UNIVERSITE DE LIMOGES

Ecole Doctorale Sciences Biologie Santé

Faculté de Pharmacie

ANNEE 2003 N°

RADIOLYSE GAMMA DES FLAVONOIDES. ETUDE DE

LEUR REACTIVITE AVEC LES RADICAUX ISSUS DES

ALCOOLS : FORMATION DE DEPSIDES.

THESE
pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE LIMOGES
Spécialité : Biophysique
Présentée et soutenue publiquement par
Abdelghafour MARFAK

Le 12 Décembre 2003

Membres du Jury
MIALOCQ J. C. Directeur de recherche CEA Saclay Président
HOUEE-LEVIN C. Professeur Paris Sud Rapporteur
CHAOUCH A. Professeur Kénitra (MAROC) Rapporteur
DUROUX J. L. Professeur Limoges Examinateur
ALLAIS D. P. Maître de Conférences Limoges Examinateur
TROUILLAS P. Maître de Conférences Limoges Examinateur
 e tiens tout d'
abord à remercier Monsieur Jean-Claude Mialocq qui m'
a honoré en

acceptant d'
être président de ce jury et pour ses précieux conseils.

e remercie Madame Chantal Houée-Levin pour avoir accepté la charge d'

être

rapporteur de ma thèse, pour avoir jugé ce travail et pour ses conseils importants et pertinents
donnés à la suite de notre rencontre.

e remercie également Monsieur Aziz Chaouch d'

avoir accepté d'
être rapporteur de ma

thèse et d'
être présent ici aujourd'
hui, présence qui a nécessité un déplacement du Maroc.

e tiens à exprimer ma reconnaissance à mon directeur de thèse Monsieur le

Professeur Jean-Luc Duroux pour la confiance qu'

il m'
a témoigné et pour le temps qu'
il a
consacré pour diriger cette thèse.

e travail de thèse étant un travail d'

équipe, je remercie tout particulièrement Madame

Daovy-Paulette Allais et Monsieur Patrick Trouillas pour leur aide et pour avoir suivi de très
prés l'
évolution de ce travail. Merci à Patrick pour sa vision éclairée du secteur de la
modélisation moléculaire apportée à cette thèse.

'associe à mes remerciements Monsieur Yves Champavier et Madame Hayat Lotfi

pour leur précieuse collaboration.

erci à mon ancien voisin de bureau, Monsieur Claude-Alain Calliste, pour sa

gentillesse et sa disponibilité.

e tiens à remercier Monsieur Philipe Vignoles et Redouane ainsi que l'

ensemble des

membres du laboratoire de biophysique.

ADH Alcool Déshydrogénase
ALDH Aldéhyde Déshydrogénase
BDE Bond Dissociation Enthalpy
CAT Catalase
CLHP Chromatographie Liquide à Haute Performance
COSY Correlation Spectroscopy
DPPH 2,2-diphénylpicrylhydrasyl
GPX Gluthatiumperoxydase
GSH γ-glutamyl-cystéinyl-glycine
GSSH Gluthation-disulfure
HER 1-Hydroxyethyl radical
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
HMR 1-Hydroxymethyl radical
HOMO Highest Occupied Molecular Orbital
IC50 Concentration permettant d’inhiber 50% du signal de référence
LC-MS Chromatographie Liquide / Spectroscopie de Masse
NADPH Nicotinamide Adenine Dinucléotide Phosphate
RMN Résonance Magnétique Nucléaire
ROS Reactive Oxygen Species
RPE Résonance Paramagnétique Electronique
SOD Superoxyde dismutase
SOMO Singlet Occupied Molecular Orbital
XO Xanthine Oxydase
1. Reactivity of flavonoids with 1-hydroxyethyl radical: a γ-radiolysis study.
Abdelghafour MARFAK, Patrick TROUILLAS, Daovy-Paulette ALLAIS, Claude-Alain CALLISTE,
Jeanne COOK-MOREAU and Jean Luc DUROUX.
Biochimica et Biophysica Acta-General Subject- (2004), 1670, 28-39. (Facteur d’impact 2003 : 2,37)

2. Transformation mechanism of the antioxydant kaempferol into depsides. -Radiolysis study in

methanol and in ethanol.
Abdelghafour MARFAK, Patrick TROUILLAS, Daovy-Paulette ALLAIS, Claude-Alain CALLISTE,
Jeanne COOK-MOREAU and Jean Luc DUROUX.
Radiation Research (2003), 160 (3), 355-365. (Facteur d’impact 2003 : 2,47)

3. Redox reactions obtained by gamma irradiation of quercetin methanol solution are similar to
in vivo metabolism.
Abdelghafour MARFAK, Patrick TROUILLAS, Daovy-Paulette ALLAIS, Claude-Alain CALLISTE
and Jean Luc DUROUX.
Radiation Research (2003), 159 (2), 218-227. (Facteur d’impact 2003 : 2,47)

4. Radiolysis of kaempferol in water/methanol mixtures. Evaluation of antioxidant activity of

kaempferol and products formed.
Abdelghafour MARFAK, Patrick TROUILLAS, Daovy-Paulette ALLAIS, Yves CHAMPAVIER,
Claude-Alain CALLISTE and Jean Luc DUROUX.
Journal of Agricultural and Food Chemistry (2003), 51 (5), 1270-1277. (Facteur d’impact : 1,57)

5. Radiolysis of quercetin in methanol solution : observation of depside formation.

Abdelghafour MARFAK, Patrick TROUILLAS, Daovy-Paulette ALLAIS, Yves CHAMPAVIER,
Claude-Alain CALLISTE and Jean Luc DUROUX.
Journal of Agricultural and Food Chemistry (2002), 50 (17), 4827-4833. (Facteur d’impact : 1,57)

6. Antioxidant, anti-inflammatory and antiproliferative properties of sixteen water plant

extracts used in the Limousin countryside as herbal tea.
Patrick TROUILLAS, Claude-Alain CALLISTE, Daovy-Paulette ALLAIS, Alain SIMON,
Abdelghafour MARFAK, Christiane DELAGE and Jean Luc DUROUX.
Food Chemistry (2003), 80 (3), 399-407. (Facteur d’impact 2003 : 1,15)

7. A theoretical study of the conformational behavior and electronic structure of taxifolin

correlated with the free radical scavenging activity.
Patrick TROUILLAS, Catherine FAGNERE, Roberto LAZARONI, Claude-Alain CALLISTE,
Abdelghafour MARFAK and Jean Luc DUROUX.
Food Chemistry (2004), 88 , 571-582. (Facteur d’impact 2003 : 1,15)
INTRODUCTION 1

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE

CHAPITRE I

LES RADICAUX LIBRES OXYGENES ET FORMATION DES RADICAUX DERIVES

DES ALCOOLS

INTRODUCTION 5

I. DERIVES REACTIFS DE L’OXYGENE 6

I.1. FORMATION 6
I.1.1. Le radical superoxyde 6
I.1.2. Le peroxyde d’hydrogène 7
I.1.3. Le radical hydroxyle 7
I.1.4. Les radicaux peroxyles 8
I.1.5. Les hydroperoxydes organiques 8
I.1.6. Les radicaux alcoxyles 8
I.2. SYSTEMES DE DEFENSE CONTRE LES ROS : ANTIOXYDANTS ENDOGENES 9
I.2.1. La prévention à plein temps 9
I.2.2. La détoxication active suite à un stress oxydatif 10
a) La superoxyde dismutase 10
b) La catalase 10
c) Les glutathion peroxydases et réductases 10
I.2.2. La détoxication passive 11

II. STRESS OXYDANT ET MALADIES ALCOOLIQUES DU FOIE 12

II.1. ENZYMES DU METABOLISME DE L’ETHANOL 13

II.1.1. Alcool déshydrogénase 13
II.1.2. Aldéhyde déshydrogénase (ALDH) 13
II.1.3. Cytochrome P450E1 (CYP2E1) 14
II.2. MECANISMES RADICALAIRES INDUITS PAR L’ETHANOL DANS LE FOIE 14
II.1.1. Formation des espèces réactives de l’oxygène (ROS) 15
II.2.2. Formation du radical 1-hydroxyethyl dérivé de l’éthanol 16
a) Rôle de OH 16
b) Rôle de CYP2E1 17
c) Rôle de l’hydrogène peroxyde, du superoxyde et du fer 17
II.3. IMPLICATION DE HER DANS LES MALADIES DU FOIE LIEES A LA CONSOMMATION
D’ALCOOL 18
II.4. L’INTOXICATION AU METHANOL : FORMATION DU RADICAL 1-HYDROXYMETHYL
20
 CHAPITRE II :LES FLAVONOÏDES

INTRODUCTION 23

I. STRUCTURE CHIMIQUE ET CLASSIFICATION 24

I.1. FLAVONES ET FLAVONOLS 26
I.2. FLAVANONES ET DIHYDROFLAVONOLS 26
I.3. FLAVAN-3-OLS, FLAVAN-3,4-DIOLS ET ANTHOCYANIDOLS 26
I.4. CHALCONES ET AURONES 27

II. DISTRIBUTION ET LOCALISATION 28

III. PROPRIETES DES FLAVONOÏDES 29

III.1. LES FLAVONOÏDES COMME ANTIOXYDANTS 30

III.1.1. Inhibition enzymatique 30
III.1.2. Chélation des ions métalliques 33
III.1.3 Piégeage des radicaux libres 34
a) Comparaison de l’activité antioxydante des différents 3,5,7,3’,4’-pentahydroxyphénols
35
b) Importance de la structure ortho-diphénolique du cycle B 35
c) Le rôle du groupe 3-OH sur le cycle C et la double liaison C2-C3 37
d) L’effet de la glycosylation sur l’activité des flavones et flavanones 38
e) Anthocyanidols 38
III.2. ACTIVITES BIOLOGIQUES DES FLAVONOÏDES 40
III.2.1. Effets antiallergiques 40
III.2.2. Effets anti-inflammatoires 40
III.2.3. Effets anti-ulcéreux 41
III.2.4. Effets anticancéreux 41
III.2.5. D’autres effets biologiques 42

CHAPITRE III

LA TECHNIQUE DE L’IRRADIATION : APPLICATION A LA CONSERVATION

DES ALIMENTS

INTRODUCTION 43

I. CONSERVATION DES ALIMENTS PAR IRRADIATION 44

I.1. FACTEURS D’ALTERATION DES PRODUITS ALIMENTAIRES 44

I.1.1. Les altérations d’origines internes : actions enzymatiques 45
I.1.2. Les altérations d’origines externes 45
I.2. TRAITEMENT PAR IRRADIATION IONISANTE 47
I.2.1. Rayonnements ionisants 47
I.2.2. Rayonnements ionisants utilisés dans le traitement des aliments 49
I.2.3. Définition de la dose 51
a) Traitement à faibles doses : inhibition de le germination et désinsectisation 51
b) Traitement à doses moyennes 52
c) Traitement à fortes doses 53
I.3. APPLICATIONS DE L’IONISATION AUX FRUITS ET LEGUMES 54
I.3.1. Fruits 54
a) Fraises 54
b) Framboises 55
c) Pruneau 55
d) Pommes et poires 55
e) Mangue et papaye 55
I.3.2. Légumes 56
a) Pommes de terre 56
b) Ails, oignons et échalotes 56
c) Champignons 56
I.4. EFFET DE L’IRRADIATION SUR LES FLAVONOIDES PRESENTS DANS LES FRUITS 57
I.4.1. Fraises 57
I.4.2. Clémentine 59

CHAPITRE IV

RADIOLYSE DES SOLUTIONS

INTRODUCTION 61

I. LES ETAPES DE LA RADIOLYSE DES LIQUIDES 61

II. RADIOLYSE DE L’EAU 62

III. RADIOLYSE DU METHANOL 64

IV. RADIOLYSE DE L’ETHANOL 68

V. COURBE DE DILUTION 70

PARTIE EXPERIMENTALE

CHAPITRE V

MATERIELS ET METHODES

I. IRRADIATION 73

I.1. APPAREILLAGE 73
I.2. CHOIX DES CONCENTRATIONS 73
I.3. MODE OPERATOIRE 74

II. LES ANALYSES DES ECHANTILLONS IRRADIES 74

II.1. APPAREILLAGE 74
II.2. MODE OPERATOIRE 74
III. PURIFICATION DES ECHANTILLONS IRRADIES 75

IV. IDENTIFICATION DES PRODUITS RADIOLYTIQUES 75

IV.1. RMN 75
IV.2. LC-MS 76

V. MESURE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE 76

V.1. ACTIVITE ANTI-SUPEROXYDE ET CHIMILUMINESCENCE 77

V.1.1. Appareillage 77
V.1.2. Principe 77
V.1.3. Mode opératoire 79
V.1.4. Calcul du pourcentage d’inhibition 79
V.2. ACTIVITE ANTI-DPPH ET RESONANCE PARAMAGNETIQUE ELECTRONIQUE 80
V.2.1. Principe de la RPE 80
V.2.2.Le radical DPPH 82
V.2.3.Mode opératoire 83

VI. MESURE DE L’INHIBITION ENZYMATIQUE 84

VI.1. METHODE 84
VI.2. MODE OPERATOIRE 84

VII. MODELISATION MOLECULAIRE 85

VII.1. LES METHODES UTILISEES EN MODELISATION MOLECULAIRE 85

VII.1.1. La mécanique moléculaire 85
VII.1.2. La mécanique quantique 86
VII.2. CONFORMATION 87
VII.3. RAPPELS SUR LES PROPRIETES ELECTRONIQUES DES MOLECULES ET DES
RADICAUX 88

CHAPITRE VI

RADIOLYSE DES FLAVONOIDES DANS LE METHANOL ET L’ETHANOL

INTRODUCTION 91

I. RADIOLYSE DES FLAVONOIDES DANS LE METHANOL 91

I.1. RADIOLYSE DE LA QUERCETINE 91

I.1.1. Identification des produits radiolytiques de la quercétine 95
a) Spectres UV de QM1 et QM2 96
b) Spectres RMN de QM1 et QM2 97
c) Spectres de masse de QM1 et QM2 100
d) Confirmation de la connexion entre les cycles A et B de QM1 et de QM2 101
e) Equilibre chimique entre QM1 et QM2 103
f) Stabilité des produits de radiolyse au cours de l’irradiation 103
I.2. RADIOLYSE DES FLAVONOIDES DANS LE METHANOL : GENERALISATION 104
I.2.1. Identification des produits de radiolyse des flavonols 108
a) Spectres UV/Visible 108
b) Spectres RMN des produits de radiolyse 108
c) Confirmation par LC-MS 115

II. RADIOLYSE DES FLAVONOIDES DANS L’ETHANOL 118

II.1. SPECTRES UV/VISIBLE DES PRODUITS RADIOLYTIQUES 120

II.2. SPECTRES RMN DES PRODUITS RADIOLYTIQUES 120

III. MECANISME DE TRANSFORMATION DES FLAVONOLS EN DEPSIDES 126

III.1. RENDEMENT RADIOLYTIQUE ET COURBE DE DILUTION 126

III.2. CONFIRMATION DES PREMIERES ETAPES DU MECANISME DE TRANSFORMATION
DES FLAVONOLS EN DEPSIDES PAR MODELISATION MOLECULAIRE 135

IV. COMPARAISON AVEC LA DEGRADATION DES FLAVONOIDES PAR CERTAINES

ENZYMES 138

V. RELATION STRUCTURE-ACTIVITE DES FLAVONOIDES EN TANT QUE PIEGEURS

DES RADICAUX DERIVES D’ALCOOLS 140

V.1. CALCUL DES CONSTANTES DE VITESSE DE REACTION DES FLAVONOLS AVEC

HMR ET HER POUR LE PREMIER MECANISME 140
V.2. LA TRANSFORMATION FLAVONOLS-DEPSIDES : LE MECANISME CORRIGE
(CALCUL DES CONSTANTES DE VITESSE DE REACTION) 145
V.3. RELATION ENTRE CONSTANTES DE VITESSE DE REACTION ET ACTIVITE
ANTIOXYDANTE 156

CHAPITRE VII

RADIOLYSE DES FLAVONOIDES DANS DES MELANGES EAU/METHANOL :

APPLICATION AU TRAITEMENT DES ALIMENTS PAR IRRADIATION

INTRODUCTION 159

I. IRRADIATION DES FLAVONOIDES DANS DES MELANGES EAU/METHANOL 160

II. CONTRIBUTION DE L’EAU ET DE SES ESPECES RADIOLYTIQUES DANS LA

DEGRADATION DES FLAVONOLS 168

III. COMPARAISON AVEC LE TRAITEMENT DES FRAISES PAR IRRADIATION 172

IV. ACTIVITE ANTIOXYDANTE DES FLAVONOLS ET DE LEURS PRODUITS DE

RADIOLYSE 174

IV.1. ACTIVITE ANTI-SUPEROXYDE ET ANTI-DPPH 174

IV.2. INHIBITION DE LA XANTHINE OXYDASE 176
V. MODELISATION MOLECULAIRE ET DEPSIDES 178
V.1. CONFORMATION GEOMETRIQUE 178
V.2. DETERMINATION DE LA DISTRIBUTION HOMO 179
V.3. BDE 181

CONCLUSION ET PERSPECTIVES 183

REFERENCES 187
INTRODUCTION
 INTRODUCTION

L’ oxydo-réduction est le transfert d’ un ou plusieurs électrons d’ un atome vers un

autre. Un tel processus est nécessaire pour la vie en aérobie et pour notre organisme, puisque
l’ oxygène est l’ accepteur ultime d’ électrons au niveau de la chaîne respiratoire pour former de
l’ énergie sous forme d’ ATP. Cependant, dans le cas où il y a transfert d’ un nombre
d’ électrons impair, nous assistons à la formation d’ espèces toxiques ayant des électrons non
appariés (célibataires), appelées radicaux libres. Parmi ceux-ci, peuvent être cités les radicaux
-
peroxyles (ROO•), alcoxyles (RO•), superoxydes (O2• ) et hydroxyles (HO•). Ces radicaux
centrés sur l’ oxygène (appelés ainsi parce que l’ électron célibataire est porté par l’ atome
d’ oxygène) sont reconnus par leur grande réactivité et font partie des espèces oxygénées
réactives (ROS : Reactive Oxygen Species, selon la terminologie anglo-saxonne). Il a été
démontré que les ROS oxydent les lipides, les protéines, les enzymes et l’ ADN. Ces
dommages oxydatifs sont considérés comme la cause principale de nombreuses maladies
dégénératives telles que les maladies cardiovasculaires et le cancer (Gutteridge, 1993).

Les ROS ne sont pas les seuls radicaux formés au sein de notre organisme, puisque
l’ on a observé au niveau du foie, organe principal du métabolisme, la formation d’ espèces
réactives appartenant à la famille des radicaux centrés sur le carbone, notamment le radical 1-
hydroxyméthyl (•CH2OH ou HMR : Hydroxymethyl Radical) et le radical 1-hydroxyéthyl
(CH3•CHOH ou HER : Hydroxyethyl Radical) (Albano, 1987 ; Reinke, 1987 ; Nordmann,
1990 ; Kadiiska, 2000). Ceux-ci sont produits, après une administration importante ou
chronique d’ alcool, soit indirectement par une voie radicalaire résultant de l’ attaque de
l’ éthanol ou du méthanol par les radicaux hydroxyles, soit directement par une voie
enzymatique faisant intervenir le cytochrome P450 (CYP2E1). Il a été rapporté que ces
radicaux sont, en partie, responsables des maladies hépatiques d’ origine alcoolique.

Pour lutter contre les radicaux libres nocifs, notre organisme possède des systèmes de
défense antioxydants. Certains sont endogènes, alors que d’ autres sont obtenus à partir de
molécules apportées par l’ alimentation (exogènes). Le système endogène est formé par des
enzymes qui agissent en synergie, à savoir la glutathion peroxydase, la catalase et la
superoxyde dismutase (SOD). En effet, la SOD transforme le superoxyde en peroxyde

1
d’ hydrogène tandis que la catalase métabolise ce dernier en une molécule d’ eau et une autre
d’ oxygène.
A cause des agents externes comme les polluants de l’ air, les radiations UV et l’ alcool,
les radicaux libres peuvent être produits en excès. De ce fait, notre système endogène de
défense se trouve incapable de réduire toutes ces espèces réactives. Pour diminuer ces
dommages oxydatifs, notre organisme a alors besoin d’ une alimentation riche en antioxydants
exogènes. Parmi ces antioxydants, on trouve les vitamines C, E et A, ainsi que les
flavonoïdes.

Les flavonoïdes (Figure 1) constituent un groupe de produits naturels appartenant à la

famille des polyphénols. Dans certaines conditions, ils se transforment par des enzymes telle
que la quercétine 2,3-dioxygénase en depsides (Oka, 1972 ; Kooter, 2002) similaires à ceux
que nous avons identifiés dans notre travail (Figure 2). Structuralement parlant, les
flavonoïdes ont un squelette de base commun constitué de 15 atomes de carbone assemblés en
trois cycles nommés A, C et B. Selon la structure du cycle intermédiaire (cycle C), les
flavonoïdes se répartissent en plusieurs classes de molécules dont les plus importantes sont les
flavones, les flavonols, les flavanones, les dihydroflavonols, les flavan-3-ols et les flavan-3,4-
diols.
Les flavonoïdes sont largement représentés dans la quasi-totalité des plantes,
notamment dans les fruits et les légumes. Ils sont également présents dans le vin rouge et le
thé. Les céréales, les épices et les herbes aromatiques (persil, thym, céleri) sont considérés
aussi comme des sources importantes de flavonoïdes. Des études épidémiologiques ont
démontré qu’ une consommation régulière de fruits frais et de légumes diminue le risque de
développement des maladies cardiovasculaires et d’ apparition de certains cancers (Hertog,
1993). Ces effets sont attribués, en partie, aux concentrations relativement importantes des
flavonoïdes présents dans ces aliments.
Les flavonoïdes sont également reconnus pour leurs nombreuses activités biologiques,
citons par exemple les activités anti-allergiques, antivirales (Van Hoof, 1984) et anti-
inflammatoires (Brasseur, 1989). Ces activités sont en général attribuées à leur capacité à
piéger les radicaux libres, chélater les ions métalliques ou inhiber les enzymes responsables
de la formation des radicaux.

La réactivité des flavonoïdes avec les espèces réactives de l’ oxygène (hydroxyle et

superoxyde) a fait l’ objet de nombreuses études (Cotelle, 1996 ; Rice-Evans, 1996 ;

2
Jovanovic, 1994 ; Pietta, 2000 ; Cos, 1998). Cependant, à notre connaissance aucune étude
n’ a été consacrée à l’ établissement de la relation entre la structure chimique des flavonoïdes et
leur capacité à piéger les radicaux dérivés des alcools, notamment HER et HMR. Le travail
que nous présenterons ici est lié à cette problématique.

Les radicaux HER et HMR ont été produits par l’ irradiation de flavonoïdes en
solutions méthanoliques et éthanoliques. Un grand nombre de recherches dans le domaine de
la chimie sous rayonnement a porté sur l’ étude de la radiolyse du méthanol et de l’ éthanol
(Jin, 1996 ; Taub, 1962 ; Getoff, 1993). Lors de l’ irradiation, ces deux solvants se
transforment principalement en espèces radicalaires : HMR (à partir du méthanol), HER (à
-
partir de l’ éthanol), e s et H• (à partir des deux solvants). Ces espèces sont reconnues pour leur
grande réactivité vis-à-vis des solutés présents dans les milieux irradiés.
Le premier aspect de ce travail consistera principalement à étudier les transformations
chimiques induites sur les flavonoïdes au cours de la radiolyse, ce qui permettra de mieux
comprendre les mécanismes réactionnels entre ces molécules et les espèces radiolytiques
issues des alcools.

Par ailleurs, l’ irradiation γ est utilisée actuellement pour décontaminer les aliments en
ralentissant le développement des micro-organismes pathogènes et par conséquent en assurant
une plus longue conservation de ces nutriments. Elle peut remplacer les techniques classiques
de conservation telles que la stérilisation et la congélation. Elle détruit les bactéries et les
moisissures et inhibe la croissance des insectes nuisibles dans les fruits secs. Cependant,
l’ irradiation peut présenter des inconvénients en provoquant des modifications structurales
des groupes moléculaires constituant les aliments tels que les lipides, les glucides, les
vitamines et également les flavonoïdes.
Le deuxième aspect du travail que nous exposerons ici, nous permet d’ appréhender les
transformations chimiques que peuvent subir les flavonoïdes contenus dans les aliments
soumis à un traitement par irradiation.
Les flavonoïdes sont peu solubles dans l’ eau. Ceci nous a empêché de réaliser
directement leur radiolyse en solution aqueuse. C’ est pourquoi, en nous servant des résultats
obtenus lors de l’ irradiation de ces molécules en milieux alcooliques, nous avons entrepris
d’ étudier les effets de l’ introduction d’ eau dans le milieu d’ irradiation. Notre objectif est de
nous rapprocher le plus possible des conditions physico-chimiques existant réellement dans

3
les fruits et légumes lors d’ un traitement ionisant. On suppose en effet que dans les fruits et
les légumes, les flavonoïdes sont en milieu aqueux probablement acide. La modélisation in
vitro de ces conditions n’ est pas une tâche facile, cependant, nous avons testé différents
mélanges eau/alcool et nous discuterons de l’ effet remarquable de l’ eau sur la dégradation des
flavonoïdes.

L’ effet de l’ irradiation sur la qualité nutritionnelle des aliments a également retenu

notre attention. Pour cela, nous avons évalué l’ activité antioxydante des flavonoïdes et celle
de leurs produits de radiolyse en mesurant leur capacité à piéger les radicaux DPPH (2,2-
diphénylpicrylhydrasyl) et superoxyde et à inhiber la xanthine oxydase, enzyme responsable
de la formation de ce dernier.

4
 PARTIE
BIBLIOGRAPHIQUE
 CHAPITRE I

LES RADICAUX LIBRES OXYGENES ET FORMATION DES

RADICAUX DERIVES DES ALCOOLS
 LES RADICAUX LIBRES OXYGENES ET FORMATION DES
RADICAUX DERIVES DES ALCOOLS

Un radical libre est une espèce, atome ou molécule, contenant un électron non apparié.
Ce déséquilibre n’ est que transitoire et il est comblé soit par l’ acceptation d’ un autre électron
soit par le transfert de cet électron libre sur une autre molécule. Ces espèces radicalaires très
instables et très réactives sont produites d’ une manière continue au sein de notre organisme,
dans le cadre de nombreux phénomènes biologiques.

Par exemple, lors de la respiration cellulaire, l’ oxygène moléculaire se transforme en

diverses substances oxygénées, communément appelées radicaux libres de l’ oxygène ou
espèces réactives oxygénées (Reactive Oxygen Species : ROS). Dans certaines situations,
cette production augmente fortement, entraînant un stress oxydatif que l’ on définit comme un
déséquilibre entre la production et la destruction de ces espèces. En raison de leur capacité à
endommager les cellules, les tissus et les organes, les espèces réactives de l’ oxygène sont
impliquées dans un grand nombre de pathologies, tant aiguës que chroniques (Gutteridge,
1993).

Par ailleurs, au niveau du foie, organe principal du métabolisme, l’ administration

d’ alcool est susceptible d’ entraîner des maladies hépatiques. Quoique les mécanismes
impliqués dans le développement de celles-ci demeurent encore une énigme, des dérivés
réactifs de l’ éthanol détectés in vivo et in vitro après administration d’ alcool seraient l’ une des
causes du déclenchement de ces maladies.

Une première partie de ce chapitre est consacrée à la présentation générale de

différentes formes de radicaux libres de l’ oxygène, au mécanisme de leur formation et à leur
élimination par l’ organisme.

La deuxième partie, portera sur la description du métabolisme de l’ alcool entraînant la

formation de radicaux réactifs tels que :

5
 Le radical 1-hydroxyéthyl (Hydroxyethyl Radical : HER ou CH3•CHOH) issu de la
métabolisation de l’ éthanol.
Le radical 1-hydroxyméthyl (Hydroxymethyl Radical : HMR ou •CH2OH) issu de la
métabolisation du méthanol.
Nous verrons également leur implication dans les maladies hépatiques.

L’ appellation ROS n’ est pas restrictive (Gutteridge, 1993). Elle inclut les radicaux
-
libres de l’ oxygène : radical superoxyde (O2• ), radical hydroxyle (•OH), monoxyde d’ azote

(NO•), et aussi certains dérivés oxygénés réactifs non radicalaires dont la toxicité est
-
importante tels que le peroxyde d’ hydrogène (H2O2) et le peroxynitrite (ONOO ).

I.1. FORMATION

I.1.1. LE RADICAL SUPEROXYDE

-
L’ une des sources physiologiques majeures de radicaux superoxydes (O2• ) est la
chaîne respiratoire mitochondriale. Cette production résulte de l’ addition d’ un électron à
l’ oxygène moléculaire. Une telle réaction est catalysée par le cytochrome oxydase
mitochondrial :

Cytochrome oxydase
- -
O2 + e O2• (1)

Le radical superoxyde peut également se former lors de la phagocytose grâce à la

NADPH oxydase présente dans la membrane plasmique des phagocytes :

NADPH oxydase
-
2O2 + NADPH 2O2• + NADP+ + H+ (2)

Le système enzymatique xanthine / xanthine oxydase est également considéré comme

une source biologique importante de radicaux superoxyde. En effet, en présence d’ oxygène la
xanthine oxydase catalyse l’ oxydation de la xanthine en acide urique. Dans cette réaction,

6
l’ oxygène moléculaire agit comme un accepteur d’ électron produisant ainsi le radical
superoxyde :

Xanthine oxydase
-
Xanthine + 2O2 + H2O Acide urique + 2O2• + 2H+ (3)

Le radical superoxyde est peu réactif, mais représente un précurseur d’ espèces plus
agressives. Avec l’ apport d’ un autre électron, il devient un ion peroxyde (O22-), qui, à son
tour, avec l’ ajout de deux ions hydrogène (2 H+), produit le peroxyde d’ hydrogène (H2O2).

I.1.2. LE PEROXYDE D’ HYDROGENE

Il se forme par dismutation du radical superoxyde, catalysée par la superoxyde

dismutase (SOD) :

- SOD -
2O2• + 2 H+ H2O2• + O2+ (4)

L’ absence de charge à sa surface rend ce ROS très lipophile et peu réactif en milieu
aqueux. Le peroxyde d’ hydrogène peut néanmoins être considéré comme un dérivé réactif de
l’ oxygène potentiellement toxique car sa faible réactivité, associée à sa capacité à traverser les
membranes biologiques, fait qu’ il peut se retrouver à une grande distance de son lieu de
synthèse. Il peut alors participer à la biosynthèse du radical hydroxyle.

I.1.3. LE RADICAL HYDROXYLE

Il est formé par la dégradation du peroxyde d’ hydrogène en présence de métaux de

transition sous leur forme réduite. Ainsi, le peroxyde d’ hydrogène associé à du fer ferreux
conduit à la réaction de Fenton :

• - • -
H2O2 + Fe2+ OH + OH2 + Fe3+ (5)

Le peroxyde d’ hydrogène peut également réagir avec le radical superoxyde

aboutissant, là encore, à la production du radical hydroxyle. Ce mécanisme réactionnel se
nomme la réaction d’ Haber-Weiss :

7
 • - -
H2O2 + O2• •
OH + OH + O2 (6)

Cette réaction très lente ne se produit qu’ en présence de métaux.

En dehors des réactions biochimiques aboutissant au radical hydroxyle, celui-ci peut

être aussi obtenu directement à partir d’ eau ou de milieux aqueux soumis aux rayonnements
ionisants (voir chapitre III).

Avec une demi-vie de l’ ordre de la nanoseconde, le radical hydroxyle est le plus

instable et le plus réactif de toutes les espèces dérivées de l’ oxygène. Il réagit avec de
nombreuses espèces moléculaires se trouvant dans son voisinage (protéines, lipides, ADN…)
entraînant ainsi de multiples dommages. Il apparaît comme l’ espèce réactive ayant une
responsabilité majeure dans la cytotoxicité des radicaux libres (Gutteridge, 1993).

I.1.4. LES RADICAUX PEROXYLES

Les radicaux peroxyles (ROO•) se forment par l'

addition d'
oxygène moléculaire sur
des radicaux libres carbonés. Ils sont peu réactifs, mais sont capables de diffuser à travers les
membranes biologiques.

I.1.5. LES HYDROPEROXYDES ORGANIQUES

Les hydroperoxydes organiques (ROOH) sont les formes hydrogénées des radicaux
peroxyles. Ils sont réactifs et se redécomposent en radicaux peroxyles ou en radicaux
alcoxyles.

I.1.6. LES RADICAUX ALCOXYLES

Les radicaux alcoxyles (RO•) se produisent lors de la dégradation des peroxydes

organiques. Ils sont très réactifs.

8
I.2. SYSTEMES DE DEFENSE CONTRE LES ROS : ANTIOXYDANTS
ENDOGENES

Comme nous venons de le voir, les radicaux libres se produisent spontanément et

d’ une manière continue au sein de notre organisme. Cependant, ils sont rigoureusement
contrôlés par des antioxydants dits endogènes. Lorsque ce précaire équilibre est rompu soit
par une augmentation du nombre de radicaux libres, soit par une baisse de l'
activité
antioxydante, il survient un stress oxydatif. Ce dernier peut occasionner plusieurs types de
dommages aux cellules entraînant ainsi une perte de fonction et d'
intégrité, voire la mort
cellulaire.
Afin de contrer l'
action oxydante des radicaux libres, notre organisme possède une
« armée » d'
antioxydants de nature protéique, enzymatique et d'
agents oxydables. Ces
antioxydants interviennent en trois temps, constituant ainsi trois lignes de défense : la
prévention à plein temps, la détoxification active suite à un stress oxydatif, et la détoxification
passive.

I.2.1. LA PREVENTION A PLEIN TEMPS

Cette première ligne de défense prévient la surproduction de radicaux libres de

l'
oxygène en inactivant les molécules endogènes telles que le fer divalent et le cuivre
monovalent. Elle comprend des enzymes ferroxydases et des protéines chélatrices du fer
(transferrine, hémosidérine) et du cuivre (albumine, céruloplasmine).
La ferroxydase : c’ est une enzyme qui permet la transformation de l'
ion ferreux
(Fe2+) en ion ferrique (Fe3+). Cette activité oxydante favorise la capture du fer par la ferritine
et limite ainsi la quantité de ce métal qui pourrait s'
auto-oxyder et former alors des espèces
réactives de l'
oxygène dans les vaisseaux sanguins.
La transferrine : c’ est une glycoprotéine plasmatique capable de piéger jusqu’ à deux
atomes de fer ferrique. Celui-ci devient incapable d’ intervenir dans des mécanismes
d'
oxydoréductions générateurs de radicaux libres.
L'
albumine : c’ est une protéine plasmatique qui joue le même rôle que la
transferrine mais en captant l'
ion cuivreux.

9
 I.2.2. LA DETOXICATION ACTIVE SUITE A UN STRESS OXYDATIF

Cette ligne de défense est constituée principalement de trois enzymes. Il s'

agit de la
superoxyde dismutase (SOD), de la catalase et de la glutathion peroxydase (GPx).
Ces enzymes ont une action complémentaire sur la cascade radicalaire au niveau du
superoxyde et du peroxyde d’ hydrogène, conduisant finalement à la formation d’ eau et
d’ oxygène moléculaire.

a) La superoxyde dismutase

Comme l'
indique son nom, la superoxyde dismutase (SOD), qui existe sous différentes
formes, est une enzyme qui accélère la dismutation de l'
anion superoxyde en peroxyde
d'
hydrogène selon la réaction suivante :

- SOD -
2O2• + 2 H+ H2O2• + O2+ (7)

Il existe trois types de SOD : SOD ferreux (Fe-SOD), SOD à cuivre (Cu-SOD) et SOD
à manganèse (Fe-SOD).

b) La catalase

Cette enzyme est contenue dans les peroxysomes qui vivent en aérobie (présence
d’ oxygène). Elle existe en forte concentration dans le foie et les globules rouges. Au niveau
sub-cellulaire, la catalase se retrouve dans le cytosol et dans les peroxysomes.
Elle agit en synergie avec la SOD puisque son rôle est d'
accélérer la dismutation du
peroxyde d'
hydrogène en eau et en oxygène moléculaire selon la réaction suivante :

2H2O2 Catalase 2H2O + O2+ (8)

c) Les glutathion peroxydases et réductases

Ces deux enzymes sont localisées dans le cytosol et dans les mitochondries. Le rôle de
la glutathion peroxydase (GPx) est de réduire d’ une part le peroxyde d'
hydrogène en molécule
d’ eau, et d’ autre part les hydroperoxydes organiques (ROOH) en alcools. Lors de cette

10
réaction, qui demande l’ intervention de deux molécules de glutathion (GSH), celles-ci se
transforment en glutathion-disulfure (GSSG) :

H2O2 + 2GSH 2H2O + GSSG + (9)

GPx
ROOH + 2GSH ROH + H2O + GSSG + (10)

La glutathion réductase (GR), quant à elle, a pour rôle de régénérer le GSH à partir du
GSSG. Au cours de cette réaction, la glutathion réductase utilise un cofacteur, le NADPH :

GR
GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP++ (11)

Cette réaction produit du NADP+ qui sera régénéré en NADPH pour une utilisation
ultérieure, par une autre enzyme, le G6PD (glucose-6-phosphate-déhydrogénase) :

G6PD
NADP+ NADPH (12)

Au total, le mécanisme réactionnel invoqué dans la détoxication active peut être

résumé dans le schéma suivant :

- SOD CAT
e -
O2 O2 • H2 O2 H2 O + ½ O2
GSH NADP+

GPx GR G6PD

H 2O GSSG NADPH

I.2.3. LA DETOXICATION PASSIVE

Cette troisième ligne de défense permet la réduction des radicaux libres qui ont pu
« survivre » aux deux autres lignes de défense. Sont regroupées dans cette catégorie des
molécules antioxydantes telles que l'
alpha-tocophérol (vitamine E), le bêta-carotène et l'
acide
L-ascorbique

11
 L’ activité antioxydante de la vitamine E et du bêta-carotène comprend
l’ hydrogénation des radicaux peroxyles (ROO•) et alcoxyles (RO•) des acides gras
membranaires permettant ainsi la terminaison du mécanisme de peroxydation des lipides.
L’ acide L-ascorbique est le principal antioxydant de la troisième ligne de défense. En
effet, il peut capter à la fois les radicaux hydroxyles, superoxydes et peroxyles.

Au niveau du foie, organe principal du métabolisme, l’ éthanol est susceptible

d’ entraîner diverses lésions telles que la nécrose et l’ hépatite alcoolique aiguë (Badger, 2003).
Les mécanismes impliqués dans le développement des maladies hépatiques chroniques
d’ origine alcoolique demeurent encore une énigme. Néanmoins, la fréquence de ces maladies
est liée à la dose et à la durée de l’ alcoolisation.

La majeure partie de l’ éthanol est oxydée au niveau de l’ hépatocyte. Le mécanisme

fait intervenir deux oxydations, la première transformant l’ alcool en radical hydroxyéthyl
(HER) et acétaldéhyde, la seconde transformant l’ acétaldéhyde en acétate.
L’ oxydation de l’ éthanol en acétaldéhyde se fait selon deux voies enzymatiques,
chacune située dans un compartiment cellulaire différent :
La voie de l’ alcool déshydrogénase (ADH), qui est cytosolique.
La voie du système microsomal d’ oxydation de l’ éthanol (MEOS : microsomal
ethanol oxidation system), qui fait intervenir le cytochrome P4502E1 (CYP2E1) et qui est
localisé dans le réticulum endoplasmique.
L’ acétaldéhyde est ensuite oxydé en acétate par l’ aldéhyde déshydrogénase (ALDH),
dont la localisation est cytosolique et mitochondriale.

Une grande partie de l’ éthanol peut également être oxydée en HER :

Soit directement en impliquant le CYP2E1.
Soit indirectement par voie radicalaire, résultant de l’ attaque de l’ éthanol par des
radicaux hydroxyles générés par la réaction de Fenton :
• -
H2O2 + Fe2+ OH + OH + Fe3+ (13)
•
OH + CH3CH2OH CH3•CHOH + H2O (14)

12
II.1. ENZYMES DU METABOLISME DE L’ETHANOL

II.1.1. ALCOOL DESHYDROGENASE

L’ alcool déshydrogénase (ADH) est une enzyme cytosolique utilisant le NAD+ comme
cofacteur. Du fait de son abondance dans le foie, l’ ADH joue un rôle très important dans le
métabolisme de l’ alcool. En effet, elle catalyse l'
oxydation de l'
éthanol en acétaldéhyde en
réduisant simultanément le coenzyme NAD+ en NADH :

ADH
+
CH3CH2OH + NAD CH3CHO + NADH + H+ (15)

L'
enzyme n'
a pas d'
affinité pour l'
alcool si elle n'
est pas préalablement associée au
coenzyme NAD+ en un premier complexe ; puis le complexe ternaire Enzyme-NAD+-Ethanol
se transforme en un complexe Enzyme-NADH-Acétaldéhyde ; ce dernier complexe se
dissocie en libérant l'
acétaldéhyde puis le NAD réduit.

L'
acétaldéhyde, métabolite intermédiaire obligatoire dans le métabolisme oxydatif de
l’ éthanol, est une substance électrophile très réactive. Elle est capable de former des adduits
avec les molécules environnantes telles que les protéines et les acides nucléiques, ce qui peut
aboutir à des nécroses cellulaires. Les adduits acétaldéhyde-protéine ont été retrouvés aussi
bien au niveau du foie que du cerveau (Rintala, 2000). L’ acétaldéhyde est par ailleurs
particulièrement toxique pour la mitochondrie : il favorise la mort cellulaire en diminuant la
quantité du glutathion réduit, en augmentant la peroxydation lipidique et les effets toxiques
des radicaux libres.

