LABORATOIRE Procédure de la coproculture :examen cytobactériologique des

MOHAMMED selles
ZEFZAF DATE D’APPLICATION
REDACTRICE APPROBATRICE

Dr : KHAFALLAL SOUKAINA Dr : BERRA MOUNA 12/10/2020

FONCTION : BIOLOGISTE FONCTION : DIRECTRICE
ASSISTANTE

1. But

Le but de ce mode opératoire est de décrire les différentes étapes pour la

réalisation d’un examen cytobactériologique des selles (coproculture)

2. Etendue

Ce mode opératoire s’applique à toute demande de coproculture enregistrée

au laboratoire.

3. Responsabilité

Le technicien responsable de l’unité de microbiologie est tenu de veiller à

la mise en application des dispositions prises dans ce mode opératoire.

4. Documents de références
 Cours de bactériologie du professeur Fafa Cissé : professeur de microbiologie
à l’université Cheikh Anta Diop de Dakar,Sénégal.
 Cours de bactériologie de la quatrième année du diplôme d’étude spécialisé
en biologie clinique l’université Cheikh Anta Diop de Dakar,Sénégal .

5. Abréviations

 SS :milieu Salmonella Shigella

 EMB :Eosine Bleu de Méthylène
 TCBS :Thiosulfate citrate bile saccharose
 KH :Kligler Hajna
 CS :Citrate de Simons
 EPSA :Eau Peptonée Salée Alcaline
 ONPG :Ortho-Nitro-Phényl-Glactosidase
 TIAC : Toxi infection alimentaire collective
 AB : antibiotique

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6. Contenu

6.1-Précautions
 Les échantillons utilisés dans ce mode opératoire doivent être considérés
comme potentiellement infectieux et donc traités avec toutes les
précautions liées à cet effet.

6.2-Matériels et réactifs

 Tubes stériles .
 Lames,lamelles,microscope optique .
 Milieux de culture gélosés :SS,EMB,Chapman,Hektoen,TCBS,KH,CS .
 Milieux de culture liquide :bouillon urée-indole,EPSA.
 Eau physiologique stérile.
 Disques imprégnés :oxydase et ONPG.

7. Indications de la coproculture

 Episode aigue ou chronique de diarrhée.

 Epidémie de diarrhée.
 Détection de porteurs sains.
 Etude de la qualité microbiologique :eau potable (colimétrie) et aliments.

8. Fiche de renseignements cliniques

 L’âge du patient.
 Présence ou non de la fièvre.
 Nombre de selles effectuées par jour.
 Origine géographique ou voyage récent.
 Antibiothérapie récente.
 Epidémie :gastro-entérite infantile,choléra ,TIAC .
 Type de diarrhée et symptômes associés.

9. Principaux micro-organismes et contextes cliniques

9.1-Coproculture standard

 Salmonella spp :
o tableau clinique :gastro-entérite aigue.
 Shigella spp :
o tableau clinique :syndrome dysentérique.

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  Campylobacter spp :
o Tableau clinique :gastro-entérite.
 Yersinia enterocolitica :
o Tableau Clinique : gastro-entérite fébrile.

9.2- Enfant de moins de 2 ans :

 Coproculture standard.
 Recherche d’E.coli entéropathogène.
 N.B :Dans cette tranche d’âge les causes principales de diarrhée restent
d’origine virale :recherche surtout de Rotavirus et Adénovirus.
 Cas particulier du nouveau-né :recherche des bactéries responsables
d’infections néonatales dans le méconium :Listeria monocytogens,E.coli
K1 et Streptococcus agalactiae.

9.3-Tableaux cliniques particuliers

9.3-1-Syndrome cholériforme :

 Diarrhée aqueuse
 Mécanisme toxinique :
o E.coli entérotoxinogène :diarrhée du voyageur.
o Vibrio cholerae .

9.3-2-Syndrome dysentérique :

 Diarrhée glairo-sanglante
 Mécanisme entéro-invasif :
o E.coli entéro-invasif.
o E.coli entéro-hémorragique.

9.3-3-Diarrhée secondaire à l’antibiothérapie

 Clostridium difficile :colite pseudomembraneuse.

 Clostridium perfringens.

9.3-4-Recherche des germes résistants aux antibiotiques

 Chez les malades hospitalisés dans les services à risque :réanimation et

oncologie .

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 Recherche des bactéries multi résistantes :
o Enterocoque résistant à la vancomycine.
o SARM(Staphylococcus aureus résistant à la méticilline).
o Entérobactéries productrices de BLSE.

