3 raisons essentielles :
Elle possède en plus de son unique chromosome, des plasmides.
Elle se reproduit très vite permettant d’obtenir rapidement plusieurs générations successives. Le cytoplasme de cette bactérie est riche en ribosomes, et possède tous les éléments nécessaires à la synthèse des protéines.
Les enzymes de restriction
Ce sont des enzymes capables de couper l'ADN au niveau des sites précis, après avoir reconnu des séquences nucléotidiques bien déterminées.
Ainsi une molécule d’ADN peut-être découpée en plusieurs fragments : les fragments de restriction.
Les ligases Ce sont des enzymes qui ont la propriété de coller ensemble des extrémités simples d'ADN, selon des séquences nucléotidiques bien déterminées.
La transcriptase inverse (ou retro-transcriptase)
C’est un enzyme qui permet de convertir l'ARN en ADN.
Le brin d'ADN résultant de cette réaction est appelé ADN complémentaire (ADNc).
3-2/ Les étapes du génie génétique
Introduction Quel que soit l'objectif visé de la manipulation génétique, le transfert du gène, d’une cellule à l’autre, nécessite 4 étapes essentielles qui sont : 1. La recombinaison de l’ADN in vitro. 2. Le clonage du gène. 3. Le criblage des clones transformant. 4. L’expression du gène.
La recombinaison de l’ADN in vitro
Les étapes pour isoler et intégrer un gène dans une cellule (Transgénèse) :
Le clonage du gène désiré
Le clonage nécessite 1’introduction du plasmide recombinant dans un système hôte, puis la mise en culture de cette bactérie dans un milieu favorable.
Généralement on utilise comme hôte les bactéries E. coli sans plasmide.
On rassemble donc les plasmides recombinants et des bactéries dans un milieu
convenable, et on 1’incite à se multiplier, formant ainsi des colonies sous forme de clones.
Cela permet à certaines bactéries d’intégrer les plasmides recombines.
Le criblage des bactéries transformant par l’utilisation des antibiotiques
Après le clonage du gène d’Intérêt, ce ne sont pas toutes les bactéries qui intégreront les plasmides, alors les cellules doivent être sélectionnées afin d’identifier celles qui auront intégré les plasmides et celles qui ne l’auront pas fait.
Afin de déterminer les bactéries génétiquement modifiées, on utilise le caractère de la
résistance aux antibiotiques.
Les plasmides renferment généralement des gènes qui favorisent la résistance aux antibiotiques (la pénicilline, l'ampicilline, etc.).
Le principe de cette technique est la culture de bactéries dans des milieux qui contiennent des antibiotiques, puis analyser les résultats obtenus dans chaque milieu de culture, pour déterminer les clones contenant le gène désiré.
Le document suivant décrit les circonstances et les résultats de ces expériences :