II.1.2. ALDEHYDE DESHYDROGENASE (ALDH)

Ces enzymes sont très abondantes dans le cytoplasme et les mitochondries de

nombreuses cellules : foie, rein, cerveau, globules rouges. Elles catalysent la dégradation de
l’ acétaldéhyde en acétate en utilisant le NAD+ comme cofacteur (Borson, 1986) :

ALDH
CH3CHO + NAD+ + H2O CH3COOH + NADH + H+ (16)

13
 II.1.3. CYTOCHROME P450E1 (CYP2E1)

CYP2E1 est une enzyme de la superfamille des cytochromes P450 qui utilisent le
NADPH et l’ oxygène comme cofacteurs. Ces enzymes sont localisées principalement dans le
réticulum endoplasmique. Le CYP2E1 est exprimé en grande quantité au niveau de
l’ hépatocyte, et en quantité 10 à 100 fois plus faibles dans les cellules de Kuppfer (Koivisto,
1996). Il est situé aussi dans les tissus extrahépatiques (poumons, œsophage, intestin, cerveau)
(Lieber, 1999).

Le CYP2E1 catalyse de façon spécifique le métabolisme de nombreuses molécules.

Parmi celles-ci, certaines sont des substrats endogènes (acétone, acides gras), d’ autres
proviennent de l’ alimentation (éthanol, nitrosamine), d’ autres sont des médicaments
(anesthésique, paracétamol) ou des solvants organiques industriels (benzène, styrène).

Le CYP2E1 catalyse l’ oxydation de l’ éthanol en acétaldéhyde selon la réaction

(Lieber, 1999):

CYP2E1
CH3CH2OH + NADP+ CH3CHO + NADPH + H+ (17)

Le CYP2E1 possède aussi la capacité d’ oxyder l’ acétaldéhyde en acétate (Bell-Parikh,

1999). Il a été rapporté également que des radicaux libres sont formés au cours du
métabolisme de l’ éthanol par le CYP2E1 (Eckstöm, 1989), notamment des radicaux
hydroxyles et 1-hydroxyéthyles (HER).

A la différence de la voie de l’ ADH, la voie microsomale du CYP2E1 est inductible

par l’ alcool. Cette induction est observée soit à la suite de l’ administration d’ une seule dose
forte d’ éthanol (Peterson, 1982), soit au cours d’ un alcoolisme chronique (Roberts, 1994).

II.2. MECANISMES RADICALAIRES INDUITS PAR L’ETHANOL DANS LE FOIE

L’ un des aspects de la toxicité de l’ alcool qui a suscité récemment un grand intérêt est
la contribution de radicaux libres provenant de son métabolisme dans certaines pathologies.
De nombreuses études expérimentales ont démontré que l’ administration aiguë ou chronique
d’ alcool à des animaux augmente d’ une part la peroxydation des lipides, et d’ autre part,

14
diminue le taux d’ antioxydants dans les tissus (Nordmann, 1992). Des études cliniques
supportent ces observations montrant que, chez des patients atteints de maladies du foie liées
à l’ alcool, le taux des marqueurs du stress oxydatif est très élevé tandis que celui des
antioxydants est faible (Nordmann, 1992 ; Lecomte, 1994).
La destruction des systèmes antioxydants de défense cellulaire, accompagnée de la
formation de radicaux oxygénés, pourrait causer des dommages oxydatifs associés à des
maladies du foie chez les alcooliques. Ces mêmes effets peuvent être causés également par
d’ autres radicaux libres, qui ne dérivent pas de l’ oxygène.

II.2.1 FORMATION DES ESPECES REACTIVES DE L’ OXYGENE (ROS)

L’ administration d’ éthanol à des rats a montré une augmentation de la production des

espèces réactives de l’ oxygène telles que le radical superoxyde, le peroxyde d’ hydrogène et le
radical hydroxyle (Boveris, 1983 ; Thurman, 1973 ; Klein, 1983). Ces radicaux peuvent être
générés selon deux voies : par le NADPH cytochrome P450 réductase (une flavoenzyme) ou
par le cytochrome P450 qui peuvent produire le radical superoxyde, qui à son tour, permet la
formation du radical hydroxyle via une réaction d’ Haber-Weiss (réaction 6). Une
augmentation de l’ activité de la réductase a été observée chez des rats nourris avec de
l’ éthanol (Joly, 1973 ; Ekström, 1986). Cependant, cette variation est apparue faible comparée
à celle observée sur le cytochrome P450. Dans les microsomes des rats traités préalablement
par l’ éthanol, la formation de la plupart des radicaux dérivés de l’ oxygène implique
l’ intervention du cytochrome P450. Une forme unique de cette enzyme a été isolée à partir
des microsomes du foie humain (Lasker, 1987). Il a été montré que cette isoenzyme
(CYP2E1) peut être induite par l’ éthanol (Koop, 1982 ; Ingelman-Sundberg, 1984) mais
également par l’ acétone (Patten, 1986 ; Johansson, 1986). On a aussi observé une corrélation
-
entre la production de O2• et de H2O2 et la quantité de CYP2E1 (Ekström, 1989). Ceci
indique le rôle important de cette isoenzyme dans la génération des espèces réactives de
l’ oxygène au niveau des microsomes des rats nourris par l’ éthanol.

15
 II.2.2. FORMATION DU RADICAL 1-HYDROXYETHYL DERIVE DE L’ ETHANOL

a) Rôle de •OH

En 1987, deux études indépendantes utilisant la Résonance Paramagnétique

Electronique (RPE) ont montré que des microsomes de foie murin incubés en présence d’ un
spin-trap, d’ éthanol et de NADPH produisent une espèce radicalaire identifiée comme étant le
HER (Albano, 1987 ; Reinke, 1987). De plus, il a été constaté que la formation de HER
augmente avec la concentration d’ éthanol et que cette production est très élevée chez les rats
nourris avec de l’ éthanol par rapport aux rats non traités. Les radicaux hydroxyles générés
dans la réaction de Fenton, pourraient oxyder l’ éthanol en HER (Cederbaum, 1977 ;
Ingelman-Sundberg, 1984). En effet, il y a arrachement, par le radical hydroxyle, d’ un atome
d’ hydrogène à partir du carbone 1 de la molécule d’ éthanol permettant la formation de HER :

H 2 O 2 + Fe 2+ → • OH + - OH + Fe 3+ (18)

CH 3 CH 2 OH + • OH → CH 3 • CHOH + H 2 O (19)

Par ailleurs, Cederbaum et Dicker ont montré qu’ en présence de chélateurs de fer et de
piégeurs de •OH, l’ éthanol peut être aussi oxydé par les microsomes du foie via une réaction
catalysée par le cytochrome P450 (Cederbaum, 1983). Ekström et ses collaborateurs ont
démontré qu’ en présence de chélateur de fer, la forme isoenzymatique du cytochrome P450
induite par l’ éthanol (CYP2E1) possède une grande spécificité pour l’ oxydation de l’ éthanol
mais pas pour la production de •OH (Ekström, 1986). Une autre voie suggérée par Ingelman-
Sundberg et Johanson est l’ intervention des radicaux •OH produits au niveau du site actif de
l’ enzyme et qui ne seraient pas accessibles à leurs piégeurs (Ingelman-Sundberg, 1984).
Nous constatons qu’ au moins deux mécanismes sont invoqués dans la génération de
HER à partir de l’ éthanol. Le premier implique la participation des radicaux •OH formés par
la réaction de Fenton, tandis que le deuxième est indépendant de •OH et fait intervenir le
cytochrome CYP2E1.

16
 b) Rôle de CYP2E1

Dans les microsomes du foie, la formation de HER exige la présence de NADPH et

des enzymes monoxygénase fonctionnelles et actives. La présence du cytochrome P450
apparaît essentielle puisque HER ne peut être généré par les systèmes monoxygénases
reconstitués incubés en présence de NADPH, que si le cytochrome P450 réductase et le
cytochrome P450 sont toutes les deux présents (Albano, 1991). Le rôle de CYP2E1 dans la
formation de HER est confirmé par le fait que la présence des anticorps anti-CYP2E1 ou des
inhibiteurs de cette isoenzyme tels que le p-nitrophenol et diéthyldithiocarbammate, réduisent
la formation de HER d’ environ 60% (Albano, 1991 ; Albano, 1994).

c) Rôle du peroxyde d’ hydrogène, du superoxyde et du fer

Le signal RPE détecté après incubation, dans un tampon phosphate ou Tris, de

microsomes en présence d’ éthanol, de NADPH et du POBN (spin-trap), est identifié comme
étant le signal caractéristique de HER (Reinke, 1997). En effet, durant le métabolisme aérobie
et en présence de NADPH, les microsomes produisent continuellement le superoxyde et le
peroxyde d’ hydrogène. Ces espèces réactives de l’ oxygène peuvent, par conséquent, interagir
avec le fer et produire •OH puis HER. Afin de confirmer ces interactions, les auteurs ont
rajouté au milieu réactionnel de la catalase (inhibiteur de H2O2), de la superoxyde dismutase
-
(SOD, piégeur de O2• ), de la deferoxamine (DFO, chélateur du fer), et de l’ azoture (inhibe la
dégradation de H2O2 par la catalase). Ils ont observé que le signal de HER a largement
augmenté en présence de l’ azoture, tandis que la catalase a montré un effet négatif. Ceci
indique que le peroxyde d’ hydrogène joue un rôle important dans la production de HER.
-
L’ intervention de O2• et du fer est aussi importante puisque la SOD et DFO inhibent la
formation de HER comme le montre la diminution de son signal RPE.

Par ailleurs, l’ implication des ROS dans la production de HER est en accord avec le
rôle joué par CYP2E1, puisque cette isoenzyme a une grande activité de NADPH oxydase
-
dans la génération de O2• et H2O2 (Albano, 1991 ; Gorsky, 1984 ; Ekstöm, 1986). Ces ROS

peuvent réagir avec le fer et produisent des espèces (comme par exemple, •OH formé dans la
réaction de Fenton) ayant le pouvoir d’ arracher un atome d’ hydrogène de la molécule

17
d’ éthanol aboutissant ainsi à la formation de HER. Cependant, ce mécanisme ne peut pas
expliquer les observations suivantes :
(i) durant le métabolisme de l’ éthanol, 1-propanol et 1-butanol, le signal RPE de
l’ adduit spin trap-radical formé à partir de chaque alcool, augmente en fonction d’ une part de
la taille de la chaîne carbonée (Albano, 1991), et d’ autre part de la concentration de CYP2E1
(Morgan, 1982).
(ii) en l’ absence du fer, CYP2E1 montre une grande spécificité pour l’ oxydation de
l’ éthanol et non pas pour la production de •OH (Ekström, 1989).
Ces observations suggèrent la possibilité qu’ au moins une partie, des radicaux HER
produits par les microsomes du foie, est formée après l’ interaction de l’ éthanol avec une
espèce oxydante liée au CYP2E1. Albano et ses collaborateurs ont suggéré que HER peut se
former aussi durant l’ oxydation de l’ éthanol, catalysée par CYP2E1, en acétaldéhyde, et que
le complexe CYP2E1-Fe3+-O2 pourrait être responsable de l’ oxydation de l’ éthanol suivant la
réaction (Albano, 1999) :

CYP2E1-Fe3+-O2 + 2CH3CH2OH 2CH3•CHOH + H2O2 + CYP2E1-Fe3+ (20)

II.3. IMPLICATION DE HER DANS LES MALADIES DU FOIE LIEES A

L’ADMINISTRATION D’ALCOOL

Comme nous l’ avons vu, la SOD est considérée comme la première ligne de défense
contre les effets toxiques des radicaux libres de l’ oxygène en catalysant la dismutation du
radical superoxyde en peroxyde d’ hydrogène et en oxygène. L’ administration chronique ou
aiguë d’ éthanol entraîne une diminution de l’ activité de la SOD dans plusieurs tissus murins
tels que le foie (Ribière, 1985) et le cerveau (Ledig, 1981).

Récemment, Santiard et ses collaborateurs ont démontré que HER est capable de
réagir avec Cu, Zn-SOD conduisant à l’ inactivation de l’ enzyme (Santiard, 1995). Celle-ci
n’ est pas la seule protéine cible pour HER, puisque ces radicaux peuvent aussi inactiver la
(Na+, K+)-ATPase dans les membranes synaptiques (Olfield, 1991) et participent à
l’ alkylation des protéines microsomales (Albano, 1993).
L’ administration d’ éthanol a également comme conséquence de réduire les taux d’ α-
tocophérol (Bjorneboe, 1987) et de glutathion (Vina, 1980 ; Strubelt, 1987) dans le foie. Une

18
étude menée par Stoyanovsky et ses collaborateurs a montré que cet effet indésirable est lié à
la réactivité de HER sur ces antioxydants cellulaires ainsi que sur l’ acide ascorbique
(Stoyanovsky, 1998). En administrant l’ éthanol et un spin-trap (PBN) à des rats, le spin adduit
PBN/HER a été détecté par RPE. En présence de glutathion (GSH), on a enregistré une
diminution de ce signal RPE, indiquant l’ inhibition de HER par GSH. En rajoutant la
glutathion peroxydase, on a observé une diminution de la capacité de GSH à piéger HER.
Ceci est du au fait que GSH est oxydé en glutathion di-sulfure (GSSG) selon la réaction (9)
précédemment décrite.

L’ inactivation de la catalase et la glutathion peroxydase par HER a été également

démontrée (Puntarulo, 1999). L’ inhibition de la première enzyme peut augmenter la
production du radical hydroxyle et par conséquent, diminuer les réserves d’ antioxydants dans
les cellules (Puntarulo, 1999).
La possibilité de ces antioxydants cellulaires à interagir avec HER pourrait jouer un
rôle dans les effets néfastes de l’ éthanol et contribuer alors à un stress oxydatif au niveau du
foie. Il a d’ ailleurs été constaté que le taux d’ α-tocophérol est faible chez des patients
alcooliques souffrant de maladies hépatiques (Bjorneboe, 1987).

En conclusion, HER peut contribuer aux mécanismes responsables de l’ hépatotoxicité

de l’ éthanol via :
(i) La formation des adduits HER/protéine (Sakurai, 2000 ; Nordmann, 1990).
(ii) Un stress oxydatif en détruisant l’ équilibre oxydant/antioxydant cellulaire
(Moncada, 1994).
(iii) L’ interaction avec les antioxydants cellulaires (glutathion, α-tocophérol, acide
L-ascorbique) (Stoyanovsky, 1998).
(iv) L’ inactivation des enzymes de défense cellulaires (glutathion réductase,
glutathion peroxydase, catalase, SOD) (Santiard, 1995 ; Puntarulo, 1999).

19
II.4. L’INTOXICATION AU METHANOL : FORMATION DU RADICAL 1-
HYDROXYMETHYL

Le méthanol est un alcool très présent dans notre environnement. En tant que solvant,
il est un des composants de nombreux produits destinés au lavage et dégraissage. Il est
également présent dans les diluants pour peintures et vernis. L’ exposition humaine au
méthanol par voie orale ne se produit généralement qu’ accidentellement. Le méthanol n’ est
que peu toxique par lui-même, mais après ingestion il est métabolisé en produits toxiques
(Jacobsen, 1986). La majeure partie du méthanol absorbé (90 à 95%) subit le métabolisme
hépatique selon un schéma similaire à celui détaillé pour l’ éthanol : l’ ADH oxyde le méthanol
en formaldéhyde, lui-même rapidement transformé en acide formique par l’ ALDH, pour
aboutir à la production de CO2 et H2O. Ces voies métaboliques mettent à contribution
respectivement le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et le glutathion. L’ accumulation
d’ acide formique semble être le principal responsable de l’ acidose métabolique observée chez
des sujets intoxiqués par le méthanol (Jacobsen, 1986; Liesivuori, 1991; McMartin, 1980).

Afin d’ éliminer l’ intoxication au méthanol, deux traitements ont été recommandés. Le

premier est l’ hémodialyse qui permet l’ extraction du méthanol de l’ organisme ainsi que celle
des métabolites toxiques déjà formés (Jacobsen, 1986; Gonda, 1978). Le deuxième traitement
nécessite l’ administration d’ antidotes tels que l’ éthanol et le 4-méthyl pyrazole (Blomstrand,
1979). Ce sont des inhibiteurs de l’ ADH, qui bloquent ainsi le métabolisme du méthanol, et
donc, empêchent la formation des métabolites toxiques.

Comme nous l’ avons évoqué dans le paragraphe précédent, la métabolisation de

l’ éthanol fait l’ objet d’ un grand intérêt pour de nombreux groupes de recherches. Il est à noter
que des radicaux intermédiaires analogues à HER sont produits durant l’ oxydation
microsomale de plusieurs alcools aliphatiques tels que le propanol, le butanol et le pentanol
indiquant, la présence d’ un mécanisme métabolique commun pour la formation des radicaux
centrés sur le carbone à partir des alcools (Albano, 1987 ; Albano, 1991 ; Albano, 1994).

Récemment, en administrant à des rats le méthanol et un spin-trap, α-(4-pyridyl-1-

oxide)-N-tert-butylnitrone (POBN), Kadiiska et Masson ont démontré, et pour la première
fois, que cette intoxication aiguë au méthanol génère chez ces sujets un radical identifié par
RPE comme étant le radical HMR (Kadiiska, 2000). Le spin adduit POBN/HMR a été détecté

20
dans la bile et l’ urine 2 h après l’ injection du méthanol. On a observé qu’ un traitement
simultané par du méthanol et du 4-méthyl pyrazole augmente l’ intensité du signal RPE. Ceci
est dû apparemment à l’ inhibition de l’ ADH, ce qui bloque la transformation de la molécule
du méthanol en formaldéhyde et favorise, par conséquent, la formation du HMR.

Quoique le mécanisme de formation de HMR soit encore mal connu, ce radical,

comme son analogue HER, semble jouer un rôle dans la toxicité du méthanol. En effet, une
fois formé, HMR est rapidement converti en radical peroxyl, qui se transforme par la suite en
formaldéhyde en libérant le radical HO •2 (Bothe, 1978) :

•
CH 2 OH + O 2 → • OOCH 2 OH (21)
•
OOCH 2 OH → H 2 CO + HO •2 (22)

HMR peut également réagir avec le glutathion (GSH) produisant ainsi le radical thiyl
(Eriksen, 1988) :
•
CH 2 OH + GSH → CH 3 OH + GS • (23)

Puisque ce radical thiyl peut réagir aussi avec l’ oxygène, ces trois réactions pourraient
représenter des sources génératrices des radicaux dérivés de l’ oxygène et causer ainsi un
stress oxydatif suite à une intoxication au méthanol.

21
 CHAPITRE II

LES FLAVONOÏDES
 LES FLAVONOÏDES

Le terme flavonoïdes désigne une très large gamme de composés naturels appartenant
à la famille des polyphénols. Ils sont considérés comme des pigments quasi universels des
végétaux. Structuralement, les flavonoïdes se répartissent en plusieurs classes de molécules,
dont les plus importantes sont les flavones, les flavonols, les flavanones, les dihydroflavonols,
les isoflavones, les isoflavanones, les chalcones, les aurones, les anthocyanes et les tanins.
Ces diverses substances se rencontrent à la fois sous forme libre ou sous forme de glycosides.
On les trouve, d’ une manière très générale, dans toutes les plantes vasculaires, où ils peuvent
être localisés dans divers organes : racines, tiges, bois, feuilles, fleurs et fruits.

Les flavonoïdes sont reconnus pour leurs nombreuses activités biologiques, citons par
exemple les activités antivirales, anti-inflammatoires et anticancéreuses. Ces activités sont
attribuées en partie, à la capacité de ces composés naturels à piéger les radicaux libres tels que
-
les radicaux hydroxyles (•OH) et superoxydes (O2• ).

Nous classifierons dans un premier lieu, les flavonoïdes et nous présenterons leur
distribution nutritionnelle. Ceci sera suivi, dans une deuxième partie, par une présentation de
leur activité antioxydante en tant que piégeurs des radicaux libres et également en tant
qu'
inhibiteurs d’ enzymes responsables de la formation de ces espèces nocives.

23
 De nos jours, plus de 4000 flavonoïdes ont été identifiés. Ils ont une origine
biosynthétique commune et par conséquent, possèdent tous un même squelette de base à
quinze atomes de carbones, constitué de deux unités aromatiques, deux cycles en C6 (A et B),
reliés par une chaîne en C3 (Figure 3) (Bruneton, 1999).

Figure 3: Squelette de base des flavonoïdes.

Leur biosynthèse (Figure 4) se fait à partir d’ un précurseur commun, la 4,2’ ,4’ ,6’ -
tétrahydroxychalcone. Cette chalcone de couleur jaune est métabolisée sous l’ action
d’ enzyme, la chalcone isomérase, en flavanone (1) : naringénine. C’ est sur cette dernière
qu’ agit ensuite la flavone synthase ou la (2S)-flavanone-3-hydroxylase pour donner la
formation de la flavone (2) : apigénine ou le dihydroflavonol (3) : (2R,3R)-
dihydrokaempférol, respectivement. Les deux enzymes fonctionnent différemment, la
première introduit la double liaison entre les carbones C-2 et C-3, tandis que la deuxième
catalyse l’ hydroxylation du carbone C-3. Le dihydroflavonol, en présence de la flavonol
synthase ou la dihydroflavonol-4-réductase, se métabolise en flavonol (4) : kaempférol ou en
flavan-3,4-diol (5) : leucoanthocyanidol, respectivement. Ce dernier semble être le précurseur
des flavan-3-ols (6) et anthocyanidols (7) (Figure 4). Cependant, les étapes ultimes de leur
formation ne sont pas encore élucidées. Le pélargonidol (7), sous l’ action de la 3-O-glycosyl-
transférase, se transforme en anthocyanoside (8) : pélargonidol-3-glucoside (Figure 4).
Les composés de chaque sous-classe se distinguent par le nombre, la position et la
nature des substituants (groupements hydroxyles, méthoxyles et autres) sur les deux cycles
aromatiques A et B et la chaîne en C3 intermédiaire.
A l’ état naturel, on trouve très souvent les flavonoïdes sous forme de glycosides. Une
ou plusieurs de leurs fonctions hydroxyles sont alors glycosylés. La partie du flavonoïde autre
que le sucre est appelée aglycone.

24
 OH
4
4 OH
2
B
HO 4' 6' OH HO 4'
1 O
A

2' 2'
O
OH O OH

4,2',4',6'-tétrahydroxychalcone 4,2',4'-trihydroxyaurone

chalcone-isomerase

2' 4' OH OH

B
HO 7 O 2 HO O
1'
A flavone-synthase
3
5
OH O OH O
(1) flavanone: naringénine (2) flavone: apigénine

(2S)-flavanone-3-hydroxylase
OH OH

HO O HO O
flavonol-synthase

OH OH

OH O OH O
(3) dihydroflavonol: (2R,3R)-dihydrokaempférol (4) flavonol: kaempférol

dihydroflavonol-4-réductase
OH
OH

HO O HO O

OH OH

OH OH OH
(5) flavan-3,4-diol: leucoanthocyanidol (6) flavan-3-ol: afzéléchol

OH OH

+ +
HO O HO O

3-O-glucosyl-transférase
OH O-Glu

OH OH
(7) anthocyanidol: pélargonidol (8) anthocyanoside: pélargonidol-3-O-glucoside

Figure 4 : La biosynthèse des flavonoïdes (Bruneton, 1999).

25
I.1. FLAVONES ET FLAVONOLS

Comme nous avons mentionné ci-dessus, tous les types des flavonoïdes dérivent de la
4, 2’ ,4’ ,6’ -tétrahydroxychalcone et par conséquent, possèdent tous au moins trois hydroxyles
phénoliques en C-5, C-7 et C-4’ (Figure 4), cela étant, l’ un d’ entre eux peut être absent.
Dans plus de 90% des cas, le cycle A des flavones et flavonols (structures (2) et (4) sur
la Figure 4) est substitué par deux hydroxyles phénoliques en C-5 et en C-7. Ces hydroxyles
peuvent être libres ou éthérifiés. D’ autres substitutions sont possibles avec des fréquences
variables: hydroxyles libres ou éthérifiés en C-7 et/ou en C-8, méthylation en C-7 ou en C-8,
implication du C-6 et/ou C-8 dans une liaison carbone-carbone avec un sucre.
D’ autre part, dans plus de 80% des cas, le cycle B est substitué en C-4’ ou disubstitué
en C-3’ et C-4’ , ou moins fréquemment 3’ ,4’ ,5’ -trisubstitué; ces substituants peuvent être des
groupes hydroxyles (OH) comme peuvent être des methoxyles (OCH3). Les autres positions
(C-2’ et C-6’ ) ne sont qu’ exceptionnellement substituées.
En plus, les flavonols se distinguent des flavones par la présence d’ un groupement OH
en position C-3 (Figure 4). Sur la Figure 1 nous avons présenté quelques exemples de
molécules les plus répandues de ces deux groupes de flavonoïdes.

I.2. FLAVANONES ET DIHYDROFLAVONOLS

Les flavanones et les dihydroflavonols sont caractérisés par l’ absence de la double

liaison C2-C3 et par la présence de centres d’ asymétrie (Figure 4) (structures (1) et (3)). Les
variations structurales sont de même nature que celles décrites pour les flavones et les
flavonols. Les dihydroflavonols se distinguent des flavanones par l’ hydroxylation de la
position C-3. Cette classe de flavonoïdes semble un peu moins fréquente que son homologue
insaturé rassemblant les flavones et flavonols. Sur la Figure 1, nous montrons des exemples
de molécules appartenant à ce groupe de flavonoïdes.

I.3. FLAVAN-3-OLS, FLAVAN-3,4-DIOLS ET ANTHOCYANIDOLS

A la différence des flavonoïdes décrits au-dessus, ces trois groupes de molécules sont
toujours hydroxylés en position 3 et se caractérisent par l’ absence du groupe carbonyle en C-
4. Cette position peut être libre (cas des flavan-3-ols et anthocyanidols) ou hydroxylée (cas
des flavan-3,4-diols).

26
 Les flavan-3-ols et les flavan-3,4-diols sont à l’ origine des polymères flavaniques
appelés proanthocyanidols ou tanins condensés.

Les anthocyanidols les plus fréquents sont le pélargonidol et le cyanidol (Figure 1).

Les anthocyanosides sont caractérisés par l’ engagement de l’ hydroxyle en position 3

dans une liaison hétérosidique. On trouve parmi ces composés, le pélargonidol-3-O-glucoside
et le cyanidol-3-O-rutinose ou kéracyanine.

I.4. CHALCONES ET AURONES

Les chalcones sont différentes des autres types de flavonoïdes cités au-dessus. De par
l’ ouverture du noyau pyranique central, elles sont constituées par deux unités aromatiques
reliées par une chaîne tricarbonée, cétonique, α,β-insaturée (Figure 4). Le noyau B est assez
fréquemment non substitué, alors que les substitutions sur le cycle A sont le plus souvent
identiques à celles des autres flavonoïdes.

Les aurones sont caractérisées par une structure de 2-benzylidène coumaranone.

Pour ces deux types de molécules, la numérotation des positions est différente des
autres flavonoïdes décrits précédemment (Figure 4).

27
 Les flavonoïdes sont largement abondants dans les légumes feuilles (salade, choux,
épinards, etc), ainsi que dans les téguments externes des fruits.
Récemment, de nombreux travaux ont montré que certains fruits et légumes sont très
riches en flavonols, flavones et flavanones (Justen, 1998; Bronner, 1995; Hollman, 1996;
Crozier, 1997). Le Tableau 1 regroupe la distribution nutritionnelle de certains flavonoïdes.

Tableau 1: Sources alimentaires des flavonoïdes.

Flavonoïdes Aliments
Flavanones
naringénine fruits du genre citrus

Flavones
chrysine peau des fruits
apigénine persil, thym, romarin, céleri
lutéoline persil, céleri

Flavonols
kaempférol radis, brocoli, thé noir
quercétine oignon, pomme, olive, vin rouge, tomate
myricétine canneberge, vin rouge

Flavan-3-ols
épicatéchine thé vert, thé noir
catéchine thé vert, thé noir
épigallocatéchine vin rouge

Anthocyanidols
cyanidol cassis, myrtilles
malvidol raisins, fraises, cassis
apigénidol framboises, fraises

Les flavones apigénine et lutéoline sont très spécifiquement détectées dans les herbes
aromatiques comme le persil, le thym, le romarin et le céleri. Pour ce dernier, les
concentrations de ces deux flavones sont largement supérieures à celles présentes dans les
tiges. Cependant, leurs analogues hydrogénés (flavanones), l’ hespérétine et la naringénine
sont exclusivement présents dans les agrumes (Justen, 1998). Dans les tomates, il y a autant

28
de naringénine que de quercétine. Cette dernière se retrouve de façon majoritaire dans la
quasi-totalité des végétaux. Le kaempférol, autre flavonol, y est également largement détecté.
Les isoflavones sont largement distribuées dans des légumes comme le soja, les haricots verts,
les haricots noirs et les pois.

Autres flavonoïdes souvent étudiés, les anthocyanes confèrent aux fruits et légumes
leurs teintes rouges ou bleutées. Ils se trouvent surtout dans les myrtilles, cassis, airelles,
groseilles, mais également, à un degré moindre, dans tous les autres fruits rouges comme les
raisins, les fraises et les framboises. On peut aussi les trouver dans certains légumes comme le
chou rouge et les radis.

Le monde animal est lui aussi concerné par les flavonoïdes. On trouve par exemple de
la chrysine, de la quercétine, et de la galangine dans la propolis des abeilles. Ces insectes les
synthétisent à partir des sécrétions de bourgeons de nombreux arbres comme le bouleau,
l’ aulne, le sapin, et les modifient grâce à leurs enzymes salivaires.

Une des propriétés majeures des flavonoïdes est de contribuer à la couleur des plantes
et notamment à celle des fleurs. Or, c’ est par la couleur de ses fleurs que la plante exerce un
effet attracteur sur les insectes et les oiseaux pollinisateurs, assurant par ce biais une étape
fondamentale de sa reproduction. On peut également noter que les flavonoïdes, en repoussant
certains insectes par leur goût désagréable, peuvent jouer un rôle dans la protection des
plantes.

Les flavonoïdes montrent d’ autres propriétés intéressantes dans le contrôle de la

croissance et du développement des plantes en interagissant d’ une manière complexe avec les
diverses hormones végétales de croissance. Certains d’ entre eux jouent également un rôle de
phytoalexines, c’ est-à-dire de métabolites que la plante synthétise en grande quantité pour
lutter contre une infection causée par des champignons ou par des bactéries.

Par ailleurs, les flavonoïdes présentent un intérêt thérapeutique qui date de la

découverte de la vitamine C par Szent Gyorgyi (Prix Nobel, 1937), chercheur de l’ Université
de Szeged (Hongrie), qui a constaté que les symptômes hémorragiques du scorbut, liés à la

29
fragilité ou l’ hyperperméabilité des vaisseaux, étaient guéris par des extraits de paprika ou de
jus de citron, riches en vitamine C et flavonoïdes. Cette action a été appelée propriété
vitaminique P (P étant la première lettre du mot perméabilité).
Malgré ces premiers résultats prometteurs, les recherches ne permirent pas ensuite
d’ attribuer un rôle essentiel aux divers polyphénols du monde végétal. A partir des années
quatre-vingts, c’ est la découverte du rôle des radicaux libres dans les processus pathologiques
qui a relancé l’ intérêt pour ces molécules dont les propriétés antioxydantes sont très
marquées.

III.1. LES FLAVONOÏDES COMME ANTIOXYDANTS

D’ après Halliwell (Halliwell, 1994), les mécanismes de l’ action d’ un antioxydant

peuvent comprendre :
(i) Le piégeage direct des ROS.
(ii) L’ inhibition des enzymes et la chélation des traces métalliques responsables de
la production de ROS.
(iii) La protection des systèmes de défense antioxydants.

III.1.1. INHIBITION ENZYMATIQUE

La xanthine oxydase (XO) catalyse l’ oxydation de l’ hypoxanthine et de la xanthine en

acide urique suivant la réaction précédemment décrite (réaction 3, Chapitre I).

Par conséquent, la xanthine oxydase est considérée comme une source biologique
importante du radical superoxyde. Hansaki et ses collaborateurs, dans une étude sur la
maladie de la goutte, ont montré que les flavonoïdes peuvent agir sur l’ activité de la xanthine
oxydase et par conséquent, peuvent faire régresser la maladie de la goutte en réduisant à la
fois les concentrations d’ acide urique et celles du radical superoxyde dans les tissus humains
(Hansaki, 1994). Ces résultats ont été confirmés par Cos et ses collaborateurs qui ont mesuré
l’ activité d’ une trentaine de flavonoïdes sur la production d’ acide urique (Cos, 1998). Ils ont
ainsi déterminé la relation entre la structure chimique des flavonoïdes et leur activité
inhibitrice de la xanthine oxydase (Figure 5). Les différents points qui ressortent de cette
étude sont les suivants :

30
 La taxifoline, la (+)-catéchine et la (-)-épicatéchine ne peuvent inhiber la xanthine
oxydase qu’ à des concentrations supérieures à 100 µM.
La flavone, la 4’ -hydroxyflavone et la naringénine sont incapables d’ inhiber la
production de l’ acide urique.
Les flavanones, les dihydroflavonols et les flavan-3-ols n’ ont donc aucune influence
sur l’ activité de la xanthine oxydase.
Seuls les flavonols et les flavones ont la capacité à inactiver l’ enzyme (Figure 5).
Ceci montre l’ importance de la double liaison C2-C3 dans l’ inhibition de la xanthine oxydase.
En effet, les flavanones, les dihydroflavonols et les flavan-3-ols diffèrent des flavones et des
flavonols par l’ absence de la double liaison entre C-2 et C-3. Cette double liaison et la
conjugaison qu'
elle induit, entraîne la coplanarité du cycle B avec les cycles A et C. Il est
donc possible qu’ une structure plane soit importante pour l’ inhibition de la xanthine oxydase.
En comparant les activités des flavones et de leurs analogues flavonols, on observe
que l’ absence du groupe hydroxyle en C-3 augmente légèrement l’ activité (Figure 5).
Toutes les flavones ont montré des activités presque similaires quelque soit les
substituants du cycle B, indiquant que le cycle B n’ a que peu d'
influence sur l’ inhibition de
l’ enzyme pour les flavones (Figure 5).
Les flavonoïdes glycosylés ont des activités inférieures à celles des composés non
glycosylés. Par exemple, la rutine est presque dix fois moins active que la quercétine (Figure
5).

D’ autres études ont montré que les flavonoïdes sont aussi des bons inhibiteurs d'
autres
enzymes responsables de la production des radicaux libres comme la cyclooxygénase et la
lipooxygénase (Landolfi, 1984).

31
 OH

OH

HO O

OH O
Lutéoline

0,55 µM
OH

HO O HO O

OH O OH O
Chrysine Apigénine

0,84 µM OH 0,70 µM
OH

HO O

OH

OH O
Quercétine

1,06 µM OH

HO O HO O

OH OH

OH O OH O
Galangine OH Kaempférol

2,62 µM OH 1,80 µM
HO O

O-rutinose

OH O
Rutine

14,80 µM

OH OH

OH OH OH

HO O HO O HO O

OH O-rutinose OH

OH O OH O OH
Taxifoline 3-rutinosylkaempférol (+)-catéchine

> 100 µM 52,20 µM > 100 µM

Figure 5: Relation structure activité des flavonoïdes sur l’ inhibition de la xanthine oxydase
(les valeurs sont les IC50) (d’ après Cos, 1998).
32
 III.1.2. CHELATION DES IONS METALLIQUES

Les ions du fer (Fe2+) et du cuivre (Cu+) sont essentiels pour certaines fonctions
physiologiques. Ils peuvent être, soit des constituants des hémoprotéines, soit des cofacteurs
des différentes enzymes du système de défense antioxydant (par exemple, Fe pour la catalase,
et Cu et Zn pour la superoxyde dismutase). Mais ils sont aussi responsables de la production
du radical hydroxyle par la réduction du peroxyde d’ hydrogène selon la réaction suivante:

H 2 O 2 + Fe 2+ (Cu + ) → • OH + - OH + Fe 3+ (Cu 2+ ) (24)

Les flavonoïdes sont considérés comme de bons chélateurs de ces ions métalliques
(Morris, 1995 ; Brown, 1998).
Les études menées par Van Acker et ses collaborateurs sur la chélation du fer par
certains flavonoïdes, ont montré les résultats suivants (Van Acker, 1996) :
Le flavonol (3, 5-OH; 7, 3’ , 4’ -OEtOH) possède une activité supérieure à celle du
(3-OGlu; 5-OH; 7, 3’ , 4’ -OEtOH), ce qui indique l'
importance du groupement 3-OH.
Le (3-OGlu, 5-OH; 7, 4’ -OEtOH; 3’ -OH) est moins actif que le (3-OGlu, 5-OH; 7-
OEtOH; 3’ , 4’ -OH). Ceci démontre l'
efficacité d’ un groupement catéchol sur le cycle B (3’ ,
4’ -OH).
La quercétine est la plus active des flavonoïdes étudiés dans ce travail.
On peut résumer (Figure 6) les sites essentiels pour la chélation des ions métalliques :
(i) un noyau catéchol sur le cycle B, (ii) les groupes 3-hydroxyle et 4-oxo du cycle C, et (iii)
les groupes 4-oxo et 5-hydroxyle entre les cycles A et C.
Men+

OH

3'
4' OH
B
O

A C
4 3
5 OH

OH O

Men+
Men+

Figure 6 : Flavonoïdes et leurs sites proposés pour la chélation des ions métalliques (Men+).
(D’ après Van Acker, 1996)

33
 III.1.3. PIEGEAGE DES RADICAUX LIBRES

L’ interaction des flavonoïdes avec de nombreux radicaux a été employée dans

plusieurs études afin de déterminer les éléments majeurs de l’ activité antioxydante. A cause
de leurs faibles potentiels redox (Jovanovic, 1994), les flavonoïdes (Fl-OH) sont
thermodynamiquement capables de réduire les radicaux libres oxydants comme le
superoxyde, le peroxyle, l’ alkoxyle et l’ hydroxyle par transfert d’ hydrogène :

Fl − OH + R • → Fl - O • + RH (25)

Où R• représente l’ anion superoxyde, le peroxyle, l’ alkoxyle et l’ hydroxyle.

Le radical flavonoxy (FL-O•) peut réagir avec un autre radical pour former une
structure quinone stable (Figure 7).

.
O O O
OH
. .
R RH R RH
OH OH OH O

.
quinone

Figure 7 : Piégeage des ROS (R•) par les flavonoïdes.

En outre, le radical flavonoxy peut interagir avec l’ oxygène pour donner une quinone
et un anion superoxyde. Cette réaction est responsable d’ un effet prooxydant indésirable des
flavonoïdes. Nous constatons que la capacité des flavonoïdes d’ agir comme antioxydants
dépend non seulement du potentiel redox du couple Fl-O• / FL-OH mais aussi de la réactivité
du radical flavonoxy.

De nombreuses études ont établi des relations entre les structures chimiques des
flavonoïdes et leur capacité à piéger les radicaux libres (Jovanovic, 1994 ; Van Acker, 1996 ;
Rice-Evans, 1996, Cotelle, 1996 ; Cao, 1997 ; Bors, 1997, Cos, 1998 ; Dugas 2000, Pietta,
2000).
Rice-Evans et ses collaborateurs ont développé un test basé sur la capacité d’ un
antioxydant à piéger le radical cation chromophore, acide 2,2’ -azinobis(3-
éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS•+) (Rice-Evans, 1996). L’ activité des flavonoïdes

34
est comparée avec celle du Trolox (acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-
carboxylique), et exprimée en TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Il est à noter
que plus la valeur de TEAC est élevée plus la molécule est active.

Les résultats obtenus ont montré que l’ activité des flavonoïdes à piéger les radicaux
dépend essentiellement de leur structure.

a) Comparaison de l’ activité antioxydante des différents 3,5,7,3’ ,4’ -pentahydroxy

phénols

Les molécules de la Figure 8 représentent trois flavonoïdes avec 5 groupes hydroxyles

aux mêmes positions : la quercétine, un flavonol ; la catéchine, un flavan-3-ol; et la cyanidine,
un anthocyane. L’ activité de la quercétine (4,72 mM) est deux fois plus élevée que celle de la
catéchine (2,4 mM). Ceci est dû au fait que la quercétine possède une double liaison C2-C3 et
une fonction 4-oxo. La cyanidine avec une structure conjuguée, a approximativement la
même activité antioxydante que celle de la quercétine. Ces résultats démontrent l'
importance
de la présence d’ un cycle C insaturé, qui permet la délocalisation des électrons.

OH OH OH

OH OH OH

+
HO O HO O HO O

OH OH OH

OH O OH OH
Quercétine Catéchine Cyanidine

TEAC 4,72 ± 0.10 TEAC 2,40 ± 0,05 TEAC 4,42 ± 0,12

Figure 8 : Comparaison de l’ activité antioxydante des différents 3,5,7,3’ ,4’ -

pentahydroxy phénols. Les valeurs sont exprimées en mM (Rice-Evans, 1996)

b) Importance de la structure ortho-diphénolique du cycle B

La morine avec deux groupements hydroxyles en méta et le kaempférol avec un seul

groupement hydroxyle sont moins actifs que la quercétine (deux groupements hydroxyle en
ortho) (Figure 9). Ces résultats démontrent l’ importance de la structure ortho-diphénolique du

35
cycle B. La présence d’ un troisième groupe OH sur le cycle B (myricétine) diminue
légèrement l’ activité antioxydante.

OH OH
OH OH OH

HO O HO O HO O
OH

OH OH OH
OH O OH O OH O
Kaempférol Quercétine Myricétine

TEAC 1,34 ± 0,08 TEAC 4,72 ± 0,10 TEAC 3,12 ± 0,28

HO OH

HO O

OH

OH O
Morine

TEAC 2,55 ± 0,02

Figure 9 : Valeurs de TEAC montrant l’ importance du groupement catéchol au

niveau du cycle B pour l’ activité antioxydante des flavonols. Les valeurs sont
exprimées en mM (Rice-Evans, 1996).