9.3-5- Toxi-infection alimentaires collectives :TIAC :

 TIAC d’incubation courte 1-4h :

o Staphylococcus aureus.
o Bacillus cereus.
 TIAC d’incubation longue 12h-76h :
o Salmonella spp.
o C .perfringens.
o C.botulinum.
o Y.enterocolitica.

10. Recueil des selles

10.1- Conditions du recueil

 En dehors de tout traitement susceptible de perturber le déroulement de

l’analyse :laxatifs huileux ,charbon,pansements
intestinaux,antibiotique,etc.
 Recueillir les selles fraîchement émises :glaire,sang,mucus .
 Choisir les prélèvements mucopurulents ou sanglants.
 Récipients stériles (ou propres)
 A tout moment de la journée et de la nuit.

10.2-Matériels du recueil

 Pot stérile à large ouverture.

 Ecouvillons stériles en coton.
 Papier buvard stérile.

10.3- Techniques du recueil des selles

 Recueil physiologique des selles

o Malade déféque dans un pot de chambre.
o Recueillir 5 g de selles fraîches grâce à une spatule ou un abaisse
langue.
o Placer ces 5 g de selles dans un pot stérile.

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 Recueil des selles à l’aide d’un instrument
o Ecouvillonner le rectum chez le nouveau-né, le nourrisson
o Recueillir les selles sur papier buvard chez le cholérique
o Réaliser des biopsies rectales ou coliques lors d’endoscopies
 Nota bene : ne prélever pas les selles émises dans la cuvette des WC

11. Transport-conservation des selles

11.1-Transport

 Immédiat au Laboratoire, dans un délai de 30 min

 En cas de transport sur les longues distances et ou un long délai :
o Mettre les selles dans une gélose molle : gélose de Cary Blair
o Mettre 5 à 10 gouttes de selles liquides sur papier buvard. Laisser
sécher, placer le papier buvard dans une enveloppe et l’adresser au
Laboratoire.

11.2- Conservation

 Conservation en salle climatisée : délai de 1H sur la paillasse

 Conservation au réfrigérateur à +4°C : délai de 12H
 Conservation sur papier buvard : délai de 48 H
 Conservation en gélose de Cary Blair : délai de 72 H

12. Technologie au laboratoire :Premier jour

12.1-Examen macroscopique

 Noter l’aspect des selles :sang,glaire,mucus,eau de riz,etc.

 Noter la consistance :pâteuse,solide,liquide,molle,moulée.
 Selles normales :sont moulées ,ferme ou molles.
 Selles liquides ,ocres,jus de melon :Salmonella.
 Selles afécales eau de riz :Vibrio cholerae.
 Selles glaireuses,sanguinolentes :dysenterie,amibiase ,etc.

12.2-Examen microscopique
12.2-1-Etat frais

 Selles liquides :prélever la selle et mettre entre lame et lamelle.

 Selles moulées :mélanger avec une goutte d’eau physiologique.
 Observer à l’objectif 40 et chercher :
o Les leucocytes :

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 - En cas de diarrhée à germes invasifs :présence de leucocytes :supérieure à
5 par champs :suspicion de Salmonella spp,Shigella spp et Campylobacter
spp.Dans certains cas la présence de leucocytes n’est pas toujours constantes.
- En cas de diarrhée à germes entérotoxinogènes :absence de
leucocytes :suspicion de Vibrio cholerae,Aeromonas spp et Clostridium difficile.
o Les hématies :
- Ils sont présents en cas d’invasion de la muqueuse intestinale.
o La mobilité de la flore bactérienne :
- rechercher les bactéries à mobilité polaire :suspecter Vibrio (en vol de
moucheron) et Campylobacter (en vol de mouette) ,etc.
o La recherche des levures
o La recherche des KAOP :Kyste,Adulte ,Œuf de parasite.

12.2-2-Coloration de Gram :facultative

 Flore équilibrée = 70% de bactéries à Gram (-) et 30% de bactéries à

Gram (+)
 Flore déséquilibrée = autres situations.Toute perturbation anotable de cet
équilibre doit être signalée.

