Le document décrit la technique de la cytométrie en flux qui permet de compter et mesurer des paramètres de cellules individuelles comme la quantité d'ADN à l'aide de marqueurs fluorescents. Le document explique également son application pour l'étude du cycle cellulaire.
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Le document décrit la technique de la cytométrie en flux qui permet de compter et mesurer des paramètres de cellules individuelles comme la quantité d'ADN à l'aide de marqueurs fluorescents. Le document explique également son application pour l'étude du cycle cellulaire.
Le document décrit la technique de la cytométrie en flux qui permet de compter et mesurer des paramètres de cellules individuelles comme la quantité d'ADN à l'aide de marqueurs fluorescents. Le document explique également son application pour l'étude du cycle cellulaire.
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La technique de la cytométrie en flux :
Comment mesurer la quantité d'ADN dans une cellule?
Le cytomètre en flux est un appareil qui permet de compter précisément le nombre de cellules présentes dans un échantillon (population de cellules mélangées dans un liquide) tout en mesurant, pour chaque cellule, un ou plusieurs paramètres.
Les cellules sont marquées par une ou plusieurs substances fluorescentes qui se fixent spécifiquement sur certaines de leurs molécules. (Par exemple sur l'ADN en cours de réplication...etc)
Dans le cytomètre, les cellules passent en « file indienne » devant un faisceau lumineux qui « excite » le marqueur fluorescent. Les cellules sont alors comptées par un détecteur en fonction de leur réponse au faisceau lumineux.
Plusieurs paramètres peuvent alors être mesurés et enregistrés en fonction des marqueurs fluorescents qui ont été utilisés : taille de la cellule, fluorescence émise... Cette analyse permet de faire un tri des cellules. Elle est répétée à intervalle régulier. (par exemple toutes les heures)
L'analyse statistique des données cytométriques ainsi réalisées à des intervalles de temps réguliers permet de suivre l'évolution des caractéristiques de la population de cellules étudiée (par exemple ladurée de son cycle cellulaire, durée de la réplication...)
Le logiciel "Cytométrie" permet de présenter graphiquement les données relevées par le cytomètre. Ces dernières peuvent être représentées sous la forme d’un graphe bidimensionnel où l’on peut choisir les paramètres affichés en ordonnée (Y) et en abscisse (X). Chaque point (Events) du "graphique" correspond à une cellule.
Application à l'étude du cycle cellulaire :
Déroulement de l’expérience : 1°) marquage de cellules de hamster chinois pendant 30 minutes en présence de bromodésoxyuridine (BrdUrd) 2°) mise en culture 3°) au bout d'une heure : Prélèvement et marquage des cellules en présence d’iodure de propidium (PI) puis analyse au cytomètre. 4°) remise en culture puis répétition étape 3 et 4 pendant 10 heures
Propriétés des marqueurs utilisés:
- Le BrdUrd est utilisé comme précurseur (c’est un analogue de la thymine) par les cellules lors de la synthèse de l’ADN. Il permet donc de marquer les cellules en cours de réplication. - Le PI est un marqueur se fixant à l’ADN. La quantité de PI fixé est proportionnelle à la quantité d’ADN dans la cellule
Rem. Chaque fichier à charger dans le logiciel "cytométrie" correspond aux mesures réalisées à chaque heure de prélèvement. Par exemple : Le fichier n°6,correspond à des cellules prélevées 6 heures après mise en culture. Ci-dessus : Exemple de fichier affiché par le logiciel « cytomètre » Ci-dessous : la même image légendée, titrée
Pour aller plus loin dans la définition et l exploitation de la cytométrie en flux, vous pouvez consulter ces liens : http://jean-jacques.auclair.pagesperso-orange.fr/cycle%20cellulaire/principe.htm http://acces.ens-lyon.fr/biotic/morpho/html/cycle.htm#mat