Pour les flavones, un cycle B dihydroxylé en ortho est aussi important pour l’ activité
antioxydante (Figure 10). En effet, les deux flavones, apigénine (3’ -OH) et chrysine (sans
groupement OH sur le cycle B) ont presque la même valeur de TEAC (Figure 10).

OH

OH OH

HO O HO O HO O

OH O OH O OH O
Lutéoline Apigénine Chrysine

TEAC 2,09 ± 0,05 TEAC 1,45 ± 0,08 TEAC 1,43 ± 0,07

Figure 10 : Valeurs de TEAC montrant l’ importance du groupement catéchol au

niveau du cycle B pour l’ activité antioxydante des flavones. Les valeurs sont
exprimées en mM (Rice-Evans, 1996).

36
 c) Le rôle du groupe 3-OH sur le cycle C et la double liaison C2-C3

La glycosylation du groupement 3-OH de la quercétine (cas de la rutine) ou sa

suppression (cas de la lutéoline) diminue l’ activité antioxydante à 2,4 mM et 2,1 mM,
respectivement (Figure 11). Ceci démontre l’ importance du groupe 3-OH en combinaison
avec la double liaison C2-C3 adjacente à la fonction 4-oxo.
L’ importance de la double liaison est confirmée en comparant l’ activité de la
quercétine avec celle de la taxifoline. En effet, cette dernière, sans double liaison
(dihydroflavonol), est deux fois moins active que son analogue flavonol, la quercétine
(Figure 11).

OH
OH
OH
OH

HO O
HO O

OH

OH O
OH O
Quercétine
Lutéoline

TEAC 4,72 ± 0,10 TEAC 2,09 ± 0,05

OH OH

OH OH

HO O HO O

ORut OH

OH O OH O
Rutine Taxifoline

TEAC 2,40 ± 0,12 TEAC 1,90 ± 0,03

Figure 11 : Valeurs de TEAC indiquant l’ importance du groupe 3-OH en

combinaison avec la double liaison C2-C3. Les valeurs sont exprimées en mM
(Rice-Evans, 1996).

37
 d) L’ effet de la glycosylation sur l’ activité des flavones et flavanones

La comparaison de la naringénine avec le naringoside (Figure 12) montre que la

glycosylation du groupe 7-OH diminue largement l’ activité. Des effets similaires sont
observés quand l’ hespérétine est comparée avec son rutinoside (hespéridine), et la lutéoline
avec son 3’ ,7-diglucosides (Figure 12).

OH OH
OH OMe OH

HO O HO O HO O

OH O OH O OH O
Naringénine Hespérétine Lutéoline

TEAC 1,53 ± 0,05 TEAC 1,37 ± 0,08 TEAC 2,09 ± 0,05

OH
OGluc
OMe
OH OH

RutO O
RutO O GlucO O

OH O
OH O OH O
Hespéridine
Naringoside Lutéoline-3'
,7-glucoside
TEAC 0,76 0,05 TEAC 1,08 ± 0,03 ± 0,04
TEAC 0,79±

Figure 12 : Influence de la glycosylation sur l’ activité antioxydante des flavones et

flavanones. Les valeurs sont exprimées en mM (Rice-Evans, 1996).

e) Anthocyanidols

Le cyanidol, un équivalent de la quercétine, est le composé le plus actif de ce type de

flavonoïdes (Figure 13). L’ élimination du groupe 3’ -OH (pélargonidol) diminue le potentiel
antioxydant comme c'
est le cas pour le kaempférol en comparaison avec la quercétine.
L’ insertion d’ un groupe méthoxyle en position 3’ du cycle B (péonidol) augmente légèrement
l’ activité mais celle-ci reste toujours moins importante qu’ avec un groupement catéchol (cycle
B di-orthophénolique).
Le cyanidol, le delphinidol et le malvidol ont tous la même activité, ce qui montre
qu’ un cycle B trisubstitué ne semble pas être très important pour l’ activité antioxydante des
anthocyanidols (Figure 13).

38
 OH
OH OH

+ +
HO O HO O
OH

OH OH

OH OH
Pélargonidol Delphinidol

TEAC 1,3 ± 0,1 TEAC 4,4 ± 0,1

OH

OH

+
HO O

OH

OH
Cyanidol

TEAC 4,4 ± 0,1

OMe OMe

OH OH

+ +
HO O HO O
OMe

OH OH

OH OH
Péonidol Malvidol

TEAC 2,2 ± 0,2 TEAC 4,1 ± 0,1

Figure 13 : Effet de la substitution du cycle B sur l’ activité antioxydante des

anthocyanidols. Les valeurs sont exprimées en mM (Rice-Evans, 1996).

En analysant tous ces résultats concernant la capacité des flavonoïdes à piéger les radicaux
libres, la communauté scientifique a pu conclure que les composés les plus actifs sont ceux
qui combinent les trois critères suivants:

1. La structure ortho-dihydroxy sur le cycle B (groupement catéchol) qui confère la

stabilité au radical flavonoxy et participe à la délocalisation des électrons.
2. La double liaison C2-C3 en conjugaison avec la fonction 4-oxo.
3. La présence du groupe 3-OH en combinaison avec la double liaison C2-C3.

A titre d’ exemple, la quercétine satisfait à tous ces critères et par conséquent, elle est le
composé le plus actif de la famille des flavonoïdes (Figure 14).

39
 R'
3

R'
2 R'
4

HO O

R3

OH O

Figure 14 : Eléments essentiels pour l'

activité antioxydante des flavonoïdes.

III.2. ACTIVITES BIOLOGIQUES DES FLAVONOÏDES

De nos jours, les propriétés des flavonoïdes sont largement étudiées dans le domaine
médical où on leur reconnaît des activités anti-virales, anti-tumorales, anti-inflammatoires,
anti-allergiques et anti-cancéreuses.

III.2.1. EFFETS ANTIALLERGIQUES

Ces effets sont attribués à l’ influence des flavonoïdes sur la production de l’ histamine.
En effet, les flavonoïdes inhibent les enzymes, telles que l’ AMP cyclique phosphodiesterase
et ATPase Ca2+-dépendante, responsables de la libération de l’ histamine à partir des
mastocytes et des basophiles. Par exemple, l’ ATPase Ca2+-dépendante dégrade l’ ATP
produisant ainsi de l’ énergie afin de faciliter l’ absorption du calcium par les membranes
cellulaires, ce qui favorise la libération de l’ histamine stockée dans les vésicules. En
inactivant cette enzyme, la quercétine a montré un potentiel d’ action supérieur à celui du
cromoglycate de sodium utilisé comme médicament en empêchant la libération de l’ histamine
et d’ autres substances endogènes qui causent l’ asthme (Di Carlo, 1999).

III.2.2. EFFETS ANTI-INFLAMMATOIRES

Sous l’ action de la cyclooxygénase et la lipooxygénase, l’ acide arachidonique se

métabolise respectivement en prostaglandines et leucotriènes induisant ainsi des phénomènes
inflammatoires. Landolfi et son groupe ont montré que certains flavonoïdes sont capables de
modifier le métabolisme de l’ acide arachidonique dans les plaquettes (Landolfi, 1984). Ils ont
même reporté que les effets de la quercétine et la myricétine sont dose-dépendants. A de

40
fortes concentrations, ils inhibent la cyclooxygénase et la lipooxygénase. Cependant à de
faibles concentrations, seule la lipooxygénase est affectée. En outre, d’ autres flavonoïdes tels
que l’ apigénine et la chrysine agissent principalement sur l’ activité de la cyclooxygénase.

III.2.3. EFFETS ANTI-ULCEREUX

Dans des expériences réalisées sur des rats, il a été démontré que la quercétine et la
naringénine jouent un rôle important dans la réduction de l’ ulcère et la protection des cellules
gastriques. Il a été suggéré que la quercétine exerce son activité via un mécanisme complexe
impliquant la production du mucus, le piégeage des radicaux libres, et également l’ inhibition
de la production de leucotriènes (Di Carlo, 1999).
D’ autres études ont permis d’ établir une relation étroite entre les propriétés anti-
ulcéreuses de la quercétine, naringénine, rutine et kaempférol, et la production du PAF
(Platelet Activating Factor) qui est un agent ulcérogène potentiel (Izzo, 1996). En effet, il s’ est
avéré que la réduction des dommages gastro-intestinaux est due probablement à l’ inhibition
du PAF par ces flavonoïdes.

III.2.4. EFFETS ANTICANCEREUX

Présente pratiquement dans tous les types de thé et en particulier dans le thé vert, la
catéchine a montré une activité anti-tumorale (Bracke, 1991). Une telle activité est attribuée à
la capacité de ce flavonoïde d’ inactiver le t-PA (tissue-type plasminogen activator) en greffant
à celui-ci la laminine, une molécule de la matrice extracellulaire qui joue un rôle important
durant la mort cellulaire. La quercétine inhibe la croissance cellulaire en empêchant certaines
phases du cycle cellulaire et en bloquant les sites récepteurs des hormones (Larocca, 1994).
La croissance cellulaire peut être inhibée également par d’ autres mécanismes, à savoir : la
stabilisation du collagène, l’ altération de l’ expression des gènes, et la réduction des radicaux
libres (Di Carlo, 1999). En effet, la catéchine augmente la résistance du collagène (Scutt,
1987) et inhibe l’ activité de la collagénase (Makimura, 1993).

41
 III.2.5. D’ AUTRES EFFETS BIOLOGIQUES

Les flavonoïdes peuvent aussi empêcher le diabète ou du moins le réduire en inhibant

l’ enzyme aldose réductase (Chaudhry, 1983). Ong et Khoo ont reporté que la myricétine
possède un effet hypoglycémiant chez des animaux diabétiques (Ong, 1997 ; Ong, 2000).
Certains flavonoïdes peuvent entraver l’ athérosclérose et par conséquent réduisent le
risque des maladies cardiovasculaires (Hertog, 1993).
Les effets anti-viraux des flavonoïdes ont été également démontrés (Chu, 1992).

42
 CHAPITRE III

LA TECHNIQUE DE L’ IRRADIATION : APPLICATION A LA

CONSERVATION DES ALIMENTS
 LA TECHNIQUE D’ IRRADIATION : APPLICATION A LA
CONSERVATION DES ALIMENTS

Les produits alimentaires sont périssables. En effet, l’ infection bactérienne peut altérer
les aliments et par la suite causer des maladies d’ origine alimentaire. C’ est pourquoi les
scientifiques de l’ industrie alimentaire cherchent continuellement des méthodes efficaces pour
réduire l’ altération en inhibant ou en détruisant les micro-organismes pathogènes afin de
rendre les aliments plus sûrs tout en les gardant propres à l’ alimentation humaine.

Depuis la fin du XVIII° siècle, les techniques de conservation les plus utilisées sont le
traitement par la chaleur (stérilisation, pasteurisation) et par le froid (réfrigération et
surgélation). Dans les années soixante, il y a eu l’ apparition d’ un autre mode de préservation
semblable à la pasteurisation, il s’ agit de l’ irradiation. C’ est un procédé non chimique qui
consiste à exposer les aliments à un rayonnement ionisant. Les premiers essais ont été réalisés
sur les pommes de terre en 1960 afin d’ éviter leur germination. Depuis, les autorités de 40
pays et nations ont autorisé l’ irradiation de plus de 200 catégories d’ aliments allant des épices
aux grains en passant par la viande, les fruits et les légumes (Urbain, 1986 ; IAEA, 2002).

Dans une première partie, nous présenterons les fondements des techniques
d’ irradiation, puis nous montrerons ses applications sur les produits alimentaires.

43
 Rares sont les produits alimentaires animaux ou végétaux qui sont consommés à l’ état
naturel. Tous les produits ont été cueillis, conservés plus ou moins longtemps et pour certains
cuisinés avant d’ être consommés. Or, dans la plupart des cas, les tissus qui constituent les
denrées évoluent de l’ état vivant vers un état de décomposition qui est le processus naturel à
partir du moment où la plante est récoltée ou l’ animal abattu. Afin de freiner la
décomposition, l’ homme utilise divers procédés dont certains sont ancestraux comme le
séchage au soleil, le fumage et la fermentation contrôlée. Ces méthodes ancestrales de
conservation furent les seules utilisées jusqu’ au début du 19ème siècle, où Nicolas APPERT
(1810) découvrit que le chauffage dans une boîte fermée conduisait à une longue
conservation. Il fallut ensuite plus de 40 ans pour que Louis PASTEUR (1857) explique que
le chauffage détruisait les micro-organismes et que la boîte close évitait toute contamination
ultérieure. En 1868, Charles TELLIER venait d’ ajouter la technique de congélation qui
devenait ensuite la technique la plus importante et la plus utilisée à nos jours.
Dans les dernières années, des progrès considérables ont été accomplis dans le
domaine de l’ alimentation grâce à tout un faisceau de connaissances acquises par de
nombreuses disciplines scientifiques : microbiologie, physiologie, biochimie, toxicologie,
chimie et physique. L’ exploitation rationnelle de ces connaissances a permis le
développement de nombreux procédés de conservation comme la lyophilisation, l’ emballage
sous vide ou sous atmosphère contrôlée et enfin le traitement par rayonnements ionisants.
Toutes ces techniques ont pour objectif principal d’ éliminer les agents microbiens
responsables des maladies d’ origine alimentaire.

I.1. FACTEURS D’ALTERATION DES PRODUITS ALIMENTAIRES

Le degré d’ altération d’ un aliment n’ est une notion simple qu’ en terme de perte de
qualité. Ces altérations résultent d’ une action progressive de toute une série de facteurs
agissant isolément ou simultanément sur une ou un ensemble de propriétés initiales
considérées comme essentielles dans l’ appréciation de la qualité. On peut rencontrer :
Des altérations physiques : chocs, blessures et modifications d’ état.
Des altérations chimiques : oxydation.

44
 Des altérations biochimiques : soit d’ origine interne sous l’ action d’ enzymes, soit
d’ origine externe : fermentation et développement des micro-organismes pathogènes.

I.1.1. LES ALTERATIONS D’ ORIGINES INTERNES : ACTIONS ENZYMATIQUES

Catalyseurs d’ un grand nombre de processus chimiques et biochimiques, les enzymes

jouent un rôle très important dans le métabolisme cellulaire et dans la croissance de toutes les
cellules vivantes. Elles ne sont pas modifiées par les réactions et peuvent alors servir très
longtemps. L’ action catalytique des enzymes permet à ces réactions d’ évoluer rapidement aux
températures et aux concentrations physiologiques. Dans les tissus vivants, ces réactions se
modifient avec l’ âge et conditionnent le phénomène de maturation. Ces différentes réactions
sont couplées entre elles pour former des chaînes métaboliques qui, dans des conditions
physiologiques normales, agissent régulièrement sans qu’ il y ait accumulation de produits
intermédiaires de métabolisme. Cette régulation métabolique précise est fragile et pourrait
être bouleversée très facilement par la modification de facteurs extérieurs telle la température.
Comme conséquence, il y aura un déséquilibre de la chaîne enzymatique résultant de
l’ accumulation de certains produits intermédiaires. Si parmi ceux-ci, il en est qui présentent
un mauvais goût ou une odeur désagréable, leur accumulation pourra entraîner la dépréciation
des qualités de l’ aliment. Ces qualités peuvent être conservées en ralentissant les réactions
enzymatiques par un abaissement de température. Mais certaines enzymes peuvent garder une
activité même à des températures très basses et sous forme congelée. D’ où la nécessité d’ une
inactivation, même pour les produits destinés à la surgélation.
Par ailleurs, lorsque les tissus végétaux sont hachés, broyés ou subissent tout autre
traitement qui détruit les parois cellulaires sans inactiver les enzymes, celles-ci seront alors
libres d’ agir plus efficacement que dans les tissus vivants où leur action est plus contrôlée. De
cette façon un facteur naturel de contrôle de l’ activité enzymatique aura ainsi été supprimé. Il
y a donc nécessité pour ce type de produit de réaliser dans les brefs délais l’ inhibition des
enzymes par un traitement thermique.

I.1.2. LES ALTERATIONS D’ ORIGINES EXTERNES

Elles sont dues aux agents externes provoquant des réactions chimiques et
biochimiques sans faire intervenir les enzymes internes. Par exemple, les réactions physico-
chimiques résultent de l’ action catalytique d’ agents physiques (la lumière) ou chimiques (les

45
ions métalliques). Les réactions biochimiques, quant à elles, peuvent résulter de l’ action de
micro-organismes et de leurs enzymes. Pour croître et se multiplier, ces micro-organismes
doivent se nourrir. La croissance des micro-organismes est conditionnée par la nature du
substrat mais aussi par des facteurs physiques et chimiques du milieu tels que, par exemple, la
teneur en eau et la présence de l’ air.
Les micro-organismes sont classés, d’ une manière générale, en bactéries, moisissures
et levures. La plupart d’ entre eux peuvent être détruits à des températures situées au voisinage
du point d’ ébullition de l’ eau. Certains sont, cependant, doués d’ une résistance à la chaleur
nettement plus élevée que celles des cellules végétales.

Les bactéries

Les bactéries sont classées, suivant la température de leur croissance, en psychrophiles

(entre 2° C et 10° C), mésophiles (entre 20° C et 45° C) et thermophiles (entre 50° C et 75°
C). C’ est surtout ce dernier type de bactéries résistantes à la chaleur qui peuvent se
développer et produire des altérations.

Les levures

En se développant en milieu acide riche en hydrates de carbone, les levures sont très
répandues sur les fruits et les fleurs. Elles sont des agents d’ altération typiques des conserves
de fruits insuffisamment chauffées. Certaines levures peuvent se développer dans des milieux
très sucrés, et constituent par la suite la flore fermentante des marmelades et des fruits au
sirop. La plupart des levures se développent en l’ absence d’ air, et souvent les traitements
thermiques de pasteurisation suffisent à les détruire.

Les moisissures

Avec une activité assez semblable à celle des levures, les moisissures se développent
en présence d’ air, quasi exclusivement en surface et présentent une faible résistance
thermique.

En général, toutes les altérations, qu’ elles soient physiques, chimiques ou

biochimiques, sont plus ou moins importantes en fonction principalement :

46
 de la protection physique des produits contre les chocs, la lumière et le contact de
l’ air (une des fonctions de l’ emballage),
de la température (réfrigération, congélation, température ambiante),
de la teneur en eau des produits,
et bien évidement de la durée du stockage.

I.2. TRAITEMENT PAR IRRADIATION IONISANTE

L’ irradiation des aliments est un mode de préservation semblable à la pasteurisation.

Alors que cette dernière utilise la chaleur pour détruire les micro-organismes, l’ irradiation
utilise l’ énergie sous forme d’ un rayonnement ionisant.

I.2.1. RAYONNEMENTS IONISANTS

Le principe de la dualité onde-corpuscule explique que l’ on peut décrire un

rayonnement comme la propagation dans l’ espace d’ une onde ou de particules.
Un rayonnement ionisant est un rayonnement dont l’ énergie est suffisante pour ioniser
les atomes et les molécules qu’ il rencontre sur son chemin, c’ est-à-dire pour leur arracher un
ou plusieurs électrons. Dans le cas où l’ apport d’ énergie fournie par le rayonnement est trop
faible pour éjecter l’ électron hors de l’ atome cible, on dit que le rayonnement est non ionisant
(la lumière visible, les micro-ondes et les ondes radioélectriques).

Les divers types de rayonnements ionisants sont :

Les particules α : ce sont des noyaux d’ hélium He2+ émises par des éléments
radioactifs naturels tels que l’ uranium et le radium, ainsi que par certains éléments artificiels.
Ces particules ont une capacité de pénétration si faible qu’ elles peuvent être arrêtées par une
feuille de papier.
Les particules β : ce sont des électrons qui ont une grande énergie cinétique
positive ou négative. Comme ils sont plus petits que les particules α, ils ont un pouvoir de
pénétration plus élevé.
Les électrons accélérés : ils s’ obtiennent à l’ aide de générateurs électriques dont le
principe de fonctionnement et la technologie déterminent les caractéristiques du faisceau

47
d’ électrons émis. Cependant, pour ce qui concerne les traitements ionisants appliqués dans
l’ industrie agro-alimentaire, l’ énergie des électrons mis en œuvre est limitée à 10 Mev.
Les rayons X : ils résultent du freinage, à l’ aide d’ une cible constituée d’ un métal
lourd (par exemple, tungstène), d’ électrons préalablement accélérés. L’ interaction de ces
électrons avec les atomes de la substance se traduit par un ralentissement des particules
incidentes. Une fraction notable de l’ énergie cinétique perdue par ces électrons se convertit
plus ou moins en chaleur. Une autre partie est rayonnée hors de la cible sous la forme de
photons X dont l’ énergie peut être variable.
Les rayonnements γ : ils sont émis par les noyaux radioactifs. Leur énergie est
donc bien déterminée. Pour ioniser les denrées alimentaires, on utilise principalement comme
sources de rayonnements le Cobalt 60 (60Co) ou le Césium 137 (137Cs) :
Le cobalt 60, utilisé dans notre travail comme une source de rayonnement γ,
possède un excès relatif de neutrons. En conséquence, il se désintègre par radioactivité β- pour
donner le nickel 60 ( 60
28 Ni ) sous la forme excitée. Ce noyau fils se désexcite en émettant deux

rayonnements γ d’ énergies différentes (1,17 MeV et 1,33 MeV) (Figure 15).

60
27 Co

β-
60
2e niveau excité de 28 Ni (2,50 MeV)
γ (1,17 ΜeV)
Μ
60
1er niveau excité de 28 Ni (1,33 MeV)
γ (1,33 ΜeV)
Μ
60
niveau fondamental de 28 Ni

Figure 15 : Schéma de désintégration radioactive du 60Co.

-
55 Cs ) se désintègre également par rayonnement β pour aboutir au
Le césium 137 ( 137

baryum 137 ( 137

56 Ba ). Lors de cette transformation, 5% seulement des noyaux de césium

conduisent directement au baryum 137 à son état fondamental, alors que 95% se désintègrent
pour donner le baryum 137 à l’ état excité qui, à son tour, émet un photon γ de 0,662 MeV en
revenant à son état stable.

48
 I.2.2. RAYONNEMENTS IONISANTS UTILISES DANS LE TRAITEMENT DES
ALIMENTS

Les rayonnements particulaires doivent présenter, pour ioniser le milieu traversé, un

pouvoir de pénétration suffisant, ce qui élimine les particules α.

Les neutrons, en raison de leur absence de charge, possèdent un pouvoir de pénétration

supérieur à celui des particules chargées et lourdes. Cependant, ils n’ interagissent que très
faiblement avec les électrons orbitaux des atomes de la matière irradiée. En effet, leur énergie
cinétique se trouve principalement absorbée de manière progressive par leur interaction avec
les noyaux de ces atomes. Une telle interaction est susceptible de créer des noyaux radioactifs
au sein du milieu rencontré, ce qui rend évidemment ces particules impropres à une utilisation
dans le domaine agro-alimentaire.

L’ examen des valeurs des énergies d’ ionisation des principaux atomes constituant la
matière vivante (à savoir 13,58 eV pour l’ hydrogène, 11,24 eV pour le carbone, 14,24 eV
pour l’ azote, et 13,57 eV pour l’ oxygène) montre que les rayonnements possédant une énergie
inférieure à une dizaine d’ électrons-Volts ne peuvent pas provoquer l’ ionisation des milieux
biologiques soumis à leur action.

Les rayonnements γ issus du cobalt 60 ou du césium 137 ont tous des énergies très
supérieures aux énergies d’ ionisation des atomes cités ci-dessus, par conséquent, ils peuvent
provoquer l’ ionisation de la matière qu’ ils rencontrent.

Les rayons X caractérisés par des longueurs d’ ondes inférieures à 0,1 µm sont aussi
capables de déclencher le phénomène d’ ionisation. En revanche, les ondes radioélectriques,
l’ ultraviolet, la lumière visible, l’ infrarouge et les micro-ondes ne manifestent aucun pouvoir
ionisant.

L’ application de l’ irradiation en agro-alimentaire consiste alors à exposer des aliments,

pour un temps donné, à un faisceau d’ électrons, rayons X ou dans la plupart des cas, des
rayons γ. A l’ inverse des micro-ondes qui ont pour effet de produire de la chaleur, de cuire la

49
nourriture, l’ irradiation n’ entraîne pas une élévation marquée de la température de l’ aliment.
C’ est pourquoi le processus d’ irradiation est souvent appelé pasteurisation froide.

Tout comme certains consommateurs qui pensaient initialement que les aliments cuits
au four à micro-ondes pouvaient être radioactifs, d’ autres pensent également que les aliments
irradiés peuvent devenir radioactifs. Cette opinion s’ avère inexacte parce que les
rayonnements utilisés dans le traitement des aliments par irradiation (rayonnement γ, rayons
X ou électrons accélérés) ne peuvent en aucun cas perturber le noyau de l’ atome. Ils
n’ agissent qu’ au niveau des couches électroniques et ne peuvent absolument pas induire dans
la matière irradiée le phénomène de radioactivité.

L’ irradiation des aliments a été étudiée et testée beaucoup plus que tout autre procédé
de préparation ou de conservation des aliments. Il a été montré qu’ elle comporte plusieurs
bénéfices dont les suivants :
Elle détruit les bactéries telles que Escherichia coli et les moisissures qui
contaminent les aliments et causent leur altération, et par conséquent permet de retarder le
mûrissement et la maturation des fruits et des légumes et en prolonge la durée de conservation
de plusieurs semaines à la température ambiante.
Elle inhibe la croissance des insectes nuisibles dans les fruits et les légumes secs, la
farine et les grains.
Elle détruit les germes pathogènes dans les viandes, en particulier porc et volaille
fortement contaminés par Salmonella ou Campylobacter.
Elle a aussi l’ avantage indéniable de remplacer l’ utilisation d’ agents de fumigation,
notamment du dibromure d’ éthylène interdit depuis 1984, et d’ autres agents de stérilisation
comme l’ oxyde d’ éthylène et les nitrites. Ces substances chimiques peuvent favoriser le
développement de cancers, et l’ irradiation dans ce sens pourrait remplacer ces éléments.

Les aliments sont alors irradiés dans une chambre aux murs épais contenant une
source de rayonnements ionisants qui passent à travers l’ aliment et détruisent les insectes, les
bactéries et les autres micro-organismes. Quel que soit le type de rayonnement utilisé
(faisceau d’ électrons, rayons X ou γ), le processus est le même : l’ énergie contenue dans les
rayons est transférée aux molécules du produit alimentaire irradié, ce qui permet de convertir
les atomes et les molécules en ions et radicaux. Ces espèces ioniques et radicalaires perturbent

50
les fonctions normales des différents micro-organismes et diminuent leur activité et par
conséquent, ils ne peuvent plus causer l’ altération de l’ aliment.

I.2.3. DEFINITION DE LA DOSE

On définit la dose absorbée comme étant la quantité d’ énergie absorbée par unité de
masse du matériau irradié :
E
D=
m
L’ unité de dose est le Gy :
1 Gy = 1 J kg-1

Comme pour d’ autres traitements physiques tels que le traitement thermique qui
dépend de la température, les effets des rayonnements varient avec la dose appliquée. Ces
effets diffèrent d’ un micro-organisme à l’ autre et d’ un aliment à l’ autre. Les doses les plus
couramment utilisées en agro-alimentaire varient de 0,10 kGy à 30 kGy. Selon le but
recherché, on distingue trois applications (Tableau 2) (Urbain, 1986) :
Application à faibles doses (inférieures à 1 kGy), en vue de la décontamination et
l’ inhibition de la germination.
Application à des doses moyennes (de 1 à 10 kGy) pour augmenter la durée de
conservation.
Application à fortes doses (de 10 à 30 kGy) afin d’ éliminer les germes pathogènes.

a) Traitement à faibles doses : inhibition de la germination et désinsectisation

Le traitement des oignons, pommes de terre, échalotes et ails a montré que de faibles
doses, entre 50 et 150 Gy, permettent un contrôle efficace de la germination. Ces doses ne
provoquent pas d’ effets indésirables sur le produit. Elles sont fonction de la variété et de la
maturité. L’ ionisation est remarquablement efficace si le traitement s’ effectue pendant la
période de dormance, généralement le mois suivant la récolte.

Les effets des rayonnements sur les insectes ravageurs sont fonction du stade de
développement et de l’ espèce. L’ ionisation à des doses comprises entre 0,15 et 1 kGy, est
utilisée pour la désinsectisation de denrées stockées telles que céréales, noix, fruits et légumes

51
secs et farines. A la différence de la fumigation chimique, un avantage décisif de l’ ionisation
réside dans la capacité à traiter les œufs des insectes cachés dans les grains ou les fruits.
L’ utilisation d’ une dose minimale de 0,15 kGy est de plus en plus reconnue par les autorités
de quarantaine comme un procédé valable pour la désinsectisation, en particulier pour les
fruits tropicaux et subtropicaux.

Tableau 2 : Les doses utilisées en agro-alimentaire (Urbain, 1986).

Dose (kGy) Effet Aliments

0,05 - 0,15 Inhibition de la germination Pommes de terre
Oignons, ails

0,15 - 0,50 Désinsectisation et déparasitage Céréales

Faibles Doses
Fruits frais et secs
Poisson et viande

0,50 - 1,0 Ralentisement des processus physiologiques Fruits et légumes

1,0 - 3,0 Prolongation de la conservation Poissons frais

Fraises
framboises
Doses Moyennes

1,0 - 7,0 Elimination des micro-organismes pathogènes Fruits de mer

Raisins, fraises
Volaille et viande

10,0 - 30,0 Décontamination des ingrédients alimentaires Epices

Fortes Doses
30,0 - 50,0 Stérilisation industrielle Viande, volaille

b) Traitement à doses moyennes

De nombreux ingrédients secs (en particulier les épices et les herbes aromatiques),
fruits et légumes peuvent être contaminés par des micro-organismes parfois pathogènes pour
l’ homme. L’ ionisation de ces aliments à des doses comprises entre 1 et 10 kGy réduit la
charge microbienne de 103, voire 105 germes par gramme, essentiellement des bactéries, des
levures ou des moisissures. En conséquence, la durée de vie de ces produits se trouve
augmentée. En France, l’ ionisation à des doses de 3 kGy, 5 kGy, 9 kGy, 10 kGy et 11 kGy est

52
autorisée pour la débactérisation et l’ augmentation de la durée de conservation,
respectivement, des fraises, la farine de riz, la gomme arabique, des légumes déshydratés et
des épices (Vasseur,1991).

Un aliment traité par irradiation devient stérile lorsqu’ il « absorbe » une dose
provoquant la destruction de 90% de micro-organismes qu’ il contient. Cette dose est appelée
Dose de Réduction Décimale (DR 10) ou Dose Létale 90 (DL 90). Elle varie d’ un micro-
organisme à l’ autre et également avec la nature du milieu (pH, présence d’ oxygène). Dans le
Tableau 3, nous avons regroupé la DR 10 des principaux micro-organismes rencontrés dans
les produits alimentaires.

Tableau 3 : La dose de réduction décimale (DR 10) de micro-

organismes fréquemment rencontrés dans les produits alimentaires
(Urbain, 1986).
Micro-organismes Espèces DR 10 (kGy)

Lactobacillus 0,15
Micrococcus 0,70
Pseudomonas 0,06
Bactéries Escherichia coli 0,10
Salmonella 0,70
Campylobacter 0,08 - 0,16
Listeria 0,2 - 1,10
Spores de Penicillium 0,40
Moisissures
Spores de Cladosporium 1,30
Virus Polio myélite 14,00

c) Traitement à fortes doses

L’ emploi de doses stérilisantes, de plusieurs dizaines de kilograys, demande dans la

majorité des pays, une dérogation particulière. De ce fait, les applications sont aujourd’ hui
limitées à quelques cas spécifiques. Sachant qu’ une dose minimum de 20 kGy est nécessaire
pour une sécurité microbiologique, les doses utilisées sont très élevées et peuvent atteindre 50
kGy. La viande, le poisson, les légumes, les mélanges de céréales, les plats complets et les
boissons en poudre peuvent être ainsi stérilisés. Les conditions de traitement telles que
température et emballage sont extrêmement importantes pour la qualité finale de l’ aliment;
ainsi la plupart des stérilisations par ionisation se font sur le produit congelé afin d’ éviter le

53
développement d’ odeurs désagréables. L’ aliment traité est généralement conditionné dans un
emballage adéquat pour éviter toute recontamination ou toute altération par des agents
extérieurs.

I. 3. APPLICATIONS DE L’IONISATION AUX FRUITS ET LEGUMES

I.3.1. FRUITS

Depuis la découverte de la technique du traitement des aliments par irradiation, un très

grand nombre d’ espèces ont été soumises expérimentalement aux rayonnements ionisants.
Citons, entre autres, les fraises, les pommes, les pêches et nectarines, les fruits rouges, les
oranges, la châtaigne, les prunes et les raisins.

a) Fraises

C’ est le fruit qui incontestablement a été jusqu’ à présent le plus étudié pour
l’ application du traitement ionisant. Les essais entrepris montrent que l’ ionisation permet de
limiter nettement le développement des moisissures affectant les fraises. Les effets de
l’ irradiation diffèrent d’ une variété à l’ autre. Par exemple, le Tioga ou Selecta d’ origine
américaine montrent une grande résistance à l’ ionisation ainsi des doses plus élevées ont été
appliquées sans modification de la qualité de l’ aliment. Par contre, des variétés comme
Favette, Red Gontlet ou Brighton supportent moins bien l’ effet des rayonnements. Ceux-ci
affectent, en effet, la texture des fraises qui s’ amollit permettant la croissance rapide des
micro-organismes encore présents après l’ ionisation.
Les essais entrepris en France montrent que la variété Gorella peut être conservée dans
un aspect de fraîcheur entre 4 et 6° C pendant au moins 10 jours. Cette variété doit être traitée
dans les 24 ou 48 heures après la récolte avec des doses allant de 1,7 à 2,6 kGy. Cependant,
des doses plus élevées, des délais de traitement plus tardifs ou des niveaux thermiques de
conservation plus hauts entraînent la modification des qualités organoleptiques ou limitent le
potentiel de survie après récolte et donc imposeraient une commercialisation à plus court
terme (4 à 6 jours).
Afin de diminuer les doses nécessaires au contrôle des pourritures, on a envisagé
d’ appliquer des traitements combinés. Ainsi, à l’ ionisation on a associé des traitements
thermiques. En effet, un traitement à 40° C pendant 10 minutes permet de réduire la dose

54
efficace de 2 à 1 kGy et de n’ avoir que 2% de fraises atteintes de pourritures après 7 jours
d’ entreposage à + 5° C contre 44% pour le témoin.

b) Framboises

Comme pour les fraises, les essais ont été réalisés sur plusieurs variétés de framboises.
Les meilleurs résultats sont obtenus sur la variété Neeker à une dose de 1 kGy. Là aussi des
traitements à une dose de 2 ou 3 kGy affectent très fortement la physiologie et les qualités
organoleptiques des framboises malgré leur action limitant très nettement le développement
des micro-organismes pathogènes, bactéries et moisissures. On a observé également que
l’ association avec un entreposage au froid reste indispensable. Par exemple, un facteur de 3
est obtenu entre le pourcentage d’ altérations d’ une framboise irradiée à 1 kGy et conservée à
+ 4° C (5%) et celui correspond à une conservation à la température ambiante (15%).

c) Pruneau

Cet aliment très riche en sucre présente un terrain favorable pour le développement des
micro-organismes. Le traitement par rayonnement ionisant à des doses de 6 à 8 kGy permet
de lutter efficacement contre ces atteintes. L’ ionisation provoque aussi un assouplissement de
la texture et n’ altère pas les autres caractéristiques organoleptiques du produit.

d) Pommes et poires

Quoique le principal intérêt du traitement des pommes et des poires par irradiation
réside dans la lutte contre des larves d’ insectes de type Leucoptera à des faibles doses de 0,6
kGy, un traitement de 2 ou 3 kGy permet aussi de limiter efficacement le développement de
moisissures comme le Gloesporium, le Pénicillium ou le Botrytis. Cependant, à ces doses on a
observé des modifications indésirables telles que ramollissement de la chair ou accélération
de la maturation.

e) Mangue et papaye

Pour ces deux espèces, il apparaît que le traitement le plus efficace est la combinaison
d’ une ionisation à 0,7 kGy et un trempage dans de l’ eau à 50° C pendant une dizaine de

55
minutes. Ce traitement permet de réduire significativement les problèmes d’ insectes, de
moisissures et assure un retard de maturation. Il en résulte que leur qualité peut être
maintenue pendant quelques jours, surtout lorsque les fruits sont conservés sous froid à 11° C.

I.3.2. LEGUMES

Les légumes sont plus fermes et moins fragiles que les fruits, ainsi ils se prêtent
souvent mieux au traitement ionisant que les fruits. De nombreuses espèces ont été soumises à
l’ ionisation, citons par exemple, oignons, ails, échalotes, pommes de terre et champignons.

a) Pommes de terre

Les pommes de terre ont été les premiers légumes soumis aux essais du traitement
ionisant par Brunelet et Vidal au cours des années 1960. Les résultats ont montré que le
traitement avec une faible dose de 0,1 kGy permet d’ inhiber la germination et d’ assurer une
parfaite conservation pendant une période d’ un an des tubercules à + 10° C.

b) Ails, oignons et échalotes

Les essais entrepris sur ces aliments ont montré que l’ application doit être pratiquée
dans les 2 à 3 semaines qui suivent la récolte. Les effets sont comparables à ceux obtenus
pour la pomme de terre. Pour des échalotes contenant respectivement 72% et 100% de bulbes
germés, l’ ionisation avec une dose de l’ ordre de 0,1 kGy permet de diminuer le nombre de
germinations à 5% et 10%, respectivement. Après irradiation, une conservation à froid (+ 10°
C) assure un maintien de qualité pendant plusieurs mois.

c) Champignons

Les champignons sont trop sensibles à plusieurs facteurs tels que la lumière, la
température et l’ humidité, et par conséquent, ils perdent leur qualité en 2 à 3 jours. Un
traitement par irradiation en combinaison avec emballage plastique permet d’ augmenter la
durée de conservation de 4 à 5 jours.

56
I.4. EFFET DE L’IRRADIATION SUR LES FLAVONOÏDES PRESENTS DANS LES
FRUITS

I.4.1. FRAISES

Les fraises sont caractérisées par une courte durée de vie. Pour les conserver, neuf
pays ont autorisé leur irradiation avec une dose maximale de 3 kGy (IAEA, 2002). Cette dose
permet de multiplier la durée de vie des fraises par un facteur 2. Pour les fraises irradiées, des
modifications de texture et de couleur sont observées (IAEA, 2002). Ceci est une preuve
visible que l’ irradiation peut provoquer des changements structuraux des groupes
moléculaires constituant ces fruits.
Pour étudier un tel processus, des fraises fraîches sont irradiées à température
ambiante avec des doses allant de 1 à 6 kGy (Breitfellner, 2002 ; Breitfellner, 2003). Les
échantillons irradiés et non irradiés sont hachés puis dissous dans le méthanol.
L’ analyse, par CLHP et LC-MS, des échantillons non irradiés a montré la présence
d’ acides phénoliques (acide 4-hydroxybenzoïque, acide p-coumarique, acide caféique et acide
gallique) et de flavonoïdes (kaempférol-3-O-glucoside, quercétine-3-O-glucoside, quercétine-
3-O-galactoside, (+)-épicatéchine et (+)-catéchine) (Figure 16).

Après irradiation, les auteurs ont observé que l’ acide p-coumarique, l’ acide caféique et
l’ acide gallique ne sont pas affectés par l’ irradiation, en revanche la concentration d’ acide 4-
hydroxybenzoïque augmente linéairement avec la dose (Figure 17).

57
 Flavonoïdes
OH OH OH

OH OH OH

HO O HO O HO O

O-Glucose O-Galactose OH

OH O OH O OH
quercétine-3-O-glucoside quercétine-3-O-galactoside épicatéchine

OH

OH OH

HO O HO O

O-Glucose OH

OH O OH
kaempférol-3-O-glucoside catéchine

Acides phénoliques

OH OH
OH
OH OH OH

HO HO
OH
O O HOOC
HOOC
acide 4-hydroxybenzoïque acide gallique acide p-coumarique acide caféique

Figure 16 : Structures chimiques de flavonoïdes et d’ acides phénoliques présents

dans les fraises (Breitfellner, 2002 ; Breitfellner, 2003).

En ce qui concerne les flavonoïdes, la concentration de la (+) catéchine, de la (+)-

épicatéchine et du kaempférol-3-O-glucoside diminue significativement au cours de
l’ irradiation (Figure 17). En outre, l’ irradiation n’ a montré aucun effet sur la concentration de
la quercétine-3-O-glucoside et de la quercétine-3-galactoside malgré l’ application d’ une dose
supérieure à 6 kGy.

58
 60 6 6

(A) (B)
50 5 5
Concentration (mg/kg)

Concentration (mg/kg)
40 4 4

30 3 3

20 2 2

10 1 1

0 0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
Dose (kGy) Dose (kGy)

Figure 17 : (A) Dégradation de la (+)-catéchine ( , échelle gauche), de la (+)-

épicatéchine ( ) et du kaempférol-3-glucoside (∆) (échelle droite) et (B) formation
d’ acide 4-hydroxybenzoïque ( ) présents dans la fraise en fonction de la dose
appliquée (Breitfellner, 2003).

I.4.2. CLEMENTINE

La clémentine est également une source importante de flavonoïdes tels que les
flavanones glycosylées et les flavones polyméthoxylées (Tableau 4) (Oufedjikh, 2000).

Tableau 4 : Structures chimiques des flavonoïdes présents dans la clémentine (Figure

1) (Oufedjikh, 2000).