12.3-Ensemencement
 Géloses sélectives pour l’isolement des bactéries
o Hektoen : H
o Eosin Methylen Blue : EMB
o Thiosulfate Citrate Bile Saccharose : TCBS
o Columbia au sang frais sélective : Campylosel
 Bouillons d’enrichissement
o Bouillon au Sélénite de sodium (BS) pour Salmonella
o Eau Peptonée Salée Alcaline (EPSA) pour Vibrio cholerae.
 Incuber les milieux
o à 37°C, en atmosphère aérobie : H, TCBS, EMB, BS, EPSA
o à 42°C, en atmosphère microaérophile : gélose Campylosel

12.4-Choix des milieux à ensemencer en fonction de l’âge

 Tout âge
o Ensemencer une gélose H
o Ensemencer une gélose TCBS
o Ensemencer une gélose Columbia au sang frais sélective (Campylosel)
o Ensemencer un bouillon BS
o Ensemencer un bouillon EPSA
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  Enfant âgé de 0 à 18 mois
o Mêmes milieux que pour tout âge
o Compléter avec une gélose EMB
 Enfant âgé de 0 à 3 ans : Rotavirus, Adénovirus

13. Technologie au laboratoire :Chronologie de la coproculture

13.1-Coproculture standard :adulte et enfant de plus de 2 ans :
13.1-1-Recherche de Salmonella-Shigella :recherche systématique

 Premier jour :
o Ensemencer une gélose H
o Ensemencer un bouillon BS
o Incuber le BS pendant 3 à 6 heures à 37°C
o Puis repiquer une grosse goutte du bouillon BS sur une nouvelle
géloseH .
 Deuxième jour :
o Choisir 5 colonies lactose (-) sur H ⇒ colonies vertes
- 3 colonies lactose (-) et SH2 (+) ou SH2(-) ⇒ colonies vertes avec un
centre noir :suspicion de Salmonella spp.
- 2 colonies lactose (-) et SH2 (-) ⇒ colonies totalement, vertes sans centre
noir :suspicion de Shigella spp.
o Repiquer chacune des 5 colonies
- En milieu urée-indole (UI) ; incuber 4H et noter la couleur des milieux UI
 Milieux UI restent jaune paille ⇒ bactérie uréase (-)
 Milieux UI virent au rouge ⇒ bactérie uréase (+) ⇒ jeter ces
bactéries
- Repiquer les bactéries uréase (-) sur gélose de Kligler-Hajna (KH)
 Troisième jour :
o Lecture de la mini galerie : KH et UI
- Salmonella: U (-), I (-), L (-), SH2 (+)⇒ agglutination avec sérums anti
Salmonella
- Shigella: U (-), I (-), L (-), SH2 (-) ⇒ agglutination avec sérums anti
Shigella
- Réaliser un antibiogramme lorsque l’agglutination est positive
- Refaire la même démarche avec la gélose H ensemencée à partir du BS le
2ème jour

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Démarche diagnostique de la recherche de salmonella-shigella

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tableau 1 les caractéres biochimiques des salmonella-shigella

 Agglutination avec les sérums anti-salmonella et anti-shigella

o Salmonella:
- OMA: S Typhi S. Paratyhi A, S. Paratyphi B, S.Typhymurium,
S.Enteritidis, S. Dublin
- OMB: S. Paratyphi C
o Shigella : Agglutination avec sérums anti Shigella

13.1-2-Recherche de Campylobacter jejuni

 Premier jour :
o Ensemencer une gélose Columbia au sang frais sélective (mélange de 3
AB)
o Incuber pendant 48H, à 42°C, en atmosphère microaérophile
 Deuxième jour
o Choisir 5 colonies plates, grisâtres
o Réaliser :
- Etat frais : rechercher une mobilité polaire(vol de mouette).
- Coloration de Gram : bacille en forme de «S»
o Rechercher la catalase et l’oxydase : elles sont (+)
o Ensemencer chaque colonie suspecte sur une galerie : KH, UI et MH
 Troisième jour :
o Lire et interpréter la galerie
o Réaliser un antibiogramme

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 13.1-3- Recherche de Yersinia enterocolitica

 Ensemencement sur CIN(Cefsulodine Irgasan Novobiocine).

 Incubation 30°C,18-24h.
 Petites colonies à centre rouge entourées d’une zone translucide ,à contour
irrégulier .
 Caractères biochimiques :uréase,fermentation du mannitol.