Substituants des flavones e t flavanones

Flavonoïdes
3 5 6 7 8 3' 4'
ériocitrine OH ORut OH OH
narirutine OH ORut OH
hespéridine OH ORut OH OCH3
didymine OH ORut OCH3
scutélarine OCH3 OCH3 OCH3 OCH3
isoscutélarine OCH3 OCH3 OCH3 OCH3
tangérétine OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3
sinensétine OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3
nobilétine OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3
quercétogétine OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3
heptaméthoxyflavone OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3

59
 Oufedjikh et ses collaborateurs ont étudié par CLHP l’ effet de l’ irradiation γ sur ce
fruit. Avec une dose de 0,3 kGy, ils ont montré que les concentrations de flavanones
glycosylées et de flavones polyméthoxylées présentes dans l’ échantillon irradié sont deux fois
inférieures à celles présentes dans le témoin (fruit non irradié). Ceci constitue le seul élément
de cette étude qui permet de montrer que l’ irradiation entraîne la dégradation de ces
flavonoïdes, en revanche aucune information sur le mécanisme de dégradation n’ a été
proposé.

Pour les flavones méthoxylées, les auteurs ont observé que plus le nombre de
groupements méthoxyles constituant la molécule est important, plus sa dégradation est
importante (Tableau 5).

Tableau 5 : Relation entre le degré de dégradation des flavonoïdes polyméthoxylés

présents dans la clémentine et le nombre de groupements méthoxyles les constituant. La
dose d’ irradiation est de 0,3 kGy et les concentrations sont exprimées en mg/100 g
(Oufedjikh, 2000).
nombre de groupes Concentration Concentration
Flavonoïde s % de dégradation
méthoxyles avant irradiation après irradiation
scutélarine 4 1,41 1,21 14,2
isoscutélarine 4 2,00 1,71 14,5
tangérétine 5 5,70 4,57 19,8
sinensétine 5 1,44 1,14 20,8
nobilétine 6 5,92 4,70 20,6
quercétogétine 6 0,77 0,57 26,0
heptaméthoxyflavone 7 0,85 0,60 29,4

A partir de ces études, nous constatons clairement que l’ irradiation affecte les
flavonoïdes présents dans les aliments et, par conséquent, elle peut conduire à la formation de
substances chimiques appelées produits radiolytiques, qui n’ ont pas été identifiés. Dans notre
travail, nous irons plus loin dans l’ étude des réactions physico-chimiques permettant de
comprendre la formation de ces produits.

60
 CHAPITRE IV

RADIOLYSE DES SOLUTIONS

 RADIOLYSE DES SOLUTIONS

La radiolyse est l’ ensemble des transformations chimiques provoquées dans la matière

par l’ absorption de l’ énergie d’ un rayonnement ionisant. Ces transformations sont dues aux
interactions des photons incidents avec les molécules de la matière irradiée. Elles sont
quantifiées par le rendement radiolytique G donné par l’ équation (éq. 1) (Fricke, 1966) en
µmol J-1 :
M
G= x 10 6 µmol J -1 (éq. 1)
D×
où ∆M est la concentration en mol/l (M), D est la dose et ρ la densité du milieu irradié.

Cette partie du manuscrit porte sur la description de la radiolyse de l’ eau, principal

constituant de la matière vivante, ainsi que celle du méthanol et de l’ éthanol, très largement
utilisés en physico-chimie comme solvants. Nous évoquerons également la radiolyse des
solutions (soluté/solvant).

Lorsqu’ un liquide, noté RH, est soumis à un rayonnement, l’ étape primaire est
l’ excitation ou l’ ionisation du solvant :

RH → RH ∗ ou RH +• + e - (26)
Il existe alors dans le milieu une distribution de molécules excitées (RH*) ou ionisées
(RH+). R peut représenter des groupements aussi divers que OH (pour l’ eau), OCH3 (pour le
méthanol), OCH2CH3 (pour l’ éthanol). Il est évident que les quantités de RH+ et d’ électrons
formées sont égales, et que la quantité de RH détruite est égale à la somme de RH* et de
paires (RH+, e-) formées, dites géminées.

61
 Les paires géminées, séparées par des distances courtes, subissent une attraction
coulombienne mutuelle, d’ autant plus forte que le cation géminé est fortement chargé, et une
partie d’ entre elles se recombine.
Dans les liquides polaires comme l’ eau et les alcools, les électrons perdent leur énergie
cinétique par collision avec les molécules du solvant en provoquant d’ autres ionisations et
excitations. Ils deviennent thermalisés puis solvatés ( e s− ). Cette étape de solvatation est
d’ autant plus lente que les molécules sont grandes et que la viscosité du liquide est élevée.
Dans le même temps, RH* et RH+ se dissocient ou réagissent avec RH pour donner
naissance à des radicaux libres. Cette étape dure un temps inférieur à la picoseconde pour
l’ eau et les alcools (méthanol et éthanol). La diffusion n’ a pas le temps d’ intervenir, c’ est
pourquoi les espèces primaires (radicaux libres et e s− ) créées par radiolyse sont initialement
groupées sur le lieu de formation, les grappes. Ceci favorise leurs réactions mutuelles qui sont
en compétition avec la diffusion.
étape suivante, au terme de la diffusion (stade homogène – 10-9s), le bilan typique
A l'
en produits radiolytiques (radicalaires et moléculaires) à la fin de cette étape est donc :

RH → e -s , RH 2+ • , H • , R • , H 2 , R 2 (27)

En chimie sous rayonnement, l’ eau a été, depuis les origines de cette discipline, le
solvant le plus étudié. Comme nous venons de l’ évoquer, l’ eau liquide irradiée se décompose
principalement en produits radicalaires notamment e -aq (électron hydraté), H•, HO• et

moléculaires H2 et H2O2 (Buxton, 1987 ; Cobut, 1994 ; Cobut, 1996 ; Jay-Gerin, 2000). Le
mécanisme permettant la formation de ces entités est présenté sur la Figure 18. Leurs
rendements radiolytiques, déterminés au stade homogène par les différents groupes de
recherche, sont donnés dans le Tableau 6.

62
 H2O Etape et durée
γ de vie

Excitation Ionisation
primaire

H2O* H2O+• + e- 10-17 à10-16 s

Dissociation H2O H2O prédiffusionnelle

H• + •OH •
OH + H3O+ e-aq 10-14 à10-12 s

diffusionnelle
Recombinaison

H2 + H2O2 H• + H2O 10-11 à10-7 s

Figure 18 : Radiolyse de l’ eau (Buxton, 1987 ; Cobut, 1994 ; Cobut,

1996 ; Jay-Gerin, 2000).

Tableau 6 : Rendements radiolytiques des espèces radicalaires et moléculaires

formées lors de la radiolyse de l’ eau (Buxton, 1987 ; Cobut, 1994 ; Cobut, 1996 ; Jay-
Gerin, 2000).

Espèce -
e aq H HO H2 H 2O 2
Re ndeme nt (µmol J -1) 0,27 0,06 0,27 0,04 0,07

63
 La radiolyse des alcools a également été un sujet très étudié. Le méthanol semble
particulièrement intéressant à divers égards. D’ une part ce solvant offre, par ses
caractéristiques physico-chimiques, la possibilité d’ établir des comparaisons utiles avec l’ eau.
D’ autre part, le méthanol peut être utilisé comme solvant pour étudier la radiolyse de
nombreux solutés non solubles dans l’ eau, tel que les flavonoïdes. Ceci nécessite une bonne
connaissance du mécanisme de radiolyse de ce solvant.
Les résultats obtenus par diverses équipes de recherche (Baxendale, 1972; Pikaev,
1989; Getoff, 1993) ont montré que le mécanisme des réactions se déroulant lors de
l’ irradiation du méthanol (Figure 19) est semblable à celui de l’ eau.

Etape et durée
CH3OH
de vie
γ

primaire

* CH3OH+•
CH3OH e- 10-16 s

CH3OH prédiffusionnelle
CH3OH

H2CO H2 CH3O• H• CH3O• + CH3OH+2 -

e s 10-12 s

CH3OH CH3OH

H• + CH3OH

diffusionnelle

CH3OH + •CH2OH
• •
CH2OH + H2 CH2OH + H2

H2CO + CH3OH (CH2OH)2 10-9 s

Figure 19 : Radiolyse du méthanol (Lind, 1979 ; Wargon, 1972; Shiotani, 1976;

Getoff, 1992 ; Getoff, 1993).

64
 Le passage du rayonnement engendre l’ ionisation primaire :

CH 3 OH → CH 3 OH + • + e - (28)
suivie par la réaction très rapide de transfert de proton (Shiotani, 1976) :

CH 3 OH +• + CH 3 OH → CH 3 OH 2+ + CH 3 O • (ou • CH 2 OH) (29)

Il a été montré que dans les premières étapes, CH3O• se forme préférentiellement par
rapport à •CH2OH (Wargon, 1972; Sargeant, 1974 ; Schlick, 1976 ; Shiotani, 1976; Lind,
1979 ; Getoff, 1993).
Quant à l’ électron éjecté, comme dans le cas de l’ ionisation de l’ eau, il perd son
énergie par ionisations et excitations successives et devient thermalisé, puis solvaté ( e s- ) :

e − + CH 3 OH → e -s (30)
Le temps d’ apparition de cette espèce radiolytique a été calculé par plusieurs groupes
de recherche (Taub, 1962 ; Chase, 1975; Wang, 1980; Hirata, 1990; Pépin, 1994; Shi, 1995).
Il est de l’ ordre de 6-10 ps.
Dans le même temps, les molécules excitées CH3OH* se dissocient et conduisent, soit
à la formation de H• et CH3O•, soit à la formation d’ hydrogène moléculaire et de
formaldéhyde :

CH 3 OH ∗ → CH 3 O • + H • (31)
H 2 + H 2 CO

En résumé, 10 ps après l’ absorption du rayonnement, le méthanol irradié devient un

mélange composé principalement de CH 3 OH +2 , de es- , de H• et de radicaux CH3O•,

équivalents des radicaux •OH formés lors de la radiolyse de l’ eau. Ces espèces radiolytiques
peuvent réagir ensuite soit avec le solvant soit entre elles pour donner d’ autres entités. Les
réactions suivantes sont alors envisageables :
(i) le radical oxydant CH3O• conduit, par réaction avec le méthanol, au radical isomère
•
CH2OH thermodynamiquement plus stable (Shiotani, 1976) :

CH 3 O • + CH 3 OH → • CH 2 OH + CH 3 OH (32)
La constante de vitesse de cette réaction est k = 2,6 x 105 M-1 s-1 (Ellison, 1972).

65
 (ii) e s- + CH 3 OH +2 → H • + CH 3 OH (33)
(k = 5,6 x 1010 M-1 s-1) (Baxendale, 1972)
suivie de la disparition de H• selon :

H • + CH 3 OH → H 2 + • CH 2 OH (34)
(k = 8,1 x 106 M-1 s-1) (Zhang, 1994).

(iii) le radical •CH2OH, peut lui aussi disparaître conduisant à des produits stables tels
que l’ éthylène glycol (CH2OH)2 et le formaldéhyde (H2CO) suivant les réactions de
dismutation (Getoff, 1993) :
•
CH 2 OH + • CH 2 OH → (CH 2 OH) 2 (35)
→ CH 3 OH + H 2 CO
(k = 1,4 x 109 M-1 s-1)

Pour le méthanol, comme pour l’ eau, il est nécessaire de connaître la durée de vie des
zones hétérogènes. On a constaté que le rendement de e s- initial est de l’ ordre de 0,35 µmol J-1
à 30 ps, puis décroît jusqu’ à environ 0,2 µmol J-1 à 1 µs (Sauer, 1965; Bronskill, 1970;
Baxendale, 1972; Johnson, 1977a; Kalachandra, 1983). L’ homogénéisation des espèces
présentes dans le milieu semble alors survenir vers 50 ns, ce qui est sensiblement plus rapide
que pour la radiolyse de l’ eau où l’ étape homogène commence vers 0,1 µs (Buxton, 1987;
Cobut, 1994).

Si l’ on continue à développer le parallèle avec la radiolyse de l’ eau, l’ électron solvaté

subit diverses réactions, et tout d’ abord, sa dismutation :

e s- + e s- → H 2 + 2CH 3 O - (36)
D’ après Fletcher et Richards, la valeur de la constante de vitesse de cette réaction est
de l’ ordre de 3,3 x 109 M-1 s-1 (Fletcher, 1971). En adoptant la même valeur, Johnson et
Salmon ont montré que cette réaction de dismutation de e s− ne peut pas intervenir d’ une façon
notable dans les zones hétérogènes (Johnson, 1977a ; Johnson, 1977b).

66
 En outre, les électrons solvatés peuvent réagir sur le solvant suivant la réaction :

e s- + CH 3 OH → H • + CH 3 O - (37)
(k =8,5 x 103 M-1 s-1) (Johnson, 1977a ; Johnson, 1977b).
Les électrons solvatés peuvent également réagir avec le radical •CH2OH (Johnson,
1977a ; Johnson, 1977b) :

e s- + • CH 2 OH → CH 3 O - (38)
(k = 8,0 x 109 M-1 s-1)
-
L’ ion résiduel CH3O peut intervenir dans une réaction de neutralisation acido-basique
donnant la formation de méthanol (Fowles, 1971) :

CH 3 O - + CH 3 OH +2 → 2CH 3 OH (k = 7,1 x 1010 M-1 s-1) (39)

En conclusion, 10-9 s après l’ absorption du rayonnement, le méthanol irradié devient
un mélange de produits moléculaires (H2, (CH2OH)2 et H2CO) et radicalaires ( e s- , H•, CH3O•

et •CH2OH). Ces espèces réagissent entre elles durant leur coexistence et, par conséquent, les
valeurs de leurs rendements radiolytiques ne sont pas indépendantes. Elles vérifient, à chaque
instant, une relation traduisant la décomposition radiolytique du méthanol (Getoff, 1993) :

G(e s- ) + 2G(H 2 ) + G(H • ) = G( • CH 2 OH) + 2G((CH 2 OH) 2 ) + 2G(H 2 CO) (éq. 2)

Étant donnée la complexité du mécanisme des réactions mises en jeu, il est difficile
d’ évaluer expérimentalement le rendement de chaque entité radiolytique pour un temps
précis, en particulier pour les espèces radicalaires e s- , H•, CH3O• et •CH2OH. En se reposant

sur les résultats obtenus par de nombreux auteurs (Baxendale, 1972 ; Shiotani, 1976 ; Lind,
1979 ; Getoff, 1992 ; Getoff, 1993 ; Zhang, 1994), les rendements radiolytiques
communément admis pour les différentes espèces formées lors de la radiolyse du méthanol
sont répertoriés dans le Tableau 7.

Tableau 7 : Rendements radiolytiques des espèces radicalaires et moléculaires formées lors

de la radiolyse du méthanol (Baxendale, 1972 ; Shiotani, 1976 ; Lind, 1979 ; Getoff, 1992 ;
Getoff, 1993 ; Zhang, 1994).

Espèce -
e s H CH3O CH2OH H2 H2CO (CH2OH)2
Rende ment (µmol J -1) 0,20 0,10 0,36 0,44 0,56 0,20 0,32

67
 Depuis les années soixante, les chimistes du domaine de l’ irradiation ont montré un
grand intérêt pour la radiolyse de l’ éthanol (Taub, 1962; Shiotani, 1976; Jin, 1996 ; Wang,
1999). En réunissant les données expérimentales disponibles dans la littérature, on a constaté
qu’ il y a une grande analogie avec la radiolyse du méthanol (Figure 20).

CH3CH2OH Etape et
durée de vie
γ

primaire

10-16 s
+•
CH3CH2OH* CH3CH2OH e-

CH3CH2OH
CH3CH2OH
pré-
diffusionnelle

CH3CHO H2 CH3CH2O• H• CH3CH2O• + CH3CH2OH2+ es - 10-12 s

CH3CH2OH H• + CH3CH2OH

diffusionnelle

CH3CH2OH + CH3•CHOH CH3•CHOH + H2

(CH3CHOH)2 CH3CHO + CH3CH2OH 10-9 s

Figure 20 : Radiolyse de l’ éthanol (Taub, 1962; Shiotani, 1976; Jin, 1996 ; Wang, 1999).

68
 Quand l’ éthanol est soumis aux rayonnements γ, les réactions suivantes se produisent
initialement :

CH 3 CH 2 OH → CH 3 CH 2 OH +• + e - (40)

CH 3 CH 2 OH → CH 3 CH 2 OH ∗ (41)

L’ électron éjecté, comme son homologue issu de la radiolyse du méthanol, perd son
énergie par excitations et ionisations successives et devient un électron solvaté ( e s- ) :

e − + CH 3 CH 2 OH → e s− (42)

Les cations CH3CH2OH+ réagissent très rapidement avec les molécules d’ éthanol et
conduisent à la formation d’ autres espèces radiolytiques :

CH 3 CH 2 OH +• + CH 3 CH 2 OH → CH 3 CH 2 O • + CH 3 CH 2 OH +2 (43)

CH 3 CH 2 OH +2 + e s- → CH 3 CH 2 OH + H • (44)

Il est possible de résumer la radiolyse de l’ éthanol au stade initial par :

CH 3 CH 2 OH → CH 3 CH 2 OH 2+ , e s- , H • , CH 3 CH 2 O • (45)
Ce sont ces espèces primaires qui contribuent par la suite à la formation d’ autres
entités radiolytiques, soit en réagissant entre elles, soit avec le solvant.
Par exemple, H• réagit avec une molécule d’ éthanol et conduit à la formation du
radical 1-hydroxyéthyl (CH3•CHOH : HER) et d’ une molécule d’ hydrogène :

H • + CH 3 CH 2 OH → CH 3 • CHOH + H (46)
(k = 1,8 x 107 M-1 s-1)
Une autre voie de formation de HER est la réaction d’ isomérisation du radical éthoxy :

CH 3 CH 2 O • + CH 3 CH 2 OH → CH 3 • CHOH + CH 3 CH 2 OH (47)
(k = 1,1 x 106 M-1 s-1)

En suite, par recombinaison de deux radicaux HER, on a formation du 2,3-butandiol et

de l’ acétaldéhyde :

69
 CH 3 • CHOH + CH 3 • CHOH → (CH 3 CHOH) 2 (48)
CH 3 CHO + CH 3 CH 2 OH
(k = 7,5 x 108 M-1 s-1)

En résumé, à l’ étape homogène (10-9 s) l’ éthanol irradié se décompose en espèces

radicalaires (e-s, H•, CH3CH2O•, CH3•CHOH) et moléculaires (H2, (CH3CHOH)2, CH3CHO).
Ces différentes espèces sont quantifiées par leurs rendements radiolytiques (Tableau 8).

Tableau 8 : Rendements radiolytiques des espèces radicalaires et moléculaires formées lors

de la radiolyse de l’ éthanol (Taub, 1962; Shiotani, 1976; Jin, 1996 ; Wang, 1999 ; Sun,
1999).

Espèce -
e s H CH3CH2O CH3 CHOH H2 CH3CHO (CH3 CHOH)2
-1
Rende ment (µmol J ) 0,17 0,15 0,30 0,38 0,47 0,24 0,21

Lorsque le solvant contient un soluté, celui-ci intervient dans la radiolyse. Si le soluté

est dilué, il ne réagit qu’ en phase homogène. Mais s’ il est concentré, il peut intervenir dans
l’ étape diffusionnelle. Si le soluté est encore plus concentré, il peut être directement ionisé par
le rayonnement, c’ est ce qu’ on appel l’ effet direct.
L’ ensemble des réactions d’ oxydo-réduction entre le soluté et les espèces radiolytiques
du solvant se traduit par le rendement de disparition du soluté, noté G(-S) et donné par la
formule (éq. 1). La courbe représentant l’ évolution de cette grandeur en fonction de la
concentration du soluté (courbe de dilution) a, dans la plupart des cas, l’ allure indiquée sur la
Figure 21 (Ferradini, 1983).

70
 G(-S)

[S]

Figure 21 : Courbe de dilution

On observe que le rendement croît d’ abord avant d’ atteindre un plateau. Ceci est dû à
la capture de l’ ensemble des espèces radiolytiques du solvant, par le soluté.

71
 PARTIE
EXPERIMENTALE
 CHAPITRE V

MATERIELS ET METHODES
 MATERIELS ET METHODES

I.1. APPAREILLAGE

Nous avons utilisé un irradiateur expérimental de type Oris installé à la Faculté de

Pharmacie de Limoges en 1987. Il est constitué du :
une chambre d’ irradiation : elle est sous forme d’ un cylindre en acier de hauteur de
30 cm et de diamètre 12 cm. C’ est ici que les produits à irradier sont chargés.
une partie fixe : dite corps de l’ irradiateur, où sont placées les sources de Cobalt 60.
une partie mobile : appelée ascenseur, destinée à effectuer par coulissement les
opérations d’ ionisation des produits.
un dispositif de chaîne et roues dentées : entraîné par un moteur, il permet la montée
et la descente de l’ ascenseur.
un dispositif de contrepoids : maintient l’ équilibre dans toutes les positions et assure
la sécurité de l’ opérateur pendant l’ introduction ou la récupération des produits irradiés.
une armoire de commande contenant :
un commutateur à clé « arrêt – marche »
une minuterie permettant de programmer le temps d’ irradiation.
une commande montée – descente de l’ ascenseur avec possibilité d’ arrêt
momentané.
une commande d’ arrêt d’ urgence qui permet la mise hors tension de
l’ appareil.

I.2. CHOIX DES CONCENTRATIONS

Nous avons vu (chapitre IV) que si la concentration du soluté est inférieure à 7 x 10-3
M, celui-ci ne réagit qu’ avec les espèces radiolytiques du solvant présents dans l’ étape
homogène. Les concentrations étudiées sont alors : 5 x 10-5 M, 10-4 M, 2,5 x 10-4 M, 5 x 10-4
M, 10-3 M et 5 x 10-3 M.

73
I.3. MODE OPERATOIRE

Les différents flavonoïdes sont solubilisés dans le méthanol, l’ éthanol ou des mélanges
eau/alcools. Ensuite, 1 ml de chaque solution est irradié, dans des tubes en plastique fermés
par un septum, avec des doses allant de 0,2 kGy jusqu’ à 20 kGy. Les solutions ne sont pas
désaérées. Ce mode opératoire est appliqué pour toutes les concentrations précédemment
mentionnées.
Pour l’ étude de la radiolyse dans des mélanges eau/alcools, quatre pourcentages sont
utilisés : 10/90%, 15/85%, 20/80% et 25/75%.

II.1. APPAREILLAGE

Les solutions irradiées sont analysées en utilisant la Chromatographie Liquide à Haute

Performance (CLHP). Nous avons utilisé un appareil de marque Waters équipé avec :
une pompe quaternaire modèle 600.
un détecteur UV/visible à barrette de diodes PDA 996.
un contrôleur modèle 600.

Le système CLHP est combiné avec un logiciel (Millennium) qui permet de gérer la
phase mobile de l’ injection en cours, d’ analyser et stocker les résultats ainsi obtenus.

II.2. MODE OPERATOIRE

Pour chaque flavonoïde (quercétine, morine, kaempférol, galangine, myricétine,

lutéoline, apigénine, chrysine, taxifoline, éridictyol, catéchine, naringénine, rutine et
astragaline), 20 µl sont injectés avant et après irradiation dans le système CLHP en utilisant
une colonne analytique C18 µBondapack (10µm : granulométrie des particules, 250 x 4,6
mm : longueur x diamètre).

La phase mobile est constituée par du méthanol (A) et de l’ eau contenant 1% d’ acide
acétique (B).

74
 Les analyses sont effectuées en utilisant le gradient suivant :

Temps (min) Débit (ml/min) A (%) B(%)

0 1 20 80
40 1 80 20

Pour la galangine, nous avons adopté un protocole différent, avec un gradient allant de
30% A jusqu’ à 90% A.

La purification des produits irradiés est effectuée à l’ aide du même système CLHP
mais en utilisant une colonne semi-préparative C18 µBondapack (10µm : granulométrie des
particules, 100 x 25 mm : longueur x diamètre).
La phase mobile est la même que celle utilisée avec la colonne analytique.
Le gradient adopté est le suivant :

Temps (min) Débit (ml/min) A(%) B(%)

0 5 20 80
60 5 80 20

Les produits de radiolyse sont identifiés par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
et par spectroscopie de masse couplée à un système CLHP (LC-MS).

IV.1. RMN

Les analyses RMN sont réalisées sur un spectromètre Bruker 400 MHz DPX Avance
Les spectres proton (1H) et carbone (13C) sont mesurés dans le méthanol deutéré
(CD3OD) en utilisant le tétraméthylsilane comme standard interne.

75
 Les positions des différents protons et carbones sont assignées à partir des spectres
mono et bidimensionnel :
COSY : 1H – 1H Correlation Spectroscopy,
HMQC : 1H – 13C Heteronuclear Multiple Quantum Coherence,
HMBC : 1H – 13C Heteronuclear Multiple Bond Correlation.

IV.2. LC-MS

Le couplage LC-MS est constitué du module de séparation Alliance Waters 2690 relié
à un détecteur UV à barrettes de diodes PDA 996 de chez Waters et du spectromètre de masse
ZMD de chez Micromass muni d’ une source d’ ionisation à pression atmosphérique
fonctionnant en mode électrospray. L’ ensemble est piloté par un ordinateur grâce au logiciel
Masslynx .
La séparation est réalisée avec une colonne Nucléosil C18 (3,5 µm : granulométrie des
particules, 100 x 2 mm : longueur x diamètre), en adoptant un mode isocratique de 40% A et
60% B à un débit de 0,2 ml/min pendant 25 min. Le volume injecté est 2 µl.
L’ acquisition en spectrométrie de masse se fait en électrospary positif (ES+) et
électrospray négatif (ES-) avec une tension du cône maintenue à 40 V pour ES+ et – 40 V pour
ES-. Le débit de gaz de nébulisation (N2) est fixé à 400 l/h. L’ acquisition des spectres se fait
en mode courant ionique total.

L’ activité antioxydante des composés étudiés au cours du présent travail est évaluée en
mesurant leur capacité à inhiber le radical superoxyde ( O •- ) et le radical 1,1-diphényl-2-
2

pycril-hydrazyl (DPPH).
L’ activité anti-superoxyde est mesurée par chimiluminescence, alors que l’ activité
anti-DPPH est mesurée par Résonance Paramagnétique Electronique (RPE).

76
V.1. ACTIVITE ANTI-SUPEROXYDE ET CHIMILUMINESCENCE

V.1.1. APPAREILLAGE

L’ appareil utilisé est un luminomètre de type LUMAT LB 9507 (EG & Berthold). Il
est constitué de :
Deux injecteurs automatiques : leur rôle est de faciliter le travail du manipulateur en
injectant automatiquement deux réactifs dans le milieu réactionnel. Les injections des autres
réactifs se font manuellement à l’ aide de micropipettes.
Une chambre de mesure : c’ est dans celle-ci, parfaitement étanche à toute lumière
extérieure, que l’ échantillon est placé. Elle doit être comme une chambre noire car c’ est ici où
les réactions se déroulent.
Un détecteur de lumière : c’ est un photomultiplicateur qui a pour rôle de convertir
les photons formés dans la chambre de mesure en impulsions électriques. Ces impulsions sont
comptabilisées en unité relative de lumière (URL).
L’ appareil est couplé à un ordinateur, et les résultats sont traités et affichés par un
logiciel de traitement des données.

V.1.2. PRINCIPE

La chimiluminescence, comme son nom l’ indique, est l’ étude de réactions chimiques

accompagnées par une émission de la lumière. La technique est basée sur l’ utilisation d’ un
luminophore, molécule luminescente qui, en réagissant avec un radical libre, émet de la
lumière.
Dans notre cas, nous avons utilisé la lucigénine comme luminophore. Le radical
superoxyde, quant à lui, est généré par le système enzymatique xanthine/xanthine oxydase
précédemment décrit (chapitre I, réaction 3) :

Xanthine oxydase
Acide urique + 2 O •2- + 2H
+
Xanthine + 2O2 + H2O

L’ introduction de la lucigénine dans ce milieu réactionnel, va entraîner sa réaction

avec le radical superoxyde et conduire à la formation d’ un produit intermédiaire, un

77
dioxéthane, qui se décomposera ensuite en deux molécules N-méthylacridone sous sa forme
excitée (Figure 22).

CH3 CH3
+
N N

C
+ O •2−

+ +
N N

CH3 CH3

Lucigénine
O •2−

CH3

N
CH3

N
O
(x 2)
O

O
(430 nm) N

CH3

N-méthylacridone Dioxéthane

Figure 22 : Mécanisme de la réduction de la lucigénine par le radical superoxyde.

Lorsque le N-méthylacridone se stabilise en passant de l’ état excité à l’ état

fondamental, il émet des photons sous forme d’ onde lumineuse. C’ est cette quantité de
lumière que l’ on mesure à l’ aide du luminomètre. Elle est proportionnelle au nombre de
radicaux superoxydes présents dans le milieu réactionnel. La valeur enregistrée par le
luminomètre est considérée alors comme le signal de « référence ».

78
 Pour mesurer l’ activité anti-superoxyde d’ un composé, on l’ introduit dans la solution
contenant la lucigénine et le système générateur du radical superoxyde. Le composé peut agir
selon deux mécanismes. D’ une part, en inhibant l’ enzyme et diminuant ainsi le nombre de
radicaux formés. D’ autre part, par piégeage direct avec radicaux superoxydes en compétition
avec la lucigénine. La nouvelle valeur enregistrée par le luminomètre est considérée comme le
signal « test ».
En absence d’ enzyme (xanthine oxydase), le luminomètre détecte une lumière
résiduelle, le signal « bruit de fond ».

V.1.3. MODE OPERATOIRE

Dans un tube à hémolyse de 12 mm de diamètre et de 75 mm de hauteur, nous avons

mélangé :
400 µl de PBS (pH = 7,4, NaCl [120 mM], KCl [2,7 mM], tampon phosphate [10
mM]).
5 µl du composé à tester (pour le signal test) ou de méthanol (pour le signal
référence). Différentes concentrations du composé sont testées.
20 µl de xanthine oxydase à 0,5 U/ml.
Le tube est immédiatement placé dans la chambre de mesure puis nous avons rajouté,
grâce aux deux injecteurs automatiques :
60 µl de xanthine à 2 mM.
50 µl de lucigénine à 1 mM.
Ce milieu réactionnel est resté incubé dans la chambre de mesure pendant 90
secondes, puis la mesure est effectuée sur une durée de 60 secondes.

V.1.4. CALCUL DU POURCENTAGE D’ INHIBITION

L’ activité antioxydante d’ un produit est exprimée en pourcentage d’ inhibition en

utilisant la formule suivante :
réf - test
inhibition =
% d' x 100 (éq. 4)
réf - bdf
Où, réf, test et bdf représentent respectivement le signal de « référence », le signal « test » et
le signal « bruit de fond ».

79
 L’ activité d’ un antioxydant peut être caractériser par une grandeur appelée la IC50 :
concentration de l’ antioxydant qui permet l’ inhibition de 50% du signal de référence.
La IC50 permet de comparer l’ activité de différents composées antioxydants. Il est à
noter que plus la IC50 est petite plus l’ antioxydant a une activité plus importante.

Pour déterminer la IC50, nous avons calculé dans un premier temps le % d’ inhibition
pour différentes concentrations. Ensuite, en utilisant le logiciel Winreg, l’ équation du tracé
qui correpond le mieux aux points expérimentaux est déterminée. C’ est à partir de cette
équation que la IC50 est calculée.

V.2. ACTIVITE ANTI-DPPH ET RESONANCE PARAMAGNETIQUE

ELECTRONIQUE

Ce test est basé sur la mesure de la capacité des produits étudiés au cours de notre
travail à inhiber le radical DPPH (1,1-diphényl-2-pycril-hydrazyl). Une telle étude est
effectuée en utilisant la résonance paramagnétique électronique (RPE). Découverte en 1945
par Zavoïsky, la RPE est une technique spectroscopique qui permet de détecter les espèces
radicalaires.

V.2.1. PRINCIPE DE LA RPE

Basée sur les principes de la mécanique quantique, la technique consiste à mesurer

l’ absorption d’ une onde électromagnétique traversant une solution soumise à un champ
magnétique.
En mécanique quantique, un électron est caractérisé par sa masse (me), sa charge (e)
ρ ρ
son moment magnétique ( µ e ) et son moment angulaire intrinsèque (vecteur de spin, noté S et

1
de norme égale ). A ce dernier est associé un nombre quantique ms dont les valeurs sont
2
fixées par les lois de la mécanique quantique, à savoir :
ρ ρ
− S ≤ ms ≤ S (éq. 5)
ρ ρ
Dans cette inégalité, S représente la norme de S .

80
 Sachant que la différence entre deux valeurs de ms est égale 1, celui-ci ne peut prendre
1 1
que les valeurs : − et .
2 2
ρ
Le moment magnétique est lié à S par l’ équation :
ρ ρ
µ e = - ge. .S (éq. 6)
Où :
ge est le facteur de Landé (2,0023)
β est le magnéton de Bohr (9,27 x 10-24 A.m2).

ρ
Lorsque l’ électron est placé dans un champ magnétique B , il se trouve animé autour
de l’ axe d’ orientation de celui-ci avec une énergie donnée par la relation :
ρ ρ ρ ρ
E = - µ e x B = ge S x B (éq. 7)
ρ ρ
Sachant que ms représente la projection de S sur l’ axe d’ orientation de B , alors :
ρ
E = g e m s B , où B est le module de B
On déduit que l’ énergie d’ un électron soumis à un champ magnétique peut prendre,
selon la valeur de ms, deux valeurs égales et de signes opposés :
1
E1 = - ge B (éq. 8)
2
1
E2 = + ge B (éq. 9)
2
La transition de l’ électron entre ces deux états énergétiques peut être stimulée par
l’ application d’ un champ de radiofréquence (d’ énergie hν) perpendiculairement au champ
ρ
magnétique B.
Dans le cas où hν est égale à la différence d’ énergie, ∆E = E2 – E1 = ge β B, se produit
le phénomène de résonance. Ainsi, la mesure de ∆E est la base de la RPE.

Pour faire apparaître la résonance, on peut procéder de deux manières :

on garde une valeur fixe pour le champ magnétique B et on fait varier la fréquence
de l’ onde électromagnétique.
on fixe une valeur pour la fréquence de l’ onde électromagnétique et on fait varier le
champ magnétique.

81
 V.2.2. LE RADICAL DPPH

Ce radical (Figure23), stable au cours du temps, est largement utilisé pour évaluer
l’ activité antioxydante d’ un composé X (Cotelle, 1996 ; Trouillas, 2003).

O 2N

N N NO 2

O 2N

Figure 23 : Structure chimique du radical DPPH

Le spectre caractéristique du radical DPPH est représenté sur la Figure 24.

DPPH

DPPH+ [X]1

DPPH+[X]2
[X]2 > [X]1 10G

Figure 24 : Evolution du spectre RPE du radical DPPH en fonction de la

concentration antioxydant X.

82
 Si le composé X a une activité anti-DPPH, une réduction du nombre de radicaux aura
lieu, entraînant ainsi une baisse mesurable de l’ amplitude du spectre RPE. Plus le composé
antioxydant est concentré plus la baisse du signal est importante (Figure 24).
La double intégrale du signal, quantité proportionnelle au nombre de radicaux présents
dans la solution, est utilisée pour une interprétation quantitative des spectres.
Nous avons utilisé un appareil de type BRUCKER ESP 300E pouvant délivrer un
champ magnétique de 3500 G.

V.2.3. MODE OPERATOIRE

Dans un tube en plastique, 50 µl d’ une solution éthanolique de DPPH (5 x 10-4 M)

sont mélangés avec 50 µl du composé à tester. Le mélange réactionnel est agité
vigoureusement à l’ aide d’ un agitateur électrique pendant 10 secondes. Le contenu est ensuite
transféré dans un micro-tube en quartz à l’ aide d’ une micropipette puis placé dans la cavité de
la RPE. 3 min après, les spectres sont enregistrés sur le spectromètre en utilisant les
paramètres suivants :
modulation de fréquence : 100 kHz.
fréquence micro-onde : 9,78 GHz.
puissance micro-onde : 4 mW.
modulation d’ amplitude : 1, 97 G.
temps de conversion : 5,12 ms.
constante de temps : 10,24 ms.

Pour chaque composé à tester, cette manipulation est effectuée avec différentes
concentrations et à température ambiante, chaque mesure est réalisée en 3 fois.

Le pourcentage d’ inhibition est calculé en utilisant la double intégrale du signal RPE

et à partir de l’ équation :
réf - test
inhibition =
% d' x 100 (éq. 10)
réf - bdf
Où « réf » est le signal de référence (DPPH + solvant), « test » est le signal test (DPPH
+ composé à tester), et « bdf » est le signal bruit de fond.

83
 En évaluant la capacité d’ un composé X à piéger le radical superoxyde, nous avons
utilisé comme générateur de radicaux, le système enzymatique xanthine/xanthine oxydase. En
réalité, la réaction entre le radical et le produit X n’ est pas la seule qui peut avoir lieu. Le
composé X peut réagir également avec l’ enzyme et conduire à son inactivation, ce qui
entraîne également une diminution du nombre de radicaux. Alors, il est important de mesurer
la capacité de nos composés à inhiber la xanthine oxydase.

VI.1. METHODE

Après l’ oxydation de la xanthine, il y a production d’ acide urique (réaction 3, chapitre

I), molécule caractérisée par un maximum d’ absorption à 290 nm. Un inhibiteur de la
xanthine oxydase dans le milieu réactionnel aura pour effet de diminuer la concentration en
acide urique. La capacité de l’ antioxydant à inhiber la xanthine oxydase est alors évaluée en
mesurant la quantité d’ acide urique formé. Cette mesure est effectuée par spectrophotomètre.
Dans un premier temps, nous mesurons un signal témoin avec uniquement l’ enzyme.
Ensuite, nous rajoutons le composé à tester et nous suivons l’ évolution du signal témoin. Les
courbes obtenues représentent l’ évolution de la formation d’ acide urique en fonction du
temps.

VI.2. MODE OPERATOIRE

La manipulation est réalisée en deux temps :

• Pour le signal témoin, elle est effectuée seulement avec la xanthine oxydase
pour mesurer la production d’ acide urique.
• Pour le signal test, le composé à tester est introduit.
Les mesures débutent 2 min après le mélange des réactifs, et nous étudions l’ évolution
de la densité optique d’ acide urique en fonction du temps pendant une minute. Nous avons
obtenu des droites.

84
 Pour comparer l’ activité inhibitrice des différents produits testés, nous avons calculé
pour chacun la IC50, à partir des pentes des droites précédentes, de la même manière que
précédemment (voir test anti-superoxyde) en se basant sur l’ équation suivante :

pente du témoin - pente du test

inhibition =
%d' x 100 (éq. 11)
pente du témoin
Où, « témoin » est le signal témoin (obtenu uniquement avec la xanthine oxydase) et « test »
est le signal test (obtenu en présence de l’ antioxydant). Les mesures sont effectuées trois fois.

La modélisation moléculaire consiste, en se basant sur les formalismes de la

mécanique classique et de la mécanique quantique, à minimiser l’ énergie de la molécule et
obtenir ainsi les propriétés physico-chimiques correspondant à la conformation la plus stable.

VII.1. LES METHODES UTILISEES EN MODELISATION MOLECULAIRE

Il existe deux grands types de méthodes en modélisation moléculaire : les méthodes de

mécanique moléculaire basées sur le mouvement des noyaux et les méthodes de chimie
quantique basées sur le mouvement des électrons.

VII.1.1. LA MECANIQUE MOLECULAIRE

Dans ce cas, la molécule est considérée comme un ensemble de sphères (les atomes)
connectées entre elles par des ressorts (les liaisons). Le mouvement des électrons est alors
négligé et les interactions intermoléculaires (élongation des liaisons, angles de torsion,
liaisons électrostatiques, liaisons de Van Der Waals) sont décrites par les lois de la mécanique
classique. L’ ensemble des constantes de forces décrivant ces interaction constitue ce que l’ on
appelle le champ de force. Il existe de nombreux champs de force, chacun construit pour des
types d’ interaction bien précis. Certains décrivent correctement les liaisons hydrogène,
d’ autres décrivent précisément les interactions existantes dans les protéines (AMBER,
CHARMM, …), etc. Les potentiels d’ interaction sont issus de la mécanique classique. Il faut
noter que la minimisation de l’ énergie est calculée à 0 K. Pour prendre en compte le

85
paramètre température, on utilise les méthodes de dynamique moléculaire. Dans ce cas, on
résout l’ équation fondamentale de la dynamique :
dv
m = ΣF (éq. 12)
dt
où Σ F est calculée avec les potentiels définis par le champ de forces choisi et v est la vitesse
des atomes (vibration, rotation).

Les méthodes de mécanique moléculaire ne donnent aucune information concernant

les propriétés électroniques de la molécule. Cependant, elles donnent de très bons résultats
pour les conformations avec un coût de calcul moindre.

VII.1.2. LA MECANIQUE QUANTIQUE

Ici, à la différence de la mécanique moléculaire, seul le mouvement des électrons est

pris en compte en considérant l’ ossature des noyaux fixes. Ce découplage du mouvement des
noyaux et des électrons est possible parce que, les noyaux étant beaucoup plus lourds, on peut
les considérer fixes lorsque les électrons se déplacent. Ceci constitue l’ approximation de
Born-Oppenheimer. Le mouvement des électrons ne peut pas être traité par la mécanique
classique, il faut utiliser les formalismes de la mécanique quantique et résoudre l’ équation de
Schrödinger :

H Ψ(r, R) = E Ψ(r, R) (éq. 13)

H est l’ opérateur Hamiltonien, il contient l’ opérateur énergie cinétique plus tous les
opérateurs liés aux interactions électrons-noyaux et électrons-électrons.
E est l’ énergie totale de la molécule.
Ψ est la fonction d’ onde décrivant l’ ensemble des électrons.

Pour résoudre cette équation, il existe différents types d’ approximation.

Les méthodes semi-empiriques, par exemple, négligent certains types d’ interaction

comme les interactions à longue distance (cette distance pouvant varier selon le degré
d’ approximation). Ces méthodes sont moins coûteuses en terme de temps de calcul que les
méthodes ab initio et DFT (Density Functional Theory), et certaines sont connues pour

86
donner des résultats proches de l’ expérience. Nous utiliserons ici la méthode AM1 (Dewar,
1985).

VII.2. CONFORMATION

Pour obtenir la conformation la plus stable, il faut déterminer l’ énergie la plus faible. Il
faut alors étudier l’ évolution de l’ énergie en fonction de l’ ensemble des coordonnées d’ espace
de la molécule. On parle de coordonnées de réaction ; leur nombre dépend du nombre de
degrés de liberté dans la molécule. En général, on s’ intéresse surtout aux angles de torsion, les
angles et les distances étant plus aisément optimisés. On obtient alors une courbe de potentiel
comme le montre la Figure 25. C’ est de cette manière que nous avons procédé avec les
flavonols pour lesquels nous avons observé la rotation du cycle B.

Structure de départ
E

Minimum
énergétique local

Conformation la
plus stable
Angle de torsion

Figure 25 : Courbe de potentiel.

La conformation la plus stable correspond au puits de potentiel le plus profond, « le

minimum absolu ».
Lorsqu’ il existe deux angles de torsion à optimiser, il faut réaliser des courbes en trois
dimensions, au delà, l’ interprétation des courbes de potentiel est plus compliquée. On peut
alors explorer l’ ensemble des courbes de potentiel à l’ aide de la dynamique moléculaire. C’ est
ce que nous avons choisi de faire avec les depsides pour lesquels le nombre d’ angles de
torsion à faire varier est trop important. Nous avons, en fait, utilisé la méthode de recuit
simulé avec le champ de forces esff.

87
 Cette méthode consiste, dans une première étape, à chauffer la molécule jusqu’ à une
température assez élevée (800 K) pour que les barrières d’ énergie qui séparent les minima
locaux et le minimum globale puissent être franchies. Ensuite, on refroidit la molécule jusqu’ à
une température de 300 K, et ceci par paliers successifs de 50 K. Chaque température est
maintenue durant 100 ps, ce qui constitue un temps suffisant pour être représentatif. Ensuite,
pour chaque étape, nous traçons le graphe de l’ énergie en fonction du temps. La valeur la plus
basse de l’ énergie est ainsi enregistrée et la conformation correspondante est retenue pour
l’ étape suivante. Ces étapes sont répétées plusieurs fois afin de vérifier que l’ on retombe bien
sur la même conformation. La conformation obtenue à 300 K est à nouveau optimisée en
mécanique moléculaire et en chimie quantique avec la méthodes AM1. Les calculs de
mécanique et de dynamique moléculaire sont réalisés dans le module Discover 3 de Insight II
v. 2000, et les calculs de chimie quantique sont effectués avec le programme MOPAC.

VII.3. RAPPELS SUR LES PROPRIETES ELECTRONIQUES DES MOLECULES ET

DES RADICAUX

Les électrons d’ une molécule sont autour des noyaux dans des orbitales. Selon la loi
de Pauli, on ne peut loger sur ces couches électroniques que deux électrons, un de spin -1/2 et
l’ autre de spin +1/2 (Figure 26).

Energie Energie

LUMO
SOMO

HOMO

Molécule Radical

Figure 26 : Représentation des niveaux énergétiques.

88
 Trois orbitales moléculaires vont retenir notre attention dans la suite de ce manuscrit,
parce qu’ elles sont impliquées dans les réactions redox qui nous intéressent.
La HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital), c’ est la dernière orbitale
moléculaire occupée dans un système à couches fermées.
La LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital), c’ est la première orbitale
moléculaire inoccupée dans un système à couches fermées.
La SOMO (Singlet Occupied Molecular Orbital), c’ est l’ orbitale moléculaire qui
contient l’ électron célibataire d’ un système à couche ouverte, un radical.
Elles sont impliquées de différentes manières dans les mécanismes redox régissant les
activités anti-oxydantes.
Considérons un flavonoïde antioxydant, noté ROH, qui réagit avec un radical libre
(par exemple, •OH). Deux voies réactionnelles sont alors possibles :
soit par transfert d’ électron :
ROH + • OH → ROH + + - OH (49)
soit par transfert d’ un atome d’ hydrogène,
ROH + • OH → RO • + H 2 O (50)

Dans le premier cas, l’ aptitude du flavonoïde à céder un électron est régie par le
potentiel d’ ionisation, c’ est à dire l’ énergie de la HOMO. De plus, la distribution de la
HOMO sur l’ antioxydant permet de connaître les sites où peuvent se produire ce transfert
d’ électrons. Les paramètres de la HOMO sont calculés à partir de la conformation la plus
stable avec la méthode AM1. La répartition spatiale de la HOMO sera représentée comme un
ensemble de boules dont le rayon dépend des coefficients LCAO (Linear Combination of
Atomic Orbitals) calculés. La représentation est réalisée avec le logiciel ZOA.

Au contraire, si la réaction se fait par transfert d’ un atome d’ hydrogène, l’ activité

antioxydante est évaluée par le calcul de l’ énergie de dissociation ou BDE (Bond Dissociation
Energy) de la liaison O-H. On calcule la BDE pour chaque groupement OH comme la
différence entre la chaleur de formation de l’ antioxydant et celle du radical RO• formé après
la réaction (77). Les deux énergies sont calculées par la méthode AM1 et ceci pour chaque
groupement OH présent sur l’ antioxydant. Plus la BDE est petite, plus le groupement a une
forte capacité à céder son atome d’ hydrogène.

89
 La SOMO est également impliquée dans cette réaction ; en effet, après le transfert
d’ hydrogène, il se forme le radical RO•. La répartition spatiale de la SOMO montre la
délocalisation de l’ électron célibataire. Plus la SOMO est délocalisée, plus le radical est
stable, et plus on confirme a posteriori que le transfert d’ hydrogène correspondant est un
événement énergétiquement favorable.

90
 CHAPITRE VI

RADIOLYSE DES FLAVONOÏDES DANS LE METHANOL ET

L’ ETHANOL
 RADIOLYSE DES FLAVONOÏDES DANS LE METHANOL ET
L’ ETHANOL

La capacité des flavonoïdes à piéger les radicaux hydroxyle et superoxyde, précurseurs

du stress oxydatif, a fait l’ objet de nombreuses études adoptant différentes approches (Cotelle,
1996 ; Rice-Evans, 1995 ; Cos, 1998 ; Jovanovic, 1994 ; Pietta, 2000). L’ une d’ elles,
développée par Jovanovic et ses collaborateurs, utilise la radiolyse pulsée (Jovanovic, 1994).
Il s’ agit d’ irradier des flavonoïdes dans des solutions aqueuses en se plaçant à un pH basique
pour augmenter la solubilité de ces molécules. Cette étude concerne, par conséquent, la
réactivité des flavonoïdes avec les espèces radicalaires issues de la radiolyse de l’ eau.
Il nous est apparu important d’ étudier également le comportement des flavonoïdes
face aux espèces radiolytiques des alcools, notamment celles formées durant la radiolyse du
méthanol et l’ éthanol. C’ est cette étude que nous présenterons dans le présent chapitre.
Quatorze flavonoïdes parmi lesquels des flavonols, des flavones, des dihydroflavonols, des
flavanones, des flavan-3-ols et des flavonoïdes glycosides ont été irradiés séparément dans le
méthanol et l’ éthanol.

I.1. RADIOLYSE DE LA QUERCETINE

Nous avons irradié des solutions de quercétine dissoute dans le méthanol avec
différentes concentrations (5 x 10-5 M, 1 x 10-4 M, 2,5 x 10-4 M, 5 x 10-4 M, 1 x 10-3 M, 5 x 10-
3
M) et différentes doses allant de 0,2 kGy jusqu’ à 20 kGy (Marfak, 2002 ; Marfak, 2003a).
Les solutions n’ étaient pas désaérées et le débit de dose était 0,22 Gy/s. Ces solutions ont
ensuite été analysées par CLHP.
Sur la Figure 27, nous avons reporté les chromatogrammes d’ une solution de
quercétine à 5 x 10-3 M non irradiée (le contrôle) et irradiée avec les doses suivantes : 2 kGy,

91
4 kGy, 6 kGy, 8 kGy et 14 kGy. Nous observons que le pic de quercétine (temps de rétention :
tr = 30 min) diminue en fonction de la dose absorbée. 50% de quercétine est décomposée à
une dose de 6 kGy, et la dégradation complète est effective pour 14 kGy.

En ce qui concerne les faibles concentrations (< 10-4 M), une dose de 4 kGy (pour 10-4
M) voire 2 kGy (pour 5 x 10-5 M) est suffisante pour causer une dégradation totale de la
quercétine (Figure 28). Nous constatons que cette radiolyse est un processus qui dépend à la
fois de la concentration et de la dose.

La disparition du pic de quercétine est accompagnée de l’ apparition de nouveaux pics

indiquant la formation de nouveaux composés (Figure 27). La surface de chaque pic
augmente, d’ une part, quand celle de la quercétine diminue, et d’ autre part, en fonction de la
dose appliquée. Parmi ces produits de radiolyse, QM1 (tr = 27 min) est déterminé comme
étant le produit majoritaire de la dégradation de la quercétine. Notons également la présence
de composés minoritaires formés en faibles concentrations, tel que QM2 (tr = 12 min).

92
 quercétine
0,6 0 kGy 0,6
quercétine
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
0,4 0,4

0,2 0,2

QM2 QM1
0,0 0,0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,6 4 kGy 0,6 6 kGy

Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

quercétine
0,4 0,4

quercétine
0,2 0,2
QM1
QM1

QM2 QM2

0,0 0,0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,6 8 kGy 0,6 14 kGy

QM1
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,4 0,4

QM1

0,2 quercétine 0,2

QM2
QM2
1
quercétine
0,0 0,0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

Figure 27 : Chromatogrammes obtenus par CLHP, enregistrés à 280 nm, d’ une

solution de quercétine (5 x 10-3 M) avant irradiation et après irradiation avec des
doses de 2 kGy, 4 kGy, 6 kGy, 8 kGy et 14 kGy. Le débit de dose a une valeur
de 0,22 Gy/s.

93
 (A) (B)
0,03

0,010 quercétine
0 kGy 0 kGy quercétine

0,008
0,02
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
0,006

0,004
0,01

0,002

0,000 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,010 0,03

1 kGy 1 kGy
0,008

0,02

Absorbance (U. A)
Absorbance (U. A)

0,006

0,004
QM1 0,01
2
0,002 QM2 quercétine
QM1 quercétine
QM2

0,000 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40

Temps (min) Temps (min)

0,01 0,03

0,008
2 kGy 2 kGy
0,02
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,006

QM1
2
0,004
0,01
QM1

0,002 QM2
QM2
quercétine quercétine

0 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,010 0,03

3 kGy 3 kGy
0,008

0,02
QM1
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,006 2

0,004
0,01 QM1

0,002 QM2
QM2
quercétine quercétine

0,000 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

Figure 28 : Chromatogrammes de solutions de quercétine (5 x 10-5 M, colonne

A) et (10-4 M, colonne B) irradiées avec des doses inférieures à 4kGy. Le débit
de dose a une valeur de 0,22 Gy/s.
94
 I.1.1. IDENTIFICATION DES PRODUITS RADIOLYTIQUES DE LA QUERCETINE

Afin d’ identifier le produit majoritaire de dégradation (QM1), nous l’ avons isolé en

utilisant dans un premier temps la CLHP semi-préparative. 48 mg de quercétine en poudre
sont dissous dans 31,8 ml du méthanol (solution de 5 x 10-3 M) et irradiés à 14 kGy, ce qui
correspond au chromatogramme de la Figure 29. Dans ce système semi-préparatif, QM1 est
élué entre 47 et 49 min. C’ est cette fraction (F1) (Figure 29) que nous avons récoltée.

1,4
QM1 = F1
1,2

1
Absorbance (U.A)

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 10 20 30 40 50 60
Temps (min)

Figure 29 : Chromatogramme obtenu par CLHP semi-préparative d’ une solution de

quercétine à 5 x 10-3 M irradiée avec une dose de 14 kGy.

Après évaporation de F1, sous vide et à 45°C, nous avons obtenu 9,4 mg de matière.
L’ analyse par CLHP de cette fraction a révélé la présence d’ un deuxième composé (tr = 12
min) (Figure 30). Ce résultat était inattendu à cause de la différence importante entre le temps
de rétention de ce composé et celui de QM1. De plus, en comparant le spectre UV de ce
composé avec ceux des produits de radiolyse, nous avons observé qu’ il correspond à celui de
QM2 (Figures 27 et 28).

95
 0,3
QM2

Absorbance (U. A)
0,2

QM1
0,1

0
0 10 20 30 40
Temps (min)

Figure 30 : Chromatogramme obtenu par CLHP après évaporation de la fraction F1,

séparée à partir d’ une solution de quercétine (5 x 10-3 M) irradiée avec une dose de 14 kGy.

Pour déterminer les structures chimiques des deux produits, nous avons ensuite
effectué une seconde purification de F1 et nous avons obtenu 6,4 mg de QM2 et 3 mg de
QM1. En réalité, les deux composés sont instables et nous verrons par la suite qu’ un équilibre
chimique s’ établit entre QM1 et QM2.

a) Spectres UV de QM1 et QM2

Les spectres UV des deux composés possèdent deux bandes d’ absorption entre 220-
227 nm et entre 270-300 nm (Figure 31). Le spectre de la quercétine est caractérisé par deux
bandes d’ absorption λ1max = 255,1 nm et λ2max = 367,7 nm, attribuées respectivement aux
conjugaisons entre les cycles A et C et entre les cycles B et C. Nous constatons que ces deux
bandes d’ absorption ont disparu. Ceci indique que le cycle C de la quercétine est détruit au
cours de la radiolyse et n’ existe plus dans les structures chimiques de QM1 et QM2.

96
 225 272
0,60 298

255 367
0,50 224

Absorbance (U. A)
0,40

0,30

0,20

0,10

0,00

250 300 350

Longueur d’ onde (nm)

Figure 31 : Spectres d’ absorption UV de la quercétine (trait plein) et des

produits de radiolyse QM1 (trait en tirets) et QM2 (trait en pointillés). La
concentration de chaque composé est 10-4 M.

b) Spectres RMN de QM1 et QM2

Ces composés sont identifiés par leurs spectres RMN: 1H, 13

C, COSY, HMQC et
HMBC.

Le composé QM2

Le spectre RMN du proton 1H de QM2 (Tableau 9) correspond à cinq protons

aromatiques:
Deux protons à 6,24 ppm (d ; J = 2,2 Hz) et à 6,17 ppm (d ; J = 2,2 Hz) indiquant la
présence d’ un cycle A asymétrique.
Trois protons à 7,58 ppm (d ; J = 2,1 Hz), à 7,56 ppm (dd ; J = 2,1 ; 8,2 Hz) et à
6,86 ppm (d ; J = 8,2 Hz) montrant la présence d’ un deuxième cycle, appelé B.

Les positions de tous ces protons sont déterminées à partir du spectre COSY du
couplage proton-proton (Tableau 9).

97
 Le spectre carbone 13C Jmod (Tableau 9) est constitué de :
Trois groupes carbonyles : une fonction cétone (188,6 ppm, C-7), un groupe acide
(165,8 ppm, C-8) et un groupe ester (165,9 ppm, C-7 ).
Cinq carbones tertiaires (101,5 ppm, C-3 ; 104,7 ppm, C-5 ; 118,4 ppm, C-2 ; 116,1
ppm, C-5 ; 125,0 ppm, C-6 ).
Sept carbones quaternaires dont cinq sont liés à un atome d’ oxygène (168,1 ppm, C-
2 ; 167,2 ppm, C-4 ; 155,5 ppm, C-6 ; 146,3 ppm, C-3 ; 152,7 ppm, C-4 ) et deux sont liés à
un atome de carbone (105,5 ppm, C-1 ; 121,3 ppm, C-1 ).

Tableau 9. Spectres RMN 1H (400 MHz) et 13

C (100 MHz) et corrélations
observées sur les spectres COSY, HMQC et HMBC des produits QM1 et
QM2 mesurés dans CD3OD/TMS (δ ppm; J Hz).
13
Position 1
COSY C J mod/ HMBC
H
HMQC
Produit QM1
1 105,6
2 168,2
3 6,27 d (2,2) H-5 101,7 C-1; C-5
4 167,7
5 6,19 d (2,2) H-3 105,0 C-1; C-3
6 155,4
7 188,6
a
8 165,5
8-OCH3 3,44 s 53,2 C-8
1' 120,7
2' 7,48 d (2,1) H-6' 118,0 C-4'
; C-6'
; C-7'
3' 146,6
4' 153,1
5' 6,89 d (8,2) H-6' 116,2 C-1'
; C-3'
6' 7,50 dd (8,2; 2,1) H-2'
; H-5' 124,9 C-2'
; C-4'
; C-7'
a
7' 165,9

Produit QM2
1 105,5
2 168,1
3 6,24 d (2,2) H-5 101,5 C-1; C-5
4 167,2
5 6,17 d (2,2) H-3 104,7 C-1; C-3
6 155,5
7 188,6
b
8 165,8
1' 121,3
2' 7,58 d (2,1) H-6' 118,4 C-4'
; C-6'
; C-7'
3' 146,3
4' 152,7
5' 6,86 d (8,2) H-6' 116,1 C-1'
; C-3'
6' 7,56 dd (8,2; 2,1) H-2'
; H-5' 125,0 C-2'
; C-4'
; C-7'
b
7' 165,9
a,b
Les assignements peuvent être interchangeables
98
 Les positions de tous les carbones tertiaires et quaternaires sont respectivement
déterminées à partir des spectres HMQC et HMBC du couplage 1H-13C (Tableau 9).
La connexion entre les cycles A et B est démontrée grâce aux indications suivantes :
(i) La valeur du déplacement chimique de C-2 (168,1 ppm), correspond à un carbone
aromatique lié à un atome d’ oxygène. En outre, le cycle A a une structure asymétrique, ce qui
indique que C-2 est lié à un atome d’ oxygène mais non hydroxylé. De plus, C-7 étant un
groupe ester, nous démontrons la liaison C2-O-C7 (Figure 32).
(ii) Sur le spectre HMBC, nous avons observé deux taches de corrélation 3J entre les
protons H-2 /H-6 et le carbonyle C-7 (Figure 32). De plus, C-1 est lié à un carbone. En se
basant sur ces deux résultats, nous avons pu déterminer la liaison C7 -C1 .
Finalement, la connexion entre les cycles A et B est établie via la liaison C2-O-C7 -
C1 (Figure 32).
La liaison C1-C7-C8, quant à elle, a pu être établie car, d’ une part aucun proton n’ est
corrélé ni avec C-7 ni avec C-8, et d’ autre part C-1 est lié à un carbone.

Finalement, QM2 est identifié comme acide 2-[4,6-dihydroxy-2-oxy(3,4-

dihydroxybenzoyl)phényl]-2-oxo acétique (Figure 32) (Marfak, 2002 ; Marfak, 2003a).

Le composé QM1

En dehors du milieu d’ irradiation, nous avons remarqué que QM2 se transforme au

cours du temps en QM1. En effet, après avoir identifié QM2, celui-ci est solubilisé à nouveau
dans le méthanol. Puisque QM2 n’ est pas stable dans le méthanol, nous avons suivi son
évolution au cours du temps par RMN et CLHP. Nous avons observé l’ apparition, d’ une part,
de nouveaux signaux sur les spectres RMN proton et carbone de QM2, et d’ autre part, d’ un
pic sur le chromatogramme CLHP de QM2. En analysant le spectre d’ absorption UV de ce
pic CLHP, nous avons déduit qu’ il correspond à celui du composé QM1. Ces analyses RMN
et CLHP ont montré également que QM1 augmente au cours du temps, alors que QM2
diminue.
Les spectres 1H et 13
C de QM1 sont presque similaires à ceux de QM2 (Tableau 9).
La seule différence observée est la présence d’ un groupe méthoxyle pour QM1, représenté par
un carbone à 53,2 ppm et un singulet de trois protons à 3,44 ppm. La position du méthoxyle
est assignée par la tache de corrélation en 3J reliant les protons (3,44 ppm) avec le carbone C-
8.

99
 QM1 est alors identifié comme 3,5-dihydroxy-2-(7-méthoxyloxycarbonyl-7-
oxo)phényl 3,4-dihydroxybenzoate (Figure 32) (Marfak, 2002 ; Marfak, 2003a).

OH
3' OH
2'
4'
B
HO 7 O 2
A C
4 3
5 OH

OH O

quercétine
OH OH

2'H 3' 3'

4' OH 2'H
4'
OH

O 1' O 1'
3H H5' 3H H5'
7' 7'
HO 2 O H HO 2 O H
O 6' O 6'
4 4

7 CH3
5H 1 7 8 OH 5H 1 8 O
6 6
OH O OH O
QM2 QM1

Figure 32 : Structures chimiques de QM1 et QM2 et corrélations 1H-13C (3J) ( )

importantes observées sur les spectres HMBC.

c) Spectres de masse de QM1 et QM2

Les spectres de masse négatif et positif de QM2 possèdent respectivement deux ions
moléculaires à m/z 333 [M - H]- et à m/z 357 [M + Na]+ (Figure 33). Par conséquent, la
formule moléculaire de QM2 est C15H10O9 confirmant ainsi la structure obtenue par RMN.

La détection des ions moléculaires à m/z 347 [M - H]-, à m/z 349 [M + H]+ et à m/z 371
[M + Na]+, dans les spectres négatif et positif de QM1 (Figure 33), montre que sa formule
moléculaire est C16H12O9, ce qui correspond à la structure déterminée par RMN.

100
 137
100
(A)

357

169 352 389

199

0 m/z
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

137
100
(B)
371

%
213
349
366 397
106 387

0
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z

Figure 33 : Spectres de masse positifs des produits QM2 (A) et QM1 (B).

d) Confirmation de la connexion entre les cycles A et B de QM1 et de QM2

L’ analyse d’ un spectre de masse ne sert pas seulement à déterminer la masse

moléculaire d’ un produit, mais peut également fournir des informations supplémentaires sur
la structure chimique du composé analysé.

Les spectres positifs de QM2 et QM1 ont montré la présence d’ autres ions à m/z 137
(pour QM1 et QM2) et à m/z 199 (pour QM2), ainsi qu’ à m/z 213 (pour QM1) (Figure 33).
Sur la Figure 34, nous avons proposé un mécanisme de formation de ces fragments. Ceci
nous permet de déterminer le site de connexion entre les cycles A et B constituant QM1 et
QM2.
L’ ion H+ formé au cours de l’ ionisation s’ attache à la molécule (QM1 ou QM2) et
conduit à la formation de l’ ion moléculaire [M + H]+ (Figure 34). Celui-ci se décompose pour
donner le fragment à m/z 137 (il représente le cycle B, de QM1 ou de QM2, attaché à une
fonction CO) et un composé intermédiaire CI qui représente le reste de la molécule [M + H –
137]. L’ addition d’ un autre ion H+ à CI conduit à la formation des fragments à m/z 199 (à
partir de QM2) et à m/z 213 (à partir de QM1).

101
 OH

OH

B
O 1'

7'
HO 2 O

A
O
QM2 (R = H)
7 8 OR QM1 (R = CH3)
OH O

H+ OH

OH

[M + H]+
H +
HO O
O

OR

OH O

OH

OH HO OH CI
O
B A
O
+
C OR

OH O

OH H+
OH

+
B
O

m/z = 137 R = H, m/z = 199 (à partir de QM2)

R = CH3, m/z = 213 (à partir de QM1)

Figure 34 : Mécanisme proposé pour la formation des fragments à m/z 137 et à

m/z 199 détectés sur le spectre de masse positif de QM2, et des fragments à m/z
137 et à m/z 213 détectés sur celui de QM1 (Marfak, 2002 ).

Nous observons que les trois fragments sont obtenus après le détachement des deux
cycles A et B au niveau du carbone C-7 . Ceci montre que la connexion entre les cycles A et
B de QM1 et de QM2 s’ effectue au niveau de la liaison C2-O-C7 -C1 , ce qui confirme le
résultat déjà obtenu par les analyses RMN.

De plus, le fragment détecté à m/z 199 sur le spectre de QM2 est détecté pour QM1 à
m/z 213. Cette différence confirme, d’ une part, la liaison C7-C8 et, d’ autre part, la présence
du groupe OCH3 lié au carbone en position 8 caractérisant QM1 (Figure 32). En effet, c’ est la
seule différence qui existe entre les structures chimiques de QM1 et QM2 puisque ce dernier
est hydroxylé en cette position.

102
 e) Equilibre chimique entre QM1 et QM2

Contrairement à QM1, identifié comme le produit majoritaire de la radiolyse de la

quercétine, QM2 est formé en faibles concentrations et est de ce fait un produit minoritaire.
En dehors du milieu d’ irradiation, QM2 est aussi formé durant l’ évaporation de l’ éluent
contenant QM1. En effet, ce dernier est collecté avec approximativement 30% d’ eau et 70%
de méthanol. Lors de l’ évaporation, l’ eau hydrolyse le groupe méthoxyle de QM1 conduisant
ainsi à la formation de QM2. Lorsque QM2 est à nouveau solubilisé dans le méthanol, il est
estérifié en QM1 (Figure 35).

OH OH

OH OH

O O

HO O + H2O HO O
+ CH3OH
O O

CH3
O OH

OH O OH O

QM1 QM2

Figure 35 : Equilibre chimique entre QM1 et QM2.

f) Stabilité des produits de radiolyse au cours de l’ irradiation

A ce niveau de notre étude, il est intéressant de savoir si QM1 et QM2 sont stables
face à l’ irradiation dans le méthanol. Pour démontrer ceci, nous avons étudié à nouveau la
radiolyse dans le méthanol de QM1 et QM2 après les avoir purifiés.
Les analyses par CLHP des solutions avant et après irradiation ont montré que les
deux composés ne se dégradent pas. QM1 et QM2 sont donc stables durant l’ irradiation, ce
qui montre que la réaction d’ hydrolyse de QM1 en QM2 ne se produit qu’ en présence de
l’ eau, et indépendamment de l’ irradiation.

103
I.2. RADIOLYSE DES FLAVONOÏDES DANS LE METHANOL :
GENERALISATION

Pour mieux comprendre le processus de radiolyse des flavonoïdes dans le méthanol,

nous avons étudié la radiolyse de 13 autres molécules appartenants à différents groupes de
flavonoïdes. Il s’ agit de la morine, du kaempférol, de la myricétine, et de la galangine (des
flavonols), de la lutéoline, de l’ apigénine et de la chrysine (des flavones), de la (±)-taxifoline
(une dihydroflavonol), de la (±)-naringénine et du (±)-ériodictyol (des flavanones), de la (-)-
épicatéchine (une flavan-3-ol), de la rutine et l'
astragaline (des flavonoïdes glycosides)
(Figure 36).

FLAVONOLS FLAVONES FLAVANONES FLAVAN-3-OLS

OH OH OH OH

OH OH OH OH

HO O HO O HO O HO O

OH OH

OH O OH O OH O OH

quercétine lutéoline ériodictyol épicatéchine

OH OH OH

HO O HO O HO O

OH

OH O OH O OH O

kaempférol apigénine naringénine

HO O HO O

OH

OH O OH O

galangine chrysine

HO OH

HO O

OH

OH O

morine FLAVONES GLYCOSIDES DIHYDROFLAVONOLS

OH
OH OH
OH OH
OH OH

HO O HO O
HO O HO O
OH

O-rutinose O-rutinose
OH OH
OH O OH O
OH O OH O

myricétine rutine astragaline taxifoline

Figure 36 : Structures chimiques des flavonoïdes étudiés.

104
L’ analyse des chromatogrammes obtenus avant et après irradiation de :
la lutéoline, l’ apigénine et la chrysine (des flavones : absence du groupe 3-OH),
la (±)-taxifoline (une dihydroflavonol : présence du groupe 3-OH et absence de la
double liaison C2-C3),
la (±)-naringénine et le (±)-ériodictyol (des flavanones : absence simultanée de la
double liaison C2-C3 et du groupe 3-OH),
la (-)-épicatéchine (une flavan-3-ol : présence du groupe 3-OH et absence
simultanée de la double liaison C2-C3 et de la fonction 4-oxo),
la rutine et l'
astragaline (flavonoïdes glycosides : l’ hydrogène du groupe 3-OH est
remplacé par un sucre),
ne montre pas de modifications bien que ces neuf flavonoïdes soient irradiés avec des
doses supérieures à 20 kGy.

Ces résultats montrent que les flavones, les dihydroflavonols, les flavanones, les
flavan-3-ols et les flavonoïdes glycosides ne se dégradent pas au cours de la radiolyse. En
revanche, tous les flavonols étudiés (myricétine, morine, kaempférol et galangine) se sont
dégradés. Nous déduisons que la présence simultanée du groupe 3-OH et de la double liaison
C2-C3 joue un rôle important dans la dégradation des flavonoïdes.

Sur la Figure 37, nous avons reporté les chromatogrammes de la galangine (tr = 34
min), du kaempférol (tr = 34 min), de la morine (tr = 28 min) et de la myricétine (tr = 28 min)
(5 x 10-3 M) avant irradiation (contrôles) et après irradiation avec une dose de 14 kGy. A cette
concentration et à cette dose, les pics CLHP de ces flavonols ont pratiquement disparu à
l’ exception de la galangine (partiellement dégradée) caractérisée par un cycle B non substitué.

Nous observons également, comme nous l’ avons décrit pour la quercétine, que la
disparition de la morine, du kaempférol, de la galangine et de la myricétine au cours de la
radiolyse est accompagnée de l’ apparition de nouveaux produits radiolytiques (Figure 37).

105
 (A) (B)
1,20 1,00
morine
MM1
1,00
0,80

0,80
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
0,60

0,60

0,40
0,40

0,20
0,20

MM2 morine
0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,80 1,60
kaempférol
KM1
1,40

0,60 1,20
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
1,00

0,40 0,80

0,60

0,20 0,40
KM2
0,20
kaempférol
0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

galangine
0,80 0,80

0,60 0,60
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,40 0,40

galangine
GM1
0,20 0,20

GM2

0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,70 0,70
myricétine
0,60 0,60

0,50 0,50
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,40 0,40

0,30 0,30

0,20 0,20

0,10 0,10
myricétine
0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

Figure 37 : Chromatogrammes, enregistrés à 280 nm, de la morine, du

kaempférol, de la galangine et de la myricétine avant irradiation (colonne A) et
après irradiation avec une dose de 14 kGy (colonne B). Le débit de dose est 0,22
106
Gy/s.
 Nous avons mentionné préalablement que la radiolyse de la quercétine est un
processus qui dépend à la fois de la concentration et de la dose. Autrement dit, pour les
concentrations élevées (5 x 10-3 M), la dégradation totale de la quercétine n’ est survenue
qu’ après l’ application d’ une dose importante (14 kGy). En outre, pour les faibles
concentrations (< 10-4 M), l’ irradiation avec des doses inférieures à 4 kGy est suffisante pour
causer la dégradation complète de la quercétine. Le même résultat est enregistré pour la
radiolyse de la morine, du kaempférol, de la galangine et de la myricétine.

La dégradation de la quercétine, de la morine, du kaempférol et de la galangine

conduit à la formation d’ un produit majoritaire et d’ autres produits minoritaires. Pour la
myricétine, tous les composés de dégradation sont formés en faibles quantités et aucun
produit majoritaire n’ a été détecté. Ceci ne nous a pas permis de continuer l’ étude de cette
molécule. Pour la suite, nous ne présenterons que les résultats obtenus sur la radiolyse de la
quercétine, la morine, le kaempférol et la galangine.

GM1 (tr = 26 min), KM1 (tr = 30 min) et MM1 (tr = 31 min) sont détectés comme
étant les produits majoritaires de la dégradation de la galangine, du kaempférol et de la
morine, respectivement. D’ autres composés sont formés en faibles quantités, notamment GM2
(tr = 16 min), KM2 (tr = 16 min) et MM2 (tr = 17 min) (Figure 37).

GM1, KM1 et MM1 sont séparés, par CLHP semi-préparative, à partir de solutions
méthanoliques (5 x 10-3 M) préparées avec 48 mg de galangine, de kaempférol ou de morine
et irradiées avec une dose de 14 kGy. Les fractions récoltées sont ensuite évaporées sous vide
et à 45°C. Les analyses CLHP de ces fractions ont montré, comme dans le cas de la
quercétine, la présence de composés qui correspondent à GM2, KM2 et MM2. Ces molécules
sont, là encore et comme nous le verrons après l’ identification présentée dans les paragraphes
suivants, issues de l’ hydrolyse de GM1, KM1 et MM1.

107
 I.2.1. IDENTIFICATION DES PRODUITS DE RADIOLYSE DES FLAVONOLS

a) Spectres UV/visible

Il est reconnu que la plupart des flavones et flavonols possèdent deux bandes
d’ absorption dans la région ultraviolet/visible : la Bande I entre 230 nm et 385 nm
représentant la conjugaison entre les cycles B et C, et la Bande II allant de 240 nm jusqu’ à
280 nm représentant la conjugaison entre les cycles A et C (Markham, 1989). Pour les
flavonols, une augmentation dans le nombre de groupes hydroxyles sur le cycle B induit un
déplacement de la Bande I de 3 nm à 10 nm. Par exemple, les longueurs d’ onde d’ absorption
de la galangine (aucun groupe OH sur le cycle B), du kaempférol (un groupe OH en position
4’ ) et de la quercétine (deux groupes OH en positions 3’ et 4’ ) sont respectivement 359 nm,
364 nm et 367 nm (Figure 38).

Après la dégradation de la quercétine, de la galangine, du kaempférol et de la morine,

nous avons observé que leurs produits de radiolyse possèdent qu’ une seule bande
d’ absorption entre 250 nm et 300 nm (Figure 38). Ce résultat témoigne de la disparition des
conjugaisons entre les cycles B et C, et entre les cycles A et C, ce qui indique l’ ouverture du
cycle C dans les produits de radiolyse.

b) Spectres RMN des produits de radiolyse

Les spectres RMN du proton des composés GM1, KM1, MM1, GM2, KM2 et MM2
sont presque similaires (Tableaux 10, 11 et 12). Ils diffèrent entre eux par le nombre de
protons aromatiques : cinq pour MM1 et MM2, six pour KM1 et KM2, sept pour GM1 et
GM2. En fait, ils sont tous constitués d’ un cycle tétra substitué (cycle A) et d’ un cycle B tri-
substitué (MM1 et MM2), di-substitué (KM1 et KM2) et mono-substitué (GM1 et GM2).

Les spectres RMN du carbone de GM2, KM2 et MM2 ont tous montré la présence de
15 carbones aromatiques, alors que ceux de GM1, KM1 et MM1 ont révélé la présence d’ un
groupe méthoxyle supplémentaire (OCH3) (Tableau 10, 11 et 12).

108
 272 (A) 274 (B)
0,60 298 0,60

276
0,50 255 367 0,50
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
364
0,40 0,40
265
0,30 0,30

0,20 0,20

0,10 0,10

250 300 350 250 300 350

Longueur d’ onde (nm) Longueur d’ onde (nm)

(C) (D)
0,60 0,60
A 265 265
0,50 0,50
295 295
Absorbance (U. A)

0,40 0,40
359 359
291 261 291
0,30 0,30

0,20 0,20

0,10 0,10

250 300 350 250 300 350

Longueur d’ onde (nm) Longueur d’ onde (nm)

Figure 38 : Spectres UV/Visible de flavonols et de produits formés au cours de la radiolyse dans

le méthanol. (A) : quercétine, QM1 et QM2, (B) : kaempférol, KM1 et KM2, (C) : galangine,
GM1 et GM2, et (D) : morine, MM1 et MM2. Les flavonols (trait plein), QM1, KM1, GM1 et
MM1 (trait en tirets), QM2, KM2, GM2 et MM2 (trait en pointillés). La concentration de chaque
composé est 10-4 M.

109
Tableau 10. Spectres RMN 1H (400 MHz) et 13
C (100 MHz), et corrélations
observées sur les spectres COSY, HMQC et HMBC des produits KM1 et KM2
mesurés dans CD3OD/TMS (δ ppm; J Hz) (Marfak, 2003b).
13
Position 1
COSY C J mod/ HMBC
H
HMQC
Produit KM1
1 105,5
2 167,5
3 6,26 d (2,2) H-5 101,6 C-1; C-5
4 168,0
5 6,19 d (2,2) H-3 104,8 C-1; C-3
6 155,4
7 188,6
a
8 165,4
8-OCH3 3,46 s 53,3 C-8
1' 120,9
2' 7,99 d (8,7) H-3' 133,9 C-4'
; C6'/2'; C-7'
3' 6,88 d (8,7) H-2' 116,5 C-1'
; C5'/3'
4' 164,8
5' 6,88 d (8,7) H-6' 116,5 C-1'
; C3'/5'
6' 7,99 d (8,7) H-5' 133,9 ; C2'/6'; C-7'
C-4'
a
7' 165,9

Produit KM2
1 105,7
2 167,7
3 6,27 d (2,2) H-5 101,7 C-1; C-5
4 168,2
5 6,21 d (2,2) H-3 105,0 C-1; C-3
6 155,3
7 188,6
b
8 165,7
1' 120,5
2' 7,96 d (8,8) H-3' 133,9 C-4'
; C6'/2'; C-7'
3' 6,92 d (8,8) H-2' 116,6 C-1'
; C5'/3'
4' 164,8
5' 6,92 d (8,8) H-6' 116,6 C-1'
; C3'/5'
6' 7,96 d (8,8) H-5' 133,9 C-4'
; C2'/6'; C-7'
b
7' 165,9
a, b
Les assignments peuvent être interchangeables

110
Tableau 11. Spectres RMN 1H (400 MHz) et 13
C (100 MHz), et corrélations
observées sur les spectres COSY, HMQC et HMBC des produits MM1 et
MM2 mesurés dans CD3OD/TMS (δ ppm; J Hz).

13
1 C J mod/ HMBC
Position H COSY
HMQC
Produit MM1
1 105,3
2 167,8
3 6,24 d (2,2) H-5 101,8 C-1; C-5
4 168,2
5 6,18 d (2,2) H-3 104,6 C-1; C-3
6 154,6
7 188,7
a
8 165,6
8-OCH3 3,42 s CH3 53,2 C-8
1' 105,6
2' 166,6
3' 6,31 d (2,0) H-5' 103,4 C-1'
; C-5'
4' 168,3
5' 6,43 dd (8,8; 2,0) H-3'
; H-6' 109,7 C-1'
; C-3'
6' 7,67 d (8,8) H-5' 134,4 C-2'
; C-4'
; C-7'
b
7' 165,8

Produit MM2
1 105,4
2 167,6
3 6,27 d (2,2) H-5 101,9 C-1; C-5
4 167,8
5 6,21 d (2,2) H-3 104,7 C-1; C-3
6 155,1
7 188,6
b
8 165,8
1' 104,9
2' 167,2 C-1'
; C-5'
3' 6,35 d (1,8) H-5' 103,7
4' 168,5
5' 6,41 dd (8,4; 1,8) H-3'
; H-6' 109,4 C-1'
; C-3'
6' 7,64 d (8,4) H-5' 133,8 C-2'
; C-4'
; C-7'
b
7' 165,9
a, b
Les assignements peuvent être interchangeables

111
Tableau 12. Spectres RMN 1H (400 MHz) et 13
C (100 MHz), et corrélations
observées sur les spectres COSY, HMQC et HMBC des produits GM1 et GM2
mesurés dans CD3OD/TMS (δ ppm; J Hz).
13
Position 1
COSY C J mod/ HMBC
H
HMQC
Produit GM1
1 105,8
2 167,4
3 6,30 d (2,2) H-5 101,9 C-1; C-5
4 168,1
5 6,25 d (2,2) H-3 105,1 C-1; C-3
6 155,1
7 188,2
a
8 166,0
8-OCH3 3,41 s 53,1 C-8
1' 130,5
2' 8,18 de (7,2) H-3' 131,4 C-4'; C6'/2'; C-7'
3' 7,58 te (7,4) H-2'
; H-4' 130,0 C-1'; C5'/3'
4' 7,73 te (7,5) H-3'
; H-5' 135,5 C-2'; C-6'
5' 7,58 te (7,4) H-4'
; H-6' 130,0 C-1'; C3'/5'
6' 8,18 de (7,2) H-5' 131,4 C2'/6'; C-4'; C-7'
b
7' 165,6

Produit GM2
1 105,5
2 168,1
3 6,24 d (2,2) H-5 101,5 C-1; C-5
4 168,3
5 6,17 d (2,2) H-3 104,7 C-1; C-3
6 155,5
7 188,6
a
8 165,7
1' 130,7
2' 7,97 de (7,2) H-3' 131,2 C-4'; C6'/2'; C-7'
3' 7,56 te (7,4) H-2'
; H-4' 130,3 C-1'; C5'/3'
4' 7,75 te (7,7) H-3'
; H-5' 135,8 C-2'; C-6'
5' 7,56 te (7,4) H-4'
; H-6' 130,3 C-1'; C3'/5'
6' 7,97 de (7,2) H-5' 131,2 C2'/6'; C-4'; C-7'
b
7' 165,9
a, b
Les assignements peuvent être interchangeables

112
 Les positions des carbones tertiaires et quaternaires ainsi que celles des groupes
méthoxyles sont déterminées par les mêmes procédures que celles utilisées lors de
l’ identification de QM1 et QM2 (Tableaux 10, 11 et 12).

Finalement, MM1, KM1, GM1, MM2, KM2 et GM2 sont identifiés respectivement
comme (Figure 39) :
3,5-dihydroxy-2-(7-méthoxyloxycarbonyl-7-oxo)phényl 2,4-dihydroxybenzoate.
3,5-dihydroxy-2-(7-méthoxyloxycarbonyl-7-oxo)phényl 4-hydroxybenzoate.
3,5-dihydroxy-2-(7-méthoxyloxycarbonyl-7-oxo)phényl benzoate.
acide 2-[4,6-dihydroxy-2-oxy(2,4-dihydroxybenzoyl)phényl]-2-oxo acétique.
acide 2-[4,6-dihydroxy-2-oxy(4-hydroxybenzoyl)phényl]-2-oxo acétique.
acide 2-[4,6-dihydroxy-2-oxy(benzoyl)phényl]-2-oxo acétique.