13.2-Coproculture standard :enfant de moins de 2 ans: Recherche

de E.coli entéropathogène :ECEP :

 Recherche de ECEP dans les selles liquides de nourrissons présentant un

tableau de fièvre avec déshydratation.
o 1er jour
- ensemencer une gélose EMB
o 2ème jour
- Choisir 5 colonies à « reflet métallique » (violet)
- Agglutiner chacune d’elles avec les sérums anti
ECEP :agglutination sur une lame des colonies en présence de
sérums qui doit apparaître en moins de 5 secondes et présenter un
caractère massif selon ce processus.
- A partir des agglutinations (+), ensemencer une mini galerie : KH,
UI, CS
- Réaliser un antibiogramme en cas d’agglutination (+)
o 3ème jour
- Lire les caractères de la mini galerie : KH, UI, CS
- Lire l’antibiogramme

13.3-Recherche de E.coli entéro-hémorragique 0157-H7

 Il s’agit de la recherche d’E.coli producteurs de shiga –toxines(STEC)

 Chez les enfant de moins de 3 ans.
 Caractérisée par une :
o Diarrhée banale
o Colite hémorragique
o Syndrome hémolytique et urémique(SHU)(5 à 8% des cas).
 Culture sur Mac Conkey au Sorbitol(SMAC) :
o Bactéries sorbitol (-) (O157 ;H7) :colonies incolores.
 Agglutination :les colonies sorbitol (-) sont agglutinées avec un sérum anti-
0157 (latex sensibilisé).

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 13.4-Recherche de Vibrio cholerae :coproculture orientée
 1er jour
o Ensemencer une gélose TCBS
o Ensemencer un bouillon EPSA
- Incuber le bouillon EPSA pendant 4H à 37°C
- Repiquer une grosse goutte du voile en surface sur un TCBS neuf
 2ème jour
o Choisir sur les TCBS 5 colonies saccharose (+) ⇒ colonies jaunes
o Ensemencer la moitié de chacune des 5 colonies sur galerie : KH, UI,
CS, et MH
o Agglutiner l’autre moitié avec le sérum polyvalent anti Vibrio
o Réaliser un antibiogramme si l’agglutination est (+)
o Rendre les résultats partiels au clinicien
 3ème jour
o Lecture des galeries (KH, UI, CS) et l’antibiogramme
- Vibrio cholerae: L (-), SH2 (-), U (-), I (+), Saccharose (+)
o Réaliser les tests complémentaires
- MH ⇒ recherche de l’oxydase : V. cholerae est oxydase (+)
- KH ⇒ réaliser le test à l’ONPG : V. cholerae est ONPG (+)
- MH : refaire l’agglutination avec les sérums polyvalents anti
Vibrio O1 et O139

Démarche diagnosttique de la recherche de vibrio cholerae

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 13.5- Intoxication alimentaire :coproculture orientée

 Recherche de Staphylococcus aureus :incubation courte de 1 à 4h.

 Recherche de Salmonella spp et Yersinia enterocolitica :incubation
longue de 12h à 72h.
 N.B :Recherche de la toxine et/ou de la bactérie dans les selles et
les aliments.

13.6-Détection de portage chez le personnel de restauration

 Recherche de Salmonella spp et de Staphylococcus aureus chez les

cuisiniers par les méthodes classiques.
 Si isolement de S.aureus :faire la recherche d’entérotoxine car les souches
non productrices ne donnent pas de TIAC.

13.7-Recherche des virus des gastroentérites

 Centrifuger 1-2 grammes de selles

 Recueillir le surnageant
 Réaliser un test d’agglutination sur lame ou carte
 Virus recherchés : Rotavirus, Adénovirus

14. Technologie au laboratoire :Résultats-Interprétation

14.1-Interprétation des résultats

 Présence de bactéries entéropathogènes spécifiques

o « Infection en cours » si le germe pousse en abondance sur la gélose
d’isolement
o « Portage possible » si le germe est isolé uniquement après
enrichissement
 Absence de bactéries entéropathogènes spécifiques
o Infection peut être au début (peu de germes dans les selles)
o Prélèvement de mauvaise qualité (recueil, transport, conservation)
o Malade sous antibiotique
o Diarrhée peut être d’origine virale ou parasitaire

14.2-Validation – Saisie – Délivrance des résultats

 Délai : 3-4 jours

 Il ne faut pas répondre « Coproculture négative
 Mais il faut dresser la liste des germes entéropathogènes recherchés

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 15. Agents entéropathogènes souvent isolés

 Bactéries
o Salmonella : Typhi, Paratyphi ….
o Shigella
o Vibrio cholerae
o E. coli entéro-pathogène : ECEP
o Campylobacter jejuni
 Virus des gastroentérites
o Rotavirus
o Adenovirus
 Parasites
o Trichomonas intestinalis, Giardia intestinalis
o Entamoeba histolytica
o Ankylostome, Ascaris ….

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