113
 OH OH

H 3' 3'
2' 4' OH H 2' 4' OH
OH
1'
B 1'
B
3' O O
2' 4' OH H 5' H H 5' H
7' 6' 7' 6'
B 3 3
HO O HO 2 O H HO 2 O H
7 2 O O
4 4
A C A 1 A 1
5 7 8 5 7 8
3 OH H 6 OCH3 H 6 OH
5
OH O OH O OH O

quercétine QM1 QM2

H H

H 3' 3'
2' 4' OH H 2' 4' OH

1'
B 1'
B
3' O O
2' 4' OH H 5' H H 5' H
7' 6' 7' 6'
B 3 3
HO O HO 2 O H HO 2 O H
7 2 O O
4 4
A C A 1 A 1
5 7 8 5 7 8
3 OH H 6 OCH3 H 6 OH
5
OH O OH O OH O

kaempférol KM1 KM2

H H

HO 3' 3'
2' 4' OH HO 2' 4' OH

1'
B 1'
B
HO 3' O O
2' 4' OH H 5' H H 5' H
7' 6' 7' 6'
B 3 3
HO O HO 2 O H HO 2 O H
7 2 O O
4 4
A C A 1 A 1
5 7 8 5 7 8
3 OH H 6 OCH3 H 6 OH
5
OH O OH O OH O

morine MM1 MM2

H H

H 3' 3'
2' 4' H H 2' 4' H

1'
B 1'
B
3' O O
2' 4' H 5' H H 5' H
7' 6' 7' 6'
B 3 3
HO O HO 2 O H HO 2 O H
7 2 O O
4 4
A C A 1 A 1
5 7 8 5 7 8
3 OH H 6 OCH3 H 6 OH
5
OH O OH O OH O

galangine GM1 GM2

Figure 39 : Structures chimiques des produits issus de la radiolyse des flavonols (quercétine,
morine, kaempférol et galangine) dans le méthanol.

114
 c) Confirmation par LC-MS

Les spectres de masse négatifs et positifs de MM1, KM1, GM1, MM2, KM2 et GM2
ont montré la présence des ions suivants :
à 347 [M - H]-, à m/z 349 [M + H]+ et à m/z 371 [M + Na]+ (pour MM1),
à 331 [M - H]-, à m/z 333 [M + H]+ et à m/z 355 [M + Na]+ (pour KM1),
à 315 [M - H]-, à m/z 317 [M + H]+ et à m/z 339 [M + Na]+ (pour GM1),
à m/z 333 [M - H]- et à m/z 357 [M + Na]+ (pour MM2),
à m/z 317 [M - H]- et à m/z 341 [M + Na]+ (pour KM2),
à m/z 301 [M - H]- et à m/z 325 [M + Na]+ (pour GM2).
Ces résultats démontrent que les formules moléculaires de MM1, KM1, GM1, MM2,
KM2 et GM2 sont respectivement C16H12O9, C16H12O8, C16H12O7, C15H10O9, C15H10O8,
C15H10O7, ce qui confirme les structures chimiques obtenues par RMN.

D’ un autre côté, d’ autres ions sont également détectés sur les spectres positifs de
MM1, MM2, KM1, KM2, GM1 et GM2, à savoir :
à m/z 137 et à m/z 199 (pour MM1),
à m/z 137 et à m/z 213 (pour MM2),
à m/z 121 et à m/z 199 (pour KM1),
à m/z 121 et à m/z 213 (pour KM2),
à m/z 105 et à m/z 199 (pour GM1),
à m/z 105 et à m/z 213 (pour GM2).

Rappelons que sur les spectres positifs de QM1 et QM2 (produits de dégradation de la
quercétine), nous avons détecté la présence d’ un fragment à m/z 137. Celui-ci représente le
cycle B attaché à une fonction CO (Figure 34). Ce fragment est également observé sur les
spectres positifs de MM1 et MM2. Ceci est dû à la structure du cycle B qui est di-substitué
pour les quatre composés : MM1/MM2 (2’ , 4’ -OH) et QM1/QM2 (3’ , 4’ -OH).

Pour KM1/KM2 et GM1/GM2, nous avons la formation des fragments à m/z 121 et à
m/z 105, respectivement. La différence de masse existant entre ces deux fragments et celui à
m/z 137 (formé à partir de MM1/MM2 et QM1/QM2) est 16 et 32, ce qui correspond
respectivement à la masse atomique de 1 et 2 atomes d’ oxygène. Nous déduisons que les deux

115
fragments représentent une fonction CO attachée au cycle B de KM1/KM2 et de GM1/GM2,
qui est respectivement mono- et non-hydroxylé. Ces résultats montrent que la connexion entre
les cycles A et B s’ effectue à travers la chaîne C2-O-C7’ -C1’ (Figure 32), ce qui renforce les
conclusions des analyses RMN.

La série des composés MM2, KM2 et GM2 donne un fragment à m/z 199, alors que la
série MM1, KM1 et GM1 donne un fragment à m/z 213. Cette différence de masse de 14 est
due au fait que les composés de la deuxième série sont méthoxylés en position 8, tandis que
les composés de la première série sont hydroxylés (Figure 39).

Nous constatons que tous ces composés se comportent de la même manière en

spectroscopie de masse, ce qui nous permet de généraliser le mécanisme permettant la
formation de tous les fragments cités ci-dessus (Figure 40).

116
 R = CH3

R 3' QM1 (R’ 2 = H, R’ 3 = R’ 4 = OH)

R2' R 4' MM1 (R’ 2 = R’ 4 = OH, R’ 3 = H)
KM1 (R’ 2 = R’ 3 = H, R’ 4 = OH)
O GM1 (R’ 2 = R’ 3 = R’ 4 = H)
HO O
O R=H

OR QM2 (R’ 2 = H, R’ 3 = R’ 4 = OH)

OH O MM2 (R’ 2 = R’ 4 = OH, R’ 3 = H)
KM2 (R’ 2 = R’ 3 = H, R’ 4 = OH)
GM2 (R’ 2 = R’ 3 = R’ 4 = H)
H+

R 3'

R2' R4'

H +
HO O
O

OR

OH O
R3'

R 2' R4' HO OH
O

O
+
C OR

OH O

R 3' H+
R 2' R 4'

+
O

R = CH3
m/z = 137 (à partir de QM1, QM2, MM1 et
MM2 m/z = 213 (à partir de QM1, MM1, KM1 et GM1)

m/z = 121 (à partir de KM1 et KM2) R=H

m/z = 105 (à partir de GM1 et GM2) m/z = 199 (à partir de QM2, MM2, KM2 et GM2)

Figure 40 : Mécanisme proposé pour la formation des fragments détectés sur les
spectres de masse positifs de QM1, MM1, KM1, GM1, QM2, MM2, KM2 et GM2.

117
 Pour mieux comprendre le comportement des flavonoïdes en solution face au
rayonnement et nous aider dans la recherche du mécanisme de transformation de flavonols,
nous avons également étudié leur radiolyse dans l’ éthanol (Marfak, 2003d). Nous avons
adopté le même protocole que pour le méthanol, différentes concentrations allant de 5 x 10-5
M à 5 x 10-3 M et différentes doses allant de 0,2 kGy à 20 kGy.
De la même manière que pour les solutions méthanoliques, les flavones (lutéoline,
chrysine, apigénine), les dihydroflavonols ((±)- taxifoline), les flavanones ((±)- naringénine,
(±)- ériodictyol), les flavan-3-ols ((-)- épicatechine) et les flavonoïdes glycosides (rutine et
astragaline) n’ ont pas été dégradés après irradiation dans l’ éthanol. En revanche, les flavonols
sont à nouveau le seul groupe de flavonoïdes ayant subi une dégradation. En effet, les
analyses CLHP ont montré que la disparition des flavonols est accompagnée de l’ apparition
de nouveaux pics indiquant la formation de nombreux composés. La Figure 41 montre les
chromatogrammes de la galangine (tr = 34 min), du kaempférol (tr = 34 min), de la quercétine
(tr = 30 min) et de la morine (tr = 28 min) (5 x 10-3 M) avant irradiation (contrôles) et après
irradiation avec une dose de 14 kGy. A cette concentration et à cette dose d’ irradiation, les
flavonols sont complètement dégradés, exceptée la galangine (cycle B non substitué) qui n’ est
que partiellement dégradée.

En ce qui concerne les faibles concentrations (< 10-4 M), une dose de 4 kGy est
suffisante pour entraîner la disparition totale des pics CLHP correspondant aux molécules
mères (témoin de leur dégradation complète). On se souvient que des résultats similaires ont
été observés lors de l’ irradiation des flavonols dans le méthanol.

Toujours en comparaison avec la radiolyse dans le méthanol, nous avons également

observé que la quercétine, la morine, le kaempférol et la galangine sont transformés en
produits majoritaires QE1 (tr = 28 min), ME1 (tr = 33 min), KE1 (tr = 32 min) et GE1 (tr = 32
min), respectivement (Figure 41). D’ autres composés sont formés en faibles quantités.

118
 0,8 1,4

quercétine
1,2 QE1

0,6
1
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
0,8
0,4
0,6

0,4
0,2

0,2 QM2
quercétine
0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

1,2 0,6
ME1
morine

1,0 0,5

0,8 0,4
Absorbance (U. A)

0,6 Absorbance (U. A) 0,3

0,4 0,2

0,2 0,1

morine
MM2
0,0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,8 1,4
kaempférol KE1

1,2

0,6
1
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,8
0,4
0,6

0,4
0,2

0,2 KM2
kaempférol
0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

1,0 0,3

galangine
0,8
GE1 galangine
0,2
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,6

0,4
0,1

0,2

GM2

0,0 0
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

Figure 41 : Chromatogrammes, enregistrés à 280 nm, de la quercétine, de la morine,

du kaempférol et de la galangine (5 x 10-3 M) avant et après irradiation dans une
solution éthanolique avec une dose de 14 kGy.

119
 En utilisant la CLHP semi-préparative, QE1, ME1, KE1 et GE1 sont séparés à partir
de solutions d’ éthanol préparées avec 48 mg de quercétine, morine, kaempférol et galangine
et irradiées avec une dose de 14 KGy. Ensuite, les éluats sont évaporés à 45°C sous vide.
Nous avons ainsi obtenu 12,5 mg de QE1, 8,4 mg de ME1, 11,6 mg de KE1 et 15,4 mg de
GE1.
Au cours de la phase d’ évaporation, nous avons observé que QE1, ME1, KE1 et GE1
sont transformés respectivement en QE2, ME2, KE2 et GE2 dont les spectres d’ absorption
UV-visible (Figure 42) sont identiques à ceux de QM2, MM2, KM2 et GM2 (Figure 38),
produits déjà détectés comme étant des composés minoritaires de la dégradation dans le
méthanol de la quercétine, de la morine, du kaempférol et de la galangine, respectivement
(Figure 41). Nous constatons, là encore, l’ analogie entre la radiolyse des flavonols dans le
méthanol et dans l’ éthanol.

II.1. SPECTRES UV/VISIBLE DES PRODUITS RADIOLYTIQUES

Les spectres UV de QE1, KE1 et GE1 possèdent tous une bande d’ absorption centrée
vers 275-300 nm (Figure42). Le spectre de QE1 diffère à ceux de KE1 et GE1 par la présence
d’ un épaulement à 280 nm. Le spectre d’ absorption UV de ME1 présente deux pics de même
intensité à 268 nm et 298 nm (Figure 42). Il est différent du spectre de MM1 (produit
majoritaire de la dégradation de la morine dans le méthanol). L’ ensemble de ces analyses
indique la disparition du cycle C.

II.2. SPECTRES RMN DES PRODUITS RADIOLYTIQUES

Les spectres RMN 1H et 13

C de QE1, ME1, KE1 et GE1 (Tableaux 13 et 14) sont
presque similaires à ceux de QM1, MM1, KM1 et GM1 (produits majoritaires de la
dégradation des flavonols dans le méthanol) (Tableaux 10 et 11). La seule différence
enregistrée est la présence d’ un groupe OCH2CH3 (pour les produits formés dans l’ éthanol) à
la place du groupe OCH3 caractérisant les composés formés dans le méthanol. Les structures
chimiques de QE1, ME1, KE1 et GE1 sont déterminées par les procédures RMN déjà
détaillées, et confirmées par des analyses LC-MS à partir desquelles nous avons déterminé
C17H14O9, C17H14O7, C17H14O8, C17H14O9 comme étant les formules moléculaires de ME1,
GE1, KE1 et QE1, respectivement.

120
 (A) (B)
0,60 0,60
298
276
0,50 255 367 0,50
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
364
0,40 0,40
265
0,30 0,30

0,20 0,20

0,10 0,10

250 300 350 250 300 350

Longueur d’ onde (nm) Longueur d’ onde (nm)

(C) 252 (D)

0,60 0,60
A 265
0,50 0,50
268 298 354
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

293
0,40 0,40
359
0,30 0,30

0,20 0,20

0,10 0,10

250 300 350 250 300 350

Longueur d’ onde (nm) Longueur d’ onde (nm)

Figure 42 : Spectres d’ absorption UV/Visible de flavonols et de produits formés au cours de la

radiolyse dans l’ éthanol. (A) : quercétine et QE1, (B) : kaempférol et KE1, (C) : galangine et
GE1, et (D) : morine et ME1. Les flavonols (trait plein), QE1, KE1, GE1 et ME1 (trait en tirets).
La concentration de chaque composé est 10-4 M.

121
Tableau 13. Spectres RMN 1H (400 MHz) et 13
C (100 MHz), et corrélations
observées sur les spectres COSY, HMQC et HMBC des produits QE1 et KE1
mesurés dans CD3OD/TMS (δ ppm; J Hz).
13
Position 1
COSY C J mod/ HMBC
H
HMQC
Produit QE1
1 105,4
2 168,4
3 6,18 d (1,7) H-5 101,9 C-1; C-5
4 168,1
5 6,10 d (1,7) H-3 105,1 C-1; C-3
6 155,4
7 189,2
a
8 165,3
8-OCH2 3,68 q (7,1) CH3 63,2 C-8
CH3 0,96 t (7,1) 8-OCH2 14,3
1' 120,7
2' 7,43 d (1,6) 8-OCH2 118,3 C-4'
; C-6'
; C-7'
3' 146,8
4' 153,3
5' 6,79 d (8,3) H-6' 116,2 C-1'
; C-3'
6' 7,38 dd (8,3; 1,6) H-2'
; H-5' 124,7 C-2'
; C-4'
; C-7'
b
7' 165,8

Produit KE1
1 105,1
2 167,7
3 6,19 d (2,2) H-5 101,6 C-1; C-5
4 168,0
5 6,10 d (2,2) H-3 104,8 C-1; C-3
6 155,0
7 188,7
a
8 164,6
8-OCH2 3,66 q (7,1) CH3 62,8 C-8
CH3 0,95 t (7,1) 8-OCH2 14,0
1' 120,0
2' 7,83 d (8,7) H-3' 133,5 ; C6'/2'; C-7'
C-4'
3' 6,82 d (8,7) H-2' 116,4 C-1'
; C5'/3'
4' 164,8
5' 6,82 d (8,7) H-6' 116,4 C-1'; C3'/5'
6' 7,83 d (8,7) H-5' 133,5 C2'/6'; C-4'
; C-7'
b
7' 165,0
a ,b
Les assignements peuvent être interchangeables

122
Tableau 14. Spectres RMN 1H (400 MHz) et 13C (100 MHz), et corrélations
observées sur les spectres COSY, HMQC et HMBC des produits ME1 et GE1
mesurés dans CD3OD/TMS (δ ppm; J Hz).
13
Position 1
COSY C J mod/ HMBC
H
HMQC
Produit ME1
1 105,7
2 167,6
3 6,29 d (2,0) H-5 102,0 C-1; C-5
4 168,1
5 6,23 d (2,0) H-3 105,1 C-1; C-3
6 155,4
7 188,6
a
8 165,5
8-OCH2 3,90 q (7,2) CH3 63,5 C-8
CH3 1,17 t (7,2) 8-OCH2 14,2
1' 104,5
2' 167,2
3' 6,37 d (1,6) H-5' 103,8 C-1'
; C-5'
4' 168,6
5' 6,44 dd (8,0; 1,6) H-3'
; H-6' 109,8 C-1'
; C-3'
6' 7,75 d (8,0) H-5' 133,6 C-2'
; C-4'
; C-7'
b
7' 165,8

Produit GE1
1 105,7
2 167,5
3 6,29 d (2,2) H-5 101,9 C-1; C-5
4 168,0
5 6,25 d (2,2) H-3 105,0 C-1; C-3
6 155,1
7 188,5
8 165,6
8-OCH2 3,78 q (7,1) CH3 63,3 C-8
CH3 1,07 t (7,1) 8-OCH2 13,9
1' 130,1
2' 8,10 de (7,2) H-3' 131,5 C-4'; C6'/2'; C-7'
3' 7,57 te (7,8; 6,5) H-2'
; H-4' 130,1 C-1'; C5'/3'
4' 7,72 te (6,4; 1,8) H-3'
; H-5' 135,6 C-2'; C-6'
5' 7,57 te (7,8; 6,5) H-4'
; H-6' 130,1 C-1'; C3'/5'
6' 8,10 de (7,2) H-5' 131,5 C2'/6'; C-4'; C-7'
7' 165,6
a, b
Les assignements peuvent être interchangeables

123
 Finalement, GE1, KE1, QE1 et ME1 sont identifiés respectivement comme (Figure
43) :

3,5-dihydroxy-2-(7-éthoxyloxycarbonyl-7-oxo)phényl benzoate.
3,5-dihydroxy-2-(7-éthoxyloxycarbonyl-7-oxo)phényl 4-hydroxybenzoate.
3,5-dihydroxy-2-(7-éthoxyloxycarbonyl-7-oxo)phényl 3,4-dihydroxybenzoate.
3,5-dihydroxy-2-(7-éthoxyloxycarbonyl-7-oxo)phényl 2,4-dihydroxybenzoate.

124
 OH OH

H 3' 3'
2' 4' OH H 2' 4' OH
OH
1'
B 1'
B
3' O O
2' 4' OH H 5' H H 5' H
7' 6' 7' 6'
B 3 3
HO O HO 2 O H HO 2 O H
7 2 O O
4 4
A C A 1 A 1
5 7 8 5 7 8
3 OH H 6 OCH2CH3 H 6 OH
5
OH O OH O OH O

quercétine QE1 QM2

H H

H 3' 3'
2' 4' OH H 2' 4' OH

1'
B 1'
B
3' O O
2' 4' OH H 5' H H 5' H
7' 6' 7' 6'
B 3 3
HO O HO 2 O H HO 2 O H
7 2 O O
4 4
A C A 1 A 1
5 7 8 5 7 8
3 OH H 6 OCH2CH3 H 6 OH
5
OH O OH O OH O

kaempférol KE1 KM2

H H

HO 3' 3'
2' 4' OH HO 2' 4' OH

1'
B 1'
B
HO 3' O O
2' 4' OH H 5' H H 5' H
7' 6' 7' 6'
B 3 3
HO O HO 2 O H HO 2 O H
7 2 O O
4 4
A C A 1 A 1
5 7 8 5 7 8
3 OH H 6 OCH2CH3 H 6 OH
5
OH O OH O OH O

morine ME1 MM2

H H

H 3' 3'
2' 4' H H 2' 4' H

1'
B 1'
B
3' O O
2' 4' H 5' H H 5' H
7' 6' 7' 6'
B 3 3
HO O HO 2 O H HO 2 O H
7 2 O O
4 4
A C A 1 A 1
5 7 8 5 7 8
3 OH H 6 OCH2CH3 H 6 OH
5
OH O OH O OH O

galangine GE1 GM2

Figure 43 : Structures chimiques des produits issus de la radiolyse des flavonols (quercétine,
morine, kaempférol et galangine) dans l’ éthanol.

125
 Au cours de la radiolyse dans le méthanol ou dans l’ éthanol, les flavonols étudiés sont
transformés en :
(i) produits majoritaires : QM1, MM1, KM1 et GM1 (formés respectivement
après irradiation de la quercétine, de la morine, du kaempférol et de la
galangine dans le méthanol), et QE1, ME1, KE1 et GE1 (formés dans
l’ éthanol).
(ii) produits minoritaires parmi lesquels nous avons identifié : QM2, MM2,
KM2 et GM2 formés après dégradation, dans les deux milieux d’ irradiation
(méthanol et éthanol).
Ces 12 composés possèdent une structure de base commune : deux cycles aromatiques
liés entre eux par une fonction ester (Figure 2). Ils diffèrent par le nombre d’ hydroxylation
sur le cycle B, et également par la nature du groupement lié au carbone C-8. Nous constatons
que ces composés constituent un nouveau groupe de molécules qui appartiennent à la famille
des depsides.

III.1. RENDEMENT RADIOLYTIQUE ET COURBE DE DILUTION

Pour calculer les rendements radiolytiques, nous avons utilisés la même méthode pour
tous les flavonols étudiés et nous développons à titre d’ exemple, la radiolyse de la quercétine
dans les deux solvants :

Première étape

Dans un premier temps, nous avons établi une courbe d’ étalonnage concentration-
surface du pic CLHP pour la quercétine, QM1 et QE1.

Deuxième étape

A partir des chromatogrammes obtenus pour chaque concentration initiale de

quercétine (5 x 10-5 M, 10-4 M, 2,5 x 10-4 M, 5 x 10-4 M, 10-3 M et 5 x 10-3 M) irradiée avec
différentes doses (0,2 kGy à 20 kGy) (Figures 27, 28 et 41) et à partir de l’ étalonnage

126
précédent, nous avons suivi l’ évolution de la disparition de quercétine et de la formation de
QM1 et QE1 (Figures 44 a et 44 b).

5
(A) 1,0
(B)

4 2
0,8
Concentration (10 M)

Concentration (10 M)
R = 0,997
-5

-4
3 0,6
2
R = 0,999

2 0,4
2
R = 0,999
2
R = 0,993

1 0,2

0 0,0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
Dose (kGy) Dose (kGy)

2,5
(C) 2
5 (D)
R = 0,998

2,0 4
Concentration (10 M)

Concentration (10 M)

2
R = 0,997
-4

-4

1,5 3

1,0 2 2
R = 0,999

2
0,5 R =0,999
1

0,0 0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0 1 2 3
Dose (kGy) Dose (kGy)

1 (E) 5 (F)
2
R = 0,987

0,8 4
Concentration (10 M)

Concentration (10 M)
-3

-3

2
R = 0,993
0,6 3

0,4 2

0,2 1
2
2
R = 0,988
R = 0,985

0 0
0 2 4 6 0 2 4 6 8 10 12 14
Dose (kGy) Dose (kGy)

Figure 44 a : Consommation de quercétine (∆) et formation de QM1 ( ) en

fonction de la dose et pour différentes concentrations initiales de quercétine : 5 x
10-5 M (A), 10-4 M (B), 2,5 x 10-4 M (C), 5 x 10-4 M (D), 10-3 M (E), 5 x 10-3 M
(F). Le débit de dose est 0,22 Gy/s. Solvant : méthanol en solutions non
désaérées.

127
 5
(A) 1
(B)

4 0,8
Concentration (10 M)

Concentration (10 M)
2
R = 0,970
-5

-4
2
R = 0,977
3 0,6

2 0,4
2
R = 0,975
2
R = 0,979

1 0,2

0 0
0 0,5 1 1,5 2 0 0,5 1 1,5 2
Dose (kGy) Dose (kGy)

5
2,5
(C) 2
R = 0,987
(D)
4
2 2
R = 0,993
Concentration (10 M)

Concentration (10 M)
-4

-4

1,5 3

2
R = 0,982

1 2

0,5
2
R = 0,989 1

0 0
0 1 2 3 0 1 2 3 4
Dose (kGy) Dose (kGy)

5
1,0 (E) (F)
2
R = 0,985
4
0,8
Concentration (10 M)

Concentration (10 M)
-3

-3

3
0,6 2
R = 0,984

0,4 2

0,2 1
2
R = 0,981 2
R = 0,987

0,0 0
0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 10 12 14
Dose (kGy) Dose (kGy)

Figure 44 b : Consommation de quercétine (∆) et formation de QE1 ( ) en

fonction de la dose et pour différentes concentrations initiales de quercétine : 5 x
10-5 M (A), 10-4 M (B), 2,5 x 10-4 M (C), 5 x 10-4 M (D), 10-3 M (E), 5 x 10-3 M
(F). Le débit de dose est 0,22 Gy/s. Solvant : éthanol en solutions non désaérées.

128
 Troisième étape

Les courbes obtenues (Figures 44 a et b) sont des droites. Les rendements

radiolytiques de la quercétine, de QM1 et de QE1 sont calculés, à partir des pentes de ces
droites, pour chaque concentration initiale du soluté en utilisant l’ équation (éq. 1)
précédemment décrite au chapitre IV :

10 6 M
G= µmol J -1
s D

ρs est la densité du solvant, D est la dose absorbée (Gy) et ∆M est la concentration (M).

M
Dans cette expression, représente la pente des droites illustrées sur les Figures
D
44 a et b décrivant l’ évolution de la concentration en fonction de la dose.

Ces calculs permettent de reporter sur la Figure 45, l’ évolution du rendement de

disparition de la quercétine et celui de formation de QM1 et QE1 en fonction de la
concentration initiale de quercétine.

129
 0,40
Rendement radiolytique G(µmol J )
-1

0,30

0,20 (A)

0,10

0,00
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005
Concentration initiale de la quercétine

0,40
Rendement radiolytique G(µmol J )
-1

0,30

0,20

(B)

0,10

0,00
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005
Concentration initiale de la quercétine

Figure 45 : Rendement radiolytique de disparition de la quercétine ( ) et de formation

de QM1 et QE1 ( ). (A) et (B) correspondent respectivement à la radiolyse dans le
méthanol et dans l’ éthanol.

Pour des concentrations inférieures à 10-4 M, G(-quercétine)méthanol ≅ G(QM1) et G(-

quercétine)éthanol ≅ G(QE1).

130
 Pour des concentrations supérieures à 10-4 M, nous observons que les deux courbes
représentatives du rendement de disparition de la quercétine sont au-dessus de celles décrivant
les rendements de QM1 et de QE1.

Il est à noter également que le rendement de disparition, dans le méthanol ou dans

l’ éthanol, augmente d’ abord avec la concentration initiale de quercétine puis atteint un palier
pour des concentrations supérieures à 10-3 M. Ce résultat est en accord avec ce que l’ on
appelle l’ effet de dilution que nous avons décrit précédemment (voir chapitre IV). En effet, au
palier de la courbe de dilution, le rendement de disparition de la quercétine est indépendant de
la concentration initiale, et G(-quercétine)méthanol ≅ G(HMR) et G(-quercétine)éthanol ≅ G(HER)
(voir les Tableaux 7 et 8 chapitre IV pour les valeurs de rendements G(HMR) et G(HER) de
la bibliographie).
Les mêmes résultats sont obtenus pour les autres flavonols (kaempférol, morine et
galangine). Nous proposons dans un premier temps que seuls HMR et HER sont responsables
de la dégradation des flavonols et, par conséquent, la formation de QM1 et QE1.

Il nous reste maintenant à déterminer le site primaire où la réaction flavonols-

HMR/HER se déclenche.

HMR et HER peuvent réagir avec les flavonoïdes :

(i) soit au niveau des groupes 2’ -OH, 3’ -OH ou 4’ -OH sur le cycle B,
(ii) soit au niveau des groupes 5-OH et 7-OH sur le cycle A,
(iii) soit au niveau du groupe 3-OH.

Nous avons observé que durant leur radiolyse, les flavonols (quercétine, kaempférol,
morine et galangine) se transforment majoritairement en depsides après ouverture du cycle C,
cependant que les structures des deux cycles A et B ne sont pas affectées par l’ irradiation.
Ceci indique que les groupes 5-OH, 7-OH, 2’ -OH, 3’ -OH et 4’ -OH ne sont pas impliqués
dans la transformation des flavonols en depsides et que, par conséquent, nous pouvons exclure
les première et deuxième suppositions ((i) et (ii)). En revanche, le cycle B peut contribuer à la
formation de produits minoritaires. Par exemple, Jovanovic et ses collaborateurs ont montré
que les radicaux superoxydes réagissent avec les flavonoïdes au niveau du cycle B et
conduisent à la formation de quinones (Jovanovic, 1994).

131
 La radiolyse des flavones (lutéoline, apigénine et chrysine analogues de la quercétine,
du kaempférol et de la galangine, respectivement) et des flavonoïdes glycosides (rutine et
astragaline) a montré que ces deux groupes de flavonoïdes (caractérisés par l’ absence de 3-
OH ou la substitution par un sucre) ne se dégradent pas. Ce résultat démontre l’ importance du
groupe 3-OH dans la capacité des flavonoïdes à piéger les radicaux HMR et HER.

Nous avons également observé que la taxifoline (dihydroflavonol analogue de la

quercétine, caractérisée par l’ absence de la double liaison C2-C3) et la (-)-épicatéchine
(flavan-3-ol analogue de la quercétine, caractérisée par l’ absence de la fonction 4-oxo et de la
double liaison C2-C3) n’ ont pas été dégradées par irradiation. Ceci nous permet d’ avancer
que la double liaison C2-C3 est également un paramètre important dans la dégradation des
flavonoïdes en depsides.

En réunissant tous ces résultats, nous proposons que le groupe 3-OH des flavonols est
le site redox primaire d’ attaque de HMR et HER, alors que la double liaison C2-C3 permet
l’ ouverture du cycle C, et de ce fait joue un rôle complémentaire dans la transformation des
flavonols en depsides (Figures 39 et 43).

Par le truchement de toutes ces discussions, nous pouvons proposer un premier

mécanisme de transformation de la quercétine, de la morine, du kaempférol et de la galangine
en depsides ((QM1, QE1 et QM2), (MM1, ME1 et MM2), (KM1, KE1 et KM2) et (GM1,
GE1 et GM2), respectivement) (Figure 46). La première étape est le transfert d’ un atome
d’ hydrogène à partir du groupe 3-OH au profit des radicaux HMR ou HER aboutissant à la
formation du flavonoxy Fl-O• et d’ une molécule de méthanol ou d’ éthanol. La deuxième
étape est la réduction de la double liaison C2-C3 suivie de la formation d’ une fonction cétone
en position 3 via un effet mésomère (F1•). Les solutions non désaérées avec lesquelles nous
avons travaillé contiennent 2,2 10-4 M d’ oxygène. Ce dernier peut oxyder rapidement le
radical carboné F1• et conduire à la formation du radical peroxyle (F2•). En réagissant avec le
méthanol ou l’ éthanol, F2• se transforme en un hydroperoxyde organique (F3). Cette réaction
est accompagnée de la formation de HMR ou HER. Les hydroperoxydes organiques étant des
composés très instables à cause de la faible énergie de dissociation de la liaison O-O, F3 se
décompose alors en un radical hydroxyle (•OH) et un radical alcoxyle (F4•).

132
 Flavonols (Fl-OH) R1 Fl-O• R1

R R2 R R2

R•
HO O HO O

+ S
H .
O O
étape 1
OH O OH O

quercétine (R = H, R1= R2 = OH)

morine (R = R2 = OH, R1 = H)
kaempférol (R = R1 = H, R2 = OH) étape 2
galangine (R = R1 = R2 = H)

R1 R1

F2• .O R R2 F1• R R2

O
HO O HO O •
O2
O étape 3 O

OH O OH O

étape 4 S

R1 R1

F3 R R2 F4• R R2
HO
O
.O
HO O HO O

•
R + + •OH
O étape 5 O

OH O OH O

étape 6
R1 R1

R R2 R R2
F5• O
O HO O
X•
HO O
•
O étape 7 O

OH O
OR'

OH O •
étape 8 OH
Depsides (D1)
R1

R R2
R = CH3
O
QM1 (R = H, R1= R2 = OH)
MM1 (R = R2 = OH, R1 = H) HO O
O
KM1 (R = R1 = H, R2 = OH)
GM1 (R = R1 = R2 = H) OH

OH O

R = CH2CH3 Depsides (D2)

QE1 (R = H, R1= R2 = OH) Q2 (R = H, R1= R2 = OH)

ME1 (R = R2 = OH, R1 = H) M2 (R = R2 = OH, R1 = H)
KE1 (R = R1 = H, R2 = OH) K2 (R = R1 = H, R2 = OH)
GE1 (R = R1 = R2 = H) G2 (R = R1 = R2 = H)

Figure 46 : Mécanisme réactionnel proposé pour la transformation des flavonols, au

cours de leur radiolyse en solutions méthanoliques ou éthanoliques non désaérées, en
depsides. R• représente HMR ou HER et X• représente CH3O• ou CH2CH3O•. S est le
solvant, méthanol ou éthanol.
133
 F4• peut se transformer, en cassant la liaison C2-C3 voisine, en un autre radical F5•.
Ceci aboutit à l’ ouverture du cycle C et la formation d’ une deuxième fonction cétone en
position 2. F5• peut se recombiner avec CH3O• (milieu méthanolique) ou avec CH3CH2O•
(milieu éthanolique) pour former des depsides (QM1, MM1, KM1 et GM1) ou (QE1, ME1,
KE1 et GE1), respectivement. De la même manière, le radical •OH, formé après la
décomposition de F3, peut réagir avec F5• et conduire à la formation des depsides hydroxylés
en position 8 (QM2, MM2, KM2 et GM2). Ces derniers composés sont formés en faibles
quantités (produits minoritaires). Ceci peut être dû au fait que seule une faible quantité de
radicaux •OH ne sont pas piégés par le solvant (méthanol et éthanol reconnus pour leur grande
réactivité vis-à-vis de •OH).

Un mécanisme similaire a été récemment proposé pour la quercétine et le kaempférol

(Kaizer, 2001). En effet, il a été montré qu’ en présence des radicaux tels que 2,2,6,6-
tétraméthyl-1-piperidinyloxyl (TEMPO) et 2,6-di-tert-butyl-a-(3,5-di-tert-butyl-4-oxo-2,5-
cyclohexadien-1-ylidene)-p-totyloxyl (galvinoxyl), les deux flavonols subissent une
oxygénation catalytique et se transforment en depsides avec libération de CO (Figure 47).

quercétine (R = OH)
kaempférol (R = H)
R R R

OH OH OH

.
HO O rad HO O HO O
.

OH -radH .
O étape 2 O

OH O OH O OH O
étape 1

+ O2
depsides R
R R
OH
OH
.O OH
O
O
HO O HO O
HO O
radH O
. O
-rad - CO O étape 3 O
OH
OH O .
étape 4 OH O
OH O

Figure 47 : Les radicaux TEMPO et galvinoxyl (rad.) initient la transformation de la

quercétine et du kaempférol en depsides. Mécanisme proposé par Kaizer et ses
collaborateurs (Kaizer, 2001).

134
 Dans ce mécanisme (Figure 47), il a été proposé (étape 3) que le radical peroxyle se
transforme en radical alcoxyle pour lequel l’ électron célibataire est porté par l’ oxygène lié au
carbonyle 4, ce qui favorise la libération de CO. En comparaison avec le mécanisme de la
Figure 46, nous avons proposé que le radical peroxyle (F2•) réagit avec l’ alcool et conduit à
la formation d’ un hydroperoxyde organique (F3). C’ est la différence au niveau de cette étape
intermédiaire qui peut expliquer le fait que les depsides QM1, MM1, KM1, GM1, QE1, ME1,
KE1, GE1, QM2, MM2, KM2 et GM2 ont conservé leur fonction CO (carbonyle 7) (Figure
46). Mis à part ce détail, les radicaux TEMPO, galvinoxyl, HMR et HER jouent le même rôle
puisqu’ ils réagissent tous avec le groupe 3-OH des flavonols menant à l’ ouverture du cycle C
et par conséquent à la formation de depsides.

Nous avons suggéré que, grâce à leur groupe 3-OH, les flavonols réagissent avec
HMR et HER en leur cédant un atome d’ hydrogène (Figure 46). En modélisation
moléculaire, comme nous l’ avons évoqué précédemment (matériels et méthodes), ce transfert
d’ hydrogène se traduit par l’ énergie de dissociation ou BDE. En conséquence, il nous est
apparu important de calculer les valeurs de BDE pour tous les flavonoïdes étudiés (Tableau
15). Rappelons que plus la valeur de BDE est faible plus la capacité à céder l’ atome
d’ hydrogène est importante.

135
 Tableau 15 : BDE (kcal/mol) calculées pour chaque groupement OH des flavonoïdes en
utilisant la méthode AM1 (Marfak, 2003e).

OH-substitutions
Flavonoïde s Composé
3-OH 5-OH 7-OH 2' -OH 3' -OH 4'
-OH
Flavonols quercétine 31,6 47,5 45,9 32,8 32,9
morine 31,7 47,9 46,1 40,4 41,1
kaempférol 31,3 47,7 45,8 38,6
galangine 31,3 47,6 45,7
Flavones lutéoline 48,2 44,3 33,4 33,4
apigénine 48,2 44,2 39,3
chrysine 48,2 44,3
Dihydroflavonols (2S3S)-taxifoline 60,9 46,9 45,2 32,1 31,8
(2R3R)-taxifolin 60,9 47,2 45,1 32,8 32,4
Flavanone s S-ériodictyol 47,1 44,6 32,7 36,2
R-ériodictyol 47 44,5 36,6 32,1
S-naringénine 46,9 44,5 38,1
R-naringénine 46,9 44,5 38,1
Flavan-3-ols (-)-épicatéchine 58,9 38,1 40,28 32,9 36,1

Nous observons que les valeurs de BDE les plus faibles sont obtenues pour le
groupement 3-OH des flavonols (quercétine, kaempférol, morine et galangine), ce qui indique
que ce groupement est le plus apte à céder un atome d’ hydrogène, et par conséquent confirme
la première étape du mécanisme de transformation des flavonols en depsides (Figure 46).
De plus, ces valeurs sont deux fois inférieures à celles du groupe 3-OH de la taxifoline
(absence de la double liaison C2-C3) (60,9 kcal/mol) et de l’ épicatéchine (absence de la
double liaison C2-C3 et de la fonction 4-oxo) (58,9 kcal/mol). Ce résultat est en accord, d’ une
part avec le fait que ces deux molécules ne se dégradent pas au cours de l’ irradiation, et
d’ autre part, avec le fait que la double liaison C2-C3 est un paramètre important dans la
dégradation des flavonols en depsides, puisque sa présence favorise la transformation du
radical flavonoxy (Fl-O•), par effet de mésomérie, en radical F1• (Figure 46).

Un autre paramètre qui contribue à la confirmation de notre mécanisme réactionnel

(Figure 46) est la répartition de la bande SOMO. Après avoir cédé un atome d’ hydrogène à
HMR ou HER, le flavonol se transforme en radical flavonoxy (Fl-O•). L’ électron célibataire
est essentiellement représenté par la SOMO, qui doit être délocalisée pour stabiliser le radical.
En revanche, si l’ électron et donc la SOMO sont localisés sur un site bien déterminé du
radical, celui-ci devient instable et réagit très vite avec les molécules avoisinantes.

136
 Pour tous les flavonols étudiés, nous avons réalisé un calcul au niveau AM1 de la
distribution spatiale de la SOMO pour les radicaux flavonoxy formés après arrachement de
l’ atome d’ hydrogène du groupement 3-OH (Marfak, 2003e). Sur la Figure 48, nous avons
représenté la distribution de la SOMO sur le radical flavonoxy issu de la quercétine. Le même
résultat est obtenu pour les autres radicaux issus du kaempférol, de la morine et de la
galangine.

Figure 48 : Répartition spatiale de la couche SOMO sur le radical flavonoxy formé

après arrachement de l’ atome d’ hydrogène à partir du groupement 3-OH de la
quercétine.

Nous observons que la SOMO est localisée sur le carbone C2. Ceci confirme les
deuxième et troisième étapes du mécanisme proposé pour la transformation des flavonols en
depsides (Figure 46). En effet, nous avons suggéré l’ existence du radical F1• dont l’ électron
célibataire est sur le carbone C2, ce qui permet l’ addition d’ oxygène moléculaire sur ce site
pour former F2•.

137
 Les dioxygénases sont des enzymes qui utilisent l’ oxygène moléculaire pour oxyder
leurs substrats. Ce sont des métalloprotéines qui jouent un rôle important dans la biosynthèse
et le catabolisme de certains composés. Par exemple, la quercétine 2,3-dioxygénase extraite à
partir du champignon Aspergillus flavus, est une enzyme cuivre-dépendante (Oka, 1971) qui
catalyse l’ oxydation de la quercétine en depside avec libération de CO (Oka, 1972).
Récemment, Kooter et ses collaborateurs ont isolé cette enzyme à partir d’ un autre
champignon (Aspergillus japonicus), et ont étudié sa réactivité sur différents groupes de
flavonoïdes (Kooter, 2002). Ils ont observé que l’ enzyme réagit avec les flavonols et conduit à
leur transformation en depsides. Les flavones (absence du groupe 3-OH), les flavanones
(absence de la double liaison C2-C3) et les flavan-3-ols (absence de la double liaison C2-C3
et de la fonction 4-oxo) ne sont pas dégradés. On peut déduire que la présence simultanée du
groupement 3-OH et de la double liaison C2-C3 est responsable de la dégradation des
flavonols par la quercétine 2,3-dioxygénase (Figure 49).

Flavonols R3 ' E-Fl R3 '

.
E-Fl R3 '

R2' R4 ' R2 ' R4 ' R2 ' R4 '

HO O
Cu2+-E HO O HO O
.

OH O O

OH O OH O OH O
2+
Cu -E Cu+-E

+ O2

R3 '

Depsides R2 ' R4 ' E-Fl-O2 R3 '

R2' R4 '
O
HO O
HO O
+ CO + Cu2+-E O
O
O
OH
OH O
Cu2+-E
OH O

Figure 49 : Mécanisme de dégradation des flavonols par l’ enzyme, quercétine 2, 3-

dioxygénase (Cu2+-E) (Kooter 2002).

138
 Le mécanisme réactionnel propose, dans un premier temps, que l’ enzyme s’ attache au
flavonol, via son ion Cu2+ au niveau du site liant les groupes 3-OH et 4-oxo, ce qui conduit à
la formation d’ un complexe (E-Fl) (Figure 49). Par effet de mésomérie, E-Fl se transforme en
radical E-Fl•, qui après réaction avec le dioxygène au niveau du carbone C2 conduit à la
formation d’ un autre complexe E-Fl-O2. Ce complexe oxygéné se décompose ensuite en
depside avec libération de CO et régénération de l’ enzyme (Figure 49).

En comparaison avec nos résultats, nous constatons que la quercétine 2,3-dioxygénase

et les radicaux HMR et HER jouent le même rôle dans la dégradation des flavonols, puisqu’ ils
réagissent tous au niveau du groupe 3-OH et conduisent à l’ ouverture du cycle C grâce à la
présence de la double liaison C2-C3.

L’ ouverture du cycle C a été également observée au cours de la dégradation de

certains flavonoïdes comme la quercétine, le kaempférol et la naringénine, par des bactéries
du genre Clostridium, isolées à partir des matières fécales humaines (Winter, 1989). En effet,
ces bactéries synthétisent des enzymes capables de causer la cassure du cycle C au niveau de
la liaison C3-C4 du flavonoïde. Les bactéries Eubactérium ramulus et methanogenic
Consortia sont aussi capables de dégrader la rutine et la quercétine en les transformant en
depsides (Schneider, 1999 ; Herrmann, 2001). Là aussi, le mécanisme métabolique a suggéré
la présence de quercétine 2,3-dioxygénase.

Par ailleurs, la formation des depsides a été également observée chez les champignons.
Par exemple, Bars et ses collaborateurs ont rapporté que la dégradation de la rutine en depside
est due à la présence de trois enzymes secrétées par le champignon (Barz, 1975). Dans une
première étape, la β-glycosidase hydrolyse la rutine en quercétine. Ensuite, sous l’ action de la
quercétine 2,3-dioxygénase, la quercétine se convertit en depside et ceci en libérant du
monoxyde de carbone (CO). La dernière étape fait appel à l’ estérase qui favorise le
détachement des deux cycles constituants le depside, conduisant à la formation de deux acides
aromatiques : 3,4-dihydroxy acide benzoïque et 2,4,6-trihydroxy acide benzoïque.

Quoique l’ irradiation ne puisse pas être considérée comme un modèle in vitro de la

dégradation des flavonoïdes par les enzymes, puisque certains processus enzymatiques sont
très spécifiques et que l’ irradiation ne peut pas les reproduire, la radiolyse des flavonols dans
le méthanol et dans l’ éthanol conduit à la formation d’ un nouveau groupe de depsides

139
similaire à celui formé au cours de la dégradation des flavonols par la quercétine 2,3-
dioxygénase (Balogh-Hergovich, 2000 ; Barhàcs, 2001 ; Kooter, 2002).

Comme nous venons de le voir, en les irradiant en solutions méthanoliques ou

éthanoliques, les flavanones, les dihydroflavonols, les flavones, les flavan-3-ols et les
flavonoïdes glycosides ne sont pas affectés. En revanche, les flavonols sont transformés en
une nouvelle série de depsides. Nous avons proposé que cette transformation structurale est
due au piégeage, par les flavonols, des radicaux HMR et HER présents dans le milieu
d’ irradiation. Rappelons que c’ est le groupe 3-OH de ces molécules qui réagit avec les deux
radicaux en leur cédant un atome d’ hydrogène, conduisant à la formation d’ un radical
flavonoxy (Figures 46). Pour déterminer la relation entre la structure des flavonoïdes et leur
capacité à piéger ces radicaux, il nous est apparu nécessaire de calculer les constantes de
vitesse des réactions flavonols – HMR/HER.

VI.1. CALCUL DES CONSTANTES DE VITESSE DE REACTION DES

FLAVONOLS AVEC HMR ET HER POUR LE PREMIER MECANISME

En se basant sur la Figure 46, nous pouvons écrire le schéma cinétique suivant :

e s- + SH + 
→ H • + S (51)

H• + S 
→ R • + H 2 (52)

X • + S →
k 53
R• + S (53)
R • + R • →
k 54
produits (54)

R • + Fl - OH →
k 55
F1• + S (55)
F1• + O 2 
→ F2 • (56)

F2 • + S 
→ F3 + R • (57)
→ F4 • + • OH
F3  (58)
F4 • 
→ F5 • (59)
F5 • + X • 
→ D1 (60)

140
 F5 • + • OH 
→ D2 (61)
•
→ R • + H 2 O
OH + S  (62)

Dans ce schéma cinétique, Fl-OH représente les flavonols (quercétine, morine,

kaempférol et galangine). S est le solvant (méthanol ou éthanol). R• est •CH2OH ou
CH3•CHOH. X• est CH3O• ou CH3CH2O•. Fl-O•, F1•, F2•, F3, F4• et F5• sont les intermédiaires
de la Figure 46. D1 et D2 représentent respectivement les depsides majoritaires (QM1, MM1,
KM1, GM1, QE1, ME1, KE1 et GE1) et minoritaires (QM2, MM2, KM2 et GM2).

L’ application du principe des états stationnaires sur H•, X•, R•, F1•, F2•, F3, F4•, F5•, et
•
OH permet d’ écrire :
d[H • ]
= a s IG(H • ) + v 51 - v 52 = 0 (éq. 14)
dt
d[X • ]
= a s IG(X • ) - v 53 - v 60 = 0 (éq. 15)
dt
d[R • ]
= a s IG(R • ) + v 52 + v 53 - 2v 54 - v 55 + v 57 + v 62 = 0 (éq. 16)
dt
d[F1• ]
= v 55 - v 56 = 0 (éq. 17)
dt
d[F2 • ]
= v 56 - v 57 = 0 (éq. 18)
dt
d[F3]
= v 57 - v 58 = 0 (éq. 19)
dt
d[F4 • ]
= v 58 - v 59 = 0 (éq. 20)
dt
d[F5• ]
= v 59 - v 60 - v 61 = 0 (éq. 21)
dt
d[ • OH]
= v 58 - v 61 - v 62 = 0 (éq. 22)
dt
Où I est le débit de dose (0,22 Gy/s) et as = ρs x 10-6.

A partir de ces équations, nous obtenons :

v 52 = a s IG(H • ) + v 51 (éq. 23)

141
 v 53 = a s IG(X • ) - v 60 (éq. 24)

a s IG(R • ) + v 52 - 2 v 54 + (v 53 + v 57 - v 55 ) + v 62 = 0 (éq. 25)

v 55 = v 56 = v 57 = v 58 = v 59 = v 60 + v 61 (éq. 26)

Substituons (éq. 23), (éq. 24) et (éq. 26) dans (éq. 25), nous aboutissons à :

a s IG(R • ) + a s IG(H • ) + v 51 - 2 v 54 + (a s IG(X • ) - v 60 ) + v 62 = 0 (éq. 27)

Puisque v 62 = v 60 (à partir de éq. 20 – éq. 22) et v 51 = a s IG(e -s ), alors :

2 v 54 = a s IG tot avec G tot = G(e -s ) + G(H • ) + G(X • ) + G(R • )

D’ où,
a s IG tot
[R • ] = (éq. 28)
2k 54

D’ un autre côté, on a :
a s IG(−Fl - OH) = k 55 [Fl - OH][R • ] (éq. 29)

Insérons (éq. 28) dans (éq. 29), nous obtenons l’ évolution du rendement de disparition
de chaque flavonol en fonction de sa concentration initiale :

k 55 a s IG tot
G(− Fl - OH) = [Fl - OH] (éq. 30)
asI 2k 54

Sur la Figure 50, nous avons tracé l’ ensemble des points expérimentaux G(-Fl-OH) de
chaque flavonol (quercétine, morine, kaempférol et galangine) en fonction de sa concentration
initiale. Ces rendements sont calculés suivant les démarches précédemment détaillées (pages
126-129).

142
 0,70

0,60

0,50
G(-Fl-OH) (µmol J-1)

0,40
(A)
0,30

0,20

0,10

0,00
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005
Concentration initiale des flavonols (M)

0,50

0,40
G(-Fl-OH) (µmol J-1)

0,30

(B)
0,20

0,10

0,00
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005
Concentration initiale des flavonols (M)

Figure 50 : Rendements de disparition des flavonols en fonction de leurs

concentrations initiales. Les points représentent les valeurs expérimentales ( :
quercétine, : kaempférol, ∆: morine et galangine), et les droites
représentent les rendements théoriques donnés par l’ équation (éq. 30). (A) :
radiolyse dans le méthanol, et (B) : radiolyse dans l’ éthanol.

143
 Nous observons que pour des concentrations inférieures à 10-4 M, les valeurs
expérimentales de G(-Fl-OH) augmentent linéairement avec [Fl-OH]. Pour des concentrations
supérieures, G(-Fl-OH) atteint un plateau.
En comparaison avec l’ équation (éq. 30) dans laquelle les rendements de disparition
k 55 a s IG tot
des flavonols sont des droites de pentes , nous constatons que ces formules
asI 2k 54

théoriques ne sont valables que si [Fl-OH] ≤ 10-4 M. Dans cette gamme de concentrations, les
pentes sont alors calculées par régression linéaire, ce qui permet de déterminer les constantes
de vitesse k55 pour les différents flavonols étudiés (Tableau 16).

Tableau 16 : Constantes de vitesse de réaction des flavonols avec HMR

et HER calculées, pour les faibles concentrations des flavonols, à partir
de l’ équation (éq. 30) et de la Figure 50.

Flavonols k55(flavonol-HMR) k55(flavonol-HER)

4 4
quercétine 6,2 x 10 4,9 x 10
4 4
kaempférol 4,7 x 10 3,6 x 10
4 4
morine 4,1 x 10 2,8 x 10
4 4
galangine 2,4 x 10 1,7 x 10

En conclusion, le mécanisme proposé Figure 46 (page 133) et qui aboutit à

l’ expression du rendement donné par (éq. 30) ne permet pas de décrire la transformation des
flavonols en depsides aux fortes concentrations. Pour décrire le phénomène dans cette gamme
de concentrations, nous pouvons supposer que les flavonols réagissent avec les espèces
radicalaires qui aboutissent à la formation de HMR ou HER, notamment X• (CH3O• ou
CH3CH2O•). En effet, nous avons vu au chapitre IV que, si sa concentration est élevée, le
soluté peut intervenir dans l’ étape diffusionnelle. Deux hypothèses sont alors envisageables :

1ère hypothèse : L’ oxygène participe toujours aux réactions de dégradation des

flavonols.

2ème hypothèse : La probabilité de l’ oxygène, à intervenir dans les étapes

intermédiaires du mécanisme de transformation des flavonols en depsides, diminue aux fortes
concentrations.

144
VI.2. LA TRANSFORMATION FLAVONOLS–DEPSIDES : LE MECANISME
CORRIGE (CALCUL DES VITESSES DE REACTION)

1ère hypothèse : En supposant qu’ un flavonol peut réagir avec un radical X•, on doit
simplement ajouter, dans le schéma cinétique précédent, la réaction suivante :

X • + Fl - OH →
k 63
F1• + S (63)

L’ équation (éq. 29) devient :

a s IG(−Fl - OH) = k 55 [Fl - OH][R • ] + k 63 [Fl - OH][X • ] (éq. 31)

L’ application du principe des états stationnaires sur X• et F1• conduit respectivement

à:
d[X • ]
= a s IG(X • ) - v 53 - v 60 - v 63 = 0 (éq. 32)
dt
d[F1• ]
= v 55 + v 63 - v 56 = 0 (éq. 33)
dt
A partir de (éq. 32), nous obtenons :
a s IG(X • ) - v 60
[X • ] = (éq. 34)
k 53 [S] + k 63 [Fl - OH]

On a v 60 = a s IG(D1), ce qui donne :

• a s I(G(X • ) - G(D1))
[X ] = (éq. 35)
k 53 [S] + k 63 [Fl - OH]

Insérons (éq. 28) et (éq. 35) dans (éq. 31), on obtient :

k 55 a s IG tot (G(X • ) - G(D1))

G(-Fl - OH) = [Fl - OH] + k 63 [Fl − OH] (éq. 36)
asI 2k 54 k 53 [S] + k 63 [Fl - OH]

145
 Nous calculons maintenant les constantes de vitesse k55 et k63.

Sur la Figure 51, nous avons reporté l’ évolution du rendement expérimental de

chaque produit de radiolyse (D1) en fonction de la concentration initiale du flavonol à partir
duquel il se forme. Nous avons obtenu les équations suivantes :
1 1
= s + s (éq. 37)
G(D1) [Fl - OH]

Cette équation peut également s’ écrire sous la forme :

b s [Fl - OH]
G(D1) = , (éq. 38)
c s + [Fl - OH]

1
avec b s = et c s = s
.
s s

En introduisant (éq. 38) dans (éq. 36), nous obtenons :

k 55 a s IG tot
G(-Fl - OH) = [Fl - OH] +
asI 2k 54
(éq. 39)
c s G(X • ) + (G(X • ) - b s ) [Fl - OH]
k 63 [Fl - OH]
(k 53 [S] + k 63 [Fl - OH])(c s + [Fl - OH])

L’ évolution expérimentale du rendement de disparition des flavonols (Figure 52), est

alors modélisée par l’ équation suivante :

p1 [Fl - OH] + p 2 [Fl - OH]2 + p 3 [Fl - OH]3

G(-Fl - OH) = (éq. 40)
1 + q 1 [Fl - OH] + q 2 [Fl - OH]2

Les paramètres bs, cs, p1, p2, p3, q1 et q2 des deux modélisations (éq. 38 et 40) sont
répertoriés dans le Tableau 17.

146
 50 40 R2 = 0,9951
2
R = 0,9918
40
30
1/G(QM1)

1/G(QE1)
30

20
20

10
10

0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
3 3
10 /[quercétine] 10 /[quercétine]

50 70
2
2
R = 0,9995 R = 0,9948
60
40
50

30
40
1/G(KM1)

1/G(KE1)
30
20

20
10
10

0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
3 3
10 /[kaempférol] 10 /[kaempférol]

80
70 2
R = 0,9882
2
60 R = 0,985
60
50
1/G(MM1)

1/G(ME1)

40
40

30

20 20

10

0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
3 3
10 /[morine] 10 /[morine]

120
R2 = 0,9839 120
R2 = 0,9933
100
100

80
80
1/G(GM1)

1/G(GE1)

60
60

40
40

20 20

0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
3 3
10 /[galangine] 10 /[galangine]

Figure 51 : Evolution du rendement radiolytique de chaque produit de radiolyse

en fonction de la concentration du flavonol à partir duquel il se forme.
147
 0,50

0,40
G(-Fl-OH) (µmol J-1)

0,30

(A)
0,20

0,10

0,00
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005
Concentration initiale des flavonols (M)

0,40

0,30
G(-Fl-OH) (µmol J-1)

0,20
(B)

0,10

0,00
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005
Concentration initiale des flavonols (M)

Figure 52 : Rendements de disparition des flavonols en fonction de leurs

concentrations initiales. Les points représentent les valeurs expérimentales ( :
quercétine, : kaempférol, ∆: morine et galangine), et les courbes représentent les
équations empiriques (éq. 40). (A) : radiolyse dans le méthanol, et (B) : radiolyse
dans l’ éthanol.

148
 Tableau 17 : Les différents paramètres des équations empiriques (éq. 38) et
(éq. 40).

Flavonols
Solvant Paramè tre s
quercétine kae mpfé rol morine galangine
2 2 2 2
p1 9,81 x 10 5,65 x 10 5,43 x 10 4,16 x 10
5 4 4 4
p2 1,28 x 10 4,94 x 10 8,82 x 10 7,73 x 10
6 6 6 6
p3 9,00 x 10 2,90 x 10 2,41 x 10 1,92 x 10
3 2 2 2
Mé thanol q1 2,04 x 10 8,66 x 10 9,51 x 10 6,95 x 10
5 5 5 5
q2 4,10 x 10 2,43 x 10 3,21 x 10 3,52 x 10
-4 -4 -4 -4
cs 6,49 x 10 6,88 x 10 7,76 x 10 5,46 x 10
-1 -1 -1 -1
bs 1,71 x 10 1,53 x 10 1,62 x 10 1,28 x 10
2 2 2 2
p1 5,82 x 10 4,74 x 10 3,81 x 10 2,50 x 10
4 4 4 4
p2 4,75 x 10 4,87 x 10 3,52 x 10 1,08 x 10
7 6 6 6
p3 1,02 x 10 4,66 x 10 3,54 x 10 1,75 x 10
2 2 2 2
Ethanol q1 6,79 x 10 7,61 x 10 4,04 x 10 2,22 x 10
5 5 5 5
q2 3,72 x 10 2,75 x 10 2,53 x 10 1,63 x 10
-4 -3 -4 -3
cs 5,67 x 10 1,07 x 10 7,32 x 10 1,27 x 10
-1 -1 -1 -1
bs 1,32 x 10 1,19 x 10 1,25 x 10 1,12 x 10

En identifiant (éq.39 et éq. 40), quelque soit la concentration du flavonol étudié, les
différents paramètres doivent vérifier les relations suivantes :

p3 asI
k 55 = (éq. 41)
q2 a s IG tot
2k 54

k 53 [S] k a s IG tot
k 63 = •
p 1 - 55 (éq. 42)
G(X ) asI 2k 54

Les valeurs de k55 et k63 sont données dans le Tableau 18.

149
 Tableau 18 : Constantes de vitesse de réaction des flavonols avec HMR, HER,
CH3O et CH3CH2O calculées, pour les fortes concentrations des flavonols, à
partir des équations (éq. 41) et (éq. 42).

Mé thanol
Flavonols
-1 -1 • -1 -1
k55(flavonol-HMR) (M s ) k63(flavonol-CH3O ) (M s )
2 10
quercétine 4,4 x 10 1,7 x 10
2 9
kaempférol 2,3 x 10 9,6 x 10
2 9
morine 1,7 x 10 9,3 x 10
2 9
galangine 1,1 x 10 7,1 x 10
Ethanol
Flavonols
-1 -1 • -1 -1
k55 (flavonol-HER) (M s ) k63 (flavonol-CH3CH2O ) (M s )
2 10
quercétine 3,8 x 10 4,1 x 10
2 10
kaempférol 2,3 x 10 3,3 x 10
2 10
morine 1,9 x 10 2,7 x 10
2 10
galangine 1,5 x 10 1,7 x 10

Pour comparer avec les résultats obtenus expérimentalement, nous avons tracé, à titre
d’ exemple, l’ ensemble des points expérimentaux du rendement de disparition de la quercétine
pour des concentrations supérieures à 10-4 M (Figure 53). Nous avons également tracé la
courbe représentative de l’ équation théorique (éq. 39) avec les deux termes qui la composent
et qui représentent respectivement la contribution du radical R• et du radical X•.

150
 0,60

G(-quercétine) (µmol J-1)

0,40

0,20

0,00
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005
Concentration initiale (M)

Figure 53 : Rendement de disparition de la quercétine pour des

concentrations supérieures à 10-4 M. Les points sont les valeurs
expérimentales. La courbe en trait plein représente l’ équation
théorique (éq. 39), en tiret le terme R• et en pointillés le terme X•.
Solvant : méthanol.

2ème hypothèse : Dans le mécanisme proposé pour la transformation des flavonols en

depsides (Figure 46), le radical F1 se transforme en radical peroxyle par l’ addition de
l’ oxygène moléculaire (étape 3). En l’ absence de celui-ci, cette étape peut être remplacée par
une réaction de recombinaison radicalaire entre F1 et X (CH3O ou CH3CH2O ). Pour les
fortes concentrations, on pourrait alors proposer le mécanisme illustré sur la Figure 54.

151
 Flavonols (Fl-OH) R1 Fl-O• R1

R R2 R R2

R• ou X•
HO O HO O

+ S
H .
O
étape 1 O

OH O OH O

quercétine (R = H, R1= R2 = OH)

morine (R = R2 = OH, R1 = H)
kaempférol (R = R1 = H, R2 = OH) étape 2
galangine (R = R1 = R2 = H)

R1 R1

F2
R'
R R2 F1• R R2

O
HO O HO O •
X•
O
étape 3 O

OH O OH O

R = CH2CH3 (à partir de l’ éthanol)

= CH3 (à partir du méthanol)
étape 4 R•
R1

•
F3 R
.O
R2

HO O
CH3CH2OH (à partir du méthanol)
+ ou
O CH3CH(CH3CH2)OH (à partir d’ éthanol)
OH O

R1
étape 5
R R2
R1

F4• R R2 O

O
HO O
X• HO O
O
•
étape 6
O OR'

OH O OH O

Depsides (D1)

R = CH3

QM1 (R = H, R1= R2 = OH)

MM1 (R = R2 = OH, R1 = H)
KM1 (R = R1 = H, R2 = OH)
GM1 (R = R1 = R2 = H)

R = CH2CH3

QE1 (R = H, R1= R2 = OH)

ME1 (R = R2 = OH, R1 = H)
KE1 (R = R1 = H, R2 = OH)
GE1 (R = R1 = R2 = H)

Figure 54 : Mécanisme réactionnel proposé pour la transformation des flavonols

depsides. [Fl-OH] ≥ 5 x 10-4 M et solutions non désaérées. R• représente HMR ou
HER et X• représente CH3O• ou CH2CH3O•. S est le solvant, méthanol ou éthanol.
152
 A partir de la Figure 54, nous proposons le schéma cinétique suivant :

e s- + SH + 
→ H • + S (51)

H• + S 
→ R • + H 2 (52)

X • + S →
k 53
R• + S (53)
R • + R • →
k 54
produits (54)

R • + Fl - OH →
k 55
F1• + S (55)
X • + Fl - OH →
k 63
F1• + S (63)
F1• + X • 
→ F2 (64)
F2 + R • 
→ F4 • + produits (65)

F4 • + X • 
→ D1 (66)

Dans ce schéma cinétique, Fl-OH représente les flavonols (quercétine, morine,

kaempférol ou galangine). S est le solvant (méthanol ou éthanol). R• est •CH2OH ou
CH3•CHOH. X• est CH3O• ou CH3CH2O•. Fl-O•, F1•, F2 et F4• sont les intermédiaires de la
Figure 54. D1 représente les depsides majoritaires (QM1, MM1, KM1, GM1, QE1, ME1,
KE1 et GE1).

En utilisant les procédures détaillées pour le schéma cinétique précédent, nous

déterminons [R•] et [X•] :
asI
[R • ] = (G tot - 4G(D1)) (éq. 43)
2k 54

• a s I(G(X • ) - 2G(D1))
[X ] = (éq. 44)
k 53 [S] + k 63 [Fl - OH]

En introduisant ces deux équations et (éq. 38) dans (éq. 31), on obtient :

k 55 a s I c s G tot + (G tot - 4b s )[Fl - OH]

G(-Fl - OH) = [Fl - OH] +
asI 2k 54 c s + [Fl - OH]
(éq. 45)
c s G(X • ) + (G(X • ) - 2b s ) [Fl - OH]
k 63 [Fl - OH]
(k 53 [S] + k 63 [Fl - OH])(c s + [Fl - OH])

153
 Sur la Figure 55, nous avons tracé, l’ ensemble des points expérimentaux G(-
quercétine), et les différents termes de l’ équation (éq. 45).

0,50

0,40
G(-quercétine) (µmol J-1)

0,30

0,20

0,10

0,00
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005
Concentration initiale (M)

Figure 55 : Rendement de disparition de la quercétine pour des

concentrations supérieures à 10-4 M. Les points sont les valeurs
expérimentales. Les courbes en tirés et en pointillés et représentent
respectivement le premier et deuxième termes de l’ équation théorique
(éq. 45). La courbe en trait plein est la somme des deux termes.
Solvant : méthanol.

Pour les deux hypothèses, nous observons que le processus de dégradation, pour la
gamme de concentrations [10-4 M – 10-3 M], ne peut être décrit que par la somme des deux
termes des expressions (éq. 39) et (éq. 45) (Figures 53 et 55). Dans ce cas, les deux radicaux
HMR/CH3O• ou HER/CH3CH2O• contribuent à la dégradation des flavonols. Pour les très
fortes concentrations (> 10-3 M), on constate que les modèles ne décrivent plus les points
expérimentaux (Figures 53 et 55). Le résultat serait plus satisfaisant si l’ on ne prend en
compte que la contribution de X•.

154
 Pour résumer, il semble que l’ on puisse distinguer trois zones qui correspondent
chacune à un mécanisme (Figure 56).

0,50

0,40
G(-quercétine) (µmol J-1)

0,30

0,20

0,10

0,00
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005
Concentration initiale (M)

Figure 56 : Rendement de disparition de la quercétine. Les points sont les valeurs

expérimentales. La courbe en tiret représente la contribution de R• (éq. 30). La
courbe en pointillés correspond à la participation de R• et X• (éq. 39), et la courbe en
trait plein représente la contribution de X• (éq. 39, deuxième terme). Solvant :
méthanol.

Une première zone, pour les concentrations inférieures à 10-4 M et pour laquelle HMR
et HER sont les radicaux responsables de la dégradation des flavonols. Dans ce mécanisme
l’ oxygène moléculaire doit jouer un rôle primordial dans l’ ouverture du cycle. Ensuite, il y a
une zone intermédiaire, pour les concentrations comprises entre 10-4 M et 10-3 M, où l’ on
« rentre » dans l’ étape diffusionnelle et donc où le flavonol commence à réagir avec CH3O• ou
CH3CH2O•. Finalement, pour les concentrations supérieures à 10-3 M, les mécanismes que
nous avons proposés semblent montrer que la participation de HMR/HER devient
négligeable. Dans cette zone (Figures 53 et 55) on constate même que les modèles prenant en
compte X seulement, sous-estiment la valeur du rendement de disparition des flavonols. On
-
peut supposer, alors, que des espèces radicalaires tels que H• et e s participent en plus et de
façon non négligeable à la dégradation des flavonols.

155
 Afin de mieux définir le mécanisme réactionnel permettant d’ expliquer la
transformation des flavonols en depsides, il conviendra d’ effectuer la radiolyse des molécules
dans des solutions désaérées d’ une part, et dans des solutions saturées en oxygène d’ autre
part.

VI.2. STRUCTURE – ACTIVITE DES FLAVONOÏDES VIS-A-VIS HMR ET HER

Afin d’ établir la relation entre les structures chimiques des flavonoïdes et leur capacité
à piéger les radicaux HMR et HER, nous avons utilisé les constantes de réaction (k55)
(Tableau 16) comme indicateur de l’ activité antioxydante. Il est à noter que plus la valeur de
k55 est élevée, plus l’ activité de la molécule est importante.
La galangine, sans aucun groupe hydroxyle sur le cycle B, est le flavonol le moins
actif sur les deux radicaux : k55(galangine-HMR = 2,4 x 104 M-1 s-1) et k55 (galangine-HER =
1,7 x 104 M-1 s-1. L’ addition d’ un groupement hydroxyle en position 4’ a pour effet
d’ augmenter significativement l’ activité d’ inhibition. C’ est le cas du kaempférol possédant
des constantes vitesse de réaction deux fois supérieures à celles de la galangine :
k55(kaempférol-HMR = 4,7 x 104 M-1 s-1) et k55(kaempférol-HER = 3,6 x 104 M-1 s-1).
L’ addition d’ un deuxième groupe hydroxyle en position 2’ semble n’ avoir aucune influence
sur la capacité de piégeage, puisque la morine (2’ ,4’ -OH) a montré une activité presque
similaire à celle du kaempférol : k55(morine-HMR = 4,1 x 104 M-1 s-1) et k55(morine-HER =
2,8 x 104 M-1 s-1). En revanche, la présence d’ un groupe catéchol sur le cycle B (3’ , 4’ -OH)
augmente significativement l’ activité antioxydante. C’ est le cas de la quercétine, la plus active
des flavonols : k55(quercétine-HMR = 6,2 x 104 M-1 s-1) et k55(quercétine-HER = 4,9 x 104 M-1
s-1).

Ces résultats sont en accord avec les relations structure-activité reportées pour les
flavonoïdes comme piégeurs de radicaux superoxyde (Jovanovic, 1994 ; Rice-Evens, 1996 ;
Cotelle, 1996 ; Cos, 1998). Par exemple, Jovanovic et ses collaborateurs ont reporté que la
réactivité des flavonoïdes avec ces radicaux dépend de leurs propriétés redox. La constante de
vitesse de réaction la plus élevée est obtenue pour la quercétine (k(quercétine-O2•- = 4,7 x 104
M-1 s-1)), alors que la valeur la plus faible est obtenue pour la galangine (k = 8,8 x 102 M-1 s-1)
sans aucun groupement hydroxyle sur le cycle B (Tableau 19). Le kaempférol est également
moins actif que la quercétine. La morine, avec un cycle B dihydroxylé en positions 2’ et 4’ ,

156
est aussi moins actif que la quercétine. Ceci démontre l’ importance du groupe catéchol sur le
cycle B (3’ , 4’ -OH) de la quercétine.

Tableau 19 : Constantes de vitesse de réaction entre les

flavonoïdes et le radical superoxyde, d’ après (Jovanovic,
1994).

Flavonoides (Fl-OH) .-
k(Fl-OH + O2 )
4
quercétine 4,7 x 10
4
rutine 5,1 x 10
4
catéchine 1,8 x 10
3
hespéritine 5,9 x 10
3
kaempférol 2,4 x 10
3
morine 1,6 x 10
2
galangine 8,8 x 10

La rutine, où l’ hydrogène du groupement 3-OH est remplacé par un sucre, montre une
activité égale à celle de la quercétine (Tableau 19), ce qui indique que le groupement 3-OH
n’ a aucune influence sur cette activité. Les auteurs supposent que le site d’ attaque préférentiel
des radicaux superoxydes sur les flavonoïdes est le cycle B. Ceci est confirmé puisque, en
dépit de l’ absence de la double liaison C2-C3 et de la fonction 4-oxo, la catéchine, grâce à la
structure catéchol de son cycle B, est plus active que le kaempférol (4’ -OH) et la morine (2’ ,
4’ -OH) (Tableau 19). La flavanone hespéritine (3’ -OH, 4’ -OCH3) a également montré une
activité plus élevée que celle de la morine et du kaempférol (Tableau 19).
Les résultats enregistrés à partir de cette étude ont permis à Jovanovic et ses
collaborateurs de proposer le mécanisme réactionnel des flavonoïdes avec ces radicaux
oxygénés (Figure 57). Ces réactions conduisent à la formation du peroxyde d’ hydrogène et
des radicaux flavonoxy. On déduit que l’ inhibition des radicaux superoxydes par les
flavonoïdes, se fait par un transfert d’ électron et également par un transfert de proton.

-
OH O

OH
.
O

HO O HO O

•- + H 2O 2
OH
+ O2 OH

OH O OH O

Figure 57 : Mécanisme proposé pour l’ inhibition du radical superoxyde

par les flavonoïdes. D’ après (Jovanovic, 1994).
157
 Nous avons observé que les flavanones (absence de 3-OH et de la double liaison C2-
C3), les flavones (absence de 3-OH) et les dihydroflavonols (absence de la double liaison C2-
C3) ne sont pas capables de piéger HMR et HER, deux radicaux carbonés,. Cette différence
d’ activité est due à la nature de ces radicaux, et peut être expliquée par le fait que la réactivité
des flavonoïdes est stéreospécifiquement différente avec les radicaux carbonés et avec les
radicaux oxygénés (réaction au niveau de 3-OH puis impliquant la double liaison C2-C3 dans
un cas et au niveau du cycle B dans l’ autre cas).

Comme nous l’ avons mentionné au chapitre I, la SOD est considérée comme la

première ligne de défense contre les effets nocifs des radicaux libres oxygénés. Santiard et ses
collaborateurs ont démontré que cette enzyme est capable de piéger HER avec une constante
de vitesse de réaction : k(SOD-HER) = 6,8 x 105 M-1 s-1 (Santiard, 1995). En comparaison
avec nos valeurs : k55(flavonols-HMR) = 2,4 x 104 – 6,2 x 104 M-1 s-1 et k55(flavonols-HER =
1,7 x 104 – 4,9 x 104 M-1 s-1), nous constatons que les flavonols sont de bons piégeurs de
HMR et HER.

158
 CHAPITRE VII

RADIOLYSE DES FLAVONOÏDES DANS DES MELANGES

EAU/ METHANOL : APPLICATION AU TRAITEMENT DES
ALIMENTS PAR IRRADIATION
 RADIOLYSE DES FLAVONOÏDES DANS DES MELANGES
EAU-METHANOL : APPLICATION AU TRAITEMENT DES
ALIMENTS PAR IRRADIATION

L’ irradiation γ est une technique actuellement très utilisée dans le domaine agro-
alimentaire. Elle peut, comme nous l’ avons mentionné au préalable, décontaminer les produits
alimentaires et prolonger leur durée de conservation en ralentissant le développement des
bactéries et des levures, micro-organismes responsables de l’ altération des aliments,
notamment des fruits et légumes. Ces derniers représentent des sources importantes de
composés naturels tels que les vitamines, les acides phénoliques et les flavonoïdes reconnus
pour leurs effets bénéfiques sur la santé humaine.
L’ un des problèmes rencontrés lors du traitement par irradiation est que les aliments
peuvent en partie perdre leur qualité nutritionnelle : changements dans la concentration des
composés qui constituent l’ aliment, ou bien encore modifications des structures chimiques.
Par exemple, Graham et Stevensen ont montré que la concentration en vitamine C dans les
fraises et les pommes de terre diminue après irradiation (Graham, 1997). Oufdejeikh et ses
collaborateurs ont également rapporté que les concentrations en polyphénols, y compris en
flavonols, diminuent lorsque les clémentines sont exposées au rayonnement γ (Oufdejeikh,
2000). Des résultats similaires ont récemment été obtenus pour les acides phénoliques et les
flavonoïdes présents dans les fraises (Breitfellner, 2002 ; Breitfellner, 2003). La concentration
en acide 4-hydroxybenzoïque semble augmenter linéairement avec la dose d’ irradiation, alors
que les concentrations en (-)-épicatéchine et en kaempférol-3-O-glucoside diminuent.
Quoique ces investigations aient montré l’ effet négatif de l’ irradiation sur la teneur en
flavonoïdes dans les fruits, la compréhension des réactions chimiques produites durant le
processus d’ irradiation des aliments reste encore une énigme. L’ étude de la radiolyse des
flavonoïdes dans des mélanges eau/méthanol que nous aborderons dans cette partie du
manuscrit servira à appréhender un tel phénomène.

159
 Nous avons montré dans le chapitre précédent que durant la radiolyse des flavonoïdes
dans le méthanol, les flavonols (quercétine, morine, kaempférol et galangine) sont
transformés majoritairement en QM1, MM1, KM1 et GM1, respectivement, ainsi qu’ en
d’ autres produits minoritaires parmi lesquels nous avons identifiés QM2, MM2, KM2 et
GM2.
Pour se rapprocher des conditions physiologiques existant dans les fruits et légumes,
nous avons introduit l’ eau dans le milieu d’ irradiation. Les flavonols sont alors irradiés avec
différentes doses (0,2 – 20 kGy) dans des mélanges eau/méthanol avec des proportions :
10/90, 15/85, 20/80 et 25/75 (seuil de solubilité). Pour chaque mélange, l’ étude est effectuée
sur quatre concentrations (5 x 10-5 M, 10-4 M, 5 x 10-4 M et 5 x 10-3 M).

Les Figures 58a, 58b, 58c et 58d illustrent les chromatogrammes CLHP de la
quercétine, de la morine, du kaempférol et de la galangine (5 x 10-3 M) irradiés dans les
différentes solutions eau/méthanol (10/90, 15/85, 20/80 et 25/75) à une dose de 14 kGy.
Nous observons que les chromatogrammes obtenus sont similaires à ceux obtenus
dans les solutions contenant 100% de méthanol. Sur ces chromatogrammes nous retrouvons
en effet les produits QM1, MM1, KM1, GM1, QM2, MM2, KM2 et GM2. La surface du pic
CLHP correspondant à chacun de ces composés varie en fonction de la quantité d’ eau
présente dans le milieu d’ irradiation. Pour étudier l’ effet de l’ eau sur la dégradation des
flavonols (quercétine, morine, kaempférol et galangine), nous avons calculé leurs rendements
radiolytiques ainsi que ceux des produits de dégradation (QM1, QM2, MM1, MM2, KM1,
KM2, GM1 et GM2) (Tableaux 20a, 20b, 20c et 20d).

160
 0,80 0,60
(A) (B)
quercétine QM1

0,60
0,40
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
0,40

0,20
0,20
QM2

quercétine
0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,40 0,40
QM1 (C) QM1 (D)

0,30 0,30
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,20 0,20
QM2
QM2

0,10 0,10

quercétine
quercétine

0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,30 0,25
(E) (F)
QM2
QM1
0,20 QM1

QM2 quercétine
0,20
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,15

0,10
quercétine
0,10

0,05

0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

Figure 58a : Chromatogrammes de la quercétine à 5 x 10-3 M, (A) dans le

méthanol avant irradiation, et des mélanges eau/méthanol (B) 0/100, (C) 10/90,
(D) 15/85, (E) 20/80, (F) 25/75 irradiés à 14 kGy. Le débit de dose est 0,22 Gy/s.

161
 0,80 1,60
kaempférol
KM1
1,40

0,60 1,20
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
1,00

0,40 0,80

0,60

0,20 0,40
KM2
0,20
kaempférol
0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

1,00 0,80
KM1 (C) (D)

KM1
0,80
0,60
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,60

0,40

0,40

0,20 KM2
kaempférol
0,20 KM2
kaempférol

0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,30
KM1 (E) (F)
0,40
KM1
KM2 kaempférol

0,30 0,20
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

kaempférol
0,20 KM2

0,10

0,10

0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

Figure 58b : Chromatogrammes du kaempférol à 5 x 10-3 M, (A) dans le méthanol

avant irradiation, et dans des mélanges eau/méthanol (B) 0/100, (C) 10/90,
(D) 15/85, (E) 20/80, (F) 25/75 irradiés à 14 kGy. Le débit de dose est 0,22 Gy/s.

162
 1,20 1,00
morine
MM1
1,00
0,80

0,80
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
0,60

0,60

0,40
0,40

0,20
0,20

MM2 morine
0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,80
(C) MM1 (D)
MM1
0,60

0,60
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,40
0,40

0,20
0,20

morine morine
MM2 MM2
0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,60 0,60
MM1 (E) (F)
MM1

0,40 0,40
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,20 0,20

morine morine
MM2 MM2

0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

Figure 58c : Chromatogrammes de la morine à 5 x 10-3 M, (A) dans le méthanol

avant irradiation, et dans des mélanges eau/méthanol (B) 0/100, (C) 10/90,
(D) 15/85, (E) 20/80, (F) 25/75 irradiés à 14 kGy. Le débit de dose est 0,22 Gy/s.

163
 0,30
(A) (B)
galangine
0,80
GM1

galangine
0,60 0,20
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)
0,40

0,10

0,20
GM2

0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,30 0,30
(C) galangine (D)

0,25 galangine 0,25

GM1
0,20 0,20
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

GM1
0,15 0,15

0,10 0,10
GM2
GM2
0,05 0,05

0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

0,40
(E) (F)
galangine
galangine 0,40

0,30
0,30
Absorbance (U. A)

Absorbance (U. A)

0,20
0,20
GM1
GM2 GM1
0,10 GM2
0,10

0,00 0,00
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
Temps (min) Temps (min)

Figure 58d : Chromatogrammes de la galangine à 5 x 10-3 M, (A) dans le méthanol

avant irradiation, et dans des mélanges eau/méthanol, (B) 0/100, (C) 10/90, (D)
15/85, (E) 20/80, (F) 25/75 irradiés à 14 kGy. Le débit de dose est 0,22 Gy/s.

164
Tableau 20 a. Rendement radiolytique de la quercétine et des produits de radiolyse
QM1 et QM2 en fonction de la concentration initiale de la quercétine et en fonction des
différents pourcentages eau/méthanol utilisés comme milieu d’ irradiation.
Concentration (M) -5 -4 -4 -3
-1 5 x 10 1 x 10 5 x 10 5 x 10
G(µmol J )
Mélanges Eau/Méthanol
0/100 0,0485 0,0713 0,2410 0,4300
10/90 0,0422 0,0653 0,2232 0,4214
G(-quercétine) 15/85 0,0384 0,0578 0,2045 0,4085
20/80 0,0327 0,0514 0,1776 0,3747
25/75 0,0245 0,0471 0,1284 0,3378
0/100 0,0201 0,0432 0,1620 0,3256
10/90 0,0185 0,0344 0,1346 0,2705
G(QM1) 15/85 0,0138 0,0289 0,1134 0,2279
20/80 0,0114 0,0227 0,0715 0,1714
25/75 0,0078 0,0156 0,0547 0,1237
0/100 0,0017 0,0028 0,0105 0,0315
10/90 0,0019 0,0031 0,0121 0,0354
G(QM2) 15/85 0,0025 0,0039 0,0163 0,0411
20/80 0,0031 0,0045 0,0212 0,0511
25/75 0,0039 0,0073 0,0303 0,0604

Tableau 20 b. Rendement radiolytique du kaempférol et des produits de radiolyse KM1

et KM2 en fonction de la concentration initiale du kaempférol et en fonction des
différents pourcentages eau/méthanol utilisés comme milieu d’ irradiation (Marfak,
2003b).
Concentration (M) -5 -4 -4 -3
-1 5 x 10 1 x 10 5 x 10 5 x 10
G(µmol J )
Mélanges Eau/Méthanol
0/100 0,0416 0,0679 0,1660 0,4070
10/90 0,0369 0,0611 0,1490 0,3540
G(-kaempferol) 15/85 0,0312 0,0490 0,1310 0,3100
20/80 0,0270 0,0428 0,1080 0,2530
25/75 0,0229 0,0370 0,0923 0,2120
0/100 0,0314 0,0420 0,1550 0,3060
10/90 0,0220 0,0304 0,1120 0,2170
G(KM1) 15/85 0,0144 0,0193 0,0690 0,1490
20/80 0,0094 0,0130 0,0465 0,0920
25/75 0,0063 0,0084 0,0323 0,0640
0/100 0,0017 0,0028 0,0105 0,0291
10/90 0,0020 0,0032 0,0131 0,0340
G(KM2) 15/85 0,0022 0,0036 0,0146 0,0372
20/80 0,0024 0,0038 0,0159 0,0401
25/75 0,0026 0,0041 0,0197 0,0447

165
Tableau 20 c. Rendement radiolytique de la morine et des produits de radiolyse MM1
et MM2 en fonction de la concentration initiale de la morine et en fonction des
différents pourcentages eau/méthanol utilisés comme milieu d’ irradiation.

Concentration (M) -5 -4 -4 -3
-1 5 x 10 1 x 10 5 x 10 5 x 10
G(µmol J )
Mélanges Eau/Méthanol
0/100 0,0339 0,0465 0,1970 0,3800
10/90 0,0320 0,0434 0,1931 0,3724
G(-morine) 15/85 0,0302 0,0426 0,1862 0,3610
20/80 0,0284 0,0381 0,1718 0,3511
25/75 0,0275 0,0344 0,1687 0,3385
0/100 0,0145 0,0356 0,1220 0,2490
10/90 0,0138 0,0315 0,1154 0,2288
G(MM1) 15/85 0,0111 0,0298 0,1046 0,2042
20/80 0,0096 0,0266 0,0953 0,1951
25/75 0,0075 0,0235 0,0842 0,1755
0/100 0,0012 0,0019 0,0091 0,0287
10/90 0,0013 0,0022 0,0105 0,0292
G(MM2) 15/85 0,0017 0,0026 0,0121 0,0324
20/80 0,0022 0,0031 0,0153 0,0345
25/75 0,0027 0,0046 0,0202 0,0368

Tableau 20 d. Rendement radiolytique de la galangine et des produits de radiolyse

GM1 et GM2 en fonction de la concentration initiale de la galangine et en fonction des
différents pourcentages eau/méthanol utilisés comme milieu d’ irradiation.

-5 -4 -4 -3
-1 Concentration (M) 5 x 10 1 x 10 5 x 10 5 x 10
G(µmol J )
Mélanges Eau/Méthanol
0/100 0,0219 0,0460 0,1620 0,3500
10/90 0,0216 0,0412 0,1454 0,3244
G(-galangine) 15/85 0,0190 0,0361 0,1278 0,2965
20/80 0,0134 0,0279 0,1041 0,2417
25/75 0,0097 0,0186 0,0843 0,1823
0/100 0,0090 0,0145 0,1090 0,1828
10/90 0,0083 0,0105 0,0887 0,1596
G(GM1) 15/85 0,0062 0,0086 0,0485 0,1290
20/80 0,0034 0,0054 0,0265 0,0890
25/75 0,0014 0,0028 0,0173 0,0382
0/100 0,0010 0,0017 0,0084 0,0175
10/90 0,0011 0,0019 0,0098 0,0204
G(GM2) 15/85 0,0012 0,0021 0,0105 0,0223
20/80 0,0014 0,0023 0,0127 0,0271
25/75 0,0016 0,0025 0,0159 0,0305

166
 A titre d’ exemple, pour la concentration 5 x 10-3 M, nous avons rapporté sur la Figure
59 l’ évolution du rendement radiolytique de chaque flavonol et des produits de radiolyse en
fonction du pourcentage d’ eau introduite dans le milieu irradié.

(A) (B)
0,40 quercétine 0,40 kaempférol

0,30 0,30
QM1 KM1
G(µmol J )

G(µmol J )
-1

-1
0,20 0,20

0,10 0,10
QM2 KM2

0,00 0,00
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
% de l'
eau % de l'
eau

0,40
0,40 (C) (D)
galangine
morine

0,30 0,30
G(µmol J )

G(µmol J )
-1

-1

MM1
0,20 0,20
GM1

0,10 0,10

MM2 GM2

0,00 0,00
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
% de l'
eau % de l'
eau

Figure 59 : Variation des rendements radiolytiques des flavonols : quercétine (A),

kaempférol (B), morine (C), galangine (D) et leurs produits de dégradation QM1, QM2,
MM1, MM2, KM1, KM2, GM1 et GM2 en fonction du pourcentage d’ eau présent dans
le milieu d’ irradiation.

Nous constatons que au fur et à mesure que la quantité d’ eau augmente, la

consommation des flavonols et la formation des composés QM1, MM1, KM1 et GM1
diminuent. En contrepartie, les rendements de QM2, MM2, KM2 et GM2 augmentent.
Lorsque la radiolyse est effectuée dans un mélange 25/75 (seuil de solubilité des
flavonols), les depsides QM2, MM2, KM2 et GM2 sont formés en quantités presque égales à
celles des depsides QM1, MM1, KM1 et GM1. L’ ensemble de ces résultats démontre que
l’ eau contribue, en partie, à la formation des depsides QM2, MM2, KM2 et GM2.

167
 Nous avons démontré que au cours de la radiolyse dans le méthanol, les radicaux
HMR réagissent avec les flavonols au niveau du groupement 3-OH. Une telle réaction conduit
à l’ ouverture du cycle C au niveau de la double liaison C2-C3 et par conséquent à la
transformation des flavonols (quercétine, morine, kaempférol et galangine) en depsides,
produits majoritaires de la dégradation (QM1, MM1, KM1 et GM1, respectivement).
En effectuant la radiolyse dans des mélanges eau/méthanol, nous observons que la
formation de QM1, MM1, KM1 et GM1 diminue avec le pourcentage de méthanol. En
diminuant le pourcentage de méthanol dans le milieu d’ irradiation, la quantité de HMR
formée diminue, ce qui limite la transformation des flavonols.

En introduisant l’ eau dans le milieu d’ irradiation, nous avons montré que les
concentrations de QM2, MM2, KM2 et GM2 augmentent en fonction du pourcentage d’ eau.
Ceci peut être attribué aux réactions chimiques entre les flavonols et les espèces radiolytiques
de l’ eau. Trois mécanismes sont possibles :

1er cas : La radiolyse simultanée de l’ eau et du méthanol conduit à la formation de :

- -
e aq, •OH (à partir de l’ eau), e s, •CH2OH, CH3O• (à partir du méthanol) et H• (à partir des
deux solvants). Puisque le méthanol est un bon piégeur des radicaux •OH (Roux, 1973), la
réaction suivante peut avoir lieu :
•
OH + CH 3 OH → H 2 O + • CH 2 OH

Si tous les radicaux •OH sont convertis en radicaux HMR, les flavonols réagissent
d’ abord avec ces derniers et se transforment en depsides selon le mécanisme précédemment
décrit (Figure 46). La dernière étape de cette transformation est la réaction du radical F14,
soit avec CH3O• pour former QM1, MM1, KM1 et GM1 (formation d’ un groupe
ester lié à C8,
soit avec •OH pour former QM2, MM2, KM2 et GM2 (formation d’ un groupe acide
en C8) (Figure 60, voie 1).

168
 Flavonols (Fl-OH) R1
Fl-O• R1

R R2 R R2

R• ou X•
HO O HO O

H .
+ S
O O

OH O OH O

quercétine (R = H, R1= R2 = OH)

morine (R = R2 = OH, R1 = H)
kaempférol (R = R1 = H, R2 = OH)
galangine (R = R1 = R2 = H)

R1 R1

• •
F2 .O R R2
F1 R R2

O
HO O HO O •
O2
O O

OH O OH O

R1 R1
•
F3 R R2 F4 R R2
HO
O
.O
HO O HO O

•
R + + •OH
O O

OH O OH O

R1 R1

R R2 R R2
F5• O
O HO O
•
X
HO O •
O O

OH O
OR'

OH O •
OH (voie 1)
Depsides (D1)
H2O (voie 2) R1

R R2
R = CH3
O

QM1 (R = H, R1= R2 = OH) HO O

MM1 (R = R2 = OH, R1 = H) O

KM1 (R = R1 = H, R2 = OH) OH
GM1 (R = R1 = R2 = H) OH O

Depsides (D2)
QM2 (R = H, R1= R2 = OH)
MM2 (R = R2 = OH, R1 = H)
KM2 (R = R1 = H, R2 = OH)
GM2 (R = R1 = R2 = H)
Figure 60 : Mécanisme réactionnel proposé pour la formation des depsides QM2,
MM2, KM2 et GM2 à partir des flavonols quercétine, morine, kaempférol et
galangine, respectivement. R• représente HMR et X• représente CH3O• S est le
solvant, méthanol. 169
 2ème cas : Comme nous l’ avons montré dans le chapitre précédent, il existe un
équilibre chimique entre les depsides possédant une fonction ester et ceux avec une fonction
carboxyle (Figure 35). Celle-ci est obtenue après hydrolyse de la forme ester. Par conséquent,
en introduisant l’ eau dans le milieu d’ irradiation, celle-ci peut réagir avec QM1, MM1, KM1
et GM1 et conduit respectivement à la formation de QM2, MM2, KM2 et GM2 (Figure 60,
voie 2).

3ème cas : La troisième voie de formation de QM2, MM2, KM2 et GM2 peut être un
mécanisme qui dépend de •OH et surtout indépendant de HMR. En effet, les flavonols sont
reconnus pour leur grande réactivité avec le radical •OH. Selon la structure de la molécule, les
sites redox primaires sont les groupes 3’ -OH, 4’ -OH ou 3-OH. Dans notre cas, les radicaux
•
OH qui ne sont pas piégés par le méthanol peuvent réagir avec les flavonols (quercétine,
morine, kaempférol et galangine) via un mécanisme similaire à celui proposé pour HMR et
HER conduisant ainsi à la formation des depsides QM2, MM2, KM2 et GM2 (Figure 61).
Toutefois, aucune étude bibliographique n’ a mis en évidence d’ attaque du radical •OH sur le
groupement 3-OH.

170
 Flavonols (Fl-OH) •
R1
Fl-O R1

R R2 R R2

HO O • HO O
OH
H .
+ S
O O

OH O OH O

quercétine (R = H, R1= R2 = OH)

morine (R = R2 = OH, R1 = H)
kaempférol (R = R1 = H, R2 = OH)
galangine (R = R1 = R2 = H)

R1 R1
• •
F2 .O R R2
F1 R R2

O
HO O HO O •
O2
O O

OH O OH O

H2O

R1 R1
•
F3 R R2 F4 R R2
HO
O
.O
HO O HO O

•
OH + + •OH
O O

OH O OH O

(voie 3)
R1

R R2
R1

R R2
F5•
O

O
HO O
HO O •
O OH
•
OH O

OH O OH O

Depsides (D2)

QM2 (R = H, R1= R2 = OH)

MM2 (R = R2 = OH, R1 = H)
KM2 (R = R1 = H, R2 = OH)
GM2 (R = R1 = R2 = H)

Figure 61 : Mécanisme réactionnel proposé pour la formation des depsides QM2, MM2,
KM2 et GM2 à partir des flavonols quercétine, morine, kaempférol et galangine,
respectivement. R• représente HMR et X• représente CH3O• S est le solvant, méthanol.

171
 Les fraises sont des sources importantes d’ acides phénoliques (acide gallique, acide p-
coumarique, acide caféique et acide 4-hydroxybenzoïque) et de flavonoïdes (quercétine-3-O-
glucoside, quercétine-3-O-galactoside, kaempférol-3-O-glucoside, (+)-catéchine et (-)-
épicatéchine) (Breitfellner, 2002). En irradiant ces fruits, Breitfellner et ses collaborateurs ont
montré que l’ acide gallique, l’ acide p-coumarique, l’ acide caféique et les dérivés de la
quercétine n’ ont pas été affectés par l’ irradiation (Breitfellner, 2002 ; Breitfellner, 2003). En
revanche, les concentrations du kaempférol-3-O-glucoside, de la (+)-catéchine et de la (-)-
épicatéchine ont largement diminué au cours du traitement. A une dose de 6 kGy, leurs
quantités sont passées de 2,31 mg/kg, 48,87 mg/kg et 2,85 mg/kg (avant irradiation) à 1,27
mg/kg, 34,07 mg/kg et 1,80 mg/kg, respectivement.

L’ acide 4-hydroxybenzoïque (Figure 62), quant à lui, est le seul composé dont la
concentration augmente linéairement avec la dose appliquée. Sa concentration initiale (1,5
mg/kg avant irradiation) est triplée (5,6 mg/kg) après application d’ une dose de 6 kGy.

OH

OH OH

HO HO

O O
acide 4-hydroxybenzoïque acide 3, 4-dihydroxybenzoïque

Figure 62 : Structures chimiques des acides phénoliques.

Quoique le mécanisme réactionnel permettant la formation de cet acide n’ ait pas été
proposé, nous pouvons suggérer qu’ il serait issu de la dégradation du kaempférol. Par
exemple, parmi les produits minoritaires formés au cours de la radiolyse de la quercétine,
nous avons identifié, par RMN et LC-MS, l’ acide 3, 4-dihydroxybenzoïque (Figure 62)
(Marfak, 2003a).

172
 Les études de Breitfellner et ses collaborateurs ont également montré la formation
d’ un autre composé (noté C2) dont la quantité augmente linéairement avec la dose absorbée.
La structure chimique de ce produit n’ est pas encore déterminée, néanmoins en analysant son
spectre UV/visible, il s’ est avéré que celui-ci ne correspond ni aux spectres des flavonoïdes ni
à ceux des acides phénoliques. Des analyses préliminaires par LC-MS ont montré que sa
masse moléculaire est 318.
Rappelons que la radiolyse du kaempférol, dans les mélanges eau/méthanol, conduit à
la formation du produit KM2 dont la masse moléculaire est également 318.
Ce résultat est intéressant car il montre que des mécanismes de transformation
similaires peuvent être observés, d’ une part, dans les fruits irradiés, et d’ autre part, dans des
solutions alcools ou dans des mélanges eau/alcool. Cependant, il est important de noter que
les solutions alcooliques de flavonoïdes ne représentent pas le milieu environnant des
flavonoïdes dans les fruits. En rajoutant de l’ eau dans les solutions nous avons essayé de nous
rapprocher des conditions physiologiques. Cependant, à cause du caractère très peu polaire
des flavonoïdes, nous n’ avons pu réaliser que des solutions avec 25% d’ eau et 75% de
méthanol, c'
est-à-dire encore éloignées des véritables conditions existant dans les fruits.
Réaliser un modèle in vitro de ces conditions semble difficile. Nous envisageons par exemple
de modifier le pH des solutions pour augmenter la solubilité des flavonoïdes tout en se
rapprochant de ces conditions.
Il est également important de remarquer que la plupart des flavonoïdes sont présents
dans les fruits sous forme de glycoside. La première question que nous devons alors nous
poser est : que devient le sucre au cours de la radiolyse ? Soit le sucre protège le flavonoïde,
soit il se « détache » conduisant à la formation de la forme aglycone du flavonoïde qui pourra
alors subir des modifications structurales, au cours de l’ irradiation, selon des mécanismes
similaires à ceux que nous avons proposés.

173
 Nous avons vu que l’ irradiation a pour effet de réduire la quantité des flavonoïdes
présents dans les fraises, et d’ augmenter celle de l’ acide 4-hydroxybenzoïque. En
conséquence, ces fruits pourraient perdre, au moins en partie, leur qualité nutritionnelle. Pour
étudier un tel effet, nous avons mesuré la capacité des flavonols et celle de leurs produits de
-
dégradation (Figure 1 et 2) à piéger les radicaux DPPH et O2• . L’ effet de ces produits sur
-
l’ activité de la xanthine oxydase, précurseur des radicaux O2• , est également étudié.

IV.1. ACTIVITE ANTI-SUPEROXYDE ET ANTI-DPPH

Les résultats obtenus pour les douze depsides identifiés dans ce travail (QM1, QE1,
QM2, MM1, ME1, MM2, KM1, KE1, KM2, GM1, GE1 et GM2) ainsi que ceux obtenus pour
les flavonols (quercétine, morine, kaempférol et galangine) sont regroupés dans le Tableau
21.

Possédant un groupement catéchol sur le cycle B (3’ ,4’ -OH), QM2 est le depside le
-
plus actif sur les deux radicaux (1,31 µM pour O2• et 0,8 mM pour DPPH) suivi de MM2
-
(2’ ,4’ -OH) avec des IC50 de l’ ordre de 4,50 µM (pour O2• ) et 3,24 mM (pour DPPH). La
suppression de 2’ -OH semble ne pas avoir un grand effet sur l’ activité antioxydante ; c’ est le
-
cas de KM2 qui a des activités (5,37 µM pour O2• et 2,76 mM pour DPPH) presque
-
similaires à celles de MM2. En revanche, en examinant l’ activité de GM2 (7,20 µM pour O2•
et 4,31 mM pour DPPH), nous constatons que l’ absence de groupement hydroxyle sur le cycle
-
B diminue largement l’ aptitude à piéger les radicaux O2• et DPPH.

174
 Tableau 21 : Activités anti-superoxyde et anti-DPPH des flavonols et
-
celles de leurs produits de radiolyse. O2• est généré par le système
enzymatique xanthine/xanthine oxydase et mesuré par
chimiluminescence. Le DPPH est mesuré par RPE.

.-
Radical superoxyde (O2 ) Radical DPPH
Antioxydant
IC50 (µM) SD IC50 (mM) SD
quercétine 0,16 0,02 0,04 0,01
QM1 8,22 0,05 2,78 0,03
QE1 7,86 0,04 5,11 0,04
QM2 1,31 0,02 0,80 0,02
morine 1,62 0,02 0,41 0,02
MM1 12,67 0,04 6,35 0,30
ME1 15,24 0,05 7,29 0,04
MM2 4,50 0,03 3,24 0,02
kaempférol 1,18 0,01 0,19 0,01
KM1 18,12 0,03 3,12 0,02
KE1 17,52 0,05 6,57 0,04
KM2 5,37 0,02 2,76 0,03
galangine 3,23 0,02 0,92 0,02
GM1 21,34 0,04 7,43 0,04
GE1 26,46 0,03 8,78 0,04
GM2 7,20 0,03 4,31 0,03

En comparant, l’ activité des différents depsides issus du même flavonol, nous avons
remarqué que les composés hydroxylés en position 8 (8-OH) (QM2, MM2, KM2 et GM2)
(Figure 2) sont plus actifs que ceux methoxylés (8-OCH3) (QM1, MM1, KM1 et GM1)
(Figure 2), lesquels possèdent une activité plus élevée que celle des depsides éthoxylés (8-
OCH2CH3) (QE1, ME1, KE1 et GE1) (Tableau 21).

En ce qui concerne l’ activité antioxydante des flavonols, la quercétine est la plus

active, suivie de la morine, du kaempférol et de la galangine (Tableau 21). Ces résultats sont
en accord avec les relations établies entre la structure des flavonoïdes et leur capacité à piéger
les radicaux superoxydes (chapitre II). En effet, de nombreuses études convergent pour
proposer que l’ activité dépend essentiellement de trois critères (Rice-Evans, 1996 ; Pietta,
2000) :
(1) La présence d’ un groupe catéchol sur le cycle B (3’ , 4’ -OH).
(2) La double liaison C2-C3 conjuguée avec la fonction 4-oxo.
(3) La présence du groupe 3-OH.

175
 Par rapport aux flavonols, les depsides sont moins actifs à l’ exception de QM2.
-
L’ activité de ce dernier (1,31 µM pour O2• ) est presque égale à celle du kaempférol (1,18
µM) et presque trois fois plus élevée que celle de la galangine (3,23 µM).
Au cours de la transformation des flavonols en depsides, il y a disparition du groupe 3-
OH, et par conséquent, ouverture du cycle C au niveau de la double liaison C2-C3. L’ absence
de ces deux caractéristiques peut expliquer la différence entre l’ activité antioxydante des
flavonols et celle des depsides.

Les groupes 2’ -OH, 3’ -OH, 4’ -OH, 5-OH et 7-OH (caractérisant les flavonols),
demeurent inchangés durant la transformation des flavonols en depsides. Ils sont numérotés
pour les depsides de la manière suivante : 2’ -OH, 3’ -OH, 4’ -OH, 6-OH et 4-OH,
respectivement. La capacité de ces groupes hydroxyles à donner un atome d’ hydrogène peut
expliquer l’ activité antioxydante des depsides.
La délocalisation des électrons pouvant exister d’ une part entre le cycle A et le groupe
8-oxo, et d’ autre part entre le cycle B et le groupe 7’ -oxo, peut également participer à la
-
capacité des depsides à piéger les radicaux O2• et DPPH.

IV.2. INHIBITION DE LA XANTHINE OXYDASE

Pour mesurer la capacité des depsides et des flavonols à piéger les radicaux
superoxydes, nous avons utilisé le système enzymatique xanthine/xanthine oxydase comme
générateur de ces radicaux. Donc, soit les molécules étudiées piègent directement le radical
-
O2• formé, soit elles inhibent la xanthine oxydase (XO), réduisant ainsi sa capacité à produire
les radicaux superoxydes. Un autre produit de cette réaction enzymatique est l’ acide urique.
Caractérisé par une longueur d’ onde d’ absorption à 290 nm, cet acide nous a permis d’ évaluer
l’ aptitude des flavonols et des depsides à inhiber la XO (voir matériels et méthodes). Moins il
s’ en forme, plus l’ inhibition est importante, indépendamment du piégeage direct.

Cette étude a montré que les depsides MM1, KM1, GM1, QE1, ME1, KE1, GE1,
MM2, KM2 et GM2 ne sont pas capables d’ inhiber l’ enzyme. Malgré des concentrations très
élevées (10-2 M), le pourcentage d’ inhibition est toujours resté inférieur à 50% (Tableau 22).
Nous concluons que l’ activité antioxydante de ces depsides est essentiellement due au
piégeage direct du radical superoxyde.

176
 Tableau 22 : Pourcentage d’ inhibition de la xanthine oxydase par les depsides non
actifs testés à une concentration de 10-2 M.

Depsides % d'
inhibition
MM2 46,78
KM2 16,99
MM1 36,82
KM1 27,70
QE1 36,54
ME1 25,05
KE1 22,96
GE1 0,00

Seuls deux depsides issus de la dégradation de la quercétine (QM1 et QM2) ont

montré une activité inhibitrice de XO (Tableau 23). En comparaison avec les flavonols, QM1
(12, 10 µM) et QM2 (8,51 µM) sont moins actifs que le kaempférol (4,48 µM) et la galangine
(15,80 µM). En outre, les deux depsides sont à peu près dix fois plus actifs que la quercétine
(46,90 µM) et la morine (47,50 µM) (Tableau 23).

Tableau 23 : IC50 liées à la réduction de l’ activité de la xanthine oxydase par les

flavonols : quercétine, morine, kaempférol et galangine, et par les depsides QM1 et
QM2.

Produits IC50 (µM) SD

quercétine 46,90 0,07
morine 47,51 0,08
kaempférol 4,48 0,06
galangine 15,82 0,07
QM1 12,10 0,09
QM2 8,52 0,08

177
 Les depsides que nous avons identifiés constituent une nouvelle famille de molécules.
Nous venons de montrer que ces composés sont de bons piégeurs de radicaux O2•- et DPPH.
Certains sont également de bons inhibiteurs de la xanthine oxydase. Cependant, nous ne
possédons pas d’ information sur les mécanismes réactionnels. En tant qu’ antioxydants, ils
peuvent agir soit par transfert d’ électron soit par transfert d’ hydrogène. En effet, nous avons
vu, dans le chapitre matériels et méthodes, que le piégeage d’ un radical libre par un
antioxydant se fait par l’ un ou l’ autre de ces transferts redox vers le radical. En modélisation
moléculaire, l’ aptitude au transfert d’ électron et d’ hydrogène se mesure respectivement par la
distribution HOMO et la BDE des liaisons O-H.
Le mécanisme enzymatique dépend lui, probablement, de plusieurs autres paramètres
tels que l’ encombrement stérique et l’ hydrophobicité.

V.1. CONFORMATION GEOMETRIQUE

Dépourvus du cycle intermédiaire C, les depsides, à la différence des flavonoïdes,

possèdent de nombreux angles de torsion, nous nous intéressons particulièrement aux quatre
suivants : τ1 = C1-C2-O-C7’ , τ2 = C1-C7-C8-O et τ3 = C1-C7-C8-R (R = H, CH3 ou CH2CH3)
et , τ4 = C2’ -C1’ -C7’ -O (Figure 63).
Nous avons optimisé la structure spatiale par la méthode du recuit-simulé en utilisant
le champ de force esff, puis nous l’ avons affinée avec AM1 (voir matériels et méthodes). La
conformation la plus stable est obtenue pour les angles de torsion suivants : τ1 = 168,03°, τ2 =
100,52°, τ3 = 39,58 et τ4 = -163,44° (cas du depside QE2) (Figure 63). Ces valeurs sont
quasiment les mêmes pour les depsides que nous avons étudiés. La superposition de toutes les
conformations ne montre aucune différence spatiale, si ce n’ est bien sûr au niveau du carbone
C-8. Ce résultat est important puisqu’ il nous permet de conclure que les différences observées
sur l’ activité enzymatique ne sont pas dues à des différences d’ encombrement stérique.

178
 Figure 63 : Conformation spatiale des depsides, cas de QE2.

V.2. DETERMINATION DE LA DISTRIBUTION HOMO

Nous nous intéressons maintenant à la distribution de la HOMO. Sa représentation

spatiale peut nous apporter des informations sur les sites concernés par le transfert d’ électron.
Ce mécanisme peut être invoqué au cours d’ une action antioxydante directe sur un radical,
mais également lorsque la molécule se trouve au niveau du site actif de l’ enzyme. Pour les
trois depsides issus d’ un même flavonol, nous avons remarqué que la délocalisation de la
HOMO est la même. Nous choisissons donc de représenter uniquement sur la Figure 64 la
couche HOMO de QM2, KM2, MM2 et GM2.

179
 QM2 KM2

MM2 GM2

Figure 64 : Répartition de la bande HOMO sur les depsides QM2, MM2, KM2 et GM2
issus de la dégradation de la quercétine, la morine, le kaempférol et la galangine,
respectivement.

Nous observons que la HOMO n’ est pas localisée aux mêmes endroits sur les quatre
composés. Pour QM2 elle est uniquement localisée sur le cycle B, et pour KM2 et GM2 elle
se situe sur le cycle A. MM2 a une distribution plus étendue sur les deux cycles. Nous
constatons donc que le positionnement des groupements OH sur les cycles A et B joue un rôle
important dans la distribution de la couche HOMO sur les depsides.

-
Nous avons montré que les depsides sont de bons piégeurs des radicaux O2• . Nous
proposons que cette réactivité soit liée au transfert d’ électron de la HOMO vers la molécule.

180
 En ce qui concerne l’ activité d’ inhibition de la xanthine oxydase et étant donné que
seuls QM2 et QM1 sont actifs, on peut supposer que la liaison entre ces depsides et l’ enzyme
se fait au niveau du cycle B. La faible délocalisation sur le cycle B dans MM2, explique
l’ activité faible mais non nulle de cette molécule. Par contre, aucune activité n’ est
effectivement observée pour KM2 et GM2 où la HOMO est localisée sur le cycle A.

V.3. BDE

De la même manière que pour les flavonoïdes, nous avons calculé les BDE de tous
groupements OH pour l’ ensemble des 12 depsides. L’ analyse du Tableau 24 permet de
montrer les sites responsables d’ un éventuel transfert d’ hydrogène.

Tableau 24 : Les valeurs BDE (kcal/mol) calculées pour chaque

groupement OH des depsides en utilisant la méthode AM1.

OH-substitutions
De psides
4-OH 6-OH 8-OH 2' -OH 3' -OH 4'
-OH
QM1 44,81 46,38 34,36 38,18
QE1 44,76 46,15 34,34 38,16
QM2 44,83 46,19 32,30 34,45 38,23
MM1 44,80 46,05 44,70 44,25
ME1 45,03 46,44 44,97 44,49
MM2 44,84 46,22 32,23 44,97 44,34
KM1 44,97 46,16 41,28
KE1 44,91 46,24 41,24
KM2 45,00 46,22 32,32 41,37
GM1 44,87 46,05
GE1 44,83 46,15
GM2 44,87 46,14 32,30

Nous constatons que les BDE sont relativement importantes sur le cycle A (autour de
45 kcal/mol). Comme nous l’ avions déjà observé pour les flavonoïdes, ce cycle n’ est pas le
site préférentiel pour un transfert d’ hydrogène.
Par contre, de la même manière que pour les flavonoïdes, les BDE sont plus faibles sur
le cycle B, particulièrement pour les depsides issus de la quercétine. En effet, dans ce cas, la
présence d’ un noyau catéchol (3’ ,4’ -OH) sur le cycle B permet une stabilisation du radical par
liaison hydrogène (Figure 65). En revanche, l’ absence de cet effet sur les depsides issus de la
morine et du kaempférol entraîne des BDE plus importantes et donc une activité plus faible.

181
 Figure 65 : Stabilisation du radical par liaison hydrogène.

Il est également intéressant de constater que le groupement 8-OH présente la BDE la

plus faible. Ce site n’ existe pas dans les flavonoïdes et semble pouvoir participer à la
réactivité des depsides.

Pour l’ inhibition de la xanthine oxydase, seuls QM2 et QM1 sont actifs. Nous avons
constaté que les différences d’ activité ne pouvaient pas être attribuées aux différences de
conformations spatiales.
Grâce aux résultats obtenus pour les BDE, on peut dire que si la réaction au niveau du
site actif de l’ enzyme se fait par transfert d’ hydrogène, la différence se situe au niveau du
cycle B. En effet, sur ce cycle les BDE sont plus faibles pour les depsides issus de la
quercétine que pour les autres. En revanche, il n’ y a aucune différence sur le cycle A.

182
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Au sein du foie, organe principal de la métabolisation, les alcools, notamment le

méthanol et l’ éthanol, se métabolisent en radicaux 1-hydroxyméthyl (HMR) et en radicaux 1-
hydroxyéthyl (HER), respectivement. Ces radicaux sont capables de réduire l’ activité de
certains antioxydants endogènes tels que l’ α-tocophérol, le glutathion et la superoxyde
dismutase (Santiard, 1995 ; Stoyanovsky, 1998 ; Puntarulo, 1999). De ce fait, ils sont
responsables, en partie, du stress oxydatif au niveau du foie causé par l’ administration aiguë
ou chronique d’ alcool.

Les flavonoïdes, composés naturels largement présents dans les fruits et les légumes,
sont reconnus pour leur activité antioxydante. Ils sont des piégeurs de radicaux libres
oxygénés, des chélateurs des ions métalliques et également des inhibiteurs d’ enzymes
responsables de la formation des radicaux libres (Cotelle, 1996 ; Cos, 1998 ; Rice-Evans,
1996 ; Jovanovic, 1994).

Au cours de la dernière décennie, des études expérimentales ont permis de déterminer

les sites de la métabolisation des flavonoïdes. Là encore, le foie semble être l’ organe
principalement évoqué (Hollman, 1997). De grandes quantités de flavonoïdes se métabolisent
au sein du foie alors que de faibles quantités se métabolisent au niveau de la muqueuse
intestinale (Scalbert, 2000). Dans les fruits et les légumes, on retrouve généralement les
flavonoïdes sous forme de glycosides. Il a été montré que la première étape de la
métabolisation in vivo de ces flavonoïdes glycosylés est leur déglycosylation. Les aglycones
ainsi formés subissent une O-méthylation ou une sulfonation (Hollman, 1997 ; Hollman,
1999 ; Walle, 2000). Puisque toutes ces réactions ainsi que la formation de HER et HMR se
produisent au sein du foie, des réactions entre ces radicaux et les flavonoïdes pourraient avoir
lieu.
Pour étudier la possibilité de telles réactions, nous avons utilisé la radiolyse γ.
Quatorze molécules représentant différentes classes de flavonoïdes (flavonols,
dihydroflavonols, flavan-3-ols, flavanones, flavones et flavonoïdes glycosylés) sont irradiés
en solutions alcools (méthanol et éthanol).

183
 En utilisant la CLHP, nous avons observé que les flavones, les flavanones, les
dihydroflavonols, les flavan-3-ols et les flavonoïdes glycosylés ne sont pas affectés par
l’ irradiation. En revanche, les flavonols étudiés sont transformés en :
produits majoritaires QM1, MM1, KM1 et GM1 (formés au cours de la radiolyse
dans le méthanol de la quercétine, de la morine, du kaempférol et de la galangine,
respectivement) et QE1, ME1, KE1 et GE1 (formés au cours de la radiolyse dans l’ éthanol).
produits minoritaires parmi lesquels nous avons détecté QM2, MM2, KM2 et GM2
(formés au cours de la radiolyse dans le méthanol et dans l’ éthanol).

Les structures chimiques de ces douze composés sont déterminées par RMN et LC-
MS.
A la différence des flavonols, ces produits de radiolyse sont dépourvus du cycle
intermédiaire (cycle C). Leur structure chimique est constituée de deux cycles A et B et ils
diffèrent entre eux par le nombre de groupements hydroxyles sur le cycle B. De plus, les
produits majoritaires sont caractérisés par la présence d’ une fonction ester (COOCH3 si le
milieu d’ irradiation est le méthanol ou COOCH2CH3 si le milieu est l’ éthanol). Celle-ci est
remplacée chez les produits minoritaires par une fonction acide. Nous avons donc constaté
que l’ irradiation entraîne la transformation des flavonols en une nouvelle classe de molécules
qui appartiennent à la famille des depsides.
Les réactions redox permettant la formation des depsides sont stéréospécifiques
puisqu’ elles ne peuvent se produire qu’ au niveau du groupe 3-OH et en présence de la double
liaison C2-C3. Autrement dit, seuls les flavonols sont concernés. Les mécanismes
réactionnels permettant cette transformation sont alors proposés. Aux faibles concentrations
(< 10-4 M), les flavonols réagissent avec HMR ou HER. Dans ce cas l’ oxygène joue un rôle
primordial dans la transformation des flavonols en depsides. Pour des concentrations entre 10-
4
M et 10-3 M, ils réagissent à la fois avec HMR et CH3O• ou HER et CH3CH2O•. Finalement,
aux fortes concentrations (> 10-3 M), les flavonols réagissent avec CH3O• ou CH3CH2O• et
-
dans une moindre mesure avec d’ autres espèces telles que H• et e s. Les constantes de vitesse
des réactions flavonols–HMR/HER et des réactions flavonols–CH3O•/CH3CH2O• sont
calculées et utilisées comme indicateur de la capacité des flavonols à piéger ces quatre
radicaux.

184
 Ces résultats sont donc les premiers à déterminer les relations entre les structures des
flavonoïdes et leur capacité à piéger les radicaux nocifs issus de la dégradation des alcools
(méthanol et éthanol). Cette investigation est une première étape qui s’ inscrit dans la
recherche d’ une diminution des stress oxydatifs causés par une intoxication chronique ou
aiguë à l’ alcool.

Au cours de notre travail, nous avons également mesuré l’ activité antioxydante des
depsides. Ils ont montré une activité comparable à celle des flavonoïdes vis-à-vis les radicaux
superoxyde et DPPH. De plus QM1 et QM2, issus de la dégradation de la quercétine,
réagissent également comme inhibiteurs de la xanthine oxydase.
Les résultats de modélisation moléculaire nous ont permis de confirmer certaines
relations structure-activité établies expérimentalement tels que l’ importance du groupement 3-
OH dans l’ attaque des radicaux HMR, CH3O•, HER et CH3CH2O• sur les flavonols.
L’ importance du cycle B a été démontré dans l’ activité antioxydante des depsides. Par
ailleurs, les différences de structure électronique entre les depsides ont été avancées pour
expliquer les différences d’ activité sur la xanthine oxydase. Les calculs ont été effectués en
utilisant la méthode semi-empirique AM1 et nous envisageons d’ affiner les calculs de
structure électronique par des méthodes ab-initio et DFT.

L’ irradiation des fruits tels que les fraises et les clémentines a montré que les
concentrations de flavonoïdes présents dans ces deux aliments diminuent en fonction de la
dose appliquée. Ceci est dû apparemment au fait que les flavonoïdes subissent des
dégradations au cours de l'
irradiation. Par contre, aucun mécanisme réactionnel n’ a été
proposé. Pour étudier ces réactions physico-chimiques, nous avons irradié des flavonoïdes
dans des mélanges eau/méthanol. La non solubilité de ces molécules dans des milieux aqueux
neutres, nous a empêché de réaliser leur radiolyse dans 100% d’ eau. Quoique les modèles
utilisés dans cette étude ne constituent pas le milieu physiologique des flavonoïdes dans les
fruits et les légumes, nous avons montré que la concentration des depsides QM2, MM2, KM2
et GM2 augmente en fonction du pourcentage d’ eau présent dans le milieu d’ irradiation. En
conséquence, il est possible que durant le traitement des aliments par irradiation, une série de
produits radiolytiques semblables à ces depsides puisse se former. Pour développer cet axe de
recherche, nous travaillons sur l’ amélioration du milieu d’ irradiation. Les études
expérimentales envisagées sont les suivantes :

185
 La radiolyse dans des milieux à pH basique pour augmenter la solubilité des
flavonoïdes.
La radiolyse dans des milieux acides pour se rapprocher des conditions
physiologiques.
La radiolyse d’ un mélange de flavonoïdes pour construire une matrice semblable à
celle existant dans les fruits et les légumes.

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199
Résumé

Nous avons établi, pour la première fois, la relation structure – activité des flavonoïdes en tant que
piégeurs des radicaux 1-hydroxyméthyl (HMR) et 1-hydroxyéthyl (HER) (deux radicaux carbones-centrés reconnus
pour leur implication dans des maladies hépatiques liées à la prise d’ alcool).
Cette étude est réalisée en utilisant la radiolyse γ. Quatorze molécules représentant différentes classes de
flavonoïdes sont irradiées dans le méthanol (système générateur de HMR) et dans l’ éthanol (système générateur de
HER).
Au cours de la radiolyse dans les deux solvants, les flavones, les flavanones, les dihydroflavonols, les
flavan-3-ols et les flavonoïdes glycosilés ne sont pas affectés par l’ irradiation.
En revanche, les flavonols sont dégradés en produits de radiolyse. Parmi ceux-ci, nous avons détecté QM1,
MM1, KM1 et GM1 (des depsides méthoxylés en C-8) comme étant les produits majoritaires de la dégradation dans
le méthanol de la quercétine, de la morine, du kaempférol et de la galangine, respectivement. Par analogie, dans
l’ éthanol, ces mêmes flavonols sont transformés en QE1, ME1, KE1 et GE1 (des depsides éthoxylés en C-8). Dans
les deux solvants, nous avons observé la formation de Q2, M2, K2 et G2 (des depsides hydroxylés en C-8) mais en
faibles quantités.
Les douze composés de radiolyse,identifiés par RMN et LC-MS, constituent une nouvelle série de
molécules de la famille de depsides.
Le mécanisme réactionnel permettant la transformation des flavonols en depsides est proposé et confirmé
par l’ ensemble des résultats expérimentaux et par la modélisation moléculaire. Les flavonols réagissent avec HMR
et HER et conduisent à leur inhibition. Les rendements radiolytiques de HMR et HER et leurs constantes de
réactions avec les flavonols ont été calculés et témoignent de la bonne activité des flavonols sur ces radicaux.
Nous avons également étudié la radiolyse des flavonoïdes dans des mélanges eau/méthanol. Nous avons
observé que les concentrations de Q2, M2, K2 et G2 augmentent avec le pourcentage d’ eau présent dans le milieu
d’ irradiation. Cette étude peut contribuer à la compréhension des dégradations chimiques que peuvent subir les
flavonoïdes au cours du traitement des aliments par irradiation.
La capacité des depsides, identifiés au cours de ce travail, à piéger les radicaux superoxyde et DPPH est
également étudiée en utilisant la chimiluminescence et la RPE.

Abstract

We established, for the first time, relationships between the flavonoid structures and their capacity to
scavenge the 1-hydroxymethyl radical (HMR) and the 1-hydroxyethyl radical (HER) (two carbon-centered radicals
recognized for their implication in liver injuries of alcoholic subjects). In this investigation, we used γ-radiolysis.
Fourteen flavonoids including flavones, flavanones, dihydroflavonols, flavan-3-ols, flavonoid glycosides
and flavonols were irradiated in methanol (the HMR generator system) and in ethanol (the HER generator system).
During radiolysis in both solvents, flavanones, flavones, flavan-3-ols, dihydroflavonols and flavonoid glucoside
were not affected by irradiation, whereas, flavonols were degraded into several compounds. In the irradiated
methanol-flavonol media, we detected QM1, MM1, KM1 and GM1 (depsides with a methoxyl group on C-8) as the
major products formed after degradation of quercetin, morin, kaempferol and galangin, respectively. Similarly,
these flavonols were transformed, in irradiated ethanol medium, into QE1, ME1, KE1 and GE1 (depsides with an
ethoxyl group on C-8), respectively. In both irradiated media, we identified Q2, M2, K2 and G2 (depsides with a
hydroxyl group on C-8) as minor radiolytic products. These twelve compounds, identified by NMR and LC-MS,
constitute an original series of polyphenols belonging to the depside family. The flavonol-depside transformation
mechanism was then proposed and confirmed according to all the experimental data and by molecular modeling.
The chemical yields of HMR and HER, and the rate constants for their reaction with flavonols were also
calculated and used to compare the reactivity of flavonols on HER and HMR with reference compounds.
We also studied radiolysis of flavonoids in different water/methanol mixtures. We observed increasing of
the Q2, M2, K2 and G2 concentrations with increasing of the water percentage present in the irradiation medium.
This investigation can contribute in the comprehension of chemical degradation of flavonoids during treatment of
aliments by irradiation.
The capacity of depsides to scavenger superoxide and DPPH radicals was also studied by
chemiluminescence and EPR.

Key words:
γ-radiolysis, free radicals, flavonoids, HPLC, LC-MS, NMR, Chimiluminescence, EPR.